1

Targeting Telomeres in Human Disease: Advances and Therapeutic Opportunities 

30 April 2014  [0:00:00]  Slide 1  Sean Sanders:  Hello everyone and thank you for joining this Science/AAAS webinar. I'm 

Sean Sanders, Editor for Custom Publishing at Science.  Slide 2    The maintenance of telomeres is essential to the health of any cell while 

dysfunction  in  telomere maintenance pathways plays an  integral role  in aging,  cancer,  and  certain  rare  diseases.  The  molecular  analysis  of telomere  lengths,  telomerase  levels,  and  activation  of  the  alternative lengthening of telomere's pathway are currently being used as prognostic tools  in  human  diseases  and  current  research  is  targeting  telomere lengthening mechanisms as a cancer therapy. 

   In  this  webinar,  our  experts  will  describe  the  advances  in  telomere 

research as  it applies to human health and how deep a characterization of  the  telomerase  maintenance  process  can  uncover  targets  for therapies. It's my pleasure to introduce our webinar panel to you now. 

   First,  we  have  Dr.  Roger  Reddel  from  Children's  Medical  Research 

Institute  in  Sydney,  Australia.  Our  second  speaker  will  be  Dr.  Suneet Agarwal from Boston Children's Hospital in Boston, Massachusetts. Thank you both very much  for being here  today. Before we get started, some important information for our viewers. 

 Slide 1    Note  that  you  can  resize  or  hide  any  of  the windows  in  your  viewing 

console. The widgets at the bottom of the console control what you see. Click  on  these  to  see  speaker  bios,  additional  information  about technologies related  to  today's discussion, or  to download a PDF of  the slides. 

   Each  of  our  guests  will  give  a  short  presentation  followed  by  a  Q&A 

session, during which they will address the question submitted by our live 

2

online  viewers,  so  if  you're  joining  us  live,  start  thinking  about  some questions now and submit them at any time by typing them into the box on  the  bottom  left  of  your  viewing  console  and  clicking  the  "submit" button. 

   If you  can  see  this box,  click  the  red Q&A widget at  the bottom of  the 

screen.  Please  remember  to  keep  your  questions  short  and  concise  as this will give them the best chance of being put to the panel. You can also log in to your Facebook, Twitter, or LinkedIn accounts during the webinar to post updates or  send  tweets about  the event.  Just click  the  relevant widgets at the bottom of the screen. For tweets, you can add the hashtag #ScienceWebinar.  Finally,  thank  you  to  PerkinElmer  for  sponsoring today's webinar. 

   Now, I'd like to introduce our first speaker, Dr. Roger Reddel. Dr. Reddel 

is  currently Director of Children's Medical Research  Institute  in Sydney, Australia where his studies have mostly  focused on  the role of p53 and retinoblastoma  abnormalities,  and  on  telomere  length  maintenance mechanisms. He is also the Lorimer Dods Professor in the Sydney Medical School at the University of Sydney. 

   Welcome, Dr. Reddel, and many thanks for being with us.  Slide 3  Dr. Roger Reddel:  Thanks  very much  for  the  introduction,  Sean.  I'd  like  to  talk with  you 

today  about  the opportunities which may exist  to  target  telomeres  for cancer treatment. 

   There's a huge amount  that  still  remains  to be  learned about  telomere 

structure and function, how this becomes abnormal in cancer cells. What I'll do today is give some background about telomere biology, make some comments  about  techniques  for  investigating  telomere  lengthening  in cancers, and then outline some ideas about opportunities to apply some of  what  we  do  know  about  telomere  biology  to  develop  new  cancer therapeutics. 

 Slide 4    The  first  point  to  note  is  that  telomeres,  the  ends  of  chromosomes, 

consist of repetitive DNA. In all vertebrate species, the repetitive unit is a hexanucleotide, TTAGGG repeated many  times.  In each of  the diagrams that I've prepared for this webinar like the slide in front of you now, the bulk  genomic  DNA  in  the  chromosome  is  drawn  in  blue  with  the 

3

centromere being off the  left of the slide and the repetitive DNA of the telomere is drawn in red. 

   Another  point  to  note  here  is  that  the  telomeric  DNA  is  not  double‐

stranded all the way to its end. The last part of it is single‐stranded.  Slide 5    The  repetitive  DNA  of  the  telomere  is  recognized  by  specific  binding 

proteins, especially  shelterin. This  is a  complex of  six different proteins which coat the telomere and protect  it from being recognized as a DNA break, and therefore protect it from inappropriate DNA repair reactions. 

 Slide 6    Telomeres  are  able  to  adopt  a  higher  order  structure  referred  to  as  a 

telomere  loop or T‐loop where the telomere folds back on  itself and the single‐stranded  end  burrows  into  a  double‐stranded  region  forming  a lasso or a lariat structure which protects the telomere's very end. 

 Slide 7    In  addition,  recent  evidences  confirm  something  that's  long  been 

suspected that has to do with the G‐rich nature of the TTAGGG sequence.  [0:05:03]    Because  telomeres are very G‐rich  sequences,  they  can  form G‐quartet 

structures where four Gs bond to each other by Hoogsteen base pairing. When G‐quartets are stacked next to each other, the overall structure  is referred to as the G‐quadruplex. 

 Slide 8    One  of  the most  important  pieces  of  background  information  to  know 

about  telomeres  is  that  they're not  completely  replicated  right  to  their end when all the other DNA  in the chromosomes  is being replicated. So every time a cell replicates its DNA with every cell division, the telomere becomes a little shorter. 

   In normal cells, this continues until the telomere reaches a specific length 

and causes a DNA damage response, which signals to the cell that  it can no  longer proliferate. The cell remains alive, but permanently unable to replicate in a state referred to as senescence. This provides a very potent 

4

protection against cancer because  if a cell  is starting to accumulate pro‐oncogenic  mutations,  the  telomere's  shortening  process  eventually forces  its  progeny  to  stop  dividing  and  become  senescent  before  a clinically significant tumor forms. 

 Slide 9    This  process  of  gradual  telomere  shortening  is  opposed  by  telomere 

lengthening processes. One way in which telomeres can be lengthened is by  the  activity of  an enzyme  called  telomerase, which  synthesizes new telomeric DNA  by  reverse  transcription.  Telomerase  contains  a  reverse transcriptase  subunit  (TERT)  and  an  rRNA  molecule  which  contains  a template  region  for  synthesis  of  the  TTAGGG  DNA  sequence.  The dyskerin subunit is an rRNA binding protein. 

   There are some normal cells which have  low  levels of telomerase which 

slows down, but doesn't  completely prevent  the  shortening process.  In contrast  however,  in  most  cancers,  telomerase  is  up‐regulated sufficiently to completely compensate for the normal shortening process so that telomere length in the cancer cells is maintained. 

