A polysaccharide fraction of adlay seed ( Coix lachryma-jobi L.) induces apoptosis in human non-

small cell lung cancer A549 cellsXiangyi Lu a, Wei Liu a, Junhua Wua, Mengxian Li a,

Juncheng Wangb, Jihui Wub, Cheng Luo

•DANIELA URREGO•MATEO ZAPATA

INTRODUCTION

INTRODUCTION

Is a process in multicellular organisms, where cells that are no longer needed or are a threat to the organism are destroyed.

APOPTOSIS

INTRODUCTION

Apoptosis is mediated by proteolytic enzymes called caspases, which trigger cell death.

INTRODUCTION

Is the uncontrolled growth of abnormal cells in the body.There are many different kinds of cancer but it most are diagnosed by biopsy.

CANCER

INTRODUCTION

Symptoms of cancer depend on the type and location of the cancer. The outlook and treatment varies based on the type of cancer and its stage.

INTRODUCTION

There are small cell lung cancer and non-small cell lung cancer.The most common types of NSCLC are squamous cell carcinoma, large cell carcinoma, and adenocarcinoma.

LUNG CANCER

INTRODUCTION

Non-small cell lung cancer (NSCLC) are associated with cigarette smoke, however adenocarcinomas may be found in patients who have never smoked. NSCLCs are relatively insensitive to chemotherapy and radiation therapy compared with SCLC.

INTRODUCTION

Is a concentrated form of something, whether solid, viscid, or liquid, of a food, flavoring, etc.

EXTRATC

INTRODUCTION

DIFFERENT SEED EXTRACTS FROM ADLAY SEED HAVE BEEN USED FOR THE TREATMENT OF VARIOUS CANCERS IN CHINA, AND CLINICAL DATA SUPPORT THE USE OF THESE EXTRACTS FOR CANCER THERAPY IN THIS CASE OF LUNG CANCER.

OBJECTIVE

OBJECTIVE

The objective of the study was to test the induction of apoptosis by the CP1 to A549 cells

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES

RPMI 1640RevertAid kit de la primera cadena de

sintesis de cdna fragmentadaSuero fetal bovino Solución de penicilina-estreptomicina Tripsina Tampón fosfato salino (PBS)Dimetil sulfoside (DMSO), 3 - (4,5-

dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenyltertrazolium bromuro (MTT)

Agarosa de bajo y normal punto de fusión

MATERIALES

Propidio iodidewasAnexina V FITC Kit de detección de

apoptosisRNeasy Mini Kitanticuerpos contra b-actinacaspasa-3 y 9Peroxidasa de rábano picante conjugado

con anticuerpos secundarios

MÉTODOS

El polisacárido CP-1 fue extraído a partir de semillas adlay mediante técnicas de hundimiento de etanol.

Células humanas no pequeñas de cáncer de pulmón de la línea celular A549 en RPMI 1640, con suero fetal bovino y penicilina-estreptomicina, a 37º C

PURIFICACIÓN DEL POLISACÁRIDO CP-1

CULTIVO

MÉTODOS

El efecto de CP-1 sobre la viabilidad de las células A549 se evaluó mediante el ensayo de MTT.

Los cambios morfológicos fueron observadas bajo un microscopio electrónico de barrido (SEM).

VIABILIDAD CELULAR

OBSERVACIONES MORFOLÓGICAS

MÉTODOS

Se realizó por citometría de flujo, y la población de células en cada fase se calculó utilizando el programa de software de la Modifit LT. Cada experimento se realizó tres veces.

ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR

MÉTODOS

Detención del ciclo celular en la fase S y la inducción de la apoptosis en las células A549 por CP-1.El haz de luz laser cuando atraviesa una célula sufre una dispersión que puede ser evidenciada en un fotodetector.

CITOMETRÍA DE FLUJO

MÉTODOS

Cuantificar la fragmentación de ADN asociado con el daño del ADN causado por la apoptosis.

COMETA

MÉTODOS

Medir las cantidades relativas de la caspasa 3 y la caspasa 9 en las muestra de cultivo.

Las proteínas se separan por electroforesis en gel, por lo general SDS-PAGE .

Las proteínas se transfirieron a un filtro, que se incuba con una anticuerpo que se relaciona con la proteína de interés.

El anticuerpo unido al filtro puede ser detectado de varias formas, identificando por ende la proteína de interés

WESTERN BLOT

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

CP-1 inhibió el crecimiento de las células A549 in vitroEsto lo hizo de una manera tiempo y concentración dependiente (MTT)

RESULTADOS

Por observaciones morfológicas (SEM) se logró determinar que el CP-1 induce apoptosis en las células A549Esto igualmente es dependiente de la concentración

RESULTADOS

RESULTADOS

En la primer imagen(control) se observan micro vellosidades densas con protuberancias menoresEn 100 μg/ml se comienzan a observar micro vellosidades delgadas, un poco mas grandes y en mayor cantidadA 200 μg/ml se formaron arrugas en la superficieA 300 μg/ml se formaron cuerpos apoptóticos en la superficie celular

