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Research Collection
Doctoral Thesis
Präparative und kinetische Untersuchungen an micellartigenCobyrinsäurederivaten
Author(s): Munk, Wolfgang
Publication Date: 1994
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000971816
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Ofss. ETH fiX-3Dissertation ETH Nr. 10524
Praparative und kinetische
Untersuchungen an miceiiartigen
Cobyrinsäurederivaten
ABHANDLUNG
zur Erlangung des Titels eines
Doktors der Naturwissenschaften
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt von
WOLR3ANGMUNK
dipl. ehem. ETH
geboren am 3. Mai 1963
aus der
Bundesrepublik Deutschland
Angenommen auf Antrag von
Prof. Dr. B. Kräutler, Referent
Prof. Dr. St. Benner, Korreferent
Zürich 1994
Alle Rechte vorbehalten
© 1994, Redaktion: Wolfgang Munk
Druck: Stiftung Zentralstelle der Studentenschaft der Universität Zürich
Meinen Eltern und Claudia gewidmet
Gegenwind bringt Auftrieb
Bedanken mochte ich mich bei meinen Kollegen im Labor CHN F 61: Frau Yajing Feng, Dr.
Narla Gowriswari, Dr. Christian Lehmann, Dr. Maria Ngu, meinen anderen Kollegen im
Laboratorium für organische Chemie und all jenen ETH-Angehörigen, welche durch ihre
moralische Unterstützung und menschliche Atmosphäre zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen haben.
Danken möchte ich auch meinen Eltern für die finanzielle Unterstützung, ohne die diese
Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen
Forschungskredit der ETH Zürich gefördert.
I
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
SUMMARY
ALLGEMEINER TEIL
1. Einleitung
1.1 Bedeutung des Cobalamin
1.2 Die Kobalt-Alkyl-Bindung
1.3 Micellenmoleküle
1.4 Wirt-Gast-Komplexe
1.5 Der Käfigeffekt
1.6 Arbeitshypothese
2. Synthetische Arbeiten
2.1 Synthese des 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin
2.2 Synthese micellartiger Cobyrinsäurederivate
2.2.1 Synthese der Cobyrinsäure
2.2.2 Synthese des miceiiartigen Cobyrinsäurederivates Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat)
2.3 Alkylierungen
2.3.1 Methylierung
2.3.2 Adenosylierung
2.3.3 Alkylierungen mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat unter Natrium¬
borhydridreduktion
2.3.4 1 ,N6-Ethenoadenosylierung
2.4 Synthese der Gastmoleküle
Wirt-Gast Komplexe des miceiiartigen Cobyrinsäurederivates
3.1 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen
3.2 5'-0-Tosyladenosin
3.3 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
Reduktionskinetik
Kinetik der Methylierung und Adenosylierung
EXPERIMENTELLER TEIL
6.1 Allgemeine Bemerkungen
6.1.1 Apparative Ausstattung
6.1.2 Standard-Arbeitsabläufe
6.1.3 Qualität der verwendeten Chemikalien
6.1.4 Verzeichnis der Abkürzungen
6.2 Synthese des 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin
6.3 Orientierende Experimente zur Synthese einiger Organocobalamine und
von Dicyanocobalamin
6.3.1 Methylcobalamin
6.3.2 Ethylcobalamin
6.3.3 Vinylcobalamin
6.3.4 Dicyanocobalamin
III
6.4 Synthese micellartiger Cobyrinsäurederivate
6.4.1 Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
6.4.2 Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton
6.4.3 Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitro-
phenyl)-cobyrinat
6.4.4 Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxycar-
bonyl-n-decyl)-cobamid
6.4.5 Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat)
6.5 Praparative Alkylierungen von Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-
N, N', N", N"', N"M, N,
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)
6.5.1 Hexakalium-Coo-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
6.5.2 Adenosylierungen
* Praparative Synthese
* Synthese via Komplex mit Alkylierungsagenz
6.5.3 Alkylierung mit 1,N6-Ethenoadenosinen unter Natriumborhydridreduktion
6.5.4 1 ,N6-Ethenoadenosylierungen
• Elektrochemische Synthese
• Synthesebeweis durch Dealkylierung
6.6 Synthese der Gastmoleküle
6.6.1 9,10-Dibrom-(4-butyloxy)-anthracen
6.6.2 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat: Synthese und ihre Kinetik
6.7 Orientierende Wirt/Gast-Assoziationsexperimente von Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N, N\ N", N'", N"", N,
N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)
6.7.1 Die absoluten und relativen Löslichkeiten der Gastmoleküle in Wasser
6.7.2 Methoden zur Bestimmung des Assoziationsgrades
6.7.3 Bestimmung des Assoziationsverhaltens in wässriger Lösung
6.7.3.1 9,10-Dibrom-(4-butyloxy)-anthracen
• Assoziation in wässriger Lösung
* Phasentransfer Hexan/Wasser
IV
• Phasentransfer Methylenchlorid/Wasser
* Zerfallskinetik des Assoziates mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)
6.7.3.2 Assoziationsexperimente mit 5'-0-Tosyladenosin
6.7.3.3 Orientierende Experimente mit Methyltosylat
6.8 Wirt/Gast-Assoziationsexperimente von Dicyano-heptakalium-C o
(lll)-cobyrinat und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",
N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in Deuteriumoxid
6.8.1 Lumineszenzexperimente
6.8.1.1 Totallumineszenzspektren von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
6.8.1.2 Konzentrationsreihe des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in D2O
6.8.1.3 Bestimmung der Löslichkeit von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in D20
6.8.1.4 Hydrolyse und Stabilität von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in D2O
6.8.1.5 Lumineszenzverhalten der Wirtverbindungen Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",
N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) sowie ihrer Coa-
aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-derivate
6.8.1.6 Verdünnungsreihe von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und Hepta-
kalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) mit gesättigtem, wässrigen 1,N6-Ethenoadenosyl-
5'-0-tosylat
6.8.1.7 Sättigung einer Konzentrationsreihe von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-
cobyrinat und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",
N ,N' -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit 1,N6-Ethenoadenosyl-
5'-0-tosylat
6.8.2 UV/vis-Experimente
6.9 Reduktionskinetik von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",
N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)
V
6.10 Kinetik der Alkylierung von in situ hergestelltem Co(l)-cobyrinat und
Co(l)-cobamido-N,N\N",N"\N""1N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb.
oxyiat) mit Methyltosylat und 5'-0-Tosyladenosin
7. LITERATURVERZEICHNIS
8. ANHANG
8.1 Nomenklatur der Corrine
8.2 Nomenklatur der Kohlenstoffatome kompletter Corrinoide
8.3 Nomenklatur der 1,N6-Ethenoadenosyle
9. LEBENSLAUF
1
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese einiger Coenzym Bi2-analoger
Corrinderivate und untersucht in kinetischen, präparativen und spektroskopischen
Experimenten das Assoziationsverhalten des micellartig erweiterten Cobyrinsäurederivat
Cobamido-N,N\N",N"\N"",N""',N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit ausgewählten
Gastmolekülen (15,16, 22).
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N,",N"",N ,
N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (19), das genauso wie die anderen in der
vorliegenden Arbeit synthetisierten Adenosylcorrine (Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-
adenosyl-cobyrinat (20), Hexanatrium-Coo-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-
cobyrinat (21), Hexakalium-Coo-aquo-Coß-5,-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N""',
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18) und 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)) ein
Derivat des Coenzym Bi2 darstellt, zeichnet sich durch sieben (n-Decyl-10'-carboxylat)-
Ketten an den Propyl- bzw. Acetylsäureamiden des Corrinringes aus. Die Cobamido-
verbindungen 18 & 19 besitzen somit tentakelartige Fortsätze, die die molekulare
Grundlage für die Entstehung eines Käfigeffektes bei Reaktionen im Zentrum des Moleküles,
z.B. am Kobalt, bilden.
Die Synthese des 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) erfolgte auf elektrochemischem Wege,
der allgemein für Cobalamin, die Cobyrinsäure sowie das micellartige Cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) durchführbar ist. Die
direkte Adenosylierung und 1,N6-Ethenoadenosylierung der Co(l)-cobyrinsäure und des
Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) sowie die
Synthese des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) (17), welches ausgehend von Cyanocobalamin (10) in einer
bekannten fünfstufigen Synthese zugänglich ist, werden beschrieben.
Eine Assoziation konnte in vergleichenden Experimenten zwischen 5'-0-Tosyladenosin (15)
bzw. 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) auf der einen Seite und Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw. Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) auf der anderen Seite
nachgewiesen werden.
2
Heptakalium-dicyano-Co(lll) cobamido N,N',N",N"',N"",N ,N hepta-(n-decyl-10'
carboxylat) (17) zeigte bei Assoziationsexperimenten sowohl mit 5'-0-Tosyladenosin
(15) als auch dem 9,10-Di-(4 brombutyloxy)-anthracen (22) und 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) ausgesprochene Assoziatbildung, wie sie beim Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) nicht beobachtet wurde Die Assoziation zwischen 5'-
O-Tosyiadenosin (15) und Heptakahum-dicyano Co(lll) cobamido-N,N',N",N'",N"",N,
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) konnte durch UV/vis-, 1H-NMR- und für das
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) als Gast zusätzlich durch Totallumineszenz-
spektroskopie bewiesen werden
In Alkytierungsexpenmenten von Co(l)-cornnen mit 5'-0-Tosyladenosin (15) wurde eine
Beschleunigung der Geschwindigkeitskonstanten der Alkylierung für das Co(l) cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) festgestellt, wenn auch die
Bestimmungsfaktoren für dieses Verhalten nicht vollständig aufgeklärt werden konnten
Reduktionsexperimente der Co(ll)-corrtne mit Natriumborhydrid lassen u a einen
Detergenzeffekt der (n-Decyl-IO'-carboxylat)-Ketten als Ursache für die beobachteten
Unterschiede der Alkylierungsgeschwindigkeiten vermuten
S U M M A R Y
In this thesis the synthesis of vanous cornn derivatives analogous to coenzyme B12 (1) is
reported In kinetic, preparative and spectroscopic expenments the association of cobamtdo-
N,N',N",N"',N"",N""',N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylate), a micellular derivative of
cobyrinic acid, with selected potential guest molecules (15,16, 22) was analyzed
Hexasodium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylate) (19), which as the other adenosylcornnes
descnbed here (hexapotassium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobynnate (20), hexasodium-
Coa-aquo-Coß-5'-(1 ",N6-etheno)-adenosyl-cobynnate (21), hexapotassium-Coa-aquo-
Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl 10'-carboxylate)
(18) and 1,N6-ethenoadenosylcobalamine (4)) is a derivative of coenzyme B12 (1), bears
a (n-decyl-10'-carboxylate) unit on each of the seven side-chains of the cornn ring The
3
CONH2CN
1
KOOCm
KOOC-
(17)
preparative synthesis&
kinetic measurements
Hfi
R,: (20) ; R2:(21)
R,=
R,: (18) ; R2: (19) ; fy.- (30)
7 /
*+
ö (22)
N H—**—
">Ö (15)
CH.
0c)
4^»-^ (16)
uv/vis-spectroscopy
'H-nmr-spectroscopy
c. only:
total luminescence
spectroscopy
4
cobamido Compounds 18 & 19 thus possess tentacle-like structures which can be expected
to result in a cage effect in reactions taking place inside the corrin molelecule e.g. in the
direct vicinity of cobalt.
The synthesis of 1,N6-ethenoadenosylcobalamine (4) was carried out using an
electrochemical method which was shown to be a general method for cobalamine, the corrin
core structure and the micellular cobamido-N,N',N",N"',N"",N""',N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylate). The direct adenosylation and 1,N6-ethenoadenosylation of Co(l)-
cobyrinic acid and Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylate) as well as the synthesis of heptapotassium-dicyano-Co(IM)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylate) (17), the latter accessed
via an established five-step synthesis starting off from cyanocobalamin (10), are reported.
Association could be detected in Solutions in deuteriumoxide by comparison of the behaviour
of 5'-0-tosyladenosine (15) and 1,N6-ethenoadenosyl-5'-0-tosylate (16) with dicyano-
heptapotassium-Co(lll)-cobyrinate (24) and heptapotassium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylate) (17).
Heptapotassium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylate) (17) exhibited a pronounced tendency towards association with 5'-0-
tosyladenosine (15), 9,10-di-(4-bromobutyloxy)-anthracene (22) and 1,N6-
ethenoadenosyl-5'-0-tosylate (16) undetectable with the dicyano-heptapotassium-
Co(lll)-cobyrinate (24). The association between 5'-0-tosyladenosine (15) and
heptapotassium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylate) (17) could be verified by means of uv/vis- and 1H-nmr-spectroscopy. In
addition, for 1,N6-ethenoadenosyl-5'-0-tosylate (16) as the guest molecule luminescence-
spectroscopy was employed.
In experiments on the alkylation of Co(l)-corrins with 5'-0-tosyladenosine (15) an
increased rate-constant of alkylation of Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylate) as compared to the cobyrinate analogue was observed. The factors
causing the observed behaviour could not be identified completely and unambigiously.
Experiments on the reduction of Co(l)-corrins with sodium borohydride suggested that the
detergent-like properties of the n-decyl-10'-carboxylates is one of the main sources of the
differences in the rate-constants of alkylation.
5
ALLGEMEINER TEIL
1. Einleitung
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Derivaten des Coenzym B-12 (Adenosylcobalamln,
1), die sich ebenso wie das Coenzym B12 durch eine stabile Kobalt-Alkylbindung
auszeichnen. Diese Adenosyl-Kobalt-Bindung stellt die Grundlage für die biologische
Funktion des Coenzym B12 dar.
Adenosylcobalamln (Coenzym B1Z, 1)
6
1.1 Bedeutung von Methyl- und Adenosylcobalamln
Adenosylcobalamin (Coenzym B12,1) und Methylcobalamin (2) sind für den menschlichen
Organismus essentielle Cofaktoren.
Methylcobalamin (2) katalysiert in vivo den Methyltransfer von N5-Methyltetrahydrofolat
auf Homocystein unter Bildung von Methionin [1, 2]. Methionin entsteht auch als Produkt
der direkten Umsetzung von Methylcobalamin mit Homocystein bei 65-95 °C
(H20/8h/95°C) [3]. Methylcobalamin mit modifizierten Basen (Pseudo Vitamin B12 bzw.
Factor III) ist als Methylquelle und Elektronendonor in der Methansynthese sowie zudem in
bakteriellen Anaerobiern an der Acetatbiosynthese (Acetyl-CoA-Weg) aus C02 beteiligt [1,
2].
Adenosylcobalamin (1) hingegen katalysiert eine Reihe von 1,2-Umlagerungen mit C-C-
Bindungsbrüchen (Glutamat-Mutase, Methylmalonyl-CoA-Mutase, ct-Methylenglutarat-
Mutase), C-O-Bindungsbrüchen (Dioldehydratase, Glyceroldehydratase, Ribonukleotid-
Reduktase) und C-N-Bindungsbrüchen (Ethanolamin-Ammonium-Lyase, L-ß-Lysin-
Mutase, D-a-Lysin-Mutase, Ornithine-Mutase, Leucin-2,3-Aminomutase) [4].
Eine Reihe Coenzym B12-Analoga mit modifiziertem Adenosinteil wurde bereits synthetisiert
[5-9] und einige davon auf ihre Eigenschaften in physiologischen Systemen getestet.
Informationen über die komplementären Apoproteine zu Methylcobalamin (2) und
Adenosylcobalamin (1) liegen nur wenige vor.
Coffey beschäftigte sich zwar mit dem Tracing von Cobalamin in Leberzellextrakten von
Ratten [10], Kumar und Meyer isolierten Bi2-Transportproteine in menschlicher
Körperflüssigkeit [11], Ragsdale et al. reinigten ein zum Methylgruppentransfer befähigtes
Protein, das neben Corrin einen [4Fe-4S]1+/2+-Cluster enthielt [12]. Auch konnten die
corrinbindenden Enzyme aus Leberzellextrakten von Ratten als Apoenzyme der
Methioninsynthetase und S-Methylmalonyl-CoA Mutase identifiziert werden [13, 14], doch
blieb bis heute die Ausgestaltung der aktiven Bereiche des Apoenzyms zu Methylcobalamin
(2) selbst nach einer ersten Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse der Cobalamin
bindenden Domäne der Methionin-Synthetase von E. coli [15] praktisch unaufgeklärt.
Ebenso sind die Kristallstrukturen der Apoenzyme zum Adenosylcobalamin (1) weiterhin
unbekannt, selbst nachdem bereits vor einigen Jahren die Kristallisation der
7
Adenosylcobalamin(1)-abhängigen Methylmalonyl-CoA-Mutase des Propionibacterium
shermanii von Marsh et al. [16] und McKie et al. [17] beschrieben wurden.
Da in vitro bei homolytischer Bindungsspaltung des Adenosylcobalamin (1) in
radikalfängerfreier Lösung Zyklisierung in bedeutendem Ausmass beobachtet wird (vgl.
Kapitel 1.2), ist anzunehmen, dass neben der obligaten Substraterkennung eine der
wesentlichen Aufgaben des Apoenzyms ist Stabilisierungsreaktionen, die für die entstehenden
freien Radikale in Lösung typisch wären, z.B. Rekombination und Zyklisierung, zu
verhindern [18]. Eine Reihe von Autoren sehen daneben eine wesentliche Enzymaufgabe in
der Erzeugung einer Deformation des Corrinmoleküles bzw. -ringes, die für die Spaltung der
Kobalt-Kohlenstoffbindung ausschlaggebend sein soll [4, 18-21).
1.2 Die Kobalt-Alkylbindung
Synthese
Die Alkylierung des Kobalts in Corrinen ist in den Oxidationsstufen Co(l), Co(ll) oder
Co(lll) möglich [22-24].
Die gängigste Methode zur Co-C-Bindungsbildung ist die Reduktion des Co(ll)- oder Co(lll)-
corrin zum Co(l)-corrin mit anschliessender Alkylierung des Co(l) unter nukleophilem
Angriff auf ein Alkylhalogenid oder ein anderes Substrat mit geeigneter Abgangsgruppe. Wie
der intermolekulare, radikalische Transfer von Methylgruppen, der in Äquilibrierungsex-
perimenten beobachtet wurde [3, 25, 26], nahelegt ist die Synthese von Alkylcobaltcorrinen
auch radikalisch durchführbar. Für die Cobalamine wurde durch Blaser und Halpern die
praparative Alkylierung des Co(ll)-cobalamin (B12r, 3) mit Alkyhalogeniden gemäss der
Gleichung
2 B12r + R-X = R-B12 + Bi2a + X"
beschrieben [23].
Die Synthese der Acetale der Formylmethylcobalt-cobalamin und -cobaloxim durch
Umsetzung des Co(lll)-cobalamin bzw. -cobaloxim mit Vinylethern in Gegenwart von
Alkoholen und Basen wurde von Silverman und Dolphin untersucht [24], wobei dieser
Syntheseweg allerdings in der Literatur nicht unangefochten blieb [27].
8
Cobalamine besitzen bei der Alkylierung eine ausgesprochene Seltenselektivität Co(l)-
cornne, die bedingt durch ihre äquatoriale 4fach-Koordination durch den Cornnliganden a-
und ß-seitig zugänglich sind, zeigen ß-seitig grosse Nukleophihe. Mechanistische Faktoren
können jedoch zur Bevorzugung der a-seitigen Alkylierung fuhren So entsteht bei der
Alkylierung von Cob(l)ynnsäure-heptamethylester mit Methyltosylat via eine SN2-
Reaktion überwiegend der Co-ß-Methylcob(lll)ynnsäure-heptamethylester während bei
der Alkylierung mit Methyhodid, vermutlich über eine zweistufige Radikaireaktion,
hauptsächlich die Co-oc-Methyl-Konfiguration erhalten wird [28] Den "kompletten"1
Cob(ll/lll)yrinsäuredenvaten wie z B den 5fach koordinierten Co(ll)-Formen ist die
Alkylierung bedingt durch die Blockierung der a Seite durch die Nukleotidkoordination nur
ß-seitig möglich und auch ß-Hydroxo-cob(lll)alamin reagiert aus demselben Grund,
wahrscheinlich über einen n-Komplex als Zwischenstufe [24], nur ß-seitig
Bmdungsdissoziationsenergie
Die Bmdungsdissoziationsenergie (BDE= AHi-AH 1t vgl Abbildung 1, [29]) für die
thermische Homolyse des Coenzym B12 (1) in wässriger Lösung wurde von Halpern et al
mit 26 ± 2 kcal/mol angegeben [20] Finke und Hay schätzten aufgrund kinetischer
Messungen in Ethylenglykol die Bmdungsdissoziationsenergie der Kobalt-Alkylbindung des
Coenzym B-|2 zwischen 30,1 und 34,5 kcal/mol und führten ihr unterschiedliches Ergebnis
auf die unter den Versuchsbedingungen von Halpern stattfindende Heterolyse zurück [30]
Die Bmdungsdissoziationsenergie des basenfreien Coenzym B12-Denvats Adenosylcobinamid,
bei dessen Thermolyse im wässrigen Phosphatpuffer, pH 7, im Umfang einiger Prozente
Heterolyse eintritt, bestimmten sie zu 34,5 ± 1,8 kcal/mol [31]
Die Stabilität der Kobalt-Kohlenstoffbindung eines freien Alkylcorrnns wird nicht nur
durch den Alkylliganden, sondern auch aufgrund des sogenannten trans-Effektes durch den
auf der gegenüberliegenden Seite koordinierenden axialen Liganden beeinflusst [32] So ist
zum Beispiel gemäss der durch Methylgruppentransferexpenmente bestimmen
Gleichgewichtskonstante zwischen Co(ll)cobalamin (3), Co(ll)cobester, Methylcobalamin
(2) und Methylcobester die Co-CH3-Bindung in Methylcobalamin durch die Koordination der
axialen Base bezüglich Homolyse um ca 0,3 kcal/mol gegenüber der base-off Form gestärkt
1 Als "komplett" werden Cornne bezeichnet, bei denen analog dem Adenosylcobalamin (1)
eine Base über weitere Bausteine an das C17 gebundenen ist [22]
9
, [M L]
/TSl äH-l(gis)
1 1
} 1
/ P^l(g»s)
i
M. + L.
M-L
t 1
/ 1
/ 1
1
BDE
+
Abbildung 1: Enthalpiediagramm einer Reaktion in der Gasphase dargestellt für die homo-
lytische Bindungspaltung; AHi: Aktivierungsenthalpie der Hinreaktion; AH.i: Aktivierungs¬
enthalpie der Rückreaktion; BDE: Bmdungsdissoziationsenergie
Die Nukleotidkoordination destabilisiert hingegen gegenüber der Übertragung als formales
Methylanion auf ein Elektrophil um ca. 7 kcal/mol, und stabilisiert um ca. 4,2 kcal/mol
gegenüber der Übertragung der Methylgruppe als formelles Kation auf Nukleophile. Nimmt
man die Korrelation zwischen Basizität und Bindungsstärke in Methylcobalamin als
Anhaltspunkt, so ist im Coenzym B12(1) die Kobalt-Kohlenstoffbindung durch
Basenkoordination gegenüber Homolyse um ca. 0,7 kcal/mol geschwächt.
Spekulationen über die Art und Bedeutung sterischer Faktoren auf die Kobalt-
Kohlenstoffbindung im enzymgebundenen Adenosylcobalamin sind in der Literatur immer
wieder anzutreffen [4, 6, 19, 33, 34]. Was den Einfluss des Nukleotids auf die
Bindungsenergie der Kobalt-Kohlenstoffbindung betrifft, so vermag er für sich allein
genommen nicht die Beschleunigung um mehr als zehn Grössenordnungen der durch das
Enzym katalysierten Reaktionen zu erklären, sodass wahrscheinlich das Nukleotid mehr für
die Bindung des Cofaktors von Bedeutung ist als es zum Co-C Bindungsbruch beiträgt [31].
10
Bindungsbruch
Der Bindungsbruch der Kobalt-Alkyl-Bindung ist homolytisch durch Photolyse und
Thermolyse sowie heterolytisch durch Einwirkung von Cyanid, bei Adenosylcobalamin (1)
und analogen protonierbaren Derivaten auch mit verdünnten Mineralsäuren, durchführbar.
Bei den "kompletten" Cobalaminen wird bei der Cyanolyse gemäss Hogenkamp et al. [35] in
einem ersten Schritt der Alkylrest ß-seitig durch ein Cyanid verdrängt während in den
basenfreien Corrinen ein Cyanid zuerst an der a-Seite koordiniert. Die Geschwindigkeit des
Bruches der Kobalt-Alkylbindung mit Cyanid wird somit durch Basenkoordination
in trans-Position zum Alkylrest beeinflussbar. Die meisten Alkylcobalamine dealkylieren
mit Cyanid in alkalischer Lösung nur sehr langsam, doch verläuft die Dealkylierung von
Corrinen, die a-seitig keine Base koordinieren, bedeutend schneller.
Auch die Natur des Alkylrestes spielt eine Rolle. Coenzym B12 (1) dealkyliert z.B. im
Vergleich zu Methylcobalamin (2) mit Cyanid schnell. Jacobson [7] berechnete für die
Cyanolyse von 1,Ne-Ethenoadenosylcobalamin (4) aus fluorometrischen und spektrophoto-
metrischen Messungen eine Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung von ca. 0,058
min"1 und für Coenzym B-|2(1), das aufgrund fehlender Fluoreszenzeigenschaften nur
spektrophotometrisch untersucht wurde, einen Wert von 0,050 min-1.
Die Photolyse von Alkylcorrinen erfolgt unter homolytischem Bindungsbruch und
generiert ein Radikalpaar, dessen Geschwindigkeiten von Rekombination, Abfangreaktion und
Abdiffusion in Abhängigkeit von der Grösse des Alkylrestes und der Temperatur in weiten
Grenzen variieren kann.
Abbildung 2 präsentiert eine phänomenologische Beschreibung des Metall-Kohlenstoff-
Bindungsbruches: k-\ stellt die Geschwindigkeitskonstante für die Bildung eines geminalen
Radikalpaares in Lösung und k^ die Geschwindigkeitskonstante für die Rekombination freier
Radikale zu einem geminalen Radikalpaar dar, kc bezeichnet die Rekombination geminaler
Radikale, kd die Abdiffusion der geminalen Radikale voneinander. KaW steht für die Reaktion
eines oder beider Radikale mit einem Radikalfänger [36].
Symons et al. [37] beispielsweise bestrahlten Methyl- (2) bzw. Adenosylcobalamin (1) in
Deuteriumoxid/Deuteromethanol-Glass bei 77 K. Aus dem ESR-Spektrum der
Photolyseprodukte des Methylcobalamin (2), Co(ll)-cobalamin (3) und ein Methylradikal,
11
leiteten sie einen mittleren Radikalabstand von cirka 8,3 A, für die analogen Produkte des
Ethylcobalamin (5), Co(ll)-cobalamin (3) und das Ethylradikal, weit schwächere
Wechselwirkungen und einen vergrösserten Abstand ab. Bei der analogen Photolyse des
Adenosylcobalamin (Coenzym B12,1) [37, 38] wurde erst ab ca. 200 K ein ESR-Spektrum
beobachtbar.
k k
[M-L] ^[M* •L]^M* -L -^rAbfangprodukte
Abbildung 2: Reaktionsmöglichkeiten bei homolytischem Bindungsbruch [36]
Die Quantenausbeuten der Photolyse von Alkylcobalaminen liegen für Wellenlängen zwischen
250 und 570 nm, bei 0,1 bis 0,5 [39]. Die Quantenausbeuten der base-off Form sind
wesentlich kleiner als die der base-on Form. So wurde die Quantenausbeute <D der
präparativen Photolyse für die base-off Form des Coenzym B12 (1) zu <D = 0,04 (pH 1, 470
nm) und für die base-on Form zu * = 0,13 {pH 7, 455 nm, vgl. auch Endicott [40] mit
*45S nm (Coenzym Bu, base-on) * 0,09 ± 0,035) bestimmt [39]. Untersuchungen im
Nanosekundenbereich hingegen lieferten mit *» 0,23 für base-on und <t>= 0,045 ± 0,015
für base-off viel höhere Werte [34].
Produkte des Bindungsbruches
Die anaerobe Thermolyse von Adenosylcobamid, das durch Hydrolyse mit Ce(lll)(OH)3 aus
Adenosylcobalamin (1) partiaisynthetisch zugänglich ist, in wässrigem Phosphatpuffer pH
7 ergibt 6% Adenin, 90% zyklisches 8,5'-Anhydroadenosin (6) sowie 4% 5'-
Deoxyadenosin. In Anwesenheit von 200 Äquivalenten 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinoxid
(TEMPO) verschieben sich die Verhältnisse zu 6% Adenin, 89% 5'-TEMPO-adenosin, < 5%
zyklischem 8,5'-Anhydroadenosin (6) und < 2% 5'-Deoxyadenosin [29]. Bei der anaeroben
Thermolyse von Adenosylcobalamin (1) in Ethylenglykol werden hingegen 60% 8,5'-
Anhydroadenosin (6) und 40% 5'-Deoxyadenosin, mit 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinoxid
im Überschuss praktisch quantitativ 5'-TEMPO-adenosin, erhalten [30].
12
Als Photoreaktionen in aprotischen Lösungsmitteln ist bei den Alkylcobalaminen neben
dem homolytischen Co-C-Bindungsbruch auch die Abspaltung des C(10) Protons möglich
[41].
Die Produkte der Photolyse sind eingehend untersucht worden. Mittels ESR konnten die durch
homolytische Bindungsspaltung aus den entsprechenden Alkyl-(pyridinato)-cobaloxim-
komplexen hervorgegangenen Isopropyl-, Isobutyl-, n-Pentyl- und Cyclohexylradikale in
entgastem Chloroform beobachtet [42] sowie Co(ll)-cobalamin (3) und Alkylradikale als
Photolyseprodukte von in Deuteriumoxid/Deuteromethanol gelösten Organocobalaminen
nachgewiesen werden [37, 43, 44].
Die Produkte der aeroben Photolyse von Adenosylcobalamin (1) sind neben dem Aquo-
Co(lll)-cobalamin (9) das zyklische 8,5'-Anhydroadenosin (6), der Adenosylaldehyd (7)
[45], sowie gemäss Johnson et al. [46] die Adenosin-5'-carbonsäure (8) (Abbildung 3).
Hay und Finke erhielten bei der anaeroben Photolyse von Adenosylcobinamid in Gegenwart
eines 200-fachen TEMPO-Überschusses 97% Tempo-Adenosin sowie 3% 5'-Deoxyadenosin,
in Abwesenheit von Radikalfängern 93% zyklisches 8,5'-Anhydroadenosin (6) und 7% 5'-
Deoxyadenosin [31].
N— N NH, NHj M/j
££1hv/02
OH OH
6
toi * toi*
wOH OH
7
OH OH
8
+ Co(III)- cobalamin 9
Abbildung 3: Produkte des Bindungsbruches von Adenosylcobalamin (1) in aerober Lösung
Anaerobe Photolyse von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) lieferte 1,N6-Etheno-5',8-
cyclo-5'-deoxyadenosin, aerobe Photolyse den 1,N6-Ethenoadenosin-5'-aldehyd [7] wobei
Co(ll)-cobalamin (3) sofort zu Aquocobalamin (B12a, 9) oxidiert wird.
13
Als Produkte der Cyanolyse des Adenosylcobalamin (1), für die sie einen
Reaktionsmechanismus gemäss Abbildung 4 postulierten, wurden von Johnson und Shaw
[46] Cyanocobalamin (10), welches direkt nach der Cyanolyse in der Dicyanoform 11
vorliegt, Zuckercyanhydrin sowie Adenin isoliert.
Hogenkamp und Oikawa [9] cyanolysierten 2',5'-Dideoxyadenosylcobalamin bzw. 5'-
Deoxythymidylcobalamin unter analogen Bedingungen und erhielten nach Aufarbeitung
ebenfalls Cyanocobalamin (10), sowie Adenin bzw. Thymin.
Abbildung 4: Reaktionsmechanismus der Cyanolyse von Adenosylcobala¬
mln (1) unter Lichtausschluss nach Johnson und Shaw [46]
Kinetik der Reaktionen am Kobaltzentrum
Bei der Reduktion der Co(lll)-corrine Cobyrsäure, Pseudovitamin B12 sowie Faktor III mit
Natriumborhydrid in grossem Überschuss in wässriger Lösung (pH 8,8) zu Co(l) ändert die
Absorption bei 387 nm gemäss Moskophidis [47] mindestens für die halben Umsatz linear
mit der Zeit. Diese Beobachtung legt nahe, dass bei diesen Reduktionen die Lösung des
zugegebenen Natriumborhydrids geschwindigkeitsbestimmend ist.
Für die Umsetzung von Alkylhalogeniden mit Co(ll)-cobalamin (3) in methanolischer
Lösung sowie den Alkylchloriden und -bromiden in wässrigem Medium wurden
Geschwindigkeitsgesetze 2. Ordnung gefunden. Alkyliodide in wässriger Lösung gehorchen
einem Geschwindigkeitsgesetz 3. Ordnung [23]. Für die Seitenselektivität der Alkylierung
von Co(l)-cobalamin ist eine Abhängigkeit von der Abgangsgruppe des Alkylierungsmittels
zu erwarten, wie sie z.B. bei der Alkylierung von Co(l)-cobester mit Methyltosylat und
14
Methyiiodid gefunden wurde [28]. Die Geschwindigkeitsgesetze der Alkylierung von Co(l)-
cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat) in Wasser und Methanol und ihre Geschwindigkeitskonstanten sind Gegenstand der
vorliegenden Arbeit.
Die aerobe oder in Gegenwart von 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinoxid als Radikalfänger
durchgeführte thermolytische oder photolytische Homolyse der Kobalt-Kohlenstoff-Bindung
von Alkylcobalaminen folgt einer Kinetik erster Ordnung [20, 30, 39]. Die Photolyse unter
anaeroben Bedingungen ist in der Regel langsamer als in Gegenwart von Sauerstoff oder eines
anderen Radikalfängers und zeigt stärkere Abweichungen von einer Kinetik erster Ordnung
[39, 48]. Die anaerobe Photolyse des Coenzym B12 (1), bei der das bei der Homolyse
entstehende Adenosylradikal zu 8,5'-Anhydroadenosin (6) intramolekular zyklisieren kann,
bildet hiervon eine Ausnahme.
Aus Experimenten zur anaeroben Thermolyse von Adenosylcobalamin (1) in Ethylenglykol,
welche als Produkte 8,5'-Anhydroadenosin (6) und 5'-Deoxyadenosin lieferte, wurden die
Geschwindigkeitskonstanten kcyC|. für die Zyklisierung des Adenosylradikals zum 8,5'-
Anhydroadenosin (6), für die Abstraktion eines Wasserstoffes aus dem Lösungsmittel kabf
und für die Rekombination kcage des Adenosylradikales mit B12r (3) bestimmt zu kcyC|.(110
°C)= 5x105 s-\ kab(. (110 °C)= 7x103M"1s-1 und kcage= 3x108M-1s1 [30]. Diese Werte
entsprechen ziemlich genau der Abschätzung, welche von Chen und Chance [34] mit
Nanosekunden-Spektroskopie für die Photolyse (wässrige Lösung, N2-gesättigt) getroffen
wurde. Chen und Chance bestimmten nämlich kcyoi.(FiT) zu 104 s_1 oder weniger und k^ge zu
108-109M-1S"1.
Die Geschwindigkeitskonstanten der Thermolyse des Kobalt-Kohlenstoff-Bindungsbruches
des Coenzym B12 (1) wurden von Halpern et al. zu k^lOO °C)= (1,00 ± 0,04)x 10~4 s_1
bestimmt [20].
15
1.3 Micellenmoleküle
Als Micellenmoleküle werden nachfolgend Verbindungen bezeichnet, die aufgrund ihrer
Grösse und Eigenschaft andere Moleküle zu solubilisieren einer Micelle ähnlich sind jedoch
ihre micellaren Eigenschaften nicht erst durch das Zusammenwirken eines Ensembles
gleichartiger Moleküle entfalten [49, 50]. Sie wurden vorwiegend als Komplexbildner
hergestellt oder als synthetische Reaktionsräume, doch spielten bei ihrer Konzeption auch
potentielle Anwendungen in der Pharmazie, z.B. eine Reservoirfunktion für ein
Depotpräparat, eine Rolle [50].
Die von Tomalia et al. [51-55] konzipierten Dendrimere (Abbildung 5) unterscheiden sich
von klassischen Polymeren dadurch, dass sie aus drei strukturellen Einheiten bestehen:
einem Kern, nach einem einfachen und einheitlichen Verzweigungsmuster aufgebaute und
sich wiederholende Schichten, und terminalen Funktionen. Dieses Bauprinzip erlaubt eine
kontrollierte Raumerfüllung, Grösse und organische Funktionalität. Maciejewski [56] und
Gennes [57] leiteten aufgrund theoretischer statistischer Arbeiten entsprechende Formeln
her, die die Kettenlängen und Verzweigungsmultiplizitäten der Bauelemente mit diesen
Parametern in Beziehung setzen.
Arborole, ein Konzept von Newkome et al. [49, 58], basieren auf demselben Bauprinzip,
doch werden die Arborole ausgehend von einem "Stamm" synthetisiert und bilden eine
Baumstruktur mit sich regelmässig wiederholendem Verzweigungsmuster, z.B. 12. Die
durch die peripheren Endgruppen gebildete Oberfläche ist konkav gewölbt und kann im
Gegensatz zu den Dendrimeren keine geschlossene Kugel bilden.
Pedersen's Coranden [59] sind zyklische Polyether ("Kronenether") und besitzen im
Gegensatz zu den Kryptanden von Lehn et al. [60] nur eine einzige, brückenfreie
Ringstruktur (z.B. 13, Abbildung 6).
Die von Cram [61] beschriebenen Sphäranden (z.B. 14, Abbildung 6) und die Cyclophane
nach Diederich [62] sind in (poly)-Zyklen angeordnete, (poly)-zyklische aromatische
Kohlenwasserstoffe, die einen Hohlraum weitgehend vorbilden.
Für die Kraken/Tentakel-Moleküle von Vögtle und Weber [63] sowie die "Enzymmodelle"
von Murakami [64] und Suckling [65] sind mehrere an eine zentrale Ringstruktur
angefügte (aliphatische) Ketten charakteristisch.
Letztere synthetisierten Azaparazyklophane mit Alkylseitenketten bzw. Benzol-1,3,5-tris-
(11-pyrimidinium-undecanyl)-tricarboxylat-trichlorid, die in der Lage waren weitgehend
selektiv Gastmoleküle, z.B. 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-oxyl und Phenol, zu
inkorporieren.
16
in in in-N CH2CH2C NHCHjCH, N CH2CH2 C NHCHfH2 N CH2CH2 C NHCH2CH2NH2
'
« * >
Kern Wiedeiholungseinheit
vv
'
1 Generation 2 Generation
terminale Funktion
V
Y'
3 Generation
Abbildung 5 "Starburst Dendnmere" nach Tomalia [51-55], oben schematische Darstellung der
Topologie, unten Ausschnitt aus der Molekulstniktur eines Dendnmeren
C»j
£ONHC(CHfiH)3
V ^CONHC(CHfiH)3/° /CO,•ONHC(CHflH)3
ONHC(CHfiH)3
P CONHCiCHfiHhf ^CONHC(CHfiH)3^C\0NHC(CHfiH),
CONHC(CHfiH)3
[27]-Arborol
12
[18]-Krone-6
13 14
Abbildung 6 Em [27]-Arborol (12), [18]Krone-6 (13), ein Pedersen Corand, Beispiel eines
Sphäranden (14)
17
1.4 Wirt-Gast-Komplexe
Das Gebiet der Wirt-Gast-Komplexe wurde von Freudenberg und Meyer-Delius [66]
begründet, welche die Aduktbildung zwischen lod und Cyclodextrinen auf die Einlagerung des
lods in molekulare Hohlräume der Cyklodextrine zurückführten. Seither wurden Wirt-Gast-
Molekülkomplexe, wenn auch biologisch nicht funktionsfähige, synthetisiert, die mit
Enzymen vergleichbare Stabilitäten aufweisen, und Enzymmodelle als Wirt-Gast-Komplexe
hergestellt. Ziel der Wirt-Gast-Komplexierung ist die molekulare Erkennung, selektive
Substratbildung, Katalyse, Regulation und Transport.
Die Wirt-Gast-Komplexchemie ist durch zwei Prinzipien gekennzeichnet: dem Prinzip der
sterischen und elektronischen Komplementarität [61, 62] und dem Prinzip der
Präorganisation der Bindungsstelle vor der Komplexierung [67].
Das Prinzip der elektronischen und sterischen Übereinstimmung (Komplementarität) ist
das für die molekulare Ebene formulierte Schlüssel-Schloss-Prinzip von Emil Fischer
[68]. Das Prinzip der Präorganisation der Bindungsstelle besagt, dass wenn im
Komplexierungsschritt die Bindungsstellen erst durch den eintretenden Gast organisiert
werden müssen, die benötigte Energie auf Kosten der freien Energie für die Komplexbildung
geht und der Komplex als Ganzes destabilisiert wird. Im Extremfall bleibt die Komplexierung
aus.
Als treibende Kräfte bei der Wirt-Gast-Assoziation können je nach spezifischer Situation
der "hydrophobe Effekt", Elektronen-Donor-Akzeptor-Wechselwirkungen, Wasserstoff¬
brückenbindungen oder ionische Kräfte wirken [69].
Mit hydrophobem Effekt wird der, durch die starken Kohäsionskräfte der Wassermoleküle
bedingte, stark positive Entropiebeitrag bei der Freisetzung der Grenzflächen-
Wassermoleküle unpolarer Substrat- bzw. Wirtmoleküle bezeichnet. Bei der
Komplexbildung werden die Wassermoleküle dort von der Oberfläche verdrängt, wo der Gast
einlagert. Wässrige Lösungen können somit Voraussetzung für die Wirt-Gast-
Komplexbildung sein [70].
Unter der Bezeichnung Elektronen-Donor-Akzeptor-Wechselwirkungen versteht man
schwache intermolekulare Wechselwirkungen zwischen elektronenreichen Wirten und elek¬
tronenarmen Gästen bzw. umgekehrt. Diese Wechselwirkungen bestehen hauptsächlich aus
elektrostatischen Wechselwirkungen, Polarisations- und Charge-Transfer-
Wechselwirkungen sowie Dispersionskräften [62].
Den Einfluss von Wasserstoffbrückenbindungen auf die Bildung von Wirt-Gast-Komplexen
illustriert die von Rebek et al. [71] durchgeführte stöchiometrische Komplexierung von
18
Heteroarenen, unter anderem auch 9-Ethyl-adenin, durch nicht makrozyklische,
spaltförmige Rezeptoren.
Nicht bei allen Stoffklassen sind die Bedingungen für eine Wirt-Gast-Assoziation aber
gleichermassen klar. Für Zucker, Aliphaten und Heteroaliphaten fehlen bislang noch wirk¬
same synthetische Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit werden nun die Gasteigenschaften
von 5'-0-Tosyladenosin (15) und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) untersucht.
Die Methoden zur Untersuchung von Wirt-Gast-Komplexen gliedern sich in vier Gruppen:
die Fest-flüssig- und Flüssig-flüssig-Extraktion, die Bestimmung der Stöchiometrie und
Stabilität der Komplexe durch 1H-NMR-Titration und optische Titration, die kompetitive
Hemmung der Komplexierung eines fluoreszierenden Gasts durch einen
nichtfluoreszierenden Inhibitor, sowie die 1H-NMR-spektroskopische Abschätzung der
Assoziation eines Wirt-Gast-Komplexes in unterschiedlichen Lösungsmitteln [62].
Bei jeder Analyse des Wirt-Gast-Verhaltens, insbesondere apolarer Gast- oder Wirtmole¬
küle ist, wenn aussagefähige Daten erzielt werden sollen, das Selbstaggregationsverhalten
der Wirt- und Gastmoleküle zu untersuchen. Abgesehen von schlecht definierten Wirt-Gast-
Komplexen wird bei manchen Wirten zudem oberhalb der kritischen Aggregationskon¬
stanten eine mit steigender Konzentration zunehmend stärker werdende Linienverbreiterung
der Signale gefunden [62].
Betreffend die a priori Abschätzung der Selbstaggregationstendenz liefern Arbeiten von Die-
derich [62] erste Hinweise darauf, dass Komplexe von Gastkomponenten mit aus dem Hohl¬
raum ragenden ionischen Gruppen eine beträchtlich niedrigere Aggregationstendenz haben.
Unter den analytischen Methoden zum Nachweis von Einschlusskomplexen hat sich die 1H-
NMR-Spektroskopie, vor allem bei den Cyklophanen, durchgesetzt [62, 72]. Sie bietet
neben Informationen zur Kinetik auch Information zur Struktur der gebildeten Komplexe. So
lassen z.B. Signalverbreiterungen auf innerhalb der 1H-NMR-Zeitskala ablaufende
Dekomplexierungsschritte oder Änderungen der chemischen Verschiebungen auf die relative
Lage im Wirt schliessen [72]. Die Fluoreszenzspektroskopie dagegen ermöglicht aufgrund
der Intensität und der Lage des Emissionsmaximums Aussagen über die Polarität der
Bindungsstelle [73, 74].
Als Wirt-Gast-Komplexe sind auch die synthetischen Enzymmodelle zu verstehen. Wie am
Beispiel von Proteasen durch Rebek et al. [75, 76] gezeigt werden konnte, kann die Katalyse
durch das Zusammenwirken der zum Substrat hin konvergierenden Gruppen im aktiven
Zentrum des Enzym bedingt sein. Trotz nur geringer Effekte der einzelnen isolierten
katalytisch aktiven Gruppen wird durch das Zusammenwirken mehrerer aktiver Gruppen die
Reaktion um Grössenordnungen beschleunigt.
19
1.5 Der Käfigeffekt
Die Interpretation chemischer Reaktionen wird in der Regel auf der Basis der aus der Gas¬
phase abgeleiteten Theorie des Übergangszustandes vorgenommen. Der Übergangszustand im
Kontinuum hat sich als Modell für die flüssige Phase jedoch schon lange als unzuverlässig
erwiesen [77]. In der flüssigen Phase werden Phänomene beobachtet, welche sich mit einer
einfachen Theorie des Übergangszustandes nicht mehr vereinbaren lassen. Das Phänomen
magnetischer Feldeffekte auf chemische Radikalreaktionen [78] und CIDNP lassen sich z.B.
ohne Käfigeffekt nicht erklären.
Der Begriff des Käfigeffekt wurde 1934 von Franck und Rabinovitch [79] eingeführt und ist
mittlerweile experimentell und theoretisch gut fundiert. Unter Käfigeffekt verstehen Franck
und Rabinovitch die zeitweise Fixierung eines Reaktandenpaares durch eine Solvenshülle.
Der Käfigeffekt wurde bis anhin in einer Reihe von Reaktionen nachgewiesen. Die ersten
experimentellen Arbeiten nach Franck und Rabinovitch wurden von Noyes für die Photo¬
dissoziation von I2 durchgeführt. 1952 und später untersuchten Williams, Hamill, Schwartz
and Burell unter Verwendung von Radikalfängern eine Reihe organischer und anorganischer
Systeme, welche sowohl thermisch als auch photolytisch initiiert werden. Szwarc et al. be¬
schäftigten sich ab 1954 mit dem thermischen Zerfall von Diacylperoxiden und der Photo¬
lyse von Azomethan und Perfluoroazomethan. Ab 1955 erscheinen Studien von Hammond und
Mitarbeitern über den thermischen Zerfall von Azonitrilen. Breitere Beachtung findet der
Käfigeffekt erst ab 1960 durch Untersuchungen über den Temperatureffekt, den Einfluss
von Viskosität, Radikalfängerkonzentration, Stereochemie, elektrostatischer Ladung bei
geminalen Radikalen, sowie der Entdeckung des Einflusses des Käfigeffekt auf die absoluten
Geschwindigkeitskonstanten. Das Interesse am Käfigeffekt steigerte sich noch durch die
Entdeckung von CIDNP (chemically induced dynamic nuclear p_olarization), einer
spektroskopischen Methodik bei der als Folge einer anormalen Verteilung der Spinzustände
im NMR Emissionssignale entstehen können und dessen Grundlage unter anderem der
Käfigeffekt ist.
Untersucht wurden auch die kompetitive radikalische Bromierung von Toluol [80], ESR-
Spektren bei geminalen Isopropyl-ketyl-Radikalen [81], Isotopenanreicherung bei der
Photolyse von Dibenzylketon [82], die Photolyse von H2O in Ar-Matrix [83] und die
Photolyse von l2, Hl sowie H202 [84]. Balk et al. berechneten das Photolyseverhalten von l2
20
in flüssigem CCI4 und Ethan auch theoretisch [85] Ein dynamischer Käfigeffekt wurde für
Cl2, ICI, CH3I in Edelgasmatizen gefunden Zudem liegen einige Untersuchungen über den
Käfigeffekt in Micellen (z B ESR [86], 13C Anreicherung [82]) und vergleichende
Messungen für Reaktionen in Micellen und freier Lösung vor [81] Jacobson und Bergmann
[87] entdeckten auch in Lösungen von Organoubergangsmetallverbindungen geringer
Viskosität bedeutsame Käfigeffekte
In Übereinstimmung mit der später von Chen et al [34] durch Nanosekunden Photolyse zu
108 109 M 1sec 1 bestimmten Rekombinationsgeschwindigkeit kc des durch die Photolyse
der Kobalt Kohlenstoff-Bindung generierten Radikalpaares in Adenosylcobalamin (1) bei
RT in wässriger Lösung konnten Endicott et al [40] für dieselbe Reaktion durch
Picosekunden Blitzphotolyse für die Rekombinationsgeschwindigkeit kc und die Diffusion kd
zeigen, dass kc= (1,3±1,1) x 109 sec1 und kd= (0,5±0,4) x 109 sec
1
In der flussigen Phase ist die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation von Molekül
fragmenten geringer als in der Gasphase Die molekulare Grundlage dieses Effektes ist die
Umhüllung der Reaktanden durch Lösungsmittelmolekule, welche die sofortige Entfernung
der Partikel voneinander verhindern Das mittlere Kraftpotential zwischen Molekülen in
Lösung, Radikale eingeschlossen, ist nämlich gewöhnlich anziehend und weist ein relativ
tiefes Minimum beim Abstand der nahesten Annäherung auf [81]
Für die Beschreibung des Käfigs wurden mehrere Modelle entwickelt
Das einfachste mechanistische Modell einer Reaktion in der Gasphase (Abbildung 1)
postuliert, dass bei Überschreiten einer gewissen Energiebarriere (AH1) eine Reaktion
stattfindet, und dass sich die Reaktanden voneinander in die Unendlichkeit entfernen Die
Energiebarriere der Ruckreaktion (AH 1) bezeichnet dementsprechend die, von sich aus dem
unendlichen annähernden Reaktanden benötigte thermische Energie zur erfolgreichen
Ruckreaktion
Zahlreiche theoretische Arbeiten haben versucht, die Realität der flüssigen Phase
angemessen zu beschreiben
Wie am Beispiel der Photolysereaktionen, die sich im Picosekundenbereich abspielen,
besonders deutlich wird, beinhalten chemische Reaktionen in Lösung typischerweise schnelle
oder hochfrequente gelöste Partikeln in relativ langsamen Lösungsmittelmolekulen Die
21
Autokorrelationsfunktion (dx(t)/dt) beschreibt den über das Ensemble gemittelten Zerfall
einer Molekülgeschwindigkeit (v) von einem Ausgangswert v=1 bei t=0 zur Maxwell-
Boltzmann-Verteilung des Gleichgewichts von <v>= 0 bei t= ~.
Das Brownsche Bewegungsmodell, beschrieben durch die Autokorrelationsfunktion
dK(t)/dt= exp[-ßt],
mit ß gleich dem Reibungkoeffizient eines Lösungsmittelmoleküles sagt Dissipation ohne
Oszillation voraus.
Das Modell des starren Käfigs mit dem Ansatz für eine Autokorrelationsfunktion zu
dK(t)/dt= cos(cat)
mit (cot) der Oszillationsfrequenz im Käfig und t der Zeit steht für Oszillation ohne
Dissipation.
Die Realität spielt sich zwischen diesen beiden Extremen ab. Muro, Kubo und Zwanzig [88]
entwickelten daher erstmals ein Mischmodell mit erweitertem, frequenzabhängigem
Reibungskonzept. Kramer [89] leitete für eindimensionale parabolische Barrieren einen
sogenannten "Transmissionskoeffizienten" k ab mit Frequenz coD und £, der reduzierten
Masse des effektiv reagierenden Moleküles:
k= k/kTST= [1+(C/2cob)2]1/2-(C/2cob)
An der zu einer gegenüber der Gasphase (krsT) verringerten Geschwindigkeit wird deutlich,
dass die Anwesenheit eines Lösungsmittel automatisch zu einem Käfigeffekt führt.
Für Radikalreaktionen wurden noch eine Reihe weiterer Modelle entwickelt, um die
Geschwindigkeitskonstanten der Reaktionen zu berechnen. Das einfachste Modell für die
flüssige Phase ist die Smoluchowski-Gleichung für die diffusionskontrollierte Reaktion
sphärischer Reaktanden. Modelle unter Einbezug ionischer Kräfte, nichtsphärischer
Geometrie, statistischer Spinverteilungen und der Käfigeigenschaften von Micellen liegen
ebenfalls vor [84].
Während für sehr einfache Verhältnisse, wie z.B. die Photodissoziation von H20 in einer
Argonmatrix, die Mechanistik aufgeklärt werden konnte [83] ist momentan der Ansatz für
komplexere Systeme die thermodynamische Betrachtungsweise.
22
Die thermodynamische Betrachtungsweise des Käfigeffekts sei anhand des Diagrammes
der freien Energie (AG) (Abbildung 7) für die homolytische Bindungsspaltung (Reaktions¬
schema Abbildung 2) erläutert.
Nach Homolyse (k,) entfernen sich die Reaktionspartner nicht augenblicklich voneinander
sondern verbleiben in nächster Nähe. Die Radikale können nun entweder rekombinieren (kc)
oder den Lösungmittelkäfig verlassen (ka). Frei in der Lösung befindliche Radikale reagieren
endgültig zu Abfangproduken ab (kAbf.) oder treten wieder in eine, ein komplementäres
Radikal umgebende Lösungsmittelhülle ein (k.j).
Abbildung 7 stellt das Diagramm der freien Energie dieser Reaktionen in Lösung dar. Für
jeden der beschriebenen Schritte ist eine Aktivierungsbarriere zu überwinden. Dabei
können selbstverständlich die Summanden AH und TAS jeweils andere Einflussfaktoren und
Abhängigkeiten aufweisen, sodass für AS und AH unterschiedliche relative Barrieren und
Energien möglich sind und der Käfigeffekt keine einfache Temperaturabhängigkeit aufweist
[90].
[M L] [M L] [(M bz»L). R)
rr\ 'AGc
\ : s\—;' V j /A.GA 4 gm
AGl \ \ >>-v
i (M L) Freie Radikale \
; Käfig \
-1 Abfangprodukte
Reaktionskoordinate
Abbildung 7: Schema der freien Energie, AG, für die Bindungshomolyse in Lösung
Koenig und Finke [36] wandten die thermodynamische Betrachtung des Käfigeffektes bei
kobaltorganischen Verbindungen an und prägten dabei den Begriff der fraktionalen Käfig¬
effizienz Fe (Fc= kc/fkc+kd)). Sie stellten fest, dass ohne Kenntnis der Käfigeffizienz die
Reaktionskinetik nicht mit der beobachteten Bindungsenergie AHoi,s korreliert werden kann.
1
ML
Edukt
23
1.6 Arbeitshypothese
Die Geschwindigkeitskonstante für die Homolyse der Adenosyl-Kobalt-Bindung im Coenzym
B12 (1) bei 30 °C ist mit ca. 10"7 sec1 ungefähr 10"9 mal kleiner als die Geschwindig¬
keitskonstante enzymatischer Reaktionen mit Beteiligung des Coenzym B12 [4]. Die
Beschleunigung der enzymatisch katalysierten Umlagerungsreaktionen für Coenzym B12 (1)
um Grössenordnungen verglichen mit der Homolysegeschwindigkeit, die die Adenosyl-
Kobalt-Bindungsenergie erwarten lässt, sind noch unerklärt. Trotz aller Unsicherheiten
über die Konstitution des Reaktionsraumes Coenzym Bi2-katalysierter Reaktionen gilt
jedoch die Rolle des Coenzym B12 (1) als Quelle für ein 5'-Adenosylradikal als gesichert
[11-
Gesucht wurde nun eine Modellverbindung für das Coenzym B12 (1), die einen
Reaktionsraum zur Verfügung stellt, in dem das Adenosyl-Kobait-Radikalpaar möglichst eine
gegenüber dem homogen gelösten Coenzym B12 (1) verlängerte Lebensdauer aufweist.
Ein micellartig erweitertes, mit 2',3'-lsopropylidenadenosyl alkyliertes Cobyrinsäure-
derivat, Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-(2",3"-isopropyliden-adenosyl)-cobamido-N,N',
N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat), war bereits von Stepanek [91]
synthetisiert worden (Abbildung 8a).
KOOCICH^^INOC
CHi
KOOC(CH,)iSINOC
CONHICHJuPOOK
'ICH,
CONH<CH,)j:OOK
KOOC(CH1)U^NOC CONHiCHtlitCOOK
(16 b)
Abbildung 8 a:
24
Es bot sich daher an zu untersuchen, ob das Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) als Reaktionsraum für Reaktionen des Adenosylradikals dadurch
geeignet ist, dass die entstehende Adenosyleinheit mit den N-Hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)en tendenziell assoziiert und so zu einer Verlängerung der Lebensdauer eines
durch Homolyse entstehenden geminalen Radikalpaares führen könnte.
Vom Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) waren
bereits einige Eigenschaften, die eine Behinderung der freien Abdiffusion der beiden
Fragmente eines Radikalpaares wahrscheinlich erscheinen Hessen, bekannt bzw. Hessen sich
aufgrund der Konstitution ableiten:
Die sieben n-Decyl-10'-carboxylat-Ketten geben dem Cobamido-N,N',N",N'",N"",
N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) eine micellartige Konstitution
(Abbildung 8b).
0%3^
CONHfCHJifiOOKV
- CH1 f-CONH(CH,)„fOOKKOOC(CH,),JmOC
KOOCfCH3)lcflNOC
CONHtCHJtfiOOi
VYKOOCiCHJxflliOC CONHICHJ^OOK
Q hydrophiler Teil
I lipophiler Teil
Schematische Darstellung einer Micelle Struktur des Heptakalium-dicyano-Co(III)-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N,"",N -
hepta-(n-decyl-lO'-carboxylat) (17)
Abbildung 8 b
25
In Organoübergangsmetallverbindungen sind Käfigeffekte ein anscheinend
verbreitetes Phänomen [87] (Abbildung 8c).