 Slide 10    In a smaller subset of cancers, there's an alternative to telomerase called 

ALT, Alternative Lengthening of the Telomeres.  Slide 11    Unlike  telomerase,  which  reverse  transcribes  an  rRNA  template,  ALT 

involves copying of a DNA template.  Slide 12    What I've  illustrated here  is one telomere  inviting another telomere and 

using it as a template for extending itself by DNA replication.  Slide 13  Slide 14    ALT  involves  the  recombination  step where  the  telomere  invades other 

telomeric DNA and the DNA replication step with the end resulting that there  is  synthesis  of  new  telomeric  DNA  to  counteract  the  normal telomere shortening process. 

5

 Slide 15    The great majority of cancers use one or other mechanism, telomerase or 

ALT, to completely prevent telomere shortening, allowing them to bypass the  senescence  barrier  and  to  go  on  dividing  in  unlimited  number  of times. 

 Slide 16    In addition  to the normal, steady attrition of telomeric DNA that occurs 

with  each  cell  division,  there  is  also  a  rapid  shortening  process  called telomere  trimming  that occurs when  telomeres get overlengthened  for whatever reason. 

 Slide 17    If  an  overlengthened  telomere  occurs,  the  cell  is  able  to  correct  this 

rapidly  by  shedding  a  T‐circle,  thereby  shortening  the  telomere  and restoring it to its former length. 

 Slide 18  Slide 19    If we're  going  to  use  cancer  therapeutics  that  are  based  on  telomere 

biology, we need to have ways of detecting which telomere  lengthening process is present in a tumor. For two decades now, the TRAP assay, the Telomere Repeat Amplification Protocol, has been used as the standard technique for detecting telomerase activity in cell lines and tumors. 

   The  principle  of  this  assay  is  that  a  cell  lysate  is  presented with  DNA 

molecules  which  are  subtrates  for  telomerase  together  with  dNTPs. Extension of the substrate by telomerase results in a mixture of extension products with a range of lengths. Each of these DNA molecules can then be amplified by PCR  in the presence of radiolabel or some other way of labeling the PCR products and visualized after gel electrophoresis.  

   As  you  can  see  from  the  panel  on  the  right,  an  ALT  cell  line  has  no 

detectable  TRAP  activity, whereas  in  a  telomerase  positive  cell  line  or tumor,  activity  can  be  recognized  by  the  presence  of  a  six  base  pair ladder of extension products. 

 [0:10:07] 

6

 Slide 20    One of the known problems with a TRAP assay, especially for tumors,  is 

that there are TRAP inhibitors present in some tumor lysates. A potential way around  this  is  to use an  immunoprecipitation step  first  to clean up the  lysate  using  an  antibody  against  the  TERT  catalytic  subunit  of telomerase. 

   As illustrated here, telomerase can be pulled down with the antibody and 

then  released by  supplying  an excess of  the peptide  against which  the antibody was originally  raised. This cleaned up  lysate  is  then presented with a  telomerase  substrate DNA molecule which gets extended  in  the presence  of  label  as  illustrated  before,  then  the  extension  product  is separated by gel electrophoresis and visualized as a six base pair ladder. 

   What  you  can  see  from  the  tumor  panels  on  the  right  is  that  at  the 

highest amount of protein lysate from tumor A, the lane labeled 10, there is no detectable TRAP activity and it's only as the lysate is diluted that the TRAP activity begins to appear. 

   When  immunoprecipitation  is  carried  out  first,  there  are  no  longer 

problems with the  inhibitors  in the  lysate, but  if you compare the  lanes labeled 0.1,  the activity  is clearly present  in  the  total  lysate, but  there's no detectable activity of this deletion when IP clean‐up was done first, so there's  a  trade‐off  here  with  the  IP‐TRAP  removing  problems  with inhibitors, but reducing the sensitivity of the assay, and the same effect is seen in tumor B in the panel below. 

 Slide 21    A more quantitative way of measuring telomerase activity  is via a direct 

assay and there are various protocols available. The one  illustrated here was developed by Scott Cohen and you can see  that  the  first step  is an immunoprecipitation using an antibody against TERT. 

   Again, the telomerase is released from the antibody by adding an excess 

of  the  peptide  antigen  against  which  the  anti‐TERT  antibody  was generated, and then that cleaned up lysate is presented with a substrate molecule  and  nucleotides  so  the  substrate  can  be  extended  by telomerase. 

   One of  the nucleotides can be radiolabeled  to allow visualization of  the 

extension  products  after  gel  electrophoresis.  You  can  see  from  the 

7

quadruplicate assay's reach of four telomerase positive cell lines that this method is highly reproducible. 

 Slide 22    We don't have an enzyme assay for alternative lengthening of telomeres 

and we  rely  instead  on  various methods  for  detecting  the  phenotypic characteristics of cells  in cancers that use ALT. One of these methods  is terminal  restriction  fragment  Southern  blotting.  The  principle  of  this  is that  genomic  DNA  is  first  cut  with  restriction  enzymes  that  don't recognize  the  TTAGGG  repeat  sequence,  which  generates  terminal restriction  fragments  consisting  mostly  of  the  telomere  plus  a  small amount of sub‐telomeric DNA down to the first restriction site. 

   These  fragments have been  separated by gel electrophoresis,  Southern 

blotted, and detected with a radiolabeled probe for telomeric DNA. What you can see here  is the very stark contrast between the telomere smear pattern seen in ALT and telomerase positive cells. ALT cells typically have highly heterogeneous  telomere  lengths  ranging  from very  short  to very long with  the main being much  longer  than  in  telomerase positive cells which have more homogeneous telomere lengths. 

 Slide 23    Another  robust method  of  detecting ALT  in  tumors  is  to  visualize ALT‐

associated PML bodies. PML bodies are structures found  in the nuclei of most  cells and what's unusual about ALT‐associated PML bodies  is  that they  contain  telomeric material,  telomeric DNA,  and  telomeric  binding proteins.  They've  been  visualized  here  by  immunostaining  using antibodies  against  TRF2,  one  of  the  shelterin  proteins,  and  the  PML protein, which forms the outer shell of PML bodies. 

   As you can see, there's telomeric material inside the PML bodies in these 

ALT cell nuclei. This technique  is very useful for detecting ALT  infections of  formalin‐fixed, paraffin‐embedded  tumors or  in  frozen  sections of  in cytology specimens. 

 Slide 24    And  then  the  final  technique  for detecting ALT activity  that  I'll mention 

today  is  the  C‐Circle  assay.  ALT‐positive  cell  lines  and  tumors characteristically contain an unusual type of DNA molecule which consists of  a  circle  of  partially  single‐stranded  telomeric DNA where  the  C‐rich strand is intact and the G‐rich strand is incomplete. 

8

   We  refer  to  these  molecules  as  C‐Circles  and  they  can  be  used  as 

substrates  for  rolling  circle  amplification  by  phi29  polymerase without the addition of any primer. 

