AnastasiaCindy Espreancelly SJauza NurriantiM Wildan Shalli RPutri SariBioteknologi FarmasiStem Cell

Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future directionOUTLINE :

Pendahuluan : Stem CellMultipotent and Pluripotent Stem CellsMicrocarrier TechnologyPropagation and Differentiation Human Pluripotent Stem Cell

PENDAHULUAN : STEM CELLStem cell atau sel induk adalah sel yang mempunyai kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi berbagai macam sel dan mempunyai kemampuan untuk meregenerasi dirinya sendiri (self renewal)

TIPE STEM CELL

PERBEDAAN

pluripotent stem cellstissue stem cellsKemampuan berdiferensiasiBersifat pluripotent : mampu berdiferensiasi menjadi berbagai macam sel dalam tubuh manusia kecuali sel yang dibutuhkan untuk embrio, seperti plasentaBersifat multipotent: hanyadapat berdiferensiasi menjadi sel-sel jaringan dimana sel ini ditemukanPeranan di dalam tubuhMengubah embrio menjadi manusiaMenggantikan sel yang rusak atau yang lukaTempat ditemukanembrioOrgan dan jaringan-jaringan, seperti sumsum tulang belakang, darah, jaringan adiposa, otot, sistem saraf, otak dan kulit.

Multipotent and Pluripotent Stem Cells

PLURIPOTENT STEM CELLS, hESCs dan hiPSCsHuman embryonic stem cells (hESCs) yang pertama diperoleh pada tahun 1998 oleh James ThomsonDengan menggunakan sisa blastosit beku dari pasangan yang ingin melakukan fertilisasi in vitro (IVF)Blastosit dikultur dari embrio yang mengalami pembelahan awal, kemudain 14 inner cell masses (ICM) diisolasi dari blastosis. Dihasilkan lima baris sel dari isolasi tersebut.(Thomson et al., 1998).

ContdPada tahun 2007, Takahashi dan Yamanaka menemukan metode baru, yang disebut induced pluripotent stem cells (hiPSCs).Menghasilkan sifat pluripotent yang sama dengan hESCsDengan cara mentransfeksi 4 gen ke dalam fibroblast manusia (Takahashi et al., 2007).

PERKEMBANGANPada awalanya, hESCs diperoleh dari tikus (Thomson et al., 1998).Karena digunakan untuk terapi sel, maka dicari alternatif lain (selain hewan), untuk menghindari potensi pindahnya patogen ke dalam selmTeSR1 hESC PHPL dan StemPRO hESC SFM adalah media yang paling cocok untuk mengkultur hESCs

Kemampuan DiferensiasiFleksibilitas dari hESCs dan hiPSCs menjadi beberapa jenis sel dalam tubuh menjadikan mereka kandidat yang menarik bagi studi perkembangan biologi. Diharapkan bahwa sel-sel ini pada akhirnya dapat menemukan aplikasi dalam terapi sel.

Biasanya, diferensiasi in vitro hESCs menjadi tiga lapisan germ membutuhkan terbentuknya embryoid bodies (EBs), di mana sel agregat berada dalam suspensi.EBs dapat berdiferensiasi menjadi endoderm primitif, endoderm definitif, mesoderm, ektoderm, dan trophectoderma.Sampai saat ini, neuron, glia, sel endotel, kardiomiosit, keratinosit, sel-sel mirip hepatosit, prekursor hematopoietik, sel osteogenik, sel yang memproduksi insulin, jaringan prostat, sel lemak dan melanosit telah didiferensiasi dari hESC

hESCs telah berdiferensiasi menjadi 80% sel endoderm definitif dalam serum rendah dan Activin A. Sel lebih matang dari organ endodermal yang dihasilkan dari sel-sel endoderm definitif ini setelah transplantasi dibawah kapsul ginjal.Agregat sel endodermal mengekspresikan berbagai gen penanda, seperti HNF6, FOXA2 dan PDX1 yang menunjukkan bahwa mereka berasal dari endoderm pankreas.