[M-L] t~> [Ü #L] £. M L* ---->
Eduktkc k-l
Radikalpaar freie Radikale
kl = Homolyse
kc = Bindungsbildung
kd = Diffusion zu freien Radikalen
k-l= Rückbildung des Radikalpaares
M=Co,Wetc.
Abbildung 8 c
Die Kobalt-Kohlenstoff-Bindung in Alkylcobyrinaten und Alkylcobamido-N,N',N",
N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)en [91] ist photolytisch unter
Homolyse spaltbar (Abbildung 8d).
Folge¬produkte
Abbildung 8 d
26
Das bei der Synthese von Hexakalium-2',3'-isopropylidenadenosyl-aquo-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) eingesetzte
Alkylierungsmittel 2',3'-lsopropyliden-5'-tosyl-adenosin liess sich nur mit
Schwierigkeiten vom Produkt abtrennen [91] (Abbildung 8e)
Abbildung 8 e
Inwieweit das Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n decyl-10'-carboxylat)
einen Reaktionsraum für durch Homolyse seiner Alkylderivate entstandene Radikalpaare
darstellt, sollte über das Assoziationsverhalten mit den abgespaltenen Fragmenten ähnlichen
Verbindungen untersucht werden können Dazu boten sich einerseits das 5'-0-Tosyladenosin
(15), andererseits das fluoreszierende l,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) als
Probemoleküle an Beide Verbindungen ermöglichen als Alkyherungsagenzien durch
Umsetzung mit Co(l)-cornnen die Synthese Coenzym B12-analoger Verbindungen Ein
eventuelles Assoziationsverhalten sollte sich über Konzentrationsbestimmung mit
verschiedenen spektroskopischen Methoden (UV/vis- & 1H-NMR-Spektroskopie)
bestimmen lassen Die Lumineszenzspektroskopie ermöglicht zudem eine Aussage zur
räumlichen Nähe von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) und Kobaltion (Abbildung 8f)
27
CONHICHJhPOOK^~i CH, f-CONH(CH,)„pOOK
KOOC(CH,),JINOC -\ /**^X~S*t£H,
CONHfCHJ^OOl
KOOQCH^nfmOC -y/^KOTN=\£H,
CH, ^^ y ^ CH,
S CVKOOCtCH^^mOC CONWCHJgPOOlC
COOK
--. CH, rCOOK
KOOC-\ /^A.^\CW
VYCOOKCOOK
«),
b) OH OH
UV/vIs-Spektroskople
'HNMRSpektroskoplc
Mr b. zudem :
Totallumineszenzspektroskopie
Abbildung 8 f
Ein eventuelles Assoziationsverhalten sollte sich auch in der Alkylierungsgeschwindigkeit
niederschlagen. Dazu ist die Alkylierungsgeschwindigkeit der Co(l)-corrine mit den bereits
auf das Assoziationsverhalten untersuchten Verbindungen zu untersuchen (Abbildung 8g).
28
jmattSBmL^S^^r
fV?l (15)
«jy-
KOOC
KOOC'
Abbildung 8 g
Zu Beginn der Arbeit waren die notwendigen Edukte und Vergleichsverbindungen zu
synthetisieren (Abbildung 8h). Dabei handelte es sich neben dem miceiiartigen Grundkörper
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (17), für den bereits eine wenn auch in der Folge noch zu optimierende
Synthesevorschrift bestand, um seine Adenosyl- und 1,N6-Ethenoadenosylanalogen (18 &
19).
Um den Effekt der Hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)e zu isolieren, mussten zudem von
sämtlichen zu untersuchenden Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)en die entsprechenden Cobyrinsäurederivate (20&21) hergestellt werden.
29
> Hf,
CH, f-COOK
N-~S**f'
2 <NXX
0X°Xr(10)0 0- \»W
/
VYCOOK COOK
(24)
(29)
/(27)
/
KOOC(CHJJ1NOC
CH,
KOOCtCHJafWOC
CONHiCHJ^OOK
CH, r-CONHICHjl^OOK
VYCOOK COOK
Ä,.(20) ,R2.(21)
'» V-liCNN—/ COHH(CH,)uf:OOK
> CYKOOC(CHJ,jmOC CONH(CHJ,fiOOK
KOOC(CH,),jmOC
__ KOOC(CH,)^mOC
COWCHJxPO
CH,/fCONHtCHtl^fiOOK
Ipffj
'CONHICHjl^OOl
VYKOOCtCHJatmOC CONH(CH,)„f:OOK
(17)
R.=
R,.(18) ;R2.(19)
R,=
Abbildung 8 h
30
Da noch keine vollständigen spektroskopischen Vergleichsdaten für base-off 1,N6-
Ethenoadenosylcorrine vorlagen, sollte ihr Strukturbeweis durch die Synthese auf zwei
unabhängigen Wegen erfolgen. Ein Syntheseweg sollte sich dabei der Methodik der
elektrochemischen Synthese bedienen, die für Alkylcobalamine bereits eingeführt wurde
[92], und ihre allgemeine Anwendbarkeit der elektrochemischen Synthese für basenfreie
Corrine, insbesondere Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat), geprüft werden. Dabei war diese Methodik vorderhand durch die Synthese des
1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4), das in seiner Charaktersierung analog einigen anderen
Organocobalaminverbindungen zu ergänzen war, zu verifizieren (Abbildung 8i).
HjNOCH^OC
. OHOH HjNOC
Hfi,
MeOTos
EtOTos
O O- OH
Methylcobalamin
Ethylcobalamin
Vinylcohalamin
(2)
(S)
(23)
Abbildung 8 i
31
2. Synthetische Arbeiten
Zusammenfassung
Die Synthese des 1,Nß-Ethenoadenosylcobalamin (4) auf neuem elektrochemischem Wege,
der allgemein für Cobalamin, die Cobyrinsäure sowie das micellartige Cobamido-
N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) durchführbar ist, die
direkte Adenosylierung und 1,NP-Ethenoadenosylierung der Co(l)-cobyrinsäure und des
Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) sowie eine
modifizierte Synthese des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",
N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17), welches ausgehend von Cyanocobalamin
(10) in einer fünfstufigen Synthese zugänglich ist, werden beschrieben.
Im Hinblick auf ihre tentativen Eigenschaften als Gäste für das Heptakalium-dicyano-
Co(lll)-cobamido-N,N,,N",N",,N"",N ,N '-hepta-(n-decyl-10 '-carboxylat) (17)
wurden das 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) und das 1.hfi-Ethenoadenosyl-
5'-0-tosylat (16) hergestellt.
2.1 Synthese des l,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)
1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) wurde als Vergleichssubstanz für die analogen
Cobyrinat- und Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-
verbindungen synthetisiert, da der Versuch der Synthese von 1,N6-Ethenoadenosyl-aquo-
hexakalium-Co(lll)-cobyrinat (21) bzw. 1,N6-Ethenoadenosyl-aquo-hexakalium-
Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"">N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (19)
durch Alkylierung von mit NaBH4 erzeugtem Co(l)-cobyrinat bzw. Co(l)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit 5'-Chloro-5'-deoxy-
1 ,N6-etheno-adenosin zu Verbindungen führte, bei der die 1 ,N6-Ethenobrücke anscheinend
nicht mehr intakt war.
Die Produkte der versuchten Alkylierung von Co(ll)-cobyrinat bzw. Co(ll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) unter Reduktion mit
Natriumborhydrid mit 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-ethenoadenosin wiesen im 1H-NMR-Spek-
32
*^*Ä (4)
o 0 *OH
Methylcobalamin (2)
Etbylcobalamin (5)
Vinylcobalamin (23)
Dicyanocobalamin (11)
> CY (24)
ff 1 )—HCNN—/
CH3
COT?
>H3
S °YCOfl COR
i
(29)
1= —NH(CHJ 10CO
(27)
R= o^^-«
Ä;.(20) ; Ä2.(21) Ä,.(18) ; Ä2(19), R3:(30)R.=
CH
IAbbildung 9:
Obersichtsschema der synthetisierten Organocobalamine
33
trum die erwarteten Hochfeldsignale der Ethenobrücke, d.h. vier Singlets der Intensität je 1
H nicht mehr auf, hingegen zeigte sich ein Singlet der Intensität von ca. drei H bei 7,13 ppm
und ein Singlet der Intensität ca. 1 H bei 7,30 ppm (in CD3OD). Literaturwerte zur
Zuordnung der Signale lagen nicht vor, da entsprechende basenfreie Verbindungen bislang
nicht synthetisiert worden waren und für das 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) nur 1H-
NMR-Daten der base-on Form existierten. Das elektrochemisch synthetisierte 1,N6-
Ethenoadenosylcobalamin (4) kann über seine spektroskopischen Eigenschaften mit
Literaturangaben verglichen und identifiziert werden. Die base-off-Form ist durch
Säurezugabe leicht herstellbar, sodass die ungefähren Signallagen der 1,N6-
Ethenoadenosyleinheit der basenfreien 1 ,N6-Ethenoadenosylcorrine auf unabhängige Weise
zugänglich werden.
Die früher beschriebenen Synthesemethoden für 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) sind
die folgenden:
1.
Umsetzung von 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-ethenoadenosin mit Co(l)-cobalamin, reduziert
aus Co-(ll)- oder Co(lll)-cobalamin mit Zn/NH4CI [93-96] oder in alkalischem Milieu
mit Natriumborhydrid [93, 97].
2.
Alkylierung analog 1., jedoch via das 2',3'-isopropylidengeschützte 1,N6-Ethenoadenosyl-
tosylat [5, 98], mit anschliessender Säurehydrolyse und Aufarbeitung.
3.
Die Ethenobrücke ist auch direkt im Adenosylcobalamin (Coenzym B12,1) einführbar. Bei
der erstmaligen Synthese des 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) wurde dieser Weg 1974
von Rudakova et al. [99] gewählt, die Adenosylcobalamin (1) mit dreifachem Uberschuss
1,2-Dibromethylacetat in wässriger, bei pH 4,0-4,5 gepufferter Lösung unter
Lichtausschluss während sieben Tagen umsetzten.
4.
Dieselben Autoren synthetisierten, um durch einen zweiten Syntheseweg den Struktur¬
nachweis führen zu können, 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) durch Alkylierung des
Co(l)-cobalamins mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-2',3'-borsäurephenylester. Die
entsprechende Publikation enthält leider keine Angaben über die genaue Reaktionsführung
des Alkylierungschrittes.
34
Moskophidis und Friedrich [5] sowie Smith et al [98] führten die Alkylierung des Co(l)-
cobalamin deshalb mit 2',3'-isopropylidengeschutzem 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
durch, weil sie die von Clark et al [100] beobachtete thermische Zyklisierung des 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) zum 8,5'-Anhydroadenosin (6) verhindern wollten
Rudakova et al. geben für die Verwendung des Phenylborsäureesters als Schutzgruppe der
2',3'-Positionen keine Begründung an [99]
Die beschriebenen Syntheseverfahren bedingen vor der Kristallisation eine aufwendige
Reinigung des Produktes, in der Regel Phenolextraktion und Chromatographie an (Phospho)-
Cellulose Die vorliegende Arbeit zeigt, dass bei entsprechender Reaktionsfuhrung auf diese
Operationen vollständig verzichtet werden kann Im Vergleich zu den bisherigen Methoden
führte die in dieser Arbeit ausgearbeitete, elektrochemische Synthese zu einer deutlichen
Erhöhung der Ausbeute (75%) an kristallinem Material und ist zudem einfacher in der
Durchfuhrung. Dabei wird deutlich, dass das Schützen der 2' und 3' Hydroxylgruppen nicht
notwendig ist
Die elektrochemische Reduktion zu Co(l) cobalamin wurde bislang neben der indirekten
organische Synthese, in der das Cobalamin als Katalysator wirkte [z B 92, 101, 102], in
der präparativen Synthese alkylierter Cobalamine erfolgreich eingesetzt [z B 101d, 103,
104]
In einer Elektrolyseapparatur [105] und unter Inertgas wurde eine methanohsche Lösung
von Aquocobalaminchlorid (9) mit 0,1 M Tetrabutylammoniumperchlorat als Leitelektrolyt
bei -0,6 V (vs Kalomel) zu Co(ll)-cobalamin (3), dann bei -1,00 V zu Co(l)-cobalamm
reduziert und zu der von nunan lichtgeschützten Co(l)-cornn-Lösung ca vier Äquivalente
5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-ethenoadenosm gegeben. Während sechs Stunden wurde das
Potential beibehalten Alkylierungsmittel und Leitelektrolyt Hessen sich durch Fällung mit
Aceton aus methanolischer Lösung abtrennen Die Kristallisation nach der üblichen Methode
im Wasser/Aceton-System lieferte 75 % kristalline Substanz
Die Substanz ist in Übereinstimmung mit Shushin [81] unter Lichtausschluss unterhalb
minus 20 °C in kristalliner oder pulverisierter Form stabil
Die Kobalt-Kohlenstoffverbindung von Alkylcobalaminen ist lichtempfindlich Erste
orientierende Versuche zur Photolysestabilität stammen von Moskophidis et al [5] und
bestimmten die relative Stabilität von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) zu 85 %
derjenigen des Adenosylcobalamin (1)
35
Obwohl mehrere Autoren auf verschiedensten Synthesewegen zu Produkten mit identischen
UV/vis-Spektren gelangten, wurde eine genaue Charakterisierung des erhaltenen Produktes
(4) bislang nicht durchgeführt. Das Kristallisat wurde daher umfassend charakterisiert.
Die UV/vis- [5, 95, 97, 99] und CD-Spektren [8, 97] sind t 2 nm bezüglich der
Maximallagen identisch mit den Literaturwerten.
f ccc
o b- OH
(4)
Abbildung 10: CD-Spektrum (fyO) von 1,N?-Ethenoadenosylcobalamin (4), c= 2,00-10-5 M
Die UV/vis-Maxima der base-on Form liegen, in Wasser, bei 524, 375 und 275 nm mit
Schultern bei 438 und 498 nm, während die base-off Form die typische Struktur mit
Maxima bei 455 und 285 nm sowie Schultern bei 324, 344, und 378 nm aufweist. Die
UV/vis-Spektren in Methanol und Wasser unterscheiden sich kaum.
Die CD-Spektren der base-on Form in Wasser (Abbildung 10) und Methanol unterscheiden
sich im Bereich 250 bis 300 nm, indikativ für eine unterschiedliche Konformationen des
Moleküles. Die CD-Spektren der base-off Form besitzen eine völlig andere Struktur als die
der base-on Form. Abgesehen von Abweichungen des A e in der Grössenordnung einiger
Prozente unterscheiden sich die CD-Spektren der base-off-Form in Wasser und Methanol
jedoch kaum.
36
Die spektroskopischen Daten unterscheiden sich in Bezug auf die molare Elliptizität von den
Literaturwerten des CD der wässrigen Lösung, wobei die Werte, welche ohne
Konzentrationsangabe publiziert sind [8], um max. 20 % von den experimentell bestimmten
abweichen.
Im FAB-MS(+) treten die Signale des Molekülions (M+, m/z 1603,6) sowie des
dealkylierten Fragmentes, ((M-Ado)+, m/z 1328,5), deutlich hervor.
Die Fluoreszenz der 1,N6-Ethenoadenosyleinheit (Bereich von 250 bis 700 nm) ist im
1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) vollständig gequencht. Nach photolytischer Abspaltung
des 1 ,N6-Ethenoadenosin lag das Emissionsmaximum der erhaltenen Lösung bei 415 nm.
Die 1H-und 13C-NMR-Spektren des 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) in Deuteriumoxid
(Abbildungen 11 & 12) zeigten gute Übereinstimmung mit jenen des Adenosylcobalamin (1)
[106-108]. Analog Summers et al. [108] ist in wässriger Lösung im 13C-NMR-Spektrum
bei 27,3 ppm die direkt an das Kobalt gebundene Methylengruppe zu beobachten.
Im 1H-NMR-Spektrum in Methanol (Abbildungen 13 & 14) treten verglichen mit
Deuteriumoxid als Lösungsmittel grössere Verschiebungen der Signallagen ein, wiederum
indikativ für Konformationsänderungen. Die aromatischen Protonen der 1,N6-
Ethenoadenosyleinheit zum Beispiel sind in Deuteromethanol um +0,07 bis +0,17 ppm
verschoben, die des Dimethylbenzimidazol bis +0,25 ppm. Die Unterschiede waren in
saurer Lösung ohne a-seitige Basenkoordination (base-off) noch ausgeprägter; hier betrug
die Verschiebung der Signale in Deuteromethanol verglichen mit Deuteriumoxid für die
Protonen der 1 ,N6-Ethenoadenosyleinheit und der Dimethylbenzimidazols bis +0,61 ppm.
Unabhängig von der Basenkoordination bewirkte ein Lösungsmittelwechsel eine wesentliche
Änderung der chemischen Verschiebung der A5-gebundenen Protonen. Die Signale der A5-
gebunden Protonen im 1H-NMR-Spektrum lagen für die base-on Form in Deuteriumoxid bei
0,54 ppm (1H, die Lage des zweiten Protons konnte nicht identifiziert werden), in
Deuteromethanol bei 0,55 und 1,08 ppm (je 1H), in der base-off Form in D2O bei -0,25
und 0,35 ppm (je 1H). Bei der base-off Form in Deuteromethanol konnte nur ein Proton bei
0,33 ppm beobachtet werden.
Aus den Spektren der base-off Form des 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) bestimmen sich
die Vergleichswerte der 1H-NMR-Signale der 1 ,N6-Ethenoadenosyleinheit zu: 9,42 ppm (s,
A-2 oder 8), 9,31 ppm (s, A-2 oder 8), 8,35 ppm (s, A-10 oder A-11), 7,99 ppm (s, A-
10 oder A-11) in Deuteromethanol und 8,89 ppm (s, A-2 oder 8), 8,71 ppm (s, A-2 oder
8), 7,84 ppm (s, A-10 oder A-11), 7,51 ppm (s, A-10 oder A-11) in Deuteriumoxid
[106-108].
37
....Jt
ppm 8 6 1
Abbildung 11: 'H-NMR-Spektrum von I^-Ethenoadenosylcobalamin (4) in
Deuteriumoxid, c- 8,42-10'3 M, 300,13 MHz
.drhzJJ[AüJjß^ppm 8
Abbildung 12: 'H-NMR-Spektrum von 1.^-Ethenoadenosylcobalamin (4) in
Deuteriumoxid + 10% CF3COOD, c= 7,58-W3 M, 300,13 MHz
38
. . ^
1 0 ppm
Abbildung 13: ' H-NMR-Spektrum von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) in
Deuteromethanol, c= 9,36-1 fr3 M, 300,13 MHz
10 1 0 ppm
Abbildung 14: 1 H-NMR-Spektrum von 1,Ne-Ethenoadenosylcobalamin (4) in
Deuteromethanol + 10% CF3COOD, c= 8,42-1Cr3 M, 300,13 MHz
39
Erstaunlicherweise konnte von Gani et al. [97] bei der Reaktion von 5'-Chloro-5'-deoxy-
1,N6-etheno-adenosin mit Co(l)-cobalamin, welches mit Natriumborhydrid aus Co(ll)-
cobalamin reduziert wurde, entgegen den Beobachtungen der vorliegenden Arbeit eine
Substanz isoliert werden, deren UV/vis-Spektrum dem des hier synthetisierten 1,N6-
Ethenoadenosylcobalamin (4) entspricht.
Dicyanocobalamin (11) und einige Organocobalamine (2, 5, 23)
Zur systematischen Anwendung der Elektrochemie für präparativen Alkylierungen analog
dem 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) wurden Methyl- (2), Ethyl- (5) sowie
Vinylcobalamin (23), deren spektroskopische Eigenschaften zum Teil in der Literatur
beschrieben sind, nach derselben elektrochemischen Methodik synthetisiert und umfassend
charakterisiert (UV/vis, CD, IR, ^H-NMR, 13C-NMR, FAB(+)-MS).
Vinylcobalamin (23) konnte durch Reduktion des Cobalamin zu Co(l)-cobalamin in
Acetylenatmosphäre, nach Fällung und Kristallisation im klassischen Wasser/Aceton-
System, als Kristallisat in 85%iger Ausbeute erhalten werden.
Der Vergleich der spektroskopischen Daten der erhaltenen Produkte (UV/vis; CD; 1H-NMR)
mit Literaturwerten bestätigte die Strukturen. In den FAB(+)-Massenspektren waren
jeweils die erwarteten Signale des Molekülions und der dealkylierten Verbindung deutlich
ausgeprägt.
Im Rahmen der Photolyse der Alkylcorrine (Kapitel 6) erfolgte die Identifikation der
Photolyseprodukte über ihre Dicyanoformen. Aquocobalamin (9) kann bei nicht exakter
Dosierung des Cyanid Gemische der Mono- und Dicyanokomplexe bilden. Um einheitliche
Verbindungen zu erhalten, wurden daher nach der Photolyse durch einen grossen Uberschuss
an Kaliumcyanid die Dicyanoverbindungen hergestellt. Die für die Identifikation der
Photolyseprodukte notwendige Vergleichsverbindung Dicyanocobalamin (11), dessen 1H-
NMR-Spektrum in der Literatur nicht beschrieben war, wurde durch Versetzen einer
wässrigen Lösung von Cyanocobalamin (10) mit einem dreifachen Uberschuss KCN
synthetisiert und das langsam entstehende 11 UV/vis- und 1H-NMR-spektroskopiert. Die
UV/vis-Spektren in Wasser von Dicyanocobalamin (11) und Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat (24) sind erwartungsgemäss fast identisch (Abbildungen 15 & 16). Das
Dicyanocobalamin (11) zeigt aufgrund des Basenteiles bei 285 nm ein Maximum, das in 24
nicht auftritt. Zudem sind unterhalb 300 nm die Absorptionskoeffizienten unterschiedlich.
40
Abbildung 15: UV/vis-Spektrum von Dicyanocobalamin (11) in Wasser, c=
1,17-10* M, dx= 0,100 cm, 10 mM KCN
Abbildung 16: UV/vis-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-
cobyrinat (24) in Wasser, c= 4,51- 70'5 M, dx= 0,100 cm,
0,16 g KCN t1
41
2.2 Synthese micellartiger Cobyrinsäurederivate
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Synthese des bereits von Stepanek [91]
hergestellten Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) (17), das für die nachfolgenden Assoziationsexperimente und als
Ausgangssubstanz für die Alkylierungen benötigt wurde, in ausreichender Menge und unter
Erweiterung der spektroskopischen Charakterisierung des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) sowie
seiner Synthesezwischenprodukte.
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) wurde als Vergleichssubstanz
eines der bei der Cobesterhydrolyse entstehenden Nebenprodukte synthetisiert.
2.2.1 Synthese des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)
Bereits 1953 konnte als Nebenprodukt der salzsauren Hydrolyse von Vitamin B12(10) eine
als Cobyrinsäure vermutete Heptasäure nachgewiesen werden [109]. Friedrich [110]
hydrolysierte als erster Cobyrsäure und Cyanocobalamin (10) an dem lonentauscherharz
Dowex 50W. In neuester Zeit entwickelte Kreppelt [111] eine Methode zur sauberen
chromatographischen Trennung des vom Dowex 50W eluierten hydrolysierten Cobesters
(26), die allerdings mit einem beträchtlichen Substanzverlust (Ausbeute 65%) verbunden
ist. In der hier beschriebenen Synthesesequenz erfolgt die chromatographische Trennung an
Kieselgel zu einem einheitlichen Produkt nach dem Syntheseschritt zum Dicyano-Co(lll)-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid (27).
Die Hydrolyse des Cobester (26) an Dowex 50 WX2, einem Sulfonsäureharz, liefert
praktisch quantitativ Cobyrinsäure, die je nach Methode der Elution vom Dowex-Harz
(NH2OH [112], Ammoniak [113]) zu Nebenprodukten weiterreagiert. In der vorliegenden
Arbeit konnte in Anlehnung an [91] eine sehr einfache wässrig neutrale Aufarbeitung
entwickelt werden, die in mit UV/vis-Spektroskopie bestimmter 99%iger Ausbeute eine
gemäss 1 H-NMR-Spektrum mit ca. 5% Nebenprodukten verunreinigte Probe von Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) lieferte, das sich nicht kristallisieren Hess [109].
42
cgocH,--. CH, f-COOCH,
CHiH2S04IMeOH c»,
ch, 7
'
K CH>
VYCOOCHSOOCH,
(26)
VYCOOK COOK
(24)
CI04~H3N*(CH2)ioCOOC(CH3)31 EtsN
THF
(CH,)fiOfi(CH,),J{NOC
CH,
ICH,)fiOfi(CH,),JINOC
COmCHJ^OfilCH,),
~% CH, f-COHmCH,),fOiCH,),
N0,-£j-0OCCF,
ayv
Methylenchlond
COO-Q-NO,^—i ch, r-oo-^ym,
no, -Q-<wc-yJ^yk^\rH,CH'*Y-w-/ ~^"x^cyno2
y-vCH'L f\ _/
m,-(_y-ooc-* /~-»rcw>=\ CH,
CH, ^A^*^/CHiS CY
(29)
COHH(CH,),fiOf(CH,),
VY(CH,)fiO£(CHH„flNOC COHH<CH,),fiOfi(CH,),
(27)
CF3COOHI HCl I CHCI3
KOOC(CH,)jmOC
CH,"
KOOCICHJxflNOC
CONmCHjkifiOOK
CH, f~CONH(CH,),£OOK
CONH(CH,),fiO0K
VYKOOC<CH,),JINOC CONHfCHtlxPOOK
(17)
Abbildung 17: Synthese des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',
N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) aus Cobester (26)
43
Die bisherige Identifikation der Cobyrinsäure in einer Reihe von Arbeiten über
Cobyrinsäure als hypothetisches Biosynthese-Zwischenprodukt von Vitamin B12(10) aus
5-Aminolävulinat über Uroporphyrinogen III erfolgte über das Derivat Cobester (26)
[114-116].
Das Produkt 24 wurde mit DC-, IR-, UV/vis-, CD-, 13C-NMR- und 1H-NMR-
Spektroskopie sowie FAB(+)-Massenspektroskopie charakterisiert. Die Identität der
isolierten Substanz mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) ergibt sich aus dem
einheitlichen DC und dem 13C-NMR-Spektrum in Deuteriumoxid, das innerhalb ± 0,4 ppm
mit jenem von Stepanek [91] identisch ist. Das 1 H-NMR-Spektrum der im Rahmen dieser
Arbeit durchgeführten Synthese war verglichen mit dem aus [91] identisch, wenn man von
der relativen Verschiebung des Gesamtspektrums um 0,13 ppm, die höchstwahrscheinlich
durch unterschiedliche Referenzierung bedingt ist, absieht. Das bei Kreppelt [111]
publizierte 1 H-NMR-Spektrum von 24 ist innerhalb einiger Hunderstel ppm ebenfalls
identisch, weist jedoch für das C-13-Signal eine um 0,13 ppm abweichende chemische
Verschiebung auf, die wahrscheinlich durch Konzentrationseffekte hervorgerufen ist. Die
UV/vis- und das 13C-NMR-Spektren zeigten keine wesentlichen Unterschiede zu jenen bei
Stepanek und Kreppelt.
Das IR-Spektrum in KBr der aus dem Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) durch
Entsalzung an XAD-Harz hergestellten Säure war identisch mit dem bei Kreppelt [111]
beschriebenen IR-Spektrum der Cobyrinsäure.
Im FAB(+)-Massenspektrum treten bis m/z 500 praktisch nur NOBA-Signale auf. Oberhalb
m/z 500 überragen nur wenige Signale das Rauschen. Sie lassen sich praktisch sämtlich als
Signale des gleichen Corrins interpretieren, an dem in wechselndem Ausmass Kalium durch
Natrium und/oder Protonen ausgetauscht, Wasser mitgerissen bzw. Cyanidliganden
abgespalten wurden. Das Molekülion (M+H+) bei m/z 1258 ist zwar nur schwach aber
signifikant. Oberhalb m/z 1'200 Hessen sich alle Signale durch die Zielsubstanz 24
erklären.
Mithilfe des 1H-13C-COSY-Spektrums (Abbildung 18) liess sich eine weitreichende
Zuordnung der Signale der NMR-Spektren erreichen.
Im 1 H-NMR-Spektrum befinden sich neben dem C-(10)-Signal des Cobyrinat 24 (5,74
ppm) bei 5,79 und 5,69 ppm Signale ungefähr identischer Intensität (insgesamt ca. 5 %
bezogen auf das Signal bei 5,74 ppm). Eines der beiden Produkte ist Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25), identifizierbar im 1 H-NMR-Spektrum z.B. durch das
Signal bei 5,80 ppm. Gemäss 1 H-NMR-Spektrum und DC war der als Edukt eingesetzte Cob-
44
>W«»«^»^<imJ'^I»^W^'^"'*i^¥WN>»»^> UwWJiiJviWww
«•==;a»^: =-s=5
t.«.^";.. *;"-
f
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r
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v i i i i i'
Abbildung 18: H-C-COSY von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24)
in Deuteriumoxid, c= 3,68-W2 M, 0,5 g KCN t1
45
ester 26 frei von Cobester-c-lacton (28). Bei dem zweiten Nebenprodukt (C-(IO)-Signal
bei 5,69 ppm) könnte es sich um die Neocobyrinsäure handeln, die als Nebenprodukt der
Hydrolyse von Cobester auf Dowex-Harz von Lee [112] aufgrund des Verhaltens bei lonen-
austauscherpapierchromatographie und einer elektrophoretischen Analyse postuliert wurde.
Eine kritische Einflussgrösse der Synthese war der rigorose Sauerstoffausschluss sowohl
während der Reaktion, als auch während des Abkühlens der Suspension vor der Aufarbeitung.
Unkritisch hingegen ist die Verlängerung der Reaktionszeit über die für quantitativen
Umsatz notwendigen 20 Stunden hinaus; selbst nach insgesamt 48 Stunden wies das 1H-
NMR-Spektrum der isolierten Cobyrinsäure die gleichen Signallagen auf wie das 1 H-NMR-
Spektrum des Beschreibungsansatzes.
In einem separaten Versuch wurden 954,6 mg Cobester (26) mit 0,5 ml Trifluor-
essigsäure in 10 ml MeCI2 gelöst und am Rotationsverdampfer das Lösungsmittel abgezogen.
Der hellrote Rückstand wurde in 20 ml Essigsäure auf 200 ml Dowex-Harz aufgetragen und
ohne Rühren der Harzsuspension in 500 ml Wasser unter Argon während 20 Stunden bei
70°C hydrolysiert. Das Produkt wurde mit Natriumhydrogencarbonat vollständig vom Dowex
eluiert, zog mit Phosphorsäure vollständig auf 100 ml XAD auf und wurde mit 30 ml
Methanol/Aceton (1:1) eluiert. Nach Trocknung und Zugabe von 0,01g KCN Hess sich das
Produkt aus 15 ml Methanol mit 5 ml Aceton nur unvollständig fällen. Das 1 H-NMR-
Spektrum (200 MHz, CD3OD) der in der Mutterlauge verbliebenen Substanz (464 mg) Hess
auf partiell hydrolysierten Cobester schliessen, denn es waren die für die Dicyanocobyrin-
säure 24 erwarteten Signale vorhanden, doch traten im Bereich des H-(C10) drei Signale
zwischen 5,76 und 5,81 auf, während bei 3,67 ppm ein Single« beobachtbar war. Die Sub¬
stanz konnte nach Entfernung der Cyanidliganden mit Essigsäure/Trifluoressigsäure durch
eine analog der Cobyrinsäuresynthese durchgeführte Nachhydrolyse in 98% Ausbeute in ein
Produkt Oberführt werden, das das 1 H-NMR-Spektrum der Dicyanocobyrinsäure 24 zeigte.
Eine maximale Ausbeute bedingte eine Mindestmenge an Dowex-Harz, und zwar 100 g (ca.
120 ml) pro 0,5 g Cobester (26). Der Verlust durch unerwünschtes Ablösen der Substanz
vom Dowex-Trägerharz ist dann praktisch bedeutungslos. Durch Elution mit Natriumhydro¬
gencarbonat Hess sich das Produkt jedoch nicht quantitativ vom Harz lösen. Auf XAD verblie¬
ben ebenfalls geringe Mengen an Produkt. Diese auf dem Träger haftenden Anteile können nur
mit stark basischer Lösung eluiert werden und reagieren dabei in nicht unbeträchtlichem
Ausmasse zu Nebenprodukten. Die Ausbeute reduzierte sich durch diese Elutionsverluste um
ein bis zwei Prozent. Die Fällung aus methanolischer Lösung hingegen erfolgte bei
genügendem Uberschuss an Ether quantitativ. Der Versuch, das Kaliumcobyrinat 24 zu
kristallisieren, blieb wie schon bei der Cobyrinsäure bei Armitage et al. [109] erfolglos.
46
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25)
Ausgehend von Cobester-c-lacton (28) wurde erstmalig die Hydrolyse zum Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) analog der Synthese der Cobyrinsäure
durchgeführt und das Produkt umfassend charakterisiert (Abbildung 19).
Wie erwartet fehlt im Vergleich zum Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)
(Abbildung 20) im 1 H-NMR-Spektrum das H-(8)-Signal (D20: 3,45 ppm; CD3OD: 3,57
ppm) (Abbildung 21). Mit Entkopplungsexperimenten der in Deuteromethanol gelösten
Substanz konnten das C-(18), 3,02 ppm, und das C-(19), 3,79 ppm, zugeordnet werden.
Das 13C-NMR-Spektrum in Deuteriumoxid ist ähnlich dem des Dicyanocobyrinat 24 bis auf
folgende Ausnahmen: das Signal des C-(8) befindet sich statt bei 57,3 nun bei 88,2 ppm.
Des weiteren treten die tentativ C-7A, C-71, C-81 und C-7 zugeordneten Signale bei 20,13
ppm, 35,52 ppm, 38,10 ppm und 55,24 ppm statt 21,43 ppm, 32,9 ppm, 37,45 ppm und
51,46 ppm auf. Die Abweichungen der übrigen Signale sind bezogen auf das Dicyano-
heptaka!ium-Co(lll)-cobyrinat (24) minimal, in der Regel geringer als 1 ppm.
Die Maxima im UV/vis-Spektrum des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lactons
(25) sind verglichen mit dem Dicyanocobyrinat 24 in methanolischer Lösung oberhalb 400
nm um 2-3 nm zu höheren Wellenlängen verschoben und die Absorptionskoeffizienten sind
etwas unterschiedlich.
Die CD-Spektren von 24 & 25 in methanolischer Lösung unterscheiden sich hingegen
teilweise deutlich voneinander; so bleibt zum Beispiel unterhalb 372 nm das CD-Spektrum
des Dicyanocobyrinates 24 im negativen Bereich [91]. Bei Cobyrinat-c-lacton 28 treten
eine Reihe zusätzlicher Nulldurchgänge (238, 272 und 279 nm) auf.
Das Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) ist anscheinend ein
Nebenprodukt der Hydrolyse des Cobesters (26) zur Cobyrinsäure. Im 1 H-NMR-Spektrum
des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) in Deuteriumoxid traten neben dem
Signal des C-10 der Säure 24 bei 5,74 ppm zwei Singletts mit einer relativen Intensität
von maximal fünf Prozent bei 5,80 ppm und 5,66 ppm auf. Die chemische Verschiebung des
C-10 Signal des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton beträgt ebenfalls 5,80
ppm. Da die Verunreinigungen jedoch minimal sind, sind sie praktisch nur über die gut
identifizierbaren Singletts der C-10 Signale nachweisbar.
47
com, CN
/ Hfil f-CONH,
com,
CHfiOC
CHfiOC
CONH,
(10)
H^Ot I MeOH I Rückfluss
COOCH,
VYHfiOOC COOCH,
"
(26)VY
HfiOOC COOCH,
(28)
Dowex 50WX21H20170 "C 120 h
> ( (24) ^CH,(COOK COOK
Abbildung 19: Hydrolyse der Produkte der Cobestersynthese aus Cyanocobalamin (10)
48
6,05
8 1 ppm
Abbildung 20: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) in
Deuteriumoxid, c= 1,12-W2 M, 300,13 MHz, 1,4 g KCN t1
(25)
^J
X
vi VM
9 8765432 1 ppm
Abbildung 21: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lac-ton (25) in Deuteriumoxid, 300,13 MHz, c= 7,96-103 M, 1,0 g KCN r1,
die mit einem Kreuz bezeichneten Signale stammen von Methylacetat
49
2.2.2 Synthese des miceiiartigen Cobyrinsäurederivates Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N1N,,N",N'"1N,,"1N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) (17)
Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nit-
rophenyl)-cobyrinat (29)
Dicyano- Co(lll)- heptakalium- N, N', N", N'", N"", N,N - hepta-(4-nitrophenyl)-
cobyrinat (29) wurde bereits von Stepanek [91] synthetisiert. Die Analytik wurde in der
vorliegenden Arbeit um das CD- und das FAB(+)-Massenspektrum erweitert.
Zur Synthese des Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-
nitrophenyl)-cobyrinat (29) wurde aus dem Kaliumsalz 24 frisch bereitete Dicyano-
cobyrinsäure in Methylenchlorid gelöst und mit Trifluoressigsäure-4-nitrophenylester
zum Nitrophenylester 29 umgesetzt.
Als entscheidender Schritt dieses in Analogie zu Stepanek [91] durchgeführten Synthese¬
schrittes erwies sich das Lösen der Dicyanocobyrinsäure in Methylenchlorid. Dazu wurde am
XAD entsalztes 24 mit zwei Äquivalenten Triethylamin in methanolischem HCN gelöst und am
Rotationsverdampfer das Lösungsmittel entfernt. Der derart erhaltene Lack löst sich
augenblicklich in Methylenchlorid, auch ohne Kühlung der Vorlage. Wird auf die
Triethylaminzugabe verzichtet, ist der Lösungsprozess sehr langsam (ca. 60 Minuten) und
oft auch unvollständig. Die dabei nicht in Methylenchlorid gelöste Substanz reagiert nicht
und kann bei der Aufarbeitung mit Wasser von einer Fraktion vollständig verestertem
Cobyrinates abgetrennt und zum Produkt 29 nachverestert werden. Das Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) selbst Hess sich in Methylenchlorid nicht lösen2.
Das erhaltene Produkt, dessen spektroskopische Daten (IR-, 1H-NMR- und 13C-NMR-
Spektrum (jeweils in CDCI3)) mit denen von Stepanek [91] übereinstimmen, konnte nicht
kristallisiert werden.
Verglichen mit der in Methanol gelösten Substanz [91] beobachtet man im UV/vis-Spektrum
in Methylenchiorid oberhalb 400 nm eine bathochrome Bandenverschiebung von 2 bis 7 nm.
2 entgegen der Beschreibung von Stepanek [91]
50
Das CD-Spektrum in Methylenchlorid zeigt oberhalb 360 nm einen positiven CD-Effekt und
ähnelt in diesem Bereich sehr stark dem des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in Wasser. Auch die
Struktur des CD-Spektrum dieser beiden Messlösungen ist im Bereich 210-360 nm sehr
ähnlich.
Im FAB(+)-MS tritt das Signal des Molekülions (m/z 1837,6) nicht auf, das Signal des
Monocyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)cob-
yrinat (m/z 1809,5) hingegen ist deutlich ausgeprägt.
Die Amid- bzw. Esterfunktionen der Propion- und Essigsäureseitenketten in Cyanocobalamin
[109] bzw. Cobester [117] weisen bei der Hydrolyse unterschiedliche Reaktivitäten auf.
Scheinbar liegen auch bei der Veresterung der Cobyrinsäure zum Dicyano-Co(lll)-
heptakalium-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat (29) unter¬
schiedliche Reaktivitäten der Propion- und Essigsäureseitenketten vor. Wird nämlich die
Reaktion bereits 1,5 Stunden statt nach 22 Stunden nach Zugabe des Trifluoressigsäure-
nitrophenylesters aufgearbeitet, so färbt sich die Wasserphase stark ein. Das DC der aus der
Wasserphase isolierten Substanz war einheitlich. Das 1 H-NMR-Spektrum (D20) zeigte der
Cobyrinsäure 24 sehr ähnliche Signallagen, die jedoch verglichen mit der Cobyrinsäure um
+0,15 bis +0,18 ppm verschoben waren; so kam z.B. das H(C-10) bei 5,95 ppm statt bei
5,74 ppm. Zudem traten die Signale von vier Äquivalenten Nitrophenylat auf. Möglicher¬
weise war das aus der Wasserphase isolierte Produkt nur an den vier Propionseitenketten
verestert.
Dicyano-Co(lll)-N,N\N",N,",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxy-car-
bonyl-n-decyl)-cobamid (27)
Im nächsten Syntheseschritt wurde der Nitrophenylester 29 in THF mit 10-tert.Butyloxy-
carbonyl-n-decyl-ammonium-perchlorat zum Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid (27) umgesetzt3. Die
Synthese folgte hier ebenfalls dem Syntheseweg von Stepanek [91], der die Verbindung 27
erstmalig synthetisierte.
3 Synthese analog Stepanek [91] mit veränderter Aufarbeitung
51
Die Synthese des zur Kopplung eingesetzten 10-tert.Butyloxy-carbonyl-n-decyl-
ammonium-perchlorat erfolgte mit Standardmethoden ausgehend von der 11-
Aminoundecansäure [91]. Dabei erwies sich die Debenzyloxycarbonylierung des als
Zwischenprodukt erhaltenen 11 -Amino-N-benzyloxycarbonyl-undecansäure-tert.-butyl-
ester besonders kritisch bezüglich der Reinheit der Edukte. Wurde zur Hydrogenolyse nicht
frisch durch Säulenchromatographie gereiniger 11 -Amino-N-benzyloxycarbonyl-undecan-
säure-tert.butylester eingesetzt, konnte nach der Aufarbeitung das Perchlorat nicht
kristallisiert werden.
Ein dem Beschreibungansatz analoger jedoch mit doppelter Reaktionsdauer durchgeführter
Ansatz lieferte gemäss UV/vis- und 1H-NMR-Spektroskopie in identischer Reinheit
ebenfalls das Cobamid 27.
Die Substanzmenge (1546 mg 29) bedingte einen Wechsel von der bereits beschriebenen
dünnschichtchromatographischen Trennung [91] zur Säulenchromatographie. Als besonders
günstig erwies sich dabei das Laufmittelsystem Methylenchlorid/Methanol, 1%HCN dessen
Methanolanteil während des Trennungsprozesses sukzessive von 4 auf 20% erhöht wird.
Eine alternative Reinigung durch Phasenverteilung in Methanol/Hexan war nicht
erfolgreich.
Die Möglichkeit der Reinigung durch Fällung wurde ebenfalls untersucht. Das Cobamid 27,
das eine erstaunliche Löslichkeitsspannweite aufwies, konnte jedoch aus keinem der
getesteten Lösungsmittelsysteme gefällt werden. Einzig beim Abziehen des Lösungsmittels
einer Lösung von einigen Milligramm 27 in 0,5 ml Chloroform und 10 ml Hexan am
Rotationsverdampfer wurde ein metastabiler Niederschlag beobachtet, der bei Temperatur¬
anstieg rasch wieder in Lösung ging und nicht isoliert werden konnte.
Die Ausbeute, 84%, konnte gegenüber vorhergehenden Synthesen (71% [91]) wesentlich
gesteigert werden.
Von dem erhaltenen Produkt, dessen spektroskopische Daten (IR-, 1H-NMR- und 13C-NMR-
Spektren (jeweils in CDCI3)) mit denen von Stepanek [91] übereinstimmten, wurde noch
das FAB(+)-MS sowie das UV/vis- und CD-Spektrum in Methylenchlorid gemessen.
Im Gegensatz zu den wässrigen Lösungen der Cobyrinate (24 & 25) und des Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)
52
(17) zeigten Lösungen der Substanz in Methylenchlond innerhalb einiger Stunden
unverändert das UV/vis Spektrum der Dicyanoform
Das FAB(+)-Massenspektrum zeigte praktisch nur die beiden Signale des Monocyano
cobamides (m/z 2639,5) und des Cobamides 27 ohne Cyamdliganden (m/z 2613,3)
Die UV/vis-Spektren in Methanol/1% HCN4 und Methylenchlond unterscheiden sich nicht
voneinander Die entsprechenden CD-Spektren jedoch sind deutlich unterschiedlich
Oberhalb 460 nm bleibt das CD der Lösung in Methylenchlond im negativen Bereich,
während in methanolischer Lösung mehrere Nulldurchgänge stattfinden Unterhalb 460 nm
sind die Maxima um bis zu drei nm verschoben und die Werte der Elliptizität unterscheiden
sich bis zu 50%
Diese Beobachtungen bei den UV/vis und CD Spektren sowie das beschriebene
Löshchkeitsverhalten könnten Anzeichen für ein konformationelles Expansions- und
Kontraktionspotential der modifizierten Seitenketten sein, d h je nach Lösungsmittel können
die Seitenketten durch Änderung ihrer Konformation die Löslichkeit des Molekules
verändern
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hep-
ta-(n-decyl-lO'-carboxylat) (17)
Heptakalium-dicyano Co(lll)-cobamido N, N', N", N'", N"", N,N -hepta-(n decyl
10'-carboxylat) wurde bereits 1987 von Stepanek [91] aus Dicyano-Co(lll)
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta (10 tert butyloxycarbonyl-n decyl)-cobamid (27)
hergestellt Die hier beschriebene Synthese lehnt sich an seine Vorschrift an
Durch eine Lösung des Dicyanocobamid 27 in Chloroform wurde trockenes HCl geleitet und
anschliessend mit Trifluoressigsäure hydrolysiert Chloroform als Lösungsmittel war bei
diesem Syntheseschritt nicht durch Methylenchlond substituierbar Die in Methylenchlond
gelöste Substanz ölte während der Durchleitung von HCl aus sogar nur 0,001 molarer
Lösung aus
4 vgl Stepanek [91]
53
Von dem nach Zugabe von Trifluoressigsäure und Aufarbeitung ohne Trennungstufe
erhaltenen Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) (17), dessen spektroskopische Daten (IR-, 1H-NMR- (in D20)
und 13C-NMR-Spektrum (in CD3OD)) mit denen von Stepanek [91] übereinstimmten,
wurden die UV/vis- und CD-Spektren in Deuteriumoxid sowie die 1H-NMR- (Abbildung 22)
und 13C-NMR-Spektren in CD3OD bzw. D20 gemessen, um das Verhalten in wässriger und
methanolischer Lösungen vergleichen zu können.
Die UV/vis-Spektren von 17 in Wasser/KCN und Methanol/HCN waren identisch. Die CD-
Spektren in Methanol und Wasser jedoch waren nur im kurzwelligen Bereich deckungsgleich
und wichen oberhalb 460 nm in ihren relativen Intensitäten um bis zu 100% voneinander
ab. Dagegen kontrastiert das Fehlen jeglicher Unterschiede zwischen den CD-Spektren
wässriger und methanolischer Lösungen von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24).
Um festzustellen inwieweit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) sein CD-Spektrum in detergenzhaltiger
Lösung ändert, wurde 17 in einer wässrigen Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS), die
mit 2,0-10"2 M an SDS unterhalb der kritischen Micellbildungskonstante von 8,1-10"2 M
blieb, gelöst und die Veränderung des CD-Spektrums untersucht. Eine signifikante
Veränderung des CD-Spektrums war nur bei 555 nm und im Bereich um 595 nm zu
beobachten, wo die jeweilige Elliptizität um wenige Prozent, maximal ca. 5%, reduziert
wurde.
Rossi et al. [118] stellten bei 1H-NMR-spektroskopischen Experimenten mit
Methylcobalamin (2) eine für die einzelnen Protonen unterschiedlich ausgeprägte
Konzentrationsabhängigkeit der chemischen Verschiebungen fest. Die bei unterschiedlichen
Konzentrationen in Deuteriumoxid aufgenommenen 1H-NMR-Spektren von 17 zeigten
ebenfalls eine wenn auch hier nicht systematisch untersuchte Sensitivität der Signale auf
Konzentrationsänderungen, sodass eine Selbstassoziationstendenz des Heptakalium-dicyano-
Co(lll)-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) zu
vermuten ist.
Der orientierende Vergleich einiger 13C-NMR-Spektren in Deuteriumoxid wies analog den
Beobachtungen beim 1 H-NMR-Spektrum auf einen signifikanten Einfluss der Konzentration
auf die Signallagen hin. Allgemein war die Auflösung des 13C-NMR-Spektrum in
Deuteriumoxid bedeutend geringer als in Deuteromethanol.
54
Die 13C-NMR-Spektren von 17 in Deuteromethanol und Deuteriumoxid wiesen signifikante
Unterschiede der chemischen Verschiebungen auf. Die durchschnittliche Abweichung der
chemischen Verschiebungen der Deuteriumoxidprobe im Vergleich zur Probe in Deutero¬
methanol lag bei 1,8 ppm zu tieferem Feld. Im 13C-NMR-Spektrum der in Deuteromethanol
gelösten Substanz fielen sämtliche Carboxylatsignale bei 183,1 ppm zusammen, in
Deuteriumoxid hingegen Hessen sich drei Gruppen, 186,2 ppm, 186,3 ppm und 186,4
ppm, unterscheiden. Die Signale der Undecanoatketten verbreiterten sich in Deuteriumoxid
zu strukturlosen Signalgruppen.
Diese ausgeprägten Unterschiede der chemischen Verschiebungen in den 13C-NMR-Spektren
in Deuteriumoxid und Deuteromethanol deuten wiederum auf einen, dem Cobamid 27
analogen Konformationsunterschied der Undecanoathülle in wässriger und methanolischer
Lösung hin.
CONH(CH,),fiOOK
^—-. CH, f-CONH<CH,),fiOOKKOOC(CH,)1CHKOC
KOOCICHJioHNOC
CONH(CH,)l(£OOf
VYKOOC(CH,),jmOC CONH(CH,)l(f:OOK
7 6 5 4 3 2 10 PPm
Abbildung 22: 1 H-NMR-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",
N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in Deutero¬
methanol, c= 5,43-10'3 M, 0,13 g KCN r1, 300,13 MHz
55
2.3 Alkylierungen
2.3.1 Methylierung
Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-NIN',N"1N,"1N"",N ,N"""-
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30)
Zur Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30) wurde analog Stepanek [91] Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)
(17) platinkatalysiert mit Wasserstoff zu Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) und mit Natriumborhydid weiter zum Co(l)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) reduziert und anschliessend
das Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N',",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit
Methyltosylat alkyliert. Abweichend von [91] war unter den Versuchsbedingungen (3 ppm
O2) eine einmalige Zugabe von 60 Äquivalenten Natriumborhydrid zur quantitativen
Reduktion des Co(ll)-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat) zum Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-
lat) ausreichend 5.
Die Aufarbeitung erfolgte nicht wie bei dem bisher beschriebenen Verfahren [91] mit XAD
als Adsorptionsharz sondern mit C-18 Kieselgelkartuschen, auf die der Chromophor direkt
aus der Reaktionslösung quantitativ aufzog. Die Carboxylatfunktionen wurden durch Benetzen
des C-18-Kieselgels mit wässriger KHC03 in das Kaliumsalz überführt und nach Elution mit
Methanol überschüssiges Methyltosylat durch Fällung mit Aceton entfernt.
Die Aufarbeitung der Reaktionslösung einer analog durchgeführten Synthese durch
Adsorption an XAD führte zu beträchtlichem Substanzverlust, da der Chromophor sich trotz
Verwendung genügender Harzmengen nicht quantitativ auf das Harz aufbringen Hess. Eine
weitere Quelle für den Verlust an Produkt 30 war bei der XAD-Methode die Elution des
Alkylierungsmittels mit 0,01 H3P04, die zwar erstaunlich selektiv möglich war doch grosse
Mengen an Lösungsmittel benötigte. Diese Verlustquelle konnte jedoch eliminiert werden, in-
5 Die Menge des eingesetzten Natriumborhydrids hängt stark von der Güte der Inertgasatmo¬
sphäre ab. Bei einem Sauerstoffgehalt von 10 ppm ist ein 10-facher Uberschuss ausreich¬
end wenn die Reaktion hinreichend schnell, d.h. innerhalb einer Stunde abläuft.
56
a) CFfiOOH
b)Pt02IH2
c) Variante 1
NaBH4lTosR24
Variante 2
e I Tos R4
VYCOOK COOK
R2 (20) R3 (31), R4 (21)
CONHiCH^fiOOK
CHS m-CONH(CH2),<lCOOK
KOOCfCH^^NOC
KOOCfCH^aHNOC
CONH(CH2),<iCOOK
(17)
a) CFfiOOH
\ YKOOCfCH^gHNOC CONHfCH^oCOOK £j pjQ , ff
R1,2,3,4
CONH(CH2l fiOOKk
CH3 § m-COfiH(CH2)}fOOK
KOOC(CHt) „HNOC
» KOOC(CH2) „HNOC
CONHfCHiftgCOOK
vyKOOQCHJ JiNOC CONHtCHJjoCOOK
R, (30) R2 (18) , Rs (32) R4 (19)c) Variante 1
NaBH4 I Tos R12 4
Variante 2
e I Tos R4
R,=
7 ?\»
Äö/ o \-asJV
^^•jJTi/Y
R,=
Abbildung 23 Alkylierungen von Cobyrinat und Cobamido-
N,N',N",N'",N',",N"'",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
57
dem das adsorbierte Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) (30) mit Methanol zusammen mit dem Alkylierungsmittel vom
Harz eluiert und durch dreimalige Fällung aus Methanol/Ether das Alkylierungsmittel
abgetrennt wurde.
Alternativ wurde mit dem Produkt eines weiteren, analog hergestellten Ansatzes die
Reinigung durch Fällung mit Phosphorsäure aus wässriger Lösung untersucht. Der sich
bildende Niederschlag war äusserst fein und Hess sich erst durch Zentrifugation (4'000
Upm, 30 min) abtrennen. Die Reinigungswirkung war, wie die 1H-NMR-spektroskopische
Analyse zeigte, minimal.
Das (a/ß)-lsomerenverhältnis der Produkte der Methylierung mit Methyltosylat wurde
durch Auswertung der Intensitäten im 1 H-NMR-Spektrum der am Kobalt gebundenen
Methylgruppe bestimmt. Es entsprach mit einem Wert von a/ß= ca. 4/1 ungefähr dem, das
Stepanek [91] nach Alkylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) mit Methyltosylat erhielt. Die Zuordnung der (a/ß)-lsomeren
stützte sich dabei auf die von Kräutler und Caderas [28] getroffene Zuordnung bei durch
Alkylierung von Co(l)-cobester in Toluol/THF erhaltenen Methylcobestern (Coa-Methyl: -
0,21 ppm; Coß-Methyl: -0,10 ppm).
Die UV/vis- (CH3OH), 1H-NMR- (CD3OD) und IR-Spektren des Produktes entsprachen
jenen des Produktes, das Stepanek [91] nach Alkylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",
N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit Methyltosylat charakterisierte.
Die Charakterisierung wurde um die FAB(+)- & FAB(-)-Massenspektren sowie die CD-
und UV/vis-Spektren in Wasser erweitert.
Analog der Beobachtung beim Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",
N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) waren die UV/vis-Spektren in Wasser
und Methanol praktisch identisch, die CD-Spektren hingegen unterschieden sich deutlich
voneinander. Das 13C-NMR-Spektrum von 30 in Deuteromethanol bei Raumtemperatur wies
erstaunlicherweise nur eine geringe Auflösung auf, ein Effekt der für die Analoga
Hexakalium-Coa-aquo-Coß-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (18) und Hexanatrium-Coct-aquo-Coß-1,N6-ethenoadenosyl-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19), für die erst bei
Temperaturen unterhalb -1,0 °C vollständige 13C-NMR-Spektren erhalten wurden, noch
ausgeprägter war.
58
2.3.2 Adenosylierung
Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20)
Die Adenosylierung von Co(l)-cornnen wurde von Hogenkamp [9], Stepanek [91] sowie
Bernhauer und anderen Autoren [119] mit 2',3'-0-lsopropyliden-5'-0-Tosyladenosin
durchgeführt und anschliessend Isopropyliden säurekatalysiert entfernt [98, 119]. Im
Rahmen dieser Arbeit wurde die Adenosylierung von Co(l) cobyrinat zum Hexakalium-Cotx-
aquo-Coß-5'-adenosyl-cobynnat (20) direkt durchgeführt, analog der Umsetzung von
Co(l)-cobalamm mit 2',3'-Dideoxyadenosyl 5'-tosylat zum 2',3'-Dideoxyadenosyl-5'
cobalamin [104]
Die direkte Umsetzung von B12s mit 5'-0-Tosyladenosin (15) brachte nach Friedrich [5]
bescheidene Ausbeuten und auch Jacobson [96] bezeichnete diesen Syntheseweg als nicht
empfehlenswert
Die hier beschriebene Synthese jedoch verlief trotz ungeschützter Adenosyleinheit mit
befriedigenden isolierten Ausbeuten (76%), wobei die nicht quantitative Ausbeute in
Elutionsverlusten während des Waschens mit 0,1 M H3PO4 des am C-18 Kieselgel
adsorbierten Rohproduktes begründet lag
Zur Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl cobyrinat (20) wurde in einer
Glove-box Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrmat (24) platinkatalysiert mit Wasserstoff
zu Co(ll)-cobynnat reduziert, mit Natriumborhydrid Co(l)-cobynnat hergestellt und
dieses mit 5'-lodo-5'-desoxyadenosin alkyliert Die von Siefert [120] beschriebene
Methode der Reinigung durch Adsorption an XAD war für das Adenosylcobynnat 20 nicht
erfolgreich Es liess sich aber aus saurer Lösung an C-18-modifiziertem Kieselgel
adsorbieren Das Rohprodukt wurde daher aus leicht saurer Lösung direkt auf C-18
Kieselgel aufgezogen, durch Zugabe von KHCO3 in das Kaliumsalz überfuhrt und mit Aceton
aus Methanol gefällt
Zur Reinigung des Rohproduktes von überschüssigem Alkylierungsmittel war zweimalige
Fällung ausreichend, wobei der Niederschlag stets sehr fein ausfiel und durch Zentnfugation
von der Mutterlauge getrennt werden musste, doch konnte im Gegenzug vor der Fällung auf
eine Entfernung der Reste des Alkylierungsmittels durch Ausschütteln mit Methylenchlond
verzichtet werden
59
(20)
aiAaJ v«Vj ÜJu1 0 ppm
Abbildung 24: 'H-NMR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-CoßS'-adenosyl-
cobyrinat (20) in Deuteriumoxid, c= 2,40-10'2 M, 300,13 MHz
E f f
Abbildung 25: CD-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat
(20) in Wasser, c- 2,17-10's M
J 1 1 I L
ppm8 7 6 5 4 3 2 1 0
Abbildung 26: 'H-NMR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carbox-
ylat) (18) in Deuteromethanol, c= 8.26-1Q-3 M, 300,13 MHz
Die Identität der synthetisierten Verbindung mit Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-
cobyrinat (20) wurde durch Vergleich der 1H-NMR- (D20) (Abbildung 24), 13C-NMR-
(D20) und UV/vis-spektroskopischen Daten mit dem analogen Isopropylidenadenosyl-
cobyrinat [91] hergeleitet. Die Signale in den 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren waren
zudem dem Adenosylcobinamid [107] vergleichbar. Die Riboseprotonen konnten mit
Entkopplungsexperimenten zugeordnet werden.
