Teora y prctica para la extraccin ypurificacin del ADN de palma de aceite

Theory and Practice for the Extraction and Purificationof the Oil Palm DNA

Pedro J. Rocha Salavarrieta1

RESUMEN

Uno de los ms importantes aportes a la biologa ha sido el reconocimiento del ADN como la molcula de lavida. El estudio de sus propiedades fisicoqumicas y biolgicas ha desarrollado, en menos de 50 aos, un enfoquetotalmente novedoso en lo referente al origen, flujo y almacenamiento de la informacin gentica en todo servivo. Debido a que en el ADN se encuentran cifradas las instrucciones que definen las caractersticas propias decada organismo, diversas tecnologas y sistemas de anlisis se han desarrollado para la caracterizacin de estamolcula. Los resultados de tales estudios demuestran que caractersticas como la resistencia a enfermedades,potencialidades de produccin, tamao y color de los frutos, entre otros, son debidas a la expresin de la informacingentica y su interaccin con el medio ambiente. La aplicacin de este conocimiento se ha convertido en unaherramienta fundamental en programas de mejoramiento gentico. Por lo tanto, en la presente revisin se presentanconceptos bsicos y explicaciones de los mtodos utilizados para la extraccin de esa informacin genticaempleando, como ejemplo, el protocolo usado para el aislamiento de ADN de palma de aceite (Elaeis guineensisJacq.). Se espera que esta revisin sea el comienzo de una serie de artculos en los que se ver el vertiginosodesarrollo de la gentica y la biotecnologa en los ltimos aos y la importancia de aplicar las tcnicas molecularesen palma de aceite.

One of the most important contributions to biology has been the recognition of the DNA as the lifes molecule.The study of its physicochemical and biological properties has developed, in less than 50 years, a complete differ-ent approach in relation to the origin, flux, and storage of genetic information in all known living-forms. Becauseinside the DNA molecule are ciphered the instructions that define all the characteristics of any organism, severaltechnologies and systems of data analysis have been developed for the characterization of this molecule. Theresults of such studies have demonstrated that characters such as resistance against diseases, productivity poten-tial, size and colour of fruits are due to the expression of genetic information and its interaction with the environ-ment. Nowadays, the use of this knowledge is a fundamental tool in breeding programms. In this review, somebasic concepts and explanations about methods currently used for DNA extraction, in particular the protocol usedfor oil palm, are presented. This review will be the starting point of a series of papers related with the importanceof applying molecular techniques in oil palm.

SUMMARY

1 PhD. Investigador Titular. Laboratorio de Marcadores Moleculares, rea de Fisiologa y Mejoramiento. Cenipalma.Calle 21 No. 42C-47, Bogot, Colombia. E-mail: pedro.rocha@cenipalma.org.

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Palabras Claves: Biologa molecular, Palma de aceite, ADN, Marcadores moleculares.

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INTRODUCCIN

Las caractersticas fisiolgicas ybioqumicas de todo ser vivo estncontenidas en sus respectivosgenomas (ver glosario). Los geno-mas de bacterias, hongos, plantas,animales y algunos virus estncompuestos por molculas de cidodesoxirribonuclico (comnmentellamado ADN). El ADN es unaestructura qumica cuyos elemen-tos fundamentales (nucletidos) seorganizan de manera linealgenerando enormes secuencias deinformacin (Fig. 1, Tabla 1). Lainformacin que define y codificaun carcter determinado sedenomina gen (Lewin 1995). Losgenes se organizan linealmente yse agrupan formando estructurasllamadas cromosomas, los cualespueden ser vistos bajo el micros-copio durante ciertas etapas delciclo de vida de la clula.

Los genes que posee un individuoen su genoma definen su genotipo.La expresin del genotipo esafectada en gran medida por elmedio ambiente, determinando asla apariencia o rendimiento de unindividuo (fenotipo). La genticaestudia cmo el genotipo y el

Tabla 1. Variacin del tamao del genoma para algunos genomas vegetales. (basado en Bennet y Leitch 2001).

Nombre comn Nombre cientfico Tamao del genoma Nmero de(en pares de nucletidos) cromosomas

Trigo Triticum aestivum L. 16.978.500 42Tabaco Nicotiana tabacum L. 5.733.000 48Caa de azcar Saccharum officinarum L. 3.969.000 80Maz Zea mays L. 2.670.500 20Caf Coffea arabiga L. 1.176.000 44Palma de aceite Elaeis guineensis Jacq. 980.000 32Papa Solanum tuberosum L. 858.000 24Yuca Manihot esculenta Krantz 808.500 72Frjol Phaseolus vulgaris L. 588.000 22Arroz Oryza sativa L. 490.000 24Uva Vitis vinifera L. 417.000 38Arabidopsis Arabidopsis thaliana 171.500 10

Figura 1. Niveles de organizacin del ADN. Toda clula posee un ncleo enel cual se encuentra el ADN. La condensacin del ADN constituyelos cromosmas. El ADN es una doble hlice conformada pornucletidos. A lo largo de la doble cadena de ADN se localizan losgenes, los cuales codifican protenas. La interaccin de los genescon el medio ambiente define las caractersticas externas de unindividuo (fenotipo).