 [0:15:07]    The amplified material  can be dot blotted and detected with a  labeled 

probe. What  I've shown here  is  the amplification products  from serially diluted genomic DNA  from an ALT cell  line  IIICF/c and on  the  right,  the phi29  negative  controls,  which  are  particularly  important  for  tumor samples. 

   The C‐Circle assay is very useful for detecting ALT activity when genomic 

DNA  is available  from  tumors and  if  the amount of material available  is very  small,  quantitative  PCI  can  be  used  to  detect  the  rolling  circle amplification products instead of dot blotting and probing. 

 Slide 25    Tumors that predominantly use ALT  include osteosarcomas, some types 

of soft tissue sarcomas, and Grade 2 and 3 astrocytic brain tumors. ALT is also  quite  common  in  glioblastoma  multiforme,  liposarcomas,  and neuroblastomas.  It  occurs much  less  commonly  in  some  types  of  soft tissue  sarcoma  including  rhabdomyosarcoma  and  most  types  of carcinomas. About 10% of human genomes are  thought  to use ALT and most of the remainder use telomerase. 

 Slide 26    Survival  of  patients  with  osteosarcomas  was  shown  by  a  group  at 

Stanford  that  depended  on  whether  the  tumor  had  a  detectable telomere  lengthening mechanism  at  all.  Those  that  had  no  detectable telomere  lengthening mechanism did better  than  those  that had either telomerase or ALT. 

   For liposarcomas, a group in Milan showed that those with no detectable 

telomere lengthening mechanism did better than those with telomerase, which  in  turn did better  than  those with ALT.  In other words, ALT  is an indicator of poor prognosis in liposarcoma. 

   In contrast,  in the case of glioblastoma multiforme, a group  in Sheffield 

showed that although all of the patients had a poor outcome, those with ALT‐positive  tumors  did  significantly  better  than  the  others,  so  the 

9

prognostic significance of the telomere  lengthening mechanism depends very much on the tumor type. 

 Slide 27    When we  turn our attention  to what potentially  can be done  to  target 

telomeres  for  cancer  therapy,  I  think  there  are  many  opportunities. Regarding telomerase, we need to be thinking not just about inhibiting its catalytic activity, but much more broadly about the many steps within its life cycle that could potentially be targeted. 

   Targeting  the  process  of  assembling  the  telomerase  complex,  the 

telomerase  biogenesis  process  has  the  potential  to  greatly  reduce  the amount of telomerase activity in the cancer cell. Once it's assembled, the telomerase molecule  then needs  to be  transported or  trafficked  to  the telomere, and this process could be inhibited. 

   When  it arrives at the telomere, the telomerase needs to dock with the 

telomeric DNA, a process which is intricately regulated by other proteins that are present at the telomere that could potentially be targeted. 

   The catalytic activity of telomerase can be inhibited in a number of ways. 

An oligonucleotide molecule which does this by binding to the template region of telomerase's RNA subunit has been in clinical trials. 

   Finally,  telomerase needs  to move  from one  telomere  to  another by  a 

process of which we know very little, and this step could also potentially be targeted in cancer cells with therapeutic purposes. 

 Slide 28    Similarly,  for ALT, we need  to be  thinking  about  all of  the  steps  in  the 

process  of  telomere  lengthening  body's  mechanism.  For  example,  a telomere  that  undergoes  a  lengthening  by  ALT  must  first  find  and become  juxtaposed  to  a  copy  template  molecule  such  as  another telomere and it may be possible to target this step. 

 Slide 29    It's  known  that  there  are  peptide  epitopes  from  the  TERT  catalytic 

subunit  of  telomerase  that  are  displayed  on  the  surface  of  cancer  cell that use  telomerase and which  can be  recognized by T‐cells. There are clinical trials of treating cancer by vaccinating against these epitopes. 

 

10

Slide 30    In addition, there may be aspects of the telomere architecture which are 

different  in  cancer  cells. We  know  in  ALT  cells  that  there  are  variant repeat DNA sequences present  in unusually  large quantities  in the distal parts of  their  telomeres  and  this ALT  is  shelterin binding.  This  reduced protection  of  ALT  telomeres  by  shelterin  might  create  some vulnerabilities  in  cancer  cells  that  depend  on  ALT,  which  could  be exploited for therapy. 

 Slide 31    It's also possible  that  the  telomeres of cells with up‐regulated  telomere 

lengthening  mechanisms  are  more  vulnerable  to  the  binding  of  G4 ligands, molecules designed to bind to the G‐quadruplex structures that can form within telomeres. 

 Slide 32    The  telomere  lengthening processes are up‐regulated or switched on  in 

cancer cells by mechanisms which we don't yet fully understand, but the up‐regulation processes  themselves may provide opportunities  for new approaches to therapy. 

 [0:20:12]    There have been attempts  to  target cancer cells  in which expression of 

TERT is up‐regulated by transactivation, using a gene therapy approach in which  the  TERT promoter  is  linked,  for  example,  to  a  gene  encoding  a pro‐drug  activating  enzyme, which means  that  an  anti‐cancer  pro‐drug will be selectively activated in cells where telomerase is up‐regulated. 

 Slide 33    For ALT to be switched on, we know that there are repressor molecules 

that need to be lost or inactivated and this may open up the possibility of synthetic  lethal approaches  to  treating ALT cancers. For example, many ALT cancers  lack expression of the ATRX protein and ATRX  is  involved  in cellular  resistance  to  various  stresses,  so  it may  be  possible  to  find  a stressor to which ATRX negative ALT cancers are highly susceptible. 

 Slide 34  

11

  Maybe  it will be possible  if we understand  telomere  trimming  in more detail to selectively stimulate rapid telomere loss in cancer cells. 

 Slide 35    I think there are going to be a number of challenges that need to be faced 

in developing  cancer  treatments based on what we're  starting  to  learn about telomere biology. One of them is the length of time it may take for inhibitors of ALT or telomerase to act, which may depend  in part on the pre‐existing telomere length in the cancer cells at the start of treatment. 

 Slide 36    Here's an example of a cell culture experiment where ALT was turned off 

in a cell line using a genetic manipulation and the telomeres immediately began  eroding.  The  telomeres  appear  as  bands  on  this  gel  and  are highlighted by  the arrows on  the  left, whereas  the arrows on  the  right highlight interstitial sequences that don't shorten. 

   The telomeres eroded at a rate of about 130 base pairs per cell division, 

the  sort  of  rate  you'd  expect  if  a  cell  had  its  telomere  lengthening mechanisms completely inactivated, but the cells continued proliferating and  the  telomeres  continued  shortening  for  60  to  80  population doublings before the effects in inhibiting ALT began to be seen. 

