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TBC
On closer inspection, caseous tan necrotic tissue is seen to constitute the granulomas in this gross appearance of a Ghon complex. Most patients with primary tuberculosis are asymptomatic, and the granulomas resolve.
Note the subpleural granuloma at the right along with the granuloma in the hilar lymph node, typical findings for the Ghon complex of primary tuberculosis
• Prevalenza dell’infezione: 2 miliardi • Nuovi casi per anno: 8 milioni • Morti per anno: 2 milioni (esclusi HIV) • Morti evitabili: ~ 30%
Epidemiologia
Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing. WHO Report 2003.
Le ragioni di una attenzione globale
A distanza di oltre 120 anni dalla scoperta del bacillo tubercolare e nonostante l’efficacia dei farmaci, la TB è la prima causa di morte da singolo agente infettivo.
Epidemiologia
Una malattia persistente
Rappuoli R. Nat Med 2004
La tubercolosi
• nel MONDO – 2.000.000 morti all’anno – 8.000.000 nuovi casi all’anno – 1/3 della popolazione mondiale infettato
• in ITALIA – 4.287 casi notificati nel 2001
5.7 casi per 100000 abitanti nel 2013, in tutto 3153 (circa il 50% in soggetti di nazionalità non italiana). 68% a localizzazione polmonare 300 soggetti sono deceduti a causa dell’ infezione TBC (circa 1%)
Tra il 1995 e il 2007 l’incidenza della tubercolosi ha registrato un decremento del 19%, passando da 10 casi ogni 100 mila abitanti (1995) a 7,7 casi ogni 100 mila abitanti nel 2007, un tasso leggermente più alto rispetto al 2006 (7,4 per 100 mila), che pone l’Italia al di sotto del limite che definisce la classificazione di Paese a bassa prevalenza (10 casi per 100 mila abitanti). A seguito della revisione del sistema di notifica della tubercolosi (dal 1999), oltre ai nuovi casi di tubercolosi, è possibile rilevare anche i casi di Tb recidiva, che sono stati poco meno del 10% (dal 1999 al 2007) del totale dei casi segnalati. Il picco si è registrato tra il 2001 e il 2002, con valori, rispettivamente, del 13% e del 12%.
Infezione da M. tuberculosis
• Malattia tubercolare – se il sistema immunitario non riesce a
controllare l’infezione • Infezione latente (assenza di malattia)
– se l’infezione rimane sotto il controllo del sistema immunitario
M. tuberculosis, infezione
Esposizione al M. tuberculosis Assenza di infezione (5%)
Infezione (95%) TBC attiva (5%) (entro 2 anni)
TBC latente (95%) Riattivazione (5%)
nessuna riattivazione (90%)
Related species
• M. tuberculosis: humans only • M. bovis: TB in cows, rarely in man • M. avium: TB-like disease in AIDS patients • M. leprae: causative agent of leprosy • M. kansasi: TB-like disease in AIDS
patients • M. scrofulaceum: cervical adenitis in
children
Dall’esposizione alla malattia Esposizione a caso contagioso
Infezione: MTB prolifera nei fagociti e vengono reclutate
cellule infiammatorie
TB attiva e sintomatica: I soggetti possono trasmettere
la malattia ad altri
* Rischio molto maggiore negli immunodepressi
(nel 95% dei casi le cellule T controllano l’infezione, che rimane subclinica)
Infezione latente: MTB controllato dal sistema immunitario per tutto il
resto della vita
Non infezione: i macrofagi alveolari (mφ) uccidono MTB
Riattivazione (5% di rischio durante il resto
della vita) *
(il 5% va incontro a malattia attiva entro 1-2 anni) *
Patogenesi
Fondamentale è il rapporto tra attività battericida dei mφ e virulenza dei bacilli Fondamentale è l’immunità cellulo-mediata
General characteristics
• Nonmotile • Rod shaped • Obligate aerobe: found in upper lung • Facultative intracellular parasite:
macrophages • Special media: Middlebrook’s or
Lowenstein-Jensen – 4-6 weeks to get colonies – Chains of cells in smears
Colonies of Mycobacterium tuberculosis on Lowenstein-Jensen medium. CDC
General characteristics
• Acid-fast – Not typical Gram stain – Impermeability by certain dyes and
stains unless heated and treated with acidified organic compounds
– Need >10,000 organisms per sputum sample
An acid fast stain is used to diagnose the presence of mycobacteria in tissue and cytologic preparations. Note the thin red rod-like organisms
Peptidoglycan
LAMArabinogalactan Mycolic acid
mannophosphoinositide
• Cord factor – Serpentine cording – Toxic to mammalian cells – Virulence factor
• Wax-D – In cell envelope – Major component of Freund’s complete adjuvant (CFA)
Virulence factors and mechanisms
• No toxins, no capsules, no fimbriae • Slow generation time: antigen threshold
not met to trigger AMI • Lipid concentration in cell wall:
impermeability, resistance to antimicrobial agent or complement or lysozyme
• Cord factor: toxic to mammalian cells; inhibitor of PMN migration
Sometimes the bug outsmarts the phagocyte
Shigella escapes from the phagolysosome (in epitjhelial cells) or kill the cell (macrophages) Legionella diverts the nascent endosome away from the phagocytic pathway Histoplasms limits phagocome acidification Yersinia inhibits NADPH activity
Interference with phagosome maturation
Il MTB inibisce la fusione fagosoma-lisosoma. Come? Calcio?
