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Western Blot
¿En qué consiste el
Western Blot?
• También llamado Inmunoblot • Técnica utilizada para identificar una proteína en una muestra que contiene
varias proteínas
¿Cómo funciona?
• Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función de su peso molecular
• A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés • El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad
relativa en la muestra
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relativa en la muestra
Calle 1: Anticuerpo anti- β Actina (ab8226) diluido 1/1000
Calle 2: ab8226 diluido 1/10000
Calles 3-4: ab8226 diluido 1/500
Calle 1: Lisado celular HeLa (humano)
Calle 2: Lisado celular HeLa (humano)
Calle 3: Lisado celular HEK293 (humano)
Calle 4: Lisado celular 3T3 (ratón)
¿En qué casos es útil utilizar Western Blot?
¿Está la proteína de interés presente en mi muestra?
El tratamiento con un determinado agente “X”, ¿aumenta o reduce el nivel de expresión de mi proteína?
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proteína?
¿Cómo varía el nivel de expresión de la proteína en distintos tejidos o líneas celulares?
¿Mi muestra es sana o patológica? El WB permite detectar enfermedades tales como la enfermedad de Lyme, la de las vacas locas, el VIH, etc.…
Organización del Webinar
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparación de la muestra
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Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparación de la muestra
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Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
Preparación de las muestras para la electroforesis
Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas
• Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis (~1ml por cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC
• Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente
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• Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl por cada 5 µg de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300 µl de tampón, y agitar después durante 2 horas a 4 ºC
• Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo en hielo
Lisis
Mantener las muestras en hielo o a 4ºC para evitar degradación de las proteínas
Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en frío. Antes de realizar la lisis, añadir al tampón un cocktail de inhibidores de proteasas
Si la proteína de interés está fosforilada, es importante asegurarse de incluir inhibidores de fosfatasas al tampón de lisis
Elegir un tampón de lisis adecuado en función de la localización celular de la proteína
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Elegir un tampón de lisis adecuado en función de la localización celular de la proteína de interés
Localización de la proteína Tampón de lisis recomendado
Célula entera NP-40 o RIPA
Citoplasmática (soluble) Tris-HCl
Citoplasmática (citoesqueleto) Tris-Triton
Membranal NP-40 o RIPA
Nuclear RIPA
Mitocondrial RIPA
Preparación de las muestras para la electroforesis
Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas
• Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis (~1ml por cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC
• Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl por cada 5 µg de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300
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Determinar la concentración de proteínas
µl de tampón, y agitar después durante 2 horas a 4 ºC
• Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo en hielo
Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las proteínas (dímeros, estructuras terciarias)
• Añadir el tampón de carga a la muestra y calentar 5 minutos a 95-100ºC o durante 5-10 minutos a 70ºC
Condiciones reductoras y desnaturalizantes
Un tampón de carga estándar contiene SDS (dodecilsulfato sódico) y β-mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)
• El SDS desnaturaliza la proteína en su estructura primaria y la recubre de cargas negativas
• El β-mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los puentes disulfuro
• Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso molecular
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• Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso molecular mediante SDS-PAGE
• La reducción y desnaturalización permiten además la accesibilidad del anticuerpo a su sitio de unión
SDS y DTT/β-mercaptoetanol
Nota: Algunos anticuerpos solo reconocen las proteínas nativas (no reducidas y/o no desnaturalizadas). En este caso SDS y/o β-mercaptoetanol o DTT no deben añadirse a los tampones.
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparación de la muestra
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Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
SDS-PAGE
DefiniciónMétodo que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo a su movilidad electroforética
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SDS : Dodecilsulfato Sódico; PAGE : Electroforesis en gel de poliacrilamida
¿Cómo funciona?