   This suggests,  I think, that we're going to need to combine  inhibitors of 

telomere  lengthening  mechanisms  with  other  treatments  that  rapidly debulk the tumor. 

 Slide 37    Other challenges may  include side effects. As  I mentioned earlier, some 

types  of  normal  cells  require  a  level  of  telomere  lengthening  activity, which  is not enough  to allow  them  to permanently bypass  senescence, but which  is enough to allow them to continue proliferating throughout the human life span. 

   So  inhibiting  telomere  lengthening  activity  may  eventually  have 

consequences  for normal  somatic  cells as well as  for  cells of  the germ‐line. 

   Thirdly,  there's  evidence  both  in  vitro  and  in  vivo  that  tumor  cells 

respond  to effective  inhibition of one  telomere  lengthening mechanism 

12

by switching on the other, which may mean that we'll need to learn how best to use a combination of ALT and telomerase inhibitors. 

   Finally,  although  it  has  become widely  accepted  that  ALT  cancer  cells 

have  a  telomere  lengthening  mechanism,  there  will  be  a  subset  of cancers that survive without any telomere lengthening mechanism at all. If  this  is correct,  it'll be very  important  to  identify  these  tumors and  to avoid  treating  them with  inhibitors of  telomere  lengthening, which  are likely to be quite futile in this situation. 

 Slide 38    In  concluding,  I would especially  like  to acknowledge Cancer Council  in 

New South Wales and the other funding agencies shown here which have funded research in my lab. 

 Sean Sanders:  Fantastic! Thank you so much, Dr. Reddel. We're going to move right on 

to our second speaker today, and that is Dr. Suneet Agarwal.  Slide 40    Dr. Agarwal  is  currently  an  assistant  professor  in  Pediatrics  at Harvard 

Medical School, principal faculty at the Harvard Stem Cell Institute, and a staff physician  in hematopoietic cell transplantation at Boston Children's Hospital  and  the  Dana‐Farber  Cancer  Institute.  He  is  interested  in  the mechanisms  and  therapy  of  genetic  blood  diseases  with  a  focus  on dyskeratosis congenita. 

   A warm welcome, Dr. Agarwal, and thanks for joining us today.  Dr. Suneet Agarwal:  Thank  you  very much.  Thank  you  for  the  invitation  to  discuss  human 

telomere  diseases  today  with  you.  A  prototype  of  these  diseases  is dyskeratosis  congenita  and  in  the  next  20  minutes,  I'll  describe dyskeratosis  congenita  or  DC  and  give  a  historical  view  of  genetic discoveries in the disease. 

 [0:24:59]    I'll  then  discuss  how  genetics  has  led  to  an  identification  of  a  broad 

spectrum  of  telomere  diseases  and  the  complex ways  in which  lesions and  telomere  biology  genes  are  impacting  clinical  diagnosis  and  also impact clinical phenotype. 

 

13

  Finally, I will describe how this understanding of DC as a telomere disease is impacting therapy, in particular, in bone marrow transplantation. 

 Slide 41    Dyskeratosis congenita is a rare disorder first described almost a hundred 

years ago and is characterized by a clinical triad of irregularities and skin pigment  abnormalities  in  the  nails  and  white  plaque‐like  lesions  on mucosa surfaces such as the mouth.  

   These  are  the  main  and  major  findings,  but  even  early  on,  it  was 

recognized  that  these  signs  were  the  outward  manifestations  of  a broader systemic disease that cause life‐threatening dysfunction in other tissues. 

   Eighty  percent  of  patients  develop  aplastic  anemia  or  bone  marrow 

failure by age 30. There's a high  incidence of cancer of  the blood,  skin, and mucosal surfaces,  increased risk of  liver and  lung disease, and many other  defects.  In  fact,  any  organ  system  can  be  involved  leading  to  a significantly  decreased  overall  survival.  Over  the  course  of  several decades,  despite  a  more  refined  clinical  description,  the  ideology remained a mystery. 

 Slide 42    The  first  real  inroads  came  from  a  recognition  that  there was  a  high 

proportion  of boys  affected  and  in  the  '80s,  this  led  to  linkage  studies implicating a region on the X‐chromosome. 

   The key was in the mid‐'90s when Inderjeet Dokal in London established 

the  dyskeratosis  congenita  registry.  This  was  important  in  obtaining enough  families  and  enough  power  and  analysis  to  narrow  down  the region  even  further  to  an  approximately  1.4  cM  region  on  the  X‐chromosome. 

   Dokal  and  colleagues  analyzed  the  integrity  of  28  genetic  loci  in  this 

interval  in  patient  DNA  samples  and  as  shown  here  by  Southern  blot using a p32 radiolabeled cDNA probe. 

   We  found a patient with a deletion and putative gene  indicated by  the 

arrow.  Sequencing  of  that  gene  led  to  the  identification  of  missense mutations in five other patients. They dubbed this gene DKC1 and all that was  really  known  about  it  was  that  it  was  a  homolog  of  a  yeast pseudouridine synthase  that binds a class of small nucleolar RNAs via a 

14

box  H/ACA motif,  and  so,  giving  it  a  proposed  role  in  ribosomal  RNA modifications or ribosomal biogenesis, but the real pathophysiology was not understood by this finding. 

 Slide 43    The next major  insight came  from the work of Mitchell and Collins who 

were  studying  the  structure  of  vertebrate  telomerase  RNA  component called TERC. They recognized that TERC contained a box H/ACA motif and proposed that perhaps there was a defect  in this component  in patients with DKC1 mutations. 

   The key experiment was this Northern blot in their Nature paper using a 

p32  radiolabeled  probe  to  quantify  the  TERC  transcript  and  showing  a defect  in TERC  levels  in patients with DKC1 mutations. This  led  them  to conclude that DC might actually be caused by deficiencies in telomerase. And  very  remarkably  two  years  later,  Vulliamy,  et  al.  tied  all  of  this together with a report of TERC mutations in a large family with autosomal dominant  dyskeratosis  congenita, which  pointed  firmly  in  the  direction that indeed DC was likely to be a disorder of telomere biology. 

 Slide 44    Dr.  Reddel  has  already  introduced  telomeres,  but  as  way  of  brief 

background,  telomeres  are  the  ends  of  chromosomes  composed  of hundreds of thousands of copies of hexanucleotide repeat. By forming a complex  protein  DNA  structure,  they  protect  chromosome  ends  and prevent unwanted chromosome fusions. 

   Because of  the end  replication problem,  telomere  repeats are  lost with 

each  cell  division  and when  enough  copies  are  lost,  somatic  cells  stop dividing  as  a  protective  measure  and  enter  senescence.  Therefore, telomere length is associated with cellular replicative capacity. 

