sorbitol hjh

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  • 8/3/2019 sorbitol hjh

    1/9

    JOURNAL O F BACTEOLGY, J u n e 1 9 7 8 , p . 9 2 0 - 9 2 80 0 2 1 - 9 1 9 3 / 7 8 / 0 1 3 4 - 0 9 2 0 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t X 1 9 7 8 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yV o l . 1 3 4 , N o . 3

    P r i n t e d i n U . S . A .

    B i o c h e m i c a l a n d G e n e t i c S t u d y o f D - G l u c i t o l T r a n s p o r t a n dC a t a b o l i s m i n B a c i l l u s s u b t i l i sH . CH A L U ME A U , A . DELOBBE, A N D P . GAY*

    D e p a r t e m e n t d e B i o c h i m i e C e l l u l a i r e , I n s t i t u t d e R e c h e r c h e e n B i o l o g i e M o l e c u l a i r e , C e n t r e N a t i o n a l d e l aR e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e e t U n i v e r s i t e P a r i s V I I , 7 5 2 2 1 P a r i s C e d e x 0 5 , F r a n c eR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 9 J a n u a r y 1 9 7 8

    T h e c a t a b o l i c p a t h w a y o f D - g l u c i t o l ( s o r b i t o l ) i n B a c i l l u s s u b t i l i s M a r b u r g1 6 8 M i s c h a r a c t e r i z e d . I t i n c l u d e s ( i ) a t r a n s p o r t s t e p c a t a l y z e d b y a D - g l U c i t o lp e r m e a s e w h i c h i s a f f e c t e d b y t h e g u t A m u t a t i o n s , ( i i ) a n o x i d a t i o n s t e p o f t h ei n t r a c e l l u l a r D - g l u c i t o l c a t a l y z e d b y a D - g l u c i t o l d e h y d r o g e n a s e , g e n e r a t i n g i n t r a -c e l l u l a r f r u c t o s e , a f f e c t e d b y g u t B m u t a t i o n s , a n d ( i i i ) p h o s p h o r y l a t i o n o f t h ei n t r a c e l l u l a r f r u c t o s e e i t h e r a t t h e C 1 s i t e o r a t t h e C 6 s i t e a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y( A . D e l o b b e e t a l . , E u r . J . B i o c h e m . , 6 6 : 4 8 5 - 4 9 1 , 1 9 7 6 ; A . D e l o b b e e t a l . , E u r . J .B i o c h e m . 5 1 : 5 0 3 - 5 1 0 , 1 9 7 5 ) . A d d i t i o n a l d a t a a r e g i v e n c o n c e r n i n g t h e p h o s p h o -r y l a t i o n o f f r u c t o s e b y a f r u c t o k i n a s e ( f r u c t o s e A TP 6 - p h o s p h o t r a n s f e r a s e ) , w h i c hi s a f f e c t e d b y t h e f r u C m u t a t i o n . T h e i s o l a t i o n o f r e g u l a t o r y m u t a n t s a f f e c t e d i ng u t R t h a t s y n t h e s i z e c o n s t i t u t i v e l y b o t h t h e p e r m e a s e a n d t h e d e h y d r o g e n a s ei n d i c a t e s t h e e x i s t e n c e o f a D - g l u c i t o l o p e r o n i n B . s u b t i l i s . U n l i k e t h e w i l d - t y p es t r a i n , t h e s e m u t a n t s a r e a b l e t o u t i l i z e D - x y l i t o l a s s o l e c a r b o n s o u r c e .

    A D - g l u c i t o l c a t a b o l i c p a t h w a y h a s b e e n e l u -c i d a t e d i n E s c h e r i c h i a c o l i b y S o l o m o n a n d L i n( 3 0 ) a n d L e n g e l e r a n d L i n ( 1 9 ) . T h i s p a t h w a y i si n i t i a t e d b y a v e c t o r i a l p h o s p h o r y l a t i o n , i . e . ,t r a n s l o c a t i o n o f t h e h e x i t o l c o n c o m i t a n t w i t he s t e r i f i c a t i o n b y a p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ( P E P ) -d e p e n d e n t p h o s p h o t r a n s f e r a s e s y s t e m ( P T S ) a sd e s c r i b e d b y R o s e m a n ( 2 4 ) . T h e r e s u l t i n g D -g l u c i t o l 6 - p h o s p h a t e i s t h e n o x i d i z e d b y a D -g l u c i t o l 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e t o g i v e f r u c -t o s e 6 - p h o s p h a t e . M u t a t i o n s a f f e c t i n g e a c h s t e ph a v e b e e n o b t a i n e d ( 3 0 , 1 7 ) , a n d a n e x t e n s i v es t u d y o f h e x i t o l t r a n s p o r t i n E . c o l i b y L e n g e l e r( 1 7 , 1 8 ) p r o v i d e d o n e o f t h e m o s t p r e c i s e r e p o r t sa b o u t g e n e - e n z y m e r e l a t i o n s h i p s i n t h e f i e l d o ft h e P T S . V e c t o r i a l p h o s p h o r y l a t i o n s e e m s t o b et h e g e n e r a l r u l e f o r u t i l i z a t i o n o f D - g l u c i t o l b yE n t e r o b a c t e r i a c e a e , a s i n d i c a t e d b y t h e p h e n o -t y p e o f t h e m u t a n t s o f A e r o b a c t e r a e r o g e n e s( 3 1 ) a n d o f S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m ( 2 5 ) l a c k -i n g t h e e n z y m e I o f t h e P E P - d e p e n d e n t P N S( p t s I ) .We r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( 6 ) t h e e x i s t e n c e o fa n o t h e r D - g l u c i t o l c a t a b o l i c p a t h w a y i n B a c i l l u ss u b t i l i s t h a t i n v o l v e s t h e p r o d u c t i o n o f i n t r a c e l -l u l a r f r u c t o s e ( F i g . 1 ) . T h i s p a t h w a y w a s s u g -g e s t e d b y H o r w i t z a n d K a p l a n ( 1 2 ) who d e -s c r i b e d t h e p r e s e n c e o f a D - g l u c i t o l d e h y d r o g e n -a s e a c t i v i t y i n t h i s o r g a n i s m ( s u c h a n a c t i v i t yw a s d e s c r i b e d i n many o t h e r b a c t e r i a , i n c l u d i n gP s e u d o m o n a s s p . [ 2 9 ] a n d C e l l v i b r i o p o l y o l t r o -p h i c u s [ 2 8 ] ) . I t w a s c o n f i r m e d b y t h e f a c t t h a tp t s I m u t a n t s o f B . s u b t i l i s t h a t a r e u n a b l e t o