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fenotipo son transmitidos de padres a hijos y juntocon la biologa molecular han desarrollado tcnicasde anlisis de poblaciones y de individuos quepermiten ubicar, caracterizar y explicar la he-redabilidad de genes u otros fragmentos de ADN(Lewin 1995).

La linealidad de la molcula de ADN y la con-secuente disposicin de los genes en cromosomashacen posible que genes vecinos se hereden jun-tos. Este hecho, junto con las herramientasexperimentales y de anlisis, han permitido generarmapas, en los cuales cualquier fragmento de ADN(marcador molecular) puede ser utilizado como unava indirecta para seguir el patrn de herencia deuna caracterstica. Los marcadores molecularesestablecen relaciones de vecindad con genes deinters, determinando su localizacin dentro delgenoma del organismo estudiado. En Arabidopsisthaliana, la primera planta cuyo genoma fuesecuenciado completamente, existen alrededor de25.500 genes (The Arabidopsis Genome Initative2000). Cada uno de ellos vara en longitud,teniendo la mayora de ellos entre 500 hasta variosmiles de nucletidos. Sin embargo, con base en lainformacin obtenida para A. thaliana y lasestimaciones para otras plantas, se calcula que slodel 15 al 30% del genoma contiene secuenciascodificantes (genes). El restante 85 a 70% sedistribuye en secuencias reguladoras indispensablespara la expresin de los genes y en secuenciasrepetidas que varan entre una y miles de copiaspor clula (The Arabidopsis Genome Initative 2000).Estas secuencias repetidas se pueden encontraragrupadas en regiones particulares del cromosoma(centrmeros y telmeros) o dispersas a lo largodel genoma (Flavell y Twell 1996). A la de-terminacin de la posicin de genes particulares,secuencias reguladoras y repetidas dentro delgenoma se le denomina mapeo gentico.

Para mapear genes, es decir, para determinar laubicacin de una caracterstica (gen) en el genoma,se hace necesario realizar cruzamientos y analizarsus progenies con procedimientos estadsticosrelativamente sencillos (Fig. 2). El fitomejoramientotradicional ha dado las herramientas conceptualespara analizar la herencia de caracteres fenotpicosevidentes, tales como tamao, color, productividad,forma de frutos, etc. (Griffiths et al. 1993). Por suparte, el rea de marcadores moleculares ha

permitido generar y analizar mltiples puntos deinformacin independientemente de sufuncionalidad. Y es la integracin de las dosdisciplinas la que permite acelerar el proceso demejoramiento gentico de poblaciones e individuospor correlacin entre la informacin fenotpica yla molecular.

A continuacin se describen algunas de las tcnicasempleadas para manipular el ADN de plantas. Enla actualidad, la aplicacin de esas tcnicas es deespecial inters para la exitosa ejecucin deprogramas de mejoramiento gentico.

Figura 2. Esquema paraseguir el comportamiento de unacaracterstica (gen responsable del color) en unapoblacin hipottica. Una planta femenina queexpresa el color (gen dominante) se cruza conuna planta masculina que no lo exhibe (genrecesivo). El resultado del cruce es unadescendencia en la que todas las plantas de esaprimera generacin filial (F1) presentan color. Sise cruzan dos miembros de esta descendencia segenera una poblacin (F2), en la cual se puedeapreciar que tres de las cuatro individuos poseecolor y uno no. Este modelo de herencia degenesha sido observado para muchascaractersticas. Es conocido como la ley desegregacin de caracteres y fue propuesta de J.G.Mendel hacia 1865. La aplicacin de esteconcepto permite predecir las proporiconesesperadas para algunas caractersticas encruzamientos particulares. (Lewin 1995).

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AISLAMIENTO DEL ADN

El primer paso para desarrollar experimentos conmarcadores moleculares es la extraccin del mate-rial gentico de plantas que, por sus caractersticasfenotpicas, poseen caracteres agronmicos deinters. Para la extraccin del ADN vegetal esnecesario tener en cuenta tres factores:

1. El tipo de planta y de tejido que se va a emplearcomo fuente. Por ejemplo, los tejidos jvenescontienen ms ADN que los tejidos viejos.Adems, es necesario considerar la composicinbioqumica de los tejidos. Por ejemplo, elmtodo de extraccin del material genticoproveniente de tejidos ricos en compuestosfenlicos es diferente al mtodo empleado contejidos ricos en carbohidratos o aceites.

2. El tipo de ADN que se va a extraer. Las plantasposeen tres tipos de ADN: el nuclear, elmitocondrial y el cloroplstico. Reciben estosnombres dependiendo del tipo de organelocelular en el que el ADN se encuentre. Losdist