   The ribonucleoprotein complex, telomerase, can extend telomeres and is 

expressed  in  cells with  self‐renewal  capacities  such  as  embryonic  and adult  stem  cells  and  then  cancer  cells.  It's  composed  of  the  RNA template, TERC, which we've already discussed; a  reverse  transcriptase, TERT, which  is expressed only  in the cells that have telomerase activity; and  several  constitutively  expressed  factors  that  are  required  for  the stability  of  telomerase  RNA  component  and  also  the  subnuclear localization of the telomerase's whole enzyme.  

 Slide 45 

15

   Based  on  these  findings,  one  would  predict  that  if  DC  is  a  telomere 

disease,  then patients will have  shorter  telomere  length  in  their  tissues and decrease the replicative capacity of their cells, which may account for the disease findings, and both of these are true. 

   Here's a telomere Southern blot where the telomeres are detected from 

the patient's peripheral blood DNA on the  left. This can be done with a p32  radiolabeled  probe  against  the  telomere  repeat,  which  has  the advantages  of  providing  not  only  a  direct measure  of  telomere  length distribution,  but  also  a  simple  assessment  of  the  quantity  of  overall telomere DNA. 

   Telomere  length  in the peripheral blood decreases as a  function of age, 

but  the  DC  patient  shown  here  has  a  shorter  mean  telomere  length compared to his mother and father even though they are older.  

 [0:30:02]    DC patient  somatic  cells  also  show  impaired  replicative  capacity. There 

are  explants  fibroblast  growths  in  vitro  showing  the  impaired proliferation capacity of  the cells  from  the DC patient compared  to  the normal. This correlates what's shown below. The premature senescence is  correlated with a decreased  initial  telomere  length  in  the DC patient compared to the normal. 

 Slide 46    This  finding of decreased  telomere  length can be exploited as a clinical 

test.  Lansdorp  and  colleagues  have  developed  a  fluorescence  in  situ hybridization  base  method  using  a  fluorescent  probe  to  hybridize quantitatively to telomere ends and peripheral bloods cells such that the fluorescence  intensity  correlates with  the  summation  of  lengths  of  all telomere ends in the cell. 

   By combining the FISH method with flow cytometry, the mean telomere 

length  and  peripheral  blood  subsets  are  determined  and  plotted  on  a graph which has normalized for patient age.  

   Here,  Alter  and  colleagues  show  that  the  detection  of  less  than  first 

percentile  telomere  length  age‐adjusted  by  flow‐FISH  has  a  high sensitivity  and positive  predictive  value  for detecting patients with DC. This  test  is a change practice and we send  it  routinely on patients with 

16

bone marrow failure as a screen for whether they may have a subclinical phenotype of dyskeratosis congenita. 

 Slide 47    In the past 15 years, ongoing genetic discovery has confirmed that DC is a 

telomere disease and that mutations  in nine genes  in ALT and telomere biology have now been implicated and account for approximately 60% of patients with DC with 40% remaining unknown. Every inheritance swarm is represented. This includes mutations in telomerase components as well as telomere structural components and application machinery. 

   This  diagram  by  Calado  and  Young  makes  a  very  important  point 

however.  The  groups  of  Young,  Greider,  Armanios,  Garcia  and  others discovered  that  some  patients  who  have  isolated  idiopathic  aplastic anemia  (bone  marrow  failure)  or  idiopathic  pulmonary  fibrosis  (lung disease) alone without the classic findings of dyskeratosis congenita can also have mutations in TERC and TERT. This has led to a recognition that telomere diseases exist across a broad spectrum of phenotypes. 

 Slide 48    This  is captured here  in a report by Bessler, et al. where she shows that 

some patients present with very severe forms of telomere diseases early in  infancy  such  as  the  Revesz  and  Hoyeraal  Hreidarsson  syndromes, which are caused by DKC1 and TINF2 mutations. 

   Other patients can present  in  later decades of  life with  isolated aplastic 

anemia, with  cancer, with AML, and pulmonary  fibrosis or  lung  fibrosis without plastic manifestations of DC. There is some genotype‐phenotype correlation, but it is imperfect. There are several factors that can account for some of this very presentation and I'd like to describe a few of them. 

 Slide 49    First,  it was apparent  from  the early studies of Vulliamy and colleagues 

that  families  with  autosomal  dominant  forms  of  DC  showed  an anticipation,  genetic  anticipation,  which  means  an  earlier  onset  of symptoms in younger generations. 

   This can be explained by the theory that not only do affected individuals 

and  younger  generations  inherit  the  genetic  lesion  itself,  but  also  that they are passed on  shorter  telomere  length  so  that  they have  less of a 

17

reserve  or  endowment  of  telomere  length  before  they  reach  a  critical stage where they're causing functional problems in tissues. 

 Slide 50    This raises an even more interesting issue of what happens if you inherit 

only  the  short  telomeres,  but  not  the mutation  itself,  a  term which  is coined  by  Carol  Greider  called  the  telotype.  Indeed,  Garcia  and colleagues  have  shown  up  here  on  the  left  that  in  families with  TERT mutations, that in younger generations of people who have the mutation, telomere length is indeed compromised. 

   But  even  in  those  who  don't  inherit  the  mutation  in  subsequent 

generations,  telomere  length  is  also  shorter  than  in  prior  generations. Does  that  mean  that  the  patients  will  actually  have  a  problem  just because they've inherited shorter telomere length? 

   The answer to that is not clear, but I'd like to share with you the pedigree 

of a family that we've cared for on the right, which shows five children, all of whom were deemed clinically  to actually have blood defects, but on mutational analysis, only three of the patients carry the mutation. 

   Interestingly,  the  other  two  siblings  also  had  relatively  short  telomere 

length around the first percentile. And for this reason, they were deemed unsuitable  as  bone marrow  donors.  So  it may  be  that  inheriting  short telomeres does in fact cause tissue‐specific disorders. 

 Slide 51    Another  complication  is  phenotypic  variation,  different manifestations 

despite carrying the same mutations. I'd like to describe a case for you of a  15‐year‐old  girl we  cared  for who  had  classic  dyskeratosis  congenita characterized by skin and oral changes and bone marrow failure. 

   She had very short telomere length as shown by the telomere plot on the 

right, but  she was negative  for any known genes.  In  cases  like  this, we look  for  candidate  genes  to  sequence  or  for  new  genetic  discovery  by exome sequencing. 

 Slide 52    When we're looking for candidate genes to sequence on this patient and 

others,  there's  a  very  interesting  report  that  came  out  from Anderson and colleagues in a seemingly unrelated syndrome called Coats plus. 

18

 [0:35:08]    They  were  looking  for  the  genetic  basis  of  this  disorder  which  is 

characterized by brain cysts, bone  lesions, and vascular abnormalities  in the eyes and in the gut. By exome sequencing, they found mutations on a gene called CTC1, conserved telomere maintenance component. 