Potensi Aplikasi dan Uji KlinisSaat ini, hanya sedikit terapi pada manusia yang melibatkan hESC dibandingkan dengan MSC. Hal ini disebabkan oleh karena kekhawatiran tentang tumorigensitas sel-sel ini.

Cedera Tulang BelakangDelapan sampai sepuluh pasien dengan cedera tulang belakang yang parah direkrut dalam fase 1 percobaan, untuk menguji keamanan dari sel progenitor oligodendrocyte (OPC).Dalam treatment ini, koktail faktor pertumbuhan digunakan untuk menginduksi hESCs ke OPC sebelum mereka disuntikkan ke sumsum tulang belakang yang mengalami cedera.Oligodendrocytes berperan dalam mendukung sel saraf untuk mengembalikan konduksi saraf.

CondUji praklinik sebelumnya dilakukan pada tikus dewasa menunjukkan bahwa hESC-derived OPC yang ditransplantasikan meningkatkan remyelination dan mempromosikan peningkatan fungsi motorik.Tujuan dari uji klinis fase 1 adalah untuk meningkatkan perbaikan isolasi myelin di sekitar sel-sel saraf dan dengan demikian membangun kembali kemampuan sumsum tulang belakang untuk mengirimkan sinyal.

Transplantasi Retinal pigment epithelial (RPE)Sel-sel RPE adalah turunan dari neuroectoderm yang sangat penting untuk kelangsungan hidup fotoreseptor.Dalam age-related macular degeneration (AMD), sel-sel RPE berdegenerasi dan tidak dapat diganti. Studi menggunakan model hewan telah menunjukkan bahwa sel-sel RPE dapat diganti dengan transplantasi sel donor RPE. hESC baru-baru ini terbukti menjadi sumber yang sangat baik untuk menghasilkan sel-sel RPE.

CondSel-sel hESC-derived RPE ini telah menunjukkan profil ekspresi gen yang menyerupai RPE manusia.Tiga studi sebelumnya telah memanfaatkan protokol yang berbeda pada mouse sel embrio stem (mESC) dan hESC untuk membentuk sel-sel RPE sebelum transplantasi dan tidak menemukan bukti adanya tumor, sehingga menunjukkan potensi dalam mengobati AMD.

Models of disease dan drug screening hiPSC dapat dihasilkan dari sampel pasien dari berbagai macam penyakit, hiPSC berpotensi untuk digunakan dalam banyak model penyakit.Misalnya, hiPSCs dapat menjadi contoh yang bermanfaat untuk mempelajari perkembangan pasien dengan penyakit sporadis, Parkinson, Alzheimer, juvenile-onset, DM tipe I, dan Duchenne jenis distrofi otot.hiPSC juga dapat digunakan untuk skrining obat untuk cardiotoxicity untuk mengurangi attrition rate dari perkembangan obat.

Microcarrier Technology

Microcarrier (MC) TeknologyDibutuhkan suatu teknologi untuk menghasilkan sel dalam jumlah besar untuk terapi klinik.

Oleh sebab itu, perlu dipelajari Teknologi Mikrokarier

Culturing of anchorage dependent cells on MCKultur Teknologi Mikrokarier ini, sel di propagasi di permukaan dari suspensi partikel padat di medium pertumbuhan dengan agitasi lambat

Sel akan terikat dan tumbuh di permukaan mikrokarier

Advantages of the MC culturing systemsSistem Mikrokarier merupakan operasi unit dimana kedua monolayer dari kultur suspensi dibawa bersamaan

Ada beberapa keuntungan dari sistem ini

Permukaan yang tinggi terhadap rasio volume dapat ditingkatkan dengan mudah dengan mengganti konsentrasi mikrokarierPengadukan Suspensi Mikrokarier yang homogen dapat memonitor dan mengontrol variasi paramater lingkungan

Kultur Mikrokarier dapat di scale up dengan mudah di stainless steel konvensionalMikrokarier dapat digunakan untuk propagasi sel di kultur 3 dimensi

