spectrophotométrie appliquée aux biomolécules
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UNIVERSITEdeTOURSFACULTEDESSCIENCESETTECHNIQUES
TOURS
LicenceL1SciencesdelaVie
MentionSciencesduVivant
TRAVAUXPRATIQUESdeBIOCHIMIESTRUCTURALE
Spectrophotométrieappliquéeauxbiomolécules
NB:BLOUSEOBLIGATOIREpourentrerensalledeT.P.
Matérielsindispensables:Calculatrice+marqueurindélébile
SALLES070(sous-solbâtL)
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Utilisationdesmicropipettes
Les3micropipetteslespluscourantesenlaboratoire:
Micropipette volumespossiblesàprélever
P1000 100-1000µl
P200 20-200µl
P20 2-20µl
Commentpipeter:
1)Réglerlapipetteauvolumedésiré
2)Mettreuncône
3)Préleverleliquide 4)transférerleliquide
Illustrationsextraitesdehttp://bioutils.unige.ch/experiences/info_pipettes.php
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2. Spectrophotométrie moléculaire appliquée aux biomolécules
� Spectrophotométrie d’absorption UV-vis
� Fluorimétrie
� Spectroscopie infrarouge
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2.1 Principes de la spectrophotométrie d’absorption UV-vis
� La spectrophotométrie d’absorption consiste à mesurer l’atténuation de la lumière traversant un milieu pour en tirer les concentrations dessubstances absorbantes (chromophores).
� Longueurs d’onde balayées: ~200 à 800 nm (UV-vis)
Intensité de la lumière
incidente
Io (�)
Intensité de la lumière
transmise
I (�)
échantillon
bE0
E1
E2
Éne
rgie 1er état
excité
2è état excité
h�
h�
état initial
Niveaux d’énergie plus élevée
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Schéma d’un spectrophotomètre UV/vis à double faisceau
A
��(nm)
�max
400 700
Spectre absorption: A = f(�)
(www.chez.com/dalmeyda/cours/spectro/UV-spectro.htm)
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Loi de Beer-Lambert
� Loi de Beer-Lambert:
� Si c est exprimée en concentration molaire, � est l’absorptivité molaire (en M-1cm-1).
� Si c est exprimée en mg/mL, � est l’absorptivité massique(en mL/(mg·cm)).
bcII
A o )()()(
log)( �����
��A (�max)
c (mol/L)0
Ainconnu
cinconnu
Courbe d’étalonnage
I. INTRODUCTION
Principedelaspectrophotométrie
La spectrophotométrie est uneméthode analytique quantitative, rapide et non dénaturante, quipermetdemesurerl'absorbance(A)d'unesubstancechimiquedonnéeensolution.L'absorbancedesolutionsestdéterminéeparunspectrophotomètrepréalablementétalonnésurlalongueurd'onde(λ)del'espèceàétudier.
La spectrophotométrie consiste à mesurer la lumière traversant un milieu contenant une ouplusieurs substances absorbantes (chromophores). Lorsqu'un faisceau d'intensité Io traverse unesolutioncontenantunesubstancedissoute (échantillon) ilestpartiellementabsorbéet le faisceauémergeantIpossèdeuneintensitéinférieure.PluslasubstanceabsorbanteestconcentréepluselleabsorbelalumièredansleslimitesdeproportionnalitéénoncéesparlaloideBeer-Lambert.
REMARQUE:Lavaleuraffichéeparlespectrophotomètreestl'absorbance(A)àlalongueurd'onde
étudiée (λ). A est une valeur sans unité. La spectrophotométrie UV-visible emploie le spectre
comprisentre200et800nm.
Application
La spectrophotométrie est utilisée dans beaucoup de domaines: chimie, pharmacie,environnement,agroalimentaire,biologieetc.,aussibienaulaboratoirequesursiteindustriel.
Exemples d'applications: Dosage (détermination d'une concentration inconnue d'une substancechimique),suividelacinétiqued'uneréactionchimique,analysesstructurales(spectresUV),etc.Dans l’analysedesprotéines, ilestsoitnécessaired’identifier les fractionscontenantdesprotéines(ex:présenced'acidesaminésaromatiques:Phe, Tyret Trp)oudedéterminer la concentrationdeprotéinesdansunéchantillonpurifié.
l ε(λ) = coefficientd'extinctionmolaire
dusoluté(M-1.cm-1)ou(mol-1.L.cm-1)
l =longueurdutrajetparcouruparlalumièredanslasolution(cm)
c=concentrationdusoluté(Moumol.L-1)
ε.l.c
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II. PARTIEEXPERIMENTALE
1. Préparationd'untamponphosphatedesodium0,1M,pH7,4
EnBiologie,l’étudedesprotéinesnécessitedetravaillerdansunmilieutamponnéafindeminimiserlesvariationsdepH.Pour lesmêmesraisons, lesmesuresd’activitéenzymatiquese fontenmilieutamponné,àunpHcorrespondantaumaximumdel’activitédel’enzymeétudiée.
Un des systèmes tampon les plus utilisés dans les laboratoires de recherche est le systèmephosphateparcequ’ilpermetd’obtenirdesconditionsprochesdesconditionsphysiologiques(forceioniqueetpH).