• El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el tampón de migración. Un tampón de migración suele contener 25mM Tris; 190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3
• Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre 20 y 40 µg por calle
• Se aplica un campo eléctrico que provoca el movimiento de las proteínas hacia el polo positivo
• Al haberse tratado las proteínas con SDS (cargas negativas), las cargas
SDS-PAGE
funciona? • Al haberse tratado las proteínas con SDS (cargas negativas), las cargas endógenas de las mismas son despreciables
• El resultado es que las proteínas se separan en función de su talla, o peso molecular
• Las proteínas de menor tamaño quedan menos retenidas en la matriz del gel y por tanto migran mas rápidamente
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-
+
Corriente eléctricaFrente de migración
Geles
Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de amonio (APS) y TEMED
La estructura del gel puede modificarse alterando la proporción de acrilamida
Para proteínas pequeñas, se usa un gel con un porcentaje elevado de acrilamida, y viceversa para proteínas de gran tamaño
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Tamaño de la proteína (kDa) Porcentaje del gel
4-40 20
12-45 15
10-70 12,5
15-100 10
25-200 8
Los geles en gradiente se recomiendan en aquellos casos en los que el tamaño de la proteína es desconocida
Electroforesis en condiciones no reductoras y/o no desnaturalizantes
Forma requerida de la proteína
Condiciones electroforesis Tampón de carga
Tampón de migración
Reducida-Desnaturalizada
Reductor y desnaturalizante
Con ß-mercaptoetanol o DTT Con SDS
Con SDS
Reducida - Nativa Reductor no Con ß-mercaptoetanol o Sin SDS
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Reducida - Nativa Reductor no desnaturalizante
Con ß-mercaptoetanol o DTTSin SDS
Sin SDS
Oxidada –Desnaturalizada
No reductor y desnaturalizante
Sin ß-mercaptoetanol ni DTTCon SDS
Con SDS
Oxidada - Nativa No reductor y nativo
Sin ß-mercaptoetanol ni DTTSinSDS
Sin SDS
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparación de la muestra
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Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
Objetivo de la transferencia
Una vez realizada la electroforesis, es necesario marcar la proteína de interés para poder visualizarla
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El gel no es una superficie adecuada para poder marcar las proteínas
• Los anticuerpos no son retenidos en el gel
• Los geles son frágiles y difíciles de manipular
Por tanto, es necesario transferir las proteínas a un soporte más adecuado
¿Cómo funciona la transferencia?
El principio es similar al de PAGE, es decir, las proteínas cargadas negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo eléctrico
Se intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo
Las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposición que en el gel
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Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF). Estas últimas requieren un pretratamiento con metanol
Montaje de la transferencia
¿Transferencia en medio húmedo o semi seco?
InconvenientesVentajas
Medio Húmedo
• El gel y la membrana se intercalan y fijan firmemente entre finas esponjas y papel absorbente
• Este montaje “sándwich” se sumerge en un compartimento que contiene el tampón de transferencia donde se aplica a continuación la corriente eléctrica
El proceso de transferencia es más largo
Adecuado para proteínas grandes o difíciles de transferir
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la corriente eléctrica• Un tampón de transferencia se compone
normalmente de 25mM Tris, 190mM Glicina y 20% de Metanol
Semi Seca
• El montaje papel-gel-membrana-papel se humedece con tampón de transferencia
• El montaje se coloca directamente entre el cátodo y el ánodo donde se aplica la corriente
• El tampón de transferencia estándar suele contener 48mM Tris, 39mM Glicina, 0,04% SDS, y 20% Metanol
Más rápido La membrana puede secarse afectando a la transferencia de las proteínas
Transferencia de proteínas >100 kDa
Transferencia en medio húmedo durante la noche a 4 ºC y bajo voltaje
Añadir 0.1% SDS al tampón de transferencia para reducir la formación de
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Añadir 0.1% SDS al tampón de transferencia para reducir la formación de aglomerados en el gel
Reducir la cantidad de metanol en el tampón de transferencia a 10% o incluso menos para evitar la dispersión de proteínas en el gel
Si la membrana es de PVDF, el metanol puede retirarse completamente del tampón (sigue siendo necesario sin embargo su pre-tratamiento con metanol)
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparación de la muestra
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Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
¿Por qué se utilizan anticuerpos?