General requirements and properties of MCsPermukaan MikrokarierBentuk dan UkuranTransparan dan tahan panas

Commercial MCs

Variasi yang luas dari Mikrokarier tersedia secara komersial, memberikan peneliti keuntungan dalam memilih mikrokarierMikrokarier komersil ini didesain sesuai dengan kebutuhan propagasi untuk produksi vaksin dan biofarmasetik

Propagation and Differentiation Human Pluripotent Stem Cell

Scaling up MC culture for hPSC expansionBeberapa penelitian telah menunjukkan kemungkinan meningkatkan ekspansi hESC dalam suspensi dengan menggunakan termos pemintal sederhana (50-150 ml) tanpa kontrol pH dan oksigen

Serra et al. (2010) menggabungkan teknologi MC dalam bioreaktor dengan kontrol otomatis untuk menunjukkan skalabilitas dan standarisasi platform MC untuk ekspansi hESC

Lalu dihasilkanlah 2.17 106 sel/ml dalam 11 hari dengan kepadatan pembenihan 1,5 105 sel / ml, mencapai ekspansi 15 kali lipat

Parameter kunci yang perlu diselidiki untuk pengembangan skala besar sistem hESC MC yang efisien yaitu prosedur pembenihan dan transfer sel, oksigen terlarut, kontrol pH dan efek agitasi

Prosedur PembenihanSecara konvensional, sel adherent dikultur pada termos kultur jaringan yang dipisahkan ke dalam sel tunggal enzimatis sebelum dibenihkan ke MC untuk menghasilkan pemerataan sel di MC

Upaya awal kultur hESCs di MCs menunjukkan bahwa adaptasi hESCs ke sel tunggal merupakan langkah penting untuk inisiasi kultur hESCs MC.

Sel tunggal memiliki kelangsungan hidup yang lebih baik dibandingkan dengan agregat perbenihan yang dihasilkan dari treatment kolagenase.

Namun, kemudian diketahui kalau perbenihan segumpal hPSC juga dapat memberikan hasil sel yang serupa.

Untuk mendapatkan pembenihan segumpal sel 2D hPSC untuk inisiasi ke kultur MC secara konsisten, suatu studi menggunakan sel scrapper (EZ passage tool, life technologies) yang akan menghasilkan gumpalan sel yang seragam. Pada kondisi yang statis, agregat sel MC ini akan meluas dengan melekat ke dekat MC atau agregat sel MC. Berikutnya dapat dilakukan dengan hanya menambahkan sebagian kecil MCs yang dilapisi dengan sel untuk menjadi MC yang baru. Jadi, pembenihan sel tunggal tidak terlalu penting untuk menyebarkan sel-sel pada MCs melainkan penting untuk menghasilkan agregat sel-MC yang seragam.

Oksigen TerlarutOksigen merupakan salah satu parameter yang dapat mempengaruhi pertumbuhan hESC dan pluripotency, namun terdapat laporan yang bertentangan mengenai level oksigen optimal yang dibutuhkan hESCs.

Ada laporan yang menunjukkan kondisi hypoxic lebih disukasi untuk pertumbuhan hESCs dan pemeliharaan in vitro pluripotency.

Sedangkan, Serra et al. (2010) menunjukkan bahwa kontrol oksigen terlarut pada 30% saturasi udara menghasilkan pertumbuhan sel yang lebih baik dibandingkan dengan 5% saturasi udara (kondisi hypoxic) dalam cotrolled bioreactor

Lalu disimpulkan bahwa perbedaan level oksigen tidak memiliki efek signifikan pada tingkat ekspresi pluripotent marker SSEA 4. Sehingga harus dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menyelesaikan kontroversi tersebut.

AgitasiLock and Tzanakakis (2009) menunjukkan bahwa penyebaran hESCs pada MC dalam labu spinner sensitif dengan tingkat kecepatan agitasi.Kecepatan pengadukan tinggi (80 rpm) menghasilkan hasil sel yang lebih rendah dan meningkatkan waktu 2 kali lipat jika dibandingkan dengan kecepatan agitasi rendah (45 rpm).Studi lain menyebutkan bahwa hESC lines berbeda yang disebarkan di MC dapat memberikan respon berbeda terhadap agitasi.