Internalization
• Inhibits phagosome-lysosome fusion – Prevents recruitment of PI(3)K and EEA1 (early
endosome docking protein, Rab5 effector) • Prevents recruitment of lysosomal hydrolyses • Prevents acidification
• Reduction of IL-12 production – Normally stimulates Th1 response
• Intracellular growth: cytoplasmic and/or phagosome
Mycobacterium tuberculosis is probably the smartest
Stage 1
• Spread person to person• Aerosol • Small droplet (5µm)
Stage 1
• Droplet inhaled • Larger droplets lodge
in nose and throat • Smaller droplets reach
alveoli (small air sacs) Bacteria nonspecifically endocytosed by alveolar macrophagesIf dose is low and immune system healthy, macrophages activate and clear infection. High bacterial dose and/or immune deficiency, alveolar macrophages not activated and unable to destroy intracellular organisms.
Batteriemia
Storia naturale della tubercolsi
Granuloma tubercolare cellule giganti di Langhans e cellule epiteliodi
Cellula gigante di Langhans
Granuloma tubercolare: cellule di Langhans
E
Granuloma tubercolare: necrosi caseosa
Cellule epitelioidi
Reazioni da ipersensibilità
Disease • Five stages
– Only small percent of M. TB. Infections progress to disease
– Even smaller percent progress to Stage 5
• Progression depends on – Infectious dose – Immune status of host – Strain of M. TB. – Prior exposure – Vaccination?????
Stage 1
• Spread person to person• Aerosol • Small droplet (5µm)
Stage 1
• Droplet inhaled • Larger droplets lodge
in nose and throat • Smaller droplets reach
alveoli (small air sacs) Bacteria nonspecifically endocytosed by alveolar macrophagesIf dose is low and immune system healthy, macrophages activate and clear infection. High bacterial dose and/or immune deficiency, alveolar macrophages not activated and unable to destroy intracellular organisms.
Stage 2
• 7-21 days post-infection • M. TB. multiplying unrestricted within
unactivated macrophages • Macrophage bursts: release bacilli • Additional macrophages extravasate
to the scene – Many are not activated and do not
destroy
Stage 3
• Lymphocytes begin to infiltrate – T cells recognized M. TB. antigen in context of
MHC molecules – T-cell activation – Production of INF-γ – INF-γ activates macrophages – Activated macrophages now destroy M. TB.
Stage 3
• Individual becomes tuberculin-positive – result of vigorous CMI response
• Immune pathology begins – TNF-α, IL-1, INF-γ, lysosomal enzymes,
• Tubercle formation begins – Macrophages in vicinity of bacilli fuse to form
giant cells – Layer of macrophages and T cells forms
around a growing focus of damaged tissue containing bacilli
– Walled-off lesion called a tubercle
On closer inspection, caseous tan necrotic tissue is seen to constitute the granulomas in this gross appearance of a Ghon complex. Most patients with primary tuberculosis are asymptomatic, and the granulomas resolve.
Note the subpleural granuloma at the right along with the granuloma in the hilar lymph node, typical findings for the Ghon complex of primary tuberculosis
Stage 3
– Center of tubercle characterized by “caseation necrosis” (semi-solid or cheesy consistency)
– Bacilli persist, but do not replicate, in center of tubercles because anoxic and low pH.