Colorantes como Coomassie pueden usarse para teñir las proteínas después de realizar el SDS-PAGE SDS3
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Pero, ¿cuál de las bandas corresponde a la proteína de interés?
El uso de anticuerpos específicos soluciona el problema detectando únicamente la proteína de interés
Lisado celular de SDS3 transfectado (ab94303) en SDS-PAGE (izquierda) y en Western Blot con el anticuerpo ab89345 anti-SDS3 (derecha).
Inmunodetección
Bloqueo de la membrana Leche, BSA, etc…
Incubación con el anticuerpo primario Anticuerpo
Epítopo
Proteína Proteína
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Lavado (TBST)
Lavado (TBST)
Incubación con anticuerpo secundario
conjugado Anticuerpo
ProteínaProteína
Detección
Proteína
Detección
Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo
Sustrato (peróxido de hidrógeno + luminol)
Producto (sensible a la luz)
Los sustratos cromogénicos (4-cloronaftol o DAB) también pueden utilizarse con las enzimas HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la membrana próximo a la zona del anticuerpo
Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo secundario conjugado a la enzima HRP, produciendo una señal que se captura en una película fotográfica
Los anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos también pueden usarse siempre y cuando se disponga de un equipo de detección especial
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ECL : Enhanced chemiluminescence
HRP : HorseRadish Peroxidase
DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride
AP : Alkaline Phosphatase
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparación de la muestra
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Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
Controles de carga
Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de proteínas en cada calle del gel de SDS PAGE es constante
Un anticuerpo control de carga detecta una proteína altamente conservada y presente en cantidades similares independientemente del tipo de muestra
Control de carga Tipo de muestra
Peso molecular (KDa) Precauciones
β Actina Célula entera / Citoplasma
42 No es válido para muestras del musculo esquelético. Cambios en las condiciones de crecimiento celular e interacciones con los componentes de la matriz extracelular pueden alterar la síntesis de
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componentes de la matriz extracelular pueden alterar la síntesis de la proteína actina (Farmer et al, 1983)
GAPDH Célula entera / Citoplasma
30-40 Algunos factores fisiológicos, como hipoxia o diabetes, aumentan el nivel de expresión de GAPDH en determinados tipos celulares
Tubulina Célula entera / Citoplasma
55 La expresión de tubulina puede variar con la resistencia a sustancias antimicrobianas y antimitóticas (Sangrajrang S. et al, 1998, Prasad V et al, 2000)
VDCA1/Porinas Mitocondria 31
COXIV Mitocondria 16 Muchas proteínas migran al mismo peso molecular (16KDa) que COXIV
Lamin B1 Núcleo 66 No es válido para muestras en las que se ha eliminado la membrana nuclear
Proteína de unión a TATA (TBP)
Núcleo 38 No es válido para muestras sin ADN
Controles de carga
Calle 1: Células HeLa (humano) a 20 µg
Calle 2: Células 3T3 (ratón) a 20 µg
Todas las calles - anticuerpo anti - Actina – control de carga (ab8227) diluído 1/1000
Nota: la afinidad del anticuerpo puede variar según la especie o naturaleza de la proteína (nativa o recombinante), etc…
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Calle 2: Células 3T3 (ratón) a 20 µg
Calle 3: Hígado de pescado a 20 µg
Calle 4: Hígado de conejo a 20 µg
Calle 5: Células MDCK (perro) a 20 µg
Calle 6: Células EBTr (bovino) a 20 µg
Calle 7: Células SL-29 (pollo) a 20 µg
Calle 8: Células CHO (Hamster chino) a 20 µg
Calle 9: Embrión de Xenopus a 20 µg
Controles positivos y negativos
Realizar en paralelo el ensayo de muestras desconocidas con muestras en las que se ha comprobado el nivel de expresión de la proteína de interés