Pada kondisi agitasi yang sama, HES-3 menunjukkan penurunan ekspresi pluripotent marker, sedangkan tidak ada perubahan signifikan yang diamati pada HES-2 (Leung et al., 2010)

Tidak terjadi peningkatan yang teramati ketika dilakukan penambahan 5 jenis polimer pelindung sel yang berbeda (pluronic-F68, dekstran, metilselulosa, polietilen glikol, dan asam hyaluronic) ke dalam kultur HES-3 MC yang telah teragitasi

Sifat dari lapisan MC juga dapat mempengaruhi sensitivitas hESC terhadap agitasi. HES-3 yang disebarkan dalam agitated spinner flask yang dilapisi MC dengan lapisan laminin menunjukkan penurunan yang signifikan dalam ekspresi pluripotent marker bila dibandingkan dengan yang dilapisi oleh Matrigel. Bardy et al. (2013) menunjukkan bahwa hiPSc (IMR90) yang disebarkan pada MC memperlihatkan peningkatan ekspresi pluripotent marker pada kondisi agitasi ketika medium pertukaran (80% dari total volume kultur) diberikan 2 kali dan bukan sekali per hari.

Hal ini menunjukkan bahwa kondisi metabolik pada kultur agitasi dapat berkontribusi menghilangkan pluripotency (tingginya level laktat atau pH rendah yang dihasilkan dalam kultur dengan densitas tinggi).

Kesimpulannya, sensitivitas hPSCs pada agitasi dapat adikaitkan tidak hanya oleh kecepatan agitasi tapi juga oleh hPSC lines, lingkungan kultur dan lapisan pada MC.

Cell HarvestingPemilihan prosedur dan kondisi yang sesuai untuk memanen sel dari MCs sangat penting agar proses sukses. Enzim proteolitik rekombinan Tryple Express, secara rutin digunakan untuk melepaskan hESCs dari MC lalu diikuti dengan penyaringan menggunakan saringan 40 m untuk menghilangkan MCs (Oh et al., 2009). Studi ini menunjukkan bahwa sel-sel panen tersebut dapat dibudidayakan kemudian ke MCs yang segar dan menghasilkan sel yang sama dengan yang dibenihkan dari agregat sel MC yang dipisahkan secara mekanis.

Lock dan Tzanakakis (2009) memanen sel endoderm definitif dari MCs menggunakan kolagenase.

Lecina et al. (2010) mengembangkan metode panen yang berbeda untuk cardiomyocytes dari MCs yang menggunakan 2 enzim (kolagenase IV dan trypsin) berturut-turut.

Metode dan kondisi panen sel bergantung pada jenis sel dan sifat MC.

Metode-metode ini dirancang untuk skala kecil dan tidak dapat secara langsung untuk proses scale up.

Sistem yang dikembangkan untuk panen adherent cell lines lain dalam skala besar dapat disesuaikan dengan hPSCs.

Sebagai contoh, Lindskog et al. (1987) memperlihatkan penggunaan dextranase untuk menghilangkan kultur sel pada MC dengan basis dextran.

Billig et al. (1983) memperlihatkan bahwa pemisahan sel MC dapat dilakukan dengan cara diferensial sentrifugasi dengan Ficoll-Paque.

