seldi-tof function and reproducability von gerrit erdmann betreuer: benedict brors 15.06 2005
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SELDI-TOF SELDI-TOF Function and ReproducabilityFunction and Reproducability
Von Gerrit Erdmann
Betreuer: Benedict Brors
15.06 200515.06 2005
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Was ist SELDI-TOF ?
• SLEDI-TOF: S urface E nhanced L aser D esorption/I onisation T ime o f F ilght
– Form der Massenspektroskopie
– Weiterentwicklung von MALDI-TOF
– Patent bei Ciphergen®
Wie Funktioniert SELDI-TOF
• In NO-Laser gibt einen kurzen Laserpuls auf den Chip ab
• Proteine desorbiert und wird ionisiert während Matrix die Energie absorbiert
• Beschleunigung über E-Feld und Auftrennung nach Masse/Ladung (m/z) Quotient
Abb.1
Wie Funktioniert SELDI-TOF
• Proteinchips mit verschiedenen vorbehandelten Oberflächen– Ermöglicht es bestimmt Proteine anzureichern
Abb.3 Abb.4
Abb.2
Einsatzgebiete von SELDI-TOF
Abb.5
Einsatzgebiete von SELDI-TOF
• Biomarker Discovery• Expression Difference Mapping TM
• Interaction Difference Mapping TM
• Antibody-Antigen Interaction• DNA Protein Interaction• Protein Purification• Glycosylation Analyses• uvm.
Beispiel eines SELDI-TOF Experiments
• Untersuchung von Eierstockkrebs durchgeführt 2002 von Petricoin et al.
• „black box aproach“• 3 Messreihen insgesamt, 2 aber später
1. 216 Serum Proben: 50 normal , 50 Krebs als Trainingsdaten. 116 verdeckte Proben (50 normal , 50 Krebs, 16 benigne) mit Ciphergen H4 Proteinchip, baseline-subtraction“
2. Die Proben von 1. aber mit einem WCX2 Proteinchip, baseline-subtraction
3. Neue Proben. 91 normal 162 Krebs. Auftrennung in Trainingsdaten nicht angegeben
Die Durchführung
• Massen Auflösung ständig überprüft– Genauigkeit 0,1%
• 0-20000 Da als Zielgröße• Positiv und Kontrollproben gleichzeitig,
vermischt auf einem und mehreren Chips• Serum von einer Normalprobe auf 100
verschieden Chips – 9 davon zufällig für „Coefficient of Variance“
(CV) benutzt ( 8 Proteinpeaks)
Die Auswertung
• Normalisierung der Daten [0,1]• 15 200 M/Z Werte mit einem Genetischen
Algorithmus und Cluster Analyse untersucht– Fitness Test ergibt Satz an „features“ der
Trainigsdaten am besten trennt
• Anwendung auf die Verdeckten Daten mit 3 Kategorien
• „baseline-subtraction“ vermutlich erst nach Auswertung
Das Ergebnis für Messreihe 1
• CV < 10%
• 63/66 der verdeckten Kontrollen (95%) richtig als nicht Krebs– 16/16 benigne erkannt
• 50/50 als Krebs erkannt (auch Stage I)100 % Sensitivität und 95 % Spezifität
„positiv predictiv value“ 94 %
Überprüfung duch Baggerly 2004
• Rohdaten nur für Messreihe 3 verfügbar, Messreihe 1 und 2 nur „baseline-substracted“ ( irreversibel, nichtlinear)– Resultate nur für Messreihe 3
reproduzierbar
Ein Wechsel im Protokoll ?
• In Messreihe 1, Erkennung aller 16 benignen wegen deutlicher Unterschiede
• In Messreihe 2 kein deutlichen Unterschiede wegen Ähnlichkeit der zwischen 1 u. 2 vermutlich
Protokollwechsel
Daten „offset“ und Übertragung auf Messreihe 3
• Abweichung bei M/Z Value von ca. 1% zwischen 2 und 3
• Versuch der Korrektur
• „feature“ Sätze von 2 funktionierten nicht für 3
• Ungekehrt sehr schwierig ; Hinweise auf Signalsättigung
Abb.6
Fazit
• Perfekte Seperation von 3 möglich , aber im „Noise-bereich“, z.T. auch bei 1 und 2
• sehr seltsam da kein biologischer Hintergrund Unterscheide in Vorbereitung der Proben
• Keine Generalisierung der „feature“ Sets• z.T. Set nicht stabil genug für „baseline-substraction“
• Massenkalibrierung unzureichend bei 3• Werkseinstellungen
• Protokollwechsel in Messreihe 1 Struktur Erkennung theoretisch möglich,
Ergebnisse aber vermutlich nicht Verwertbar, gewisse „baseline-subtraction“ sinnvoll
Ausblick
• Verbesserung der Vergleichbarkeit auch zischen verschiedenen Studien
• vollautomatische, robotisierte Flüssigkeitshandhabung
– Verbesserung der des CV von ca. 45 % auf ca. 27%
• Einführung von „replicates“ • Auswahl der Peaks
– SNR ≥ 1,25: CV 53,3 %– SNR ≥ 2 : CV 26,4 %
• Einführung und kontinuierliche Überprüfung von standardisierten Versuchparametern
– Z.B.Trocknungszeitunterschiede von mehr als 25 min vor der Zugabe der Matrixmoleküle kann zu CVs von bis 67 % führen
Abbildungs- und Literaturverzeichnis
AbbildungensverzeihnisAbb.1: http://arthritis-research.com/content/figures/ar1723-1.jpg
Abb.2: http://www.proteomicsnijmegen.nl/Seldi_pages/possibilities.htm
Abb.3: http://www.genetics.med.ed.ac.uk/cysfib/seldipix/pipette.jpgAbb.4: http://www.mrlaser.com/Reduced%20Size%20Photos/Ciphergen%20Array.JPG
Abb.5: K. Baggerly et al. (2004) Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum: comparing datasets from different experiments Bioinformatics, 20, 777-785
Literaturverzeichnis1. K. Baggerly et al. (2004) Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum:
comparing datasets from different experiments Bioinformatics, 20, 777-7852. E. Petricoin et al. (2002) Use of Proteomic patterns in serum to identify ovarian
cancer The Lancet, 359, 572-5773. M. Aviado et al. (2005) Optimization and evaluation of surface-enhanced laser
desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF MS) with reversed-phase protein arrays for protein profiling Clin Chem Med 43(2) 133-140
4. http://www.ciphergen.com/