Die Unterschiede des CD-Spektrums beim Wechsel von Methanol als Lösungsmittel zu
Wasser waren ausgeprägter (vgl. [91] und Abbildung 25) als beim 1,N6-Ethenoadenosyl-
analogen 21.
Die Herstellung des reinen Kaliumsalzes war gemäss FAB-Massenspektrum nicht
erfolgreich, vielmehr beobachtete man neben protonierten Carboxylaten Natriumsalze. Das
Natrium wurde dabei wahrscheinlich über ubiquitär vorhandene Natriumionen und
Verunreinigungen des eingesetzten Kaliumsalzes eingeschleppt.
Bei den Synthesen der 1,N6-Ethenoadenosylcorrine wurden daher direkt die
Natriumverbindungen hergestellt.
61
Hexakalium-Co a-aquo- Co ß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18)
Zur Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N",,N"",N ,
N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (18) wurde in einer Glove-box Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)
(17) platinkatalysiert mit Wasserstoff zu Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) reduziert, mit Natriumborhydrid Co(l)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) hergestellt und mit 5'-lodo-
5'-desoxyadenosyl alkyliert6. Das Rohprodukt wurde direkt aus der Reaktionslösung an C-
18 Kieselgel adsorbiert, durch Zugabe von KHCO3 in das Kaliumsalz überführt und mit
Aceton aus Methanol gefällt.
In orientierenden Syntheseversuchen wurde deutlich, dass bei der Alkylierung mit 5'-0-
Tosyladenosin (15) das Alkylierungsmittel sich nicht durch Fällung des Rohproduktes aus
Methanol mit Aceton entfernen Hess und gleichzeitig bedingt durch Substanzverlust während
der Fällung die Ausbeute stark reduziert wird. Der Reinigungsfaktor der Fällung war mit
cirka zwei sehr gering. 5'-lodo-5'-desoxyadenosyl hingegen Hess sich vom Corrin durch
einfache Fällung aus Methanol mit Aceton quantitativ abtrennen.
Die Hydrolyse überschüssigen Natriumborhydrids mit H3PO4 war nicht notwendig, da das
Hexakalium-Coot-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-
decyMO'-carboxylat) (18) direkt aus der Reaktionslösung und quantitativ auf C-18
Kieselgel aufgezog und die adsorbierte Substanz sofort mit Wasser gewaschen wurde. Das
Natriumborhydrid Hess sich dabei problemlos entfernen. Unerwartet war, dass entgegen den
Verhältnissen beim Adenosylcobyrinat 20, das Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",
N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) 18 nur aus basischer Lösung und nicht
aus leicht saurer Lösung auf C-18 Kieselgel aufgetragen werden konnte.
Die C-18-Methode der Aufarbeitung vereinfacht die Synthese im Vergleich zu den bisherigen
Methoden wesentlich. Nicht alkyliertes Corrin blieb beim nachfolgenden Elutionsprozess auf
dem C18-Träger zurück.
6 Synthese analog Stepanek [91] mit modifiziertem Alkylierungsagenz und veränderter
Aufarbeitung.
62
Die Identität der synthetisieren Verbindung mit Hexakalium-Coot-aquo-Coß-5'-adenosyl-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18) wurde
durch die 1H-NMR- (D20), IR- und 13C-NMR-(Ü20) spektrokopischen Daten belegt, die
sich von jenen des Isopropylidenanalogen [91] in Deuteromethanol kaum unterscheiden und
bezüglich des Adenosylrestes die beim Adenosylcobinamid [107] beobachtete Signalstruktur
aufwiesen.
Im 1 H-NMR-Spektrum in Deuteromethanol (Abbildung 26) konnten die Ribosesignale des
Adenosylrestes wiederum mit Entkopplungsexperimenten zugeordnet werden.
Das 13C-NMR-Spektrum in Deuteriumoxid zeigte erst bei einer Messtemperatur von unter
1,0 °C sämtliche erwarteten Signale. Das Fehlen einer Isopropylidenschutzgruppe am
Adenosin wirkte sich im 13C-NMR-Spektrum in der Hochfeldverschiebung der
Adenosylsignale verglichen mit der Signallage im isopropylidengeschützten Derivat [91]
aus.
Das FAB(-)-Massenspektrum zeigte nicht den erwarteten Molekularpeak, hingegen trat als
Signal grösster Intensität ein Peak bei m/z 2349,5 auf, der dem Molekulargewicht eines
Tetrakalium-tricarbonsäure-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) ohne Adenosylteil entspricht.
2.3.3 Alkylierungen mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
unter Natriumborhydridreduktion
Die Synthese von Hexanatrium-Co<x-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat
(21) und Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",
N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (19) wurde bislang noch nicht
beschrieben.
Es lag nahe, in Analogie zu den Adenosylierungen von in situ aus den Co(ll)-corrinen mit
Natriumborhydrid hergestelltem Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",
N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)7, die Synthese des 1,N6-Ethenoadenosyl-
aquo-hexakalium-cobyrinat (21) über eine Reduktion in Methanol Natriumborhydrid und
7 vgl. 2.3.2
63
Alkylierung mit dem entsprechenden Tosylat, 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), zu
probieren.
In einer Glove-box wurde Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) platinkatalysiert
mit Wasserstoff zu Co(ll)-cobyrinat reduziert, das Co(ll)-cobyrinat mit 404 Äquivalenten
Natriumborhydrid zum Co(l)-cobyrinat umgesetzt und mit 14 Äquivalenten 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) alkyliert. Das UV/vis-Spektrum der wässrigen Lösung
bestätigte den Erfolg der Alkylierung und zeigte die für basenfreie Alkylcorrine typische
Struktur mit einem Maximum bei 454, 301 und 263 nm.
Das Produkt der Umsetzung von Co(l)-cobyrinat mit 1,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
(16) wurde nach Elution von der C-18-Kartusche direkt mit Ether aus der methanolischen
Lösung gefällt und war anschliessend frei von Alkylierungsmittel oder seinen
Hydrolyseprodukten. Diese Synthese lieferte aber, wie die später durchgeführte
elektrochemische Synthese8 von 21 zeigte, nicht das gewünschte Produkt sondern ein
alkyliertes Cobyrinat 31 mit unbekannter Struktur des Alkylrestes.
Es bestand Grund zu der Annahme, dass das Cobyrinatgerüst unverändert vorlag, denn unter
dealkylierenden Bedingungen, wässrigem KCN und Sonnenlicht, wurde das UV/vis-Spektrum
der Dicyanocobyrinsäure (24) zurückerhalten. Zudem konnten die Signale des Corrinringes
im 13C-NMR-Spektrum weitestgehend zugeordnet werden und im FAB(-)-Massenspektrum
war das Signal des dealkylierten Cobyrinsäuregerüstes (m/z 1155,6) zu beobachten.
Bei dem direkt an das Kobalt gebundenen Verbindungsteil handelt es sich höchst¬
wahrscheinlich um Ribose. Das 1 H-NMR-Spektrum der Produkte in Deuteromethanol zeigte
nämlich deutlich ein Triplett bei 0,20 sowie ein Dublett bei 0,50 ppm, der chemischen
Verschiebung des C5' der kobaltgebundenen Ribose. Mit Entkopplungsexperimenten Hessen
sich im 1 H-NMR-Spektrum analog dem Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat
(20) mit diesem Proton gekoppelte Protonen identifizieren, deren chemische
Verschiebungen, 5,36 ppm, 4,05 ppm und 3,48 ppm, mit einem Ribosering kompatibel
sind. Das Signal des Ribose-C4' wurde allerdings nicht gefunden, wahrscheinlich weil es mit
einer wenig aufgelösten Signalgruppe zusammenfällt.
Der 1 ,N6-Ethenoadenin-Teil des Alkylierungsmittels war in der Reaktionslösung auf jeden
Fall einer Reaktion unterworfen. Die Signale im 1 H-NMR-Spektrum einer Lösung von 31 in
8 vgl. 2.3.4
64
Deuteromethanol bei 7,33 ppm, 7,16 ppm und 6,82 ppm entsprachen nicht den
entsprechenden Signallagen der base-off Form des 1,Ne-Ethenoadenosylcobalamin (4) bei
9,42 ppm, 9,31 ppm, 8,35 ppm und 7,99 ppm und unterschieden sich auch von jenen des
später elektrochemisch synthetisierten Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-
adenosyl-cobyrinat (21 )9.
Eine Reaktion des 1,N6-Ethenoadenins im durch den grossen Natriumborhydridüberschuss
stark basische Milieu entspricht den bereits in der Literatur gemachten Beobachtungen.
Inoue [121] schlägt als Reaktion für das 1 ,N6-Ethenoadenin in stark basischem, wässrigen
Milieu die Öffnung des mittleren Ringes unter Formamidbildung vor (31 a).
7,16 ppm7,16 ppm
h ca. 7,70 ppm [122]
7,16 ppm-
ca. 13,4 ppm [112] mc.»^^ H^com,.0
7,33 ppm
ca. 8,2-8,7 ppm [122] / »Tl H
I OH OH
ca. 7,5-9,5 ppm [122]
31a
7,16 ppm
31 b
Abbildung 27: Produkte der Umsetzung von 1.NP-Ethenoadenosin mit NaBH4
Die kohlenstoffgebundenen Protonen des endständigen Pyrrols müssten dann eine praktisch
identische chemische Verschiebung aufweisen. Es wird auch tatsächlich ein Signal einer
mindestens zwei Protonen entsprechenden Intensität bei 7,16 ppm beobachtet. Das Signal bei
7,33 ppm ist mit dem einzigen Proton des anderen Pyrrolringes kompatibel. Die für die
Struktur 31 a gemäss [122] bei 8,2-8,7 ppm (HN-COtU, sowie in der Region von 7,5-
9,5 ppm (HN-COH) zu erwartenden Signale wurden aber nicht beobachtet. Das H(N-Pyrrol)
sollte bei ca. 13,4 ppm erscheinen. Es lag jedoch ausserhalb des Messbereiches (10 bis -1
ppm).
9 vgl. 2.3.4
65
Ist die Struktur 31a nicht mit dem experimentell beobachteten 1H-NMR-Spektrum
kompatibel, so lässt es sich durch das postulierte Folgeprodukte 31b, in der Formamid
durch einen Wasserstoff ersetzt ist, vollständig interpretieren. Die drei Protonen
entsprechende Intensität des Signales bei 7,16 ppm wird nun verständlich und ausser dem zu
erwartenden Signal bei ca. 13,4 ppm trat für jedes Protonen der postulierten Struktur das
erwartete Signal im 1 H-NMR-Spektrum auf, vom H(N-Pyrrol) abgesehen.
Das FAB(+)-Massenspektrum unterstützt den Strukturvorschlag für den am Kobalt
gebundenen Alkylrest, denn das Signal der protonierten, mit 31b alkylierten Tetranatrium-
disäure (m/z 1336,74) ist deutlich sichtbar.
Die Alkylierung zu 31 war sowohl mit 5'-Chloro-5'-deoxy-l,N6-etheno-adenosin als auch
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) reproduzierbar. Während zur Alkylierung mit
5'-Chloro-5'-deoxy-1 ,N6-etheno-adenosin jedoch ein 20-facher Uberschuss an
Alkylierungsmittel nötig war, um die Reaktion innerhalb einiger Stunden ablaufen zu lassen,
genügte beim Tosylat 16 ein Uberschuss von nur wenigen Prozent. Beim 5'-Chloro-5'-
deoxy-l,N6-etheno-adenosin hingegen verblieben selbst nach sechsfacher Fällung ca. 10%
Alkylierungsmittel bezogen auf das Corrin im Präzipitat, welches daher noch
dünnschichtchromatographisch gereinigt werden musste.
Analog dem Co(ll)-cobyrinat wurde Co(ll)-cobamido-N,N,,N",N"',N"",N"'",N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) mit 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin in Gegenwart
eines 200-fachen Überschusses von Natriumborhydrid zu 32 alkyliert.
Das Alkyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N"'",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) 3 2
Hess sich während der Aufarbeitung nicht mittels Ausschütteln der wässrigen
Reaktionslösung gegen Methylenchlorid von überschüssigem Alkylierungsmittel reinigen.
Bei der dünnschichtchromatographischen Trennung auf C-18 Kieselgel mit
Methanol/Wasser 6,5:5 trennte zwar eine fluoreszierende Substanz deutlich von der
Hauptbande mit dem Alkylierungsprodukt 32 ab, doch enthielt dieses nach Elution vom
Kieselgel und Fällung mit Aceton aus methanolischer Lösung gemäss 1 H-NMR-Spektrum noch
immer 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin. Zog man hingegen das Rohprodukt analog
dem Hexakalium-Coo-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N' -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) (18) mit KHCO3 auf SepPack auf, konnte man das Alkylierungs¬
mittel mit Methanol/Wasser (8:2) auswaschen und direkt das gewünschte Salz darstellen.
Gemäss 1 H-NMR-Spektrum war die am Kobalt gebundene Alkylgruppe des isoHerten
Produktes 32 mit dem des analog hergestellten Cobyrinates 31 identisch.
66
2.3.4 1,N6-Ethenoadenosylierungen
Hexana trium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobynnat (21)
Nachdem nun die Alkylierung in Anwesenheit von Natriumborhydrid nicht zu den
gewünschten Verbindungen führte bot sich als Alternativmethode die elektrochemische
Reduktion des Cornnes an, die schon bei den Cobalaminen erfolgreich angewendet werden
konnte [104]
Im Rahmen der elektrochemischen Synthese wurde die Möglichkeit der
platinoxidkatalysierten Reduktion des Dicyano-heptakalium Co(lll) cobyrinat (24) zu
Co(ll)-cobyrmat ausserhalb der Glove box geprüft Sämtliche Synthesen, welche mit derart
reduziertem Material durchgeführt wurden, lieferten kein einheitliches 1H NMR-Spektrum
sondern wiesen im Bereich 1 3 ppm eine deutliche Wölbung der Grundlinie sowie nicht
interpretierbare Signale auf Diese Beobachtungen waren gemäss HCN-Test nicht allein mit
Verunreinigung der NMR-Probe durch Co(ll) cobyrinat zu erklären (HCN-Zugabe führte
nicht zu einem sofortigen Auftreten einer Bande bei 367 nm im UV/vis-Spektrum)
Es wurden zwei Synthesevarianten untersucht Das Alkylierungsmittel wurde vor der
Reduktion des Co(ll)-cobynnates zum Co(l)-cobynnat bzw nach quantitativer Reduktion
zum Co(l) corrin zugegeben Die nach Aufarbeitung und Reinigung isolieren Hauptprodukte
der beiden Synthesevarianten waren gemäss 1 H-NMR-Spektrum identisch Erfolgte die
Zugabe des Alkylierungsmittels bereits zu Beginn der Co(ll)/Co-(l)-Reduktion wurde
jedoch 5' Chloro 5'-deoxy-1,N6 etheno adenosin, wahrscheinlich durch elektrochemische
Dehalogenierung [92], verbraucht
Die elektrochemische Reduktion des Co(ll)-cobynnates zum Co(l)-cobynnat benötigte für
ca 60 mg Co(ll) cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n decyl 10'-carboxylat)
vier Stunden Die anschliessende Alkylierung war eine Stunde nach Zugabe des
Alkylierungsmittels abgeschlossen
In Analogie zu 31 & 32 konnte 5' Chloro-5'-deoxy-1 ,N6 etheno adenosin nicht durch
Fällung aus Methanol mit Aceton entfernt werden, ebensowenig wie durch Ausschütteln einer
Lösung des Rohproduktes in Wasser gegen Methylenchlond Die als Alternative bereits bei
31 angewendete SepPack Methode mit Aufziehen der Substanz aus saurer Lösung auf C-18
Kieselgel und anschliessender zweimaliger Fällung des Natriumsalzes 21 aus wässriger
Lösung mit Aceton war auch in diesem Falle erfolgreich Bei Zugabe des 5'-Chloro-5'-
67
deoxy-1 ,N6-etheno-adenosin vor der elektrochemischen Reduktion musste das Rohprodukt
nach der Entfernung des Alkylierungsmittels an SepPack noch dünnschichtchromato-
graphisch von Nebenprodukten an einer C-18-Kieselgel Umkehrphase gereinigt werden. Die
Ausbeute an isoliertem Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat
(21) betrug für diesen Syntheseweg nur 61 % anstatt der 81 %, die bei Zugabe des
Alkylierungsmittels nach quantitativer Reduktion zum Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",
N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) erzielt werden konnten.
Die 1 ,N6-Ethenoadenosylsignale im 1 H-NMR-Spektrum (D20) (Abbildung 28), 8,91 ppm,
8,07 ppm 7,90 ppm und 7,50 ppm lagen in vergleichbaren Regionen wie die des 1,N6-
Ethenoadenosylcobalamin (4) in Deuteriumoxid/10%Deuterotrifluoressigsäure10 (8,89
ppm, 8,71 ppm, 7,84 ppm und 7,51 ppm). Die Riboseprotonen wurden ausgehend vom
H(C-5') Signal bei 0,00 ppm (CD3OD) (Abbildung 29) und dem Peak des C-1-
Riboseprotons durch Entkopplungsexperimente identifiziert und zugeordnet.
Das UV/vis-Spektrum zeigte die erwartete, für das 1 ,N6-Ethenoadenin typische Bande bei
255 nm mit dem entsprechenden, doppelt so hohen Extinktionskoeffizienten e wie beim
Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) (18). Die drei weiteren Absorptionsmaxima des 1,N6-
Ethenoadenosin schlagen sich ebenfalls in erhöhten Absorptionen nieder. Das
Absorptionsmaximum längster Wellenlänge ist im Vergleich zum Hexakalium-Coa-aquo-
Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20) um 6 nm zu kürzeren Wellenenlängen nach 454 nm
verschoben.
In Analogie zu anderen im Rahmen der vorliegenden Arbeit beschrieben Alkylcorrinen wies
das FAB(-)-Massenspektrum zwar keinen Molekularpeak auf doch war das Signal des
dealkylierten Moleküls, m/z 1087,4, beobachtbar.
Ausgehend vom Hexanatriumsalz 21 wurde die freie Säure dargestellt indem in Wasser
gelöstes 21 auf SepPack C-18 adsorbiert, mit Wasser gewaschen, mit Methanol wieder
eluiert und durch Zugabe von Ether gefällt wurde. Die Signale des (1,N6-
Ethenoadenosyl)adenosylrestes im 1 H-NMR-Spektrum (CD3OD und D20) der freien Säure
waren stark verbreitert (Halbwertsbreite 0,1 ppm).
10 vgl. 6.2
68
U7uvJuJ
^
MJ_l I u _l I I l_
11 10 9 8 76 5432 10 ppm
Abbildung 28: 'H-NMR-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-
etheno)adenosyl-cobyrinat (21) in Deuteriumoxid, c= 2,00-W2
M, 300,13 MHz
&uva_JUj"
8 1 PPm
Abbildung 29: 'H-NMR-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-
etheno)adenosyl-cobyrinat (21) in Deuteromethanol, c= 2,00-10-2
M, 300,13 MHz
69
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",
N"'^""^ ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (19)
Die Synthese des Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (19) wurde analog der des
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) durchgeführt.
Erfreulicherweise war trotz der Alkylketten das Kobaltzentrum für eine elektrochemische
Reaktion an einer festen Elektrode genügend zugänglich, um ohne Mediator zum Co(l)-
cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) reduziert zu
werden. Bei der 1,N6-Ethenoadenosylierung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) war die Reihenfolge der Alkylierungsmittelzugabe
jedoch kritischer als beim Co(l)-cobyrinat. Sofortige Zugabe des Alkylierungsmittels 5'-
Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin bei Beginn der Elektrolyse zum Co(l)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) führte gemäss 'H-NMR- und
UV/vis-Spektrum zu ca. 30% Nebenprodukten, welche nicht weiter identifiziert wurden. Es
verblieb nach Aufarbeitung und Reinigung eine isolierte Ausbeute von 30%. Gab man das 5'-
Chloro-5'-deoxy-1 ,N6-etheno-adenosin nach abgeschlossener Reduktion zum Co(l)-
cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) dazu, resultierte
hingegen eine Ausbeute von 81%.
Zur Reinigung des Rohproduktes wurde das Produkt analog 32 direkt aus der
Reaktionslösung auf eine C-18-Umkehrphase aufgezogen, mit einem Wasser-Methanol-
Gemisch, 3:7, das 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin eluiert und das
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (19) nach Elution mit Methanol mit Aceton gefällt.
Das Präzipitat wurde ebenso wie das Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (30) während des
Trocknungsprozesses lackartig.
Wurde das Alkylierungsmittel, d.h. 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin, vor Beginn
der elektrochemischen Reduktion zugegeben, mussten die entstehenden corrinoiden Neben¬
produkte mit Dünnschichtchromatographie abgetrennt werden.
70
Abbildung 30 UV/vis-Spektrum von Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",Ne-
etheno)-adenosyl-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N""",N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) (19) m Wasser, c= J,90 10~s M
l 5
Abbildung 31 CD-Spektrum von Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-
etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N""',N"""-hepta-(n-
decyl-W-carboxylat) (19) in Wasser, c= 1,90 10 5M
71
Die UV/vis-Spektren von 19 sind in Wasser (Abbildung 30) und Methanol identisch und
ähneln denen des Hexakalium-Coo-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18). Das langwelligste Absorptionsmaximum
liegt für 19 bei 456 nm, verglichen mit 458 nm bei 18.
Die CD-Spektren von 19 in Wasser (Abbildung 31) und Methanol unterscheiden sich
hingegen wie bereits bei Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es (17) in wässriger und methanolischer Lösung
voneinander. In Methanol werden zusätzliche Nulldurchgänge bei 459 und 470 nm
beobachtet während im Vergleich zum CD-Spektrum in Wasser die Nulldurchgänge bei 235
und 239 nm fehlen. Die Lage der Maxima in den CD-Spektren ist praktisch identisch.
Das 1 H-NMR-Spektrum von 19 in CD3OD (Abbildung 32) entsprach dem des Hexakalium-Co
a-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N,,N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat) (18). Die Signale des Ribose C-5a und ß traten in Deuteromethanol deutlich hervor,
wenn auch bei 0,38 & 0,91 ppm statt bei 0,30 81 0,40 ppm wie beim Adenosylanalogen 18,
und die chemischen Verschiebungen einiger Riboseprotonen konnten für 19 durch
Entkopplungsexperimente bestimmt werden.
In D20 bestand das 1 H-NMR-Spektrum nur aus Signalhaufen mit Maxima bei 1,15, 1,40,
2,05 und 3,00 ppm.
Das 13C-NMR-Spektrum von 19 in Deuteromethanol (Abbildung 33) zeigte erst nach
Abkühlung der Probenlösung auf -5,8 °C sämtliche erwarteten Signale und kontrastiert
somit zu den Alkyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)en 32 & 18, deren 13C-NMR-Spektrum bereits bei -1,0 °C eine vergleichbare
Auflösung aufwiesen.
Der Nachweis einer Kobalt-Kohlenstoff-Bindung wurde nochmals unabhängig durch eine
analog dem Hexakalium-Coo-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (30) in präparativem Massstab ausgeführte
Dealkylierung erbracht: das Produkt 19 lieferte nach Reaktion mit Kaliumcyanid unter
Lichtausschluss und anschliessender Aufarbeitung ein 1 H-NMR-Spektrum, das mit dem des
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (17) identisch war.
72
10 8 1 0 ppm
Abbildung 32: 1 H-NMR-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-
etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) (19) in Deuteromethanol, c= 2,56-10~2 M,
300,13 MHz
.eil =i ; * t i e **B'
ffff t ?m ? ? i ; : ii ?b ias< in au s s
I I I I I I ! I I I I II
KOOC{CH})](flNOC
KOOC(CH2)I(>HNOC
> CYKOOCICHJufmOC CONH(CH,)^COOK
-Ju i.(19)
ml.;,; LiL
Abbildung 33: '3C-NMR-Spektrum von Hexanatrium-Cocc-aquo-Coß-5'-(1",N6-
etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N"""-hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) (19) in Deuteromethanol, c= 1,27-1Q-2M,
100 MHz, -5,8 °C
73
2.4 Synthese der Gastmoleküle
Das micellartig erweiterte Cobyrinsäurederivat, Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17), über dessen
Assoziationsverhalten zu Beginn dieser Arbeit keinerlei Erfahrungen vorlagen, sollte auf
seine Eigenschaften als Wirtmolekül untersucht werden. Die idealen Eigenschaften eines
komplementären Gastmoleküls wurden dabei wie folgt definiert:
/. das Corringerüst nicht überschreitende Grösse
2. minimale Löslichkeit in Wasser
3. günstige Fluoreszenzeigenschaften
Als erstes wurde das leicht zugängliche 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)
synthetisiert. Die Fluoreszenzeigenschaften von 9,10 symmetrisch disubstituierten
Anthracenen waren bereits gut untersucht [123]. Die Synthese von Homologen zu 22 wäre
praktisch identisch durchführbar gewesen, sodass der gewünschte Variationsspielraum zum
genauen Abgleich mit den Eigenschaften des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)
und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'carboxylat) gegeben zu sein schien. Die Experimente mit 9,10-Di-(4-
brombutyloxy)-anthracen zeigten jedoch, dass Assoziate mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) nur unter
ganz besonderen Bedingungen, und zwar in Anwesenheit von Methylenchlorid, herstellbar
waren. Die derart erhaltenen Assoziate waren zudem metastabil11.
Analoge Versuche mit 5'-0-Tosyladenosin (15) waren ermutigender, da sie eindeutig auf
eine Assoziation von 15 mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",
N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) hindeuteten. Damit stellte sich die
Frage nach den relativen Lagen von Wirt- und Gastmolekül. 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-
tosylat (16), das durch die 1 ,N6-Etheno-Brücke Fluoreszenzeigenschaften erhält, die als
Sonde zur Aufklärung der nächsten Umgebung genutzt werden können, wurde daher erstmalig
hergestellt und auf seine Assoziationseigenschaften mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-
cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N",",N -
hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) untersucht12.
11 vgl. 4.1
12 vgl. 6.6 & 6.8
74
(33)
II H20 I jf INaOH
Na2S204
21
Br
Br
(22)
NH,
N^VN&
Sv-^JV r/'L.O-S-C^-CH,
(15) IS—PIS\ 0,
v+H°
(i6OHOH
MeOH I Phosphatpuffer (1 M, pH 9)
Abbildung 34: Synthese der Gastmoleküle 9,10-Di-(4-brom-
butyloxy)-anthracen (22) und 1.^-EthenoadenosylS'-O-tosylat (16)
75
9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)
22
Cherkasov [124] und Clark [125] stellten 9,10-substituierte Anthracenderivate aus
Anthrachinon 33 erstmals als Zwischenprodukt der Synthese von 9,10-Di-(4-
carboxybutyl)-anthracen bzw. im Zusammenhang mit Untersuchungen zum Einfluss von
Substituenten am Anthracen in 9,10-Stellung auf das UV/vis-Spektrum dar.
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Synthese stützte sich auf die Vorschrift von
Yeung [123], der in situ aus Anthrachinon 33 und Dithionit erzeugtes Anthra-9,10-diol
mit Halogenalkylen umsetzte.
Anthrachinon wurde mit Natriumdithionit zum 9,10-Anthradiol reduziert, welches mit in
grossem Uberschuss eingesetztem 1,4-Dibrombutan zum 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-
anthracen 22 weiterreagierte. Das Produkt 22 Hess sich aus dem Rohprodukt weder fällen
noch kristallisieren. Das Rohprodukt wurde daher chromatographiert wobei die grosse
Menge an überschüssigem 1,4-Dibrombutan sich rasch und problemlos durch Waschen der
Kieselgelsäule mit Hexan vor Beginn der eigentlichen Chromatographie abtrennen Hess. Die
Ausbeute lag mit 9,5 % isolierter, kristalliner Substanz deutlich unter den 45%, die von
Yeung [123] mit der Monobromverbindung erzielt wurden. Die Vorschrift wurde allerdings
in Bezug auf die Ausbeute noch nicht optimiert, da rasch genügend Material für die weiteren
Experimente vorlag.
Das 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren sowie die Mikroanalyse zeigten ausschliesslich die
erwarten Signallagen und Intensitäten und bestätigten die Synthese des gewünschten
Produktes. Das IR-Spektrum war mit der Struktur von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-
anthracen 22 kompatibel und zeigte bei 1075 cm~1 die für Etherbrücken charakteristische
Absorptionsbande. Das UV/vis-Spektrum von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen 22
wies mit seinen Maxima bei 403, 381, 363 und 258 nm das gleiche Muster mit ungefähr
den gleichen Absorptionskoeffizienten auf wie die von Yeung [123] und Cherkasov [124]
publizierten UV/vis-Spektren der 9,10-Di-(alkyloxy)-anthracene.
76
1,N6-Etheno-5'-tosyl-5'-deoxy-adenosin (16)
o
o
KU
1 6
Ein fluoreszierendes Adenosinanaloges wurde erstmalig von Kochetkov et al. [126] durch
Ringschluss am Adenin und Cytosin mittels Chloroacetaldehyd synthetisiert.
Bei der Umsetzung von 5'-0-Tosyladenosin (15) mit 1,2-Dibromethylacetat hingegen,
bereits von Powell et al. [127] 1974 erfolgreich angewendet, tritt die Hydrolyse in
Konkurrenz zum Ringschluss, sodass deutlich geringere Ausbeuten resultierten. Die
Reaktion verläuft zudem beim 5'-0-Tosyladenosin (15) wesentlich langsamer ab. Kimura
[128] zum Beispiel konnte erst nach 60 Stunden Reaktionsdauer (37 °C, pH 6,5) Adenosin
quantitativ in 1,N6-Ethenoadenosin überführen.
Für die Reaktion mit Chloroacetaldehyd hatte von Wang et al. [129] gezeigt werden können,
dass die Reaktion mit dem Angriff des N(1) auf den Aldehydkohlenstoff beginnt.
In der vorliegenden Arbeit wurde nun 5'-0-Tosyladenosin (15) in Methanol/
Phosphatpuffer pH 7, 1:1, suspendiert und 1,2-Dibrom-ethylacetat zugefügt. Die
Suspension, die langsam in Lösung ging, wurde mit wässrigem KOH während der mehrtägigen
Reaktionsdauer wiederholt auf ca. pH 4-6 eingestellt. Die Lösungsmittelzusammensetzung
erklärt sich durch das Löslichkeitsverhalten der Reaktionsteilnehmer. Kochetkov [126] gab
in seiner Vorschrift zu einer wässrigen Lösung Ethanol allein zur Homogenisierung der
Lösung hinzu. Die Reaktion Hess sich auch in reinen Ethanol oder Propanol nicht von Beginn
an homogen durchführen.
Überschüssiges Edukt wurde aus der Reaktionslösung durch Ausschütteln mit
Methylenchlorid entfernt. Im 1 H-NMR-Spektrum des verbleibenden, eduktfreien
Rohprodukts (gewogene Ausbeute 60%) fanden sich die Signale der Zielverbindung 16 sowie
77
einer weiteren Substanz, die dieselbe Anzahl Protonen besass jedoch nicht isoliert werden
konnte. Das diffizile Löslichkeitsverhalten des Tosylates 16, sowohl in Methanol als auch in
Methylenchlorid konnten nicht beliebig konzentrierte Lösungen hergestellt werden, bedingte
in der anschliessenden präparativen säulenchromatographischen Trennung einen
ungewöhnlich grossen Säulendurchmesser. Das dabei isolierte 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-
tosylat (16) (34,5 %) Hess sich, im Gegensatz zu 1 ,N6-Etheno-5'-deoxyadenosin [5], nur
in Mikrokristallen aus Chloroform und Petrolether in 30%iger Ausbeute kristallisieren.
In einer Versuchsreihe, in der identische Ansätze nach unterschiedlichen Zeiträumen
aufgearbeitet wurden, wurden die absoluten Ausbeuten an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-
tosylat (16) und die relativen Anteile an Rohprodukt und Tosylat 16 in Funktion der
Reaktionsdauer bestimmt. Eine Verlängerung der Reaktionzeit über 500 Stunden hinaus
führte zu praktisch keiner Steigerung der Ausbeute mehr.
Das Produkt 16 wurde durch 1H-NMR-, 13C-NMR- und UV/vis-Spektroskopie, Mikro¬
analyse und das Massenspektrum umfassend charakterisiert. Die Spektren sind sämtlich mit
der Struktur des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) kompatibel.
Das UV/vis-Spektrum besteht aus der ebenfalls dem 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-
adenosin [95] typischen Bandenstruktur mit ausgeprägtem Maximum bei 227 nm und vier
Maxima bedeutend geringerer aber untereinander vergleichbarer Intensität bei 258 nm,
265 nm, 275 nm und 296 nm.
Durch Entkopplungsexperimente wurden die Signallagen der Riboseprotonen im 'H-NMR-
Spektrum identifiziert. Die Signale im 1 H-NMR-Spektrum bei 7,64 ppm respektive 8,08
ppm)13 wurden gestützt auf Deuteriummarkierungsexperimente von Leonard et al. [130]
den Positionen 10 bzw. 11 im 1 ,N6-Ethenoadenin zugeordnet.
Die Assoziatbildung des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) ist in der Literatur
wiederholt beschrieben [129, 131-136]. Das FAB(+)-Massenspektrum spiegelt dieses
Verhalten wider, indem nämlich nicht nur ein Signal der Intensität des Molekularsignales
(m/z 445) sehr deutlich hervortritt sondern auch bei (m/z 891), dem doppelten
Molekülargewicht.
Spektrum aufgenommen in CD3OD, c« 3,93-10"2 M.
78
Das 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) war im Gegensatz zu Methyl- und 5'-0-
Tosyladenosin (15) [137-140] in Deuteriumoxid relativ hydrolyseunempfindlich. In einer
gesättigten Lösung in Deuteriumoxid Hess sich 1 H-NMR-spektroskopisch selbst nach einer
Woche keine Hydrolyse feststellen. Bei 5'-0-Tosyladenosin (15) hingegen mussten im
Rahmen der innerhalb eines Tages durchgeführten Assoziationsexperimente die
Konzentrationen um den hydrolysierten Anteil korrigiert werden. Der Umfang der Hydrolyse
belief sich im Zeitrahmen der durchgeführten Experimente, d.h. innerhalb eines Tages, auf
maximal 10%.
Ursache für die langsamere Hydrolyse des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) im
Vergleich zu 5'-0-Tosyladenosin (15) könnte die Stacking-Tendenz des 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) [129, 131-136] sein. Erst ab Konzentrationen
unterhalb 10"3 M liegt 16 zu mehr als 98% in monomerer Form vor. Durch die Assoziation
der Moleküle von 16 wird wahrscheinlich die Hydrolyse des Tosylates behindert.
79
3. Wirt-Gast-Komplexe des miceiiartigen Cobyrinsäure
derivates
Zusammenfassung
Wässrige Lösungen von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
(17) wurden mittels Ultraschall mit 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22), 5'-
O-Tosyladenosin (15), Methyltosylat sowie 1.f^-EthenoadenosylS'-O-tosylat (16)
gesättigt und die resultierenden Lösungen UV/vis- und 1 H-NMR-spektroskopisch, im Falle
von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat zusätzlich mit Totallumineszenzspektroskopie
untersucht.
Für Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) konnte mit den Alkylierungsmitteln 22,
15 und 16 keine signifikante Assoziation nachgewiesen werden.
Hingegen zeigten sämtliche analog durchgeführten Experimente in wässrigen Dicyano-
heptakalium-cobamido-N,N",N",N"",N"",N""",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lös-
ungen 17 deutlich erhöhte Löslichkeiten der Alkylierungsmittel:
1. 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) wurde bei Raumtemperatur in An¬
wesenheit von Methylenchlorid in derselben Konzentration wie 17 gelöst während in reinem
Deuteriumoxid kein 22 detektienoar war. Bei 5 °C kristallisierte 22 vollständig aus.
2. Für 5'-0-Tosyladenosin (15) wurden aufgrund spektroskopischer Daten Assoziate
vermutet, deren mittlere Stöchiometrie von der Konzentration der Heptakalium-dicyano-
Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lösung
abhängig war. Diese Assoziate konnten ebenfalls über die zur Alkylierung zu Hexakalium-
Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N"""-hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (18) führende Reaktion mit Natriumborhydrid nachgewiesen werden.
3. Assoziate des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) mit I.NP-EthenoadenosylS'-O-tosylat (16)
wurden mit 1H-NMR-, UV/vis- und Totallumineszenzspektroskopie nachgewiesen. Wässrige
gesättigte l.f^-EthenoadenosylS'-O-tosylat-Lösungen, welche mit festen Dicyanocorrinen
24 und 17 versetzt wurden und wässrige Lösungen derselben Dicyanocorrine, die mit 1.N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt waren, wiesen trotz gemäss UV/vis-Spektrum
unterschiedlichen Konzentrationen an 1^-EthenoadenosylS'-O-tosylat identische
Totallumineszenzintensitäten auf.
80
CONH(CH,)t£OOK
S^—-._ CH, r-CONmCHJufiOOK
KOOC(CH,)I(f{NOC—% J^jL^StlcH
CT//
KOOCiCHJxflNOC
CONH(CH,)i,COOK
VYKOOC(CH,),^INOC COHHiCHJußOOK
VYCOOK COOK
c)
CV^Jy v-i-o—
UV/vis-Spektroskopie
'H-NMR-Spektroskopie
für c. zudem :
Totallumineszenzspektroskopie
Abbildung 35: Schematische Darstellung der Experimente zu den Wirt-Gast-
Eigenschaften von Dicyano-heptakalium-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N '-hepta-(n-
decyl-10 '-carboxylat)
81
Mit den Experimenten zum Assoziationsverhalten sollte die Fähigkeit des Cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) zur Aufnahme eines
Gastmoleküles untersucht werden.
Bei der Alkylierung der Corrine mit den Alkylierungsmitteln 15 und 16 liegt das Kobalt
nicht in der Dicyanoform (Co(lll)) sondern als Co(l) vor. Für sämtliche Assoziations¬
experimente wurden dennoch die Dicyanoverbindungen eingesetzt, weil diese
erstens in aerober Lösung stabiler sind als die entsprechenden Co(l)- und Co(ll)-
Verbindungen, die z.B. bei Alkylierung in aerober Lösung keine gemäss 1H-
NMR-Spektrum einheitlichen Produkte ergaben, sodass die entsprechenden
Assoziationsexperimente unter Inertgas hätten ausgeführt werden müssen,
zweitens die Dicyanoverbindungen 24 & 17 mit1 H-NMR-Spektroskopie untersucht
werden konnten, was z.B. für die Co(ll)-verbindungen aufgrund ihrer
paramagnetischen Eigenschaften unmöglich ist, und
drittens aufgrund der relativen Grösse der Cyanidliganden keine sterischen Effekte zu
erwarten waren.
In einem orientierenden Experiment mit dem im Vergleich zum Corrin kleinen Methyltosylat
wurde zuvor abgeklärt, ob Assoziation tatsächlich beobachtbar ist.
Dazu wurden Lösungen von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) bzw. -cobyrinat (24) gleicher
Konzentration in Deuteriumoxid mit Methyltosylat versetzt, mit Ultraschall behandelt und
nach Zentrifugation der Suspensionen das 1 H-NMR-Spektrum aufgenommen.
In der Lösung von 17 (7,1 mM) war 'H-NMR-spektroskopisch eine ungefähr doppelt so
hohe Konzentration an Methyltosylat nachweisbar als in einer gleichkonzentrierten Lösung
von 24. Dieses Ergebnis ermutigte dazu, weitere Moleküle auf ihre Assoziationseigen¬
schaften genauer zu untersuchen.
3.1 Die Assoziation mit 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)
Lösungen von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) (17) bzw. Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) in
Deuteriumoxid wurden (a) mit festem 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)
versetzt, oder (b) mit einer an 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen gesättigtem
Hexanlösung überschichtet oder (c) mit einer an 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen
gesättigen Lösung von Deuteromethylenchlorid versetzt und die Proben jeweils mit
Ultraschall behandelt. Die Probenlösungen wurden anschliessend zentrifugiert und mit
UV/vis- sowie 1 H-NMR-Spektroskopie analysiert. Aus diesen Spektren wurden die
82
Konzentrationen an Corrin und Anthracen 22 durch Auswertung der Absorptionsintensitäten
im UV/vis-Spektrum bzw. der Intensitätsintegrale im 1 H-NMR-Spektrum bestimmt und
sodann die mittlere Stöchiometrie postulierter Assoziate als Verhältnis der Konzentrationen
von Gastmolekül zu Corrin abgeleitet.
Während in den Experimenten (a) und (b) in der Deuteriumoxid-Phase der Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-Probe weder 1H-NMR- noch UV/vis-spektroskopisch
9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen delektiert werden konnte, fand sich bei (b) in der
Probe des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N '-hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) UV/vis-spektroskopisch ein Gehalt an 9,10-Di-(4-brombutyl-
oxy)-anthracen in Höhe von 2,3% der Corrinkonzentration.
In Experiment (c) führte die Ultraschallbehandlung einer Lösung von Heptakalium-dicyano-
Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) in Deu¬
teriumoxid, welche mit einer an 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen gesättigen Lösung
von Deuteromethylenchlorid überschichtet worden war, zu einer D20-Phase, dessen 'H-
NMR-Spektrum in Abbildung 36 oben wiedergegeben ist. Die Auswertung der Integrale des
9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen, das in Deuteriumoxid praktisch unlöslich ist, und
des Corrins 17 zeigte ein Verhältnis der Konzentrationen an Anthracen und Corrin von
1,05:1,00. Möglicherweise liegen Assoziate vor. Dabei lassen sich aufgrund der
Stöchiometrie monomere Komplexe eines Wirtmoleküls 17 mit einem Gastmolekül 22
vermuten, doch sind auf der Basis der vorliegenden Daten weder eine Verteilung
verschiedener Assoziate unterschiedlicher Stöchiometrien mit dem zufälligen Mittelwert 1:1
noch multiple Einheiten von 1:1 Komplexen ausschliessbar. Im 1 H-NMR-Spektrum findet
sich durch die Signallage des C3 des Corrins, welches statt bei 4,06 ppm im Beschreibungs¬
spektrum nun bei 4,23 ppm beobachtet wurde, ein Hinweis auf Assoziation. Ansonsten war
das Spektrum der Probenlösung eine Superposition der Spektren der reinen Substanzen.
Die beobachteten Löslichkeiten waren bei Reduktion der Temperatur der Lösung nicht stabil.
Nach 12 Stunden bei 5 °C fiel der Gehalt der gemäss (c) hergestellten Probenlösung an 9,
10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) unter die 1H-NMR-spektroskopische Nach¬
weisgrenze (vgl. 1 H-NMR-Spektrum in Abbildung 36 unten). Um die Löslichkeit als
Funktion der Zeit genauer zu untersuchen, wurde analog eine Lösung von 17 mit 9,10-Di-
(4-brombutyl-oxy)-anthracen gesättigt, bei konstanten 5 °C lichtgeschützt gelagert und
regelmässig UV/vis-spektroskopiert. Der beobachtete lineare Löslichkeitsrückgang von
Anthracen 22 als Funktion der Zeit ist in Abbildung 37 dargestellt.
Aufgrund der vorliegenden Daten lässt sich über die genaue Ursache für die beobachtete
Dekomplexierung nur spekulieren. Ein wesentlicher Faktor könnte eine Abnahme des Deu¬
teromethylenchlorid-Gehaltes der Probe sein, für dessen Konstanz keine Vorkehrungen ge¬
troffen wurden und dessen Anwesenheit anscheinend essentiell für die Komplexbildung war.
83
CONH(CH,)rfOOOK
^—z CH, *-CONH<CH,),fOOK
*0OC(CH,),flNOC -% /\>L-^JCH
cw/
KOOCfCHJiJWOC
CONHICH,)„fOOK
VYKOOC(CH,)JINOC CONHICHJ^OOK
(17) (22)
Ultraschall
D20 / CD2C12
'H-NMR
5°C
12 h
'H-NMR
-3 I-jJ
Abbildung 36: 1H-NMR des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",
N"",N""',N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)/9,10-Di-(4-brombutyoxy)-anthracenin Deuteriumoxid unter Anwesenheit von Deuteromethylenchlorid, unten: Spektrum nach
12 Stunden bei 5 °C, oben: zentrifugierte Lösung direkt nach Ultraschallbehandlung
84
100-1
90-
80.
70^
60-
50-
40.
30-
20-
10^0
_
50 100 150
Zeit / Stunden
200
—I—
250
—I
300
Abbildung 37: Verhältnis der Konzentrationen von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-
anthracen (22) zu 17 (Besetzungsgrad) in Prozent des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) vs. Zeit¬
dauer der lichtgeschützten Lagerung bei 5 °C, Lösung in Deuteriumoxid, t= 0 bei Sättigung
mit Ultraschall, Konzentrationsbestimmung von 17 aus Absorption der Probenlösung bei
579 nm, Konzentrationsbestimmung des Anthracen 22 aus der Absorption bei 265 nm des
Differenzspektrums der Probenlösung mit einem UV/vis-Spektrum von 17 gleicher
Konzentration (vgl. 6.7.3.1).
85
3.2 Die Assoziation mit 5'-0-Tosyladenosin (15)
Die Assoziationseigenschaften von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) mit
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (17) Hessen auch für die Alkylierungsmittel 15 & 16 Assoziation erwarten.
Bereits bei der Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18) legte die schwierige
Entfernung überschüssigen 5'-0-Tosyladenosins (15) aus dem Rohprodukt nahe, dass eine
Assoziationstendenz zwischen 5'-0-Tosyladenosin (15) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) besteht.
5'-0-Tosyladenosin (15) ist nicht mehr wie das 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen
(22) praktisch unlöslich in Deuteriumoxid. Das Assoziationsverhältnis ist daher nicht
mehr identisch mit dem Quotienten der Konzentrationen von Tosylat 15 zu Corrin. Da das
5'-0-Tosyladenosin sich, wenn auch wenig, in Deuteriumoxid löst, muss bevor das
Assoziationsverhältnis berechnet wird, die Eigenlöslichkeit des 5'-0-Tosyladenosin in
Deuteriumoxid von der experimentell bestimmten Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin
subtrahiert werden.
Zur Bestimmung der Löslichkeit des 5'-0-Tosyladenosin in Deuteriumoxid wurde in einer
Messreihe Deuteriumoxid mit dem Tosylat 15 gesättigt und das UV/vis-Spektrum gemessen.
Unter Verwendung des der Literatur [100] entnommenen Extinktionskoeffizienten bei 263
nm wurde die Löslichkeit zu 4,5-10"4 M berechnet.
Zur Bestimmung der Assoziationseigenschaften der Corrine mit 5'-0-Tosyladenosin (15)
wurden zwischen 0,2 mM und 4,9 mM konzentrierte Lösungen der Dicyanocorrine 24 und
17 in Deuteriumoxid mit festem Alkylierungsmittel versetzt, zehn Minuten Ultraschall der
Frequenz 50 kHz ausgesetzt und die UV/vis- sowie 1H-NMR-Spektren gemessen. Die 1H-
NMR-Spektren erlaubten die Korrektur der via die UV/vis-Spektren berechneten
Konzentrationswerte des Tosylats 15 um den Anteil hydrolysierter Substanz, der wie
Literaturdaten zur Hydrolyseverhalten einiger Alkyltosylate bereits erwarten Hessen
[137-140] mit einem Anteil bis ca. 10% innerhalb einer Experimentserie nicht
vernachlässigbar war.
Mit den Extinktionskoeffizienten wurden aus den UV/vis-Spektren die absoluten
Konzentrationen der Corrine 24 und 17 und der Alkylierungsmittel berechnet, von der
Konzentration der Alkylierungsmittel die vorgehend bestimmte Löslichkeit in Deuteriumoxid
86
sowie der Anteil hydrolysierter Substanz subtrahiert und der Quotient der Konzentrationen
gebildet.
Im folgenden wird der um die Hydolyse und die Löslichkeit des Gastmoleküles im verwendeten
Lösungsmittel korrigierte Quotient der Konzentrationen von Alkylierungsmittel zu Corrin
als Assoziationsgrad (Besetzungsgrad) bezeichnet und in Prozent bezogen auf die
Corrinkonzentration angegeben.
Abbildung 38 zeigt den Assoziationsgrad von 5'-0-Tosyladenosin (15) mit Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
(17) ausgedrückt als Besetzungsgrad in Funktion der Corrinkonzentration. Der
Besetzungsgrad variiert stark mit der Corrinkonzentration: Je geringer die Konzentration
des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat), desto höher die relative Löslichkeit des Alkylierungsmittels. Bei relativ
hohen Konzentrationen an Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat), im Bereich von 1-5 mM, liegt der Besetzungsgrad
bei maximal 25%, steigt für den Konzentrationsbereich 0,5-1,0 mM sprunghaft auf ca.
100 % während unterhalb 0,5 mM ein Wert von ca. 200 % bestimmt wurde, der sich durch
eine relativ starke Schwankungsbreite auszeichnet. Die starken Variationen im unteren
Konzentrationsbereich reflektieren nicht zwangsläufig Undefinierte Assoziationsverhältnisse
sondern sind eher als Folge der aus der Bestimmung der Konzentrationen herrührenden
Fehlerfortpflanzung auf das numerische Ergebnis des Besetzungsgrades aufzufassen.
Die ganzzahligen Verhältnisse der Konzentrationen von 17 & 15 in praktisch dem gesamten
untersuchten Konzentrationsbereich widerspiegeln eine mittlere Assoziationsstöchiometrie
(Wirt:Gast) von 1:1 bzw. 1:2. Diese Beobachtung lässt sich am einfachsten durch 1:1- bzw.
1:2-Assoziation auf molekularer Stufe interpretieren.
Für das 5'-0-Tosyladenosin (15) sollte im Anbetracht der geringen Unterschiede zwischen
der a- und ß-Seite des Corrinringes und dem Fehlen spezifischer Wechselwirkungen das
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)-Molekül (17) spiegelsymmetrisch bezüglich der Ebene des Corrinringes sein
und wenn, dann auf der <x- und ß-Seite mit der gleichen Anzahl Gastmoleküle assoziieren. Im
Konzentrationsbereich unterhalb 0,5 mM scheint genau dies auch der Fall zu sein.
Die Assoziationsstöchiometrie von 1:1 im Konzentrationsbereich 0,5 bis 1 mM ist daher
erstaunlich. Ein Nachweis der Aggregatbildung für 17 steht zwar noch aus, doch würde eine
Dimerbildung, wie sie bereits für Cobalamine in wässriger Lösung nachgewiesen wurde
[141], das Abfallen des Besetzungsgrades auf 100 % erklären.
87
COMHCHJijCOOK
^—-. CH, r-CONHICHjl^OOOK
<OOC(CH,IJINOC -» /\X^->(<CHC"? \--\N_/ CONHICHJkCOOK
c«A X >K0OC(CH1lKflN0C-\/—irciht=\ CH,
(17) -s ch,;i r Ultraschall
K00CICH1),^m0C CONHICHJitPOOK
D20 'H-NMR-Spektroskopie
+
UV/vis-SpektroskopieHH,
(15)
<H^) \-u-\
k3'CH,
250
225
200
175
'S
o>150,
g> 1253
| 100
ö 75
50
25
0
+ UV/2 Experiment NMR/1 Expenment
0 UV/3 Experiment D NMR/2 Experiment
O UV/4 Experiment A NMR/3 Expenment
UV/5 Expenment • NMR/5 Expenment
K UV/6 Experiment NMR/6 Experiment
L-j• \\
t^W—-— |r-—i
1 1 1 1—1——i—i—i——i——1—i—l——1 r—r
355 1 15 2 25 3
[Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-1 ff-carboxylat)] / mM
45
Abbildung 38 Besetzungsgrad von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) ("Wirt") mit 5'-0-
Tosyladenosm (15) ("Gast") in Deuteriumoxid, bestimmt mit ' H-NMR- und UV/vis-
Spektroskopie, Besetzungsgrad Menge der Gastmoleküle, welche durch die Anwesenheit eines
Wirtmolekules zusätzlich in Lösung gehen, in Prozent der Wirtmolekule
88
Der Rückgang des Besetzungsgrades in noch höher konzentrierten Lösungen, 1 bis 5 mM,
wäre durch Selbstaggregation von 17, die die Assoziation mit 5'-0-Tosyladenosin (15) in
den Hintergrund treten lässt, erklärbar. Die Assoziation mit 5'-0-Tosyladenosin sollte dann
in Analogie zur Beobachtung in Micellen, bei denen sich hydrophobe Gastmoleküle bevorzugt
am äusseren Rand des hydrophoben Kerns befinden [73], vorwiegend an der Oberfläche und
nur zu geringem Teil auch innerhalb der Aggregate erfolgen.
Im experimentellen Teil sind die totalen Konzentrationen, aus denen die Daten aus Abbildung
38 berechnet wurden, bei den einzelnen Experimenten angegeben. Die nichtlineare
Entwicklung des Besetzungsgrades mit der Corrinkonzentration führt zu lokalen Maxima
einer Abbildung der totalen Konzentration an Tosylat 15 als Funktion der Konzentration des
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (17).
89
3.3 Die Assoziation mit l^-Ethenoadenosyl-S'-O-tosylat (16)
1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) erlaubt aufgrund seiner Lumineszenz¬
eigenschaften aus dem Totallumineszenzspektrum Rückschlüsse über seine nähere Umgebung
[73, 74]. Der Wechsel von einer hydrophilen zu einer hydrophoben Mikroumgebung ist in
der Regel von einer dramatischen Erhöhung der Quantenausbeute und einer Blauverschiebung
im Maximum der Fluoreszenz begleitet [73]. Der Fluoreszenzzerfall reagiert zudem in
ionischen Micellen in der Regel empfindlich auf die Anwesenheit von Sauerstoff oder eines
Gegenions, z.B. einem Schwermetallion wie Kobalt, mit verminderter Fluoreszenzintensität
(Quenching).
Für die Assoziationsexperimente mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) musste daher
der Einfluss von Sauerstoff auf die Lumineszenzintensität quantifiziert werden. Dazu wurden
zwei mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat gesättigte Deuteriumoxid-Lösungen hergestellt.
Eine sauerstoffreie Lösung wurde in der Glove-box bei [02]< 15 ppm bereitet und aus ihr
noch eine Probe mit Deuteriumoxid auf ca. Vs gasfrei verdünnt. Eine sauerstoffgesättigte
Lösung wurde analog hergestellt, indem man in der normalen Atmosphäre Deuteriumoxid mit
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat sättigte und die Lösung anschliessend mit Sauerstoff
begaste. Von diesen Lösungen wurde das UV/vis-und das Totallumineszenzspektrum
(Emissions-Exitations-Matrix) aufgenommen (Tabelle 1).
Sauerstoffgesättigte und sauerstofffreie Lösungen von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
(16) in Deuteriumoxid zeigten keine Unterschiede in ihren Lumineszenzintensitäten. Eine
eventuelle Beeinflussung der Fluoreszenzintensitäten durch unterschiedliche
Sauerstoffkonzentrationen beim Wechsel von wässriger zu einer micellaren Umgebung, die
als relativ sauerstofffrei gilt [73], konnte somit ausgeschlossen werden. Es bot sich daher
an, die Experimente zum Assoziationsverhalten von 16 mit den Dicyanocorrinen in
Laboratmosphäre durchzuführen.
Tabelle 1: Maxima der Emissions-Exitations-Matrix von 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-Q-tosylat (16) in Deuteriumoxid
Oz-Atmosphäre Stickstoff
3bS 265 nm 1,024 0,851 0,134
E*max= 320 ± 1 318 ± 3 315 ± 1
En>max= 429 ± 3 431 ± 4 436 ± 2
Messbereich Exitation: 300-340 nm, Emission: 400-450 nm; abs2e5 nm: UV-Absorption
90
Abbildung 39: Isometrische Projektion der Exitations-Emissions-Matrix von 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in D20, 296 K, unter Normalatmosphäre mit
Ultraschall gesättigt: vorn: Emission, 305-560 nm: seitlich: Exitation, 250-380 nm:
vertikal: Lumineszenzintensität
2.5x10
3.0x10
ü 3.5x10
A 0x10
3.0x10 2.5x10
emission /cm-1
2.0x10
Abbildung 40: Kontur-Repräsentation der Exitations-Emissions-Matrix von 1,N6-
Ethenoadenosyl-S'-O-tosylat (16) in D20, 296 K, unter Normalatmosphäre mit
Ultraschall gesättigt; waagerecht: Emission in cm1; senkrecht: Exitation in cm~1
91
In Tabelle 1 sind die Emissions- und Exitationsmaxima sauerstoffgesättigter und
sauerstofffreier Lösungen von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid
zusammengestellt. Das Exitationsmaximum und das Emissionsmaximum scheinen eine
geringe Konzentrationsabhängigkeit aufzuweisen mit einem Shirt des Exitationsmaximum zu
kürzeren und dem des Emissionsmaximum zu höheren Wellenlängen mit fallender
Konzentration. Die isometrische Projektion der Exitations-Emissions-Matrix von 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in Deuteriumoxid ist in Abbildung 39, eine
Konturpräsentation desselben Spektrums in Abbildung 40, und nochmals vergrössert in
Abbildung 41 wiedergegeben. Abbildung 42 ist eine das Emissionsspektrum
repräsentierender Schnitt durch das zweidimensionale Spektrum. Die Spektren gesättigter
Lösungen wiesen neben dem absoluten Maximum bei 429 nm eine Schulter bei 406 nm auf,
die den Literaturwerten für 1 ,N6-Ethenoadenosin, Maximum bei 428 nm mit Schulter bei
406 nm in wässrigem Phosphatpuffer pH 7, entsprechen [142].