 Slide 53    Interestingly, when they were  looking at these patients, they found that 

some of  them, not many of  them, but  some of  them have  sparse, gray hair, nail  changes or  low blood  counts, none of which would qualify as bone marrow failure, but some abnormalities that seem to overlap with DC. 

   And  because  of  the  nature  of  this  gene,  some  of  their  patients were 

subjected to telomere length analysis and showed indeed first percentile or somewhat low telomere length compared to their parents. This led to the  hypothesis  that  some  individuals  with  DC  might  actually  have mutations in the same gene called CTC1. 

 Slide 54    We sequence the genes on our 15‐year‐old patient and found compound 

heterozygous mutations in CTC1 as well. One allele showed a frameshift, so predicting a truncated protein, and the other showed a single amino acid deletion. So it's possible that even though our patient didn't seem to have  Coats  plus  but  have DC  that  there  could  be  allelic  variation  that would lead to different syndromes. 

   What was very  interesting about  this patient's alleles  is  that  they were 

also  shared  and  found  in  the  patients  who  actually  had  Coats  plus, identical  alleles  causing  the  frameshift  and  also  the  single  amino  acid deletion. 

 Slide 55    We  looked  in  this  patient  to  see  if  she  actually  had manifestations  of 

Coats plus, which might not have been obvious.  Slide 56  

19

  First, we  looked at  retinal eye  vessels, which were  subtly  involved, but not  in  the  same  way  that  Coats  plus  patients  are.  She  actually  had subclinical  calcifications  and  cysts  in  her  brain  and  she  had  very insignificant vascular abnormalities in her gut, none of which would cause any  significant  problems,  so  she  has  some  similarities,  but  important differences to the syndrome of Coats plus. 

 Slide 57    Subsequently, Dokal and colleagues using  the UK  registry also  screened 

for CTC1 mutations and  found  that 6 of 73 patients with classic DC had compound  heterozygous  CTC1 mutations.  This  is  nicely  summarized  in this  review by Sharon Savage. This basically proves  that Coats plus and CTC1 mutations  are  along  the  spectrum  of  telomere  diseases  and  that mutations  in  the  same  gene  can  cause  very  significantly  different phenotypes even if they have similar alleles. 

 Slide 58    One other confounding factor about genetics  in DC  is the observation of 

somatic  reversion.  In  this  very  nice  paper  by  Jongmans,  et  al.  they showed  that  some  patients  with  heterozygous  TERC  mutations  had undergone  reversion  of  the  mutation  in  the  blood.  So  on  the  lower chromatogram,  you  see  that  the  patient  has  a  heterozygous mutation and  skin  fibroblast,  but  only  one  pattern  in  the  blood,  and  that  is corresponding to the wild type allele. 

   This  is  corresponding  to  an  event  of  uniparental  disomy  by  loss  of 

heterozygosity  in both myeloid and  lymphoid cells  in the patient, which indicated an early event in hematopoietic progenitors. This reminds us to look at  somatic  tissues when we're  checking  the genetics with patients with  DC,  but  it  also  makes  a  strong  statement  about  the  potential selective advantage of cells with two functional copies of TERC in a tissue compartment such as the blood, which would reconstitute hematopoiesis if there was revertant mutation. 

 Slide 59    In  summary,  there's  been  huge  progress  in  the  genetics  and 

understanding  of  DC  in  the  past  15  years.  Patients  are  aided  by  a functional test called age‐adjusted mean telomere length testing and also by the identification of several genes that are implicated in DC and other related diseases, but there are several confounding factors which make it hard  to  diagnose  patients,  including  an  incomplete  genetic 

20

characterization,  multiple  modes  of  inheritance,  genetic  anticipation, variable penetrance and the telotype, and events of somatic reversion. 

   In practice, this means that we at this stage evaluate patients of any age 

presenting  with  aplastic  anemia,  associated  science,  or  a  suspicious family  history  for  DC  or  telomere  disease.  The  diagnosis  of  DC  or telomere disease has  significant  implications  for management,  therapy, and family counseling. 

 Slide 60    With regards to therapy, I'd  like to describe to you now how progress  in 

understanding  the  telomere  biology  basis  of  DC  is  impacting  care.  In specific,  I'd  like  to  talk  to  you  about  allogeneic  bone  marrow transplantation because there are no cures  for any of the defects  in DC except  for allogeneic bone marrow  transplantation, which  can  cure  the blood defects. 

   The  difficulty  has  been  that  historically,  there  have  been  very  poor 

outcomes  in  DC  patients  undergoing  a  conventional  form  of  bone marrow  transplantation  due  to  increased  early  and  late  complications. For  this,  I  provide  you  a  little  bit  of  background  about  bone marrow transplantation in general. 

 Slide 61    There are two steps involved.  [0:40:00]    The  first  is  conditioning  and preparing  the patient  to  receive  the  graft. 

This is traditionally done with chemotherapy and radiation, which serves several purposes. 

   First, most bone marrow transplantations are done  from cancer. And  in 

cases of  trying  to consolidate a cure  for cancer,  the chemotherapy and radiation  does  have  some  anti‐tumor  effect.  But  in  general,  for  bone marrow  transplantation, what's being achieved with chemotherapy and radiation  is providing  strong  immune  suppression  so  that  the  recipient does not  reject  the graft, and also creating  functional or physical space for the engraftment of hematopoietic stem cells in the recipient's niche. 

   The  second  aspect  is  the  transplantation  of  hematopoietic  progenitor 

cells  from  the donor and  this provides  the advantage of  replacing cells, 

21

which are normal and not mutant, or enzyme replacement in the case of metabolic  diseases,  and  in  the  case  of  malignancy  because  of  some immune differences, providing a graft‐versus‐tumor effect. 

   Overall, the downsides of conditioning include significant collateral tissue 

damage because of a non‐specificity of these agents and significant short and  long‐term  sequelae;  the  disadvantages  in  the  case  of  engraftment across  immune  barriers  or  graft‐versus‐host  disease,  the  immune suppression that's required to control that complication and the toxicities and risks. 

 Slide 62    Alter, et al. analyzed the outcome of BMT for DC in 2009 by reviewing 65 

cases in literature and they documented that there was a very poor long‐term  survival  likely  due  to  the  previous  position  of  these  patients  to pulmonary,  hepatic,  and  vascular  complications,  and  also  long‐term secondary malignancies. 

   These  transplants were done using  conventional  conditioning  regimens 

and have  led  to  the  recognition  that perhaps decreasing  the  toxicity of the regimen would be necessary to achieve satisfactory outcomes in BMT for dyskeratosis congenita. 

 Slide 63    We and others have adopted reduced intensity conditioning regimens to 

try to improve outcomes in DC and I'll tell you the rational for a trial that we  opened  recently,  and  that  is  that  because  DC  is  a  non‐malignant disease,  as  long  as  engraftment  is  not  compromised,  the  conditioning toxicity  will  improve  outcomes  because  there's  no  desired  anti‐tumor effect. 