• Granulomatous response – the cell-mediated (T cells and phagocytes)
response that produces the tubercle
Stage 4
• Bacilli replicate in poorly activated macrophages at periphery of tubercle
• Growing tubercle may invade bronchus – Spread to rest of lung and into
blood stream – Formation of secondary lesions
Stage 5
• The caseous centers of tubercle liquefies
• Bacilli escape tubercle • Cavitation of tubercle
The caseous necrosis is extensive, and cavitation is prominent. Such patients can be highly infectious.
Stage 5 • M. TB. grow and multiply extracellularly • Bronchi become necrotic and rupture • Bacilli disseminate throughout lung:
called Miliary TB = myriad of small millet seed (1-3 mm) sized granulomas
The small millet seed sized granulomas in this lung are typical for miliary tuberculosis.
• Bacilli disseminate throughout body• Genitourinary, bones, joints, lymph nodes, peritoneum
Chronic TB infection
• Latency and reactivation • Even if severe symptomatic
disease is prevented – Granuloma persists – Bacilli are latent – Reactivation of bacilli replication
I linfociti T
• Cellula-T nativa = non venuta in contatto con l’Ag
• Cellula-T effettrice = cellula-T nativa venuta in contatto con l’Ag
• Cellula-T memoria = cellula effettrice dopo l’allontanamento dell’antigene
• Cellula-T effettrice = cellula-T memoria in occasione di un nuovo contatto con l’Ag
La Mantoux
• Introdotta alla fine del 1800, è il più vecchio test diagnostico ancora in uso
• Si basa sull’inoculo intradermico del PPD, (miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni dei quali sono presenti anche nel BCG e nei micobatteri non tubercolari)
Charles Mantoux
Diagnosis • Skin test: tuberculin or Mantoux test
– PPD (purified protein derivative) – Mixture of proteins from boiled M. TB. – Injected intracutaneously: read 48-72 hours.
• Stimulates preprimed CD4+ • Cytokines PMNs monocytes macrophages • Erythema: redness and swelling • Induration (hardening): deposition of fibrin by monocytes
and macrophages – Positive: lesion diameter is ≥ 10 mm: red, raised
and hard;
Mantoux
Linfocita T Cellula presentante l’Ag
richiamo e attivazione cellulare
indurimento e arrossamento
nel punto dell’iniezione
Rilascio di IFN-γ, TNF e IL8
Measured amount of PPDInjected intracutaneously
After PPD injected, small wheal appears
48-72 hrs reddish induration (firm bump) > 10 mm
The Internet Pathology Laboratory for Medical Education Florida State University College of Medicine http://www-medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html - MENU
Punti di forza della Mantoux
• Utile per predire la TBC attiva • Il trattamento dei soggetti Mantoux-
positivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva
• Basso costo • Non richiede l’intervento del laboratorio
Limiti della Mantoux § Falsi positivi
- Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM) Falsi negativi - Errori di inoculo - Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione) - Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi
avanzata
- Complicazioni - Effetto booster
§ Problemi di ordine pratico - Doppia presentazione del paziente - Mancata lettura nel 30% dei casi
The ideal diagnostic test (the Kalashnikov paradigma)
Accurate Riproducible Specific Sensitive Predictive Discriminating Low risk Low cost Informative
Reazioni da ipersensibilità
Produzione di interferone-γ (IFN-γ)
• L’infezione tubercolare stimola la risposta della cellule T
• Le cellule-T attivate secernono citochine – IFN-γ – TNF – IL8
• Le cellule-T effettrici producono IFN-γ entro poche ore dalla stimolazione
• Le cellule-T memoria devono prima proliferare trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado di produrre IFN-γ prima di 24h
• L’IFN-γ non è normalmente presente in circolo, è stabile e misurabile
I test basati sull’interferone-γ • I linfociti del soggetto in esame vengono posti in
contatto con l’antigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo positivo contiene fitoemoagglutinina
• Ricerca dell’IFN-γ dopo opportuna incubazione – assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE – presenza di IFN-γ = INFEZIONE
• presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO • assenza di IFN-γ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO
La scelta degli antigeni