    t a s p o r t many c a r b o h y d r a t e s ( 9 , 2 2 ) c a n u t i l i z eD - g l u c i t o l a s a s o l e c a r b o n s o u r c e . M o r e o v e r , weo b t a i n e d e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f a f r u c t o -k i n a s e ( f r u c t o s e A TP 6 - p h o s p h o t r a n s f e r a s e )w h i c h may a c c o u n t f o r t h e c o n v e r s i o n o f i n t r a -c e l l u l a r f r u c t o s e i n t o f r u c t o s e 6 - p h o s p h a t e ( 6 ) .T h i s p a p e r d e a l s w i t h f u r t h e r b i o c h e m i c a l a n dg e n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e D - g l u c i t o l c a t a -b o l i c p a t h w a y o f B . s u b t i l i s . T h e f i r s t s t e p i sc a t a l y z e d b y a D - g l u c i t o l p e r m e a s e w h i c h a l l o w st h e a c c u m u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r D - g l u c i t o l . T h i st r a n s p o r t s y s t e m i s i m p a i r e d i n g u t A m u t a n t s .I n b o t h w i l d - t y p e a n d g u t A m u t a n t s , D - g l u c i t o lc a n b e a c t e d u p o n b y t h e D - m a n m n i t o l PEP 1 -P T S , b u t t h e i n t r a c e l l u l a r D - g l u c i t o l 6 - p h o s -p h a t e t h u s f o r m e d c a n n o t b e c a t a b o l i z e d b y B .s u b t i l i 8 . T h e s e c o n d s t e p i s c a t a l y z e d b y t h e D -g l u c i t o l d e h y d r o g e n a s e d e s c r i b e d p r e v i o u s l y b yH o r w i t z a n d K a p l a n ( 1 2 ) . T h e t h i r d s t e p i s ap h o s p h o r y l a t i o n a t t h e C 6 s i t e b y a n A T P - d e -p e n d e n t f r u c t o k i n a s e . M u t a n t s l a c k i n g t h i s e n -z y m e ( f r u C ) w e r e u t i l i z e d p r e v i o u s l y t o c h a r a c -t e r i z e t h e t r a n s p o r t r o l e o f t h e f r u c t o s e PEP 1 -PTS ( 5 ) .We d e s c r i b e t h e i s o l a t i o n o f m u t a n t s t h a ts y n t h e s i z e c o n s t i t u t i v e l y b o t h t h e p e r m e a s e a n dt h e d e h y d r o g e n a s e ( g u t R ) . T h e s e m u t a n t s a r ea b l e t o u t i l i z e x y l i t o l a s s o l e c a r b o n s o u r c e ,w h e r e a s t h e w i l d - t y p e c a n n o t . T h e y w e r e u t i -l i z e d t o c h a r a c t e r i z e t h e g u t A a n d g u t B m u t a n t s ,a n d t h e y a l l o w e d t h e i d e n t i f i c a t i o n o f a t b i r dc l a s s o f D - g l u c i t o l - n e g a t i v e m u t a n t s t h a t l a c ks i m u l t a n e o u s l y t h e p e r m e a s e a n d t h e d e h y d r o -

    9 2 0

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    D-GLUCITOL CATABOLISM I N B . SUBTILIS 921

    1 6 - P 2

    F I G . 1 . P r o p o s e d s c h e m e f o r D - g l u c i t o l a n d f r u c t o s e c a t a b o l i s m i n B . s u b t i l i s . T h e m u t a t i o n s a f f e c t i n g e a c hs t e p a r e i n d i c a t e d b e t w e e n b r a c k e t s ( 1 0 ) .

    g e n a s e . The r e s u l t s s u g g e s t s t r o n g l y t h a t t h eg u t A a n d t h e g u t B g e n e s a r e p a r t o f a g u to p e r o n .MATERIA LS AND METHODS

    C h e m i c a l s . Th e f o l l o w i n g a n a l y t i c a l - g r a d e p r o d -u c t s w e r e u s e d : A T P , o x i d i z e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d e ( N A D + ) , r e d u c e d NAD, a n d o x i d i z e dNAD p h o s p h a t e w e r e p u r c h a s e d f r o m B o e h r i n g e rM a n n h e i m C o r p . ( P a r i s , F r a n c e ) . G l y c e r o l w a s f r o mC a r l o - E r b a ( S a i n t - C l o u d , F r a n c e ) , a n d D - g l u C i t o l , D -m a n n i t o l , x y l i t o l , D - f r u c t o s e , L - a r a b i t o l , g a l a c t i t o l , D -g l u c o n a t e , D - a r a b i n o s e , a n d D - g l u c o s e w e r e f r o mM e r c k ( D a r m s t a d t , W e s t G e r m a n y ) . D - [ ' 4 C ] g l u c i t o la n d [ ' 4 C ] m a n n i t o l w e r e f r o m N ew E n g l a n d N u c l e a rC o r p . , B o s t o n , M a s s . P u r i f i e d D - g l u c i t o l d e h y d r o g e n -a s e , y e a s t h e x o k i n a s e , 6 - p h o s p h o g l u c o s e i s o m e r a s e ,a n d g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e w e r e f r o mB o e h r i n g e r .M e d i a . T h e m i n e r a l m e d i u m C d e s c r i b e d b y P a s c a le t a l . ( 2 3 ) w a s u s e d f o r s t a n d a r d c u l t u r e s a n d f o ri n c o r p o r a t i o n t e s t s . T h e c a r b o n s o u r c e w a s u s u a l l ya d d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 g / l i t e r , a n d n u t r i e n t sr e q u i r e d b y a u x o t r o p h i c s t r a i n s w e r e s u p p l e m e n t e d a t5 0 m g / l i t e r . S p o r u l a t i o n b r o t h ( S P m e d i u m ) was u s e da s a r i c h m e d i u m ( 2 7 ) . S o l i d C medium i n c l u d e dp u r i f i e d a g a r ( 1 7 g / l i t e r ; D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t ,M i c h . ) , a c a r b o n s o u r c e ( 1 g / l i t e r ) , a n d a u x o t r o p h i cr e q u i r e m e n t s ( 2 0 m g / l i t e r ) .Enzyme a s s a y s . Th e b a c t e r i a w e r e s u s p e n d e di n t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ( T r i s ) - c h l o r i d eb u f f e r ( 0 . 1 M , pH 7 . 5 ) a t 0 C , a n d s o n i c a l l y d i s r u p t e dw i t h a n u l t r a s o n i c MSE d i s i n t e g r a t o r a t 2 0 K H z . D -G l u c i t o l d e h y d r o g e n a s e was a s s a y e d b y t h e p r o c e d u r eo f H o r w i t z a n d K a p l a n ( 1 2 ) i n T r i s b u f f e r a t pH 9 . 5 .Th e f r u c t o k i n a s e a s s a y o f S a p i c o e t a l . ( 2 6 ) w as m o d -i f i e d , t a k i n g i n t o a c c o u n t some d a t a p r e s e n t e d i n t h i sp a p e r : 0 . 1 M T r i s b u f f e r ( p H 7 . 7 ) - 0 . 5 mM f r u c t o s e - 1 0mM ATP-10 mM M g C 1 2 . A l l t h e a s s a y s were c a r r i e do u t w i t h a G i l f o r d r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r . P r o -t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d b y t h e B u c h e rt u r b i d i m e t r i c m e t h o d ( 3 ) w i t h b o v i n e serum a l b u m i n( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . ) a s a s t a n d a r d .S p e c i f i c a c t i v i t i e s o f p e r m e a s e o r e n z y m e a r e e x p r e s s e d