Die Selbstassoziationstendenz von 1 ,Ne-Ethenoadenosin und 1 ,N6-Ethenoadenosylphosphaten
in wässriger Lösung ist seit langem bekannt [131-134]. Da diese Selbstassoziation mit
einer Änderung der direkten Umgebung des 1 ,N6-Ethenoadenosylmoleküles verbunden ist,
könnten Konzentrationseffekte die Fluoreszenzintensitäten von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-
tosylat (16) in Deuteriumoxid beeinflussen.
Aus 1,4 ml Deuteriumoxid und 10 mg 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat wurde eine
gesättigte Stammlösung hergestellt und das UV/vis-Spektrum zur Konzentrationsbestim¬
mung sowie das Totallumineszenzspektrum (Emissions-Exitations-Matrix) gemessen.
Wegen der extrem langen Messzeiten für zweidimensionale Totallumineszenzspektren und
ihrem für die zu untersuchende Fragestellung praktisch identischen Informationsgehalts
wurden für die Assoziationsexperimente nur eindimensionale Totallumineszenzspektren
(Emission) aufgenommen. Von der Stammlösung wurden Verdünnungen von 1/2,1/5, V10
und Vso der Ausgangskonzentration bereitet und analog der Stammlösung Spektroskopien.
Abbildung 43 zeigt die Lumineszenzintensität von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
in Deuteriumoxid als Funktion der Konzentration im gesamten Löslichkeitsbereich. Eine
Erhöhung der Quantenausbeute mit zunehmendem Sättigungsgrad wurde nicht beobachtet. Im
Gegenteil, oberhalb ln(l/lo)— 0,6 nahm die Lumineszenzintensität unterproportional mit
der Konzentration zu. Es lässt sich daher in Analogie zum 1,N6-Ethenoadenosin, dessen
Assoziationsverhalten Gegenstand einer Reihe von Untersuchungen bildet [129, 132-135,
142, 143], eine ausgesprochene Tendenz zur Bildung nichtkooperativer Assoziate höherer
Ordnung vermuten.
92
Abbildung 41 Kontur-Repräsentation des Maximalbereiches der Exitations-
Emissions-Matnx von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in D20, 296 K, unter
Normalatmosphäre mit Ultraschall gesättigt, waagerecht Emission in cm1, senkrecht
Exitation in cnr1
2,80x10* 2.60X104 2.30x1a4 2,00x10*cm-1
Abbildung 42 Emissionsspektrum 1,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16),
gesättigte Lösung in Deuteriumoxid, Exitation 320 nm, Emission 350-500 nm
93
30000
o
| 20000
E
| 10000
K>,
D Totallumineszenzcounts
der gesättigten Lösung
O Totallumineszenzcounts
.4 .6 .8
ln(l/lo) bei 265 nm
1.2 1.4
0.50 1.00 1.50
mM
Abbildung 43: Konzentrationsabhängigkeit der Totallumineszenz von
1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid bei
Umgebungstemperatur, [16] vs. Totallumineszenz, Regressionsgerade aus 4
Messpunkten abs 2S5 nm< 0,6, R2= 1,000, Exitation 320 nm, Emission
340-520 nm
Die Löslichkeit von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) bestimmte sich UV/vis-
spektroskopisch zu 1,29-10"* M (23,0 °C). Dazu wurde Deuteriumoxid in einem auf 23,0
°C ± 0,1 °C thermostatisierten Ultraschallbad mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
gesättigt, suspendiertes Material abzentrifugiert, die Probe mit UV/vis- und
Totallumineszenzspektroskopie untersucht und die Konzentration mithilfe der
Absorptionskoeffizienten aus dem UV/vis-Spektrum bestimmt.
Damit die Experimente zum Assoziationsverhalten des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
mit den Corrinen ohne ständige 1H-NMR-spektroskopische Kontrolle der Proben auf
Hydrolyse durchgeführt werden konnten, musste das Hydrolyseverhalten des Tosylates 16
genau bekannt sein.
Eine gesättigte Lösung von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid
wurde dazu über festem 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in Deuteriumoxid lichtgeschützt
bei 23 °C während sieben Tagen gelagert und wiederholt UV/vis- und 1H-NMR-
spektroskopiert. Basierend auf der Identität der erhaltenen Spektren mit dem Spektrum des
Beschreibungsansatzes von 16 erübrigten sich Korrekturen für die Hydrolyse wie sie für
das 5'-0-Tosyladenosin (15) notwendig waren.
94
2.75x10 4 2.00x10 4
emission /cm-1
Abbildung 44 Totaiiumineszenzspektrum Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",Ne-etheno)adenosyl-cobyrmat (21), Lösung in D20, Emissionsspektrum 350-500 nm, Ex=
320 nm, dx= 0,100 cm
1000"COOK COOK
exitation/cm-1
*:
Abbildung 45 Totaiiumineszenzspektrum Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24), Lösung in D20, Exitationsspektrum 250-440 nm, Em= 380 nm, dx= 0,100 cm
95
750
500
250
2,75x10emission/cm-1
2,00x10
Abbildung 46 Totaiiumineszenzspektrum Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",Ns-
etheno)adenosyl'Cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
(19), Lösung in D20, Emissionsspektrum 350-500 nm, Ex= 320 nm, dx= 0,100 cm
2000
2 10OO "
CÖNHiCH^nCOOK
—-. CH, r-CONHKHjluCOOK
<cooc(CH,),smoc -y y^^J^^\icH
K00C{CH,)„pH0C
CONHICH,)ifiOOH
VYKOOCICHJnHNOC COtimCH,)j:OOK
•xltation /cm-12,5x10
Abbildung 47 Totaiiumineszenzspektrum Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17), Lösung in D20,
Exitationsspektrum 250-400 nm, Em= 380 nm, dx= 0,100 cm
96
Nachfolgend wurde das Lumineszenzverhalten der Dicyanocorrine 24 und 17 und der 1,Ne-
Ethenoadenosylcorrine 21 & 19 geprüft.
Die in Blindproben mit Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat
(21) und Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) gemessene Lumineszenzintensität
(Abbildungen 44 und 45) belief sich auf eine Grössenordnung von einem Promille einer
1,N6-Ethenoadenosyltosylat-Lösung gleicher Konzentration. Bei Hexanatrium-Coa-aquo-
Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (19) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,
N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) (Abbildungen 46 und 47) wurde unter
denselben Versuchsbedingungen hingegen nur das Hintergrundrauschen beobachtet.
Zur Bestimmung des Assoziationsverhaltens von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
in Deuteriumoxid mit den Dicyanocorrinen 24 und 17 wurden zwei Arten von Experimenten
durchgeführt. Einerseits versetzte man gesättigte Lösungen von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-
tosylat in Deuteriumoxid mit variablen Mengen fester Dicyanocorrine, andererseits wurden
unterschiedlich konzentrierte Lösungen der Dicyanocorrine in Deuteriumoxid mit 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt.
Lösung von Dicyanocorrinen in mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
gesättigtem Deuteriumoxid
In einer ersten Versuchsreihe wurden Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw.
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (17) in mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigtem
Deuteriumoxid gelöst und die cirka 2,5-103 molare Probe mit UV/vis- und
Totallumineszenzspektroskopie untersucht. Von einigen der Proben wurden noch das 1H-
NMR-Spektrum aufgenommen. Die Proben wurden anschliessend mit 1,N6-Ethenoadenosyl-
5'-0-tosylat gesättigtem Deuteriumoxid derselben Stammlösung auf ungefähr die Hälfte
verdünnt und die Messungen wiederholt bis die Konzentration des Corrin cirka ein
Hundertstel der Ausgangskonzentration betrug.
Abbildung 48 zeigt die UV/vis-Spektren der Konzentrationsreihe des Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat (24), die jeweils Superpositionen der Spektren von Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) sind.
97
Abbildung 48: UV/vis-Spektren der Konzentrationsreihe Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat (24) verdünnt mit einer gesättigten Lösung von I.Nß-Ethenoadenosyl-
5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid, Schichtdicke 0,100 cm
Tabelle 2: 1H-NM R-Signalverschiebungen von Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobamido-N,N,,N",N,,,,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-car-boxylat) (17) in mit 1,N6-Et henoadenosy l-5'-0-
tosylat (16) gesättigtem Deuteriumoxid
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxvlat) (17)
1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
[17]/M reine
Substanz
mit 1 6
gesättigte
Lösung
reine
Substanz
in Lösung mit
1 7
1.23-10-3 4,06 4,07 1,85
6,74
7,39
1,96
6,82
7,42
98
In Analogie zu den nachfolgend beschriebenen Experimenten, in denen Dicyanocornnlösungen
mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat gesättigt wurden, waren in den 1H-NMR-Spektrenim Fall des Dicyano-heptakalium-Co(lll) cobyrinat (24) im Konzentrationsbereich 0,27-
0,66 mM die Signale die Summe der Spektren der isolierten Substanzen, während eine 1,23
mM Lösung von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in mit 16 gesättigtem Deuteriumoxid eine
minimale Verschiebung des C-3 Signales von 4,07 nach 4,06 ppm und eine Verschiebung
dreier Signale des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat zeigte (Methylgruppe des Tosylats in
16- 1,96 statt 1,85, Phenylnng in 16 6,82 statt 6,74 und bei 7,42 statt 7,39) (Tabelle
2).
Die Änderung chemischer Verschiebungen von Verbindungen des 1 ,N6-Ethenoadenosins durch
micellare Einlagerungen oder auch durch Lösungsmitteleffekte, ist in der Literatur seit
langem bekannt [144, 145] und wurde als Indiz für Assoziation mit anderen Molekülen
aufgefasst
Die 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0 tosylat-Molekule nähern sich aber wie die Lumineszenz¬
intensitäten belegen anscheinend nicht genügend dem Metallzentrum, damit ihre
Lumineszenzintensität gelöscht wird
Abbildung 49 zeigt die Lumineszenzintensitäten in Abhängigkeit der Corrinkonzentration
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N"',N"",N""',N -hepta-(n decyl 10'-carboxylat) (17) liegen auf
exakt derselben Kurve
Die Konzentrationen der Probenlösungen bezüglich 1,N6-Ethenoadenosyl 5'-0-tosylat
(16) waren identisch, da für beide Experimentreihen dieselbe mit 1,N6-Ethenoadenosyl-
5'-0-tosylat (16) gesättigte Stammlösung verwendet wurde
Die UV/vis- und Totallumineszenzspektren zeigten für die beiden Corrine identisches
Verhalten. Allem die Signalverschiebungen in den 1H-NMR-Spektren der Probe mit
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'
carboxylat) (17) lassen sich nur mit einer Wechselwirkung zwischen dem Tosylat 16 und
dem Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl
10'-carboxylat) (17) erklären
Damit die Assoziation kompatibel mit dem Totallumineszenzdaten bleibt, muss die Assoziation
in den äusseren Regionen des Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n decyl-10'-
carboxylat)es 17 stattgefunden haben Gemäss Förster's Theorem [74] finden nämlich die
Übertragung der elektronischen Exitationsenergie zwischen einem fluoreszierenden Donor
und einem Energieakzeptor über Distanzen von bis zu 70 A statt wobei die Geschwindigkeit
des Transfers proportional zur sechsten inversen Potenz des Abstandes ist.
99
CONHICH,l,^COOK
--. CH, l-CONHKHJgPOOK
KOOC(CH,)„)tN<X:-\ y^J^^SCH,
* CO v-l-o-(16)
in D20
Totallumineszenzspektroskopie
I Totallumineszenzcounts
Dicyano-heptakalium-Co-
(lll)-cobyrinat
O Totallumineszenzcounts
Heptakalium-dicyano-Co-(lll)-cobamldo-N',N",N•".N"",N ,N"'"\ N -
hepta-(n-decyl-10'-carb-oxylat) O
2,5[CorrinJVmM
Abbildung 49: Totallumineszenzintensität einer gesättigten Lösung von I.Nß-Etheno-
adenosyl-5'-0-tosylat (16) in D20 bei Variation der Konzentrationen an Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw. Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N"',N"",N""',N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17), Xelc 320 nm, Xam
440 nm, T= 300 K, Umgebungsatmosphäre
100
Sättigung von Dicyanocorrinlösungen mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
(16)
Da sich gezeigt hatte14, dass durch Ultraschallbehandlung für Lösungen von Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) unterschiedliche
Konzentrationen an 5'-0-Tosyladenosin (15) erhalten werden können, wurden in einem
zweiten Experiment Konzentrationsreihen der Dicyanocorrine 24 und 17 in Deuteriumoxid
mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) durch 15-minütige Ultraschallbehandlung
gesättigt. Vorbereitende Experimenten hatten zuvor bestätigt, dass nach 15 Minuten
Ultraschallbehandlung der Gleichgewichtzustand erreicht war.
a) In einer Serie von UV/vis-Experimenten15 wurden wässrige Lösungen von Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) ohne Thermo-
statisierung des Ultraschallbades in Anwesenheit eines Überschusses an 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) mit 16 gesättigt, die Lösungen zentrifugiert und ihr
UV/vis-Spektrum aufgenommen. Die Konzentrationen der Corrine und des Tosylates 16
wurden aus den UV/vis-Spektren berechnet.
Aus den UV/vis-spektroskopisch bestimmten Konzentrationen des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-
O-tosylat wurde die Eigenlöslichkeit des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat subtrahiert und
die Differenz in Prozent der Corrinkonzentration ausgedrückt (Besetzungsgrad). Die
Ergebnisse sind in Abbildung 50 dargestellt. Da nur wenige Punkte gemessen wurden handelt
es sich nur um ein grobes Raster.
Die ermittelten Besetzungsgrade belaufen sich für das Dicyano-heptakalium-Co(lll)-
cobyrinat (24) auf 0-10% während sie für Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mindestens 40 % ([17] =
2,1 mM) bzw. 150 % ([17]= 1,1 mM) betragen.
Die beobachteten Besetzungsgrade im Konzentrationsbereich des Heptakalium-dicyano-
Co(lll)-cobamido-N,N',N",N,",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) von 1,1
14 vgl. 3.2
15 vgl. 6.8.2
101
(17)
(24)
m
^^?
_I o
WOH OH
Uberschuss
D20
(16)
UV/vis-Spektroskopie
160,
140.
120.
\|100.
g 80.
§ 60.
40.
20.
0
1
D Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
cartxjxylat)
1.2 1.4 1.6 1.8
[Corrin]/mmol
0 Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat
2.2 2.4 2.6
Abbildung 50: Mit UVMs-Spektroskopie bestimmter Besetzungsgrad von Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N;N",N,",N"",N"";n -hepta-(n-decyl-W'-carboxylat) (17) mit I.hfi-Etheno-
adenosyltosylat (16) in Deuteriumoxid unter Sättigung der Lösung mit Ultraschall in
Anwesenheit eines Überschusses an Tosylat 16
102
mM bis 1,8 mM lassen auf Komplexe der mittleren Stöchiometrie von ca. 1:1 schliessen. Der
Konzentrationsbereich für diese Art vom Komplexen liegt hier bei höheren Konzentrationen
als bei den Assoziaten mit 5'-0-Tosyladenosin (15). Dort wurde eine 1:1-Stöchiometrie
zwischen 0,5 bis 1,1 mM beobachtet. Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)
assoziert wiederum nicht mit dem angebotenen Gastmolekül.
Die Assoziationsstöchiometrie wurde beim 5'-0-Tosyladenosin als eine Folge der
konzentrationsabhängigen Selbstassoziation des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) erklärt und sollte daher
eigentlich gastunabhängige Funktion der Corrinkonzentration sein. Da die Sättigung in den
orientierenden Experimenten allerdings ohne Temperaturkontrolle durchgeführt wurde, ist
die hier beobachtete Abweichung zum Verhalten mit 5'-0-Tosyladenosin nicht weiter
erstaunlich.
b) Es wurden sodann Konzentrationsreihen der Dicyanocorrine 24 und 17 in
Deuteriumoxid mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) durch 15-minütige
Ultraschallbehandlung bei 23,0 + 0,1 °C gesättigt, zentrifugiert und von den klaren
Lösungen die UV/vis-, 1 H-NMR- und Totallumineszenzspektren gemessen.
Die Konzentrationen an Corrin und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat bestimmte man aus
den UV/vis-Spektren.
Die Auswertung der UV/vis-Spektren (Abbildung 51) lässt wiederum die deutliche
Steigerung des Gehaltes an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat einer Lösung von
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (17) verglichen mit einer Lösung von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-
cobyrinat (24) identischer Corrinkonzentration erkennen.
Die Totallumineszenzspektren von mit 16 gesättigten Lösungen von Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat (24) zeigten Maxima bei 323,3 nm und 435,9 mit einer Schulter bei
409 nm während in der analogen Lösung mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (26) neben den Maxima bei
322,5 nm und 434,0 nm sowie einer Schulter bei 410 nm, in denen sich die beiden Proben
nicht signifikant voneinander unterschieden, eine weitere Schulter bei 308,9 nm auftrat
(Tabelle 3). Diese Schulter entspricht genau der von Singer [73] beschriebenen
Blauverschiebung im Maximum der Fluoreszenz beim Wechsel von einer hydrophilen zu
einer hydrophoben Mikroumgebung.
103
Formelschema siehe Abbildung 50
16,
14.
t 1 2-1
.2 E
a>
£in
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N ,N",N'",N""
,N ,N -hepta-(n-decyl
-10,-carboxylat)
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
1 12 14 16 18
abs 580 bzw 576 nm
22 24 26
Abbildung 51 1 ,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat [16] als Funktion der
Corrinkonzentration, l.hfi-Ethenoadenosyl-S'-O-tosylat-gesättigte (16) Lösungen von
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) und Heptakahum-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in D20,
£580 nm(17)= 9'480, e576 nm(24)= 9'790, dx= 0,100 cm, [16] berechnet aus der
Absorption bei 265 nm (zuvor wurde von der experimentell ermittelten Absorption bei 265
nm der durch das Cornn bedingte Absorptionswert, welcher aufgrund der bei 580 bzw 576
nm nur von Cornn herrührenden Absorption berechnet wurde, subtrahiert)
Abbildung 52 illustriert den Verlauf der experimentell bestimmten Totallumineszenz¬
intensitäten im untersuchten Konzentrationsbereich (0-2,6 mM) Bemerkenswerterweise
waren die Totallumineszenzintensitäten von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in Lösungen
von Dicyano-heptakahum-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakahum-dicyano-Co(lll)-
cobamldo-N,N',N",N"',N"•', N ,N"""-hepta (n decyl-10'-carboxylat) (17) identischer
Konzentration identischI
104
(17)
(24)
n
ITIh (16)
Uberschuss
D,0
Totallumineszenzspektroskopie
300000„
S 200000 .
2
P100000
O Totallumineszenzcounts
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"'N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Totallumineszenzcounts
Dicyano heptakalium-Co(lll)-cobynnat
1 12 14 16
abs 580 bzw 576 nm
1 8 22 24 26
Abbildung 52. Totallumineszenzintensitäten von mit 1.NS-EthenoadenosylS'-O-
tosylat (16) gesättigten Lösungen von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrmat (24) und
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N' -hepta-(n-decyl-10'
-carboxylat) (17) in D20 als Funktion der Corrinkonzentration, Xex 320 nm, Xem 435 nm,
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-l 0'
carboxylat) esso nm= 9'480; Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrmat eS76 nm= 9'790,
dx= 0,100 cm
Unterschiedliche absolute Lunineszemintensitäten im Vergleich zu anderen Expenmenten, vgl z B
Abb 49, sind durch verschieden lange Messzeiten, über die die Daten aufkumuliert wurden, bedingt
105
Tabelle 3 Lumineszenzeigenschaften von mit l,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-
tosylat (16) gesättigter Corrinlösung in D20, Konzentrations¬
bestimmung mit UV/vis-, 1 H-NMR- & Lumineszenzspektroskopie
Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat
CH
Heptakalium-dicyano-Co
(lll)-cobamido-N,N',N'•,N•",
N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat)
(17)
i
CK
(24)
Exmax= 323,3 ± 0,6
( 308,9 ± 3,0 sh )
322,5 ± 0,2
Emmax= 435,9 ± 2,7
( 409 ± 2 sh )
434,0 ± 0,8
( 410 ± 2 )
[Corrin]* 9.29-10"4 1.55-10-3
[16]+ 1.39-10"3 2.33-10"3
[16]" 1.40-10"3 1.82-10"3
Assoziationsverhältnis 0,1 0,6
*: aus UV/vis-Spektrum unter Verwendung von e(24 $7Snm)= 9790, e(17)S80nm)= 9'450; +: aus
1 H-NMR-Spektrum durch Auswertung der Integrale und Kalibierung mit UV/vis-spektroskopischbestimmter Corrinkonzentration; ": aus UV/vis-Spektrum, t(16)2e5nm^ 8'100; alle Konzentra¬
tionen in M; Assoziationsverhältnis auf Basis der UV/vis-Spektren
Im 1 H-NMR-Spektrum der Proben mit Hexakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',
N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) Hessen sich zahlreiche
Veränderungen gegenüber den Spektren der reinen Substanzen beobachten (Tabelle 4). Die
Signalshifts waren beim 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) am ausgeprägtesten und
variierten mit der Konzentration der Hexakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lösung. Das Hexakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',
N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) selbst zeigte nur veränderte
chemische Verschiebungen der Signale des C-3 und des C-19, die bei 4,03 ppm und 3,67
ppm anstatt bei 4,07 ppm und 3,66 ppm auftraten.
106
Tabelle 4: Signalshifts im 1 H-NMR-Spektrum in mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5-O-tosylat (16) gesättigten Lösungen von Hexakalium-di-
cyano-Co(MI)-cobamido-N1N'IN"1N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17)
Heptakalium-dicyano-Co(lii) 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-cobamido-N,N',N",N'",N"", tosylatN ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) (16)
[17]/M reine mit 1 6 reine in Lösung mit
Substanz gesättigte
Lösung
Substanz 1 7
0,43 10 a 4,07 4,06 6,75 6,78
1,34 10 3 4,07 4,03 8,928,217,987,607,416,774,854,63
4,454,281,85
8,938,238,00
7,617,426,804,804,604,444,27
1,93
1,55 10 3 4,07 4,03 7,416,774,854,634,454,281,85
7,446,824,834,624,424,261,82
2,13 10 3 4,07 4,03 8,92 8,953,66 3,67 8,21
7,416,776,004,854,634,451,85
8,247,436,84
6,024,88
4,584,431,96
2,56 10"3 4,07 4,03 8,928,217,987,60
6,776,001,85
8,888,17
7,927,566,825,971,82
Messungen in Deuteriumoxid, 300,13 MHz, Angaben in ppm, Referenzwerte für die reine
Substanz beziehen sich für Heptakalium-dicyano Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) auf Lösungen ähnlicher Konzentration, für
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) auf eine gesättigte Lösung in Deuteriumoxid
107
Für das Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) waren im gesamten untersuchten
Konzentrationsbereich, d.h. von 0,43 bis 2,56 mM, die 1H-NMR-Spektren Superpositionen
der1 H-NMR-Spektren der reinen Substanzen.
Gemäss UV/vis- und 1 H-NMR-Spektrum war in einer Lösung von Heptakalium-dicyano-
Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17)
verglichen mit einer gleichkonzentrierten Lösung von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-
cobyrinat zusätzliches 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gelöst. Diese zusätzlich
gelöste Tosylatmenge ist nicht anders als über Assoziate mit dem Heptakalium-dicyano-
Co(lll)-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) erklärbar.
Im 1 H-NMR-Spektrum wiesen die deutlichen Signalverschiebungen in der Lösung mit
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) ebenfalls auf eine Assoziatbildung hin. Die Richtung und der Umfang dieser
Positionsänderungen der chemischen Verschiebung waren konzentrationsabhängig und für
das Gastmolekül deutlich stärker ausgeprägt als für den Wirt (Tabelle 4). Dies macht
wahrscheinlich, dass die Assoziation vorwiegend mit den Methylenseitenketten stattfindet,
sodass die Umgebung verglichen mit wässriger Lösung sich für den Gast zwar drastisch, für
die Protonen des Corringerüstes jedoch kaum änderte.
c) Gleichkonzentrierte Lösungen von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und
Hepta-kalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-l0'-
carboxylat) (17) zeigten identische Lumineszenzintensitäten, unabhängig davon ob die
festen Corrine in mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigten Deuteriumoxid
gelöst oder aber Lösungen der Corrine in Deuteriumoxid mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-
tosylat gesättigt wurden. Die UV/vis-Spektren zeigten allerdings, dass in letzterem Fall die
Konzentration an 16 in Lösungen von 17 höher war als in Lösungen von 24. Da die Lösungen
ausser dem Kobalt im Zentrum der Corrine keine Quencher enthielten, muss aufgrund der
totalen Lumineszenzlöschung das in Lösungen von 17 zusätzlich gelöste 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat sich in genügender Nähe zum Kobalt des Heptakalium-dicyano-
Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10' -carboxylat) aufgehalten
haben, um gequencht werden zu können.
Aus mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigten Lösungen nahmen die Corrine
folglich keine Moleküle Tosylat 16 auf sondern lagerten sie erst bei Einwirkung von
108
Ultraschall in Anwesenheit eines Überschusses Tosylat 16 ein Es war anscheinend eine
Energiebarriere zu überwinden
Diese Barriere sollte auch in umgekehrter Richtung wirken und einmal gebildete Assoziate
stabilisieren Dies wurde auch beobachtet
a) Während der Zeitdauer zwischen Ultraschallbehandlung und Beendigung einer
Messung, d h je nach der angewandten spektroskopischen Untersuchungsmethode
zwischen ca 30 Minuten und einigen Stunden, war UV/vis-spektroskopisch keine
Konzentrationsveränderung des 1,N6 Ethenoadenosyl 5'O tosylat (16)
feststellbar
b) Hexakahum Coa-aquo Coß 5' adenosyl cobamido N,N',N",N'",N"",N ,N hepta
(n decyl 10'carboxylat) (18) konnte erhalten werden, indem eine wässrige Lösung
Co(ll) cobamido-N,N',N",N"',N'" ,N ,N hepta (n-decyl 10' carboxylat) mit
1,N6 Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Komplexe16 gesättigt, durch Zentnfugation von
suspendiertem Tosylat 16 befreit und nach Zugabe von Natnumborhydnd analog dem
entsprechenden Beschreibungsansatz der präparativen Synthese von 18 aufgearbeitet
wurde
Da sich das Dicyano heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium dicyano
Co(lll) cobamido N,N',N",N'",N"",N"" ,N hepta (n decyl 10' carboxylat) (17) nur
durch sieben (n Decyl-10'-carboxylat)-Ketten unterscheiden, muss die Barrierenwirkung
auf eben diese (n Decyl-10'-carboxylat)-Ketten zurückgeführt werden
16 vgl 6 7 32
109
4. Reduktionskinetik
Zusammenfassung
Die Geschwindigkeitskonstanten der Reduktion von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit Natriumborhydrid in
Phosphatpuffer zu den Co(l)-corrinen wurden gemessen.
Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-hepta-(n-decyl-W-carboxylat) wurde in
1 M Phosphatpuffer, pH 9, durch Natriumborhydrid cirka dreimal schneller reduziert (k=
35,6 min-iM-1) als Co(ll)-cobyrinat (k= 11,34 miir^M-i).
Wie im vorangehenden Kapitel gezeigt, weist das Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) eine Assoziations¬
tendenz mit ö'-O-Tosyladenosin (15) und l,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) auf. Es
ist daher interessant zu untersuchen, ob auch bereits bei der Reduktion der Co(ll)-corrine
mit Natriumborhydrid unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeiten festgestellt werden
können.
In einer Glove-box wurden Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",
N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) und Dicyano-heptakalium-Co(lll)-
cobyrinat (24) in Methanol gelöst, mit Essigsäure versetzt, Pt02 als Katalysator zugefügt
und unter Wasserstoffatmosphäre zu den Co(ll)-Verbindungen reduziert. Sobald die Reaktion
gemäss UV/vis-Spektrum quantitativ war, wurde die Lösung durch Watte filtiert und am
Hochvakuum getrocknet.
Zur Messung der Reduktionskinetik wurden in 1 M Phosphatpuffer, pH 9, cirka 10~2 molare
Lösung der Co(ll)-corrine bereitet und noch in der Glove-box in eine Apparatur wie sie für
die Alkylierungsexperimente17 verwendet wurden gefüllt. In das obere Reservoir legte man
Natriumborhydrid vor und verschluss die Apparatur gasdicht.
17 vgl. 5.1, Abbildung 47
110
NaBH4
LMU
VYCOONacoONa
HaOOC
NaOOC
NaBH4
LM2
LM i = Methanol
LM 2 = Phosphatpuffer (1 M, pH 9)
Abbildung 53: Zusammenfassende Darstellung der Experimente zur Reduktionskinetik
111
Tabelle 5
Isobestische Punkte der Reduktion von Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat und
Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N,,N",N,",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) zu Pentakalium-Co(l)-cobyrinat bzw. Pentakalium-Co(l)-
cobamido- N ,N', N", N,",N"",N ,N -hepta-fn-decyMO'-carboxylat)
Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N,",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
1M Phosphatpuffer, pH 9 IM Phosphatpuffer, pH 9
nm nm
Reduktion
Co(ll) zu Co(l)232
257
237
257
265 269
305 307
344 355
411 415
543 557
Aufgeführt sind die Mittelwerte der Einzelexperimente. Für jedes Experiment wurden dazu
die isobestischen Punkte graphisch aus einem Spektrenoverlay bestimmt.
Tabelle 6
Wellenlängen mit lokalen Maxima der e-Differenzen von Edukt und Produkt:
Reduktion von Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat und -cobamido-
N,N,,N",N,,',N"",N ,N -hepta-fn-decyl-IO'-carboxylat) zu den
Co(l)-Verbindungen
Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N,,N',,N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
1M Phosphatpuffer, pH 9
nm
1M Phosphatpuffer, pH 9
nm
248
292 294
313 316
345
385 390
466 466
112
Das UV/vis-Spektrum der Eduktlösung wurde gemessen, anschliessend das
Natriumborhydrid in die Lösung gespült und die Veränderung der Absorption bei 388 nm
(Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)) bzw. bei 384
nm (Cobyrinat) verfolgt.
Die isosbestischen Punkte der Reduktion der Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) in Phosphatpuffer zu den
Co(l)-corrinen sind in Tabelle 5 zusammengestellt. In Tabelle 6 sind die Wellenlängen
aufgeführt, deren Absorptionskoeffizienten zwischen Edukt und Produkt ein lokales
Maximum aufweisen.
Die Geschwindigkeitskonstanten wurden berechnet indem die Absorptionswerte bei 388 nm
bzw. bei 390 nm gemäss einem Ansatz erster Ordnung ausgewertet18 und anschliessend die
erhaltene Geschwindigkeitskonstante durch die Konzentration des Reduktionsmittels bzw. des
Alkylierungsmittels vor Reaktionsbeginn dividiert wurde. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse der
Einzelexperimente.
Die Reduktion des Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) mit Natriumborhydrid in Methanol verlief mit k= 35,6 min-1M"1 dreimal so
schnell wie die des Co(ll)-cobyrinat, für das die Geschwindigkeitskonstante k zu k= 11,34
min-1 bestimmt wurde.
Eine unterschiedliche Reaktivität des Co(ll) im Zentrum der Corrinringe ist sehr
unwahrscheinlich, sodass die Differenz der Reduktionsgeschwindigkeiten in der (n-Decyl-
10'-carboxylat)-Hüile des Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat)es begründet liegen sollte.
Ursache für die beobachtete um den Faktor drei erhöhte Reduktionsgeschwindigkeit des
Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es mit
Natriumborhydrid könnte eine Detergenzeffekt der (n-Decyl-IO'-carboxylat)-Ketten sein,
der eine Beschleunigung der Lösung des als Feststoff zugegebenen Natriumborhydrides
bewirkt. Die Konzentration an gelöstem Natriumborhydrid in der Lösung mit Co(ll)-
abst.n-abstlineare Regression über die Gerade: -kt = In (1 + I 1 )
absf-abst^oo
113
cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) steigt so schneller
an als in der analogen Lösung des Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat und es wird eine
anscheinend höhere Geschwindigkeitskonstante der Reduktion zum Co(l)-corrin beobachtet.
Analog der von Moskophidis [47] bei Cobyrsäure, Pseudovitamin B12 sowie Faktor III
gemachten Beobachtung war bei der Reduktion des Co(ll)-cobyrinat zum Co(l)-cobyrinat in
Methanol die Absorption bei 380 nm lineare Fuktion der Zeit mit einer Steigung von 360
Min-1 ([NaBH4]t=0= 420 mM).
Tabelle 7
Geschwindigkeitskonstanten der Reduktion von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) zu
Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N,",N,,,,,N ,N -hepta-
(n-decyl-IO'-carboxylat)
>£>wry
s-5»>*^yNjCKJcSI
Co(ll)-cobyrinat Co(ll)-cobamido-N,N',N",N,",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat)
MeOH 360* nicht gemessen
1 M Phosphatpuffer, pH 9 11,34 ±1% 35,6 ± 5%
>21,4
36,4
unabhängige Experimente, Angaben als k/minr1M-t; 'lineare Funktion der Zeit, vgl. [47]
114
5. Alkylierungskinetik
Zusammenfassung
Die Geschwindigkeitskonstanten der Adenosylierungen von Co(l)-cobyrinat und Co(l)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Methanol und
Wasser, sowie der Methylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) in Wasser wurden gemessen.
Die Adenosylierung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15) ist gegenüber der des Co(l)-cobyrinat deutlich
beschleunigt, in wässriger Lösung mit 6,8 min'1M-1 vs. 1,3 min-1M-1 cirka fünffach, in
Methanol mit 4,3 min'1M-1 vs. 0,37 minm1M-1 cirka zehnfach. Bei der Umsetzung von einer
mit 5'-0-Tosyladenosin gesättigten Lösung von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",
N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (0,6 mM) in Phosphatpuffer mit Natriumborhydrid
konnten Geschwindigkeitskonstanten von cirka 14 mim1M-1 erreicht werden.
Die Methylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) mit Methyltosylat in wässriger Lösung war mit k= ca. 3V00 min'1M-1 deutlich
schneller als in Methanol (k= V200 mim1M-1).
Die systematisch erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit der untersuchten Alkylierungs-
reaktionen im Cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10"-carboxylat)
kann durch die Wirkung der lipophilen Hülle, durch die sich das Cobamido-
N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxyiat) von der Cobyrinsäure
unterscheidet, erklärt werden. Dabei handelt es sich u.a. um in einem vorgelagerten
Gleichgewicht ähnlich dem Substrat-Enzym-Komplex entstehende Assoziate des Cobamido-
N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit dem Alkylierungsmittel.
115
LMU
rtrtj
\**/ «4^0?-O"CHstei (is)
Variante a
VY (24> VariantebNH,
LM,
(20)
(17)
LM,
fcl (15) R,
(18)
H£ ~° ?~\~f~CH>
LM,,2
CHS
M /(30)
LM i = Methanol
LM 2 = Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9)
Abbildung 54: Zusammenfassende Übersicht der Experimente zur Alkylierungskinetik
116
Assoziationsexperimente hatten bereits gezeigt19, dass in mit 5'-0-Tosyladenosin (15)
oder 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigter, wässriger Lösung von
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) das Tosylat eine Tendenz zur Assoziation mit den (n-Decyl-10'-carboxylat)-
Ketten aufweist. Durch ein derart vorgelagertes Gleichgewicht, ähnlich einem Enzym-
Substrat-Komplex, sollte die effektive Konzentration an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylatin der Nähe des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) höher sein als in einer analogen Lösung des Co(l)-cobyrinat. Demzufolge war
für die Alkylierung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) mit Methyltosylat bzw. 5'-0-Tosyladenosin (15) zu Hexakalium-Coa-aquo-
Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30)
bzw. zu Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20) und Hexakalium-Coa-
aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-
lat) (18) eine beschleunigte Alkylierungsgeschwindigkeit zu erwarten.
Das Reaktionsablauf der Alkylierungen von Co(l)-corrinen mit festem Alkylierungsmittel
ist komplex (vgl. auch Abbildung 55).
Die Alkylierungsprodukte Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",
N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (30), Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-
adenosyl-cobyrinat (20) und Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18), und die Edukte zu
ihrer Synthese, Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat), sind in Methanol und in Wasser gut löslich. Bei der
Umsetzung von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"", N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) in wässriger Lösung mit nur beschränkt löslichen
Adenosylderivaten wie 5'-0-Tosyladenosin (15) beinhaltet der Reaktionsablauf mehrere
Schritte: das Lösen des Alkylierungsmittels, den Transport in die Nähe des
Reaktionszentrums und die Reaktion mit dem Co(l)-zentrum.
Die neben dem Experimenten in Phosphatpuffer, pH 9, durchgeführten Messungen in
homogener methanolischer Lösung vermeiden zwar die aus der beschränkten Löslichkeit der
Alkylierungsmittel resultierenden Probleme, doch sind sie ein weniger gutes Modell für eine
dem Käfigeffekt unterliegende Reaktion, da die Löslichkeitseigenschaften des Gastmoleküls in
wässriger Lösung die Austrittsbarriere erhöhen.
19 Kapitel 3
117
Abbildung 55: Stationen einer als festes Alkyltosylat vorgelegten
Alkyleinheit bei der Alkylierungsreaktion mit
Co(l)-corrinen
Alkyl-tosylat(,9St> - - - >
Alkyl-tosylat(»el08t> - - - >
[Alkyltosylat; Co(l)-corrin](99lost) --->
Alkyl-Co(lll)-corrin(gelost>
Ausgehend von der durch Pt02-katalysierten Reduktion mit Wasserstoff aus Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) gewonnenen, cirka
zwei millimolaren Stammlösungen der entsprechenden Co(ll)-corrine wurden in einer
Glove-box durch Reduktion mit Natriumborhydrid in situ die entsprechenden Co(l)-corrine
hergestellt und nachfolgend in einer speziellen Glassapparatur mit Alkyltosylaten, 5'0-
Tosyladenosin (15) und Methyltosylat, bzw. 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin, umgesetzt.
Der Glassrezipient bestand aus einem mit einem langen Glasrohr versehenen Rundkolben mit
seitlich angeschmolzener UV/vis-Küvette, auf den über eine Schliffverbindung ein
abgebogener Birnkolben aufgesetzt werden konnte (Abbildung 56).
Die Alkylierungen wurden mit Methanol einerseits und in wässriger Lösung andererseits
durchgeführt. Anstatt mit einer einfachen wässrigen Lösung wurde ungeachtet der erhöhten
Hydrolysegeschwindigkeiten der eingesetzten Alkylierungsmittel in Phosphatpuffer, 1M, pH
9, gearbeitet, da NaBH4 in saurem und neutralem Medium im Vergleich zu der zu messenden
Alkylierung schnell hydrolysiert.
In dem Rundkolben befand sich neben der Reaktionslösung ein Magnetrüher. Für die
Reduktionen füllte man das Natriumborhydrid in den aufsetzbaren, abgebogenen Birnkolben,
für die Alkylierungen entsprechend das Alkylierungsmittel. Observable für den
Reaktionsverlauf war die optische Dichte, welche am Absorptionsmaximum der Co(l)-
corrine in einem auf 23,0 ± 0,2 °C thermostatisierten Spektrophotometer gemessen wurde.
Die Zahl der Messdaten und Übersichtspektren über den gesamten UV/vis-Bereich (200-
900 nm) wurde der Reaktionsgeschwindigkeit angepasst und die Zwischenprodukte, Co(ll)-
und Co(l)-corrine, über ihre UV/vis-Spektren identifiziert.
118
Abbildung 56: Apparatur zur Kinetikmessung; links:
UV-Küvette, dx= 0,100 cm; rechts: Vorratsgefäss mit
Magnetrührer zur schnellen Durchmischung; oben:
Reservoir mit NaBH4 bzw. Alkylierungsmittel:Gesamthöhe: 20 cm
Bei der Alkylierung der Co(l)-cornne mit 5'-0-Tosyladenosin (15) erschienen die
methanolischen Losungen bereits nach einigen Sekunden homogen während die wässrigen
Losungen sich aufgrund suspendierten 5'-0-Tosyladenosin (15) zuerst eintrübten. Die
UV/vis-Spektren in Methanol zeigen oberhalb der langwelligsten Absorptionsbande bis 900
nm die erwartete horizontale Basislinie, die bei den in Wasser durchgeführten Experimenten
für die ersten Messungen eine Wölbung aufwiesen. Um dennoch das Experiment so
reproduzierbar wie möglich zu gestalten, wurde mit im Ultraschallbad pulverisierten 5'-0-
Tosyladenosin (15) alkyliert. Die beobachte geringe Trübung bei Zugabe des
Alkylierungsmittels verschwand in wässrigen Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Losungen schneller als bei den analogen Ansätzen mit
Co(l)-cobyrinat.
119
Abbildung 57 (a): Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",
N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin f\5) in Methanol
(Experiment 1a); Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 6, 17 & 90 Minuten
Methanol
säe 63« ?-.e
nm
120
Tabelle 8
Isobestische Punkte der Alkylierung von Pentakalium-Co(l)-cobyrinat bzw.
Co(l)-pentakalium-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decy I-
10'-carboxylat) mit Methyl- und Adenosylderivaten
/P*^^
^^7"
Cobyrinat Cobamido-
N,N',N",N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Methanol, nm Wasser, nm Methanol, nm Wasser, nm
Methylierung 241
253
269
r322
308
R. /358
420
539
358
417
543
Adenosylierung 257
285
R= 326
410
349
411 414
353
410
HO\j "H
7546
608
735
530 539 535
Aufgeführt sind die Mittelwerte der Einzelexperimente. Für jedes Experiment wurden dazu
die isobestischen Punkte graphisch aus einem Spektrenovertay bestimmt.
121
Tabelle 9
Wellenlängen mit lokalen Maxima der e-Differenzen von Edukt und Produkt
bei Alkylierung von Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",
N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)
/£*^7
i
Hfi Hfi '.
Cobyrinat Cobamido-
N,N',N",N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Methanol, nm Wasser, nm Methanol, nm Wasser, nm
Methylierung
I"
244
264
304
345
R= / 389
457
390
457
Adenosylierung
R= 342 301
388 385 389 389
„0-F*^"HO-U? "H
7462
554
456 457 453
122
Die Alkylierungen wurden erst nach Konstanz des UV/vis-Spektums abgebrochen und waren
immer quantitativ20. Die Alkylierungsprodukte, Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-
cobyrinat (20), Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18) bzw. Hexakalium-Cocc-aquo-Coß-methyl-
cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30) konnten
nach Aufarbeitung der Reaktionslösungen analog den präparativen Synthesen durch 1H-
NMR- und UV/vis-Spektroskopie aufgrund ihrer Identität mit den Beschreibungsspektren
der entsprechenden präparativen Synthesen identifiziert werden. Die isolierten
Alkylierungsprodukte waren noch mit maximal zwei Äquivalenten Alkylierungsmittel
verunreinigt. Auf zusätzliche Reinigungsschritte zur Reindarstellung wurde jedoch wegen
der sehr geringen Substanzmengen21 verzichtet.
Aus der Schar der Übersichtsspektren (analog Abbildung 57 a) wurden die isobestischen
Punkte (Tabelle 8) und Wellenlängen mit lokalen Maxima der Differenzen der
Extinktionskoeffizienten der Produkte und Edukte (Tabelle 9) bestimmt.
Die Geschwindigkeitskonstanten wurden berechnet indem die Absorptionswerte (analog
Abbildung 57 b) gemäss einem Ansatz erster Ordnung ausgewertet wurden (analog Abbildung
57 c) und anschliessend die erhaltene apparente Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster
Ordnung durch die aus der Gesamtmenge des zu Reaktionsbeginn zugefügten
Alkylierungsmittels berechnete Konzentration dividiert wurde. In Tabelle 10 sind die
Ergebnisse der Einzelexperimente zusammengestellt.
Der Konzentrationsbereich der Co(ll)-corrinlösungen, ca. 2-10"2 M, war so gewählt, dass
er zwei Grössenordnungen über der Löslichkeit von 5'-0-Tosyladenosin (15) in Wasser lag.
Die Kinetiken Hessen sich über mehrere Halbwertzeiten auswerten und lieferten für
unterschiedliche Konzentrationen an Co(l)-corrin identische Werte.
Daraus muss geschlossen werden, dass entweder der Lösungsprozess verglichen mit der
Alkylierungsreaktion schnell ablief oder, da zur Alkylierung immer die ungefähr gleiche
Anzahl Äquivalente festes Alkylierungsmittel eingesetzt wurde, diese Linearität auf
ungefährer Proportionalität der aktiven Oberfläche zur eingesetzten Menge
Alkylierungsmittel beruhte. Eine direkte Vergleichbarkeit ist sicherlich problematisch, auf
20 Nach Zugabe von KCN in der Dunkelheit war keine Veränderung des UV/vis-Spektrums zu
beobachten.
21 Es fielen nach vollständiger Alkylierung pro Kinetikmessung cirka 1 mg alkyliertesCorrin an.
123
jeden Fall aber sollte der gefundene Wert für die Geschwindigkeitskonstante wenn, dann zu
klein verglichen mit dem wahren Wert ausfallen. Da die experimentellen Werte für die
Alkylierung von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) in Wasser jedoch sämtlich über jenen für Methanol liegen, besitzen sie
mindestens qualitative Aussagekraft.
Die Linearitätsbereiche der Auftragung des In (l/l0) vs. Reaktionsdauer erstreckten sich
analog den Beobachtungen von Blaser und Halpern [23], die die Alkylierung von Co(ll)-
cobalamin mit Alkylhalogeniden in Wasser und Methanol untersuchten, über einige
Halbwertzeiten. Die Reproduzierbarkeiten bewegten sich ebenfalls im Bereich von 10%.
Abbildung 57 (b, c): Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",
N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15) in Methanol
(Experiment 1a);
(b) optische Dichte bei 388 nm
124
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung
ln(l1 8-
/lo)
1 6
1 4.
1 2,
1.
8.
6.
4.
C\l
w— 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Zeit/ mm
Die Methylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) zu Hexakalium-Coa-aquo Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30) verlief in Wasser mit ca 3'000 min 1M 1
(Experiment 5) mehr als doppelt so schnell als in Methanol, für das eine
Geschwindigkeitskonstante von 1'200 mm 1M 1 (Experiment 6) ermittelt wurde (Tabelle
10). Die Kinetik der Methylierung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat) war zudem aufgrund der besseren Löslichkeit von Methyltosylat
in Wasser erwartungsgemäss wesentlich schneller als die der Adenosylierungen
Aufgrund der sehr hohen Alkylierungsgeschwindigkeit des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',
N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es mit Methyltosylat in Phosphatpuffer
war die Methylierung schon zum grössten Teil erfolgt als die erste Messung nach
Vermischung der Co(l)-Lösung mit dem Methyltosylat vorgenommen werden konnte
Erstaunlicherweise wurde für die Alkylierung der letzten Prozente Co(l)-cornn eine
Kinetik pseudo-erster Ordnung beobachtet, die jedoch wesentlich langsamer war als die
Alkylierungsgeschwindigkeit zu Beginn der Reaktion wie die grossen Achsenabschnitte in den
entsprechenden Experimenten (Experiment 5 & 6) belegen
125
Tabelle 10
Geschwindigkeitskonstanten k 2. Ordnung der Alkylierung von Co(l)-
cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N,,1N,")N"", N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) mit einigen Alkylierungsmitteln
Methylierungmit Methyltosylat
CH
I
Co(l)-cobyrinat
Hfi
Co(l)-cobamido-N,N',N",N"\N'"\N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
A**"-
in MeOH V200 ± 1%
lLL__inH20 3'250 ± 30%
2'500 ± 20%
(11
Adenosylierungmit 5'-0-Tosyladenosin
in MeOH 0,37 ± 5%
dt»
4,3 ± 5%
da)
inH20 1,33 ± 10%
(2b)
6,3 ± 4%
6,8 ± 7%
7,5 ± 10%
(2a)
in H20 mit 5'-Chloro-5'-
deoxy-adenosin
[Co(ll)corrin/5'-0-Tosyl-
adenosin]-Assoziat in H20
0,55 ± 9%
(4)
nicht gemessen
13,6 ± 20%
16,0 ± 10%
(3)
unabhängige Experimente, Angaben als k/min-1M-1, "nicht durchführbar, fett in Klammern:
Experiment-Nummer im experimentellen Teil
126
Die Adenosylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N' -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) war sowohl in Wasser mit ca. 6,8 min"1M-1 (Experiment 2a) als auch in
Methanol mit 4,3 min_1M-1 (Experiment 1a) wesentlich schneller, als bei Co(l)-
cobyrinat, dessen entsprechende Werte 1,33 min"1M"1 (Experiment 2b) und 0,37 min-1M-
1 (Experiment 1b) betrugen: Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) wurde in Wasser cirka fünfmal schneller als Co(l)-cobyrinat
adenosyliert bzw. zehnfach schneller in Methanol.
Die Adenosylierung von Co(l)-cobyrinat in wässriger Lösung mit 5'-Chloro-5'-deoxy-
adenosin lieferte k= 0,55 min-1M'1 (Experiment 4), ein Wert, der verglichen mit der
entsprechenden Reaktion des 5'-0-Tosyladenosin (15), mit Chlorid als der schlechteren
Abgangsgruppe erwartungsgemäss geringer ausfiel.
Für die Adenosylierungsgeschwindigkeiten lassen sich somit drei charakteristische
Eigenschaften feststellen, von denen eine auch bei den Methylierungsreaktionen
nachgewiesen werden konnte, wenn auch die vollständige Analogie nicht umfassend
untersucht wurde:
1. Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
alkyliert systematisch schneller als Co(l)-cobyrinat
Bei allen untersuchten Adenosylierungsreaktionen schwankte der Quotient der apparenten
Geschwindigkeitskonstanten der Alkylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)/Co(l)-cobyrinat zwischen fünf und elf.
Da sämtliche untersuchten Reaktionen durch Vermischen mit einem Festkörper initiiert
wurden, war allein schon aufgrund der vermuteten Oberflächenaktivität des Co(l)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) eine beschleunigte
Lösung des festen Reaktionspartners und damit eine erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit zu
erwarten.
Zudem lässt sich die erhöhte Geschwindigkeit mit Assoziation des 5'-0-Tosyladenosin mit
dem Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) er¬
klären, die in weiteren Experimenten22 und synthetisch durch die praparative Alkylierung
22 vgl. Assoziationsexperimente Kapitel 3
127
über die Reduktion einer mit 5'-0-Tosyladenosin gesättigten Lösung Cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) nachgewiesen werden konnte.
In einem weiteren, orientierenden Experiment wurde die Bedeutung der Assoziatbildung für
die Geschwindigkeitskonstante der Alkylierung untersucht.
Assoziate von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat) mit 5'0-Tosyladenosin (15) wurden durch Ultraschallbehandlung einer mit einem
Uberschuss an festem 5'-0-Tosyladenosin (15) versetzten wässrigen Lösung des Co(ll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) und anschlies¬
sendem Abzentrifugieren des verbleibenden suspendierten 5'-0-Tosyladenosin (15)
hergestellt. Die analog dem oben beschriebenen Vorgehen berechneten apparenten
Geschwindigkeitskonstanten der Alkylierung dieser Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat/5'-O-Tosyladenosin-Lösungen, dabei handelt es sich
wahrscheinlich um Assoziate, in wässriger Lösung durch Umsetzung mit Natriumborhydrid
lagen im Bereich von cirka 14 min~1M~1 (Experiment 3). Dieses Ergebnis war nicht
signifikant verschieden von 11 min~1M~1, dem Wert für die Reduktion von Co(ll)-cobyrinat
mit Natriumborhydrid in wässriger Lösung (Tabelle 7).
Es war daher zu vermuten, dass das 5'-0-Tosyladenosin (15) in diesen Assoziaten sehr nahe
am Kobalt lokalisiert war und die Alkylierung erfolgte sobald das Reduktionsmittel gelöst
war.
2. Systematische Unterschiede der absoluten Geschwindigkeiten in Wasser & Methanol
Die experimentell bestimmten Geschwindigkeitskonstanten für die Methylierungen und die
Adenosylierung liegen in Wasser systematisch über jenen derselben Reaktion in Methanol.
Einen Grund hierfür könnte die bessere Stabilisierung des Übergangszustandes der
nukleophilen Substitution in Wasser als in Methanol darstellen.
In methanolischer Lösung wurden die Lösungen praktisch augenblicklich makroskopisch
homogen. Da in wässriger Lösung eine Beschleunigung der Alkylierung eintrat könnte auch
bedingt durch den bevorzugten Aufenthalt des Corrins an der Grenzfläche des festen
Alkylierungsmittels (ähnlich Detergenzmolekülen) die effektive Konzentration des
Alkylierungsmittels in der Nähe des Co(l)-zentrums grösser gewesen sein als in der
homogenen Lösung in Methanol.
Die Phänomene sind insgesamt komplex und können in der vorliegenden Arbeit nicht
bezüglich der Beiträge der Einzelfaktoren quantifiziert werden.
128
3. Die Unterschiede der Adenosylierungsgeschwindigkeiten sind in Wasser kleiner als in
Methanol
Die Verminderung der relativen Adenosylierungsgeschwindigkeiten von Co(l)-cobyrinat und
Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) beim
Wechsel von Methanol zu Wasser als Lösungsmittel ist durch das Zusammenwirken
mehrerer Faktoren erklärbar:
a) Die (n-Decyl-IO'-carboxylat)-Ketten könnten in wässriger Lösung eine andere
Konformation einnehmen als in Methanol und so den Zugang zum nukleophilen Zentrum
beeinflussen. Dabei erscheint aufgrund des überwiegend lipophilen Charakters der
Seitenketten ein Zusammenknäulen der lipophilen Teile und eine Ausrichtung der
hydrophilen Endgruppen in die Wasserphase nicht unwahrscheinlich.23
b) Andererseits bewirkt eventuell ein Detergenzeffekt des Co(l)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) in Wasser eine bessere
Lösungskinetik des als Festkörper zugegebenen Alkylierungsmittels.
c) Beim Übergang von Wasser zu Methanol als Lösungsmittel wirken wahrscheinlich
daneben noch bedingt durch den zu ionischen Produkten führenden Substitutionsmechanismus
Lösungsmitteleffekte. Bekannterweise beeinflusst nämlich die Polarität des Lösungsmittels
die Geschwindigkeit von Sn2 Reaktion in Abhängigkeit davon, inwieweit im Vergleich zum
Eduktzustand eventuelle Ladungen im Übergangszustand der Reaktion delokalisiert werden.
23 vgl. 2.2.2
129
EXPERIMENTELLER TEIL
6.1 Allgemeine Bemerkungen
Für die Bestimmung der analytischen Daten danke ich Frau B. Brandenberg, Frau V. Egli,
Herrn M. Welti und Herrn PD Dr. Bernhard Jaun (1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren), Herrn
Dr. U. Schefer (Massenspektren) sowie den Herren H. Hediger und R. Dohner (CD-, UV/vis-
und IR-Spektren für Charakterisierungen).
Unterstützt hat mich auch die Gruppe Prof. U. Wild bei der Durchführung der Total-
Lumineszenz-Spektroskopie, wobei ich insbesondere Herrn Michael Parti für seine
Einführung in die Fluoreszenzmessungen danke.
6.1.1 Apparative Ausstattung
Arbeiten unter Stickstoff
Die Herstellung sämtlicher Lösungen zur Messung der Reduktionskinetik, die Vorbereitung der
geschlossenen Kinetikapparatur sowie die praparative Synthese der alkylierten Corrine
wurden in der Glove-box durchgeführt ([02] <18 ppm bzw. während Arbeiten mit Co(l)-
Lösungen [02] ca. 2-3 ppm):Meca-Plex Glove-box, Grenchen, Schweiz, Typ 2201 (Kristallisation und Alkylierungen
Cobalamine, [02] <2 ppm), Typ 2540 (sonstige Elektrochemie und Applikationen, [02] <18
ppm). Messung des Sauerstoffgehaltes mit Teledyne, Trace Oxygen Analyser.
CD
Messung des Circular-Dichroismus mit Jobin-Yvon Mark III, 200-700 nm, Angaben in
L/Mol/cm.
Elektrolyse
Alkylierung der Cobalamine und Ausarbeitung der Synthesemethodik für Hexanatrium-Coa-
aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) mit Electrochemistry System Model
170, Princeton Applied Research, Princeton, N.J., USA. Alle übrigen Elektrochemie¬
experimente mit Potentiostat AMEL, Model 550.
Elektrochemische Zelle gemäss [105]. Gegenelektrode Piatindraht, Arbeitselektrode Queck¬
silber im elektrischen Kontakt über eine Platindrahtverbindung, Referenzelektrode Kalomel
(in Kontakt zur Reaktionslösung über: 0,1 M wässriges KCl/ 0,1 M KCl in Methanol-Wasser
1:1 / 0,1 M Inertelektrolyt in Methanol-Wasser 1:1). Bei der Synthese des 1,N6-
Ethenoadenosylcobalamin (4) wird zusätzlich noch ein Element 0,1 M Inertelektrolyt in
Methanol vor dem Kontakt mit der Reaktionslösung geschaltet.
130
LumineszenzmessungenDie Fluoreszenzmessungen erfolgten nach der front face Methode ([146]) Hochauflösendes
computergesteuertes Spektrometer mit Photonenzähler Bandbreite des anregenden Lichtes
einige nm
Monochromatoren SPEX Modell 1402, Steuerung der Monochromatoren SPEX Speed
Controller, Photomultiplier Emission RCA Electronic Components C31034 A, PhotomultipherReferenz Hamamatsu R 928, Counter Emission General Radio 1192 B, Counter Referenz
Seyffer Modell 150, Lampe Osram Xenon Hochdruckkurzbogenlampe XBO, 2500 W, IR
Filter Glas, Kuvetten Hellma Quartzkuvetten suprasil, dx= 0,100 cm, Datenauswertung mit
Software von Kallir [146]
Gewichtsbestimmungen
Sämtliche Gewichtsbestimmungen mit Mettler Waagen, Zürich, Genauigkeit ± 0,1 mg bzw ±
1,0 mg
IR
Perkin Eimer 781 Infrared Spectrophotometer, für Messungen in KBr Perkin Eimer
Gitterspektrograph PE 983, Bandenlage in cm 1, s= stark, m= mittel, w= schwach
Massenspektroskopieal {+)&(-) FAB MS
Fast Atom Bombardment Massenspektrometer ZAB 2 SEQ, Normierung der Peakhöhe auf
jeweils höchste Intensität in ausgewählten Messbereich 100 % Peak (Basispeak), Matrix und
Messbereich sind angegeben wobei die Matrixsignale unberücksichtigt blieben (Elimination
durch Vergleich mit entsprechenden Matrixspektren)b/ El MS
Electron Impact Massenspektrometer Hitachi RMU 6D (lomsationsenergie 70 eV) und Tib
nd (70 eV), Angabe in m/z, Intensitäten in % des Basispeaks
Mikroanalysen
Durchgeführt im mikroanalytischen Laboratorium des Institutes für organische Chemie der
ETH Zürich
NMR Spektroskopie1H NMR-Spektren gemessen auf Bruker Spectrospin AMX 400 (400 MHz), Bruker
Spectrospin WM-300 (300,13 MHz), Vanan Gemini 200 bzw Bruker Spectrospin WP-80
(80 MHz)
13C NMR-Spektren 75 MHz auf Vanan XL 300 oder 100 MHz auf Bruker Spectrospin AMX
400, jeweils breitbandentkoppelt und DEPT
Chemische Verschiebungen 8 in ppm Die Spektren sind auf das Lösungsmittel referenziert Die
Verwendung interner Referenzen, TMS oder DSS, ist gesondert vermerkt
Alle NMR-Messungen ohne Temperaturangabe wurden bei Umgebungstemperatur gemessen
131
H-C-COSY, H-detected, 13C-detected Spektroskopie
gemessen auf Bruker Spectrospin 400 MHz, Spectrospin, Fällanden, Schweiz.