Au cours de la première partie de la séance de TP, vous préparerez un tampon phosphate desodium 0,1 M, pH 7,4, à partir d’une solution d’acide faible (NaH2PO4, 0,1 M) et de sa baseconjuguée(Na2HPO4,0,1M).
2. Déterminationdelaconcentrationd’uneprotéineensolution
La concentration d’une protéine dans un échantillon inconnu peut être déterminée à partir de savaleurdeε(danslarégiondelinéaritédelaloiBeer-Lambert)ouàpartird'unecourbed’étalonnagepréparéeavecdeséchantillonscontenantdifférentesconcentrationsdelaprotéineenquestion.
AucoursdeladeuxièmepartieduTP,vouscalculerezlaconcentrationdevotreprotéinepurifiée,aprèsavoirdéterminésoncoefficientd’extinctionmolaire.
III. MANIPULATIONS
1. Préparationd'untamponphosphatedesodium0,1M,pH7,4(Volumefinal=50mL)
- MesurerlepHdesdeuxsolutionsNaH2PO4(0,1M)etNa2HPO4(0,1M).- Lasolutionbasique(40mL)estplacéedansunbéchercontenantunbarreauaimanté.L’autresolution(NaH2PO4,0,1M)vaserviràajusterlepH.- Placer lebécher sur l’agitateurmagnétiqueaupostepH-mètre.Avec la solutionacideet àl’aidedelapipetteP1000,ajusterd’abordjusqu’àpH8,puisaveclaP200jusqu’àpH7,4.
2. Déterminationdelaconcentrationenprotéined'unéchantillonparspectrophotométrie
*Préparationdelagammed'étalonnage
Vousdisposezd'untamponphosphatedesodium0,1M,pH7,4(prêtàl'emploi)etd’unesolutiondeprotéinenotéeHouA,correspondantàl'unedes2protéinessuivantesdeconcentrationconnue:
Hémoglobine(H)d’érythrocytesbovins:solutionà1,5mg/mL,MM=67000g/mole(67kDa)
Albumine(A)sériquebovine:solutionà10mg/mL,MM=69000g/mole(69kDa)
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A l’aide des pipettes, P1000 et P200, distribuer, comme indiqué dans le tableau ci-dessous, lesvolumesdetamponphosphateà0,1M,pH7,4,dans7tubesàhémolyseidentifiésde1à7.
Ajoutezensuitelesvolumesnécessairesdesolutiondeprotéinepréalablementhomogénéisée.
N°tube 1 2 3 4 5 6 7
Solutiontampon(µL) 1000 950 900 850 800 750 700
Solutiondeprotéine(HouA)(µL) 0 50 100 150 200 250 300
Lorsquelagammepourlacourbed'étalonnageestprête,veillezàbienagiterlestubesauvortex.
*Préparationdel’échantillondeconcentrationinconnue
Vous disposez également d’une solution de votre protéine (échantillon) à une concentrationinconnue,notée:(H1,H2,H3,H4,H5ouH6)ou(A1,A2,A3,A4,A5ouA6).
A l’aide des pipettes, P1000 et P200, distribuez, comme indiqué dans le tableau ci-dessous, lesvolumesdetamponphosphateà0,1M,pH7,4,dans3tubesàhémolyseidentifiésdeE1àE3.
Ajoutezensuitelesvolumesnécessairesd’échantillon(protéinedeconcentrationinconnue).
N°tube E1 E2 E3Solutiontampon(µL) 925 875 775
Echantillon(µL) 75 125 225
Lorsquelesdilutionssontprêtes,veillezàbienagiterlestubesauvortex.
1. Fairelespectred’absorptiondel’échantillon
Aupréalable,effectuez(enprésenceduresponsabledelaséancedeTP)lacalibrationdelalignedebaseduspectrophotomètreaveclasolutiontamponuniquementdansunecuvette(volumefinal=1mL).Mettezdansl'autrecuvettevotreéchantillonE2etfairesonspectred'absorptionentre250et500nm.Choisissezlalongueurd'ondecorrespondantaumaximumd'absorbanceetàlaquellevousréaliserezensuitelesmesuresd'absorbance.
2. Mesuredel’absorbancedevosdifférentessolutions
Mesurerl’absorbanceàlalongueurd’ondeadéquate:
-devotregammedesolutionsétalon(tubes1-7)
-del’échantillondeconcentrationinconnue(E1,E2etE3)
3. Calculdelaconcentrationdevotreéchantillon
Calculer la concentration molaire et massique des solutions étalon (tubes 1-7) et de votreéchantillon.
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IV.COMPTE-RENDU
N’oublierpasd’indiqueravecquelleprotéinevousaveztravaillé.
- Expliquer,defaçonconcise, lebutdeceTPet leprincipede ladéterminationde la
concentrationenprotéined’unesolutionparspectrophotométrie.
- Identifier à quel spectre d'absorption de protéine (X ou Y) correspond votre
échantillon(HémoglobineouAlbumine).
- Remplirletableaudel’absorbance(enindiquantàquellelongueurvoustravaillez)en
fonctiondelaconcentrationmolaireenprotéinedelagammed’étalonnage.
- Tracersurpapiermillimétréladroited’étalonnagedel’absorbance=f(concentration
molaire).Calculergraphiquementlaconcentrationmolaire,massiqueainsiquelecoefficient
d’extinctionmolaire:ε(λ)devotreprotéine.
- Détaillervoscalculs.
-Exerciced'application:voirleCR