    i n n a n o m o l e s p e r m i n u t e p e r m i l l i g r a m o f b a c t e r i a lp r o t e i n s .U p t a k e o f " 4 C - l a b e l e d D - g l u c i t o l . Th e k i n e t i c s o fu p t a k e o f r a d i o a c t i v e D - g l u c i t o l b y c e l l s u s p e n s i o n sw e r e f o l l o w e d b y t h e p r o c e d u r e o f D e l o b b e e t a l . ( 7 ) .T h e s c r e e n i n g o f t r a n s p o r t m u t a n t s w a s b y t h e t e c h -n i q u e o f u p t a k e i n s o l i d medium ( 9 ) .C h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s o f l a b e l e d com-p o u n d s . T h e p r o d u c t s r e s u l t i n g f r o m t h e u p t a k e o fr a d i o a c t i v e D - g l u c i t o l w e r e s u b j e c t e d t o p a p e r c h r o -m a t o g r a p h y ( p a p e r , S c h l e i c h e r a n d S c h u l l 2 3 1 6w a s h e d ) i n s o l v e n t 1 ( n - b u t a n o l - a c e t i c a c i d - w a t e r i nt h e r a t i o 4 : 1 : 1 b y v o l u m e ) o r i n s o l v e n t 2 ( 1 M a m -monium a c e t a t e [ p H 3 . 8 ] - 9 5 % e t h a n o l [ 2 : 5 v o l / v o l ] ) .T h e r a d i o a c t i v e s p o t s w e r e e l u t e d b y d i s t i l l e d w a t e ra n d t h e n i d e n t i f i e d b y e n z y m a t i c t r e a t m e n t o r b y c o -c h r o m a t o g r a p h y w i t h a u t h e n t i c c o m p o u n d s .B a c t e r i a l 8 t r a i n s . T h e s t r a i n s u s e d a r e l i s t e d i nT a b l e 1 . T h e y w e r e k e p t e i t h e r f r o z e n a t - 7 0 C i n t h ec u l t u r e m e d i u m w i t h a d d i t i o n o f g l y c e r o l ( 1 5 % f i n a lc o n c e n t r a t i o n ) o r a s s p o r e s o n AK ( B a l t i m o r e B i o l o g -i c a l L a b o r a t o r y , C o c k e y s v i l l e , M d . ) s l a n t s . Th e n o -m e n c l a t u r e g u t A , g u t E , a n d g u t R w a s c h o s e n t o d e s -i g n a t e t h e g e n e s i n v o l v e d i n t h e s p e c i f i c s t e p s o f t h eD - g l u c i t o l c a t a b o l i s m . A c c o r d i n g t o L e n g e l e r ( 1 7 ) , i tr e p l a c e s t h e n o m e n c l a t u r e s o r A , s o r B , a n d s o r R c i t e dp r e v i o u s l y ( 1 0 ) . O n l y t h e r e l e v a n t g e n o t y p e s a r e p r e -s e n t e d i n t h e t e x t . T h e s y m b o l s X y l + / X y l - a n dG u t + / G u t - r e f e r t o t h e a b i l i t y t o u t i l i z e x y l i t o l o r D -g l u c i t o l , r e s p e c t i v e l y , a s s o l e c a r b o n s o u r c e .M u t a g e n e s i s . M u t a g e n e s i s e x p e r i m e n t s w e r e p e r -f o r m e d b y t r e a t m e n t o f B . s u b t i l i s c u l t u r e s w i t h 0 . 1 5M e t h y l m e t h a n e s u l f o n a t e ( E M S ) ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n )f o r 1 h a t 3 7 C . Th e w a s h e d c e l l s w e r e a l l o w e d t o g r o wi n SP b r o t h b e f o r e b e i n g p l a t e d o n C p l a t e s s u p p l e -m e n t e d b y a m i x t u r e o f D - g l u c i t o l ( 1 g / l i t e r ) a n dg l y c e r o l ( 0 . 1 g / l i t e r ) . Th e r e s u l t i n g s m a l l c o l o n i e s w e r ep a t c h e d o n g l y c e r o l C p l a t e s a n d c h e c k e d f o r t h e D -g l u c i t o l p h e n o t y p e . A l l t h e m u t a n t s d i s p l a y i n g t h esame p h e n o t y p e r e t a i n e d i n o u r c o l l e c t i o n w e r e o b -t a i n e d f r o m m u t a g e n e s i s o f s e p a r a t e c l o n e s .

    RESU LTSC h a r a c t e r i z a t i o n o f a D - g l u c i t o l p e r -

    V O L . 1 3 4 , 1 9 7 8

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    922 CHALUMEAU, DELOBBE, AND GA YT A B L E 1 . L i s t o f t h e b a c t e r i a l s t r a i n s m e n t i o n e d

    G e n o t y p et r p C 2t b p C 2 h i s A It i p C 2 l e u - 9 m e t C 3g u t - I h i M A l t r p C 2g u t B I h i s A l t r p C 2g u t - I m e t C 3 t i p 2g u t B I m e t C 3 b t p C 2f r u C I m e t C 3 trpC2g u t R I h i s A A l tpCg u t R I g u t B I ura-3g u t R I g u t A 2 h i s A l tpC2g u t R I gutB2 h i s A ) tpC2g u t R I g u t - 7 h i s A l tpC2g u t A 2 pC2 k e u - 8g u t B 2 t r p C 2 I e u - 8g u t R I g u t A 9 h i s A l t r p C 2m t L 4 1 f r u B l 3 8 f r u C I

    O r i g mC . A n a g n o s t o p o u l o sM u l t i p l e - s t e p t r a n s f o r m a t i o n o f

    1 6 8 MM u l t i p l e - s t e p t r a n s f o r m a t i o n o f168MEMS o n P G 5 0 0EMS o n P G 5 0 0E G M S on PG0fP G 5 6 3 _ P G 5 1 5PG 5 9 3 - _ P G 5 1 5D e l o b b e e t a l . ( 6 )EMS o n P G 5 0 0P G 5 9 3 f P G 6 4 1EMS o n P G 6 1 9EMS o n P G 6 1 9EMS o n P G 6 1 9t fP G 6 5 5 - , - . P G 5 1 5P G 6 5 6 _ + P G 5 1 5EMS o n P G 6 1 9G a y ( u n p u b l i s h e d d a t a )

    a X f+Y r e f e r s t o a t r a n s f o r m a t i o n c r oss w h e r e X a c t e d a s t h e DNA d o n o r s t r a i n .meae. Th e oc c u rrence o f a s p e c i f i c D - g l u c i t o lt a n s p o r t s y s t e m i n t h e w i l d - t y p e 168M wasscuges b y t h e i n d u c i b i l i t y o f t h e u p t a k e o f

    '4C-labeled hexitol (Table 2) . wascon-f i r m e d b y t h e i s o l a t i o n o f mutants lacking t h eD - g l u c i t o l d e h y d r o g e n a s e ( g u t B ) w h i c h r e t a i n e dt h i s i n d u c i b l e u p t a k e a n d o f a d o u b l e m u t a n tg u t B g u t R w h i c h s y n t h e s i z e d c o n s t i t u t i v e l y t h i stransort system ( T a b l e 3 ) . F i g u r e 2 p r e s e n t st h e u p t a k e o f D - [ " 4 C ] g l u c i t o l a s a f u n c t i o n o ft i m e i n t h e s t r a i n PG596 ( g u t B I ) . Th e c h a s ee x p e r i m e n t indicated t h a t t h e p l a t e a u o b s e r v e di n t h e kietics o f t h e u p t a k e o f D - g l U C i t o l c o r e -s p o n d s t o an e q u i l i b r i u m b e t w e e n t h e e f f l u x a n dthe influx (Vi,,- V . ) . F u r t h e r m o r e , this p l a t e a us h o w e d t h a t t h e i n t r a c e i l u l a r p r o d u c t o f t h et r n s p o r t was n o t m e t a b o l i z e d i n t h i s m u t a n t .B a c t e r i a l extracts o b t a i n e d f r o m c e l l s o f s t r a i nP G 5 9 6 a f t e r 1 0 m i n o f u p t a k e o f D - [ 1 4 C ] g l u c i t o lw e re s u b j e c t e d t o paper c h r o m a t o g r a p h y i n s o l -v e n t 1 . R a d i o a u t o g r a p h y r e v e a l e d o n l y one s p o tw h i c h m i g r a t e d a t t h e same R f a s t h e D - g l u c i t o la d d e d as c o n t r o l . M o r e o v e r , t h e e l u t e d p r o d u c twas c o n v e r t e d t o f r u c t o s e b y a c t i o n o f commer-c i a l D - g l u c i t o l d e h y d r o g e n a s e i n t h e presence o fN A D ' . T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t t h e D - g l u c i t o lt r a n s p o r t d e l i v e r s u n m o d i f i e d h e x i t o l i n s i d e t h ec e l l s .F i g u r e 3 s h o w s t h e k i n e t i c s o f D - g l u c i t o l u p -t a k e i n t h e g u t B mutant PG596 measid a t

    T A B L E 2 . I n d u c i b i i t y o f t h e a c t i v i t w e i n v o l v e d i nt e D - g l U C i t o l c a t a b o l i c p a t h w y "S p a c t o f

    I n d u c e r D - G l u c i t o l D - G l e d i t o l r u c t ; 0 8p e r m e a d g e h k i n a s eg e n a s eD - G l u c i t o l 1 4 5 1 8 0 4 4D - M a n n t o l 2 0