• Proteína recombinante
• Células transfectadas con la proteína de interés
• Tejidos o líneas celulares que expresen la proteína • Tejidos o líneas celulares que expresen la proteína
Incluir también una muestra que no exprese la proteína a detectar
• Muestras knockout o siRNA
• Tejidos o líneas celulares que no expresen la proteína
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Péptidos de bloqueo
La pre-incubación del anticuerpo primario con el péptido inmunógeno permite bloquear de manera específica los sitios de unión del anticuerpo
Las bandas específicas no serán visibles en el blot ya que el anticuerpo pre-incubado no puede unirse a la proteína en la membrana
Útil para determinar si las bandas observadas corresponden a isoformas, fragmentos de la proteína o proteínas no específicas
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proteína o proteínas no específicas
Calle 1: Preparado de Histona, células HeLa
Calle 2: Preparado de Histona de células HeLa tratadas con colcemida
Calle 3: Preparación de histona de células HeLa 0,5µg con péptido de bloqueo Histona H3 – fosfo S10, trimetil K9 (ab15644) a 1 µg/ml
Calle 4: Preparación de histona de células HeLa tratadas con colcemida 0,5µg con péptido de bloqueo Histona H3 – fosfo S10, tri metil K9 (ab15644) a 1 µg/ml
Todas las calles:
Anti-Histona H3 (fosfoS10) [mAbcam 14955] - ChIP Grade (ab14955) a 1 µg/ml
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparación de la muestra
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Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
Adecuado para Western Blot
Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testados en Western Blot
Las aplicaciones en las que un anticuerpo ha sido testado se indican en la ficha técnica del anticuerpo
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Inmunógeno y especificidad
Inmunógeno: proteína específica o secuencia de amino ácidos que se inyecta en un animal para provocarle una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos específicos contra ella
La selección del inmunógeno permite producir un anticuerpo que reconozca y se fije sobre una región específica de la proteína (epítopo)
Asegurarse que la secuencia del inmunógeno está presente en la proteína de interés cuando se esté estudiando una isoforma concreta de la proteína, la forma madura o un
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NERTCRCDKP
NERTCRCDKP
cuando se esté estudiando una isoforma concreta de la proteína, la forma madura o un precursor de la misma – si no, el anticuerpo no reconocerá la proteína
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparación de la muestra
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Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
Ausencia de bandas, o bandas muy débiles
Origen del problema Solución
Incompatibilidad con el anticuerpo secundario
Seleccionar un anticuerpo secundario que sea compatible con la especie y el isotipo del anticuerpo primario (ej. Anticuerpo secundario anti-IgM de ratón con anticuerpo primario IgM hecho en ratón)
No hay suficiente proteína o anticuerpo para producir una señal
Aumentar la cantidad de lisado, de anticuerpo primario o de anticuerpo secundario (incluso una combinación de los tres)
Tiempo de incubación insuficiente para producir una señal
Incubar la membrana con el anticuerpo primario durante la noche a 4ºC
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para producir una señal durante la noche a 4ºC
La membrana no se ha bloqueado correctamente
Bloquear durante menos tiempo o usando un agente de bloqueo diferente. La adición de Tween 20 al tampón de bloqueo reduce la fijación del anticuerpo al agente de bloqueo
La proteína no se ha transferido correctamente del gel a la membrana
Comprobar que se ha producido la transferencia usando un colorante como rojo de Ponceau. Es posible que sea necesario aumentar o disminuir el tiempo de transferencia
