tema 5 validación de métodos analíticos

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Y CCMM

“Prof. J.C. Vilchez Martín”

TEMA 5 Validación de métodos analíticos




Laboratorio

?¿




Normalización de procedimientos

NormaElaboraciónDifusiónAplicación

International Standardization Organization(ISO)

International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)

Association of Official Analytical Chemists (AOAC)

American Section of the International Association for Testing Materials (ASTM)




AnálisisProcedimientos normalizados de trabajo (PNT)

Gestión de calidadImplantación y mantenimiento de sistemas de gestión de calidadISO 9001

Reconocimiento de competencia técnicaRequisitos de aseguramiento de calidad analítica específicos para laboratorios de ensayo y calibraciónISO 17025




Entidades privadasSin ánimo de lucroReconocidas por entidades competentes

CertificaciónGarantizar el cumplimiento y aplicación del sistema de calidad en la gestión según ISO 9001

AcreditaciónReconocimiento de competencias técnicas para la realización de ensayos y calibración según los requisitos de calidad marcados por ISO 17025

Reconocimiento externo de alta confianzaTrabajos con administraciónAnálisis que requieren requisitos de calidad altos (contaminación, salud pública, etc.)Servicio de calibración externo de equipos y dispositivos




Qué es?

Parte esencial del aseguramiento de calidad (expresamente tratada en la ISO 17025)

Documentación de calidad para verificar que el método analítico cumple criterios de calidad establecidos por:

Cliente PNT de referenciaCertificación ISO 9001Acreditación ISO 17025

Organismo público Homologación, ley correspondienteAcreditación ISO 17025

Qué asegura con respecto a las medidas de ensayos y calibración (ISO 17025)?

Trazabilidad de análisis




Qué es la trazabilidad?

Cadena ininterrumpida de comparaciones que aseguran la exactitud de la medida y/o instrumentos implicados en el desarrollo del método con respecto al resto de los elementos de la cadena

Trazabilidad de pesas laboratorio con respecto al cilindro Pt/Ir Sèvres (1 kg)

Aseguramiento de que todas las pesas (con nivel de incertidumbre creciente hacia la

base) ofrecen una misma medida de masa

Patrones certificados

Instrumentos calibrados unos con otros

Procedimientos validados (normalizados)




Trazabilidad en análisis químico

Errores sistemáticosPre tratamiento de muestraInterferenciasEfecto matriz




Determinación de parámetros




Grado de concordancia entre el resultado de una medición y el valor de referencia aceptado

Materiales de referencia certificados

National Institute of Standards and Technologies

Institute for Reference Materials and Measurements (Unión

Europea)

Bureau of Analyzed Samples

American Society of Testing and Materials

Reproducen matrices de muestras problema habituales en análisis con valores certificados de composición (mediante ejercicios interlaboratorios entre laboratorios competentes)




0.95

1.25

1.92

1.060.85

1.620.95

2.501.53

Material de referencia MA-M-2-TM (IAEA)Determinación en organismos marinos

Establecer contrastes de hipótesis correspondiente a una distribución muestral con respecto a un valor límite o certificado (tema 2)

Ejemplo

s

nxtn 01

t calculada




Muestra / Patrón analizado programa interlaboratorio

componentes mayoritarios

componentes minoritarios

trazas

Relación entre coeficientes de variación y concentración de analito en interlaboratorios (Ecuación de Horwitz)

100.%x

sRSD

Similar a la reproducibilidad pero ahora utilizado para validar exactitud

a través de un interlaboratorio




Método de adiciones y estudio de recuperación

Relación entre concentración de analito y % recuperación (AOAC)

Se adiciona analito puro de concentración conocida a muestra real sin analito (disolución matriz blanco) o con concentración previamente determinada

Mismo proceso de pretratamiento de muestra

Análisis y cálculo de recuperación de analito sobre el adicionado




Comparación con un método de referencia

Método a validar

Método de referencia reconocido 1, s1

2, s2

Establecer contrastes de hipótesis con

valores de análisis

H0 Exactitud validada




Calcular la función que relaciona concentración analito y respuesta de método

Criterios de alinealidadCoeficiente de correlación r > 0,998 (r2 > 0,996)% RSD factores de respuesta de concentraciones calibración < 5%

100*%b

SRSD FR

Homocedasticidad de residuos

Incluir valores de confianza para b (pendiente) y a (ordenada en el origen) (tema 4)




Criterios de linealidad

Coeficiente de correlación r > 0,998 (r2 > 0,996)

% RSD factores de respuesta de concentraciones patrones calibración < 5%

100*%b

SRSD FR

Incluir intervalos de confianza para b (pendiente) y a (ordenada en el origen) (tema 4)

Demostrar homocedasticidad de residuos (tema 4)

Test Fischer S alta conc. y baja conc.

i

ii Conc

SeñalFR




Comparación estadística de las dispersiones (s) en condiciones de repetitividad y/o reproducibilidad

Condiciones de repetibilidad

Precisión obtenida en la que los resultados de una medición se obtienenMismo métodoMismo operadorMismo instrumento/equipo de medidaEn un corto intervalo de tiempo (mismo día)

Condiciones de reproducibilidad

Precisión obtenida en la que los resultados de una medición se obtienenMismo métodoMisma muestraDiferentes operadoresDiferentes equipos de medidaIntervalo de tiempo > 24 horasSi es posible, diferentes laboratorios

Repetibilidad Reproducibilidad

Instrumento No cambiar Cambiar

Accesorios No cambiar Cambiar

Operadores No cambiar Cambiar

Matriz muestras

Cambiar Cambiar

Concentración Cambiar Cambiar

Lote de reactivos

No cambiar Cambiar

Condiciones ambientales

No cambiar Cambiar

Laboratorios No cambiar Cambiar/ No cambiar*

*Precisión intermedia (reproducibilidad intralab)