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    D-GLUCITOL CATABOLISM I N B . SUBTILIS 9 2 3TABLE 3 . A c t i v i t i e s o f t h e D - g l u c i t o l p a t h w a y i n v a r i o u s m u t a n t s

    S p a c t o f ' :S t r a i n C a r b o n s o u r c e s a d d e d i n C m e - D - G l u c i t o l p e r - D - G l u c i t o l d e h y -

    d i u m m e a s e d r o g e n a s e F r u c t o s e k m a s eP G 6 0 2 ( f u C l ) SK < c 1 < 1 < 1SK + D - g l u c i t o l 1 2 0 1 7 2

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    9 2 4 CHALUMEAU, DELOBBE, AND GA Y

    & ' W A' r1 " 4 0 0 -a p /0 200 -0 .

    l / v x l 9 I 4

    3 0 1

    20

    1 / p x f

    1 5

    1 0

    1 0 o

    B0

    2 1 0 20 5 0 1 0 0 21/s x 1 0F I G . 3 . D - G l u c i t o l u p t a k e a s a f u n c t i o n o f i t s c o n c e n t r a t i o n i n t h e m e d i u m . C e l l s o f s t r a i n PG596 w er e

    grown in t h e same c o n d i t i o n s a s in F i g . 2 . The b a c t e r i a w e r e a l l o w e d t o t a k e u p r a d i o a c t i v e D - g l u c i t o l a t t h ef o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s : 0, 5 m M; * , 1 m M; A, 0 . 5 m M; O , 0 . 2 m M; * , 0 . 1 m M. ( A ) K i n e t i c s o f u p t a k e . ( B )L i n e w e a v e r - B u r k p l o t s o f t h e v a l u e s o f t h e i n i t i a l v e l o c i t i e s . V ( e x p r e s s e d a s n a n o m o l e s p er m i n u t e p erm i l l i g r a m o f p r o t e i n s ) and o f t h e i n t r a c e l l u l a r D - g l u c i t o l c o n c e n t r a t i o n a t t h e p l a t e a u , P , a r e e x p r e s s e d i n t h esame u n i t s .g a l a c t i t o l was o x i d i z e d . D - G l u c o n a t e a n d L - g U -l o n a t e , t h e h y d r o x y l g r o u p s o f w h i c h a r e i n t h esame s t e r i c d i s p o s i t i o n a s i d i t o l , were n o t s u b -s t r a t e s o f t h e B . s u b t i l i s D - g l u c i t o l d e h y d r o g e n -a s e . Some k i n e t i c p a r a m e t e r s o f t h e enzyme a r el i s t e d i n T a b l e 4 .We a l s o e x t e n d e d t h e s t u d y o f t h e i n d u c i b i l i t yo f t h e en z y m e. As shown i n T a b l e 2 , among t h ec o m p o u n d s t e s t e d o n l y D - g l u c i t o l i n d u c e d t h e

    s y n t h e s i s o f t h e enzyme. D - M a n n i t o l , w h i c h i n -d u c e d D - g l u c i t o l t r a n s p o r t , was i n e f f e c t i v e . X y -l i t o l , w h i c h i s a s u b s t r a t e o f t h e d e h y d r o g e n a s e ,c a n n o t i n d u c e i t s s y n t h e s i s . These r e g u l a t i o np r o p e r t i e s w i l l b e d i s c u s s e d w i t h t h e h e l p o f t h eg e n e t i c d a t a d e s c r i b e d b e l o w .P h o s p h o r y l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r u c -t o s e . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 6 ) t h e p h o s p h o -r y l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r u c t o s e i s n o t a s p e c i f i c

    J . B A C T E R I O L .

    T i m e ( m e n )

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    D-GLUCITOL CATABOLISM I N B . SUBTILIS 9 2 5s t e p f o r D - g l u c i t o l c a t a b o l i s m b e c a u s e i n t r a c e l -l u l a r f r u c t o s e may r e s u l t e i t h e r f r o m D - g l u c i t o lo x i d a t i o n , f r o m s u c r o s e h y d r o l y s i s , o r f r o m f r u c -t o s e p h o s p h a t e h y d r o l y s i s . I t may f o l l o w t w oa l t e r n a t i v e p a t h w a y s . I n t h e w i l d - t y p e 168Ms t r a i n f r u c t o s e i s p h o s p h o r y l a t e d a t t h e C 6 s i t eb y a n A T P - d e p e n d e n t f r u c t o k i n a s e . I n a m u t a n tl a c k i n g t h e f r u c t o k i n a s e ( f r u C ) , t h e i n t r a c e l l u l a rs u g a r i s e x c r e t e d i n t h e m e d i u m a n d i s t h e nr e c a p t u r e d b y t h e PEP 1 - f r u c t o s e p h o s p h o t r a n s -f e r a s e . A m u t a n t l a c k i n g t h e p h o s p h o f r u c t o k i -n a s e a c t i v i t y ( p i % ) ( 1 0 , 8 ) c a n u t i l i z e f r u c t o s e a sa s o l e c a r b o n s o u r c e . I t i s u n a b l e t o u t i l i z e e i t h e rD - g l u c i t o l ( G u t - p h e n o t y p e ) o r a m i x t u r e o f g l y c -e r o l a n d D - g l u c i t o l ( G u t e p h e n o t y p e ) b e c a u s e i ti s i n h i b i t e d b y a l l o f t h e s u b s t r a t e s , t h e m e t a b -o l i s m o f w h i c h g e n e r a t e s f r u c t o s e 6 - p h o s p h a t e .A d o u b l e m u t a n t , p f l k f r u C , w h i c h d o e s n o t s y n -t h e s i z e f r u c t o s e 6 - p h o s p h a t e , i s n o t i n h i b i t e da n d i s t h e n a b l e t o u t i l i z e D - g l u c i t o l t h r o u g h t h ef r u c t o s e 1 - p h o s p h a t e p a t h w a y . T h i s p r o p e r t ya l l o w e d t h e s c r e e n i n g o f a l a r g e n u m b e r o f f r u Cm u t a n t s ( 1 0 ) .A s s h o w n i n T a b l e 2 , t h e f r u c t o k i n a s e a c t i v i t y

    T A B L E 4 . K i n e t i c p a r a m e t e r s o f t h e D - g l u c i t o ld e h y d r o g e n a s eD e t e r n i i n a t i o n D - G l u c i t o l X y l i t o l