   Second,  eliminating  alkylator  and  radiation  exposure  will  decrease 

toxicity to those same organs which DC patients are already predisposed for  failure  such  as  liver  and  lung,  and  also  for  the  predisposition  to cancer.  

   Third,  based  on  the  findings  of  telomere  defects  in  patients  from  the 

impaired replicative capacity of their cells, we believe that the telomere defect  in  DC  will  result  in  a  defect  in  hematopoietic  and  immune response  to  the  graft  which may  favor  engraftment  with  a  less  toxic conditioning regimen. 

 

22

Slide 64    This  is schematized here where we are proposing to eliminate alkylating 

agents and  radiation  in  favor of noncytotoxic  ‐‐ non‐generally  cytotoxic immune  suppression  only  and  asking  the  question  of  whether engraftment will be successful in patients with dyskeratosis congenita.  

 Slide 65    This  is a schema of the transplant protocol that we opened  in July 2012 

where  we're  using  off‐label  anti‐CD52  antibody  as  a  lymphocyte‐depleting  antibody  for  strong  immune  suppression,  and  fludarabine, which  is  a  nucleocyte  analog  whose  cytotoxic  effects  are  limited  to hematopoietic  space. We  use  a  bone marrow  graft  and  conventional graft‐versus‐host disease prophylaxis. 

   This is an ongoing study and it's too early to draw conclusions, but we are 

encouraged from this study and other recent studies using other reduced intensity conditioning regimens that there have been improved outcomes at least in the short‐term. 

   On  this  regimen,  four patients have been  treated  so  far and  they have 

achieved  engraftment.  The  questions  are  whether  they  will  sustain engraftment, whether this  finding will be generalizable to various  forms of  DC,  and  whether  there  will  be  an  improvement  in  the  long‐term outcome. 

 Slide 66    In  summary, DC  has  been  firmly  established  as  a  disorder  of  telomere 

biology  and  this  was  satisfying  because  it  appears  to  affect  the  self‐renewal of cells in various tissues and explain the various manifestations in patients with DC and other related telomere diseases. 

   There  are  diagnostic  advances,  but  also  ongoing  challenges  based  on 

complex genetics and disease manifestations. The task in this area now is to  apply  new  knowledge,  to  innovate  therapies,  and  develop  disease‐specific trials. 

 Slide 67    I'd  like  to  acknowledge  local  collaborators  and  funding  sources  and 

colleagues  whose  work  I'd  mentioned  who  actually  made  these 

23

remarkable  advances  over  the  past  15  years  in  this  disease,  and  also thanks to Science and PerkinElmer for sponsoring this webinar. 

 Sean Sanders:  Fantastic! Thank you so much, Dr. Agarwal and many  thanks  to both of 

our speakers for the wonderful presentations.  Slide 68    We're  going  to  move  right  on  to  questions  submitted  by  our  online 

viewers. A quick reminder to those watching us  live, you can still submit your questions by typing them into the textbox and clicking the "submit" button. 

 [0:45:04]    We have received a lot of questions, so we're going to try to get through 

as many as possible.     The  first question  I'm going  to put out  to both  speakers  ‐‐ and  I'll  start 

with  you, Dr.  Reddel  ‐‐  is  do  you  think  telomere  attrition  per  se  is  as significantly meaningful  as  a  biomarker  or  is  it  better when  combined with other biomarkers, and possibly if you could talk about which ones? 

 Dr. Roger Reddel:  Thanks,  Sean.  Look,  I  think  the  answer  to  that  question  depends  very 

heavily on the context. In the case of the short telomere disease that we just  heard  about  from  Dr.  Agarwal,  it's  critically  important  to  know telomere length. 

   In many other contexts, it's a very interesting experimental subject, but it 

doesn't  really  replace  existing  clinical  markers.  If  you're  studying cardiovascular  disease,  it  doesn't  replace  ‐‐  it  may  be  an  interesting adjunct, but it doesn't replace lipid levels and blood pressure and so on. I got multiple examples. 

   One thing that's really interesting to keep in mind is that telomere length 

really results from a lot of factors acting on it and it's just one number. So in many contexts, the value of its predictive ability is quite limited. 

 Sean Sanders:  Dr. Agarwal, anything to add?  Dr. Suneet Agarwal:  I agree with Dr. Reddel. Certainly,  it's being established  that peripheral 

blood  telomere  length  can  be  helpful  in  the  diagnosis  of  inherited telomere disorders, but there's still a conundrum in how to interpret it in other contexts. The test has to be used  in a specific clinical context and 

24

it's not  really  validated generally  in other  conditions  yet,  so  I  think  the other biomarkers would be  tissue, or  to be  specific,  to  take along with telomere  length  including  the  patient  history  to  actually  try  to understand what's going on. 

 Sean Sanders:  Now, a following to that, another question received  is how accurate are 

the  current methods  for  determining  telomere  length? Maybe  I'll  give that to you, Dr. Reddel. 

 Dr. Roger Reddel:  There  is still a  lot of work to be done. So  in the context where  it's really 

important,  and  that  is  the  DC  and  related  syndromes,  dyskeratosis congenita  and other  short  telomere  syndromes, usually  the  results  are fairly  unequivocal.  It's  possible  to  say with  a  degree  of  certainty  that telomeres are very short. 

   In other contexts, the types of measurements that are being used, flow‐

FISH, qPCR, they're reproducible, but the value is often in epidemiological studies where there's a correlation between some parameter in telomere lengths and the value of an individual rating is not always clear. 

 Sean Sanders:  Excellent! Now, Dr. Agarwal, I'm going to come to you with this question. 

This is coming in a number of different ways, but essentially, what they're asking  is when  performing  telomere  therapy,  is  there  a way  to  target certain cells or would all cells receive the therapy and would you not be promoting telomerase activity in both good and bad cells? 

 Dr. Suneet Agarwal:  I think we have to speak about this in theory right now because there are 

no definitive, proven  telomere‐activating  therapies  that are  really used. Androgens are thought to activate telomerase. Certainly, they're used in bone marrow  failure  for patients with DC,  and  there's one  theory  that they act  in part by activating TERT, but  that would be  ‐‐  if  the patient's taking that, it would presumably act on any cell that's expressing TERT. 

   I  think  the  challenge  of  activating  telomere  lengthening  mechanisms 

were needed  therapeutically or  for whether or not someone was  trying to use a rejuvenating therapy  in general or  for actual therapy would be the same as other challenges in creating drugs that target specific tissues. 

   If you manipulate TERC for instance, you could end up targeting cells that 

were  naturally  expressing  telomerase  because  the  increase  in  TERC would only manifest as increased telomerase in the cells expressing TERT, but otherwise, I can't think of easy ways to target therapy specifically just to certain cells. 

