Separationsmetoder

Separationsmetoder

• Kromatografi, gas (GC) eller vätska (LC)

• Elektrofores

• Masspektrometri

Kromatografi

• Gaskromatografi, GC

Separation av t.ex. alkoholer, fetter, …• Vätskekromatografi, LC (t.ex HPLC)

Separation av vattenlösliga ämnen som ej tål höga temperaturer t.ex. proteiner, DNA, …

Kromatografi

• Provet passerar en kolonnsom separerar partiklarnamed avseende på storlek eller kemiska egenskaperberoende på kolonn-materialets egenskaper

• Separationen sker genom att en rörlig fas med de lösta ämnena rör sig genom en fast fas (stationär fas).

• Den rörliga fasen kan vara i vätske- eller gasform.

• Den stationära fasen kan vara i fast eller vätskeform (gel)

Gaskromatograf

FID detektor

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Affinitetskromatografi

Kromatogram från HPLC

Diod-Array detektor

Elektrofores

Elektrofores

• Separation av t.ex. proteiner eller DNA fragment efter storlek och ladding.

• Bestämning av DNA sekvens, sekvensering

Elektrofores

• Joner separeras i en gelgenom att de utsätts förett elektriskt fält.

• Jonerna kan separeraspå grund av sin laddning och storlek.

Sekvensering

Kapillär-elektrofores

Mass spektrometriMS

Separation av joner med avseende på massa och laddning

Mass -spektrometer

Mass-spektrometriHistoriskt perspektiv

• J.J Thompson : Upptäckte att Neon hade flera isotoper c:a 1900. Fragmentering av molekyler.

• Dempster : konstruerade första ms med riktningsfokusering c.a 1920, elektron källa.

Användes t.ex vid anrikning av U-235 för första Atombomben.

Mass- spektrometri (MS)

• Bestämma massan på molekyler och atomer

• Framställa fragment i gasform av provet• Mäta massan på fragmenten.• Fragmenten ger ett fingeravtryck av provet• Studera relativa andelen av olika

fragmentens massor.• Studera relativa andelen av olika isotoper.

Principen för en enkel Mass Spektrometer (MS)

r

r är unik för ett värde på kvoten m/q

massan = mladdningen = q

Princip för MS

X X X X X

X X X X X

X X X X X

BF

F= q*v * B

v

F = mv2/rm/q = B * r/v

r

Böjning i magnetfält

0 V4000V

v

E+

+++

Acceleration i elektriskt fält

+

+

E

F = q*E

F

d

mv2/2 = q* U

v2 = q* V*2/m

F

JoniseringsmetodElectron Impact Ionization

Exempel på vanliga fragment

Mass spektrum av benzyl alkohol

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

Joniseringsmetoder

Mass-spektrum

JoniseringmetoderElectronspray (ESI)

• 1 – 5kV spänning då areosolen lämnar kapillären.• ”dropparna” torkar in (”hyperladdning”)• Coulombic explosion• Jonerna i gasfas

JoniseringsmetodElectron spray

”rå-spektrum” från ESI-MS

Analysmetoder(MALDI) ToF

AnalysmetoderQuadropole mass filter

+(U +Vcos(t))

-(U+Vcos(t))

GCMS

homepage.univie.ac.at/Wolfgang.Werther/Folie1.JPG

Historiskt perspektiv

• GC-MS mitten på 50-talet. Test av läkemedel, hormoner, föroreningar,…

• MALDI (1985), ES-MS (1988) m.fl. har gett möjlighet att studera stora biomolekyler. (Nobelpris 2002)Kan användas vid diagnos av t.ex Malaria och Cancer (äggstock-, prostata-, bröst-)

Jonisationsmetoder

Jonisationsmetod

Typisk molekyl

Prov preparation

Mass range Egenskaper

EI Liten flyktig GC/vätske eller fast prob

-1000 Da Hård ger struktur info

CI Liten flyktig GC/vätske eller fast prob

- 1000 Da Mjuk

ESI Peptid/protein LC/spruta - 200 000 Da Mjuk / multi-laddad

FAB Kolhydrater Prov +Matrix - 6000 Da Hårdare än ESI

MALDI Peptid/protein Prov +Matrix - 500 000 Da mjuk