Las proteínas hidrófobas son más difíciles de transferir
Para este tipo de proteínas usar membranas de PVDF
La muestra no expresa la proteína de interés
Revisar literatura y bases de datos sobre la proteína de interés
El anticuerpo no reconoce la proteína de interés
Verificar que la secuencia del inmunógeno está presente en la proteína a estudiar
Ruido de fondo
Origen del problema Solución
Exceso de lisado celular, anticuerpo primario o secundario que provocan uniones no específicas
Reducir la carga de proteína en el gel y/o diluir más los anticuerpos
Temperatura de incubación del anticuerpo primario muy elevada
Incubar durante la noche a 4ºC
La membrana no se ha bloqueado correctamente
Aumentar el tiempo de lavado, y añadir un detergente, como Tween 20, al tampón de lavado. Probar otro agente de bloqueo
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Probar otro agente de bloqueo
Uso de una membrana no adecuada
Las membranas de nitrocelulosa suelen dar menos ruido de fondo que las membranas de PVDF
Degradación de la proteína Optimizar la preparación de la muestra. Mantener las muestras en hielo y añadir una solución recién preparada de inhibidores de proteasas. Almacenamiento de muestras a largo plazo puede dañar las proteínas
Presencia de isoformas o fragmentos de la proteína de interés
Consultar la literatura y SwissProt
Presencia de polímeros Hervir las muestras durante 10 minutos antes de realizar la electroforesis
Optimización del tampón de bloqueo
5% leche 5% BSA
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A cada anticuerpo le corresponderá una solución de bloqueo óptima
Anti-GAPDH [mAbcam 9484] - Loading Control (ab9484) a una dilución 1/1000
5% leche5% BSA
Burbujas de aire, lavados insuficientes, transferencia incompleta
Durante la transferencia, contacto insuficiente entre el gel y la membrana
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Burbujas de aire entre el gel y la membrana durante la transferencia
Lavados insuficientes
Proteínas en estado nativo
Algunos anticuerpos presentan mayor afinidad por las estructuras nativas de las proteínas que por las formas desnaturalizadas y/o reducidas
La imagen muestra un Western Blot de colágeno III humano purificado, en la forma reducida y desnaturalizada a la izquierda, y en su forma nativa a la derecha
La estructura tridimensional del sitio de unión del anticuerpo al antígeno se pierde al desnaturalizar y reducir la proteína pierde al desnaturalizar y reducir la proteína
Forma reducida y desnaturalizada
Forma nativa
Calle 1: Proteína en su forma reducida y desnaturalizada
Calle 2: Proteína nativa (son reducir ni desnaturalizar)
Colágeno humano purificado (ab7535) a 5 µg por calle con el anticuerpo anti-colágeno III(ab6310)
Imagen cortesía de un Abreview enviado por Michaela Leyh
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Conocer la proteína de interés
Las proteínas no siempre muestran una única banda al peso molecular esperado
Posibles motivos: fragmentación de la proteína, modificaciones post -traduccionales, expresión de isoformas, propiedades isoeléctricas
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Se aconseja consultar siempre SwissProt y la literatura
-traduccionales, expresión de isoformas, propiedades isoeléctricas
Una diferencia del 10-15% respecto al tamaño esperado se considera aceptable y dentro de la normalidad
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparación de la muestra
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Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
Protocolos y material de interés
• Protocolos detallados de WBwww.abcam.com/protocols
SwissProt – www.uniprot.org
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• Guía sobre controles de carga:http://www.abcam.com/loadingcontrolguide
• Vídeo detallado sobre WB: http://www.abcam.com/westernblotguide
Guía de trucos para WB
Descarga tu guía de trucos para WB en nuestra página de protocolosO pide tu copia por e-mail: [email protected]