 

25

Sean Sanders:  Dr. Reddel, coming back to you,  is there a telomerase or ALT assay that might work on frozen whole blood samples? 

 [0:50:01]  Dr. Roger Reddel:  Telomerase and ALT on frozen ‐‐ so for telomerase, if the cells have been 

froze,  if  they've  been  frozen  in  a  viable  state  and  telomerase  activity assay can be done on those, then there's no problem there. 

   With ALT, there are a number of options. The short answer is "yes" and it 

can be done by extracting DNA for C‐Circle assays or the frozen material could  be  processed  for  sectioning  and  immunofluorescence  for  ALT‐associated to PML bodies. 

 Sean Sanders:  Excellent. Let me stay with you actually for another question, and that is 

the G‐quartet that you talked about early on in your presentation, is this always  present  at  telomeres  or  is  it  preferentially  formed  during  a physiological process during  the  cell  cycle? Do  you have  an  answer  for that? 

 Dr. Roger Reddel:  It's  really early days  for  that;  the  labs working on  this have  really only 

developed the tools for studying  it  in cells  in very recent years. Up until now,  it's been known that telomeric DNA and other G‐rich DNA do form G‐quadruplexes  in vitro and  it's taken the development of some specific antibodies to show that they do occur at telomeres. 

   Beyond  that, how many of  the  telomeres have G‐quadruplex  formation 

and  for what  percentage  of  the  time,  I  think  there's more work  that needs to be done. 

 Sean Sanders:  Dr. Agarwal, did you have any comments on that?  Dr. Suneet Agarwal:  No. I can't comment unfortunately on G‐quadruplex.  Sean Sanders:  Okay.  No  problem.  Well,  I  have  a  question  for  you.  What  are  other 

common  types  of  cancers  among  DC  patients  and  have  these  been identified as telomerase or ALT cancers as described by Dr. Reddel, and is there a correlation? 

 Dr. Suneet Agarwal:  I think that's a great and fundamental question. Why should patients with 

DC who have a telomere defect have a predisposition to malignancy and then  what  is  sustaining  that  malignancy's  replicative  state?  They  get myeloid cancers, blood cancers, and they typically can get also squamous cell cancers of  the head, neck, and anogenital  regions,  so basically  skin 

26

surfaces and blood cells which are already degenerating as a process of these. 

   The real answer is that this actually just has not been studied adequately 

and part of it has been a difficulty in a coordinated effort to get samples, but  really once  those samples are obtained as described by Dr. Reddel, there'll be several methods of actually determining what their state was in terms of telomerase sufficiency or ALT. 

   The patients have hypomorphic mutation, so  it  is possible that they are 

still dependent on  telomerase.  It wouldn't have  to be  that  they use an alternative mechanism, but it just has not been studied. 

 Sean Sanders:  Next  question  I'm  going  to  put  to  both  of  you,  and  I'll  start with  Dr. 

Reddel  ‐‐  I'm  actually  going  to  combine  two  questions  ‐‐  is  there  a quantitative cellular response directly co‐relatable with telomere length? The other part of  that  is how do cells monitor  telomere  length? Do we know anything about that? 

 Dr. Roger Reddel:  The  answer  to  both  of  those  questions  pretty much  is  known.  There's 

more known about monitoring of telomere lengths. It appears to involve some of the proteins, which typically bind to telomeres. Beyond that, we have very little information. 

 Sean Sanders:  Dr. Agarwal, anything to add to that one?  Dr. Suneet Agarwal:  I can speak to just a laboratory observation that's been there for a while, 

and that's if you have patients who have dyskeratosis congenita or short telomeres,  their explants such as  fibroblasts show very obvious signs of senescence, various morphological and obviously cell cycle problems that are indicative. 

   So  you  can  see  morphologically  abnormalities.  They  do  express 

senescence‐associated  beta‐galactosidase,  things  that  would  be associated with  senescence  in general. Essentially,  the converse  is  then true  that  if  you  restore  their  telomerase  activity  or  overcome  their problem  in vitro, they take on a better, a more normal morphology and stop  the  senescence pathway,  so  that could be viewed,  I  suppose, as a correlate of a phenotype of telomere length. 

 Sean Sanders:  All right. Related to that, have you seen any shelterin protein variations 

or mutations in DC?  [0:55:03] 

27

 Dr. Suneet Agarwal:  Sharon  Savage  and  colleagues  and  also  subsequently  Dokal  and 

colleagues described  in a  substantial proportion of DC patients both de novo  and  autosomal  dominantly  inherited  mutations  in  TINF2,  which encodes the TIN2 component of shelterin, and that's the main one.  

   In  DC  itself,  Dr.  Savage's  group  had  also  surveyed  other  shelterin 

components and did not find any mutations  in the registry samples they had.  It's possible that there may be some that pop up  in rare cases, but certainly shelterin mutations are associated with DC. 

 Sean Sanders:  Great! We are almost out of  time.  I'm going  to give you  just one more 

question that actually just came in and I thought was an interesting one. I think we'll start with you, Dr. Reddel. Has there been any attempt to link any  signaling pathways  to  telomere maintenance  specifically  related  to cell surface antigens? 

 Dr. Roger Reddel:  They  have,  although  that's  a  little  bit  controversial  at  the  moment. 

There's more  known  about  the  signaling pathway  as  a  consequence of telomere dysfunction,  so when  the  telomeres get  very  short,  there are various signaling pathways that are activated and to do with DNA repair mediated  by  ATM  or  alternately  by  ATR DNA  repair  signaling  pathway proteins. 

 Sean Sanders:  Dr. Agarwal, last word to you.  Dr. Suneet Agarwal:  I don't have  anything  to  add  about  the  cell  surface  signaling pathways 

leading  to  telomere  extension.  It  certainly would  be  very  interesting  if there were some. 

 Sean Sanders:  Excellent!  Well,  it  sounds  like  there's  still  a  lot  of  work  to  do,  but 

unfortunately we are out of time for this webinar. I want to thank both of our  speakers  very  much  for  their  wonderful  presentations  and  the engaging discussion. 

 Slide 69    On behalf of myself  and our  viewing  audience,  thank  you  to Dr. Roger 

Reddel  from  Children's  Medical  Research  Institute  and  Dr.  Suneet Agarwal from Boston Children's Hospital. 

   Please go to the URL now at the bottom of your slide view to learn more 

about  resources  related  to  today's  discussion  and  look  out  for  more webinars  from  Science  available  at  webinar.sciencemag.org.  This 

28

particular webinar will be made available to you again as an on‐demand presentation within about 48 hours from now. 

   We're  interested to know what you thought of the webinar. Send us an 

email at the address now up in your slide viewer, webinar@aaas.org.    Again,  thank  you  very much  to  our  panel  and  to  PerkinElmer  for  their 

kind sponsorship of today's educational seminar. Goodbye.   [0:57:45]  End of Audio