RLH e NLR: il riconoscimento citoplasmatico del pericolo

(Alarmins)

DAMP

DAMP: Damage Associated Molecular Patterns

Come DC, Macrofagi e mastociti “sentono” il pericolo…

RLH (RIG-I like helicases)

RIG-I retinoic acid inducible gene I

MDA5 melanoma differentiation associated gene 5

LGP2 laboratory of genetics and physiology 2

Riconoscimento di virus a RNA Produzione di IFN di tipo I

Risposta immunitaria anti-virale(apoptosi di cells infettate, resistenza antivirale,

prodiuzione RLH, attivazione NK & T cells)

DExD/H-containing RNA helicases

RIG-I: riconoscimento di ssRNA 5’pppMDA5: riconoscimento di dsRNA (poly I:C)LGP2: inibitore dei RLH, funzione fisiologica?

Caspase Recruitment domain

Come si attiva RIG-I?

CTD --> C terminal domain, corrisponde a Repressor DomainCTD --> contiene il dominio di riconoscimento dell’RNAIn presenza ATP --> cambio conformazione helicasi --> rilascio di CARD --> interazioni con RIG-I/IPS

CARD dominio responsabile della cascata di trasduz.

IPS (IFN promoter stimulator 1)

o CARDIF

TRAF3 (E3 ubiquitin ligasi)

IKK-related kinasi: TBK-1 & IKKi

Fosforilaz IRFse formaz omo/etero dim

ISRE (IFN-I stimulated response element)

NLR (NOD-Like Receptors): i NOD & l’INFLAMMOSOMA

3 DOMINI: LRR --> riconoscimento ligando

NACHT -> oligomerizzazioneCARD/PYD/… --> reclutamento

NOD1 & NOD2

Cosa riconoscono…

PEPTIDOGLICANO

- PGN: componente parete batteri GRAM+ e GRAM-

- Polimero di glicani che alternaN-acetiglucosamina (NAG) eacido N-acetilmuramico (NAM)

- I polimeri NAM-NAG sonocollegati da ponti peptidici

GRAM postive:Lysina

GRAM negative:Acido meso-diapinopimelico

Come PGN entra in ocntatto coi NODs?

Batteri intracellulari con ciclo replicativo nel citosol: LISTERIA, SHIGELLA accesibilità DIRETTA

Batteri intracellulari che restano in fagosomi:SALMONELLA, MYCOBATTERIO

Batteri estracellulari

TRASOPRTATORI per muramildipeptide:CD14, PepT1, PepT2

Riconoscimento dell’Ag --> cambio conformazionale --> oligomerizzazione via NACHT --> reclutamento di RICK (RIP2) via CARD

Ubiquitinazione di RIP2 via TRAF (2/5; 6) --> reclutamento di TAK1 --> formazione del complesso TAK1/TAB1/2/3

Il complesso TAK1/TAB1/2/3 induce sia l’attivazione di AP1 che del complesso IKK,b, che porta all’attivazione di NFkB

TAK1 e RIP2 portano anche all’attivazione di CARD9 e alla conseguente attivazione di p38

Mutazioni in NODs

NOD2 --> frame-shift, induce NOD2 senza LRR terminale (no detection di PGN): MALATTIA DI CHRON, infiammazione aberrante a lvl intestinale, probabilm dovuta a mancata risposta a lvl delle mucose con conseguente induzione di risposta anti-batterica sistemica

NOD1 --> mutazioni associate a ASMA, eczema atopico, …

L’INFLAMMOSOMA

LRR --> per riconscimento ligandoNOD/NACHT --> per multimerizzazioneCARD o PYD --> reclutamento caspasi

Ruolo dell’attivazione dell’INFLAMMOSOMA

Attivazione della CASPASI-1

Trasformazione di pro-IL-1 e pro-IL-18in IL-1 e IL-18

IL-1 e IL-18

Attivazione della cascata infiammatoriaEffetto su cells immunità innata e sui tessuti

BLOCCO diffusione patogeno

IL-1 IL-1 media numerose funzioni:a) Attivazione cells endotelialib) Produzione IL-6c) Shock endotossico indotto da LPSd) Attivazione linfociti

Proprio per i sui effetti pleiotropici la produzione di IL-1 deve finemente regolata

La produzione deregolata o eccessiva di IL-1 può causare danno tissutale (tossicità a lvl isole pancreas e neuroni) e

patologie infiammatorie

Doppia regolazione per la secrezione di IL-1 attiva:1) Via PAMP e TLR viene indotta la sintesi del trascritto della

pro-IL-12) Un secondo segnale -INFLAMMOSOMA- induce il taglio

proteolitico della pro-IL-1 a IL-1

IL18: ruolo fondamentale nell’attivazione delle cellule NK

In vitro exps:

NK cells

BM-DCs

wt/KO spleen

DC-NK cell coculture

ELISA for

IFN-γ

wt/KO bone marrow

YLPS

recombinant cytokinesneutralizing Abs

O.N.