Photolyse
Photolyseexperimente in verdunkeltem Raum mit:
A. UV-Lampe, Universal, Camag, Muttenz, Schweiz, TL-900, mit Lichtquellen: SylvaniaF8T5/ BLB, Sylvania Electric Products Inc., Danvers, Mass., USA 01923 (366 nm) und
Heisskathodenröhre sterilAir UVC-9 (254 nm).
B. Lichtquelle und Monochromator nach Neier [122] mit Xenon-Hochdrucklampe, Osram,
XBO (Gleichstrom), 1600 W, SPEX Monochromator, SPEX Industries Inc., Metuchen, N.J.
08840, Siemens Zündgerät Z 5203, Transistor Netzgerät, Heinzinger Typ TNX 1600 W,
Halbwertsbreite des Strahlenbündels 20 nm. Messung der Intensität mit Sciencetech 365,
power & energy meter, Sciencetech Detector, Catalogue No. 360001, Sciencetech, Boulder
Colorado.
Schmelzpunkt
Schmelzpunktapparatur Büchi, Flawil, nach Tottoli, mit offenem Probenrohr.
Thermostatisierung
Das UV/vis-Spektrometer Uvikon 860 wurde während der Messungen zur Alkylierungskinetikund das Wasserbad des Ultraschallgerätes während der Assozationsexperimente mit einem
Thermostaten Haake F3S auf ± 0,2 °C themostatisiert, wobei die thermostatisierte Flüssigkeit
(Wasser) die Küvettenhalterung des UV/vis-Gerätes bzw. eine Kühlspirale, welche in das zu
thermostatisierende Ultraschallbad eingetaucht war, durchströmte.
Trockenschrank
Memmert-Trockenschrank mit natürlicher Durchlüftung, 120 °C Innentemperatur, Memmert
GmbH, Schwabach, Deutschland.
Ultraschall
Elgasonic, Elga S.A., Biel/Bienne, Schweiz, Frequenz 50 kHz.
UV/vis-SpektroskopieFür Routinespektren: Uvikon 860, Kontron Instruments; für Charakterisierung: Perkin-
Elmer 555; Angaben in cnr1M\ 200-800 nm, Küvetten Hellma, Suprasil, Schichtdicke
0,100 cm soweit nicht anders vermerkt.
Zentrifugation
Runne Zentrifuge Modell 100-2, ungekühlt, soweit nicht anders vermerkt 4'000 UpM.
132
6.1.2 Standard-Arbeitsabläufe
Vorbereitung
Sauerstoffsättigung der Proben
Sauerstoff wurde während mindestens 45 Minuten durch Kieselgel und nachfolgend durch zwei
in Reihe geschaltete Gaswaschflaschen geleitet, welche das Lösungsmittel der zu sättigenden
Lösung enthielten.
Glaswarentrockung
Für wasserfreie Ansätze wurden die benötigten Glaswaren mindestens 12 h im Trocken¬
schrank bei 120 °C getrocknet und anschliessend unter Inertgas (Argon- oder Stickstoff¬
strom) ausgekühlt.
Reinigung der UV-Zellen
Die Zellen wurden vor Gebrauch mit MeOH (Fluka, puriss.), nachfolgend mit Aceton (Fluka,
puriss.) jeweils innen und aussen gewaschen und am Hochvakuum während 30 Minuten bei RT
getrocknet.
Entgasen der Lösungen
Die zu entgasenden Lösungen wurden dreimal unter heftigem Rühren am HV mit flüssigem
Stickstoff eingefroren und anschliessend aufgetaut. Wurden Lösungen in eine Glove-box
transferiert legte man in der Box sofort nochmals Hochvakuum an bis keine wesentliche
Blasenentwicklung mehr zu beobachten war.
SEP-Pack Vorbehandlung
Originalverpackte SEP-Pack Kartuschen wurden vor Gebrauch mit 5 ml Methanol und 10 ml
H20 gewaschen. Vor dem zweiten Gebrauch einer Kartusche wiederholte man die Vor¬
behandlung. Die Kartuschen wurden nur für dieselbe Substanz, maximal jeweils zweimal,
verwendet.
Reinigung S'-O-Tosyladenosin
Vor Verwendung des 5'-0-Tosyladenosin bei den Assoziationsexperiemnten wurde die
kommerzielle Ware wie folgt behandelt: ca. 150 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) wurden in 5,0
ml H20 suspendiert, 15 Minuten mit 50 kHz Ultraschall beschallt, während 10 Minuten mit
4'000 UpM zentrifugiert und die farblose, partikelfreie Lösung vom Niederschlag vollständig
abpipettiert. Der Vorgang wurde wiederholt und der Rückstand eine Stunde am Hochvakuum
lyophilisiert. Gemäss 300 MHz 1 H-NMR war das 5'-0-Tosyladenosin (15) nun frei von
Hydrolyseprodukten.
133
Herstellung gesättigter Lösungen von I.Nß-EthenoadenosylS'-O-tosylat und S'-O-Tosyl¬adenosin
Gesättigte, wässrige Lösungen von 1 ,N6-Etheno-5'-0-tosyladenosin 16 und Tosyladenosin 15
wurden analog der Reinigung von S'-O-Tosyladenosin mit vorgereinigtem Material hergestellt.
Man filtrierte die mithilfe von Ultraschall gesättigte Mutterlauge durch eine mit Glaswatte
gefüllte Pasteurpipette.
XAD-PräparationGrundsätzlich wurde der feucht einzusetzende XAD-Harz mit den bei der entsprechenden
Aufarbeitung verwendeten Chemikalien vorbehandelt (Angaben je 50 ml XAD):
1. Cobyrinsäure: Waschen des suspendierten Harzes mit 50 ml Eisessig, 500 ml Wasser, 200
ml wässriger, 2 %iger KCN-Lösung, 200 ml Aceton/Methanol, 1:1, und zuletzt wiederum mit
500 ml Wasser.
2. HeptakaliunW-natrium-cobyrinat: 100 ml ges. KHCO3 + 0,1 gl-1 KCN, 5-faches Volumen
H20, 5-faches Volumen MeOH, 5-faches Volumen H20. Wurde das Harz bereits verwendet
reinigte man es vorher bis zur vollständigen Entfärbung mit MeOH/2N NaOH (1:1).
3. Bei den alkylierten Cobyrinaten, die aus saurer Lösung auf das XAD aufgetragen wurden,
wusch man zuerst mit 10 %iger Phosphorsäure, eventuell mit wenigen ml Methanol zur
vollständigen Benetzung, eluierte mit 100 ml Methanol und abschliessend mit ca. 200 ml H20.
4. Bei den basisch aufzutragenden alkylierten Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat)en wusch man zuerst mit 100 ml Methanol, dann 100 ml
gesättigter, wässriger KHCO3 und abschliessend mit ca. 200 ml H20.
Regeneration Dowex
Zur Regeneration des Dowex 50 WX 2 wurden 150 ml Harz in Folge mit 800 ml 2 N NaOH,
1'000 ml H20, 700 ml HCl und 1'000 ml H20 gewaschen. Nach wiederholtem Gebrauch für die
Hydrolyse mussten zudem zur vollständigen Entfärbung des Harzes Substanzreste mit 100 ml
4 N NaOH gewaschen werden.
Synthese
Alkylierungen
Ausführung sämtlicher Alkylierungen, d.h. Methylierungen, Adenosylierungen und 1,N6-
Ethenoadenosylierungen, in einer Mecaplex Glove-box unter minimaler Kunstlichtbeleutung.
Der Sauerstoffgehalt wurde während der Alkylierung kontrolliert und überstieg in keinem Fall
30 ppm, bei elektrochemischer Reduktion nicht 3 ppm.
Die Aufarbeitung wurde ebenfalls unter stark reduzierten Lichtverhältnissen durchgeführt.
134
Kontrolle des Reaktionsverlaufes
Die Reaktionsverlauf wurde soweit nicht anders vermerkt mit DC, bei den Reduktionen der
Corrine zu Co(ll)-corrinen oder Co(l)-corrinen mit UV/vis-Spekroskopie verifiziert.
Flash ChromatographieZur Flash-Chromatographie wurde das Kieselgel nass und entgast im Laufmittel aufgezogen.Säulendimensionen und Methodik entsprechend [117].
DC-Chromatographie
Angegeben sind das verwendete Laufmittelgemisch und eventuelle Reagentien zur Detektion.
Kristallisation
Zur Kristallisation der Cobalamine löste man das Rohprodukt jeweils in H20 und tropfte
solange Aceton zu, in der Regel das 4-fache Volumen, bis sich die Lösung zu trüben begann. Bei
Kristallisation im Kühlschrank nutschte man nach den jeweils in den einzelnen Vorschriften
angegebenen Zeiten die Kristalle ab.
Analytik
Probenvorbereitung für NMR-Messungen
Man löste die zu analysierende Substanz zuerst in 0,7 ml deuteriertem Lösungsmittel, zog am
Rotationsverdampfer das Lösungsmittel ab, trocknete anschliessend am HV und löste zur
Messung erneut in 0,7 ml deuteriertem Lösungmittel. Wässrige Lösungen wurden entsprechend
lyophilisiert.
NMR-SpektroskopieDie angegebenen Zahlenwerte der J-Kopplungskonstanten sind bei Multipletten das Mittel der
Signaldifferenzen der jeweiligen Gruppe.Die Interpretation der Spektren der Cobalamine erfolgt auf der Basis der angebenen
Vergleichssubstanz indem die Differenzen der chemischen Verschiebungen möglichst minimiert
werden und die Multiplizitäten sowie Signalintensität, im Falle der 1 H-NMR-Spektroskopieauch die Signalform, mit der Zuordnung kompatibel sind.
Test auf Alkylierung eines Corrines
Die Alkylierungsansätze wurden erst nach befriedigendem Test auf quantitive Alkylierung
aufgearbeitet. Hierzu versetzte man eine mit Methanol verdünnte Probe der Reaktionslösung
(insgesamt 0,3 ml) mit ca. 0,05 ml methanolischer 1 %iger HCN-Lösung, schüttelte kurz und
heftig um und nahm umgehend das UV/vis-Spektrum auf.
Nicht alkylierte Co(ll)-Verbindungen gehen ausgenblicklich in die Dicyanoform über, deutlich
messbar an der Intensität des Maximums bei 578 nm in Falle der Cobyrinsäure und 581 nm
im Fall des Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es.
135
Mikroanalyse
Analysen mit jeweils ca. 0,5 bis 0,8 mg Probensubstanz. Eichsubstanz war Acetanilid.
Hydratwasser wurde in Schritten von 0,5 H20 pro Molekül berechnet bis beste Überein¬
stimmung der theoretischen mit den experimentellen Werten herrschte.
Von den jeweils doppelt gefahrenen Messreihen ist dasjenige Resultat, welches in seiner
Gesamtheit mit den theoretischen Werten besser übereinstimmt, erwähnt.
Handling
Fällungen
Die Mutterlauge wurde durch Zentrifugation vom Niederschlag abgetrennt, der Niederschlagnochmals mit Lösungsmittel aufgeschlämmt und zentrifugiert.
Rotationsverdampfer
Soweit in der Synthesevorschrift nicht explizit formuliert wurde am Wasserstrahlvakuum bei
Raumtemperatur (20 - 25 °C) das Lösungsmittel abgezogen.
Lagerung der Substanzen
Sämtliche Substanzen wurden im Dunkeln, die alkylierten Corrine unter vollständigem
Lichtausschluss, bei 5 °C gelagert. Lediglich die Dicyanocobyrinsäure und die Tosyladenosinewurden im Tiefkühler bei -20 °C aufbewahrt.
Datenauswertung
Bestimmung isobestischer Punkte
Die isobestischen Punkte wurden graphisch aus übereinander gezeichneten, auf DIN A 3-Grösse
vergrösserten Spektren bestimmt. Die Ablesegenauigkeit lag im Bereich ± 1 nm.
FehlerrechnungDie Fehlerrechung erfolgte gemäss Standardstatistikverfahren unter Verwendung der Her¬
stellerangaben betreffend apparativer Genauigkeiten (z.B. Waagengenauigkeit, Messzylinder,
UV-Küvette).
136
6.1.3 Qualität der verwendeten
Aceton (C3H60)
Acetonitril (CH3CN)
Aluminiumoxid (Al20s)
Anthrachinon (C14H8O3)
Argon (Ar)
Benzol (CöHe)
Benzylamin (C7H7NH2)
Blausäure (HCN)
11 -Bromundecansäure (Ci2H22Br02)tert.-Butanol (C4Hi00)Calciumchlorid (CaCI2)Celite
5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin
(Ci0H12O3N5CI)
5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-ethenoadenosin
(C12H1203N5CI)
Chloroform (CHCI3)
Cobester (CMH73C0N6OH, 26)
Cobester-c-lacton (C53H69C0N6OH)
Cyanocobalamin
Cyclohexan (C6H12)
Cyclohexen (C6H10)
Deuteriumoxid (D20)
ien
a) Schalter ETHZ redest.
b) Fluka, puriss. p.a.
Fluka, puriss. p.a.
"Alumina Woelm B", bas. Aluminiumoxid,
Akt.l, Woelm Pharma, D-37269 Eschwege
Schalter ETHZ, purum
PanGas
Fluka, puriss. p.a
Fluka, puriss. p.a.
MeOH gesättigt mit HCN (10%ige Lösung),
für 500 ml MeOH wird HCN, aus 100 g in
300 ml H20 gelöstem NaCN und 110 ml konz.
H2S04, in eisgekühlte Methanolvorlage geleitet
Fluka, pract.
Schalter ETHZ, redest.
Schalter ETHZ
Schalter ETHZ
Sigma, 2x umkrist.
2x krist., 1H-NMR-rein (200 MHz), synthe¬
tisiert von Dr. Maria Ngu gemäss [97]
Fluka, puriss. p.a., stab. mit 1 % Ethanol,
über bas. Alox filtriert
Synthese gemäss [147], Reinigung durch Aus¬
schütteln mit MeCI2 und anschliess. Kiesei¬
gelsäule (Hexan/i-Propanol/1% HCN in MeOH,
5:2:1), 2x Kristallisation aus Toluol/Hexan,
gemäss1 H-NMR-Spektrum (200 MHz) >95%
2x krist., gemäss 1 H-NMR-Spektrum (200
MHz) >95% rein, von Ch. Bühler
siehe Vitamin Bi2,1
Fluka, purum
Fluka, puriss. p.a., stabilisiert mit 0,01 %
p-tert.-Butylkresol
a) ICN, >99,8 % D
b) Ciba-Geigy, ultrapuriss. 99,98 % D
c) ICN, 99,97 % D
137
Deuterochloroform (CDCI3)
Deuterodichlormethan (CD2Ci2)
Deuteromethanol (CD3OD)
1,4-Dibrombutan (C4HaBr2)
1,2-Dibromethylacetat (C4H5Br202)
Dicyano-cobyrinsäure-heptamethyl-
ester (C^HysCoNeOu, 26)
Diethylether (C4Hi0O)
Diisopropylether ((CH3)2)CH)20)
N,N'-Dimethyl-4-aminopyridin
(C7H12N2)
Dimethylformamid (C3H7NO)
Dimethylsulfoxid (C2H6SO)
Dioxan (C4H802)
Dowex 50 WX 2
Essigsäure (C2H402)
Essigsäureethylester (C4H802)
Ethanol (C2HeO)
Ether
Ethyltosylat
Ethin (C2H2)
Filterwatte
Heptan (C7H16)
Hexadecyltrimethylammoniumchlorid
([N(CH3)3(C16H33)]CI)Hexan (CeH14)
Hydroxycobalamin (C62H90CIC0N13O15P,
9)
5'-lodo-5'-desoxyadenosin (CioHi2N503l)
Kaliumbromid (KBr)
Kaliumcyanid (KCN)
d) Dr. Glaser AG, Basel, >99,95 %
Fluka, puriss. p.a., stabilisiert mit Ag, D >
99,98 %
Dr. Glaser AG, Basel
Ciba-Geigy, 99,98 % D
Fluka, purum
dest., 1H-NMR-rein, synthetisiert von Dr.
Maria Ngu, nach [97]
siehe Cobester
a) Schalter ETHZ, redest.
b) Fluka, puriss. p.a., über Na/Pb
c) Carlo Erba >99,8 %, stab. mit BHT
Fluka, puriss. p.a., stabilisiert mit 0,01%
Hydrochinon
Fluka, purum
Fluka, puriss. p.a.
dest. über Molekülarsieb 3 A
Fluka, puriss. p.a.
Fluka, p.a.
a) Merck, 100% p.a., Art. 63
b) Fluka, puriss. p.a.
Schalter ETHZ, dest.
Fluka, abs., Ph.Helv., puriss.p.a.
siehe Diethylether
siehe Toluol-4-sulfonsäure-ethyl-ester
PanGas
Hecht No. 1408/2
Fluka, puriss. p.a.
Fluka, 1x umkrist.
a) Schalter ETHZ, redest.
b) Fluka, puriss. p.a.
Fluka, als Hydrochlorid, >96 % HPLC, Bio-
chemika, < 12% Trockenverlust (20 °C,HV)
Sigma
Fluka, für die IR-Spektroskopie
a) Merck, zur Analyse, Art. 4967
b) Fluka, puriss. p.a.
138
Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3)
Kaliumhydroxid (KOH)
Kaliumiodid (Kl)
Kieselgel 60
Kieselgel C-18 (RP-18)
Lithiumperchlorat (UCIO4)
Magnesiumsulfat (MgS04)
Methanol (CH3OH)
Methylenchlorid (CH2CI2)
Methyltosylat
Natriumborhydrid (NaBH4)
Natriumchlorid (NaCI)
Natriumcyanid (NaCI)
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2P04)
Natriumdithionit (Na2S204)
Natriumdodecylsulfat ((CH2)12S04Na)
Natriumhydrogencarbonat (NaHC03)
di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HP04)
Natriumhydroxid (NaOH)
Natriumperchlorat (NaCI04)Natriumsulfat (NaS04)Nitrobenzol (C6H5N02)
Palladium auf Kohle (Pd/C)
Perchlorsäure (HCI04)
Petrolether
Pivaloylchlorid ((CH3)3CCOCI)
Phosphorsäure (H3P04)
Platinoxid (Pt02)
a) Merck, p.a.
b) Fluka, microselect
Siegfried AG.CH-Zofingen, purum
Merck, p.a.
a) Fluka, für Flash-Chromatographie, Art.
60738
b) 20 x 20 cm Platten, Merck, Art. 5721,
ohne Fluoreszenzindikator
a) SEP-PAK Cartridge, Millipore, Waters
Associates, Part No. 51910
b) 10 x 20 cm Platten, Merck, Art. 5914,
für HPLC
Merck p.a., getrocknet
Schalter ETHZ
a) Schalter redest.
b) Fluka, puriss. p.a., abs. und acetonfrei
a) Schalter ETHZ, redest.
b) Fluka, puriss.p.a.siehe Toluol-4-sulfonsäure-methylester
Fluka, purum
Merck zur Analyse, Art. 6404
Schalter ETHZ
Fluka, purum p.a.
Fluka, purum
Fluka, puriss.
Merck, p.a.
Fluka, purum
Siegfried, PHVI
Fluka, purum p.a.
Schalter ETHZ
Fluka, puriss. p.a., stabilisiert mit 0,01 %
p-tert.Butylkresol
Engelhard, 10 % Pd on carbon catalyst, No.
4505
Merck p.a, etwa 60 %
Fluka, puriss. p.a., 50-70 °C
Fluka, purum
a)Merck, p.a., mind. 85 %
b)Fluka, puriss. p.a., crist.
a)Baker, 83,10 % Pt
139
Pressluft
Propanol (C3H8O)
Quecksilber (Hg)
RP-18
b)Engelhard, 92,33 % Pt
Hausleitung ETHZ
Fluka, purum
a) Merck, Art. 4403
b) Fluka, puriss.p.a. 99,9999 %
siehe Kieselgel C-18
Sauerstoff (02)
Schwefelsäure (H2S04)
SDS
Stickstoff (N2)
PanGas
Merck 95-97%, p.a., Art.731
siehe Natriumdodecylsulfat
PanGas
Tetrabutylammoniumhexafluorophosphat umkrist., Pingli Liu, rein gemäss 1 H-NMR
(NBu4PF6)
Tetrabutylammoniumperchlorat (NBu4CI04)umkrist., Pingli Liu, rein gemäss 1H-NMR
Tetrachlorkohlenstoff (CCI4)
Tetrahydrofuran (C4H80)
Toluol (C7H8)
Toluol-4-sulfonsäure-methylester
(C8H10SO3)
Toluol-4-sulfonsäure-ethylester
(C9H12S03)
5'-0-Tosyladenosin (C17H19O6N5S, 15)
Triethylamin (NEt3)
Trifluoressigsäure (CF3COOH)
Trifluoressigsäure-4-nitrophenylester
(C8H4N04F3)
Trimethyl-silyl-propansulfonsäure
(CsHie03S2)
Vitamin B12 (CesHasCoNHOuP, 1)
Fluka, puriss. p.a.
Fluka, puris. p.a., abs., stab. mit 0,025%
2,6-Di-tert.butyl-p-kresol, frisch dest.
über Natrium
Fluka, puriss. p.a.
Fluka, purum, 2x rekrist.
Fluka, pract., dest.
Sigma
Fluka, puriss. p.a., destilliert über CaH
Fluka, purum
Fluka, purum
Geigy
Roche, kristallin
Wasser (H20)
Wasserstoff (H2)
Watte
bidest., gereinigt mit Barnstaed NANOpur4.0, PanGas
Intern.Verbandstoffabrik, Schaffhausen, 75 %
Viscose/ 25% Baumwolle
XAD (Polystyrolharz) Serva, Heidelberg, reinst, Typ 2, 0,05-0,1 mm
140
6.1.4 Abkürzungen
Ado-Tos 5'-0-Tosyladenosin (15)
Berühr.pkt. Berührungspunkt
BHT 2,6-Di-tert.butyl-4-methylphenon
br. breit
bzgl. bezüglich
bzw. beziehungsweise
c Konzentration in M
13C-NMR 13C-KernspinresonanzCD Zirkular Dichroismus
d Dublett
DC Dünnschichtchromatogramm
dest. destilliert
AG freie Energie
Diss. Dissertation
DMF Dimethylformamid
DSS 4,4-Dimethyl-4-silyl-pentansulfonsäure-Natriumsalz
e Extinktionskoeffizient, in M"1cm_1
e 1,N6-Etheno-
EGW 60 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, Ethylenglykol, 1:1 (v/v)
El Electon ImpactEM Emission
Entkopp. Entkopplung
eV Elektronenvolt
EX Excitation
FAB-MS Fast Atom Bombardment Massenspektrometrie, positiv (+)
negativ (-)
Fe fraktionale Käfigeffizienz (nach Finke [36], Fc=kc/(kc+k
ges. gesättigt
Gly Glycerin
h Stunden
1H-NMR 1 H-Kernspinresonanz
HV Hochvakuum, 10"3 Torr
Hz Hertz
IR Infrarotspektroskopie
141
J Kernspinkopplungskonstanten
k Geschwindigkeitskonstante
m Multiple»m Masse
M Molarität, mol dm-3
MHz Megahertz
ml Milliliter
mw. Molmasse (molecular weight)
mol. Eilip. molare Elliptizität in grad mol nv1
MS Massenspektrogramm
3-NOBA 3-Nitrobenzylalkohol
0. oder
rf Retentionsfaktor der DünnschichtchromatographieRef. Referenz
rel. relativ
RP-18 reversed phase Kieselgel C-18
RT Raumtemperatur
s Singlett's' singloid
SDS Sodiumdodecylsulfatesh Schulter
t TriplettT TemperaturTBAP TetrabutylammoniumperchloratTEMPO 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinoxidTHF Tetrahydrofuran
u.a. unter anderem
undiff. undifferenziert
Upm Umdrehungen pro Minute
UV/Vis Ultraviolett-visible Photospektrometrie
vgl. vergleiche
vs. versus
z Elementarladung
142
6.2 Synthese des 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)
CONH, 0H
H/IOC
HJIOC
1 uX
0 0- \)H
9
CONH,
CeüHggN^O^PCo
1 uX1 "
HO^I
o'V \H
4
C74HiooOi7Ni8CoP
In einer Glove-box wurden 110,7 mg (8,22-10-5 mol) Aquocobalaminchlorid (9) in 5 ml
einer 0,1 M Lösung von Tetrabutylammoniumperchlorat (TBAP) in Methanol gelöst, sodann in
einer Elektrolyseapparatur, vgl. [105], bei einem Potential von -0,6 V innert 2 Stunden
unter Braunfärbung zu Co(ll)-cobalamin und anschliessend bei -1,00 V unter Grünfärbung zu
Co(l)-cobalamin reduziert. Nach vier Stunden gab man 116,9 mg (3,58-10"4 mol, 4,4
Äquivalente) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin, gelöst in 0,5 ml einer 0,1 M
methanolischen TBAP-Lösung, zu und entnahm nach weiteren sechs Stunden bei einem
Potential von -1,0 V (Stromverbrauch 2,3-10-4 Faraday, 2,8 Äquivalente) die Lösung der
Glove-box.
Aus der am Rotationsverdampfer auf ca. 2 ml eingeengten Reaktionslösung fiel mit 50 ml
Aceton rotes, gemäss DC mit Alkylierungsmittel verunreinigtes 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin(4) aus (insgesamt 120,3 mg), das nach nochmaliger Fällung mit 50 ml Aceton aus 5 ml H20ein DC-einheitliches Produkt ergab.Man trocknete den Niederschlag am Rotationsverdampfer, löste in möglichst wenig (ca. 10 ml)
H20 und engte dann wiederum am Rotationsverdampfer bei RT auf ca. 1 ml ein. Nach Zugabe von
Aceton bis zur beginnenden Trübung (ca. 2,5 ml) kristallisierten bei -20 °C innert zwei Ta¬
gen 99,5 mg (75%) 1 ,N6-Ethenoadenosincobalamin (4) aus.
Die am HV während vier Tagen getrockneten Kristalle gelangten zur Charakterisierung.
143
C74H1CXA7N1SCOP
mw. 1603,639
CAS-No. 54635-00-6
DC (Kieselgel C-18 (RP-18), 0,1 M Phosphatpuffer pH 7/ Methanol, 4:5)
rf= 0,72
UV/Vis (H20, c- 2,00- 10*M)
226
275
335
498
( 56'914), sh
22'700),
12'400), sh
7'000), sh
259
287
375
524
23'830),sh
19'400),sh4'200),
7'900)
265
310
438
(25'100),
(14'000),sh( 6'970),sh
UV/Vis (H2O+10% CF3COOH, C= 2,50- W5 M)
265
299
344
35'120),
21'320),sh
10'880),sh
273
313
378
( 31'080),sh
18'800),sh
7'600),sh
285
324
455
(26'920),
(16'440),sh( 8-600).
UV/Vis (CH3OH, c= 2,50-10-sM)
227
275
335
497
( 56'560),sh
23-520),
13'040),sh
7'120),sh
259
289
374
519
26'400),20-800), sh
10'560), sh
7'360).
265
300
442
(27'360),
(16'240), Sh
( 4-720), sh
UV/Vis (CH3OH+10% CF3COOH, c= 1,25-W5M)
264 ( 36'360), 273 ( 3V100),Sh 284
301 ( 22-100), 313 ( 19-300),Sh 325
377 ( 7'730), 455 ( 8'400)
(27'400),
(16'300),Sh
CD
Abb. 10
Allg. Teil
(H2O, c= 2,00-10-* M)
222
298
387
555
-23,30),
4,25),4,75),
-7,50),
239 (333 (429 (
17,50),1.75),
-2,75),
273 (360 (482 (
X0 bei 232, 257, 322, 340, 376, 406, 450, 520
4,25),
-7,75),
8,50),
144
©
Abbildung 58: CD-Spektrum von 1.N^-Ethenoadenosylcobalamin (4) in
Methanol, c= 1,2510-s M
(H^+10% CF3COOH, c= 2,50-10-5M)
262 (329 (431 (
-17,00),
23,60),
-10,20),
280 (377 (506 (
-5,20), Sh
-1,80),
-5,40),
305
400
572
5,40),sh
1.40),
4,00),
X0 bei 292, 364, 390, 406, 532
58
(CH3OH, c=1,25-10-s M)
224 ( -16,40), 239 ( 17,60), 263 ( -4,40),280 ( -4,00), 286 ( -2,40), Sh 300 ( 4,00),333 ( 4,40), 361 ( -7,60), 387 ( 2,40),429 ( -3,20), 482 ( 10.00J, 551 ( -7,60),
X0 bei 233, 253, 292, 344, 378, 400, 450, 516, 604
145
C D (CH3OH+10% CF3COOH, c= 2,2510-5 M)
263 ( -24,70), 280 ( -8,00), Sh 305 ( 7,56),sh329 ( 24,70), 377 ( -1,78), 400 ( 2,22),430 ( -7,56), 505 ( -5,78), 567 ( 4,22),
X0 bei 292, 361, 390, 409, 465, 534
(1,0 mg in 300 mg KBr)Abb. 59
3390 (s) 3190 (s) 2970 (m) 2940(m)1665 (s) 1645 (s) ,
sh 1620 (s) 1570(m)1540 (w) 1490 (m) 1465 (m), sh 1450(w)1400 (m), sh 1385 (m) 1350 (w) 1330(w)1300 (m) 1225 (m) 1155 (w) 1135(m)1095 (m) 1070 (m) 1045 (m), sh 1010 (w), sh
995 (w) 920 (w), sh 905 (w) 870 (w)845 (w) 815 (w) 730 (w), sh 700 (w)650 (m) 625 (m) 565 (m) 460 (w), sh
435 (w), sh
1 H-NMR (CD3OD, c= 9,36-103 M, 300,13 MHz)Abb. 13
Allg. Teil 9,13 ppm8,11
8,03
7,57
7,13
7,08
6,37
6,17
5,95
5,75
4,71
4,25-4,50
4,20
4,12
3,90-3,50
3,04
2,95
2,78
2,66
2,54
2,51
2,25
2,24
1,77
s, 1 H A-2 oder 8
s, 1 H A-8 oder 2
d, 1 H J = 1,6 Hz A-10 oder 11
d, 1 H J = 1,6 Hz A-10 oder 11
s, 1 H B7
s, 1 H B2
s, 1 H B4
d, 1 H J = 3,1 Hz R1
s, 1 H 10
d, 1 H J = 2,7 Hz A 1'
d+1:,1 H Jd= 4,3 Hz Jt=8,0 Hz R3
m, 5H Pr2,19,R2,A12
t, 1 H J = 3,7 Hz 3
m, 1 H R4
m, 4H R5, A13, Pr1
dd, 1 H Jl =14,0 Hz; J2=10,7 Hz 8
d, 1 H J = 9,1 Hz 13
m, 1 H 18
t, 1 H 181
s, 3H 51 oder 151
s, 3H 51 oder 151
s, 3H B51 oder B61
s, 3H B51 oder B61
s, 3H CH3
146
i ' ' ' i i ' ' ' i ' i i '—' i , i i i i i i i i i i i i i i i i , i i i i i
4000 3'500 3XX» 2500 2000 1800 1'600 1'400 1200 1000 800 600 400
cm-1
Abbildung 59: IR-Spektrum von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) in KBr (1
mg in 300 mg KBr)
o
H//OC
}CH, \.cr" f"1' ^CONH,
Hl «ÄCC0P0-%H (*)
HUL ,„VJ,.,,,, wUxhuÜp i.^iH.<Jj|„lllll,l|^ a>,.,mM300 400 500 600 700 000 900 1000 UOO 1200 1300 140015001600
u.on
.9.0B6
.1.0(6
7.0B6
.6.016
.5.016
.4.016
J.OS«
.2.0B6
L1.0B6
.0.010
noo M/Z
Abbildung 60: FAB(+)-MS-Spektrum von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4),Matrix 3-NOBA
147
2,60-1,40 m, ca. 19 H
1,38 s, 3H
1,34 s, 3H
1,29 s, 3H
1,21 d, 3H
1,08 m, 1 H
0,68 s, 3H
0,55 m, 1 H
0,51 s, 3H
CH3
CH3CHi
J= 6,3 Hz Pr 3
A5'ß12B
A5'a
1A
zugeordnet analog [108]
1H-NMR (CD3OD+10% CF3COOD, c= 8,42-10'3 M, 300,13 MHz)
Abb. 14
Allg. Teil 9,42 ppm s, 1 H A-2 oder 8
9,31 s, 1 H A-8 oder 2
8,35 d, 1 H J« 2,1 Hz A-10 oder 11
8,33 s, 1 H B-2
7,99 d, 1 H J = 2,0 Hz A-10 oder 11
7,67 s, 1 H B 7 oder 4
7,58 s, 1 H B 7 oder 4
6,86 s, 1 H 10
6,52 d, 1 H J« 4,6 Hz R1
5,73 d, 1 H J* 1,8 Hz A-1-
4,91 m, 2H
4,78 d, 1 H J- 10,5 Hz 19
4,65 m, 1 H
4,43 m, 2 H J=ca.7,6 Hz
4,20 d, 1 H J = 7,0 Hz
3,90-3 ,70 m, 3H
3,40 m, 1 H
3,00 m, 1 H 1 8
2,71 m, 2H J=ca.5,5 Hz u.a 181
2,48 s, 3H 51 oder 151
2,43 s, 3H B51 oder B61
2,42 s, 3H B51 oder B61
2,40 s, 3H 51 oder 151
2,60-1 ,50 ca. 27 H (ohne bereits zugeordnete)
1,74 s, 3H CH3
1,61 s, 3H CH3
1,50-1 ,40 2 H (ohne bereits zugeordnete)
1,45 s, 3H CH3
1,38 s, 3H CH3
1,20 d, 3H J- 6,3 Hz Pr 3
0,95 s, 3H 12B
0,88 s, 3H 1A
0,33 t, 1 H J. 8,8 Hz A5'a
zugeordnet analog [107]
148
13C-NMR (D20, c= 1,86 1(r2 M, 100 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)
17,93 (qjc C-51 ) 18,49 q,1C C-151 ) 19,24 (q,1C C-17B )
19,50 (q>1c C-2A ) 21,21 q,1C C-7A ) 21,38 (q,1C Pr3 )
21,88 (q.ic B-61 ) 22,15 q,1C B-51 ) 23,15 (q,1C C-1A )
23,63 (q.ic C-12A ) 27,3 t,1C A-5' ) 28,35 (t,1C C-81 )
28,91 (t,1C C-31 ) 29,98 t,1C C-131 ) 33,94 (q,1C C-12B )
34,15 (t,1C C-171 ) 34,35(t ,30,181/82/172)37,73 (t,1C C32/132)
37,85 (t,1C C32/132) 42,24 d,1C C-18 ) 44,80 (t,1C C-71 )
45,91 (t,1C C-21 ) 47,36 t,1C Pr-1 ) 49,06 (s,2C C-2/12 )
51,55 (s,1C C-7 ) 52,76 q,1C MeOH ) 55,42 (d,1C C-13 )
56,97 (d,1C C-8 ) 58,01 d,1C C-3 ) 60,48 (s,1C C-17 )
62,94 (t,1C R-5 ) 71,65 d,1C R-2 ) 75,51 (d,1C A-2' )
75,77 (d,1C Pr2 ) 76,09 d,1C R 3 ) 76,23 (d,1C C19+ )
84,0 (d,1C A-3' + ) 84,07 d,1C R-4 ) 88,00 (d,1C A-4' )
88,39 (s,1C C-1 ) 88,96 d,1C R-1 ) 91,26 (d,1C A-1' )
97,51 (d,1C C-10 ) 106,6 s,1C C-15 ) 108,1 (s,1C C-5 )
113,1 (d,1C B-7 ) 115,6 d,1C,A-10/11) 121,0 (d,1C B-4 )
124,9 (s,1C A-5 ) 133,0 s,1C B-8 ) 134,0 (s,1C B-5 )
134,9 (d,1C A-10/11) 136,3 s,1C B-6 ) 140,0 (d,1C A-2 )
140,7 (s,1C A-4/6 ) 140,9 s,1C B-9 ) 143,1 (d,1C A-8 )
143,4 (s,1C A-4/6 ) 144,3 d,1C B-2 ) 166,1 (s,1C C-6 )
166,8 (s,1C C-14 ) 172,8 s,1C C-9 ) 177,3 (s,1C C-11/72)
177,3 (s,1C C-11/72) 177,8 s,1C C-173 ) 178,4 (s,1C C-4/16 )
178,4 (s,1C C-4/16) 178,7 s,1C C-182) 179,0 (s,1C C-22 )
179,9 (s,1C C-83 ) 180,7 s,1C, C133/33) 180,8 (s,1C C133/33)
interpretiert auf der Basis von [108], ^Zuordnung in Analogie zum 13C-NMR des
Ethylcobalamin (5)
MS
Abb. 60
(FAB(+), 3-NOBA, m/z 50-V700)
1606,8(11,1) 1605,7(33,3)
1603,6 (100,0, M+) 1602,5 (11,1)
1351.5 (55,6, [M-(eAdo)]+Na+)
1332,7(5,6) 1331,6(22,2)
1329.6 (83,3, [M-(eAdo)]+H+)
1327,6 (11,1) 1285,6 (5,6)
1125,5 (5,6)
1625,6 (5,6, M+Na+)
1604,6 (77,8, M+H+)
1601,6 (5,6)
1343,6 (5,6)
1330,6 (61,1)
1328,5 (16,7, M-(eAdo))
1183,5 (5,6, M-(Benzimid SeAdo))
1070,5 (5,6, M-(Benzimid&Ribose&eAdo)
989,5 (5,6, M-(Benzimid&Ribose&eAdo&Phosphat))972,5 (5,6) 971,5 (11,1) 859,4
813,4 (5,6) 803,0 (22,2, M+2H+) 802,4
801,4 (11,1) 665,2 (11,0, [M-(eAdo)]+2H+)
(5,6)
(22,2, M+2H+)
149
Überführung der Base-off in die Base-on-Form
Die Probenlösung für das 1 H-NMR-Spektrum in 10%igem CF3COOH in Methanol wurde durch
eine SepPack-Kartusche gespült, wobei das Cobalamin 4 als braunes Adsorbat haften blieb.
Nach Waschen mit zuerst 5 ml wässriger NaHC03 Lösung (unter Farbumschlag nach rot) und
20 ml H20, eluierte die base-on Form mit 5 ml Methanol. Man trocknete am Wasserstrahl. Aus
0,1 ml H20 und 3 ml Aceton kristallisierten bei -20 °C innerhalb 2 Tagen 80% (7,5 mg)dunkelrotes 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)aus.Die am HV während drei Tagen getrockneten Kristalle wurden Spektroskopien.
1H-NMR (D20, C= 8,42-W3 M, 300,13 MHz)Abb. 11
Allg. Teil 8,96 ppm s, 1 H A-2
8,03 s, 1 H A-8
7,90 d, 1 H J = 1,6 Hz A-10 oder 11
7,50 d, 1.H J = 1,6 Hz A-10 oder 11
7,05 d, 1 H B7
6,85 s, 1 H B2
6,15 d, 1 H J = 3,0 Hz R1
6,12 s, 1 H B4
5,83 s, 1 H 1 0
5,57 d, 1 H J = 2,8 Hz A 1'
4,63 m, 1 H R3
4,48 m, 1 H A 12
4,26-4 ,12 m, 3H Pr2,C19,R2
4,00 m, 1 H C3, R4
3,80 d, 1 H J = 6,7 Hz R5' oder A 3'
3,78 d, 1 H J = 6,3 Hz R5' oder A 3'
3,64 dd, 1 H Ji = 3,6 Hz J2=3,8 Hz R5"
3,45 d, 1 H J = 13,7 Hz Pr 1-
3,16-3 ,01 m, 2H 8, Pr 1"
2,86 d, 1 H J = 10,1 Hz 13
2,70-2 ,20 ca. 18 H
2,36 s, 3H 51 oder 151
2,33 s, 3H 51 oder 151
2,20-1 ,80 ca. 9H
2,09 s, 3H 5 oder 15
2,08 s, 3H 5 oder 15
1,80-1 ,40 ca. 11 H
1,55 s, 3H CH3, 7A
1,30 s, 3H CH3,2Aoder 17B
1,27 s, 3H CH3,2Aoder 17B
1,22 s, 3H CH3,12A1,12 d, 3H J = 6,3 Hz CH3, Pr3
0,83 s, 3H CH3, 12B
0,75 m, 2H
0,54 t, 1 H J = 9,2 Hz A5'a
0,37 s, 3H CH3,1Azugeordnet analog [108]
150
1H-NMR (D20+10% CF3COOD, c= 7,58W3M, 300,13 MHz)Abb. 12
Allg. Teil 8,89 ppm S, 1 H A-2 oder 8
8,71 s, 1 H A-8 oder 2
7,84 d/s, 2H A-10/ oder 11
7,51 d, 1 H J = 2,2 Hz A-10 oder 11
7,06 s, 1 H B7 oder 4
7,03 s, 1 H B7 oder 4
6,41 s, 1 H C 10
6,04 d, 1 H J = 5,0 Hz R1
5,23 d, 1 H J = 1,7 Hz A 1-
4,49 t'oid,
1 H J = 4,5 Hz R2
4,41 m, 1 H R3
4,25 m, 2H 19 & R4
3,91 m, 1 H Pr 2
3,86 d, 1 H J = 5,5 Hz A2'
3,74 d, 1 H J = 9,5 Hz 3
3,42 m, 2H A 3' &. R 5
3,34-3 ,29 m, 1 H R5
3,20 m, 1 H 8
2,84-2 ,77 m, 2H Pr 1 & C13
2,39 m, 1 H 18
2,27 d'oid,2 H J = 5,4 Hz 60
2,20-1 ,50 ca. 24 H (ohne bereits zugeordnete)1,90 s, 3H 51 oder 151
1,86 s, 3H B51 oder B61
1,81 s, 3H B51 oder B61
1,79 s, 3H 51 oder 151
1,50-0 ,80 ca,.13 H (ohne bereits zugeordnete)
1,26 s, 3H CH3, 7A
1,10 s, 3H CH3,12A
0,95 s, 3H CH3
0,88 s, 3H CH3, 17B
0,70 d, 3H J = 6,3 Hz CH3, Pr 3
0,40 s, 3H CH3, 12B
0,35 d, 1 H A5'ß
0,29 s, 3H CH3,1A- 0,25 t, 1 H J = 8,9 Hz A5'a
zugeordnet analog [106, 107]
151
6.3 Orientierende Experimente zur Synthese anderer Organocob¬alamine
6.3.1 Methylcobalamin (2)
CONH, CN
HfiOC
HflOC
1 <£K1 H H0,
o'V \h
10
C63H88N14O14PC0
HflOC
HJiOC
1 <iX1 » «VI
ö'V \h
2
C63Ha,lN13014PCO
Bi2r (3) wurde aus 925,5 mg (6,83-10-4 mol) Vitamin Bi2 (10) durch katalytischeReduktion hergestellt [148] und mit 20 ml Aceton aus 3 ml Methanol quantitativ gefällt.
Die Synthese des Methylcobalamin (2) erfolgte via Umsetzung von elektrochemisch (2,16-10"3 Faraday, 3,16 Äquivalente) erzeugtem Co(l)-cobalamin mit Methyltosylat analog der
Synthese des Ethylcobalamins (5). Es wurden 367 mg (45%) kristallines Methylcobalaminerhalten.
Das UV/vis-Spektrum der Kristalle stimmt mit den Literaturwerten überein.
CraHcjiNisOMPCo
mw. 1344,413
CAS-No. 13422-55-4
152
1 H-NMR (D20. c-1.06-10'2 M, 300,13 MHz)
7,18 s, 1H B-7
6,99 S, 1H B-2
6,30 S, 1H B-4
6,26 d, 1H J= 3,20 Hz R-1
5,94 s, 1H C-10i
unter HDO R3
4,33 q. 1H J= 2,30 Hz Pr2
4,24 t, 1H J- 3,85 Hz R2
4,06 m, 2H R4, (D-19
3,98 d, 1H J= 9,98 Hz C-3
3,89 m, 1H R5'
3,74 m, 1H J,=12,60Hz J2==3,83Hz R5"
3,55 d, 1H J=14,00 Hz Pr1"
3,35 m, 1H C-8
3,08 m, 2H C-13,,PrV
2,80-1 ,60 ingesamt 33 H
2,49 s, 3H CH3 C-51 oder 151
2,46 s, 3H CHs C-51 oder 151
2,23 s, 3H CH3 B51 oder 61
2,22 s, 3H CH3 B51 oder 61
1,78 s, 3H CH3 C-7A
1,50-0 ,80 insgesamt 16 H
1,41 s, 3H CH3 C2A/17B/12A
1,36 s, 3H CH3 C2A/17B/12A
1,33 s, 3H CH3 C2A/17B/12A
1,21 d, 3H J= 6,18 Hz CH3 Pr3
0,97 s, 3H CH3 C-12B
0,48 s, 3H CH3 C-1A
0,02 s, 3H CH3 Mfi-Co
Zugeordnet auf Basis von [118]
13C-NMR (020, c=1,21-10'2 M, 75 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)
17,99 (q,1C,51/151) 18,19 (q,1C,C51/151) 19,21 (q,1C C-17B )
19,33 (q1C C-2A ) 21 ,34 (q,2C, 7A,Pr3) 21,84 (q,1C B51.B61)
22,15 (q,1C B51.61) 22,47 (q,1C C-1A ) 22,79 (q,1C C-12A )
28,35 (t,1C C-81 ) 28,61 (t,1C C-31 ) 30,18 (HC, C-131 )
34,25 (t,1C C-171) 34,45 (t,3C C-181,82,172)
34,82 (q,1C C-12B) 37,44 (t,1C,C32/132) 37,67 (t,1C C-32/132)
41,62 (d,1C C-18 ) 45,35 (t,1C,C-71/21) 45,75 (t,1C C-71/21)
47,37 (t,1C Pr-1 ) 48,85 (s,2C,C-2,7,12) 49,06 (s,1C C-2,7,12)
52,76 (q,1C C0-CH3) 55,63 (d,1C C-13 ) 56,67 (d,1C C-8, 3 )
57,72 (d,1C C-8,3 ) 60,34 (s,1C C-17 ) 62,89 (t,1C R-5 )
71,47 (d,1C R-2 ) 75,42 (d,1C Pr-2 ) 75,63 (d,1C R-3 )
76,25 (d,1C C-19 ) 84,06 (d,1C R-4 ) 87,59 (s,1C C-1 )
88,89 (d,1C R-1 ) 96,46 (d,1C C-10 ) 105,94 (s, 1C C-15)
107,68 (s, 1CC-5) 113,03 (d, 1CB-7) 120,76 (d, 1C B-4)
132,95 (s, 1CB-8) 134,06 (s, 1CB-5) 136,28 (s, 1C B-6)
153
140,62 (s, 1CB-9) 144,38 (s, 1CB-2) 165,61 (s, 1CC-6/14)
166,02(s,1C, C6/14) 172,14 (s, 1CC-9) 175,87(s,1C,11,72,173)
177,39(S,2C,11,72,173)177,71(s,1C C-14,16) 177,85 (s, 1CC14.16)
178,68(s,1C,C182,22) 178,82(s,1C C182.22) 179,89 (s, 1C C-83)
180,59(s,1C,133/33) 180,75(s,1C C-133/33)
Zugeordnet auf der Basis von [108]
MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 38-1'420)
1351.49 (17,1, [M-CH3]+Na+) 1345,52 (31,6)
1344,52 (42,1, M+H+) 1343,51 (19,2, M+) 1336,49 (19,9)
1335.50 (26,6) 1331,52 (35,7) 1330,52 (72,4)
1329.51 (100,0,[M-CH3]+H+) 1328,49 (25,9)
1327,49 (25,6) 1314 (20,2") 1270 (13,5*)
1183 (16,8*,[M-(Benzimid &Me)])
1069 (23,6*, [M-(Benzimidazol&Ribose&Me)])1051 (13,4*) 989(26,9*, [M-(Benzimidazol&Ribose&Me&Phosphat)])
971,73 (22,2) 943 (10,1*) 931 (10,0*)
914 (10,0*) 898 (10,0*) 884 (10,0*)
870 (10,0*) 859 (10,0*) 841 (6,7*)
801 (26,9*)*
graphisch aus Spektrum bestimmt
6.3.2 Orientierendes Experiment zur Herstellung von Ethyl-cobalamin (5)
CONH, HJIOC
/> CH, f-CONH, J Hfi
w,.-**tr "
CONH,
1 vC
O' "o- \)o
3 5
C62H88N13O14PC0 C64H93N13O14PC0
154
Zusammen mit 350 mg (2,55-10-4 mol) B12r(krist.) (3) [148] wurden in einer Glove-box
(02< 6 ppm) 0,587 g (2,93-103 mol, 11,5 Äquivalente) Ethyltosylat in 7 ml 0,1 M UCIO4in einem 1:1 Gemisch Wasser/Methanol gelöst und in einer Apparatur gemäss [105] bei einem
Potential von -1,0 V elektrolysiert bis der Stromfluss auf weniger als 5% des Ausgangs¬wertes gefallen war (2,70-10-4 Faraday, 1,37 Äquivalente).Die Elektrolyseapparatur wurde nach UV/vis-spektroskopischer Kontrolle der Glove-box
entnommen, die nun rote Lösung abpipettiert, direkt mit 50 ml Aceton gefällt, noch zweimal
mit Aceton gewaschen und anschliessend getrocknet.
Der Niederschlag wurde in 2 ml Methanol gelöst, 20 ml Aceton zugegeben und lichtgeschütztbei 5 °C innerhalb von fünf Tagen 271,5 mg ockerfarbene Kristalle erhalten. Dieses
Kristallisat enthielt gemäss1 H-NMR-Spektrum noch 0,5 Äquivalente Ethyltosylat.
Nach einer zweiten, analog durchgeführten zwölfstündigen Kristallisation und Trocknung am
HV während 24 Stunden wurde das Produkt 5 (Ausbeute 101,1 mg, 29%) charakterisiert.
C64H93N130i4PC0
mw. 1358,440
CAS-No. 13422-56-5
UV/Vis (H20, C= 3,30-10-5 M)
266
313
447
( 17'400),
( 12'900),
( 3'820), sh
279
345
509
15'400)sh,
1V270) ,
7'920)
290
375
(14 900),
( 7'970), sh
CD (H20, c= 3,30-10-s M)
(231
288 (359 (501 (
1,89) ,256 (
3,18) ,sh 297 (
5,30) ,387 (
8,79) ,558 (
-9,24),
5,23),
5,61),
-3,86),
276 (328 (434 (
2,58),
-2,50),
-5,76),
X.o bei 225, 237, 269, 314, 374, 404, 459, 535
IR (2,0 mg in 300 mg KBr)
3360 (s) 3190 (s) ,2970 (m) 2940(m)
2870 (m)sh 2750 (w)sh 2550 (w)sh 2450(w)2410 (w)sh 2080 (w)sh 1660 (s) 1620 (s) sh',1565 (s) 1535 (m) ,
1490 (s) 1475 (S) sh,
1450 (m)sh 1390 (m) ,1350 (m) 1295(m)
1230 (s) 1210 (s) sh 1155 (m) 1135(m) sh',1105 (m) 1070(m) ,
1045 (m)sh 1020(m)
995 (m) 920 (w) ,900 (w) 865 (w)
845 (w) 810 (w) ,560 (m)
155
1H-NMR (D20, c= 2.1-102 M, 300,13 MHz)
7,17 S, 1H
7,03 S, 1H
6,28 S, 1H
6,24 d, 1H J= 3,1 Hz
6,07 s, 1H
4,45 m, 1H
4,35 m, 1H
4,26 t'oid,1H J= 1,8 Hz
4,14 m, 2H
4,05 d, 1H J= 8,6 Hz
3,90 m, 1H
3,75 m, 1H
3,53 d, 1H J= 14,0 Hz
3,39 m, 1H
3,19 m, 1H
3,16 m, 1H
2,80- 2,30 insgesamt ca. 22.5H
2,50 s, 3H
2,48 s, 3H
2,30- 1,60 insgesamt ca.24,5H
2,23 6H
2,21 12H
1,79 s, 3H
1,60-10,80 insgesamt <ca. 23H
1,46 s, 3H
1,39 s, 6H
1,20 d, 3H J= 6,3 Hz
1,08 s, 3H
0,90 d, br. 1H Ji= 3,9 Hz
0,62 t, 1H J= 3,9 Hz
0,52 s, 3H
-0,57 t, 3H J= 7,6 Hz
B-7*
B-2*
B-4*
R-1*
C-10*
R-3
Pr-2
R-2
R-4/C-19
C-3
R-5'
R-5"
Pr 1-
C-8
C-13
Pr-1"
C-51*
C-151*
B51/61*
C-7A*
C-12A*
C-17B/2A*
Pr-3*
C-12B*
Co-CH2 a*
Co-CH2 ß*C-1A*
CoCH2CHa*
[149 a]; Zuordnung der restlichen Signale analog [108]
1H-NMR (CD3OD, c= 5.89-10-3 M, 300,13 MHz)
7,14 S, 1H
7,13 S, 1H
6,39 s, 1H
6,18 d, 1H J- 3,2 Hz
6,12 s, 1H
4,69 m, 1H
4,36 q. 1H J= 7,5 Hz
4,30 d, 1H J= 8,9 Hz
4,22 t, 1H J = 3,8 Hz
4,16 m, 2H
3,88 dd, 1H Jt-3,0 Hz
B2/7
B2/7
B4
R1
C-10
R3
Pr2
C-19
R2
R4/C3
R5'
156
3,76 dd, 1H J= 4,4 Hz R5"
3,70 m, 2H C-8
3,59 d, 1H J=13,5Hz PrV
3,28 m, 1H (teilweise unter MeOH) C-13
3,05 m, 1H Pr1"
2,82 m, 1H C-18
2,63 m, 2H C-181
2,60-1,60 insgesamt ca. 38H
2,55 s, 3H C-51
2,53 s, 3H C-151
2,26 s, 3H B-51/61
2,25 S, 3H B-51/61
1,82 s, 3H C-7A
1,60-1,30 insgesamt ca. 19H
1,50 s, 3H C-12A
1,39 s, 3H C-2A/17B
1,30-1,00 insgesamt 8H1,38 s, 3H C-2A/17B
1,22 d, 3H J=6,3 Hz Pr3
1,10 S, 3H C-12A
0,73 t, 1H J=7,4 Hz Co-CHja0,55 S, 3H C-1A
-0,53 t, 3H J=7,6 Hz Co-CH2CJdaZuordnung der Signale analog Spektrum in D20
13C-NMR (D20, c= 4.03-10-2 M, 75 MHz, breitbandentkoppelt & dept)
18.01 (q,2C C51.151) 19,20 (q,1C C-17B ) 19,83 (q, 1C C-2A
21,11 (q,1C C7A,Pr3) 21,63 (q,1C C7A,Pr3) 22,14 (q, 2C B51.61
22,30 (q,1C C-1A ) 24,63 (q,1C C-12A ) 28,52 (t, 1C C-81
28,68 (t,1C C-31 ) 29,42 (t,1C C-131 ) 33,94 (t, 1C C-171
34.02 (q,1C C-12B ) 34,63 (t,2C,181,82,172)34,94 (t, 1C 181,82,172)
36,06 (t,1C 32,132) 37,68 (t,1C 0-32,132)41,87 (d, 1C C-18
45,42 (t,1C C71.21 ) 45,73 (t,1C C-71,21) 47,10 (t, 1C Pr-1
48,58 (s,1C C-2, 12) 49,10 (s,1C C-2,12 ) 51,45 (s, 1C C-7
52,41 (q.1C.CoCH?CHa> 55,33 (d,1C C-13 ) 57,43 (d, 1C C-8,3
57,85 (d,1C C-8, 3 ) 60,77 (s,1C C-17 ) 63,28 (t, 1C R-5
72,77 (d',1C,CoCÜ2CH3) 72,85 (d,1C R-2 ) 75,10 (d, 1C Pr2
76,52 (d,1C,R-3/C19) 77,14 (d,1C R-3/C19) 86,28 (d, 1C R-4
88,34 (s,1C C-1 ) 89,19 (d,1C R-1 ) 98,04 (d, IC C-10
107,79(s,1C, C-15 ) 109,17 (s, 1C C-5) 114,10 (d, 1C B-7
127,90(d,1C B-4 ) 131,97 (s, 1C B-8) 132,40 (s, 1C B-5,6,9
136,48(s,1C B-5,6,9) 137,56 (s, 1C,B5,6,9)142,63 (I, 1C B-2
165,62(s,1C C-6,14 ) 165,90 (s, 1C,C6,14) 172,86 (s, 1C C-9
176,78(s,1C,11,72,173)177,68(s,2C,C11,72,173)177,84 (s, 1C C-14,16
178,01(s,1C,C-14,16) 178,73 (s, 2C,182,22)180,18 (s, 1C C-83
180,57(s,1C,C-133,33) 180,71 (s, 1C,133,33)
zugeordnet analog [108], i. Multiplizität inkompatibel mit Zuordnung, ?. Zuordung ten-
tativ
157
MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 50-V400)
1359 (7,6*, M+H+) 1332,72
1330.70 (100,0, M-Et) 1329,69
1327.71 (12,8
1184 (5,0*;
1069 (7,5*,1051 (7,5*
972,80 (14,9]
(36,0 ) 1331,72 (69,0)
(72,8 ) 1328,70 (20,7)
) 1312 (10,0*,-CONH2)1271 (5,0*)
M-(Ethyl&Dimethylbenzimid) )
M-(Et&Benzimid&Ribose )) 1052 (10,0*)
989,5 (10,0, M-(Benzimid &Ribose&Et&Phosphat))802 (10,0)
Intensität graphisch bestimmt
6.3.3 Vinylcobalamin (23)
HJtOC
HJtOC
CONH, CJV
1 X HO I
o"o
1 %xx1 X H0 l
o'' \V„
0 0-^OH
10
C63H88N14OHPC0
23
C64H9lN13014PC0
Cyanocobalamin (10), 1,088 g (8,03-104 mol), wurde in 14 ml Wasser/Methanol, 1:1,
gelöst, in einer Glove-box mit 22,2 mg (9,78-105 mol) Platindioxid, 120 ul Essigsäurewährend drei Stunden zu Co(ll)-cobalamin (3) (UV/vis-spektroskopische Kontrolle)reduziert, anschliessend die Lösung durch Watte filtriert und am HV getrocknet.Man beschickte eine Elektrolyseapparatur [105] in der Glove-box mit dem in 5 ml 0,1 M
LiCI04, H20/MeOH, 1:1, gelösten Co(ll)-cobalamin (3), und führte nach Entnahme der bis auf
einen definierten Auslass gasdichten Apparatur aus der Box die Elektrolyse bei -1,0 V in einem
schwachen Ethinstrom durch.