    ( M M ) ( M M )Km 5 5V . . 1 7 0 2 0 0Km ( N A D + ) 0 . 4 0 . 6 6

    1 / V X 1 0

    ( f r u c t o s e A TP 6 - p h o s p h o t r a n s f e r a s e ) i s s y n t h e -s i z e d c o n s t i t u t i v e l y b y B . s u b t i l i s , i . e . , i s n o ts u b j e c t t o t h e s a m e r e g u l a t i o n a s t h e e n z y m e sd e s c r i b e d a b o v e . We f o u n d t h a t t h e a c t i v i t y w a so p t i m a l a t pH 7 . 7 Th e Km f o r A TP i s 0 . 5 mM.H i g h f r u c t o s e c o n c e n t r a t i o n s i n h i b i t t h e a c t i v i t y( F i g . 4 ) . A V m . x o f 8 3 n m o l / m i n p e r mg o f p r o t e i na n d a Km f o r f r u c t o s e o f 0 . 1 5 mM w e r e o b t a i n e dw i t h c r u d e e x t r a c t s .M u t a t i o n s a f f e c t i n g t h e s p e c i f i c s t e p s o ft h e D - g l u c i t o l c a t a b o l i s m . ( i ) C o n s t i t u t i v em u t a n t s . Th e m a j o r p r o p e r t i e s o f t h e m u t a n t sd e s c r i b e d h e r e a r e l i s t e d i n T a b l e 3 .H o r w i t z a n d K a p l a n ( 1 2 ) n o t e d t h a t B . s u b t i l i sw a s u n a b l e t o u t i l i z e x y l i t o l w h e n p r e s e n t e d a sa s o l e c a r b o n s o u r c e b u t w a s a b l e t o u s e t h i sc o m p o u n d i n t h e p r e s e n c e o f D - g l u c i t o l . S u c h ar e s u l t l e d u s t o e x p e c t t h a t m u t a n t s w i t h c o n s t i -t u t i v e s y n t h e s i s o f t h e e n z y m e s i n v o l v e d i n t h eD - g l u c i t o l c a t a b o l i s m s h o u l d b e a b l e t o u t i l i z ex y l i t o l a s a s o l e c a r b o n s o u r c e ( p h e n o t y p e X y l + ) .S p o n t a n e o u s o r E M S - i n d u c e d m u t a n t s t h a tg r o w o n x y l i t o l p l a t e s c o u l d i n d e e d b e o b t a i n e d .A t o t a l o f 2 1 c l o n e s , i n c l u d i n g s t r a i n P G 6 1 9 , w e r ec h e c k e d f o r x y l i t o l u t i l i z a t i o n i n l i q u i d c u l t u r e sa n d f o r t h e D - g l u c i t o l p e r m e a s e a n d d e h y d r o g e n -a s e a c t i v i t i e s . Th e mean g e n e r a t i o n t i m e i n Cmedium + x y l i t o l w a s a b o u t 1 4 0 m i n . A l l o f t h em u t a n t s s y n t h e s i z e d c o n s t i t u t i v e l y b o t h t h e p e r -m e a s e a n d t h e d e h y d r o g e n a s e w h e n g r o w n o ns u c c i n a t e a n d g l u t a m a t e a s c a r b o n s o u r c es o r i nSP b r o t h . Th e m u t a t i o n s d e s i g n a t e d g u t R c o u l db e t r a n s f e r r e d t o r e f e r e n c e s t r a i n s b y DNA-me-

    201/ S x 10

    F i G . 4 . F r u c t o k i n a s e a c t i v i t y a s a f u n c t i o n o f f r u c t o s e c o n c e n t r a t i o n . F r u c t o k i n a s e was a s s a y e d i n a crudee x t r a c t o b t a i n e d f r o m t h e w i l d - t y p e 1 6 8 M s t r a i n , g r o w n i n C me d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h g l y c e r o l .

    1 2 5 1 0

    V O L . 1 3 4 , 1 9 7 8

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    9 2 6 CHALUMEAU, D E L O B B E , A N D GA Yd i a t e d t r a n s f o r m a t i o n w i t h t h e same f r e q u e n c i e sas known p o i n t m u t a t i o n s s u c h a s t r p C 2 o rh i s A l . The r e c o m b i n a n t s e x h i b i t e d t h e s a m ep r o p e r t i e s a s t h e o r i g i n a l m u t a n t s . The e x i s t e n c eo f t h e g u t R m u t a n t s p r o v i d e d u s w i t h a g o o dt o o l t o a n a l y z e t h e D - g l u c i t o l - n e g a t i v e m u t a n t s ,e s p e c i a l l y t h o s e t h a t l a c k t h e permease andw h i c h make them b e h a v e l i k e r e g u l a t i o n m u -t a n t s .( i i ) D - G l u c i t o l - n e g a t i v e mutants. A m o ngt h e D - g l u c i t o l - n e g a t i v e m u t a n t s i s o l a t e d f r o mt h e w i l d - t y p e s t r a i n P G 5 0 0 , some l a c k b o t h t h ep e r m e a s e a n d t h e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t i e s . I twas i m p o s s i b l e t o t e l l i f t h i s d o u b l e d e f e c t wasd u e t o . a r e g u l a t o r y o r a p o l a r m u t a t i o n o r t o am u t a t i o n t h at a b o l i s h e d t h e p e r m e a s e a c t i v i t ynecessa ry f o r t h e e n t r y o f t h e i n d u c e r . O ne o ft h e g u t R m u t a n t s , s t r a i n P G 6 1 9 , was t h e r e f o r eu s e d t o screen f o r G u t - m u t a n t s .Th e m u t a t i o n s d e s c r i b e d h e r e a r e r e s p o n s i b l ef o r a G u t - p h e n o t y p e . T h e y a l l r e v e r t s p o n t a -n e o u s l y t o t h e p a r e n t a l p h e n o t y p e . T h e y w e r et r a n s f o r m e d t o t h e w i l d t y p e a t t h e same f r e -q u e n c i e s a s r e f e r e n c e m a r k e r s l i k e t r p C 2 , h i s A l ,o r l e u - 8 , a n d t h e y w e r e t r a n s f e r r e d t o r e f e r e n c es t r a i n s a t t h e same f r e q u e n c i e s a s t h e l a t t e rm a r k e r s b y d o u b l e t r a n s f o r m a t i o n . T h e s e prop-e r t i e s i n d i c a t e d t h a t t h e G u t - p h e n o t y p e s t u d i e dwas very l i k e l y d u e t o p o i n t m u t a t i o n s .

    ( i i i ) D - G l u c i t o l d e h y d r o g e n a s e - n e g a t i v em u t a n t s . S t r a i n P G 6 5 6 ( g u t R I g u t B 2 ) ( a s w e l la s s t r a i n PG596 [ g u t B I ] i s o l a t e d from t h e w i l d -t y p e s t r a i n ) l a c k e d o n l y t h e D - g l u c i t o l d e h y d r o -gena se a c t i v i t y . I t was a b l e t o t a k e u p r a d i o a c t i v eD - g l u c i t o l b e c a u s e t h e t r a n s p o r t a c t i v i t y wasc o n s t i t u t i v e . H o w e v e r , t h i s d o u b l e mutant wasn o t a b l e t o u t i l i z e x y l i t o l a s s o l e c a r b o n s o u r c e ,w h i c h i n d i c a t e s t h a t t h e o x i d a t i o n o f t h e p e n t i t o li s c a t a l y z e d b y t h e D - g l u c i t o l d e h y d r o g e n a s e .( i v ) T r a n s p o r t mutants. Two c l a s s e s o f mu-t a n t s u n a b l e t o c a r r y o u t t h e u p t a k e o f r a d i o a c -t i v e D - g l u c i t o l were i s o l a t e d . Th e f i r s t c l a s s , i n -c l u d i n g s t r a i n P G 6 5 5 ( g u t R I , g u t A 2 ) , s y n t h e -s i z e d c o n s t i t u t i v e l y t h e d e h y d r o g e n a s e . Thesem u t a t i o n s , d e s i g n a t e d g u t A , l i k e l y a f f e c t e d t h es t r u c t u r a l gene c o d i n g f o r t h e permease. Th eo t h e r c l a s s was d e v o i d o f b o t h t h e pe r me a se andt h e d e h y d r o g e n a s e , l i k e t h e s t r a i n P G 6 5 9 ( g u t 7g u t R I ) . The presence o f t h e g u t R I m u t a t i o n i nt h i s s t a i n was t e s t e d b y t r a n s f o r m a t i o n w i t hw i l d - t y p e DNA a s d o n o r . A m o ng t h e G u t ' t r a n s -f o r m a n t s , 50% h a d t h e X y l + p h e n o t y p e , i n d i c a t -i n g t h e presen ce o f t h e g u t R I m u t a t i o n i n t h er e c i p i e n t s t r a i n .( v ) G e n e t i c l i n k a g e o f t h e gu t m u t a t i o n s .Th e l a t t e r c r o s s p r o v i d e d e v i d e n c e f o r a l i n k a g eb e t w e e n g u t R l a n d g u t - 7 m a r k e r s . F u r t h e r a n a l -og o u s crosses i n v o l v i n g s t r a i n s P G 6 4 9 ( g u t R ig u t B I ) , P G 6 5 6 ( g u t R I g u t B 2 ) , P G 6 5 5 ( g u t R i

    J . B A C r E R I O L .g u t A 2 ) , a n d P G 6 7 9 ( g u t R I g u t A 9 ) a s r e c i p i e n ts t r a i n s , t r a n s f o r m e d b y w i l d - t y p e DNA ( a t t h ec o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 1 , g / m l ) , i n d i c a t e d t h a t a l lt h e s e m a r k e r s a r e l i n k e d . Th e f o l l o w i n g d i s -t a n c e s ( r e c o m b i n a t i o n u n i t s ) w e r e f o u n d : g u t R I -g u t B 2 , 4 1 ; g u t R I - g u t B I , 3 8 ; g u t R l - g u t A 2 , 5 9 ;a n d g u t R l - g u t A 9 , 7 1 .