Al menos 5 medidas a 2 o 3 concentraciones diferentes del rango de trabajoCalcular el % RSD

CRSD log5.012%

Valores aceptables de precisión en función de la concentración para reproducibilidad (aceptados por AOAC)

Ecuación de Horwitz

Para condiciones de repetibilidad se aceptaCxRSD log5.0125.0%

*C como concentración g/ml




Reproducibilidad aceptable para este método

EjemploDeterminación de plaguicidas organofosforados en microalgas mediante GC-MSD




El grado por el cual un método puede determinar un analito en particular dentro de una mezcla compleja sin ser interferido por otros componentes de la mezcla

Las pruebas para asegurar la selectividad dependen deMatriz muestraTécnica utilizadaInformación bibliográficamente…Incluir toda la información relevante que verifique la selectividad del método

EjemploEn un método cromatográfico puede expresarse en términos de resolución de picos de analitos

Pico analito interferidoPicos analitos resueltos




Análisis de muestra y MRC por el

método a validar y otros métodos independientes

Análisis de muestras conteniendo varias

interferencias sospechadas en la

presencia del analito de interés

¿Las interferencias inhiben o incrementan la detección

o cuantificación?

¿Se identifica irrefutablemente la señal

de analito?¿Se ve interferido por otros componentes?

Señal de analito identificada y comprobada

libre de interferencias




Intervalo de concentración en el que puede obtenerse una exactitud y precisión adecuadas al objetivo del método

Determinación a partir de datosEstudio rango lineal (Linealidad) Estudio homocedasticidad (Linealidad)

LDO y LQO (Tema 4)

Estudios precisión y exactitud

Con todos estos datos se define el rango de aplicación del métodoConcentración mínima suele coincidir con LDO y LQOConcentración máxima en función de linealidad, homocedasticidad y datos de precisión y exactitud




Hemos definido LOD

YLOD = YB + 3 SBlanco

Y LOQ

YLOQ = YB + 10 SBlanco

Interpolar en recta calibrado para averiguar concentraciones LOD o LOQ

Recuerda!!! HOMOCEDASTICIDAD de residuos

Obtención del valor de YBlanco

Obtención del valor de SBlanco

S es igual en todo el rango de concentración calibrado

Podemos tomar S Blanco = S y/x de los puntos de calibración

Podemos realizar la S de las 10 medidas de señal de blanco

Podemos tomar el valor a (ordenada en el origen) de la calibración

Podemos pasar 10 veces un disolución blanco y realizar promedio de señal




Estimación que caracteriza un intervalo de valores en el que se sitúa con una alta probabilidad el valor verdadero de la magnitud medida

Se deben evaluar todas las fuentes de incertidumbre posibles de etapas que influyen en la medida última

Curva calibraciónSb

Sa

Sx0

Preparación patronesPatrónDiluciónPipeta MatrazTemperatura labBalanzaCalibración balanzaPesasPesada balanzaReactivos…

Curva calibraciónSb

Sa

Sx0

Preparación patronesPatrónDiluciónPipeta MatrazTemperatura labBalanzaCalibración balanzaPesasPesada balanzaReactivos…

*Desarrollado en tema 6

Toma de muestraExtracciónPreparaciónAtaque /DisgregaciónDiluciónBalanzaPipetasMatraces…

Toma de muestraExtracciónPreparaciónAtaque /DisgregaciónDiluciónBalanzaPipetasMatraces…




Todo contribuye a aumentar el error de la medidaPropagación de errores

i

iuu 2 Ejemplo

Contribución a la incertidumbre en la pesadaIncertidumbre pesas de calibraciónIncertidumbre de la calibración de la balanza realizada con ellasIncertidumbre de la propia pesada (repetibilidad del equipo)Incertidumbre de deriva (descalibración con el tiempo e influencia de la T)

2222drcpBalanza uuuuu






A su vez Ubalanza se compone con otras incertidumbres

...2222. patrónpipetamatrazbalanzapatronesprep uuuuu

Ejemplo

Preparación de patrones de calibración

Y así continuamente hasta componer todas las posibles fuentes de error en una U de la medida

...222 pretratamrepetncalibraciómedida uuuu

La U de la medida se expresa en términos de Incertidumbre expandida

ukU . Siendo k=2 para un 95% de probabilidad




Medida de la capacidad del método de permanecer inalterado debido a pequeñas (pero deliberadas) variaciones en los parámetros indicando su fiabilidad durante su uso normal

Identificar las condiciones y variables del método que puedan tener un efecto significativo en la medida

Test de robustez de Youden-Steiner




Test de robustez de Youden-Steiner

Factores que cambianX variable del métodox variable modificada

Ejemplo

A 45 ml HCl utilizado en digestióna 20 ml HCl utilizado en digestiónB Temperatura de estufa a 120 ºCb Temperatura de estufa a 100 ºC…….

Resultados de los 8 análisis con diferente

combinación de factores




Se establecen las medias de los resultados en los que participa cada factor y se representa en una gráfica de columnas la diferencia de concentración por factor (a-A, b-B, c-C,…)

Se establecen las medias de los resultados en los que participa cada factor y se representa en una gráfica de columnas la diferencia de concentración por factor (a-A, b-B, c-C,…)

El factor que más influye (más sensible) es el cambio de volumen de HCl de digestión de 40 a 20 ml.

Ejemplo

tema 5 validación de métodos analíticos

Education

calidad en

medida en

calidad iso

y baja

ensayos y calibracin

ordenada en

ensayo y calibracin

variacin y concentracin