158
Nachdem der Stromfluss auf weniger als 5 % des Ausgangswertes gefallen war (2,02-10"3Faraday, 2,51 Äquivalente e~), pipettierte man die Lösung ab, entfernte das Methanol am
Rotationsverdampfer und versetzte den mit 10 ml Wasser aufgenommenen Rückstand bis zur
beginnenden Trübung mit ca. 80 ml Aceton. Nach vier Tagen bei Raumtemperatur bildeten sich
0,914 g (84 %) dunkelrote Kristalle, die noch mit Aceton gewaschen und vor der
Charakterisierung vier Tage am HV getrocknet wurden.
C64H91N13O14PC0
mw. 1356,424
CAS Nr. 15053-74-4
UV/Vis (H20, c=2,50-10-5 M)
272 ( 15-200),371 ( 10'440),
288 ( 12'960),475 ( 4 -300),
Sh
Sh
337 ( 10'920)521 ( 7'040)
CD (H20, c=2,50-10-5 M)
230
287
331
402
1,50),
1,30),0,40),
3,80), sh
257 (296 (356 (467 (
-10,50),
3,10),-8,90),
8,10),
278
320
388
551
-0,70),
-2,00),
4,70),
-4,10),
Sh
X0 bei 221, 240, 282, 312, 328, 334, 376, 520, 605
IR (2,0 mg in 300 mg KBr)
3350 (s), 3190 (s), 2970 (m), 2940(m),2880 (m), sh 2760 (w) sh 2160 (w), br 1665(s),1615 (s), 1570 (s), 1545 (m), sh 1495(s),1485 (m), sh 1450(m) 1400 (s), 1365(m),1350 (m), 1310(m) 1295 (m), sh 1260{m),1220 (m), 1155(m) 1120 (m), 1110(m),1085 (m), 1070(m) sh 1045 (m), sh 1000(m),975 (w), 950 (w) sh 870 (w), 850 (w),810 (w), 625 (m) 585 (m), 565 (m).
sh
1H-NMR (D20, c= 1,05-10-2M, 300,13 MHz)
7,20 s, 1 H B7
7,10 s, 1 H B4
6,39 s, 1 H C-10
6,28 d, 1 H J= 3,08 Hz R1
159
5,93 s, 1 H
5,65 m, 1 H J1=6,0 Hz, J2= 14,6 Hz H^CCH
4,33 m, 1 H
4,25 t'oid,1 H J=ca.3,7 Hz
4.19 d'oid,1 H J=ca.4,0Hz HfrHciSCCH
4,08 m, 3H
3,92 m, 1 H
3,75 m, 1 H
3,59 d+d, 2H HtrHcfeCCH3.33 m, 1 H
3.20 d, 1 H J= 8,73 Hz
3,05 m, 1H Pr-1'
2,61 's',14H
2,54 s, 3H C-51/151
2,52 s, 3H C-51/151
2,70-2,38 m, insgesamt ca. 20H
2,24 s, 6H B-51/61
1,81 s, 3H CH3
2,38-1,60 m, insgesamt ca. 29H
1,42 s, 3H CH3
1.34 s, 3H CH31,29 s, 3H CH3
1,22 d, 3H Pr3
1,03 s, 3H C-12B
1,18-0,80 m, insgesamt 6 H
0,47 s, 3H C-1A
Zuordnung der restlichen Signale analog [108, 149 a]
Entkopplungsexperimente
eingestrahlt Beobachtung
5,68 ppm d (4,21) zu S
d (Signale 3,59 & 3,64) zu s
13C-NMR (D20, c=1,05-10-2 M, 75 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)
17,87 (q,1C C-51 ) 18,06 (q,1C C-151 ) 18,68 (q. 1C C-17B )
19,29 (q,1C C-2A ) 21,30 (q,1C C-7A ) 21,81 (q, 2C Pr3, B61 )
22,20 (q,1C B-51 ) 22,30 (q,1C C-1A ) 22,77 (q, 1C C-12A )
28,57 (t,2C C81.31 ) 30,58 (t,1C C-131 ) 33,57 (q, 1C C-12B )
34,37 (t,3C,82,171,172,181) 34,61 (t, C 82,171,172,181
37,39 (t,1C C32/132) 37,68 (t,1C C32/132) 41,47 (d, 1C C-18 )
45,13 (t,1C C-71 ) 45,52 (t,1C C-21 ) 47,41 (t, 1C Pr-1 )
48,90 (s,1C C-2,12 ) 49,33 (s,1C C-2,12 ) 52,65 (s, 1C C-7 )
55,78 (d,1C C-13 ) 57,30 (d,1C C-8 ) 58,12 (d, 1C C-3 )
60,53 (s,1C C-17 ) 62,82 (t,1C R-5 ) 75,39 (d, 1C R-2/Pr2 )
75,56 (d,1C R2/Pr2) 76,64 (d,1C C-19 ) 83,96 (d, 1C R-4 )
84,08 (t,1C CoCHCJd2) 87,60 (s,1C C-1 ) 89,02 (d, 1C R-1 )
96,60 (d,1C C-10 ) 106,27(s,1C, C-15 ) 108,24 (s, 1C C-5 )
113,07 (d, 1C B-7) 120,87(!1C, B-4 ) 122,88 (I, 1C CoCüChfc )
160
132,85 (s, 1C B-8) 134,18(s,1C, B-5 136,38 (s, 1C B-6 )
140,48 (s, 1C B-9) 144,64(I1C B-2 165,75 (s, 1C C-6 )
166,22 (s, 1CC-14) 172,91(s,1C, C-9 176,51 (s, 1C C-11/72 )
177,23 (s, 1CC11/72)177,73(s,1C, C-173 177,90 (s, 1C C-4/16 )
178,09 (s, 1CC4/16) 178,73(s,1C, C-182 178,91 (s, 1C C-22 )
179,95 (s, 1CC-83) 180,63(s,1C,133/33 180,86 (s, 1C C-133/33)
zugeordnet analog zu [107], '
Zuordnung
experimentell bestimmte Multiplizität inkompatibel mit
MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 38 -V400)
1394,75
1362,82
1336,83
1255,78
1096,78
1002,73
989,76
971,78
888,68
868,66
829,71
681,53
655,45
(4,2*
(66,
02,
(4,2
(4,2,
(4,2
(4,2,
(4,2
(4,2
(4,2
(4,2
(4,2
(4,2
M+K+) 1378,73
1357,85
1335,77
1254,85
(8,3,M+Na+)
(70,8)
(12.5)
(4,2)
1363,83
1356,81
1329,78
1151,74
1015,80M-(Vinyl&Benzimidazol&Ribose))
) 998,82 (4,2)
M-(Vmyl&Benzimidazol&Ribose&Phosphat))
) 912,64 (4,2) 910,62
) 886,67 (8,1) 871,61
) 858,63 (4,2) 842,69
) 770,57 (4,2) 697,50
) 678,53 (4,2) 669,47
) 626,44 (4,2) 596,41
(41,6)
(100,0, M+H+)
(16,7,M-Vinyl)
(4,2)
(4,2)
(4,2)
(4,2)
(4,2)
(4,2)
(4,2)
(4,2)
161
6.3.4 Dicyanocobalamin (11)
HJ40C
hjoc
n H ho^j
O o. \»
CONH,
CONHj CN
HiNOC
10
C63H88N14O14PC0
1 1
C64H88N15014PC0K
5,5 mg (4,6-10'6 mol) Cyanocobalamin (10) und 0,5 mg KCN0"3'- (7,68-1 Qe mol) wurden
in 0,7 ml Deuteriumoxid gelöst und nach Ereichen des Endpunktes der Farbvertiefung
(UV/vis-Kontrolle) die Lösung UV/vis- und 1H-NMR-spektroskopisch charakterisiert.
C64H88N15014PC0K
mw. 1420,512
UV/Vis (H20, c= 1,16.10-4M, 1,95-W4 M KCN, dx= 0,100 cm)Abb. 15
Allg. Teil 578 ( 9500), 541 ( 9320), 501
418 ( 2820), 366 ( 31400), 306
285 ( 16700), 277 ( 16850).
( 6070),
( 11030),
1H-NMR (D20, c= 6,56.10-3M, 1.10-10-3 M KCN, 300,13 MHz)Abb. 61
8,26 ppm S, 1 H
7,43 S, 1 H
7,31 S, 1 H
6,27 d, 1 H J= 4,31 Hz
5,79 s, 1 H
4,60 t, 1 H J= 4,51 Hz
162
4,47
4,27
3,80
3,64
3,59
3,29
3,17
3,12
2,70
2,65-2,35
2,35-2,10
2,25
2,24
2,14
2,30-1,80
1,80-1,50
1,60
1,32
1,30
1,25
1,18
1,12
1,08
m,
m,
qd,d,
d,
m,
d,
m,
m,
1 H
1 H
2H
1 H
1 H
2H
1 H
1 H
1 H
insgesamt 5 H
insgesamt 21 H
s, 3H
s, 3H
s, 6H
ca. 6H
insgesamt 7 H
s, 3H
3H
3H
3H
3H
3H
3H
J= 2,5 Hz
J= 7,34 Hz
J=10,36 Hz
J= 6,46 Hz
J=15,3 Hz
CH3CH3CH3
CH3Pr3
CH3CH3
CONH, CN
J HjC* f-CONH,
ppm 8
Abbildung 61: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyanocobalamin (11) in Deuteriumoxid, 10
mM KCN, c= 6,56.10"3 M, 300,13 MHz
163
6.4 Synthese micellartiger Cobyrinsäurederivate
6.4.1 Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat24 (24)
COOK
VYHjCOOC COOCH,
_». KOOC
CH, /-COOK
COOK
VYCOOK COOK
26
C54H730HN6CO
24
C47H52014N6CoK7
Man löste unter Rühren bei Raumtemperatur 1,800 g Cobester (26) (1.65-10'3mol) in 20 ml Methylenchlorid und gab 0,7 ml Trifluoressigsäure (9,16-10"3 mol)zu. Sobald der Farbumschlag von violett nach hellrot stattgefunden hatte, d.h. nach ca.
15 Minuten, wurde am Rotationsverdampfer und Hausvakuum das Lösungsmittelabgezogen.
Der Rückstand wurde anschliessend in 30 ml Essigsäure gelöst. Die gelöste Substanz
adsorbierte beim ersten Durchströmen durch 400 ml Dowex 50 WX 2 quantitativ. Man
wusch nun das Dowexharz mit 500 ml H20, suspendierte es in weiteren 700 ml H20und hielt die entgaste und unter Argon gesetzte Suspension vier Stunden lichtgeschütztbei einer Ölbadtemperatur von 70 °C.
Nach Abkühlen der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wurde die Lösung vom
Harz abfiltriert, mit 500 ml H20 gewaschen und in 700 ml H20 suspendiert. Sodann
wurde das Reaktionsgemisch gründlichst entgast und wiederum unter Argon gesetzt.Nach 21 Stunden heftigem Rühren unter Lichtausschluss bei einer Ölbadtemperaturvon 70 °C war die Reaktion gemäss DC beendet.
Auf das von der erkalteten Lösung abfiltrierte Harz wurde festes KHCO3 gegeben bis
weitere Zugabe nicht mehr von Schaumbildung begleitet war. Das Cobyrinat 24 wurde
24 Vorschrift nach R. Stepanek [91] mit veränderter Aufarbeitung
164
dann mit 400 ml ges. KHC03-Lösung, 0,1 g KCN pro Liter enthaltend, praktischquantitativ eluiert25.
Dieses Eluat wurde zur Entsalzung auf 100 ml XAD aufgezogen indem man die
Suspension von XAD in dieser wässrigen Lösung solange vorsichtig mit conc. H3P04versetzte bis die Lösung völlig entfärbt war26. Das XAD wurde vor Elution der
Substanz auf einer Glasfilternutsche (Porengrösse 3) mit ca. 200 ml H2Ö nun solangegewaschen, bis das Cobyrinat begann, sich vom Trägerharz abzulösen und dann die
Cobyrinsäure mit 300 ml Methanol, 1% HCN/ Aceton, 1:1, eluiert27.
Man engte die Lösung am Rotationsverdampfer bei RT bis auf ca. 1 ml ein (hellroteLösung), versetzte mit 2,2 ml einer 5 M wässrigen KCN-Lösung und lyophilisierteden Rückstand am HV. Das derart isolierte Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24) wurde in 15 ml 1% HCN/Methanol gelöst und fiel im Kühlschrank (T= 0 °C, 24
Stunden) bei Zugabe von 300 ml Ether praktisch quantitativ aus. Die farblose
Mutterlauge wurde abpipettiert, das Präzipitat nochmals mit Ether gewaschen und der
pulvrige Niederschlag zuerst im Stickstoffstrom, dann während 24 Stunden am
Hochvakuum getrocknet.Es resultierten 2,050 g (99%, 1,63 mM) violettes, schwach hygroskopischesPulver, welches charakterisiert wurde.
Lagerung des so erhaltenen Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) unter
Stickstoff und bei Lichtausschluss bei einer Temperatur von 5 °C führte gemäss 1H-
NMR-Spektrum in Deuteromethanol nach einem Jahr zu keiner beobachtbaren
Veränderung der Substanz.
mw. 1257,592
C47H52Oi4N6CoK7
DC (Kieselgel 60, i-Propanol/H20/1% HCN in MeOH/Et3N, 70:40:10:1)
rf= 0,20
(RP-18, 1% HCN in MeOH/H20, 10:1)
rf= 0,44
UV/Vis (H20, c= 4.51-10-5 M, 0,16 g KCN h1)Abb. 16
Allg. Teil 210 ( 5V620), 221 ( 47'100), 276 (10'320)302 ( 9-790), 311 ( 9'790), 348 (15'350)365 ( 31-500), 469 ( 3'180), 504 ( 6'090)535 ( 8-760), 576 ( 9'790).
sh
25 Farbwechsel von hellrot zu violett
26 Farbwechsel von violett zu hellrot
27 Farbwechsel von hellrot zu violett
165
t i
Abbildung 62: CD-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) in
Wasser, c=4,51-10"5 M, dx= 0,100 cm, 0,16 g KCN I"1
CD
Abb. 62
(H20, c= 4,51-10-5 M, 0,16 g KCN r1)
212 ( 7,76), 226 ( 7,76), 241 ( -5,99)249 ( -11,10), 274 ( 1,33), 285 ( 1,11)305 ( -11,10), 321 ( -6,87), 346 ( -10,90)366 ( -42,10), 395 ( 18,40), 424 ( 12,40),484 ( -1,70), 512 ( -3,33), 534 ( -4,66),574 ( -4,66),
X0 bei 236, 263, 289, 372, 464
(1,2 mg in 300 mg KBr)
3420 (s) 3250 (m) sh 2960 (m) 2930(m) sh
2500 (w), br 2140 (w) sh 2120 (w) 1770(w) ,sh
1695 (m) 1640 (m) sh 1580 (s) 1500 (s)1445 (w) 1400 (s) 1370 (s), sh 1355 (m) sh
1295 (w) 1220 (w) 1200 (w) 1155(m)1135 (w), sh 1105 (w) 1050 (w) 1020(w)
166
1H-NMR (D20, 300,13 MHz, c= 1,12 W2 M, 1,4 gl' KCN)Abb. 20
Allg. Teil 5,74 ppm s, 1 H C-10
3,81 d, 1 H J= 7,7 Hz C-3*
3,52 d, 1 H J= 10,3 Hz C-19*
3,45 m,1 H C-8*
3,04 m,1 H C-13*
2,77 t, 1 H J= 10,1 Hz C-18*
2,20 S, 3H C51 oder 151
2,18 S, 3H C51 oder 151
1,75- 2,63 insgesamt 27 H
1,63 s, 3H CH31,41 s, 3H CH3
1,39 s, 3H CH31,36 s, 3H CH3
1,19 s,3H CH31,07 S, 3H C-12B
1,00- 1,70 insgesamt 21H
laut Vergleichspektrum mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat-c-lacton (25)
verunreinigt, vgl 5,80 ppm (ca 5%) und Methylgruppenbereich,
die von Stepanek [91] beschriebenen Signallagen sind um 0,13 ppm bei höherem
Feld referenzler,
'zugeordnet mit H-C-COSY-Spektrum
13C-NMR (D20, c= 3,68-10-2 M, 0,5 gf1 KCN, 100 MHz, breitbandentkoppelt und
DEPT)
17,43 (q,lC )
20,28 (q,1C )
24,26 (q, 1C )
30,50 (t, 1C
36,54 (t, 1C
38,52 (t, 1C
48,50 (t, 1C
51,46 (s,1C,7,12,17)*
59,52 (d,1C C-3)
85,68 (s,1C
106,5 (s,1C
166,5 (s,1C
179,5 (s, 1C "
)
182,4 (s, 1C"
)
185,4 (s,1C"
)"
22, 33, 72, 83, 133, 1
[107], vgl auch [149 b],* irrtümlicherweise wurde
Wert 52,5 ppm angegeben
51,5 ppm auftrat
C-1 )
C-5 )
C6.14)
17,95
21,43
28,58
32,93
37,45
40,63
48,52
56,33
61,42
93,71
115,0
167,3
180,2
184,6
185,4
73, 182
(q,
(q,
(t,
(q,
(1,
(t,
(t,
(d,
(s,
(d,
(s,
(s,
(s,
(s,
(s,
& 4,
19,24 (q,1C21,46 (q,1C30,02 (t,lC36,00 (t,lC37,91 (t,lC43,02 (d,1C C18
49,73 (s,2C,C7,12,17
1C
1C
1C
1C C12B
1C
1C
2C
1C C-13) 57,29 (d, 1C C-8
1C C-2 ) 78,17 (d, 1C C-19
1C C-10) 105,4 (s, 1C C15
1C ) 142,5 (s, 2C CN
1C C6.14) 175,3 (s, 1C
1C "
) 181,8 (s, 1C
1C"
) 184,8 (s, 1C
1C "
16, 'zugeordnet aufgrund Analogie mit
von Stepanek [91] für das Signal bei 51,5 ppm der
obwohl im Originalspektrum das Signal ebenfalls bei
167
100-
90.
1» .0
70.
7B0 730 •Oft
1«B.3 I
lHr«rwr/jflHMiM«SO »00 »30 1000 1050 1100
Abbildung 63: FAB(+)-MS-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24), Matrix 3-NOBA
1H/13C-NMR
(H-C-COSY, D20, c= 3,68-10-2 M, 0,5 gr1 KCN )Abb. 18
Allg. Teil
8 1H / ppm 813C/ppm 81H/ppm 813C/
1,07 32,99 1,19 20,27
1,36 21,43 1,39 24,26
1,41 19,24 1,63 21,46
1,66 30,50 1.70&2.05 30,02
1.90&2.23 28,58 1,93&2,34 36,54
2,04&2,55 36,00 2,12&2,23&2,56 48,50
2,21&2,34 37,91 2,21 37,45
2,26 17,95 2,29 17,43
2,378i2,49 40,63 2,47ci2,67 38,52
2,8 43,02 3,1 56,33
3,5 78,17 3,55 57,29
3,9 59,52 5,9 93,71
MS (FAB(+), 3-NOBA, M/Z 500-1 300)Abb. 63
1295 (0,5; M+K+) 1280 (0,3; M+Na+) 1264,2 (1,0; +K+-2Na+)1258 (0,5, M+H+) 1225 (0,9;M-2CN+3H+) 1222 (0,4;M+-2CN+H2O)1211 (1,0; M-2CN-K++2Na+) 1210
1209,3 (1,7; M-3K++3Na++H+) 1202
11 2 8,2 (8; M-4K++Na++4H+) 1090,0
1051,3 (30; M-6K++Na++6H+) 1014,3
968,3 (14; M-CN-6K++Na++7H+) 537,1
500,1 (100; Ringfragment)
(0,6; M+H20-4K++4Na++H+)(1,0; M-2K++Na++2H+)
(18; M-5K++Na++5H+)
(22; M-7K++Na++7H+)
(57; Ringfragment+K+)
168
6.4.2 Dicyano-hexakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25)
HfOOC—y/ -«OIW=*\ CH,
CH,,_
CH,
VYHfOOC COOCH,
COOCH,
VYCOOK COOK
28
C53He90i4N6Co
25
C47H5iOi4N6CoK6
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) ist ausgehend vom
Dicyanocobester-c-lacton (28) ebenso wie das Cobyrinat 24 durch Hydrolyse an
Dowex synthetisierbar.Dazu wurden 21,0 mg (1,9-10'5 mol) Dicyanocobester-c-lacton (21) mit 20 pl
Trifluoressigsäure und 1,5 ml Methylenchlorid versetzt, die Lösung eine halbe Stunde
gerührt, wobei mehrmals Hausvakuum angelegt wurde, und anschliessend am
Rotationsverdampfer das Lösungsmittel abgezogen. Der zurückbleibende hellrote Lack
wurde noch zwei Stunden am Hochvakuum getrocknet.Der Lack wurde in 0,25 ml Essigsäure gelöst und die Lösung mit Hausvakuum durch
20 g (cirka 25 ml) Dowex 50 WX2 gesogen wobei das Lacton 28 praktisch quantitativabsorbierte. Das Harz wurde mit 50 ml Wasser gewaschen, anschliessend in 30 ml
Wasser suspendiert, die Suspension dreimal gründlich entgast, unter Argon gesetzt und
lichtgeschützt im Ölbad während vier Stunden bei 70 °C gerührt.Die Suspension wurde sodann im Kühlschrank auf ca. 0 °C gekühlt, das Harz
abgenutscht, mit 200 ml Wasser gewaschen, wiederum in 30 ml Wasser suspendiert,gründlichst entgast und unter Argon gesetzt bevor es für weitere 24 Stunden
lichtgeschützt und unter Rühren im Ölbad bei 70 °C belassen wurde.
Die Suspension wurde vor dem Öffnen der Apparatur wiederum auf ca. 0 °C gekühlt,das Harz abgenutscht, das Produkt mit 35 ml gesättigter KHCO3, welche 0,1 g KCN /l
enthielt eluiert, in das Eluat 5 ml XAD gegeben und bis zur Entfärbung der Mutterlauge
tropfenweise konz. H3P04 zugefügt.Das XAD-Harz wurde sofort mit 400 ml Wasser gewaschen, das Produkt mit 10 ml
1,23-10"2 M KCN in Methanol (8 mg, 6,1 Äquivalente, 1,23-104 mol) unter
vollständiger Entfärbung des XAD eluiert und am Rotationsverdampfer das
Lösungsmittel abgezogen bevor eine halbe Stunde am HV getrocknet wurde.
Der nun tiefviolette Lack wurde in 1,0 ml Methanol gelöst und mit 100 ml Ether
gefällt. Im Verlauf von drei Stunden setzte sich im Kühlschrank bei 0 °C der feine
Niederschlag ab und die farblose Mutterlauge konnte abpipettiert werden.
Das während zwölf Stunden am HV getrocknete, violette Pulver (23,5 mg, 0,018 mM,
97%) wurde charakterisiert.
C47H550i4N6CoK6
169
Abbildung 64: UV/vis-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyr-inat-c-lacton (25) in Methanol, c= 9,24-105 M, dx= 0,100
cm
Abbildung 65: CD-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) in Methanol, c= 9,24-10'5 M
170
mw. 1255,576
DC (Kieselgel 60, i-Propanol/H20/1% HCN in MeOH/Et3N, 70:40:10:1)
rf= 0,61
UV/Vis
Abb. 64
(CH3OH, c= 9,24-10-5 M)
278 ( 6'410), 307
352 ( 9-420), sh 366
512 ( 3'620), sh 543
( 5'540), Sh
(18'330),
( 5'480),
314 (418 (583 (
5'910),
1'690),
6'750)
CD
Abb. 65
(CH3OH, C= 9,24-10-5 M)
246 ( -5,30),sh 253
346 ( -9,31), 364
427 ( 9,31), 483
554 ( 0,87), 579
(
(
(
(
-8,01),
-5,74),
-1,30),
-0,22),
309 (392 (520 (600 (
-6,28),
13,40),
-0,33),
0,43),
Xo bei 238, 272, 279, 371, 456, 536, 573, 588
(1,0 mg in 300 mg KBr)
3420 (s), br 3250 (m), sh 2970(m), 2940(w), sh
2860 (m), sh 2170 (w), 2190(w), 1990(w),
1695 (w), 1660 (m), sh 1630(m), 1580(s),
1505 (s), 1470 (m), 1445(m), sh 1400(s),1370 (S), sh 1350 (m), sh 1310(w), 1295(w),1275 (w), sh 1220 (w), 1200(w), 1190(w), sh
1155 (m), 1130 (m), sh 1115(m), 1095(w), sh
1050 (w), 1025 (w), 1000(w), 975 (w),
950 (w), 925 (w), 880 (w), 800 (w),
765 (w), sh 730 (w), 650 (m), br
1H-NMR (D20, 300,13 MHz, c= 7,96-10'3 M, 1,0 gV KCN)Abb. 21
Allg. Teil 5,80
3,85
3,57
S, 1 H
d, 1 H J= 8,3 Hz
d, 1 H J= 10,5 Hz
C-10
C-19+
C-3
3,10 m, 1 H J1= 8 Hz J2= :3 Hz C-13
2,80 td, 1 H J1= 10 Hz J2= :3 Hz C-18+
2,58 dd, 1 H Ji= 15 Hz J2=3,5 Hz C-181 +
2,50- 1,50 insgesamt ca. 26 H
2,24 s, 3H C51 oder 151
2,20 s, 3H C51 oder 151
1,61 s, 3H CH3
1,43 s, 3H CH3
1,42 s, 6H CH3
171
1,22 s, 3H CH3
1,11 S, 3H C-12B
Zuordnung auf Basis Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat, + zugeordnet mit
Entkopplungsexperiment
Entkopplungsexperiment
Einstrahlung Beobachtung
2,84 ppm 3,58 ppm, d zu s,
2,58 ppm, dd zu d, J= 3,5 Hz verschwindet,
2,30-2,50 Intensitätsverschiebung
1 H-NMR (CD3OD, 300,13 MHz, c= 7,96-10'3M)
5,88 s, 1 H C-10
4,26 d, 1 H J= 8,0 Hz
3,79 d, 1 H J= 10,5 Hz C-19+
3,04 m, 1 H
3,02 t, 1 H J= 10,5 Hz C-18+
2,64 dd, 1 H J1= 25,1 Hz J2= ca. 2 Hz
2,66-2,47 insgesamt 2 H, Maximum 2,5'I ppm
2,47-1,78 insgesamt 24 H
2,33 s, 3H 51 0. 151
2,32 s, 3H 51 0. 151
weitere Maxima 2,07/ 2,03 / 1,99/ 1,95
1,78-1,10 insgesamt 16H
1,68 s, 3H CH31,57 s, 3H CH31,54 s, 3H CH3
1,44 s, 3H CH3
1,31 s, 3H CH3
1,17 s, 3H CH3*
Zugeordnet analog Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24), + Zugeordnet
aufgrund Entkopplungsexperiment
Entkopplungsexperimente
Einstrahlung Beobachtung
3,82 ppm 3,01 ppm, t zu d
3,00 ppm 3,82 ppm, dzus
2,71/2,76 Kopplung von ca. 1 Hz verschwindet
2,38/2,42 Signale mit höherer rel. Intensität
172
13C-NMR (D&, 300,13 MHz, c>
DEPT)
7,96-10-3M, 1,0 gr1 KCN, breitbandentkoppelt &
17,54 (q,1C C51/151
19,75 (q,1C C2A
24,24 (q,1C, C12A.1A;
33,06 (q,1C C12B
36,52 (t,1C
38,48 (t,1C
48,56 (t,1C
55,24 (s,1C C7
61,62 (s,1C C2
88,22 (s,1C C8
107.0 (s,1C C5
163.7 (s,1C
174,4 (s,1C
180.8 (s,1C
182,6 (s,1C
185.1 (s,1C
17,83
20,13
28,67
35,52
38,10
40,62
48,69
56,43
78,12
91,67
141,7
166,3
180,3
182,4
184,7
185,4
q,1C C51/151) 19,32 (q,1C, 2A/17A)
q,1C, 37A) 21,61(q,1C,7A,12A,1A)
t,1C 30,17 (t, 1C )
t,1C, C71 81) 36,06 (t, -ic )
t,1C, C71 81) 38,16 (t, 1C )
t,1C 43,06 (d, 1C )
t,1C 49,98 (s,1C,C12,17)
d,1C C13 59,57 (d, 1C C3)
d,1C C19 85,82 (s, 1C C1)
d,1C C10 106,2 (s,1C C15)
s,1C CN br) 142,2 (s,1C, CN, br)
s,1C 167,7 (s, 1C br)
s,1C 180,5 (s, 1C )
s,1C 182,4 (s, 1C )
s,1C 184,9 (s, 1C )
s,1C
Zuordnung analog Dicyanocobyrinat 24
173
6.4.3 Dicyano-Co(lll)-N>N,,N,,,N,",N"",N ,N -hepta-
(4-nitrophenyl)-cobyrinat28 (29)
,,{yooc
N02-Q-OOCo»
24
C47H52014N6CoK7
VY0,-Q-Ooc coo-^yNo2
29
C89H8o02gNi3Co
Zu 1322 mg (1,06 10 3 mol) in 20 ml H20 gelöstem und zusammen mit 40 g XAD
vorgelegtem Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) tropfte man unter Ruhren
konz H3PO4 solange zu (ca 2 ml) bis die Farbe von violett nach karminrot umschlugund das Corrin unter vollständiger Entfärbung der Lösung an das XAD Harz
adsorbierte
Das XAD Harz wurde sodann mit 80 ml Phosphatpuffer, pH 3, 0,1 g KCN 11, und
anschliessend mit H2029 gewaschen bis Substanz begann auszutreten (ca 50 ml) Die
Cobyrinsäure liess sich nun mit 300 ml Methanol vollständig eluieren Man zog das
Lösungmittel zuerst am Rotationsverdampfer ab und trocknete den Rückstand eine
Stunde am HV (0,08 Torr)Die hellrote Substanz wurde mit 10 ml 10 % HCN haltigem Methanol gelöst, mit 0,16
ml Et3N (2,2 Äquivalente, 2,33 mmol) versetzt und vor der Trockung am HV (5 h,
0,05 Torr) das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt Es blieb ein
tiefvioletter Lack zurück
Man legte die Dicyanocobyrinsäure unter Stickstoff vor, kühlte mit Eis/NaCI auf ca
10 °C und fügte 30,0 ml Methylenchlond, dann 1,50 ml Tnethylamin (9,01 10 3
mol, 8,5 Äquivalente) und zuletzt 6,250 g (2,66 10 2 mol, 25,1 Äquivalente)Tnfluoressigsäure 4 nitrophenylester gelöst in 10,0 ml Methylenchlond dazu Das
Eisbad konnte sofort entfernt werden Zu der unter Ruhren gehaltenen Lösung gab man
nach ca 2 Stunden weitere 0,50 ml Tnethylamin Die Reaktion war gemäss Dunn-
schichtchromatogramm nach 22 h Stunden beendet
Zur Aufarbeitung verdünnte man die hellrote Lösung mit 100 ml Methylenchlond30und schüttelte mit 15 Portionen ä ca 200 ml einer gesättigten wässrigen NaHC03-
Lösung, die 0,1 g KCN I1 enthielt, aus31, filtrierte durch Watte und engte die
tiefvioletten Lösung am Rotationsverdampfer auf ca 30 ml ein Zugabe von 300 ml
Hexan führte zur quantitativen Fällung des Produktes 29, das noch zweimal mit 300
ml Hexan gewaschen wurde bevor das bläulich-violette Pulver nach 16-stundigerTrocknung bei 10 3 Torr zur Charakterisierung gelangte (1,923 g, 99,5 %)
28 Vorschrift analog R Stepanek [91] mit der freien Säure als Edukt
29 Die tiefviolette Dicyanoform verliert beim Waschen mit Wasser wieder einen
Cyanidliganden und beginnt kurz vor Beginn der Ablösung der Substanz vom Trägereine rote Farbe anzunehmen
30 Substituierbar durch Ether
31 Die letzte Portion der wässrigen Phase bleibt praktisch farblos
174
ch, r-coo-^yNo,'fCH,
°-C}xo,
Abbildung 66: UV/vis-Spektrum von Dicyano-Co(IM)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat (29)in Methylenchlorid, c= 3,78-10'5 M
s35
©
Abbildung 67: CD-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat (29) in
Methylenchlorid, c= 3,78-10"5 M
175
CsgHeoC^sNisCo mw. 1838,633
DC (MeCI2/1%HCN in MeOH, 95:5, Kieselgel 60)
rf= 0,90
Löslichkeitsverhalten
löslich
nicht löslich
Acetonitril, Methylenchlorid, Nitrobenzol, Essig-
säureethylesterBenzol, Toluol
UV/Vis
Abb. 66
(Methylenchlorid, c= 3,78-10'5 M)
590 nm
424 nm
268 nm
(10'330),
( 2-380),
(70'710)
548 nm
373 nm
( 8'140),
(29'790),
510
355
nm
nm
( 4-970),
(15'100), sh
CD
Abb. 67
(Methylenchlorid, c= 3,78-10-5 M)
250 (284 (329 (397 (605 (
-5,30),
-3,18),
-10,30),
18,00),1,32),
A.0 bei 239, 268, 278, 378
258 (303 (350 (431 (
-6,89),-8,48),
-9,27),
10,60),
274 (312 (372 (562 (
1,32),
-14,30),
-7,68),
2,12),
IR (3,1 mg in 80 ßl CHCI3)
3690 (w), 3115(w), 3080(w), 3020 (w),
2985 (m), 2925(w), 2860(w). 2455 (w),2120 (w), 1915(w), 1760 (s), 1615 (m),
1595 (m), 1580(m), 1530 (S), 1500 (m),
1490 (S), 1470(w),sh 1450(w), 1415 (w),
1400 (w), 1390(w), 1365(w), sh 1350 (s),
1325 (w), 1295(w), 1200(m), 1160 (S),
1125 (S), 1050(w), 1040(w), sh 1015 (m),
995 (w), 975 (w), 945 (w), sh 925 (w),
900 (w), 865 (m), 830 (w)
sh
1H-NMR (CDCI3, c= 2,26-10-2M, 300,13 MHz)Abb. 68
8,35-8,00 m,14 H
7,40-7,05 m,14 H
5,79 s, 1 H
4,05 d, 1 H
4,01 d, 1 H J= 13,2 Hz
Phenyl(C3-)Phenyl(C2')C-10
C-3
C-19*
176
f\-ooc
CH, I-COO-Qno.\c»,
ch, f"
(29)> r
ppm 8
Abbildung 68: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N-,N", N'", N"", N
,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat
(29) in Chloroform, c= 2,26-10'2 M, 300,13 Hz
Iiloa 3 |
iiMlrtLlJn.,i,,1.üi..i..wi'1,300 400 500 «00 T&0 000 »00
1100 1200 1300 1400 1300
1437 4 ««« »I
, . ,,i^^-.v, , , .-injUM»,!1*00 1700 ltOO 1!
I IIS
711
! 5Bi
: ie<
.TB«
SM
»00 2000
Abbildung 69: FAB(+)-MS-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat(29), Matrix 3-NOBA
177
3,64 dd, 1 H J1= 3,75 H;'. ^z
3,21 m, 1 H
3,13-2 ,50 m, insgesamt 15 H
2,43 s, 3H
2,37 s, 3H
2,50-2 ,20 m, insgesamt 10 H
2,10-1 ,90 m, 3H
1,78 s, 3H
1,73 s, 3H
1,66 s, 3H
1,62 m, undiff
1,51 s, 3H
1,46 s, 3H
1,33 s, 3H
1,20-1 ,80 insgesamt 23 H
3,25 Hz C-8*
C-13*
C51 oder 151
C51 oder 151
CH3CH3CH3
CH3CH3CH,
*
Zuordnung aufgrund Analogie zum Dicyanocobyrinat 24
13C-NMR (CDCI3, c= 8,56 W3M, 100 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)
15,68, 16,39, 17,65, 18,89, 19,37, 20,11, 22,48 (q, je 1C )
24,44 (t, 1C ) 24,62 (t, 1C ) 26,39 (t, 1C )
29,78 (t, 1C ) 30,07 (t, 1C ) 31,15 (t, 1C )
31,61 (q, 1C, C-12B ) 32,02 (t, 1C ) 32,33 (t, 1C )
33,44 (t, 1C ) 39,58 (d, 1C, C-18 ) 41,44 (t, 1C )
42,21 (t, 1C ) 46,14 (s, 1C.C-2/7/12) 46,94 (s,1C,C2/7/12)
48,84 (s,1C,C2/7/12) 53,89 (s, 1C.C-2/7/12) 48,84 (s,1C,C2/7/12)
53,89 (d, 1C, C-13 ) 54,23 (d, 1C, C-8 ) 56,67 (d, 1C, C-3 )
58,54 (s, 1C, C-2 ) 74,77 (d, 1C, C-19 ) 82,80 (s, 1C, C-1 )
91,54 (d, 1C, C-10 ) 103,09 (s, 1C, C-5/15 ) 104,04 (s, 1C, C-5/15)
115.56 (d, 1C ) 122,08, 122,15, 122,32, 122,41, 122,43, 122,56
(d, je 2 C, C-2 des Nitrophe), 124,88, 125,07, 125,10, 125,28, 125,33, 125,38,
125,53 (d, je 2C, C-3, des Nitrophenyl), 126,10 (d, 1C )
130,6 (breit, s, 2 CN) 145,22, 145,36, 145,46, 145,60, 14564, 145,82,
145,91 (s, je 2C, C-4 des Nitrophenyl), 154,43, 154,46, 154,75, 154,81, 154,
93, 155,16, 155,35 (s, je 2C, C-1 des Nitrophenyl) 163,48 (s, 1C C-6/14)
163.57 (s, 1C C-6/14) 168,21, 169,34, 169,70, 169,93, 170,04, 170,63,
171,27, 171,59, 175,21, 175,80, 177,26 (s, je 1C, 22, 33, 72, 83, 133, 173,
182 & 4, 16)
MS (FAB(+), 3-NOBA, M/Z 500-2W0)Abb. 69
1838.2 (9, M++H+ ) 1837,2(16, M+ ) 1812,5(34 )
1810.3 (72) 1809,5 (88, M-CN ) 1794,7 (26, M-N02+H+)1793,7 (28, M-N02 ) 1787,0(5, M-2CN) 1786,0(24 )
1784,9 (59, M-2CN ) 1783,8(54, M-CN--HCN)1769,1 (22, M-2CN-0 )
1768,2 (23, M-CN-HCN-O) 1646,9 (17, M-CN-(COOC6H4N02))
Signalgruppe 1590-1700 (M-Nitrophenylat) 1437,4 (13, M+H20-2CN
-3x(C6H4N02) ) Signalgruppe 1400-1510 (M- 2 Nitrophenylat )
1018 (8, M-CN+H20-5x(OC6H4N02)-(C6H4N02)) 993 (8, M-2CN+2H20
6x(C6H4N02) ) 869,53 (30, M-7x(OC6H4N02) )
759,5(84, M-3x(OC6H4N02)+2Na+) 737,54 (88,[M-3x(OC6H4N02)]2+ )
640 (20, M-7x(COOC6H4N02)-CN+H20) 610,22 (30, M-7x(COOC6H4N02)-
2CN-CH2) ) 585,12 (58, Ringfragment )
568 (42,Ringfragment) 548,21 (100,Ringfragment )
178
Kristallisationsversuche
Kristallisationversuche mit 29 wurden nach der Methodik der isothermischen
Diffusion durchgeführt [150, 151]Je 2 mg Dicyano-Co(lll)-heptakalium N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitro-phenyl)-cobynnat (29) in 0,2 ml Lösungsmittel [teils frisch destilliert und
absolutiert, teils puriss pa (vgl Tabelle 11)] wurden in einen Birnkolben gefülltund dieser mit durch Nadelstiche performiertem Parafilm verschlossen Den Kolben
stellte man in ein zweites Gefäss, welches das zweite Lösungsmittel, in dem der
Nitrophenylester 29 nur beschränkt löslich oder unlöslich ist, enthielt und
verschloss hermetisch Es wurden nur solche Lösungsmittelsysteme eingesetzt, aus
denen sich in einem Vorversuch Dicyano-Co(lll) heptakahum-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobynnat (29) fällen hess
Die Knstallisationsansätze wurden lichtgeschutzt bei Raumtemperatur stehengelassenund zwei Monate beobachtet, bzw bei Systemen mit Mischlucke der Versuch nach der
Phasentrennung abgebrochen
Kristallisation wurde bei keinem der untersuchten Lösungsmittelsysteme beobachtet
In der Regel ölte der Nitrophenylester 29 aus, bildete aber bei Hexan/Acetonitril
einen Lack während das System Ether/Methylenchond immer zu einer Fällung führte
Tabelle 11 Losungsmittelsysteme der Kristallisationsversuche
für Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N"',N"",N'"", N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat(29)
Acetonitril*
Diffusion von
Aceton
Essigethylester X
1,4-Dioxan* X
Diethylether* X
Dusopropylether*Toluol X
Tetrachlorkohlenstoff X
Cyclohexan X
n-Hexan X
Heptan X
Petrolether X
Cyclohexen X
29 gelöst in
Aceton Nitrobenzol
X
X
X
Methylenchlondt
X
X
X
X
X
X
'frisch destilliert und absolutiert, ffnsch über Alox
179
6.4.4 Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N",,N,,,,,N ,N -hepta-
(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid32(27)
CONH(CH,),<f:Ofi(CH,),
CH, r-CONHICHJnCOJCH,),
(CHJfiOfitCHjKflNOC-y S^XLs\.CH
,,-Q-ßoc COO-Qno,
{CH,)fi0piCH,)^INOC
CONHICHJxflOfitCH,)
ICH,)fiOfi(CH,)^INOC CONHICHJ^OfifCH,),
29
CsgHaoOaNisCo
27
Ci 52H262021Ni 3C0
Zu 1546 mg in einem getrockneten Kolben mit Serumstopfen unter Stickstoff vorge¬
legtem Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitro-phenyl)-cobyrinat (29) (8,41-10 mol-4) fügte man 20 ml THF, eine Lösung von
3,268 g 10-tert.Butyloxycarbonyl-n-decyl-ammonium-perchlorat33 (9,13-103mol, 10,9 Äquivalente) in 10 ml THF sowie zuletzt 2,1 ml Triethylamin (1,51-10"2mol, 17,9 Äquivalente) und hielt die Reaktionslösung unter Rühren auf Raum¬
temperatur. Das DC zeigte nach 3,5 Stunden Reaktionszeit vollständigen Umsatz an.
Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung in ca. 300 ml Ether aufgenommen, zuerst
gegen 200 ml Phosphatpuffer (2,3-10~3 mol, pH 4,0), dann mit gesättigter NaHC03mit 0,1 g KCN pro Liter solange ausgeschüttelt bis die Wasserphase nur noch schwach
gelb gefärbt war (ca. 4 I). Die Wasserphasen schüttelte man nach jeder Trennung
jeweils mit einigen ml Ether aus und vereinigte mit der organischen Phase der
Hauptfraktion.Man zog sodann den Ether am Rotationsverdampfer ab, dekantierte das zurückbleibende
Wasser, trocknete bei 0,03 Torr (25 h) und erhielt 1972,6 mg rot-violettes, gemässDC nicht einheitliches Rohprodukt.Dieses Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie mit Kieselgel 60 (Säulen¬durchmesser 8 cm, Füllhöhe 12 cm, Laufmittel Methylenchlorid / 1% HCN in MeOH)
gereinigt. Der Methanolgehalt des Laufmittel wurde im Verlauf der Trennung erhöht,
beginnend mit 25:1 für die ersten 2'500 ml, über 10:1 für die folgenden 1'000 ml,
bis auf 5:1 für die letzten VOOO ml. Man beobachtete eine Bandenstruktur bestehend,
in der Reihenfolge ihrer Elution, aus einer intensiven sowie einer schwachen Bande
mit kleinem rf-Wert. Das gewünschte Cobamid 27, 1882 mg (83,9 %), befand sich
in der ersten intensiven Bande.
Diese Fraktion gelangte nach zwölfstündiger Trocknung bei 3-10~4 Torr zur
Charakterisierung.
Ci 52^262021 N13CO
mw. 2666,791
32 Synthetisiert auf Basis der Vorschrift von Stepanek [91]33 Synthetisiert analog der Vorschrift von Stepanek [91]
180
4* 1
M
CpNHtCHjKCOflCH,),CH, r-CONHfCHJriCOJCH,!,
CHifiOflCH,),iirHOC~y y^JJ^\CH,
CONHICHjlufOflCH,)CH,
CH,)fiOfi(CH,)„flNOC
vy(CHJfOflCHJxflNOC CONHICH,)^:OftCH,),
Abbildung 70: UV/vis-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N'",N"",N ,
N - hepta - (10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl) - cobamid
(27) in Methylenchlorid, c= 3,31-10"5 M
8r*~
I
Abbildung 71: CD-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N-,N"",N ,
N -hepta- (10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl) - cobamid
(27) in Methylenchlorid, c= 3,31 -10"5 M
181
Löslichkeitsverhalten
löslich Ether, MeOH, EtOH, Aceton, Hexan, i-Propanol,
Methylacetat, Toluol, Methylenchlorid
DC (Kieselgel 60, Methylenchlorid/MeOH, 95:5)
rf= 0,23
UV/Vis
Abb. 70
(c= 3,31-10-5 M, MeCI2)
278 ( 10-260),352 ( 14'030),505 ( 5'280),
309 ( 9'510),368 ( 28-360),543 ( 8'150),
314 ( 9'660),417 ( 2'410),581 ( 1 0'110).
CD
Abb. 71
(C= 3,31-10-5 M, MeCi2)
247 ( -16,30),sh281 ( -10,60),326 ( -9,95),sh382 ( 15,40),sh488 ( -2,41),
255
299
348
395
530
(-20,20),(-10,30),sh(-15,40),( 27,80),( -0,91),sh
270
310
363
428
582
(
((
(
(
-7,54),
-18,70),
-6,94),
18,10),
-3,02),
X0 bei 372, 459
sh
(2,7 mg in 70 pl CHCI3)
3665 (w) 3440 (w) 3220 (m) 3080 (w) ,
3000 (s) sh 2980 (s) 2930 (s) 2855 (s) ,
2460 (w) br 2120 (w) 1720 (S) 1655 (s)1580 (m) 1550 (m) 1505 (s) 1465 (m)1455 (m) 1440 (w) Sh 1410 (w) 1400 (m)
1390(m) 1370 (s) 1355 (m) sh 1305 (w)1155 (s) 1110 (m) 1065 (w) 1035 (w)1010 (w) 1000 (w) 970 (w) 950 (w)915 (w) 900 (w) 880 (w) 845 (m)
1 H-NMR (CDC/3, C= 1,41-10-2M, 300,13 MHz)Abb. 72
8,05 ppm
7,63 ppm
6,91 ppm
6,77 ppm
6,61 ppm
6,50 ppm
6,20 ppm
5,56
4,52
3,83
1 H
1 H
1 H
1 H
1 H
1 H
1 H
1 H
1 H
1 H
J= 5,6 Hz
J= 5,6 Hz
J= 5,6 Hz
J= 5,6 Hz
J= 5,6 Hz
J= 5,6 Hz
J= 5,6 Hz
J= 9,6 Hz
J= 9,7 Hz
CH2-NH-CO-CH2-NÜ-CO-
CH2-NH-CO-
CH2-NH-CO-
CH2-NM-CO-
CH2-NH-CO-
CH2-NÜ-CO-C-10
C-3
C-19
182
ppm 8 1
Abbildung 72: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N-",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cob-amid (27) in Deuterochloroform, c= 1,41 -102 M, 300,13MHz
275 0 ,
412 j
IraWwiltillM it-HiTi",200 300 400 500 "W 700 «0 »öo'
1500
100.
10.
«0.
iVoo'
io'oo
4 OB«
2 OSC
.0 OBO
M/S
» »B6
7 »C
.5 »K«
.4 OBf
.2 OB«
,0 010
~1Ä -U*j^2 *3 4
.7 «*
5 »SC
.4 OS«
.2 Ol«
.0 010
2800 M/S
Abbildung 73: FAB(+)-MS-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N'"N"",N ,N -hepta-(IO-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid (27), Matrix 3-NOBA
183
3,40-3,25 m, ca 4,5 H
3,25-2,86 m, ca. 11,5 H
2,82 m, 1 H
2,71 d, 1 H J= 1
2,50 t'oid, 1H
2,25 s, 3H
2,22-2,10 m, ca. 23 H
2,07 s, 3H
2,45-1,90 m, insgesamt ca. 39 H
1,74 s, 3H
1,70-1,46 ca. 23 H
1,44 ca. 63 H
1,28 ca. 78 H
1,22 ca. 33 H
1,13 s, 6H
14,1Hz
CM2NH-COu.a. CJ&NH-CO
C-5,15
u.a.CÜ2CO
C-5,15
CH3
tert.Butyl
CH3
13C-NMR (CDCI3, c= 2,36 10~2M, 75 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)
15,07
18,16
22,02
25,72
27,19
28,08
28,86
29,51
31,69
36,00
39,61
40,28
45,67
50,49
59,03
75,76
77,00
79,84
90,64
132,74
162,92
169,26
172,14
173,01
175,19
q,1 C
q,1 C
q,1 C
t,1 C
t, ca 2 C
;d, ca21C, 0
t,1 C
t, ca 14C
t, 1 C
t,1 C
t,1 C
t,1 C
t,2C
s,2C
d,1C,C3,8
s,1 C
|d,> 7 C
[s, ca 7C, O-
d,1 C, C10;
s,i c, -cn;
s,1C,C6/14
s,1 C
s,1 C
s,1 C
s,1 C
15,63
18,83
24,31
26,96
27,60
C(£H3)3)
29,07
30,40
32,13
36,41
39,77
40,45
46,12
53,86
3)60,87
76,10
77,10
-£(CH3)3)
101,65
135,88
22,33.
171,41
172,61
173,26
175,96
(qjc )
(q,IC )
(t, 1C )
(t, ca 7 C )
(t,1C )
(t, ca 7 C
(t, 1 C
(d, 1 C
(t, 1 C
(t, 1 C
(d,1 C,
(t, 2C
(d,1 C,
(s,1 C,
(s, 1 C
(s,1 C
)
)
)
)
)
C18)
)
C3,8,1
C-17)
(s, 1C.C5/15)
(s, IC, -CN)
72,83,133,173,1
(s,1C )
(s,1C )
(s.-ßOO'Bu, ca
(s,1C )
16,07
19,86
25,06
27,04
27,80
28,77
29,31
31,09
35,55
39,48
40,00
42,46
47,15
3)55,7371,84
76,58
77,42
83,57
107,14 (s,
161,22 (s,
(q, 1C
(q, 1C
(t, ca 7 C
(t, ca 7 C
(t, 1 C
(t, 1 C
(t, ca 14 C
(t, 1 C
(t,>7C
(t, 2C
2C
1 C
1 C
(d, 1 C, C3,8,13)
(s, 1 C, C-19)
(s,>7C
(s,>7C
(s, IC,
1 C,
1 C,
(t,
(t,
(t,
C-1
C5/15)
C6/14)
82 & C4/9/11/16
171,91 (s, 1 C
172,93 (s, 1 C
7C)
176,13 (s, 1 C
MS
Abb. 73
(FAB(+), 3-NOBA, m/z 150-2W0)
2655,4 (12,2) 2639,5 (97,9,M-CN) 2613,26 (100,0, M-2CN)
412,11 (14,7) 312,08 (22,8) 275,04 (19,7)Bereich 260-490 regelmässig wiederkehrende Maxima in Abstand 14 m/z
184
6.4.5 Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N",N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)34
(17)
27
C152H262O21N13C0
1 7
Ci 24H199O21N13C0K7
Eine Gasentwicklungsapparatur wurde mit 140 ml konz Schwefelsäure sowie 200 g
NaCI beschickt und 1,7827 g Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N-",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid (27) (6,68 10'4 mol) in einem,
über einen PVC-Schlauch verbundenen 250 ml-Kolben als Lack vorgelegt. Stickstoff
durchströmte langsam die Apparatur vom NaCI zum 250 ml-Kolben, anfänglich zur
Trocknung der Apparatur, dann während der gesamten Reaktionszeit als schwacher
Trägerstrom
Cirka eine Stunde nach Beginn des Stickstoffflusses, jedoch vor Beginn der HCI-Ent-
wicklung wurde das Cobamid 27 in 100 ml Chloroform gelöst. Diese Lösung wurde bis
Ende der Hydrolyse gerührt und die HCI-Entwicklung nun so gesteuert, dass das
Natriumchlorid in der Vorlage im Laufe von ca. 100 Minuten aufgebraucht war. Dabei
wurde ein hypsochromer Effekt beobachtet, der wahrscheinlich auf die Entstehung von
Chloro-cyano-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxy-car-
bonyl-n-decyl)-cobamid durch ügandenaustausch am Kobalt zurückzuführen ist.
War die HCI-Entwicklung praktisch zum Stillstand gekommen, wurden dem Cobamid
10,0 ml Tnfluoressigsäure (0,131 mol, 196 Äquivalente bzgl. Co) zugeführt.35Vier Stunden nach Zugabe der Tnfluoressigsäure zeigte das einheitliche DC der Lösungdas Ende der Reaktion an.
Man entfernte das Lösungsmittel der Reaktionslösung am Rotationsverdampfer bei
einer Wasserbadtemperatur von 40 °C, und trocknete anschliessend zwölf Stunden am
Hochvakuum (p= 10 3 Torr)Der in ca. 10 ml Methanol aufgenommene hellrote Rückstand wurde mit KCN versetzt
bis sich das zuletzt zugegebene Cyanid nicht mehr löste.36 Die Fällung des
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-dec-yl-10'-carboxylat) (17) aus dieser methanolischen Lösung mit 150 ml Ether erfolg
34 Synthese analog R. Stepanek [91] ohne XAD-Chromatographie.35 Die Reaktionslösung ist jetzt leuchtend rot.
36 Die entstehende Dicyanoform färbt die Lösung tief violett.
185
CpNH(CH,),tPOOKCH, f-CONmCH{l,fiOOK
Abbildung 74: UV/vis-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-amido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-car-
boxylat) (17) in Wasser, c= 3,23-10"5 M, 0,13 g KCN M
Abbildung 75: CD-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)(17) in Wasser, c= 3,23-10-5 M, 0,13 g KCN I"1
186
te quantitativ. Der Niederschlag setzte sich im Laufe von einigen Stunden bei Raum¬
temperatur ab. Die praktisch farblose Mutterlauge wurde abpipettiert, der Nieder¬
schlag mit 150 ml Ether gewaschen, zuerst im 40 °C Wasserbad am Rotations¬
verdampfer und Hausvakuum, dann bei 10-3 Torr während zwölf Stunden getrocknet.Man erhielt gemäss UV/vis-Spektrum 1,6984 g (99 %) violettes Pulver, das unter
Argon und Lichtausschluss bei 5 °C gelagert, nach einem Jahr 1H-NMR-spektro-skopisch keine Veränderungen aufwies.
Cl24Hi9902iN13CoK7
mw. 2540,664
DC (RP-18, 1% methanolisches HCN/H20, 10:1)
0,30
UV/Vis
Abb. 74
(H20, c= 3,23-10-5 M, 0i13 g KCN ri)
579 ( 9'480),416 ( 2'080),305 ( 8'860),
539 ( 8'090),367 ( 27'200),277 ( 9'250),
509 ( 5'550),312 ( 8'860),233 ( 44-390).
CD (H20, c= 3,23-10-5 M, 0,13 g KCN r1)Abb. 75
244 ( -10,20), sh 252 (-14,30), 267 ( -4,34)278 ( -5,89), 296 ( -8,67),Sh 308 ( -18,90)323 ( -9,29), 347 (-11,20), 367 ( -6,20)396 ( 22,60), 426 ( 14,30), 488 ( -1 ,24)555 ( 1,55), 595 ( 1,55),
XO bei 232, 374, 463, 534
CD (H20, c= 8,90-10-5M, 1,99-W2M SDS (224 Äquivalente), 3,13-W4M KCN (3,5 Äquivalente), 400-700 nm)
signifikant geringerer Cirkular-Dichroismus im Bereich 500-650 nm:
555 ( 1,26), 595 ( 1,27)
IR (1,5 mg in 300 mg KBr)
3430(m) sh 3310 (m) 3080 (m) 2930 (s)2860 (s) 2690 (w) 2490 (w) 2120 (m)1790(w) sh 1695 (m) sh 1650 (s) 1580 (s)1565 (S) 1505 (S) 1470 (m) 1455 (m)1440(m) 1405 (s) 1370 (m) 1355 (m)sh1305(m) 1285 (m) 1260 (m) 1225 (m)sh1205(m) 1180(m) 1155 (m) 1135 (m)sh1110(m) 1070 (w) 1040 (w) 1020 (w)sh995 (w) 970 (w) 955 (w) 890 (w)835 (w) 805 (w) 735 (w) sh 725 (w)665 (w) 625 (w) 595 (w) 475 (w)
187
1 H-NMR (CD3OD, c= 1,41-10-2M, 300,13 MHz)
Abb. 22
Allg. Teil 5,78 S, 1 H C-10
4,33 d, 1 H J = 8,6 Hz C-3
3,78 d, 1 H J = 10,2 Hz C-19
3,25-3,04 m, insgesamt ca 21 H Cifc-CONH
3,04-2,96 3H Maxima 3,03/2,99
2,65 1 H
2,36 6H C-5/15
2,18 t/m,ca. 28 H alip. Kette
Ctfe-COO-
2,00-1,90 m, ca. 1 H
1,90-1,75 m, ca. 1 H
1,71 s, 3H CH3
1,65-1,50 m,insgesamt ca 30 H Maxima 1,60/1,51
1,55-1,40 m, ca. 3H Maximum 1,60
1,40-1,22 m,insgesamt ca. 100 H
1,19
Maxima 1,44/1,32/1,2
s, 3H
-(CH2)-CH3
1 H-NMR (D20, c= 5,43-10-3M, 300,13 MHz, 0,13 g KCN H)
77
06
66
33-
82
58
2,90
2,40-1,90
1,90-1,66
1,62
1,44
1,38-1,28
1,28-1,10
1,08
s, 1 H
d, 1 H
d, 1 H
m,ca. 15 H
m, 1 H
m, 1 H
m, ca. 32 H
J= 8,4 Hz
J-11,2 Hz
t'oid. Max 3,10 u.a.