    DISCUSSIONTh e t w o s p e c i f i c s t e p s o f t h e D - g l u c i t o l c a t a -b o l i c p a t h w a y o f B . s u b t i l i s h a v e b e e n i d e n t i f i e dw i t h t h e h e l p o f g u t R , g u t A , a n d g u t B m u t a n t s .T h e s e s t e p s a r e c a t a l y z e d b y a D - g l u c i t o l p e r -m e a s e a n d b y a D - g l u c i t o l d e h y d r o g e n a s e , t h es y n t h e s i s o f w h i c h i s i n d u c i b l e o n l y b y D - g l u c i t o li n t h e w i l d t y p e .Th e g u t R m u t a n t s w e r e s c r e e n e d o n t h e b a s i s

    o f t h e i r X y l + p h e n o t y p e . T h e d o u b l e m u t a n t sg u t R g u t A o r g u t R g u t B w e r e a b l e t o g r o w o nn e i t h e r x y l i t o l n o r D - g l u c i t o l , t h u s s h o w i n g t h a tt h e t w o s u b s t r a t e s s h a r e b o t h t h e p e r m e a s e a n dt h e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t i e s . B e c a u s e i t i s v e r yu n l i k e l y t h a t t h e c o n s t i t u t i v e g u t R m u t a n t s r e -s u l t f r o m t w o s e p a r a t e e v e n t s , we a s s u m e t h a tt h e s y n t h e s i s o f t h e t w o e n z y m e s i s s u b j e c t e d t ot h e s a m e r e g u l a t i o n . Th e e x i s t e n c e o f a g u to p e r o n , i n c l u d i n g t w o s t r u c t u r a l g e n e s g u t A a n dg u t E , i s s u p p o r t e d b y p r e l i m i n a r y m a p p i n g r e -s u l t s w h i c h i n d i c a t e t h a t a l l t h e g u t m u t a t i o n st e s t e d a r e c l u s t e r e d . Th e s i m u l t a n e o u s l o s s o fb o t h t h e p e r m e a s e a n d t h e d e h y d r o g e n a s e a c t i v -i t i e s i n a c o n s t i t u t i v e m u t a n t m i g h t t h u s b e t h er e s u l t o f a p o l a r m u t a t i o n .I s o t o p i c d i l u t i o n e x p e r i m e n t s ( 5 ) a n d t h e b e -h a v i o r o f t h e p f i m u t a n t s ( 1 0 ) b o t h i n d i c a t e t h a tt h e f r u c t o k i n a s e m e d i a t e s t h e t h i r d s t e p o f D -g l u c i t o l c a t a b o l i s m i n t h e w i l d - t y p e s t r a i n s . T h i sa c t i v i t y w h i c h i s r e s p o n s i b l e f o r t h e i n t r a c e l l u l a rp h o s p h o r y l a t i o n o f f r u c t o s e i s a l s o u t i l i z e d i n t h ec a t a b o l i s m o f s u c r o s e ( 2 0 ) a n d e v e n i n t h e c a t a b -o l i s m o f e x t r a c e l l u l a r f r u c t o s e . Th e b r o a d r o l e i sc o n s i s t e n t w i t h t h e f a c t t h a t t h e f r u C g e n e i s n o tu n d e r t h e s a m e r e g u l a t i o n a s g u t A a n d g u t Bg e n e s . F r u c t o k i n a s e i s i n h i b i t e d b y h i g h f r u c t o s ec o n c e n t r a t i o n s , w h i c h p r o b a b l y a c c o u n t s f o r t h el o w a c t i v i t i e s r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( 1 1 ) when t h ea s s a y w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o S a p i c o e t a l .( 2 6 ) . T h i s k i n d o f i n h i b i t i o n w a s o f t e n r e p o r t e df o r k i n a s e s w h i c h a r e a s s u m e d t o c o m b i n e s e -q u e n t i a l l y w i t h t h e i r s u b s t r a t e s ( 1 , 2 , 3 2 ) , f i r s tw i t h A TP a n d t h e n w i t h t h e s u b s t r a t e . I n s u c ha c a s e , h i g h f r u c t o s e c o n c e n t r a t i o n s w o u l d p r o -m o t e t h e p r i o r f i x a t i o n o f f r u c t o s e o n t h e e n -z y m e , t h u s i m p e d i n g i t s c o m b i n a t i o n w i t h A TP( 4 ) . Th e b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f s u c h a r e a c t i o nm e c h a n i s m , i f a n y , i s n o t c l e a r . A l l t h e f r u Cm u t a n t s t e s t e d p o s s e s s a n o r m a l g l u c o k i n a s ea c t i v i t y , w h i c h i m p l i e s t h a t t h e B . s u b t i l i s g l u -c o k i n a s e i s h i g h l y s p e c i f i c . I t i s l i k e l y t h a t b a c -

  • 8/3/2019 sorbitol hjh

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    D-GLUCITOL C A T A B O L I S M IN B . SUBTILISt e r i a l k i n a s e s d e v o t e d t o t h e p h o s p h o r y l a t i o n o fh e x o s e s h a v e a h i g h e r s p e c i f i c i t y t h a n e u c a r y o t i ch e x o k i n a s e s ( 1 3 ) .A t r a n s p o r t s y s t e m was d e s c r i b e d . T h i s a c t i v -i t y d e l i v e r s u n m o d i f i e d h e x i t o l w i t h i n t h e c e l l s .Th e k i n e t i c d a t a s h o w e d t h a t i t o b e y s t h e samel a w s a s t h o s e d e s c r i b e d b y K e p e s a n d Monod( 1 6 ) a n d Kepes a n d C o h e n ( 1 5 ) f o r t h e b a c t e r i a lpermeases. The i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n swhen t h e p l a t e a us ar e r e a c h e d a re p r o p o r t i o n a lt o t h e i n i t i a l r a t e s o f e n t r y . Then t h e a c t u a lc o n c e n t r a t i o n i n s i d e t h e b a c t e r i a i s g i v e n b y[ G u t , , ] = [ G u t , j . . [ G u t e x ] / ( K m + [ G u t e x ] ) ,w h e r e [ G u t m ] m , , a n d G u t e x a r e t h e m a x i m a l D-g l u c i t o l c o n c e n t r a t i o n i n s i d e t h e b a c t e r i a a n dt h e D - g l u c i t o l c o n c e n t r a t i o n i n t h e m e d i u m , r e -s p e c t i v e l y . Th e t h e o r e t i c a l m a x i m a l r a t i o o f ex -t r a c e l l u l a r t o i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f D-g l u c i t o l i s g i v e n b y [ G u t m . ] , , . / K m = 9 2 . 5 . S u c ha c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s h o u l d r e q u i r e a t l e a s ta f r e e energy o f 2 . 9 k c a l ( c a . 1 2 . 1 k J ) p er m o l o fa c c u m u l a t e d D - g l u c i t o l . I t i s l i k e l y t h a t t h e per-mease u t i l i z e s t h e energy g e n e r a t e d b y r e s p i r a -t i o n b e c a u s e t h e m e t a b o l i c i n h i b i t o r s a f f e c t i t sa c t i v i t y . Th e p a t t e r n o f i n h i b i t i o n b y t h e p o i s o n su s e d d i f f e r s s o m e w h a t f r o m t h e p a t t e r n d e -s c r i b e d i n t h e c a s e o f t h e c i t r a t e permease b y B .s u b t i l i s ( 3 3 ) . I n t h e two cases t h e i r a c t i o n i s n o treally u n d e r s t o o d .