Reactivos para Western Blot
• Geles prefabricados y soluciones tampón optimizadas para WB
• Otros reactivos (tinción de gel, Bradford, etc …)
• www.abcam.com/Optiblot
Optiblot
• Marcadores de peso molecular pre coloreados y listos para usarMarcadores de peso
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• www.abcam.com/prismproteinladdersde peso molecular Prism
Anticuerpos secondarios AbExcel
• Anticuerpos secundarios validados para WB
• Conjugados a fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa (HRP)
• www.abcam.com/abexcel
Kits ECL• Sustratos ECL de alta sensibilidad para WB
• www.abcam.com/ecl
Optiblot – reactivos para WB
Fáciles de usar – pocillos coloreados para facilitar la carga de la muestra
Pocillos de alta capacidad y sin peine que remover
Hasta 10 veces másfuertes que los geles convencionales
Larga duración – 1-2 años de caducidad
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Todos los reactivos necesarios para tus experimentos:
• Tampones optimizados
• Optiblot Blue (ab119211) – tinción tipo Coomassie del gel en tan sólo 15 minuots
• Reactivo Bradford y ensayo BCA – compatible con detergentes en la muestra
• Otros productos – membranas PVDF de baja fluorescencia, etc …
Fáciles de abrir, sin espátulas o cuchillos
Geles compatibles con la mayoría de tanques
Más información: www.abcam.com/Optiblot
Histona H3 (fosfoT3) RabMAb
Anticuerpos monoclonales de conejo( ), óptimos para WB
RabMAb: ventajas para WB
• Alta afinidad – mayor factor de dilución (hasta 1:500.000 en algunos RabMAbs)
• Alta especificidad – señal específica, sin o con muy poco ruido de fondo
• Reconocen epítopos diversos – ideal para la detección de modificaciones post-
Anticuerpo histona H3 (fosfoT3) (ab78351), dilución 1/500,000 en HeLa.
1) Sin tratar, 2) Tratadas con FBS + Caliculina A.
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detección de modificaciones post-traduccionales (ej. fosforilación, metilación, acetilación)
• Cada RabMAb has sido testado en WB en muestras humanas, de ratón y rata para determinar la reactividad
• Más de 4000 RabMAbs disponibles
Más información: www.abcam.com/rabmabs
AbExcel anticuerpos secundarios
5 razones para usar secundarios AbExcel
• Altamente testados
• AbExcel conjugados a AP se pueden usar en diluciones de 1/5000 a 1/50000
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Más información:
AbExcel: http://www.abcam.com/AbExcel
diluciones de 1/5000 a 1/50000
• Con 1 vial de AbExcel conjugado a AP, se pueden conseguir hasta 1.500 blots (usando dilución 1/5000 en 3ml leche/BSA)
• AbExcel conjugados a HRP se pueden usar en diluciones de 1/2000 a 1/20000
• Con 1 vial de AbExcel conjugado a HRP, se pueden conseguir hasta 600 blots (usando dilución 1/2000 en 3ml leche/BSA)
Bolígrafo Luminol para membrana (ab166858)
La forma más fácil y segura de calcular el peso molecular de la proteína de interés. Una vez las proteínas han sido transferidas a la membrana:
Marca los estándares de PM con el boli Lumimol en la membrana
Continúa con la hibridación de la membrana según tu procedimiento habitual (bloqueo, etc…)
Revela la membrana por quimioluminiscencia o colorimetría
Visualiza y localiza las bandas del estándar con película o procesador CCD
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Contáctanos
España: Teléfono: 91 114 65 54, email: [email protected]
Argentina: Tecnolab; Teléfono: +54-11-4555-0010, email: [email protected]
Chile: Biosonda; Teléfono: +56-2-209-6770, email: [email protected]
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Chile: Biosonda; Teléfono: +56-2-209-6770, email: [email protected]
Méjico: CTR Scientific; Teléfono: +52-81-8158-0600, email: [email protected]
Otros paises: Abcam; Teléfono: +1-617-577-4200, email: [email protected]
Promoción especial para participantes
20% descuento en los siguientes productos:
(hasta el 31 de mayo 2013)
48
• Gama Optiblot
• RAbMAbs
• Gama AbExcel
Código : SPWEB-XBIS1