C-10
C-3
C-19
CONHCH2
Maxima
u.a.
m, insgesamt ca. 6 H
s, 3H
m,ca. 22 H
m,ca. 15 H Maxima
m,ca. 84 H Maxima
s, 3H
2,31/2,24/2,04 CÜ2-COOK
bei
bei
CH3
1,33/1,35/1,371,21/1,17/1,11
CH3
13C-NMR (CD3OD, c= 2,0910-2M, 75 MHz, breitbandentkoppelt & DEPT)!37
16,02 (q, 1C 17,44 (q, -IC 18,45 (q, 1C )
19,45 (q, 1C 19,86 (q, 1C 22,91 (q, 1C )
26,83 (t, 1C 27,42 (t, 1C 27,59 (t, >7C )
27,84 (t,ca. 7C 28,11 (t,ca. 2C 28,57 (t, 1C )
29,55 (t,ca. 2C 29,84 (t, 1C 30,35, 30,50, 30,67,
30,75, 30,91 (t, zus.c a. 30C) 31,80 (q, 1C C12B)
33,18 (t, 1C 33,58 (t, 1C 34,14 (t )
34,89 (t, 1C 36,93 (t, 1C 39,36 (t, >7C )
40,39 (t, 1C 40,52 (t,ca. 2C 40,74 (t,ca. 2C )
40,93 (t,ca. 4C 43,37 (t, 1C 46,24 (t, 1C )
47,77 (t, 1C 47,90 (t, 1C 51,17 (q. 1C )
54,96 (d, 1C 57,44 (d, 1C 57,90 (d, 1C )
37 Zugeordnet aufgrund Analogie mit [107]
188
60,10 (s 1C C 17)
76,39 (d 1C C 19)
104,19 (s 1C C5/15)
163,92 (s 1C C6/14)
171,91 (s 1C )
173,53 (s 1C )
175,02 (s 1C )
178,12 (s 1C )
4 911 16
70,46 (s 1C ) 73,40 (s 1C )
84,55 (s 1C C 1) 92,12 (d 1C C 10)
106,76 (s 1CC5/15) 135,88 (s 2C CN)
164,50 (s 1CC 6/14) 170,36 (s 1C )
172,76 (s 1C ) 173,01 (s 1C )
174,48 (s 1C ) 174,58 (s 1C )
175,21 (s 1C ) 178,06 (s 1C )
178,29 (s 1C )
183,05 (s 7C COOK)
22 33 72 83 133 173 182 &
13C NMR (CD3OD, c= 4,11 10 2M, 100 MHz, breitbandentkoppelt & DEPT)
16,12 (q 2C ) 17,72 (q 1C 18,55 (q 1C )
19,53 (q 1C ) 19 96 (q 1C 23,01 (q 1C )
26,13 (t 1C ) 26,93 (t 1C 27,46 (t 1C )
27,89 (t ca 7C ) 27,92 (tca 7C 28,19 (tca 4C )
28,25 (t ca 2C ) 28,34 (tca 2C 28,38 (tca 2C )
28,71 (t 1C ) 28,80 (t 1C 30,27, 30,38, 30,44,
30,50, 30,57, 30,59 30,61, 30,66, 30,71 , 30,78, 30,83, 30,86,
30,92, 31,00, 31,03 (t insgesamt ca 20 C 30,01 (t 1C )
31,93 (t 1C ) 33,30 (t 1C 33,67 (t 1C )
34,18 (t 1C ) 34,92 (t 1C 37,01 (t 1C )
39,46 (t ca 7C CH2 COO ) 40,41 (q 1C )
40,56 (t ca 2C ) 40 61 (tca 3C 40,72 (t ca 2C )
40,79 (t ca 2C ) 40,99 (t 2C 43,42 (t 1C )
46,32 (t 1C ) 47,86 (dca 2C 47,97 (d ca 2C )
48,17 (s 1C ) 51,16 (s 1C 51,26 (s 1C )
53,29 (s 1C ) 55 03 (d 1C 57,45 (d 1C )
57,99 (d 1C ) 60,17 (s 1C C 17 76,47 (d 1C C 19)
84,62 (s 1C C 1) 92,18 (d 1C C 10 104,27 (s 1C C 5 15)
106,85 (s 1C C5 15) 136 00 (s(br) 2CN 163,41 (s 1C C 6 14)
163,97 (S 1C C6 14) 164,55 ( 1C 171,98 172,85, 173,10
173,59, 174,56, 174,67, 175,09 175,28, 178,11, 178,20, 178,37
(s je ca 1C 22 33 72 83 133 173 182 & 49 11 16)
183,12 (s 7C COOK)
13C NMR (D20 c= 1,41 10 2 M, 1 S102M KCN 100 MHz, br bandentk & DEPT)
17,46
20,50
24,70
29,00
29,77
40,65
42,71
53,23
84,8
108,9
166,10
176,46,
33 72 83
186,31
(q 1C
(q 1C
(q 1C
(t ca 7C
(t 1C
(tca 14C
(t 1C
(s 1C
(s 1C C 1)
(s 1C C5/15)
(s 1C C6/14)
176,85, 177
133 173 182 &
(s 2C C.OO)
18,00 (q 1C )
21,50 (q 1C )
28,40 (t,1C )
29,38 (t 1C )
31,0 31,8(tmmd35C)
(t
(d
(d
(d
42,15
48,85
56,15
93,7
110,2
167,48 (s
,50, 177,53,
4 9 11 16)
(s(br )
C 10)
CN)
ca7C)
179,0
19,15
21,70
28,99
29,55
33,85
42,46
49,46
61,70
105,3
1C
1C
1C
1C
1C
1C
164,00 (s 1C
174,10, 174,28,
179,5, 180,0 (s je
186,23 (s 3C
(q 1C
(q 1C
(t ca 7C
(t
(q
(t
(d
(d
(s C5/15
C6/14
174,6,
1C 22
COO)
186,43 (s 2C C.OO)
189
MS
Abb 76
(FAB(+), 3-NOBA, m/z 170-3V00)
2839,3
2763
2724
2525,0
2316,5
2092
1926
1840
1703
1591
2600
1199
197,8
(0,007, M+Na++2x[(CH2)4COOK]
(0,003, M+[(CH2)ioCOOK]+H+)
(0,004, M+3CN-+K++3Na+) 2659 (0,004, M+2CN-+3Na+)
(0,02, M+H+-K++Na+) 2432,4 (0,038, M-5K++5Na+-CN)
(0,07, M+6H+-7K++2Na+ & M-[(CH2)10COOK]+H+)
(0,034, -2x[(CH2)10COOK]+H+)
(0,022, M-2x[(CH2)10COOK]-[(CH2)6COOK]+H+)
(0,01 8, M-[(CH2)10COOK]-2x[NH(CH2)10COOK])
(0,013, M-4x[(CH2)9COOK])
(0,01 0, M-CN-2x[(CH2)ioCOOK]-2x[NH(CH2)10COOK)+H+)
1500 (Vielzahl von Signalen ähnlicher Intensität)
0 (M-6x[(CH2)10COOK] 536,1 (0,26, Ringfragmente+K+)
(100, (CH2)8COOK]+H+)
Abbildung 76' FAB(+)-MS-Spektrum von
do- N, N-, N", N"•,N"",N',
(17), Matrix 3-NOBA
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobami-'",N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)
190
6.5 Praparative Alkylierungen von Cobyrinat und Cob¬
amido- N, N', N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
6.5.1 Methylierungen: Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-
cobamido-N,N,,N",N"\N,,,,,N,"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)3s (30)
CONH(CH,),JCOJC
CH, B-CONmCHJnfiOJi
KOfi(CH,),^NOC -WvA^'XCWjCH?
KOf(CH,),fiNOC
KOOC
CONH(CH,),£OJi KOOC
VYKO,C(CH,),JINOC CONH(CH,)„pOj:
1 7
Ci24Hi9g02iNi3CoK7
30
C123H2q202i N11 CoK6
In einer Glove-box wurden 15,1 mg (5,94 10 6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in
5,0 ml Methanol gelöst, mit 9,0 mg Platindioxid sowie 5 pl Essigsäure versetzt und
heftig gerührt Im Laufe der Reduktion legte man wiederholt Vakuum an und flutete
anschliessend das Reaktionsgefäss mit Wasserstoff Nach quantitativer Reaktion (120Minuten, UV/vis-spektroskopische Kontrolle) zum Hexakalium-Co(ll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) wurde der Katalysatordurch Watte abfiltnert und am Rotationsverdampfer das Lösungsmittel abgezogen
Der in 5,0 ml Phosphatpuffer aufgenommene lackartige Ruckstand liess sich durch
Zugabe von 15 mg (4,0-10 4 mol, 66 Äquivalente) NaBH4 unter heftigem Schäumen
quantitativ (gemäss UV/vis-Spektrum) zum Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) reduzieren Der Farbumschlag von
braun nach grün erfolgte praktisch augenblicklichDie Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta (n-decyl-10'-carboxylat)-
lösung wurde auf 7,5 mg (4,03 10 5 mol, 6,8 Äquivalente) Methyltosylat pipettiert
und nach 30 Minuten der Glove-box entnommen
38 Synthese analog R Stepanek [91] mit veränderter Aufarbeitung
191
0,2
0,0
CONHtCHJufOOlV
-. CH,\OOC{CH,),JINOC
KOOC(CH,),flNOC
-CONH(CHJ,fiOOK
<I£H,
\ CHYKOOC(CH2)xPNOC CONH(CH2}ItJCOOK
« [-J m
Abbildung 77: UV/vis-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (30) in Wasser, c= 4,06-10-s M
Abbildung 78: CD-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (30) in Wasser, c= 4,06-105 M
192
Zur Aufarbeitung trug man die alkylierte Verbindung direkt aus der Reaktionslösungauf eine C-18-Kieselgelkartusche auf indem man zur Lösung solange krist KHCO3
zufugte bis das Corrin auf dem Harz adsorbierte und spulte mit 160 ml 0,01 M H3PO4Man wusch anschliessend mit 100 ml H20, 100 ml 0,01 H3PO4, wiederum mit 100
ml H20, benetzte das Harz mit 20 ml gesättigter KHC03-Lösung und entfernte vor der
Elution des Produktes mit 30 ml Methanol überschüssiges KHCO3 mit 30 ml Wasser
Nach Abziehen des organischen Lösungsmittels am Rotationsverdampfer wurde
lyophilisiert und das bräunlich-gelbe Pulver (13,9 mg, 95%) charakterisiert
Ci 23H2o202i N11C0K6
mw 2464,565
UV/Vis (H20, c= 4,06 10-eM)Abb. 77
264 (22'920), 303 (2V440), 353 ( 10-665), sh
372 ( 9'310), sh 458 ( 9'680), 495 ( 8'030),sh
(CH3OH, 190-900 nm, qualitative Messung, angegeben ist die gemessene
Absorption)263 ( 0,235), 303 ( 0,184), 365 ( 0,097),sh465 ( 0,091)
CD (H20, c= 4,06 10 6M')Abb 78
262 ( -25,60), 305 ( 5,91),sh 329 ( 16,70)360 ( -2,71), 457 ( -10,30), 515 ( 7,64)545 ( 4,68),
X0 bei 288, 350, 395 (Berühr pkt), 488 nm
IR (0,5 mg in 300 mg KBr)Abb 79
3430 (m) 3260 (m),,sh 3140 (w) sh 3070(w)
2930 (m) 2860 (w) 2710 (m) 2630(m)2200 (w) 1920 (w),,
br 1695 (s) ,sh 1660 (s)
1635 (s) 1580 (m),,sh 1420 (s) 1375 (s)1345 (m), sh 1330 (m) 1260 (w) ,
sh 1215 (w),1100 (w) 1060 (w) 1010 (m) 980 (m)835 (s) 705 (m) 665 (w)
sh
193
-i——i t r——i— i i '—r—i ' '
i
4'000 3'500 3'000 2500 2'000 V800 V600 1400 1'200 1000 800 600 400
cm-1
Abbildung 79: IR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-l0'-
carboxylat) (30), 0,5 mg in 300 mg KBr
Abbildung 80: FAB(-)-MS-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N', N", N'", N"", N
,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) (30), Matrix 3-NOBA
194
1H-NMR (CD3OD, c= 8,69 10'3 M, 300,13 MHz)
Hauptisomeres6,63 ppm
ppm
ppm
ppm
4,33
3,86
3,52
s,
d,
t'oid,
t'oid,
1 H
1 H
1 H
1 H
3,28-3,00
2,78 ppm
2,70
2,50
2,37
2,14
1,90
1,75
1,70-1,40
2,00
ppm
ppm
ppm
ppm
m,ca 14 H
1 H
insgesamt ca 30 H
s, 3H
s, 3H
t'oid, ca.14 H
d'oid, 1 H
s, 3H
ca. 40 H
ca 72 H
s, 3H
s, 3H
s, 3H
s, 3H
1,40-1,20
1,14
1,01
0,92
-0,21
Nebenprodukt (soweit als diskrete Signale erkennbar)
6,32
0,62
0,46
-0,10
s,
s,
s,
s,
Isomerenverhältnis ca.
1 H
3 H
3H
3H
4-1
C-10
C-3
C-19
C-8
-CONHCÜ2-
51 oder 151
51 oder 151
-CJ±>-COOH
CÜ3
u.a. NHCH2CÜ2-8CÜ2CH2COOH-(CH_2)6-CH2-
QüacüaCÜ3
Cba-Co
c-10
chb
ctlaCM3-C0
13C-NMR (CD3OD, c= 8,69-103M, 100 MHz)
27,91, 30,75 ((CH2)-Einheiten des Undecanoat); 39,45, 49,05
(CD3OD); 52,52; 161,51 (HCO3).
MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 500-2'520)
breiter Haufen 2'200-2'400 und 1'950-2100; 2597,9 (30)
Abb. 80
2511.6 (26, M+NaCN), 2430,5
2373.7 (58, M-3K++Na++3H+), 2339,2
2253,1 (100,M-((CH2)9COOK)), 2251,6
2238.3 (96, M-CH3-(CH2)9COOK),2220,72132,6 (74, M-6K++7H+-CH3-2C02),
2050.5 (72, M-CH3-(COOK)-2K++2H+-(HN(CH2)10COOK)),1959.6 (64, M-6K++7H+-CH3-6C02),
1448.4 (32, M-4x(HN(CH2)10COOK)-CO2+Na+),
1129,3 (46, M-5x(HN(CH2)10COOK)-CH3-((CH2)3COOK))
(FAB(-), 3-NOBA, m/z 500-2500)
(40, M-2K++2Na++H+),
(90, M-5K++3Na++3H+),
(100, M-(COOK)-4K++Na++5H+),
(98, M-6K++7H+-CH3),
breiter Signalhaufen 2'200-2'400 2464,6 (37,
2426,9 (34, M-CH3+H-K+), 2405,4 (40,
2374,5 (46, M-4K++3Na+), 2358,5 (64,
2327,5 (74, M+H20-4K++3H+), 2304,4 (83,
2287,7 (100, M-5K++4H++H20), 2271,6(90,
2251,7 (83, M-6K++Na+), 2219,7(72,
2123,7 (32, M-(CH)7-4Kn3H+-2C02),1148,3(21,
851,5 (15, M-COOK-6x((CH2)i0COOK))
M-K++Na++H20),
M-2K++Na+),
M-CH3--5K++3Na+),M CH3+H2C03-6K++5H+),
M-5K++4H+),
M-6K+-CH3+5H+),
M-5K++4H++Na+-)
195
6.5.2 Adenosylierungen
Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20)
CN
iCN
24
C47H52014N6COK7
a. Praparative Synthese
In einer glove-box (20 ppm 02) wurden 38,6 mg Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) (3,02-10"5 mol) in 4,0 ml Methanol gelöst und mit 10 pl (1,75-10"4mol, 5,6 Äquivalent) Essigsäure, 15,6 ml Pt02 und Wasserstoff analog 17 zum
Co(ll)-cobyrinat reduziert. Nach 70 min heftigem Rühren lag gemäss UV/vis-
spektroskopischer Kontrolle quantitativ Co(ll)-cobyrinat vor. Man filtrierte den
Katalysator mit einer mit Glaswatte gefüllten Pipette und zog das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer mit HV ab.
Zur Alkylierung wurde das erhaltene Co(ll)-hexakalium-cobyrinat in 4,0 ml
Methanol gelöst, zuerst 15,9 mg (1,37 Äquivalent) 5'-lodo-5'-deoxy-adenosin, dann
NaBH4 in Portionen zu 22, 20 und 11 mg zugefügt (insgesamt 100 Äquivalente)39.Das nach Beendigung der Gasentwicklung (ca. 7 min) bezüglich Corrinchromophor DC-
einheitliche Produkt wurde 40 Minuten nach der NaBH4-Zugabe aus der Glovebox
genommen und die Lösung am Rotationsverdampfer am Wasserstrahlvakuum bei
Raumtemperatur getrocknet.
Der in 15 ml 6%iger wässriger H3PO4 gelöste Rückstand Hess sich auf eine C-18
Kartusche unter vollständiger Entfärbung der Lösung aufziehen. Man wusch mit 30 ml
Wasser, benetzte die Kartusche mit ca. 0,1 ml gesättigter KHC03-Lösung und eluierte
vollständig mit 5,0 ml MeOH. Das Methanol wurde am Rotationsverdampfer, das
Wasser anschliessend durch Lyophilisation am HV entfernt.
Der in 1,0 ml MeOH aufgenomme Rückstand wurde durch Glaswatte filtriert und mit
50 ml Aceton gefällt. Der Niederschlag setzte sich innerhalb zwölf Stunden bei 4 °C ab.
Nach Abpipettieren der schwach gefärbten Mutterlauge (Substanzverlust gemäss
UV/vis-Spektrum < 2%) wurde zuerst am Rotationsverdampfer, dann 24 h am HV
(0,05 Torr) getrocknet.Das verbleibende, lichtempfindliche, braune Pulver (34,5 mg, 76 %) gelangte zur
Charakterisierung.
1
Hfi
20
CssHfieOisNgCoKs
Unter heftigem Schäumen eintretende Farbaufhellung.
196
CssHeeOisNgCoKe
mw. 1434,712
DC (RP-18, MeOH/H20 1:1)
rf= 0,66
UV/Vis (H20, c= 2,16.10-5 M)
460
302
( 4 '836),
(10'360),
400
262
{ 3'685),
( 19'670)
Sh 345 ( 8-980),
CD (H20, C= 2,16.10-5 M)Abb. 25
Allg. Teil 212 ( 3,57), 221 ( 0,92), sh 246 ( -4,84)305 ( 2,53),sh 330 ( 8,41), 341 ( 8,41)382 ( -0,58), 401 ( 0,23), 433 ( -3,34)493 ( -1,61), 565 ( 1,27),
Abb. 81
X0 bei 208, 227, 287, 368, 396, 404, 521
(1,2 mg in 300 mg KBr)
3400 (s) 2970 (m) 2250 (w) 2080 (w)1700 (m), sh 1668 (S) 1575 (s) 1400 (s)1332 (s) 1300 (m), sh 1260(m) 1206 (w) ,sh
1155 (w) 1125 (w), sh 1102(m) 1070 (w)1025 (w) 985 (w) 960 (w) 860 (w)
838 (w) 800 (w) 690 (w) 670 (w)645 (w) 580 (w)
1 H-NMR (D20, C= 2,40-10-2M, 300,13 MHz)Abb. 24
Allg. Teil 8,08 (breit) S, 1H A-2 oder 8
7,95 S, 1H A-2 oder 8
6,77 S, 1H C-10
5,54 d, 1H J= 4,5 Hz C-1'
4,52 d'oid,1H J=10,5 Hz C-19
4,48 t'oid ,1H J= 4,5 Hz C-2'
4,14 d, 1H J- 8 Hz C-3
3,72 m, 1H Ji= 9 Hz J2=3,5Hz C-8
3,60 t, 1H J= 5Hz C-3'
3,07 m, 1H C-13
2,74 t'oid, 1H C-18
2,34 s, 3H 51 oder 151
197
1 i i i i i i i i I' ' '
I
4'OCIO 3'500 3000 2'500 2000 1'800 1'600 V400 1'200 1000 800 600 400
cm-1
Abbildung 81: IR-Spektrum von 1,2 mg Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'adenosyl-cobyrinat (20), in 300 mg KBr
ppm 9876543 2 10
Abbildung 82: 1 H-NMR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20) in Deuteromethanol, c= 3,34-10-2M, 300,13 MHz
198
2,23 s, 1H 51 oder 151
2,12 m C-4'
1,72 s, 1H CH31,48 s, 1H CH31,36 s, 1H CH30,94 s, 1H CH30,75 s, 1H CH30,57 s, 1H CH30,32 d, 1H J= 8,1 Hz C-5' a
0,04 t, 1H J= 8,8 Hz C-5' ß
Entkopplungsexperimente
eingestrahlt Beobachtung
5,53 ppm
3,75 ppm
3,60 ppm
0,04 ppm
4,48 t+d zu d+d
keine ÄnderungenIntensitätsverschiebung bei 2,14;
4,48 d+t zu d+d
0,32 d zu s; 2,14 Intensitätserhöhung
1 H-NMR (CD3OD, c= 3,34-102 M, 300,13 MHz)Abb. 82
1,59
1,28
1,19
1,90-1
0,90
0,75
0,64
0,03
s,
s,
d,
m,
m,
t,
8,29/8,22/8,16
8,08
6,82
5,62
4,35 breit
3,97
3,74
3,10
2,99 breit
2,74
2,70
2,57
2,43
2,80-2,20
2,20-1,90
1,81
2H
1 H
1 H
3H
1 H
1 H
J =
J =
d'oid,1 H
t, 1 H
1 H
1 H
s, 3H
s, 3H
insgesamt 20 H
insgesamt 15 H
s, 3H
s, 6H
s, 3H
00 insgesamt 15 H
s, 3H
d, 1 H J =
s, 3H
t, 1 H J =
3,1 Hz
6,4 Hz
9,7 Hz
7,9 Hz
8,7 Hz
A2 oder A8
A2 oder A8
C-10
-1'
-3,19,2'
-8
-3'
-13
-18
C-
C-
C-
C-
C-
C-
51 oder 151
51 oder 151
CH3CH3
CH3
CH3C-5'a
CH3
C-5'ß
199
13C-NMR (D20, c= 3,34-10-2M, 75 MHz, jedes Signal entspricht einem C, breit¬
bandentkoppelt und DEPT)17,868
19,480
22,015
29,903
35,295
37,679
43,308
49,106
55,124
61,306
78,017
90,508
110,219
151,470
167,170
178,168
181,567
184,639
185,096
(q C51 )
(t, A 5' )
(q C 12A )
(t, C31 )
(t, C 172 )
(t, 181/132
(d C 18 )
(t, C21 )
(d C 13 )
(s C 17 )
(d, A 2' )
(d, A V )
(s, C5 )
(s, A4 )
(s, C 6/14 )
(s, C 11 )
(s, COO" )
(s, COO" )
(s, COO" )
18,131
20,379
26,637
30,817
35,550
38,186
48,160
49,412
57,785
74,787
88,854
99,637
121,840
155,415
167,170
179,222
182,643
184,902
Zuordnung analog [107]
(q, C 151 )
(q. C2A )
(q, C 1A )
(t, C 131 )
(t, C 171 )
(t, 181/132
(t. C71 )
(s, C 2/12 )
(d, C3 )
(d, A 3' )
(d, A 4' )
(d, C 10 )
(s, A 5 )
(s, A2 )
(s, C 14/6 )
(s, C 4/16 )
(s, COO" )
(s, COO" )
19,325 (q C 17B )
21,645 q C7A )
29,522 t, C 81 )
33,547 q C 12B )
37,514 t, C 82 )
40,870 t, C32 )
48,362 s C 2/12 )
52,343 s, C7 )
58,339 d, CS )
74,787 d, C 19 )
89,552 s, C1 )
109,348 s, C 5' )
143,805 s, A 8 )
158,264 s, A 6 )
174,640 s, C9 )
179,553 s C 4/16 )
182,643 s, COO" )
184,966 s, COO" )
b. Versuch der präparativen Alkylierung via Wirt-Gast-KomplexZu in 5,0 ml Phosphatpuffer, pH7, gelöstem Co(ll)-cobyrinat (3,0-10e mol) wurden
ca. 25 mg 5'-0-Tosyladenosin gegeben, die Probe 15 Minuten Ultraschall ausgesetzt,anschliessend zentrifugiert, die nun klare Lösung abpipettiert und unter Lichtaus-
schluss und Stickstoff mit 15 mg NaBH4 in mehreren Portionen versetzt40.
Der Cyanidtest nach jeder NaBH4-Zugabe lieferte keinerlei Hinweis auf Alkylierung.Das UV/vis-Spektrum der Reaktionslösung zeigte nach beendeter NaBH4-Zugabe bei
>400 nm nur die Struktur des Co(ll)-cobyrinat. Im 1 H-NMR-Spektrum (Abbildung
83) der Probenlösung war praktisch nur Lösungsmittel erkennbar.
-_jJ
ppm 8 7 6 5 4 3 2 1
Abbildung 83: 1 H-NMR-Spektrum des Produktes der versuchten Adenosyl¬
ierung von Co(l)-cobyrinat in CD3OD via einen isolierten Komplex von Co(ll)-
cobyrinat mit 5'-0-Tosyladenosin (15)
40vgl. Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"
N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (18)
200
Hexakalium-Coa-aquo-Coß-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',
N"'\N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18)
1 7 18
Ci 24H199O21 N13C0K7 Ci32H2i 1O25N1 6C0K6
a. Praparative Synthese
Es wurden 31,9 mg (1,25-10-5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in 4,0 ml
Methanol gelöst und in einer Glove-Box (02= 15 ppm) mit 25,7 mg P1O2, 10 ml
Essigsäure und Wasserstoff analog 24 zum Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) reduziert. Nach zwei Stunden
heftigen Rührens war der Umsatz zum Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) gemäss UV/vis-Spektrum quantitativ, und die
dunkelbraune Lösung wurde nach Entfernung des Katalysators durch Filtration durch
Glaswatte am Hochvakuum zur Trockene eingedampft.
Der Festkörper wurde in 1,0 ml Methanol gelöst, mit 73,4 mg NaBH4 (155 Äqui¬valente) versetzt41 und schliesslich 9,4 mg (2,17 Äquivalente) 5'-lodo-5'-deoxy-adenosin zugegeben. Die Reaktionslösung färbte sich augenblicklich hellbraun.
Zur Aufarbeitung entnahm man sodann die Reaktionslösung der Glove-box, versetzte
mit 7,0 ml eines 1,0 molaren Phosphatpuffers (pH 4,5) und zog am
Rotationsverdampfer das Methanol ab. Dabei bildete sich unter vollständiger
Entfärbung der Lösung ein brauner Niederschlag, welcher quantitativ abzentrifugiertwerden konnte.
Der amorphe Niederschlag Hess sich mit 10 ml ges. KHC03-Lösung langsam lösen und
derart gelöst auf ca. 10 ml XAD adsorbieren. Das XAD wurde zuerst mit 20 ml ges.
KHC03-Lösung gewaschen, dann mit 200 ml Wasser entsalzt. Die Elution mit 40 ml
Methanol führte zur vollständigen Entfärbung des XAD-Harzes. Man entfernte das
Methanol am Rotationsverdampfer, das verbleibende Wasser durch Lyophilisation.Das hellbraune Produkt fiel mit 8,0 ml Aceton aus 0,1 ml Methanol quantitativ aus42.
Nach Zentrifugation wurde der Niederschlag nochmals in 10 ml Aceton suspendiert und
zentrifugiert. Die Fällung wird wiederholt und das Produkt 24 h am Hochvakuum
getrocknet.Es verblieben 26,6 mg (89,2 %) 18 in Form eines feinen, braunen Pulvers.
41 Heftige Schaumentwicklung und Grünfärbung42 Die Mutterlauge war farblos.
201
Cl32H21l02sNi6CoK6
mw. 2715,769
DC (RP-18, MeOH) rf - 0,56
UV/Vis (H20, c= 1,45-10-5 M)
263 (20'550),350 ( 9'140),
304 (12'520), 314 ( 11'830),sh385 ( 4'860), sh 458 ( 5'240)
CD
Abb. 84
(H20, c= 1,45-10-5 M)
216 (306 (401 (573 (
2,59),
3,28),Sh1,03),
2,76),
253 (331 (431 (
-0,10),
12,40),
-5,17),
X0 bei 211, 225, 293, 365, 391, 409, 528
280 (378 (502 (
-2,93),sh
-1,21),
-2,41),
•l t* l e
t
cotmcH,),fioom
—-. CH, I f-CONHICH,)^:OOK<:OOC(CH,)rflNOC -
KOOCICHJJINOC
CH,
CONHKHJxpOOl
KOOC(CH,)jmOC^ CONH(CH,I^COOK
Abbildung 84: CD-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-
cobamido- N, N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) (18) in Wasser, c= 1,45-10'5 M
Hz6,7J=H1t,
H1m,
H1m,
Hz9,9J=H1d,
Hz1,9J=H1d,
H1s,
H1s,
H1s,
C-3'Hz6,7J=H1t,
3,75
3,98
C-2'H1m,
4,38
4,43
C-rHz1,9J=H1d,
5,70
6,88
7,98
8,26Allg.Teil
26Abb.
MHz)300,138,26-103M,c=(CD3OD,1H-NMR
dzumppm4,26ppm5,51
kollabierteingestrahlt
Entkopplungsexperimente
aC-5'H1m,0,28
1,17&1,42Maxima,
H143ca.insgesamt,401,60-0
CH33Hs,0,67
CH33Hs,0,80
CHg3Hs,1,56
CH3H3s,1,69
2,06MaximumH,45ca.insgesamt,602,60-1
151oder513Hs,2,27
151oder51H3s,2,32
H15ca.insgesamt,603,40-2
C-3'u.a.2Hm,3,63
H1m,4,18
C-2'H1m,4,26
c-rH1d,5,51
C-10H1S,6,87
8oder2AH1S,7,88
8oder2AH1S,ppm8,13
85Abb.
MHz)300,13M,5,36.10-3c=(D20,1H-NMR
(m)720(w)800(w)1040
(m)11101155(m)(w)1205(w)1220
(m)1250sh(m),1265(m)1310(m)1350
(s)14051465(m)(m)1495(s)1570
(s)1645(w)2410(w)2480(s)2860
(s)2920(m)3080(m),sh3290(s)3425
KBr)mg300inmg(1,0
202
203
CH?
KOOC<CH,),JINOC
CONHtCH,),£00*
CH, I f-CONHfCHJxPOOfK00C(CH,)^N0C-
CONHICH
jnOCICHjtxJINOC CONH(CH,),^COOK
h£°oi
(U)
Vj^^Jczr
876543210ppm
Abbildung 85: 1 H-NMR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido- N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat) (18) in Deuteriumoxid, c= 5,36.10-3 M, 300,13 MHz
2,86 d, 1 H J = 16,1 Hz
3,40-2,80 insgesamt ca 15 H
2,44 s, 3H 51 oder 151
2,39 s, 3H 51 oder 151
2,60-2,15 insgesamt ca 33 H, Maximum 2,16
1,77 s, 3H CH3
2,15-1,70 insgesamt ca. 17 H
1,25 s, 3H CH3
1,70-1,00 insgesamt ca. 125 H, Maxima 1,60 & 1,18
0,97 s, 3H CH3
0,86 s, 3H CH3
0,78 s, 3H CH3
0,40 d, 1 H J= 7,5 Hz C-5'ß
0,30 t, 1 H J= 7,5 Hz C-5'a
Entkopplungsexpenmente
eingestrahlt kollabiert
0,25 ppm keine Veränderung sichtbar
4,28 ppm 3,76 ppm, t zu d / 5,68 ppm, d zu s
5,68 ppm 4,30 ppm, m zu d
204
13C-NMR (CD3OD, c= 1,26.10-2M, -1,0 °C, breitbandentkoppelt & DEPT)
16,37, 6,90, 17,35, 18,58, 20,00, 20,09, 20,63, (q, Je 1C )25,26 ( 1 C ) 26,29 1C ) 27,96 (t, ca 14 C )28,22 (t, ca 4C ) 28,28 ;t, ca 3 C ) 28,41 (t, ca 2C )
29,70 ( 1 C ) 29,94 1C ) 30,49 (t, ca 3C )
30,53 (t, ca 3C ) 30,61 ;t, ca4C ) 30,70 (t, ca 7C )
30,87 (t, ca 7C ) 30,91 t. ca7C ) 30,98 (t, ca 7C )31,07 (t, ca 7C ) 32,32 q, 1 C, C12B) 33,53 (t, 1 C )
33,88 (t, 1 C ) 34,02 t, 1C ) 34,92 (t. 1 C )
35,53 (t, 1 C ) 36,98 t, 1C ) 39,40 (t, ca 7C )
40,57 (t, 2C ) 40,74 t, 2C ) 41,10 (s, 1C.C2/12)
43,88 (d,1C, C18) 44,79 s, 1C.C2/12) 46,94 (d,1C,C3/8/13)48,04 (d,1C,C3/8/13) 51,61 s, 1C, C7) 54,00 (d,1C,C3/8/13)60,32 (s, 1C, C17) 73,98 d, 1C, A3') 74,56 (d,1C,A27C19)76,37 (d,1C,A27C19) 86,14 d, 1CA4711) 88,40 (s, 1C, C1)89,44 (d,1C A1714) 98,74 d, 1C, C10) 108,28 (s, 1C, C5/15)
109,35 (s, 1C,C5/15) 120,26 s, 1C A5) 150,53 (s, 1C, A8)
154,44 (s, 1C A4) 157,55 s, 1C, A2) 161,60 (s, 1C, A6)
164,18 (s, 1C, C6/14) 165,61 s, 1C C6/14)
172,00;1 73,03;173,39; 173,50; 174,58; 174,62; 174,67; 174,93;
174,99; 177,40; 178,00 (je 1CC.ON und C-4, 9, 12, 16)
183,18 (s, 7C, -COO") Zugeordnet analog [106]
MS (FAB(-), 3-NOBA, m/z 500-2V00)
2426,4 (58,
2349,5 (100
2039,7 (50,
1767,6 (28,
1616,4 (20,
1469,3 (25,
1179,3 (44,
1156,0 (40,
1147,2 (50,
M-Ado-K++H++H-) 2388,7 (70, M-Ado-2K++2H+-i
M-Ado-3K++3H++H") 2249,4 (80, M-Ado+CH2"-6K+
M-Ado-14x(CH2)-6K++6H+)
M-Ado-24x(CH2)-3C02-6K++6H+)
M-Ado+H20-33x(CH2)-4C02-6K++6H+)
M-Ado-39x(CH2)-5C02-6K++6H+)
M-Ado-6xHN-6K++6H+-47x(CH2)-7C02)
M-Ado-6xHN-6K++6H+-50x(CH2)-7C02+H20)
M-Ado-6xHN-5K++6H+-52x(CH2)-7C02)
H")f6H+
b. Versuch der präparativen Alkylierung zu 18 via Wirt-Gast-
Komplex
7,6 mg (3,0-10-6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) wurden analog 24 in 5 ml
Methanol gelöst und mit 5 ul Essigsäure, 11,9 mg Platindioxid und Wasserstoff
während einer Stunde zu Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) reduziert43. Der Katalysator wurde sodann durch Watte
abfiltriert und die Lösung am Rotationsverdampfer getrocknet.
43 Siehe 7.5.1, quantitativ gemäss UV/vis-Spektrum
205
In einer Glove-box löste man das Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"", N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, versetzte mit
25,6 mg (6,1-10'5 mol) 5'-0-Tosyladenosin (15) und beschallte das gutverschlossene Gefäss nach Entnahme aus der Glove-box während 15 Minuten mit 50
kHz Ultraschall. Suspendiertes Material wurde abzentrifugiert. Man verbrachte das
Gefäss wieder in die Glove-box, wo 15 mg (0,41 mM) Natriumborhydrid zur
abpipettierten Lösung zugegeben wurden. Nach beendeter Reaktion (UV/vis-
spektroskopische Kontrolle) wurde die Lösung der Glove-box entnommen.
Die Aufarbeitung erfolgte analog der Synthesevariante a des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat) (18).
Das 1 H-NMR-Spektrum des Produktes (Abbildung 86) in Deuteromethanol war
identisch mit dem des 18 enthielt aber als Verunreinigung ca. 1,5 Äquivalente S'-O-
Tosyladenosin (15). Das UV/vis-Spektrum entsprach im Bereich oberhalb 300 nm
dem des Beschreibungsansatzes des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (18).
Nach Zugabe von KCN in der Dunkelheit und Stehenlassen der Lösung, bis zur Konstanz
des UV/vis-Spektrums wiederholte man die Messung des 1H-NMR-Spektrums in
Deuteromethanol. Das 1H-NMR-Spektrums des erhaltenen Produkts war nun
abgesehen von der Verunreinigung durch 5'-0-Tosyladenosin identisch mit
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17).
J I I I I I I L
8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
Abbildung 86: Hexakalium-Coa-aquo-Coß- 5'- adenosyl- cobamido- N, N', N", N"\
N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (18) in CD3OD, synthetisiert via
isolierten Komplex von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,
verunreinigt mit ca. einem Äquivalent 5'-0-Tosyladenosin (15)
206
6.5.3 Alkylierung mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat
(15) und 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin
unter Natriumborhydridreduktion
Produkt der Umsetzung mit Co(l)-cobyrinat (31)
a) mit 5'-Chloro-1,N6-ethenoadenosin
Man reduzierte 33,8 mg (2,69-105 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24) mit 20,5 mg Platindioxid, 16 ui Essigsäure und Wasserstoff in einer Lösungvom 5 ml Methanol analog 1744 zum Co(ll)-cobyrinat.Die am Rotationsverdampfer getrocknete Hexakalium-Co(ll)-cobyrinsäure wurde
zusammen mit 121,9 mg (3.74-10"4 mol, 13,9 Äquivalente) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin-H20 in 5 ml Methanol gelöst und in Abständen von ca. 20
Minuten 412 mg (1,09-102 mol, 404 Äquivalente) NaBH4 in ungefähr fünf
gleichgrossen Portionen zugegeben. Die Reaktion war gemäss UV/vis-Spektrum und
Cyanidtest nach zwei Stunden quantitativ abgelaufen (konstantes Spektrum).
Zur Aufarbeitung versetzte man zuerst mit 3 ml 1M wässrigem Phosphatpuffer, pH 3,
sowie 5 ml Phosphatpuffer pH 4,5 und zog das Methanol nach Beendigung der
Gasentwicklung bei Raumtemperatur ab.
Die wässrige Lösung wurde durch eine SEP-Pack C-18 Kartusche geführt und solange1 M Phosphatpuffer pH 4,5 zugegeben (ca. 10 ml) bis die Substanz auf dem Trägerhaften blieb.
Der C-18 Träger Hess sich gemäss UV/vis-Spektrum der Waschflüssigkeit ohne
Substanzverlust mit 10 ml Wasser waschen und das Produkt 31 mit 8 ml Methanol
vollständig eluieren. Die Kapazität der verwendeten SEP-Pack Kartuschen lag bei ca.
40 % der hier verwendeten Substanzmenge, sodass der Adsorptions- und
Elutionsvorgang zweimal zu wiederholen war.
44 Siehe 7.5.1
207
Von den vereinigten Eluate wurden zuerst am Wasserstrahl das organische Lösungs¬mittel abgezogen, anschliessend die zurückbleibende wässrige Lösung lyophilisiert.Das Rohprodukt enthielt nach viermaliger Fällung (anfangs gelöst in jeweils 5 ml
Methanol mit 100 ml Aceton gefällt, dann dreimal gelöst in 0,2 ml Methanol und mit
10 ml Aceton gefällt) und 12 stündiger Trocknung am Hochvakuum noch ca. 10 % 5'-
Chloro-5'-deoxy-l,N6-etheno-adenosin.Die praparative Dünnschichtchromatographie des Rohproduktes auf einer RP-18
Platte 10 x 20 cm, Methanol:H20 , 6,5:5, lieferte drei Banden (rf= 0,07 fluoreszier¬
end, rf= 0,41 dunkelbraun, rf= 0,45-0,64 hellbraun). Die Letzteren enthielten die
als Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) ver¬
mutete Substanz wobei nur die Bande mit rf= 0,41 gemäss 1 H-NMR-Spektrum frei
von Verunreinigungen durch Alkylierungsmittel war. Das methanolische Eluat dieser
Fraktion wurde nach Einengen am Rotationsverdampfer auf ca. 0,1 ml mit 8 ml Ether
gefällt, der feine Niederschlag bei 4'000 Upm während fünf Minuten abzentrifugiert,die farblose Mutterlauge dekantiert und der braune, pulvrige Rückstand (3,8 mg, 10
%) 48 Stunden am Hochvakuum getrocknet.
C56H660i8N8CoNae
mw. 1335,465
DC (RP-18, CH3OH:H20, 10:2)
rf= 0,20
1 H-NMR (CD3OD, C= 3,72-103M, 300,13 MHz)
7,33 ppm s, 1 H Alkylrest7,16 S, 3H Alkylrest6,83 S, 1 H C-10
5,36 d, 1 H J = 3,8 Hz C-1-
4,98 d, 1 H J- 9,8 Hz C-19*
4,27 d, 1 H J = 8,6 Hz C-3*
4,00 m, 2H C-2', C-8*
3,47 t, 1 H J = 6,2 Hz C-3'
3,00 t, 1 H J = ca. 9 Hz C-18*
2,47 s, 3H 51 oder 151
2,45 s, 3H 51 oder 151
2,24-2,90 m, insgesamt ca. 25 H
1,80 s, 3H CH3
1,90-2,24 m, insgesamt ca. 14 H
1,60 s, 3H CH3
1,57 s, 3H CH3
1,50-1,70 m, insgesamt ca. 9H
1,34 s, 3H CH3
0,97 s, 3H CH3
0,89 s, 3H CH3
0,50 d, 1 H J = 9,0 Hz C-5'a
0,20 t, 1 H J = 7,6 Hz C-5'ß*
Zuordnung analog [107]
208
abs
2.0
0,0
Abbildung 87: UV/vis-Spektrum von 31 in Wasser, c= 4,66-10'5 M
—dcAÄ
ppm 7
M^iJLAJ_J I L-
5 4 3
Abbildung 88: 1 H-NMR-Spektrum von 31 in Deuteromethanol, c= 3,72-103
M, 300,13 MHz
209
13C-NMR (CD3OD, 100 MHz, c- 4,11 1Qr2 M, breitbandentkoppelt & DEPT)
16,60 (q, C51 ) 16,72 (q. C 151 ) 18,09 q, C 17B
19,49 (t, A5' ) 19,97 (q, C2A ) 20,95 q, C7A
25,18 (q, C 12A ) 29,01 (t(b elt)C 81 ) 32,31 q, C 1A
32,44 (q, C 12B ) 33,4 (t(brelt)C 31 ) 34,3 •(brelt)C 131
35,2 (t(br)C 172 ) 35,98 (t, C 172 ) 36,65 t(breit)C 82
37,01 (t, 181/132) 37,29 (1, C 181/132) 39,30 t, C32
41,96 (d, C 18 ) 47,08 (t, C71 ) 47,88 t, C21
51,00 (s, C 2/12 ) 54,54 (d, C13 ) 57,11 d, C3
57,24 (d, C8 ) 57,52 (d, ) 57,73 d,
57,99 (d, ) 60,81 (s, C17 ) 73,59 d, A 3'
73,82 (d, C 19 ) 75,31 (d, A 4' ) 77,68 d, A 4'
86,89 (d, ) 88,47 (s, C1 ) 88,97 s, A V
97,77 (d, C 10 ) 108,11 (s, C15 ) 108,77 s, C5
122,66 (d, ) 126,36 (s, ) 132,48 (d,
139,74 (s, ) 143,59 (s, ) 164,15 s,
167,20(s, ) 174,17 (s, C9? ) 176,58 s, coo-
178,22 (s, COO" ) 179,05 (s, COO" ) 179,42 s coo
179,95 (s, COO" ) 180,42 (s, COO" ) 180,71 s, COO"
' Zuordnung tentativ
b) mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
Man reduzierte 19,8 mg (1,56.10"5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat(24) mit 22,0 mg Platindioxid, 16 ul Essigsäure und Wasserstoff in einer Lösungvom 5 ml Methanol analog 17 zum Co(ll)-cobynnat
Zur Adenosylierung wurde das Co(lt)-cobynnat in 5 ml Methanol gelöst, mit 9,3 mg
(2,09 10 s mol, 1,33 Äquivalente) 1,N6-Ethenoadenosyl-5--0-tosylat45 (16)versetzt und nacheinander 649 mg NaBH4 in vier etwa gleichgrossen Portionen
zugegeben Der Cyanidtest zeigte nach einer Stunde das Ende der Reaktion an
Zur Aufarbeitung versetzte man die Reaktionslösung mit 25 ml 1 M Phosphatpuffer,
pH 4,5, zog das Methanol am Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur ab, und
adsorbierte das Produkt durch Spülen der klaren Lösung durch drei SEP-Pack
Kartuschen unter praktisch vollständiger Entfärbung der Lösung Die Kartuschen
wurden daraufhin jeweils mit 5 ml H20 gewaschen, anschliessend mit 5 ml Methanol
das Produkt vollständig eluiert Das Produkt 31 liess sich nach Abziehen des
Lösungsmittels am Rotationsverdampfer und am HV mit 50 ml Aceton aus 1,4 ml
Deuteromethanol fällen Nach zwei Stunden bei 5 °C konnte die nur schwach gefärbte
Mutterlauge vom Bodensatz abpipettiert werden Das nach dieser ersten Fällung gemäss
DC noch als Verunreinigung enthaltene Tosylat 16 trennte bei einer zweiten, analogen
Fällung ab
Das am HV während 48 Stunden getrocknete, hellbraune Pulver (11,5 mg, 50,0 %)
gelangte zur Charakterisierung
aus Beschreibungsansatz
210
UV/Vis (H20, C» 4,66-10-5 M)Abb. 87
263 ( 32-900) 293 ( 25'300), sh 301 ( 25'200),374 ( 8'180),sh 393 ( 7'260), Sh 454 ( 8'650)
CD (H20, c- 4,66-10-5 M)Abb. 89
218 ( 5,36), 250 ( -15,50), 279 ( -2,79),sh302 ( 6,22),Sh 328 ( 23,60), 378 ( -3,86),401 ( 1,07), 432 ( -7,08), 503 ( -5,79),567 ( 3,43),
X0 bei 211, 228, 288, 360, 395, 408, 531
IR (1,2 mg in 300 mg KBr)Abb. 90
3430 (s) 2970 (m)1490 (m) 1400 (s)1200 (w) 1130 (m)990 (w) 932 (w)
1760 (w), sh 1570 (s)1350 (m), sh 1300 (m)1105 (m) 1050 (w)820 (w) 735 (w)
670 (w),sh 610 (w),sh 545 (m)
1 H-NMR (CD3OD, c= 1,13-102M, 300,13 MHz)
7,33 s, 1 H Alkylrest7,14 s, 3H Alkylrest6,82 S, 1 H C-10
5,36 d, 1 H J = 3,8 Hz C-1'
5,12 d, 1 H J = 10,6 Hz C-19*
4,31 d, 1 H J = 8,7 Hz C-3*
4,02 m, 1 H C-2-+
3,98 m, 1 H C-8*
3,47 t, 1 H J = 6,3 Hz C-3'+
3,28 m, 1 H C-13*
3,03 (breit) t, 1 H C-18*
2,78 (breit) q, 2H
2,65- 1,80 ca. 26 H
2,47 s, 3H 51 oder 151
2,45 s, 3H 51 oder 151
1,79 s, 3H CH3
1,60 s, 3H CH3
1,57 S, 3H CH3
1,35 S, 3H CH3
0,97 s, 3H CH3
0,88 s, 3H CH3
0,54 d, 1 H J= 3,07 Hz C-5'
0,15 t, 1 H J = 17,77 Hz C-5'
Zuordnung aufgrund Entkopplungsexpenment;* Zuordnung analog [107]
211
Abbildung 89: CD-Spektrum von 31 in Wasser, c= 4,66-10"5 M
-I l • I I I' '
I ' ' ' l ' ' i ' ' i
4'000 3'500 Stt» 2'500 2'000 1800 V600 V400 1'200 l'OOO 800 600 400
cm-1
Abbildung 90: IR-Spektrum von 1,2 mg 31 in 300 mg KBr
212
Entkopplungsexperiment (300,13 MHz)
eingestrahlt bei
5,36 ppm
3,48 ppm
0,54 ppm
Änderungen im Spektrumm, (4,05 ppm) zu d, J=ca. 6 Hz
m, (4,05 ppm) zu d, J= ca. 6 Hz
Wirkung auf C-4' nicht sichtbar
t, (0,15 ppm) zud, J= 12,4 Hz
MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 500-1'500)Abb. 91 1394 (0,002; M-Na++2K+);
1379 (0,004; M+H20+Na+);1356 (0,005; M+H20+H+);1336,9 (0,010; M+H+);1317 (0,007; M-Na++2H+);1117,6(5; M-Alkyl-Na++2H++H20);1096,5 (13; M-Alkyl-2Na++3H++H20);1075,5(17; M-Alkyl-2Na++3H+);1058,5 (18);1037,1 (23);
1021,1 (18);998,1 (15;);975,9 (12; Ringfragment).
(FAB(-), 3-NOBA, m/z 50-1'500)1370.4 (1,5);1312.5 (2,0; M
1155.6 (1,1)958,2 (1,9)882,2 (1,5)837,4 (1,6).
1337,4 (1,0; M-);-2Na++3H++H20); 1274,6
1035,2 (2,6)928,3 (1,3);851,3 (1,5);
(1-8);
Abbildung 91: FAB(+)-MS-Spektrum von 31, Matrix 3-NOBA
213
Produkt der Umsetzung mit Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"", N""',N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (32)
1 7 32
Cl24Hl9902iN-|3CoK7 ?
Analog der bereits beschriebenen Vorgehensweise46 reduzierte man 69,6 mg
(2,74-105 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) in einer Lösung vom 5 ml Methanol mit
33,0 mg Platindioxid, 100 ml Essigsäure und Wasserstoff.
Das am HV getrocknete Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) wurde zusammen mit 194,1 mg (5,96-10-4 mol,
21,7 Äquivalente) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin-H20 in 5 ml Methanol
gelöst und in Abständen von einigen Stunden 652 mg (1,79-10"2 mol, 237
Äquivalente) NaBH4 in vier ungefähr gleichgrossen Portionen zugegeben. Die
Reaktionslösung, die gemäss UV/vis-Spektrum und Cyanidtest nach 18 Stunden weder
Co(l)- noch Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) enthielt, wurde mit 7 ml 1 M Phosphatpuffer pH 9 versetzt und das
Methanol noch in der Glove-Box am HV47 entfernt.
Die Lösung wurde solange mit kristallinem KHCO3 versetzt bis der Chromophorquantitativ an 5 ml XAD adsorbierte. Nach Waschen mit 10 ml Wasser und Elution mit
10 ml Methanol wurde das Lösungsmittel entfernt.
Das in ca. 10 ml Wasser gelöste Rohprodukt wurde mit ca. 200 mg kristallinem KHCO3versetzt und die Substanz auf drei SEP-Pack Kartuschen aufgezogen. Man wusch
anfangs jeweils mit 120 ml MeOH:H20,1:2, und erhöhte dann für die nächsten 200 ml
den Methanolanteil auf 80 %. Die durch anschliessende Elution mit 20 ml Methanol
erhaltene hellbraune Lösung trocknete man am Rotationsverdampfer und anschliessend
am HV. Der derart erhaltene Lack wurde in 0,1 ml Methanol aufgenommen und mit 5
ml Ether gefällt. Der während fünf Minuten bei 4000 Upm abzentrifugierteNiederschlag 32 gelangte nach 48 Stunden am HV als hellbraunes Pulver zur
Charakterisierung.
46 Siehe 7.5.1
47 Bildung eines temporären Niederschlages
214
Cl33H21l02sN15CoK6
mw. 2713,773
DC (RP-18, CH3OH/H20, 50:10)
rf= 0,10
UV/Vis
ä I
(H20, c= 5,65-10-5 M)
264 ( 24-200), 303 ( 16'730), 314 ( 15'130), sh
380 ( 6'270), 454 ( 6'520).
CD (H20, c= 5,65-10-5 M)Abb. 92
251 ( -12,40), sh 260 ( -13,80), 280 ( -4,42),sh
306 ( 6,02), Sh 330 ( 20,40), 378 ( -1 ,42),
401 ( 1,95), 434 ( -7,08), 505 ( -4,25),568 ( 3,36)
X0 bei 220, 292, 363, 390, 411, 532 nm
\J
Abbildung 92: CD-Spektrum von 32 in Wasser, c= 5,65-105 M
215
1 H-NMR (CD3OD, c= 4,95-W3M, 300,13 MHz)Abb. 93
7,29 ppm
7,13
6,91
5,36
4,97
4,54
4,00
3,51
3,45
3,26
2,90
2,66
2,48
2,42
2,24
2,22
2,00
1,77
1,66
1,59
1,43
1,32 (breit)
1,21
0,99
0,83
0,46
0,34*
Zuordnung
S,
S,
S,
d,
d,
d,
m,
t,
m,
1 H
3H
1 H
1 H
1 H
1 H
2H
1 H
1 H
3,0 Hz
9,9 Hz
7,5 Hz
8,7 Hz
-3,20
-2,46
ca. 48 H
s, 6H
s, 3H
ca.9H
ca.6H
ca.9H
ca. 24 H
s,ca. 3 H
s, 3H
m, ca. 24 H
s, 6H
m, ca. 48 H
s,ca. 3 H
s, 3H
s, 3H
d, 1 H
t, 1 H
analog [107]
7,5 Hz
7,0 Hz
AlkylrestAlkylrestC-10
V
19
3
2-,8
3'
13
18
-C-NH-CO-
CH3
u.a.CH3
u.aCH3u.a.CH3-a-coo-
CH3
CH3
aliphat.Kette
aliphat.Kette
CH3CH3C-5'
C-5'
=JJct
Abbildung 93: 1 H-NMR-Spektrum von 32 in Deuteromethanol, c= 4,95-10'3 M,
300,13 MHz
216
6.5.4 1,N6-Ethenoadenosylierungen
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21)
j^^
24 2 1
C47H52O14N6C0K7 Cs/HseOisNgCoNas
a1. Zugabe des Alkylierungsmittels nach elektrochemischer Erzeugungdes Co(l)-cobyrinat
32,4 mg (2,58-10'5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) wurden mit
13,3 mg Pt02, 10 ml Essigsäure und Wasserstoff analog (17) zu Co(ll)-cobyrinat in
einer Glove-box reduziert, in 7 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, Methanol/Wasser,
1:1, gelöst und in eine Elektrolyseapparatur gemäss (105] gefüllt. Nach vier Stunden
bei einem Potential von -1,2 V, nachdem der Strom auf unter 5% des Anfangswertes
gefallen war, fügte man 62,5 mg (1,92-10-4 mol, 7,4 Äquivalente) kristallines 5'-
Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin zu (7,6.10-5 Faraday, 3,0 Äquivalente).
Zur Aufarbeitung entfernte man 40 Minuten später am Rotationsverdampfer das
Methanol und versetzte die verbleibende wässrige Lösung solange mit 1 molarem
Phosphatpuffer, pH 4,5, bis das Produkt auf SEP-Pack C-18 (4 ml Kartusche)adsorbierte. Das Adsorbat wurde mit 80 ml Wasser gewaschen, mit 5 ml Methanol das
Corrin vom C18-Träger eluiert, das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei RT
abgezogen, der Rückstand mit ca. 1 ml Wasser versetzt und NaHC03 kristallweise
dazugegeben bis der Festkörper vollständig in Lösung ging.
Aus der am Rotationsverdampfer bei RT auf ca. 0,4 ml eingeengten Lösung wurde das
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) mit 8 ml
Aceton quantitativ gefällt. Nach Wiederholung der Fällung war das Präzipitat DC-
einheitlich und Hess sich nach Lyophilisation (Ausbeute gemäss UV/vis-Spektrum
87%) wie folgt charakterisieren.
C57H660l8NcjCoNa6
mw. 1361,482
217
DC (RP-18, CH3OH:H20, 7:3)
rf= 0,74
UV/Vis (H20, C= 4,41-10-5 M)Abb. 94
225 ( 43'630), 264 ( 24'410),302 ( 2V040), 372 ( 7'320),sh
274 ( 18-190),Sh454 ( 8-000)
CD
Abb. 95
(H20, C- 4,41-10-5 M)
235 ( 7,94), 260 (305 ( 7,48), sh 328 (433 ( -7,94), 501 (
-7,26), 280 (
22,70), 383 (
-6,12), 512 (
X0 bei 228, 242, 293, 362, 529 nm
1 H-NMR (D20, C= 2,00-10-2 M, 300,13 MHz)
Abb. 28
-5,22),-3,63),
4,54),
8,96 ppm S, 1 H A-2+
8,11 S, 1 H A-7+
7,93 d, 1 H J = 1,5 Hz A-10 Oder 11
7,53 d, 1 H J = 1,5 Hz A-10 oder 11
6,75 s, 1 H C-10
5,67 d, 1 H J = 4,1 Hz C-1'
4,54 d, 1 H Jf 4,1 Hz J2= 1,5 Hz C-19"
4,51 dd, 1 H A12"
4,14 d, 1 H J = 7,6 Hz C-3+
3,72 m, 2H A3' +, C8 0.13
3,08 m, 1 H C-8 oder 13+
2,71 t, 1 H C-18"
2,70-1,00 ca. 27 H (ohne bereits zugeordnete)
2,33 s, 3H 51 oder 151
2,21 s, 3H 51 oder 151
1,71 s, 3H C-47 0.25 o. 36+
1,45 s, 3H C-47 o.25 o. 36+
1,36 s, 3H C-47 o.25 o. 36+
0,86 s, 3H C-17B+
0,74 s, 3H C-12B+
0,51 s, 3H C-1A+
0,38 d, 1 H J = 8,5 Hz C-5' ß0,07 t, 1 H J« 8,4 Hz C-5' a
+ zugeordnet analog 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4); "zugeordnet aufgrund
Entkopplungsexperiment
218
COONfCOONa
(21)
Abbildung 94: UV/vis-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) in Wasser, c=
4,41-10"5 M
Ec
8
V
Abbildung 95: CD-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) in Wasser, c=
4.41-10-5 M
219
1 H-NMR (CD3OD, c= 2,00-10'2M, 300,13 MHz)Abb. 29
Allg. Teil 9,10 s, 1 H A 2+
8,22 s, 1 H A7+
8,03 d, 1 H J= 1,2 Hz A-10 oder 11
7,56 s, 1 H A-10 oder 11
6,74 s, 1H C-10
5,72 d, 1 H J= 2,6 Hz C-1'
4,97 d, 1H z.Teil unter HDO C-19?