    Th e e f f l u x , t h e r a t e o f w h i c h i s e q u a l t o t h ei n f l u x r a t e when t h e p l a t e a u i s r e a c h e d , i s i n d e e dp r o p o r t i o n a l t o t h e i n t r a c e l l u l a r D - g l u c i t o l c o n -c e n t r a t i o n . Th e K v a l u e f o r t h i s f i r s t o r d e r k i -n e t i c s i s g i v e n b y K =V m , , / [ G u t i , ] m . . =[ 1 4 5 x1 0 3 ] / 7 4 =2 m l / m i n x g o f p r o t e i n .The d i f f u s i o n pr o ce s s t h a t c o u l d a c c o u n t f o rs u c h an e f f l u x s h o u l d a l l o w a s y m m e t r i c a l i n f l u x ,t h e r a t e o f w h i c h s h o u l d n o t b e c o n s i s t e n t w i t ht h e G u t - p h e n o t y p e o f t h e d o u b l e mutant g u t Ag u t R i n t h e s t a n d a r d m e d i u m . C o n s e q u e n t l y , weassume t h a t t h i s e f f l u x i s c a t a l y z e d b y t h e per-mease i t s e l f , w o r k i n g w i t h a very l o w a f f i n i t y , a sp o s t u l a t e d b y K e p e s ( 1 4 ) i n t h e c a s e o f t h eg a l a c t o s i d e p e r m e a s e o f E . c o l i .D - G l u c i t o l t r a n s p o r t may a l s o b e m e d i a t e d b yt h e m a n n i t o l PEP P T S . S u c h a l o w s p e c i f i c i t yo f t h e m a n n i t o l t r a n s p o r t s y s t e m was e n c o u n -t e r e d i n E . c o l i ( 1 7 , 1 8 ) , w h i c h i s a b l e t o c a t -a b o l i z e t h e D - g l u c i t o l 6 - p h o s p h a t e t h u s s y n t h e -s i z e d . T h i s i s n o t t h e c a s e i n B . s u b t i l i s , w h i c hl a c k s a D - g l u c i t o l p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( 1 2 ) .I n t h i s o r g a n i s m , D - g l u c i t o l may b e u t i l i z e d a s an o n - m e t a b o l i z a b l e s u b s t r a t e i n t h e s t u d y o f t h eD - m a n n i t o l PEP P T S .

    ACKNOWLEDGMENTSWe t h a n k R . D e d o n d e r a n d G . R a p o p o r t f o r h e l p f u l d i s -c u s s i o n s t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s w o r k a n d D . L e f e v r ef o r t h e p r e p a r a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t . We a r e g r a t e f u l t o E . C .C . L i n wh o k i n d l y r e v i s e d t h e E n g l i s h m a n u s c r i p t .

    T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y r e s e a r c h g r a n t s f r o m t h eD e l e g a t i o n G e n e r a l e a l a R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e e t T e c h n i q u ea n d f r o m t h e C o m m i s s a r i a t a l ' E n e r g i e A t o m i q u e .L I T E R A T U R E CITED

    1 . A n t o n y , R . S . , and L . B . S p e c t o r . 1 9 7 0 . A p h o s p h o e n -z y m e i n t e r m e d i a r y i n a c e t a t e k i n a s e a c t i o n . J . B i o l .C h e m . 2 4 5 : 6 7 3 9 - 6 7 4 1 .2 . B a l l a r d , F . J . 1 9 6 6 . K i n e t i c s t u d i e s w i t h l i v e r g a l a c t o k i -n a s e . B i o c h e m . J . 1 0 1 : 7 0 - 7 5 .3 . B u c h e r , T . 1 9 4 7 . U b e r e i n e P h o s p h a t u b e r t r a g e n d e s G a -r u n g s f e r n e n t . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 : 2 9 2 - 3 1 4 .4 . C l e l a n d , W. W. 1 9 7 0 . S t e a d y s t a t e k i n e t i c s , p . 3 5 4 3 . I nP . B o y e r ( e d . ) , T h e e n z y m e s , 3 r d e d . A c a d e m i c P r e s s ,I n c . , N ew Y o r k .5 . D e l o b b e , A . , H . C h a l u m e a u , J . - M . C l a v e r i e , a n d P .G a y . 1 9 7 6 . P h o s p h o r y l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r u c t o s e i nB a c i l l u s s u b t i l i s m e d i a t e d b y p h o s p h o e n o l p y r u v a t e 1 -f r u c t o s e p h o s p h o t r a n s f e r a s e . E u r . J . B i o c h e m .6 6 : 4 8 5 - 4 9 1 .6 . D e l o b b e , A . , H . C h a l u m e a u , a n d P . G a y . 1 9 7 5 . E x i s -t e n c e o f t w o a l t e r n a t i v e p a t h w a y s f o r f r u c t o s e a n d s o r -b i t o l m e t a b o l i s m i n B a c i l l u s s u b t i l i s M a r b u r g . E u r . J .B i o c h e m . 5 1 : 5 0 3 - 5 1 0 .7 . D e l o b b e , A . , R . H a g u e n a u e r , a n d G . R a p o p o r t . 1 9 7 1 .S t u d i e s o n t h e t r a n s p o r t o f a - m e t h y l - D - g l u c o s i d e i nB a c i l l u s s u b t i l i s . B i o c h i m i e 5 3 : 1 0 1 5 - 1 0 2 1 .8 . F r e e s e , E . , Y . O h , E . B . F r e e s e , M . D . D i e s t e r h a f t , and0 . P r a s a d . 1 9 7 2 . S u p p r e s s i o n o f s p o r u l a t i o n o f B a c i l l u ss u b t i l i s , p . 2 1 2 - 2 2 1 . I n H . 0 . H a l v o r s o n , R . H a n s o n , a n dL . L . C a m p b e l l ( e d . ) , S p o r e s V . A m e r i c a n S o c i e t y f o rM i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .9 . G a y , P . , P . C o r d i e r , M . M a r q u e t , and A . D e l o b b e .1 9 7 3 . C a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m a n d t r a n s p o r t i n B a c i l -l u s s u b t i l i s . A s t u d y o f c t r m u t a t i o n s . M o l . G e n . G e n e t .

