RNAinterference (RNAi)

Gerard Sellarés MartínezMódulo 6 – Genómica y Proteómica

Antecedentes

1990 R. Jorgensen“Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans.” Plant Cell

1990 R. Jorgensen 1998 Andrew Fire & Craig Mello

1995 Guo S, Kemphues KJ. ”par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed” .Cell

1995 Guo S& Kemphues KJ

1998 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature. 1998

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IntroducciónLa ribointerferencia o interferencia del RNA es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes específicos, ejercido por moléculas de RNA que, siendo complementarias a un RNA mensajero (mRNA), conducen habitualmente a la degradación de éste (Fire and Mello,1998)

dsRNA

siRNA (19-23 pb)shRNA

miRNA

Chemistry & Biology 19, January 27, 2012

Componentes del mecanismo RNAi

Nature reviews, February 11, 2012

Mecanismos de silenciamiento

Amplificación de la señal

En plantas, hongos y C. elegans

Se generan nuevas moléculas de siRNA (secundarias), específicas para diferentes secuencias del mismo mRNA, generando un efecto de amplificación

Resistencia las infecciones virales

Mecanismos de silenciamiento

Ensamblaje de heterocromatina mediante RNAi en S. pombe

Nature 457, 413-420(22 January 2009)

Estas secuencias repetitivas y los cenRNAs atraen enzimas como la Histona Metil-Transferasa (HTMasas, de las siglas en inglés) tipo H3K9 (metilan la lisina9 de la histona H3), proteínas HP1 y otros complejos que median la formación de heterocromatina.

Utilización en el laboratorio

Se sintetiza dsRNA (o siRNAs/shRNAs en mamíferos) con una secuencia complementaria a la del gen de interés y se introduce en una célula u organismo, donde se reconoce como material genético extraño, lo que activa la ruta del RNAi.

Silenciamiento de genes (“Knockdown")

Utilización en el laboratorio

Obtención de una línea de ratones transgénicos para RNAi

Aplicaciones

Genómica funcional Medicina

Biotegnología

Terapias antivirales (Expresión génica viral en células cancerosas, HIV, Hepatitis A y B, etc)

Terapias en enfermedades neurodegenerativas (Enfermedad de Hungtington).

Terapia contra el Cáncer

Diseño de plantas alimenticias

Aprovecha el fenotipo estable y heredable del RNAi en plantas

C. Elegans y  Drosophila  como animales modelo (también Plantas).

Mapeo y construcción de librerías genómicas de RNAi

VentajasFácil de utilizar

Rapidez en la obtención (algunos días)

Viable en cualquier tipo celular

Válido en experimentos in vivo e in vitro

La eficacia del sistema de interferencia radica en que RISC

cataliza múltiples ciclos de interferencia in vivo

Disminuye tiempo, “coste” y aumenta la especificidad

Inconvenientes

Off-target (OTEs) Reducción no intencionada de la expresión

Limitaciones en el uso in vivo

Sensible a las nucleasas presentes en el plasma

Administración (Deben estar protegidos)

Vida media corta

Rápida eliminación

Estabilidad

Para hacer el knockdown se necesitan dosis muy elevadas. OTE son dosis dependientes

Generación de respuesta inmune (respuesta vía INF, secuencias CpG, etc)

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prospects. Chem Biol. 2012 Jan 27;19(1):60-71. Review• Fattal E, Bochot A. Antisense oligonucleotides, aptamers and SiRNA:

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• Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11.

• Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995 May 19;81(4):611-20.

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