GM-CSF

ifnb-/-, il18-/-, il2-/-,tlr4-/-

B6 or WT

100% GFP-DOG

100% GFP-DOG

Double transgenic B6:Ub-GFP

DOG (CD11c promoter-DTR)

10-day DT treatment

20% 80%

Mixed BM chimera

ICS for IFN-γ

CD11chi DCs

NK cells/BM

cells

-

-

20% KO80% GFP-DOG

20% KO80% GFP-DOG

100% KO

>20% KO<80% GFP-DOG

Lethally irradiated

IL18: ruolo fondamentale nell’attivazione delle cellule NK

In vivo exps:

L’inflammosoma è una PIATTAFORMA di proteine il cui assemblaggio porta all’attivazione della CASPASI in grado di tagliare le pro-IL a dare le interleukine funzionali

La base di questa piattaforma è data dai NLR (14 NALP + Ipaf + NAIP)

NA

LP

3 IN

FL

AM

MO

SO

MA

L’attivazione dell’inflammosoma porta alla attivazione della CASPASI-1 o ICE (IL-1 Converting Enzyme).

ICE è il prototipo delle CASPASI INFIAMMATORIE.

Caspasi proinfiammatorie:CASPASI 1, 4 e 5 in uomoCASPASI 1, 11 e 12 in topo

Unico substrato noto: IL-1 e IL-18 per ICE

Quando WESTERN BLOT ha permesso di distinguere pro-IL-1 (31kD) e IL-1 (17kD) da estratti frazionati di monociti umani in grado di indurre qto processo è stata isolata ICE

Caspasi-11 (topo) e 4/5 (uomo):Topi resistenti a shock settico (Caspasi-1!!!)

Attivatore a monte di caspasi 1

Caspasi-12:Selezione positiva durante evoluzione di una

forma di caspasi-12 troncata in dominio CARDTopi ko hanno migliore clearance dei batteri e

maggiori lvl di IL-1, IL-6IPOTESI: decoy caspasi che controbilancia

effetti caspasi-1

CASPASI --> Cysteine proteasi che tagliano dopo un acido aspartico

originariamente scoperte nell’attivazione del porcesso apoptotico

Tutte le caspasi esistono come zymogeni

Le caspasi “esecutive” sono le capsasi-3, -6 e -7 che sono attivate da caspasi “iniziatrici” (2, 8, 9, 10) e che inducono l’attivazione del processo APOPTOTICO.

Per essere attivate qte caspasi devono essere assemblate su una piattaforma che utilizza la porteina Apaf che ha tre domini:

1) CARD per reclutare capsasi-92) NB-ARC per oligomerizzare3) WD repeat per sentire il rilascio del citocromo C dai

mitocondri

CASPASI INFIAMMATORIE attivate da NLR.Tre gruppi principali di INFLAMMOSOMI:

Co

sa in

du

ce l’

atti

vazi

on

e d

i NA

LP

:

Antrace LeTx --> azione su NALP1 (topi ko resistenti)Forse no Pyd (--> ASC) utilizzato MA CARD-CARDINAL

PATOLOGIE ASSOCIATE A DEREGOLAZIONE NELLA PRODUZIONE DI IL-1

CRIOPIRINOPATIE:Sottofamiglia di sindrome febbrile periodica ereitaria (SFPE), caratterizzata da ricorrenti fenomeni febbrili inspiegabili e processi infiammatori molto forti. NO segni autoimmunità (auto-Ab/T autoreative)Mutazione MISSENSO in NACHT di NALP3 --> GAIN OF FUNCTION --> alti livelli di IL-1 --> Pazienti rispondono a trattam con IL-1Ra

MALATTIE AUTOINFIAMMATORIE FMF E PAPA:2 patologie dovute ad alterazione dominio PYR di NALP3.

GOTTA:Alterazione del metabolismo delle purine --> formazione di cristalli di acido urico (MSU) nelle genture --> attivazione NALP3 --> pazienti rispondono a IL1Ra

VITILIGINE:Depigmentazione della pelle per assenza porgressiva melanociti.Associazioni genetiche a locus NALP1

Mutaz attivatoria --> maggiore IL1 --> aumentata attivazione T cells --> cloni T autoreattivi