    1 2 1 : 3 5 5 - 3 6 8 .1 0 . G a y , P . , and A . D e l o b b e . 1 9 7 7 . F r u c t o s e t r a n s p o r t i nB a c i l l u s s u b t i l i s . E u r . J . B i o c h e m . 7 9 : 3 6 3 - 3 7 3 .1 1 . G a y , P . , and G . R a p o p o r t . 1 9 7 0 . E t u d e d e s m u t a n t sd e p o u r v u s d e f r u c t o s e 1 - p h o s p h a t e k i na se c h e z B . s u b -t i l i s . C . R . A c a d . S c i . 2 7 1 : 3 7 4 - 3 7 7 .1 2 . H o r w i t z , S . B . , and N . 0 . K a p l a n . 1 9 6 4 . H e x i t o l d e h y -d r o g e n a s e s o f B a c i l l u s s u b t i l i s . J . B i o l . C h e m .2 3 9 : 8 3 0 - 8 3 8 .1 3 . K e l k e r , N . E . , T . E . H a n s o n , and R . L . A n d e r s o n . 1 9 7 0 .A l t e r n a t e p a t h w a y s o f D - f r u c t o s e m e t a b o l i s m i n A e r o -b a c t e r a e r o g e n e s . A s p e c i f i c D - f r u c t o k i n a s e a n d i t s p r e f -e r e n t i a l r o l e i n t h e m e t a b o l i s m o f s u c r o s e . J . B i o l . C h e m .2 4 5 : 2 0 6 0 - 2 0 6 5 .1 4 . K e p e s , A . 1 9 7 3 . T r o i s c l a s s e s d e s y s t e m e s d e t r a n s p o r tc h e z l e s b a c t e r i e s . B i o c h i m i e 5 5 : 6 9 3 - 7 0 2 .1 5 . K e p e s , A . , and G . C o h e n . 1 9 6 2 . P e r m e a t i o n , p . 1 7 9 - 2 2 1 .I n I . C . G u n s a l u s a n d R . Y . S t a i n i e r ( e d . ) , Th e b a c t e r i a ,v o l . 4 . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N ew Y o r k .1 6 . K e p e s , A . , and J . Monod. 1 9 5 7 . E t u d e d u f o n c t i o n n e -ment d e l a g a l a c t o s i d e - p e r m e a s e d ' E s c h e r i c h i a c o l i . C .R . A c a d . S c i . 2 4 4 : 8 0 9 - 8 1 1 .1 7 . L e n g e l e r , J . 1 9 7 5 . M u t a t i o n s a f f e c t i n g t r a n s p o r t o f t h eh e x i t o l s D - m a n n i t o l , D - g l u c i t o l , a n d g a l a c t i t o l i n E s c h -e r i c h i a c o l i K - 1 2 : i s o l a t i o n a n d m a p p i n g . J . B a c t e r i o l .1 2 4 : 2 6 - 3 8 .1 8 . L e n g e l e r , J . 1 9 7 5 . N a t u r e a n d p r d p e r t i e s o f h e x i t o l t r a n s -p o r t s y s t e m s i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l .1 2 4 : 3 9 - 4 7 .1 9 . L e n g e l e r , J . , and E . C . C . L i n . 1 9 7 2 . R e v e r s a l o f t h em a n n i t o l - s o r b i t o l d i a u x i e i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c -t e r i o l . 1 1 2 : 8 4 0 - 8 4 8 .2 0 . L e p e s a n t , J . - A . , F . K u n s t , J . L e p e s a n t - K e j z l a r o v a ,and R . D e d o n d e r . 1 9 7 2 . C h r o m o s o m a l l o c a t i o n o f mu -t a t i o n s a f f e c t i n g s u c r o s e m e t a b o l i s m i n B a c i l l u s s u b t i l i sM a r b u r g . M o l . G e n . G e n e t . 1 1 8 : 1 3 5 - 1 6 0 .2 1 . M c C o r k i n d a l e , J . , and N . L . E d s o n . 1 9 5 4 . P o l y o l d e -h y d r o g e n a s e s : t h e s p e c i f i c i t y o f r a t - l i v e r p o l y o l d e h y -

    9 2 7O i . 1 3 4 , 1 9 7 8

  • 8/3/2019 sorbitol hjh

    9/9

    9 2 8 CHALUMEAU, D E L O B B E , AND GA Yd r o g e n a s e . B i o c h e m . J . 5 7 : 5 1 8 - 5 2 3 .2 2 . N i a u d e t , B . , P . G a y , and R . D e d o n d e r . 1 9 7 5 . I d e n t i f i -c a t i o n o f t h e s t r u c t u r a l gene o f t h e PEP p h o s p h o t r a n s -f e r a s e enzyme I i n B a c i l l u s s u b t i l i s M a r b u r g . M o l . G e n .G e n e t . 1 3 6 : 3 3 7 - 3 4 9 .2 3 . P a s c a l , M . , F . K u n s t , J . - A . L e p e s a n t , and R . Dedon-d e r . 1 9 7 1 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t w o s u c r a s e a c t i v i t i e s i nB a c i l l u s s u b t i l i s M a r b u r g . B i o c h i m i e 5 3 : 1 0 5 9 - 1 0 6 6 .2 4 . Roseman, S. 1 9 7 2 . C a r b o h y d r a t e t r a n s p o r t i n b a c t e r i a lc e l l s , p . 4 2 - 8 9 . I n L . E . H o k i n ( e d . ) , M e t a b o l i c p a t h w a y s ,v o l . 6 , 3 r d e d . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N ew Y o r k .2 5 . S a i e r , M. H I , R . D . S i m o n i , a nd S. Roseman. 1 9 7 0 . Th ep h y s i o l o g i c a l b e h a v i o u r o f e n z y m e I a n d h e a t s t a b l ep r o t e i n m u t a n t o f b a c t e r i a l p h o s p h o t r a n s f e r a s e s y s t e m .J . B i o l . C h e m . 2 4 5 : 5 8 7 0 - 5 8 7 3 .2 6 . S a p i c o , V . , T . E . H a n s o n , R . W. W a l t e r , and R . LA n d e r s o n . 1 9 6 8 . M e t a b o l i s m o f D - f r u c t o s e i n A e r o b a c -t e r aerogenes a n a l y s i s o f m u t a n t s l a c k i n g D - f r u c t o s e 6 -p h o s p h a t e k i n a s e a n d D - f r u c t o s e 1 , 6 - d i p h o s p h a t a s e . J .B a c t e r i o l . 9 6 : 5 1 - 5 4 .2 7 . S c h a e f f e r , P . , H. lonesco, A . R y t e r , a n d G . B a l a s s a .1 9 6 5 . L a s p o r u l a t i o n d e B a c i U u s s u b t i l i s , e t u d e gene-

    t i q u e e t p h y s i o l o g i q u e , p . 5 5 3 - 5 6 3 . I n Me d er e g u l a t i o n d e s a c t i v i t 6 s c e l l u l a i r e s c h e z l e s microorga-n i s m e s . E d . C e n t r e N a t i o n a l d e l a R e c h e r c h e S c i e n t i -f i q u e , P a r i s .2 8 . S c o l n i c k , E . M L , and E . C . C . L i n . 1 9 6 2 . P a r a l l e l i n d u c -t i o n o f o - a r a b i t o l a n d D - s o r b i t o l d e h y d r o g e n a s e s . J .B a c t e r i o l . 8 4 : 6 3 1 - 6 3 7 .2 9 . Shaw, D . R . D . 1 9 6 2 . G a l a c t i t o l d e h y d r o g e n a s e . M e t h o d sE n z y m o l . 5 : 3 2 3 - 3 2 5 .3 0 . S o l o m o n , E . , and E . C . C . Ln. 1 9 7 2 . M u t a t i o n s a f f e c t i n gt h e d i s s i m i l a t i o n o f m a n n i t o l b y E s c h e r i c h i a c o l i K - 1 2 .J . B a c t e r i o l . 1 1 1 : 5 6 6 - 5 7 4 .3 1 . T a n a k a , S . , and E . C . C . L i n . 1 9 6 7 . Two c l a s s o fp l e i o t r o p i c m u t a n t s o f A e r o b a c t e r aerogenes l a c k i n gc o m p o n e n t s o f a p h o s p h o e n o l - p y r u v a t e p h o s p h o t r a ns -f e r a s e s y s t e m . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 5 7 : 9 1 3 - 9 1 9 .3 2 . W a l s h , C . T . , and L B . S p e c t o r . 1 9 7 1 . A p h o s p h o e n z y m ei n t e r m e d i a r y i n p h o s p h o g l y c e r a t e k i n a s e a c t i o n . J . B i o l .C h e m . 2 4 6 : 1 2 5 5 - 1 2 6 1 .3 3 . W i l l e c k e , K . , and A . B . P a r d e e . 1 9 7 1 . I n d u c i b l e t r a n s -p o r t o f c i t r a t e i n a g r a m - p o s i t i v e b a c t e r i u m , B a c i U u ss u b t i l i s . J . B i o l . C h e m . 2 4 6 : 1 0 3 2 - 1 0 4 0 .

    J . B A C T E R I O L .