• I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone-γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis – PPD (purified proteic derivative) – ESAT-6 (early secretory antigenic target 6) – CFP-10 (culture filtrate protein 10)
• ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT
Specificità di ESAT-6 and CFP-10
MNM
Antigeni
M abscessus
-
-
M avium
-
-
M branderi
-
-
M celatum
-
-
M chelonae
-
-
M fortuitum
-
-
M gordonae
-
-
M intracellulare
-
-
M kansasii
+
+
M malmoense
-
-
M marinum
+
+
M genavense
-
-
M scrofulaceum
-
-
M smegmatis
-
-
M szulgai
+
+
M terrae
-
-
M vaccae
-
-
M xenopi
-
-
Antigeni
ESAT-6 CFP-10 ESAT-6
M tuberculosis
+
+
Ceppi BCG
gothenburg
-
-
moreau
-
-
tice
-
-
tokyo
-
-
danish
-
-
glaxo
-
-
montreal
-
-
pasteur
-
-
Sangue eparinato
ESAT-6 CFP-10 Mitogeno
Trasferimento in pozzetti e aggiunta dell’antigene
Incubazione overnight a 37oC Se sono presenti cellule-T effettrici
viene secreto IFN-γ
Recupero del plasma e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min)
Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura
COLORE
Misura della DO e dosaggio dell’IFN-γcontro una curva di taratura
Metodo ELISA
K -
DO
450
nm
IFN-γ IU/ml
Metodo ELISA in-tube
Raccolta del sangue in provette eparinate
Incubazione per 16-24h a 37°C
Recupero del plasma e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min)
Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura
COLORE
K neg ESAT6 + CFP10 mitogeno centrifugazione
Misura della DO e dosaggio dell’IFN-γcontro una curva di taratura
DO
450
nm
IFN-γ IU/ml
Sangue eparinato
ESAT-6 CFP-10 Mitogeno
Trasferimento dei linfociti (250.000 cell.) in pozzetti coated con Ab anti-IFN-γ
e aggiunta dell’antigene
Incubazione overnight a 37oC Lavaggio e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA,
incubazione 120 min)
Conteggio degli spot, al microscopio o con
lettore automatico
K -
Separazione e conteggio dei leucociti mononucleati
COLORE
Metodo ELISpot
• Man mano che una cellula secerne IFN-γ questo viene legato dagli Ab sottostanti, si forma quindi uno spot
• POSITIVO: quando si hanno spot con almeno uno degli antigeni – se il K- ha 0-4 spot ed il pozzetto dell’Ag
ha più di 5 spot – se il K- ha >5 e <10 spot ed il pozzetto
con l’antigene ha un numero di spot almeno doppio
• NON VALIDO se K- >10 spot e/o K+ <20 spot
Metodo ELISpot: lettura
• Test in vitro • Nessun effetto booster • Specificità elevata • Non influenzati dalla vaccinazione con BCG • Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non
è richiesta la collaborazione del paziente • Interpretazione oggettiva • Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari
Vantaggi dei metodi basati su IFN-γ
Valutazione clinica dei test basati su IFN-γ
• Non esiste un gold standard per la tubercolosi latente – La sensibilità del test viene solitamente
stimata in soggetti con tubercolosi attiva, usando la coltura come gold standard
– La specificità viene solitamente stimata in soggetti ad alto rischio
La risposta IFN-γ ad ESAT-6/CFP-10 è predittiva del passaggio a TBC attiva?
• La risposta IFN-γ correla con l’esposizione
• Circa il 90% dei pazienti risponde • In Etiopia, un follow up di 2 anni di
contatti conviventi col caso indice, ha dimostrato la correlazione della risposta ad ESAT-6 (ma non al PPD) con la progressione verso la malattia
» Doherty et al (JCM 2002)
ACCURATEZZA: quanto il valore fornito dall’ analisi è prossimo al valore reale del parametro che viene analizzato
PRECISIONE: quanto vicini tra loro sono i valori ottenuti in ripetute
determinazioni SPECIFICITA’: capacità di un test di individuare solo i soggetti
malati SENSIBILITA’: capacità di un test di individuare tutti i soggetti malati
veri negativi______ = specificità veri negativi + falsi positivi
veri positivi______ = sensibilità veri positivi + falsi negativi
Correlazione IFN-γ/Mantoux
IFN-γ Mantoux
Sensibilità 89.0% (105/118)
65.7% (50/76; 5 mm)
Specificità 98.2% (213/217)
35.4% (73/113; 10 mm)
Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004
Test IFN-γ vs. Mantoux
• Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: SOVRAPPONIBILE
• Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente: MAGGIORE per IFN-γ
• I casi con Mantoux NEG e IFN-γ POS sono generalmente associati con l’esposizione
• I casi con Mantoux POS e IFN-γ NEG non sono generalmente associati con l’esposizione
Da ricordare