RESULTADOS

Efectos del CP-1 en la distribución del ciclo celular de las células A549 (Citometría de flujo):La fracción apoptótica aumentó a medida que se aplico el CP-1La reducción en la proliferación se asocia al acumulo de células en la fase S del ciclo celular

RESULTADOS

RESULTADOS

B. Se observa el aumento en el pico sub G1 a medida que se adicionó el CP-1. También se evidenció el incremento en las células en fase S, a expensas de la concentración de CP-1Generalmente en G1 y G2 se disminuyó el número de células con la adición del CP-1

RESULTADOS

CP-1 indujo apoptosis en A549(Tinción de anexina)La proporción de apoptosis aumentó en células tratadas con CP-1 con respecto a células que no recibieron el tratamiento.CP-1 indujo apoptosis mediante el detenimiento de la proliferación celular

C. Citometría de flujo +tinción con anexina mostró el porcentaje de células apoptóticas a medida que se añadió el CP-1D. A medida que se añadió el CP-1, se aumentó el % de células apoptóticas. Se inició con un 2% a una concentración de 1 μg/ml, y se obtuvo un porcentaje de 19% a una concentración de 4 μg/ml

Se analizó la expresión de las proteínas caspasa-3 y caspasa-9 por western blotLa expresión de dichas proteínas aumentó representativamente a concentraciones de 200 y 300 mg/dL de CP-1. Esto contribuye a la apoptosis de la célula A549

E. El carril 1 muestra el control, el carril 2 muestra la expresión a una concentración de 200 mg/dL de CP-1 en la cual se observa una mayor expresión que en el control, y en el carril 3 se observa la expresión a una concentración de 300 mg/dL de CP-1 en la cual se evidenció el gran cambio con respecto al control con una mayor expresión de las caspasas 3 y 9

F. De manera gráfica se evidencia el aumento en la expresión de las caspasas 3 y 9 a medida que se aumenta la concentración del CP-1

Se midió el daño del DNA por el método de la cometaSe evidenció mayor tamaño de la cola a mayores concentraciones de CP-1, evidencia de mayor daño del DNA

A. Análisis de cometa por microscopía de barrido laser confocal a 543nmEl largo de la cola aumenta progresivamente proporcional al aumento de la concentracón de CP-1Se evidencia una cola mas larga a una concentración mayor de CP-1 (300 μg/ml)B. De manera gráfica se observa el aumento en la longitud de la cola con un aumento en la concentración de CP-1

Análisis del potencial de membrana mitocondrial:A medida que se añadió el CP-1, se perdió el potencial de membrana mitocondrial por la despolarización de esta, esto es un paso inicial y completamente irreversible de la apoptosis celular. Es otro parámetro más que apoya la tesis expuesta por los autores.

C. Se observa la disminución del potencial de membrana mitocondrial a medida que aumenta la concentración del CP-1D. De manera gráfica se evidencia la diferencia existente a medida que aumenta la CP-1, con una disminución marcada del potencia como gran determinante de la apoptosis celular impulsada por el CP-1

DISCUSSION

REFERENCE What He,She or They said Agree/Disagree

D.W. Fairbairn, P.L. Olive, K.L. O’Neill, The comet assay: a comprehensivereview, Mutat. Res. 339

(1995) 37–59.

“The movement of the DNA from the head to the tail has been

described as the most obvious characteristic of apoptotic cells in

the comet assay”

YES

S.W. Lowe, A.W. Lin, Apoptosis in cancer,

Carcinogenesis 21 (2000) 485–495

“The caspase gene family plays a central role in mitochondriamediated

Apoptosis” YES

Reference What He,She or They said Agree/Disagree

A.G. Yakovlev, S.M. Knoblach, L. Fan, et al., Activation of CPP32-like

caspasescontributes to neuronal

apoptosis and neurological dysfunction after

traumatic brain injury, J. Neurosci. 17 (1997) 74l5–

7424.

“Caspase-3 contributes to the executionof apoptosis via the activation,

hydrolysis and proteolysis ofspecific substrates such as DNA-

dependent protein kinases”

YES

Reference What He,She or They said Agree/Disagree

J. Wu, J. Zhou, Y. Lang, et al., A polysaccharide from Armillaria mellea exhibitsstrong in vitro anticancer

activity via apoptosis-involved mechanisms, Int.

J.Biol. Macromol. 4 (2012)

663–667.

“The disruption of mitochondrial membrane potential, which typically

leads to the activation of caspase-3 and caspase-9, by CP-1,

further suggested that a mitochondria-dependent pathway was involved

in the induction of apoptosis by CP-1.”

YES

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS

1. The main conclusion is obtained after reviewing this document is the induction of apoptosis in A549 cells by the CP-1

2. In addition to this it could be concluded that the induction of apoptosis by the CP1 is usually concentration dependent

CONCLUSION

3. The loss of mitochondrial membrane potential is a step also induced CP1 which quickly leads to apoptosis

4. The expression of caspases 3 and 9 also regulated by the CP1 is a very important indicator when stop stimulate proliferation and apoptosis of A549 cells

MAPAS CONCEPTUALES

GRACIAS