Rho-kinase inhibitor Y27632, diketahui efektif dalam mencegah pemisahan hPSC ketika apoptosis Selain itu, karena sel panen merupakan produk yang utama, partikel-partikel sisa lainnya dari MC harus dihilangkan.Perkembangan terakhir pada MC termo-sensitif memungkinkan adanya pelepasan sel melalui perubahan temperatur tanpa adanya penggunaan enzim proteolitik. Misalnya yang telah banyak dipelajari yaitu polimer termo-sensitif seperti poli-N-isopropylacrylamide (pNIPAAm). Mengkultur sel pada pNIPAAm ditambah MCs (misal Cytodex 3, polystyrene, alginat, dan polyhydroxy etyl methacrylate) telah terbukti terjadi pelepasan sel yang efisien dengan menurunkan temperatur kultur dari 37C menjadi dibawah 30C

DifferentiationSel-sel progenitor hESCs terdiferensiasi atau intermediet diperlukan untuk terapi sel.

Oleh karena itu akan sangat ideal untuk mengkombinasikan ekspansi dan diferensiasi hESCs pada MC dalam bioreaktor.

Namun, tantangannya adalah dalam membangun sebuah platform berbasis MC yang terintegrasi harus mempertimbangkan banyak protokol berbeda yang membutuhkan beberapa manipulasi fisik termasuk replating, co-culturing, seleksi sel atau passaging.

Beberapa kelompok peneliti cukup sukses dalam usaha tersebut, misalnya Lock dan Tzanakakis (2009) memperlihatkan generasi FOXA2 dan SOX17 positif endoderm definitif setelah ekspansi hESC pada MCs.

Efisiensi pada MC secara signifikan lebih tinggi (84,2%) jika dibandingkan dengan kultur 2D yang menjadi 63,2%.

Diferensiasi cardiomyocyte merupakan kondisi dimana MC bermain peran penting dalam memenuhi kebutuhan untuk menghasilkan jumlah besar sel yang diperlukan untuk terapi infrak jantung.

Lecina et al. (2010) menskrining 2 MCs yang berbeda dan menemukan protamine yang dilapisi TSKge1 Tresyl-5PW (Tosoh Bioscience) MC ( 10 mm) merupakan MCs yang paling optimal untuk diferensiasi cardiomyocite.

Efisiensinya 2-3 kali lipat lebih tinggi dalam kultur MC dengan 0,28-0,62 cardiomyocyte yang dihasilkan per hESC dibandingkan dengan 0,13-0,22 melalui pembentukan badan embryoid.

Bardy et al. (2013) juga telah memberikan kemajuan dalam diferensiasi saraf dengan MCs, yaitu dengan mengkombinasikan 7 hari ekspansi hESC dengan pembenihan 2 x 105 sel/ml dan 16 hari diferensiasi saraf pada MCs. Lebih dari 300 PSA-NCAM positif sel saraf progenitor (NPC) per hESC telah dihasilkan.

KesimpulanUntuk membuat platform MC yang layak, ada kebutuhan untuk mengoptimalkan sifat MCs (misalnya penyalut, ukuran, dan bahan).

Selain itu, karena ada kebutuhan untuk mempertahankan pluripotency pada fase ekspansi dan mendapatkan diferensiasi yang efisien pada tahap berikutnya, MCs dapat juga direkayasa dengan memasukkan sifat inovatif lain seperti enkapsulasi faktor pertumbuhan dan matriks bio-aktif, yang dapat memfasilitasi ekspansi hPSC, diferensiasi dan juga transplantasi in vivo.

Di samping masalah yang berkaitan dengan struktur MC dan komposisinya, ada kebutuhan untuk mengembangkan sistem skala besar yang khusus karena platform hPSC MC tidak mudah disesuaikan dengan bioreaktor konvensional karena adanya efek shear stress. Selain itu juga harga yang terjangkau dari media yang xeno-free, regimen makan yang efisien, pengembangan ekspansi sel terintegrasi dan proses diferensiasi, serta seleksi dari sel-sel yang diinginkan masih tetap diperlukan.

Platform MC klasik yang dikembangkan untuk produksi biologi sel adherent kurang optimal pada stem cells. Diperlukan modifikasi teknologi MC dan proses terkait yang harus disesuaikan dengan kebutuhan stem cells dan aplikasi klinis yang akan digunakan nantinya.

ReferensiAllen KC, Shaul R, Steve KWO. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnology Advances. 2013;31:1032-1046.