4,40 m, 1 H C-2'*
4,34 d, 1 H J= 8,9 Hz
3,96 m, 1 H
3,82 t, 1 H J= 6,5 Hz C-3'*
3,09 m, 1 H
2,99 t, 1H J = ca. 4,5 Hz
2,80-1,70 insgesamt 37H
2,71 d, 2H J= 13,5 Hz
2,49 s, 3 H CH3
2,42 s, 3H CH31,81 s, 3H CH31,70-0,40 insgesamt 18H
1,60 s, 3H CH31,51 s, 3H CH3
1,21 s, 3H CH30,94 s, 3 H CH3
0,51 s, 3H CH3
0,01 t, 1 H C-5' a
*: Zuordnung mit Entkopplungsexpenment, '• Zuordnung tentativ
Entkopplungsexperiment (300,13 MHz)
eingestrahlt bei Änderungen im Spektrum
5,74 ppm 4,40 ppm, m zu d, J= ca. 6 Hz
4,40 ppm 5,74 ppm, dzus,
3,83 ppm, tzu d, J= ca. 7,2 Hz
3,83 ppm 4,40 ppm, mzud, J= ca. 3 Hz
minimale Intensitätsverschieb. 2,12 ppm
0,00 ppm minimale Intensitätsverschieb. 2,12 ppm
3,00 ppm minimale Intensitätsverschieb. 2,12 ppm
Intensitätsverschiebung 2,38 ppm
13C-NMR (D20, c= 2,12-10-2M, 100 MHz, breitbandentkoppelt & DEPT)
17,90 (q,1C, C 51) 18,19 (q,1C, C 151) 19,37 (q,1C, C 17B)
19,83 (t,1C, A 5') 20,47 (q,1C,C2A/7A) 21,62 (q,1C,C2A/7A)
21,86 (q,1C, C12A) 26,64 (q,1C, C 1A) 29,08 (t,1C, C 81)
29,45 (t,1C, C31) 30,18 (t,1C, C 132) 33,44 (q,1C, C 12B)
35,02 (t,1C, C 172) 35,14 (t,1C, C 171) 36,28 (t,1C, C 82)
220
36,57 (t,1C,181/132) 38,00 (t,1C,181/132) 40,57 (t,ic, C32)
43,23 (d,1C, C 18) 48,14 (MC C 71) 48,26 (t,1C, C 21)
48,94 (s,1C,C2/12) 49,27 (s,1C, C2/12) 52,47 (s,1C, CT,
55,08 (d,1C, C 13) 57,87 (d,1C, C3) 58,45 (d,1C, C8)
61,41 (s,1C, C 17) 74,91 (d,1C, A 3') 75,37 (d,1C, C 19)
78,09 (d,1C, A 2') 88,91 (s,1C, C1) 89,63 (d,1C, A 4')
91,20 (d,1C, A 1') 99,66 (d,1C, C 10) 109,49 (s,1C, C 15)
110,45 (s,1C, C5) 115,77 (d,1C,A10/11) 125,06 (s,1C, A 5)
134,71 (d,1C,A10/11) 140,10 (d,1C, A2/8) 141,17 (s,1C, A4/5)
143,13 (s,1C, A 4/5) 143,75 (d,1C, A2/8) 165,63 (s,1C, C6/14)
167,04 (s,1C,C14/6) 174,71 (s,1C, C9) 174,80 (s,1C, C 11)
178,17 (s,1C,C4/16) 179,17 (s,1C, C4/16) 179,63 (s,1C, £00-)
181,30 (s,1C, £00-) 182,38 (s,1C, £00-) 183,80 (s,1C, £00-)
184,01 (s,1C, £00-) 184,23 (s,1C, £00-) 184,56 (s,1C, £00-)
a2. Zugabe des Alkylierungsmittels vor elektrochemischer Reduktion zu
Co(l)-cobyrinat
Es wurden 45,7 mg (3,63-10"5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)
analog 1748 zum Co(ll)-corrin reduziert, in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,
Methanol/Wasser, 1:1, gelöst, 84,8 mg (2,61-10"4 mol, 7,2 Äquivalente) 5'-
Chloro-5'-desoxy-1 ,N6-ethenoadenosin zugefügt und bei -1,2 V während drei Stunden
elektrolysiert (1,6-10"4 Faraday, 4,6 Äquivalente).
Zur Aufarbeitung entfernte man am Rotationsverdampfer das Methanol und versetzte
die verbleibende wässrige Lösung solange mit 1 molarem Phosphatpuffer, pH 4,5, bis
das Produkt auf eine 4 ml SEP-Pack C-18-Kartusche adsorbierte. Das Adsorbat wurde
mit 80 ml Wasser gewaschen und mit Methanol eluiert.
Mit der am Rotationsverdampfer auf ca. 0,1 ml eingeengten Lösung des Rohprodukteswurde eine praparative Dünnschichtchromatographie auf zwei RP-18 Platten, 10 x
20 cm, mit Methanol:H20 (6,5:5) als Laufmittel durchgeführt. Die Hauptfraktion49(rf= 0,77) wurde mit Methanol eluiert, das Eluat mit NaHC03 neutralisiert, das
Produkt 21 nach Einengen der Lösung am Rotationsverdampfer auf ca. 0,1 ml mit 8 ml
Ether gefällt, der feine Niederschlag bei 4'000 Upm während fünf Minuten
abzentrifugiert, die farblose Mutterlauge dekantiert und der braune, pulvrigeRückstand (3,8 mg, 10 %) 30 Stunden am Hochvakuum getrocknet.
Man erhielt 29,7 mg (61%) Produkt 21 in Form eines braunen Pulvers mit
folgenden spektroskopischen Eigenschaften.
48 Siehe 7.5.1
49 Das DC zeigte eine Vielzahl von Banden.
221
IR (1,0 mg in 300 mg KBr)
3430(s),br 3255(m),sh 3120(m),sh 2960(m),
2930(m),sh 2490 (w),sh/br 1775 (w), 1705(m),sh
1645(m), 1575 (s), 1480(m), 1400(s),
1385(s),sh 1350(m), 1355(m), 1300(m),
1260(w), 1220(m), 1205(m), 1185(w),sh
1155(w),sh 1135(m), 1100(m), 1045(m),
1020(m), 970 (w), 955 (w),sh 930 (w),875 (w), 815 (w), 750 (w),sh 700 (w),650 (m), 605 (m), 560 (m)
1 H-NMR (D20, c= 3,04-10'2 M, 300,13 MHz)
8,91 S, 1 H A2+
8,07 S, 1 H A8+
7,90 s, 1 H A-10/11
7,50 s, 1 H A-10/11
6,76 s, 1 H C-10
5,63 d, 1 H J = 3,81 Hz C-1'
4,53 d, 1 H J = 10,49 Hz C-19"
4,46 q'oid,1 H C-2' "
4,11 d, 1 H J = 8,72 Hz C-3
3,74 t, 1 H J = 6,01 Hz C-3' "
3,71 m, 1 H C-8 oder 13
3,15 m, 1 H C-8 oder 13
2,73 t'oid1,1 H J = 9,57 Hz C-18"
2,53 dd'oid,2 H Ü1 =. 15,6 Hz
J2.: 3,75 Hz
2,50-1,20 insgesamt ca. 36 H
2,30 s, 3H C-51 oder 151
2,21 s, 3H C-51 oder 151
2,17 m, 1 H C-2' "
1,69 s, 3H CH31,41 s, 3H CH31,35 s, 3H CH30,90 s, 3H CH3 C-17B
0,72 s, 3H CH3 C-12B
0,51 s, 3H CH3 C- 1A
0,45 d, 1 H J = 8,02 Hz C-5' ß0,07 t, 1 H J = 8,79 Hz C-5' a
"
zugeordnet mit Entkopplungsexperiment
Entkopplungsexperiment (300,13 MHz)
eingestrahlt bei Änderungen im Spektrum
0,04 ppm 0,48 ppm, d zu s
2,18 ppm, m zu d, J= ca. 5,8 Hz
222
2,72 ppm 2,19 ppm, neuer Peak
4,55 ppm, d zu s
3,75 ppm 2,17 ppm, m zu d, J= ca. 7,0 Hz
4,48 ppm, t zu d, J- ca. 4,0 Hz
MS (FAB(-), Glycerin, m/z 50-1'50)
1087,4 (7; M'-eAdo) 1024,3 (10) 980,3 (10)
958,3 (21) 936,3 (100) 921,5 (22)
898,5 (25) 876,2 (30) 385,9 (6)
361,8 (140;(M-EAdo)3')
Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinsäure
Ca. 12,1 mg (8,91 -10-6 mol) Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat(21) aus Synthese a1. wurden in wenig Wasser gelöst, aus dieser Lösung auf SEP-
Pack C-18 adsorbiert, mit 30 ml Wasser gewaschen, die Substanz mit Methanol
eluiert und der am Rotationsverdampfer getrocknete Rückstand mit 10 ml Ether aus
0,1 ml Methanol gefällt.
Nach zweitägiger Trocknung am Hochvakuum wurden 10,8 mg (8,82-10-6 mol, 99%)eines braunen Pulvers mit folgenden spektroskopischen Eigenschaften erhalten.
mw. 1230,192
1 H-NMR (CD3OD, c= 1,26W2M, 300,13 MHz)
9,11 (breit) s, 1 H A-2 +
8,24(breit) S, 1 H A-8/A 10 oder 11
8,13(breit) s, 1 H A-8/A 10 oder 11
7,92(breit) s, 1 H A 10 oder 11
6,91 s, 1 H C-10
5,80(breit) s, 1 H C-1'
4,30 m, 1 H
4,16 d'oid, 1 H J= 7,7 Hz
3,89 m, 1 H
3,78 m, 1 H
3,66 m, 2H
3,38 m, 1 H
3,10-0,60 insgesamt ca. 96 H mit Signalmaximabei 1,99/1 ,97/1,94/1,72/1,71 ppm
2,90 s, 3H CH3
1,83 s, 3H CH3
223
1,61 S, 3H
1,48 S, 3H
1,04 S, 3H
0,90 S, 6H
0,72 d, 1 H
0,37 t, 1 H
CH3
CH3
CH3
CH3J= 8,0 Hz A5'a
A5'ß
1 H-NMR (D2O, c= 3,22 10-2M, 300,13 MHz)
9,00(breit) S, 1 H A2
8,13(breit) s, 1 H A-8/A 10 oder 11
7,96(breit) s, 1 H A-8/A 10 oder 11
7,56(breit) s, 1 H A 10 oder 11
6,79 S, 1 H C-10
5,64(breit) s, 1 H C-1'
4,56 d, 1 H J= 10,2 Hz C-19
4,43 m, 1 H C-2'
4,10 m, 1H C-3
3,75 t, 1 H J= 5,9 Hz C-3'
3.68 m, 1 H C-8/13
3,21 m, 1 H C-8/13
3,00-0,30 insgesamt 51 H
2,71 t'oid C-18
2,30 s, 3 H 51 oder 151
2,24 s, 3 H 51 oder 151
1.69 S, 3H CH3
1,42 s, 3H CH3
1,35 s, 3H CH3
0,94 s, 3H CH3
0,72 s, 3H CH3
0,57 s, 3H CH3
0,50 d, 1 H J= 8,5 Hz A5'ß
0,12 t, 1 H J= 8,8 Hz A5'a
Zuordnung analog Synthese a1 von 21
224
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cob-amido- N, N\ N-.N'-.N'-.N ,N -hepta-tn-decyl-IO'-carboxylat) (19)
1 7
Ci 24Higg02i N13C0K7
1 9
Ci34H2n024NieCoNa6
a1. Zugabe des Alkylierungsmittels nach elektrochemischer Erzeugungdes Co(l)-cobamido-N,N',N"1N,",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Es wurden 54,4 mg (2,22-10-5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in 5 ml
Methanol gelöst und analog der bereits beschriebenen Reduktion50 mit 9,7 mg Pt02,15 pl Essigsäure und Wasserstoff in einer Glove-box zum Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) reduziert. Nach
Beendigung der Reaktion gemäss UV/vis-spektroskopischer Kontrolle wurde die
Lösung durch Watte filtriert und am Rotationsverdampfer mit HV das Lösungsmittel
abgezogen.Der Rückstand wurde wiederum in ca. 0,3 ml Methanol gelöst, mit 3 ml 0,1 M
Phosphatpuffer, pH 7, Methanol/Wasser, 1:1, verdünnt und in eine Elektrolyse¬apparatur gemäss [105] gefüllt.Nach 50 Minuten bei einem Potential von -1,000 V war die Reduktion zu Co(l)-cobamidat gemäss UV/Vis-Spektrum quantitativ und 75,6 mg (2,33-10"4 mol, 10,5
Äquivalente) krist. 5'-Chloro-5'-desoxy-1,N6-ethenoadenosin wurden zugefügt. Nach
weiteren 100 Minuten, der Strom war auf unter zwei Prozent des Anfangswertesgefallen, wurde die Reaktionslösung abpipettiert und der Glove-box entnommen
(7,3-10° Faraday, 3,3 Äquivalente).Zur Aufarbeitung entfernte man am Rotationsverdampfer das Methanol und versetzte
die verbleibende wässrige Lösung solange mit 1 molarem Natriumphosphatpuffer, pH
50 Siehe 7.5.1
225
9 bis das Produkt auf drei SEP-Pack C-18 (Kartusche ä 4 ml) adsorbierte51. Das
Adsorbat wurde je Kartusche mit 10 ml H20 gewaschen, das Alkylierungsmittelvollständig mit 25 ml Methanol /H20, 7:3, eluiert und das nachfolgend mit 5 ml
Methanol eluierte Produkt am Rotationsverdampfer getrocknet.
Der braune Lack Hess sich aus ca. 0,5 ml Methanol mit 5 ml Ether quantitativ fällen.
Man dekantierte die farblose Mutterlauge nach 15 Minuten von dem bei 4'000 Upmabzentrifugierten, feinen Niederschlag, der am Hochvakuum während zwanzig Stunden
getrocknet (47,1 mg, 81%), zur Charakterisierung gelangte.
Ci 34H211024Ni6CoNa6
mw. 2626,540
DC (RP-18, CH3OH/Phosphatpuffer 0,1 M, pH 3, 95:5)
rf= 0,51
UV/vis
Abb. 30
Allg. Teil
(H20, c= 1,90-10-5 M)
224 ( 42'840), sh
303 ( 22-735),456 ( 8-370).
265
313
(
(
26'815),
20'750),sh
274
375
(20'315), sh
( 7-920), sh
UV/vis
Abb. 96
(CH3OH, c= 1,14-10-5
225 ( 4V130), sh
303 ( 2V630),457 ( 8'100).
M)
265
313
(
(
25'350),
19'800),sh
274
375
(18'710), sh
( 7'370), Sh
CD
Abb. 31
Allg. Teil
(H20, 0=1,90-10-5 M)
223 ( -22,10),306 ( 19,50), Sh
402 ( 1,05),565 ( 7,89),
262 (329 (433 (
-41,60),
52,60),
-16,80),
280 (380 (503 (
-11,60), sh
-4,74),-10,00),
X0 bei 235, 239, 291, 361, 395, 407, 523 nm
Die Adsorption erfolgte nicht ganz quantitativ.
226
Abbildung 96: UV/vis-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) in Methanol, c= 1,14-10"° M
VA
.ÄZs
V
Abbildung 97: CD-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) in Methanol, c= 1,14-10-° M
227
CD
Abb. 97
(CH3OH, c= 1,14-10-5 M)
224 (306 (401 (565 (
-31,60),
27,20),
7,02),10,50),
Sh
264 {329 (430 (
-86,80),
70,20),
-14,90),
280 {378 (504 (
A,0 bei 291, 361, 389, 412, 459, 470, 529 nm
(1,6 mg in 300 mg KBr)
-19,30),
-5,26),
-9,65),
sh
3420 (m),br/sh 3290 (m), 3080(m), 2930 (s).2860 (s), 2690 (w),sh 2480(w), br 2410 (w), sh
1955 (w), br 1710 (m), br 1645 (s), br 1565 (S), br
1490 (m), 1470 (m), 1455(m), sh 1440 (m),1415 (m), 1380 (m), 1355(m), 1330 (m), sh
1295 (m), 1260 (m), sh 1220(m), 1180 (w), sh
1155 (m), 1140 (m), sh 1110(m), 1100 (w), sh
1040 (w), 1020 (w), sh 995 (w), sh 975 (w),930 (w), 875 (w), 815 (w), 725 (w),700 (w), 670 (w),sh 655 (w), 630 (w),595 (w), 570 (w), 480 (w)
1H-NMR (CD3OD, c= 2,56-W2M, 300,13 MHz)Abb. 32
Allg. Teil 9,13 S, 1 H A-2/7
8,06 s, 2H A-10/11
7,59 S, 1 H A-2/7
6,84 s, 1 H C-10
5,69 s, 1 H C-1'
4,75 d, 1 H J= 10,13 Hz
4,50 d, 1 H J= ca. 10 Hz
4,25 d'oid,1 H J= 2,68 Hz
3,96 m,
1 H
3,82 t, 1 H
3,40-2,80 insgesamt ca. 16 H (ohne CD3OD)Cl±>-CONH-
2,80-2,00 insgesamt ca. 39 H u.a. -CÜ2POO-weitere Maxima 2,20 / 2,65
2,48 s, 3H C-51/151
2,39 s, 3H C-51/151
2,00-1,00 insgesamt ca. 152 H
weitere Maxima 1,30 / 1,60 / 1,88
1,72 s, 3H CH3
1,45 s, 3H CH3
0,91 d, 1 H J= 5,0 Hz C-5' ß
0,84 s, 3H CH3
0,83 s, 3H CH3
0,38 t, 1 H C-5' a
228
Entkopplungsexperimente
eingestrahlt bei Beobachtung
4,79 ppm Intensitätsverschiebung bei 2,93 ppm
1H-NMR (D20, C= 2,72-W3M, 300,13 MHz)
sehr breite Signalhaufen mit Maxima bei 1,15/ 1,40/ 2,05/ 3,00 ppm
13C-NMR (CD3OD, c= 1,26.102M, 100 MHz, -5,8 °C, breitbandentkoppelt &
DEPT)Abb. 33
Allg. Teil 15,58 (q, 1CC51 ) 17,55 (q, 1C C 151 ) 19,29 (q, 1C C 17B )
19,98 (q, 1C C 2A/7A) 20,18 (q, 1C.C2A/7A) 20,77 (q, 1C C 12A )
25,14 (q, 1CC1A ) 26,30 (t, 1C A 5"> ) 27,49 (t, ca 7C -£H2-
CH2-COOH) 27,70 (t, 1C C 81 )
28,21/28,25/28,40 (t, je ca 2C,-C_H2-CH2-CH2-NCO-R)
29,06 (t, 1CC31 ) 29,94 (t, 1C, C 131 )
30,40/30,48/30,57/30,65/30,71/30,85 (t, ca 35C res« Kette innen)
32.28 (q, 1C C 12B ) 32,91 (t, 1C "> ) 34,02 (t, 1C C 172 )
34.29 (t, 1C C 171 ) 34,97 (t, 1C C 82 ) 35,51 (t, 1C 181/132)
37,04 (t, 1C 181/132) 38,22 (t (br),ca 7C -£H2-COOH)
40,57/40,70/40,82/41,04 (t, ca 7C-£H2-NCO-R) darunter CH2, C32
& CH, C-18 (40,8 ppm) 44,40 (t, 1C C71/21')44,60 (t, 1C C 71/21)
47,33 (s, 1C C 2/12 ) 48,03 (s, C2/12 ) 51,72 (s, 1C C7 )
54,06 (d, 1C C 13 ) 56,55 (d, 1C C3 ) 60,59 (s. 1C C 17 )
67,07 (t, ' ) 73,46 (d. 1C C8? ) 73,64 (d, 1C A 3' )
75,02 (d, 1C C 19 ) 76,45 (d, 1C A 2' ) 87,15 (d, 1C A 4' )
88,47 (s, 1C C1 ) 90,27 (d, 1C A 1' ) 98,53 (d, 1C C 10 )
108,2 (s, 1C C 15 ) 109,3 (s, 1C CS ) 113,8 (d, 1C A10/1 1)
124,0 (s, 1C A 5 ) 133,5 (d, 1C A10/11) 138,5 (d, 1C A 2/8 )
140,0 (s, 1C A 4/5 ) 141,5 (d, 1C A 2/8 ) 142,1 (s, 1C A 4/5 )
164,8 (s, 1C C 6/14 ) 165,2 (s, 1C C 6/14) 171,7 (s, 1C )
173,3 (s, 1C ) 173,3 (s, 1C ) 173,6 (s, 1C )
174,6 (s, 2C ) 174,7 (s, 1C ) 175,0 (s, 1C )
176,9 (s, 1C ) 177,7 (s, 1C ) 177,9 (s, 1C )
(C 4/9/11/16 + 7x -HNC.O-) 181,8 (s, 7C -COOK )
' Zuordung tentativ
MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 400-2'900)
2322,5 (31, M-2Na+-eAdo + H20), 2291 (18); 2281 (21, M-eAdo"-
4Na++H20+4H + ), 2265,7 (24,[(Di-Na-pentasäure)-eAdo]+), 2221,6(19,
Heptasäure-eAdo), 1800-2500 Signalhaufen, 1161,3 (10, M-2Na+-eAdo-
+3H++H20), 450,0(100), 400-600 Signalhaufen im Abstand 14 m/z
229
a2. Zugabe des Alkylierungsmittels vor elektrolytischer Reduktion zum
Co(l)-cobamido-N1N,1N",N-1N--,N ,N -hepta-(n-decyl-1 0'-
carboxylat)
Es wurden 84,8 mg (3,34-10"4 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) wie bereits
beschrieben (6.5.1) mit 13,7 mg Pt02, 8 pl Essigsäure und Wasserstoff in Methanol
zum Co(N)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)reduziert, in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7 in Methanol/Wasser, 1:1, gelöst, mit
111,3 mg (3,42-10-4 mol, 10,3 Äquivalenten) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin versetzt und während elf Stunden bei -1,20 V elektrolysiert bis der
Stromfluss praktisch zum Erliegen kam (1.45-10-3 Faraday, 4,5 Äquivalente).Nach Aufarbeitung analog der Synthesevariante a1. erhielt man 69,5 mg braunes
Pulver, das gemäss 1 H-NMR-Spektrum ca. 65% Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) enthielt.
Die praparative Dünnschichtchromatographie auf RP-18 (3 Platten) mit 0,1 M
Phosphatpuffer pH 7/Methanol, 8:92, Elution der braunen Hauptfraktion mit 100 ml
Methanol mit anschliessender quantitativer Fällung der am Rotationsverdampfer bei
RT auf ca. 0,1 ml eingeengten Lösung mit Ether ergab nach zwanzigstündiger
Trocknung am HV 27,6 mg (30%) braunes Pulver mit folgenden spektroskopischenEigenschaften:
1H-NMR (CD3OD, c= 5,10-10-2 M, 300,13 MHz)
9,12 s, 1 H A 2 oder 7
8,06 s, 1 H A 2 oder 7
8,04 d, 1 H J = 1,5 Hz A10 oder 11
7,59 d, 1 H J = 1,5 Hz A10 oder 11
6,87 s, 1 H C-10
7,01/8i ,63/6,,35/6,32 insgesamt 1 H
5,72 d, 1 H J = 2,4 Hz C-1'*
4,80 d, 1 H J = 11,7 Hz
4,48 d, 1 H J = 8,9 Hz
4,25 m, 1 H C-2'*
4,03 t'oid, 1 H
3,90 d'oid, 1 H
3,82 t, 1 H J = 6,5 Hz C-3'*
3,52 m, 1 H
3,39 m, 2H
3,35-2 ,80 insgesamt 12 H
2,80-2 ,00 insgesamt 36 H u.a. C-4'*
Maxima 2,61/2,48/2,44/2,42/2,39/2,25
2,00-1 ,00 insgesamt 148 H
Maxima 1,90/1,73/1,58/1,32/1,20/1 ,13
0,96 d, 1 H J = 7,6 Hz C-5' ߻0,88 s, 3H CH3
0,82 s, 3H CH30,75 s, ca. 1 H
0,45 t, 1 H J = 8,4 Hz C-5' a*
'Zuordnung der Riboseprotonen mit Entkopplungsexperimenten
230
Entkopplungsexperimente
eingestrahlt bei Beobachtung
5,73 ppm
4,25 ppm
3,82 ppm
0,46 ppm
4,25 ppm, ddzud, J= 5,5 Hz
5,73 ppm, dzus,
3,82 ppm, t zu d, J= 7,5 Hz
4,25 ppm, ddzud, J= 2,5 Hz
2,00-2,10 ppm Intensitätsverschiebung0,99 ppm, dzus,
2,00-2,10 ppm Intensitätsverschiebung
Synthesebeweis von 10 durch Dealkylierung
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (19), 10 mg (2,33-1 0'4 mol),wurden mit 1,0 ml 1% methanolischem HCN sowie 3 mg KCN versetzt und bis zur
Konstanz des UV/vis-Spektrums dem Sonnenlicht ausgesetzt.Nach Entfernen des Methanols am Wasserstrahl und Lösen des Rückstandes in ca. 1,0
ml Wasser zog die Substanz direkt auf SEP-Pack auf. Mit 30 ml H20/MeOH, 1:9,
eluierte eine fluoreszierende, farblose Lösung.Die verbleibende auf SEP-Pack adsorbierte Substanz wurde mit 3 ml Methanol
eluiert, die Lösung am Wasserstrahl getrocknet, der Rückstand in 0,1 ml 1 %
methanolischem HCN aufgenommen und mit 5 ml Ether gefällt.Der am Hochvakuum getrocknete violette Niederschlag zeigte mit Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-lat) (17) identische 1H-NMR-(D20) und UV/vis-Spektren.
231
6.6 Synthese der Gastmoleküle
6.6.1 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)
Br
O 0'
o
Bf
33 22
Ci4Hs02 C22H2402Br2
In eine Vorlage mit 30 ml H20 und 20 ml Aceton gab man unter Stickstoff 2,0 g
(9,61-10-3 mol) Anthrachinon (33), 3,0 g NaOH-Plätzchen (7,5-10"2 mol) sowie
2,0 g Natriumdithionit (1,04-10"2 mol) und erhitzte am Rückfluss. Der Kolbeninhalt
färbte sich im Verlauf von ca. 15 Minuten tiefrot. Nach 30 Minuten wurden 10,0 ml
(8,3-10'2 mol) 1,4-Dibrombutan eingespritzt und weitere neun Stunden am Rück¬
fluss erhitzt.
Aus der unteren, der sich bei Abkühlung trennenden Phasen, Hess sich mit 100 ml
Hexan ein weisser Niederschlag ausfällen. Die abfiltrierte Lösung wurde mit insgesamt400 ml Dithionit-Lösung in drei Portionen ausgeschüttelt, die Hexanphase über MgSO.»
getrocknet und am Rotationsverdampfer bei 40 °C Badtemperatur das Lösungsmittel
abgezogen.Man erhielt ca. 2 g Rohprodukt, das zum grössten Teil aus 1,4-Dibrombutan bestand.
Die Wasserphase enthielt gemäss DC kein Produkt mehr.
Das Gemisch der Produkte wurde in einigen ml Hexan gelöst und auf eine mit Hexan
aufgezogene Kieselgelsäule aufgetragen. Die Säule wurde mit 21 Hexan gespült, um das
1,4-Dibrombutan auszuwaschen, dann mit Lösungsmittel wie folgt die Trennung
durchgeführt: 2,1 I Hexan/MeCI2 6:1, 1,2 I Hexan/MeCI2 5:1, 0,5 I Hexan/MeCI2
4:1, 0,4 I Hexan/MeCI2 0,8 I (2. fluoreszierende Bande, 366 nm). Die nächsten mit
der zweiten fluoreszierenden Bande beginnenden 1,5 I Hexan/MeCI2 3:1, beinhalteten
das 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22). Der Elutionsprozess war mit
UV/vis-Spektroskopie (366 nm) gut zu verfolgen.
Das Produkt wurde am Rotationsverdampfer getrocknet, in 5 ml Hexan/Methylen¬chlorid (1:1) gelöst und kristallisierte bei Zugabe von 10 ml Methanol innerhalb
232
weniger Stunden aus. Die anfangs am Rotationsverdampfer, dann am HV (0,08 Torr,90 min) getrockneten nadeiförmigen Kristalle 22, Ausbeute 0,440 g (9,5 %),wurden charakterisiert.
C^H^O^^
mw. 480,243
Schmelzpunkt 102,5 °C
DC (Kieselgel, Hexan:MeCI2, 3:1, Detektion mit l2 und 366 nm)
rf= 0,14
MikroanalyseBr
berechnet 55,02 % 5,04 % 33,28 %
gefunden 55,06 % 5,06 % 33,49 %
UV/Vis (C= 2,62-10-* M, EtOH)
403 nm (7'123), 381 nm (8'208), 363 nm (5'283),346 nm (2-689), sh 328 nm (1'037),sh 315 nm ( 377),sh258 nm (73'200)*
'bestimmt durch Vergleich mit Intensität bei 403 nm
(2,8 mg in 70pJ CHCI3)
3090 (w)sh 3060 (w) 3030 (w) 3000 (w)2950 (w) 2940 (m) 2920 (w)sh 2870 (w)2850 (w) 1950 (w) 1930 (w) 1915 (w)sh1825 (w) 1805 (w)sh 1710 (w) 1620 (m)1560 (w) 1520 (w) 1455 (w) 1440 (w)sh
1430(m) 1405 (m) 1380 (w) 1350 (s)1295 (w) 1270 (w) 1260 (w) 1240 (w)
1170(m) 1115 (w) 1070 (s) 1035 (w)
1020 (w) 1000 (w) 985 (w)sh 970 (w)
960 (w) 920 (w) 895 (w) 825 (w)
690 (w) 610 (w)
233
1H-NMR (300,13 MHz, CDCI3, 3,64-10'2 M)
2,16-2,37 m,,8H C-2',3'
3,60 t, 4 H J= 6,50 Hz C-4'
4,19 t, 4H J= 6,15 Hz c-r
7,44-7,50 m,,4H C-ß Aromat
8,20-8,26 m,,4H C-a Aromat
zugeordnet nach Vergleich mit [122]
13C-NMR (75 MHz, CDCI3, 8,48-103 M, breitbandentkoppelt & DEPT)
29,4 (t, C-27C-3'); 29,8 (t, C-27C-3')
33,6 (t, C-4'); 74,9 (t, C-1');
122,6 (d, C-2); 125,1 (s, C-11) ;
125,4 (d, C-1); 147,3 (s, C-9 )
zugeordnet aufgrund Vergleich mit [122]
MS (El, 25-482, angegeben sind Signalintensitäten m/z > 4 %)
482 (5,1; M+[8lBr;81Br])) 480 (10,4; M*plBr;79Br])478 (5,1; M*(79Br;79Br))), 400 (0,3; {[M( 81Br)]-Br}+),398 (0,3; {[M( 79Br)]-Br)*), 346 (0,7; 0-C14H8-0(CH2)481Br*),344 (0,7;0-C14H8-0(CH2)4.79Br*), 265 (0,4; 0-CuH8.0(CH2)4),235 (0,9; C14H8-0(CH2)3+). 221 (2,6; Cl4HsO(CH2)2+),210 (16,9), 209 (93,6),208 (8,2;C14H802+), 207 (4,6),193 (3,9; C14HbO+), 192 (1,9; C14H80+),181 (4,7), 180 (25,4),176 (0,7; C14H8+), 165 (10,1),164 (11,9; C13HBV. 163 (11.3),153 (13,3;B'Br(CH2)40), 152 (41,4; C4H88'BrO),151 (12,7; 79Br(CH2)40), 150 (4,3; C4H879BrO),137 (76,0; 81Br(CH2)4), 136 (6.7)135 (77,1; 79Br(CH2)4). 115 (0,5; C9H7+),109 (3,3;81Br(CH2)2), 107 (3,4; 73BrCH2CH2),95 (0,9;81BrCH2), 93 (0,9; 79BrCH2),91 (1,1; C7H7+), 77 (5,2; C6HS+),76 (3,9; C6H4+), 56 (6,5; C4H8),55 (100,0; C4H7), 53 (4,1; C4HS),51 (4,1; C7H20) 41 (13,9; C2HS).39 (10,7; C3H3) 28 (22,6; (CH2)2),27 (17,2; C2H3)
234
6.6.2 1, N 6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
o
D
W^oM,
15
C17H19O6N5S
1 6
dgHigOsNsS
250 mg (5,4-10"4 mol) 5'-0-Tosyladenosin (15) wurden in 10 ml MeOH und 10 ml
1 molarem Phosphatpuffer, pH 7, suspendiert und mit 0,5 ml 1,2-Dibrom-
ethylacetat versetzt. In der ständig gerührten, vor Lichteinwirkung geschützten
Reaktionslösung war im Laufe weniger Stunden ein markanter pH-Abfall zu
verzeichnen, der durch Zugabe von 1M wässriger KOH ausgeglichen wurde bis der pHwieder den Bereich 4 bis 6 erreichte. Nach zwei Tagen fügte man weitere 0,2 ml 1,2-
Dibromethyl-essigsäureester hinzu und glich die pH-Änderung entsprechend aus. Das
Produkt war mit DC bereits ab dem zweiten Tag als einzige stark fluoreszierende
Substanz identifizierbar. Nach ca. 10 Tagen begann Phosphat auszukristallisieren.
Nach insgesamt zwanzig Tagen extrahierte man die mit 200 ml H20 verdünnte
Reaktionslösung mit 10 Portionen Methylenchlorid ä 100 ml, zog das Lösungsmittel
ab, und fällte mit 100 ml Ether aus 5 ml Methanol.
Das Rohprodukt (149,6 mg) bestand gemäss 1 H-NMR-Spektrum aus zwei
Komponenten, davon etwa 60 % 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16).
Die Komponenten wurden mittels Säulenchromatographie (Laufmittel CH2CI2:Methanol, 85:15) aufgetrennt. Die Produktfraktion war die zweite fluoreszierende
Bande. Der Vorlauf bis nach dem Austritt der Fraktionen einer ersten schwachen,
fluoreszierenden Bande wurde verworfen. Die vereinigten, am Rotationsverdampfer
getrockneten Produktfraktionen wurden in wenigen ml Methanol aufgenommen und
nach Auffüllen mit ca. 100 ml H20 gegen zehn Portionen CH2CI2 ä 100 ml
ausgeschüttelt. Nach Entfernung des CH2CI2 am Rotationsverdampfer blieb das
Hauptprodukt 16 als farbloses Öl zurück.
Nach Fällung des Öls aus 0,3 ml Methanol mit 8 ml Ether und Trocknen am HV während
fünf Stunden erhielt man 91,2 mg (34,5 %) eines weissen Niederschlages. Aus einer
ca. 2-10-2 molaren Lösung dieses Niederschlages in Chloroform fielen beim Zutropfenunter heftigem Rühren in die 20-fache Menge Petrolether (50-70 °C) farblose
Mikrokristalle aus, die sich beim Altern in der Mutterlauge eintrübten und Flocken
bildeten. Die Kristalle wurden abzentrifugiert (4000 UpM, 5 min) und während 24
Stunden am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 79,3 mg (30 %) 16 in Form
weisser Kristalle, die charakterisiert wurden.
Ci9H1906N5S (• 2,5 H20)mw. 445,453 (490,492)
235
Schmelzpunkt
schmilzt nicht unversetzt, sichtbare Verkohlung ab ca. 180 °C
DC (Kieselgel 60, ohne Fluoreszenzindikator, CH&I&CH3OH, 85:15)
rf = 0,59
Mikroanalyse
C H N
berechnet
gefunden
51,23 %
46,53 %
46,85 %
4,30 %
4,93 %
4,23 %
15,72 %
14,28 % mit 2,5 H2014,20 %
UV/Vis (CH3OH, c= 1,01-10"i M)
227 (35-900),275 ( 4'470),
258
296
( 4'030),
( 2'410)
265 ( 4'720),
CD (CH3OH, c:= 1,01-1 O^M)
222 (266 (
-5,47),
1,09),
234
276
( 11,10),
( 1,28),
258 ( 0,81),295 ( 0,19).
1 H-NMR (CD3OD, c= 3,93-10-2M, 200 MHz)
9,12 S, 1 H A-2 (oder 8)*8,33 S, 1 H A-8 (oder 2)*8,08 d, 1 H J= 1,57 Hz A-10*
7,75/7,70 2H CH3-C6Ü4-S7,64 d, 1 H J= 1,52 Hz A-11*
7,24/7,20 2H CH3-C6H4-S6,13 d, 1 H J= 4,43 Hz C-1
4,78 t, 1 H J= 4,78 Hz C-2 +
4,51 t, 1 H J= 5,15 Hz C-3 +
4,44-4,42 m,2H C-5
4,30 t, 1 H J= 4,04 Hz C--4
2,31 s, 3H CÜ3-C$H4*
zugeordnet analog [97]; + zugeordnet aufgrund Vergleich mit 400 MHz 1H-
NMR-Spektrum unterschiedlicher Konzentration
236
1 H-NMR (CD3OD, gesättigte Lösung, c= 6,24-10'2 M, 400 MHz)
8,98 d, "1H J» 2,55 Hz A-2 (oder 8)*
8,23 S, 1 H A-8 (oder 2)*
7,96 d, 1 H J= 1,57 Hz A-10*
7,63 d, 2H J= 8,10 Hz CH3-C6H4-S
7,54 d, 1 H J= 1,47 Hz A-11*
7,13 d, 2H J= 7,86 Hz CH3-C6Ü4-S
6,06 d, 1 H J= 4,34 Hz C-1 +
4,75 t, 1 H J= 4,81 Hz C-2+
4,46 t, 1 H J= 5,16 Hz C-3 +
4,33- 4,41 m, 2H C-5 +
4,26- 4,23 m(fd), 1 H C-4 +
2,23 s, 1 H CH3-C6H4"
Aufspaltung des Singlett 1licht eindeutig,"
zugeordnet analog [97]
ordnet aufgrund Entkopplungsexpenmenten
zuge-
Entkopplungsexpenment (300,13 MHz)
eingestrahlt bei Änderungen im Spektrum
1822,21 Hz (6,07 ppm) t, 1430 Hz (4,76 ppm) zu d, J= 5,0 Hz
1425,04 Hz (4,76 ppm) d, 1822 Hz (6,07 ppm) zu s
t, 1338 Hz (4,46 ppm) zu d, J= 5,0 Hz
1339,23 Hz (4,46 ppm) t, 1430 Hz (4,76 ppm) zu d, J= 4,5 Hz
Effekt auf 1260-1320 Hz (4,20-4,40
ppm) nicht bestimmbar
1 H-NMR (D20, gesättigte Lösung, 40 °C, 200 MHz)
8,92 s, 1 H
8,21 s, 1 H
7,98 s, 1 H
7,60 s, 1 H
7,43/7,39 2H
6,80/6,74 2H
6,00 d, 1 H
4,85 m, 1 H
4,63 m, 1 H
4,45 m, 2H
4,28 t, 1 H
1,85 s. 3H
A-2 (oder 8)*A-8 (oder 2)*A-10*
A-11*
CH3-C6H4-S
CH3-C6M4-SJ=ca.l Hz C-1 +
C-2 +
C-3 +
C-5
C-4
ChU-Aromat
*
zugeordnet analog [97], + zugeordnet aufgrund Entkopplungsexpenmenten
handeln.N'-(2'-Bromethylen)-adenosyltosylatum1H-NMR-Spektrumsdesaufgrund
sicheskönnteZwischenprodukttentativesdiesemBeibesitzt.Adenosyleinheit
einenurwelchesherrühren,MoleküleinemvonEthenoadenosyl-5'-0-tosylat
1,Ne-desSignalederSubtraktionnachSignalesämtlichedassberechnet,Annahme
derunterwurdeKonzentrationDiezugeordnet.Signaleuntenstehende1H-NMR
imKomponentezweitenderwurdenRohproduktesdesSubstanzgemischesdesSpektrum
1H-NMR-demaus1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylatreinendesSpektrumsdes
SubtraktionDurchwar.vollzogennichtnoch,N6-Ringschluss1derdembeihandelte,Zwischenprodukteinumkonnte,werdenisoliertnichtSäulenchromatographie
durchwelcheSubstanz,zweitendieserbeisichesdassvermutet,daherwurdeEs
machen.sichtbargleichgutpraktisch
lodmitsichsieliessdochfluoreszierend,schwächerbedeutendwarKomponente
zweiteDiewerden.charakterisiertundisoliertkonnteund(16)5'-0-tosylat1,N6-Ethenoadenosyl-mitidentischLaufverhaltengemässwarKomponentenderEine
werden.ausgeschlossenKomponenteals(15)5'-0-TosyladenosinEduktdaskonnte
LaufverhaltensdesAufgrundKomponenten.zweiausDCgemässbestandRohproduktDas
ZwischenproduktTentatives
>400m/zfür1,6%bzw.16%,grosser<400m/z200<Signalmtensitat
(02S-Tolyl)+)(72,2;155,10
(18,2)156,10(23,9)159,10(100,0)160,11
(16,5)161,11(41,7)176,08(27,0;TosRib+)289,14
M+)(22,3;445,21(M+H)+)(100,0,446,23(33,9)447,23
(47,3;(Na+M)+)468,22(1,8)581,29(2,3)599,31
(M2)+)(9,0;891,42(4,4)892,43(2,1)893,42
(Na-M2)+)(7,0;913,40(3,4)914,41(1,6)915,41
C-4)c,1(s,146,6C-1")(s,1C,142,5
C-4")C,1(s,139,8C-8)C,(d,1137,9
C-10)c,1133,47(d,C-2,6")130,76(d,2C,
C-11)C,1124,43(s,)C-5C,113,42(s,1
C-4')c,1(d,83,42C-2')C,(d,175,40
C-5')
C,1(t,71,0C-7")(q,1C,21,52
WO)150-1m/z3-NOBA,(FAB(+),MS
C-2)C,141,7(d,1
C-6)C,134,0(8,1
C,C-3,5")129,0(d,2
C-1')C,17(d,91,1
C-3')C,171,75(d,C-5')
DEPT)&
breitbandentkoppeltMHz,1006,24-102M,c=Lösung,gesättigte(CD3OD,13C-NMR
ppm)(4,83-4,90
Hz1450-1470Intensitätsverschiebungppm)(4,63Hz1387
ppm)(4,63Hz1390Signalverjüngung
szuppm6,00beidppm)(4,85Hz1462
Hz1450-1470Int.relativeÄnderungppm)(6,00Hz1789
SpektrumimÄnderungenbeieingestrahlt
MHz)(300,13Entkopplungsexperiment
237
238
DC (Kieselgel 60, ohne Fluoreszenzindikator, CH2CI2:CH30H, 85:15)
rf = 0,16
1 H-NMR (CD3OD, c= 1,41-W2 M, 200 MHz)
9,45 s, 1 H A-2 (oder 8)8,65 s, 1 H A-8 (oder 2)8,43 m 1 H
8,10 s, 1 H
7,77 Tj" 2H CH3-C6H4-S7,40 d, 2H CH3-C6H4-S6,23 d, 1 H J= 4,4 Hz C-1
5,13 t, 1 H J- 4,7 Hz C-2
4,5-4,2 m 4H C-3 bis 5
2,43 s, 3H Chb-Aromat
zugeordnet analog [97]
Analyse der Reaktionskinetik
Zur experimentellen Analyse der Reaktionskinetik wurden vier Ansätze durchgeführt.Sie bestanden wie oben beschrieben je aus 250 mg 5'-0-Tosyladenosin (15), 0,5 ml
1,2-Dibromethyl-essigsäureester (4 Äquivalente) und 40 ml Lösungsmittel. Für die
Reaktionsdauer 766 Stunden wurde das Dreifache, für die von 67 Stunden ein Drittel
sämtlicher Mengen gewählt.Die Zusammensetzung des Rohproduktes, welches nur aus den beiden beschriebenen
Komponenten besteht, wurde analysiert.Die Mutterlaugen der Fällungen waren gemäss DC praktisch frei von diesen beiden
Substanzen.
Abbildung 98 zeigt die Zusammensetzung des Rohproduktes in Funktion der
Reaktionsdauer.
t Rohprod /% AHauptprod /%rel Nebenprod /%rel
300 400 500
Reaktionzeit / Stunden
Abbildung 98: Tosylat 15 und 1,2-Dibrom-ethylacetat, Reaktionskinetik in wäss-
rig-methanolischer Lösung, 1 M Phosphatpuffer, T= ca. 23 °C, Anteil Rohprodukt als
isolierte Ausbeuten bezogen auf das Gewicht in % des Eduktes, Prozentangaben Haupt-und Nebenprodukt bezogen auf isolierte Ausbeuten des Rohprodukt (Gew.% des Edukt)
239
6.7 Orientierende Wirt-Gast-Assoziationsexperimente
6.7.1 Bestimmung der Löslichkeiten der Alkylierungsmittel in
Deuteriumoxid
Löslichkeit von Methyltosylat in Deuteriumoxid
Eine Lösung von 1,185 mg DSS in 1,0 ml Deuteriumoxid wurde im auf 20 ± 1 °C
thermostatisierten Wasserbad mit Methyltosylat im Uberschuss während 30 Minuten
mit 50 kHz Ultraschall beschallt, die Probe zentrifugiert und die klare Mutterlauge
1H-NMR-spektroskopisch (80 MHz) untersucht. Die Operationen wurden nach 20
bzw. 190 Stunden mit derselben Probenlösung wiederholt.
Die relativen Konzentrationen von DSS und Methyltosylat wurde aus den 1 H-NMR-
Spektrum entnommen, indem die Integrale sämtlicher Signale ausgewertet wurden,
und mit der Einwaage an DSS kalibriert.
Die Konzentrationen an gelöstem Methyltosylat lagen bei 7,7-10'3 M (sofortige
Messung), 1,6-10"2 M (nach 20 h) bzw. 2,9-10-2 M (190 h nach erstem Kontakt mit
Deuteriumoxid). Nach 20 Stunden schlug sich Hydrolyse (ca. 10%) in Signalen im
1 H-NMR-Spektrum bei 7,67/7,63 ppm (C3/5), 7,35/7,31 (C3/5) sowie 2,35
ppm (Methyl des Tosylates) nieder.
Aufgrund einer möglichen Tensidwirkung des DSS sind diese Löslichkeitswerte als
Obergrenze zu betrachten. Bei den nachfolgend durchgeführten Experimenten mit
Methyltosylat, vgl. 6.7.3.3, war der Löslichkeitswert nicht kritisch für die
Interpretation.
Löslichkeit von 5'-0-Tosyladenosin (15) in Deuteriumoxid
a) Eine Lösung von 0,785 mg Trimethyl-silyl-propansulfonsäure (8,1-lO6 mol)
in 1,2 ml Deuteriumoxid wurde im auf 20 °C ± 1 °C thermostatisierten Wasserbad
mit im Uberschuss vorliegenden 5'-0-Tosyladenosin (15) während 30 Minuten mit
50 kHz Ultraschall beschallt, zentrifugiert und die Lösung 1H-NMR-spektroskopisch(300,13 MHz) untersucht.
Die Konzentration an gelöstem S'-O-Tosyladenosin lag in allen Fällen unterhalb der
Nachweisgrenze, d.h. unterhalb cirka 6,76-10"4 M entsprechend 10 % der
Konzentration der Trimethyl-silyl-propansulfonsäure. Bei Sättigung einer Lösung von
6,495 mg Trimethyl-silyl-propansulfonsäure in 1,0 ml Deuteriumoxid (28,1 mM)
bei RT mit 5'-0-Tosyladenosin ergab sich 1H-NMR-spektrometrisch (300 MHz) die
Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin zu 4,5-10-4 M.
Die relative Konzentration des 5'-0-Tosyladenosins (15) wurde dabei aus der Summe
den Integrale zwischen 7,00 & 8,20 ppm (Phenylring und Purinring) und des
anomeren H bei 5,92/5,94 ppm auf der einen Seite und jenen der Trimethyl-silyl-
propansulfonsäure zwischen 0,60 und 3,00 ppm auf der anderen Seite erhalten. Über
die Einwaage an Trimethyl-silyl-propansulfonsäure ergab sich die absolute
Konzentration von 15.
240
Aufgrund der potentiellen Tensideigenschaften der Trimethyl-silyl-propansulfonsäurekonnte dieser Wert ebenfalls nur als Obergrenze dienen und da die dermassen
bestimmte Löslichkeit in der Grössenordnung der Corrinkonzentrationen lag, musste
mit UV/vis-Spektroskopie die Löslichkeit genauer bestimmt werden.
b) Die Löslichkeitsbestimmung von 5'-0-Tosyladenosin (15) durch eine UV/vis-
spektroskopische Messreihe bestehend aus 2x10 Messungen mit von 5 bis zu 50
Minuten zunehmenden Beschallungszeiten lieferte die für die Sättigung des
Deutriumoxides mit Tosylat 15 notwendige Mindestdauer der Ultraschallexposition.
Deuteriumoxid wurde mit einem Uberschuss 5'-0-Tosyladenosin versetzt, im auf
35,0 ± 0,1 °C thermostatisierten Bad beschallt, die Suspension zentrifugiert (4000
UpM, 5 min) und die erhaltene Lösung UV/vis-spektroskopisch untersucht. Das
Experiment wurde mit Beschallungszeiten von 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 und
50 Minuten wiederholt.
Nach 10 Minuten waren praktisch keine Änderungen im UV/vis-Spektrum mehr
beobachtbar: abs(o)26o nm= 0,744, o= 0,06, dx= 0,100 cm, entsprechend 3,72-10-4
M. Messungen bei T- 15 °C, lieferten als durchschnittliche Absorption, abs(0)26o nm=
0,443, o= 0,02, dx= 0,100 cm, entsprechend 2,22-10"4 M (6 Messungen); bei T=
20-23 °C, abs26o nm= 0,609, entsprechend 3,05-10-4 M (1 Messung), dx= 0,100
cm und die Bestimmung bei 30 °C abs26o nm= 0,745 (1 Messung), dx= 0,100 cm,
entsprechend 3,73-10-4 M.
1 H-NMR-Spektren der Gastmoleküle in Deuteriumoxid
Jeweils 2,4 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin, 5,5 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-
ethenoadenosin, 1,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) und 13,8 mg Methyltosylat wurden
mit 1,4 ml Deuteriumoxid versetzt und im auf 35,0 °C thermostatisierten Wasserbad
während 30 Minuten mit 50 kHz Ultraschall beschallt, zentrifugiert und die Lösung
1H-NMR-spektroskopisch (80 MHz) untersucht. Nach Sättigung enthielten sämtliche
Lösungen noch ungelöste Substanz.
Die Signale der Verbindungen erschienen in den 1 H-NMR-Spektren (200 MHz) wie
folgt:
5'-0-Tosyladenosin (15)
8,14/8,17* s, 2H J= 9Hz Purin-H
7,52/7,55 d, 2H J= 9 Hz CH3-C6Ü4-
7,10/7,13* J= 9 Hz CH3-CeU4-
5,92/5,94* d, 1 H J= 6 Hz anomeres H
4,32 m, 3H C2-5
4,48 m, 1 H
2,28 s, 3 H (breit) C±b-C6H4-
5 '-ChloroS'-deoxy-1,Ne-etheno-adenosin
9,05* s, 1 H C-2 Purin
8,40* s, 1 H C-8 Purin
7,92* d, 1 H C-10 Purin
241
7,52 d, 1 H
6,20* d, 1 H
4,90 t, 1 H
4,52/4,40 t+t,,2H
3,93 m, 2H
C-11 Purin
anomeres H
C4'-Ribose
3'&2'-Ribose
5'-Ribose
Methyltosylat
7,83/7,79* 2H
7,49/7,45* 2H
3,78 S, 3H
2,43 S, 3H
7,67/7,63 2H
7,35/7,31 2H
2,35 s, 3H
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
siehe Charakterisierung im synthetischen Teil (7.6.2)
C-3/5
C-2/6
er
C-7
C-3/5"
C-2/6"
C-7"
Anteil Hydrolyseprodukt" bzgl. Methyltosylat ca. 30%
5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin
8,32* s, 1H
8,19* s, 1H
6,06/6,08* d, 1 H
4,35-4,50 m, 2H
3,85-3,92 m, 2H
Relative Löslichkeiten der Gastmoleküle
Die relativen Löslichkeiten der als Gastmoleküle verwendeten Akylierungsmittel
wurden durch gleichzeitige Sättigung von Deuteriumoxid mit 5'-Chloro-5'-deoxy-1 ,N6-ethenoadenosin, 5'-0-Tosyladenosin (15), Methyltosylat und 5'-Chloro-5'-
deoxy-adenosin oder 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), experimentell
bestimmt.
Für jede Temperatur (15,2; 18,2; 23,0; 33,0 °C, jeweils ± 0,1 °C) wurde separat
eine Mischung aus mindestens 2,4 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin oder 1,N6-
Ethenoadenosyl-5"-0-tosylat (16), 5,5 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin, 1,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) und 13,8 mg Methyltosylat mit 1,4 ml
Deuteriumoxid versetzt, umgehend während 10 Minuten Ultraschall (50 kHz)
ausgesetzt, in vorangehend thermostatisierten Zentrifugeneinsätzen während 10
Minuten suspendiertes Alkylierungsmittel abzentrifugiert und die überstehende klare
Lösung 1H-NMR-spektroskopisch untersucht (200 MHz).
C3/8 Purin
C3/8 Purin
er
C-2' ,& 3' Ribose
C-5' Ribose
242
Das relative Verhältnis der Löslichkeiten wurde aus der Summe der in der obigen
Aufstellung der 1 H-NMR-Spektren der Gastmoleküle in Deuteriumoxid (bzw. bei 16
im synthetischen Teil) mit*
gekennzeichneten Signale berechnet, deren Integrale
nicht miteinander überlappen und daher eindeutig ausgewertet werden konnten,
gewichtet mit der Anzahl der sie repräsentierenden Protonen.
Tabelle 12 Relative Konzentrationen von nebeneinander
gelöstem 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin, 5'-
Chloro-5'-deoxy-l ,N6-ethenoadenosin, S'-O-
Tosyladenosin (15), 1,Ne-Ethenoadenosyl-5--0-tosylat und Methyltosylat in Deuteriumoxid
T/c-C 5'- 5'- S'-O- Methyl¬ 1,N6-
Chloro- Chloro- Tosyl¬ tosylat Ethenoade
5'-deoxy- 5'-deoxy- adenosin nosyl-5'-
adenosin 1,N6-
etheno-
O-tosylat
adenosin (15) (16)
15,2 7,8 8,5 1 7,7
18,2 8,4 9,6 1 7,6
23,0 11,4 1 7,6 0,33
33,0 10,8 1 6,5 0,71
6.7.2 Methoden zur Bestimmung des Assoziationsgrades
a) Berechnung des Besetzungsgrades mit UVA/is-Spektroskopie
a) Die Konzentration an Corrin ([Corrin]) wurde mit dem Lambert-
Beerschen Gesetz aus den UV/vis-Absorptionswerten bei 580 nm bzw. 576 nm und den
entsprechenden Extinktionskoeffizienten gemäss synthetischem Teil berechnet.
Die Konzentration der Gastmoleküle konnte nicht direkt aus den UV/vis-Spektren der
Probenlösungen abgelesen werden, da im Bereich des Absorptionsmaximum von 9,10-
Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) (407 nm), des S'-O-Tosyladenosin (15) (260
nm) und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) (258 nm) die eingesetzten Corrine
ebenfalls stark absorbieren. Von dem UV/vis-Spektrum der Probenlösung wurde daher
das UV/vis-Spektrum einer gleichkonzentrierten Lösung des Corrines subtrahiert und
das UV/vis-Spektrum des in der Probe gelösten Gastmoleküles erhalten. Aus dem
Absorptionsmaximum des so generieren UV/vis-Spektrums wurde sodann die
Konzentration des Gastmoleküles berechnet ([Gast]totai).
Der Assoziationsgrad (Besetzungsgrad) ist das Verhältnis der Konzentration an
Gastmolekül, die die Löslichkeit des Gastmoleküles in reinem Deuteriumoxid
([GastJLösi.) übersteigt, zur Corrinkonzentration ([Corrin]).
Assoziationsgrad = (([Gast]totai-[Gast]Lösi.)/[Corrin])
243
Von der mit der obenbeschriebenen Differenzmethode ermittelten Gesamtkonzentration
des Gastes ([Gast]totai) wurde daher die durch separate Experimente52 bestimmte
Löslichkeit des Gastmoleküles ([Gast]L6si.) subtrahiert und von dem Resultat der
Quotient mit der Corrinkonzentration gebildet.
ß) In einigen Experimenten wurde statt der mathematischen Subtraktion des
UV/vis-Spektrums des Corrins vom UV/vis-Spektrum der Probenlösung die
Probenlösung direkt gegen eine Corrinlösung identischer Konzentration im
Referenzstrahl des UV/vis-Spektrophotometers gemessen. Das UV/vis-Spekrum des in
der Probenlösung gelösten Gastes wurde so experimentell erhalten.
Bei dieser Methode wurde vor Sättigung der Corrinlösung mit dem Gast ein Teil dieser
Lösung in eine UV/vis-Küvette gefüllt und mit einem Teflonstopfen und Parafilm
gasdicht verschlossen.
Die Berechnung der Konzentrationen und des Assoziationsgrades folgt ansonsten der
Methode 6.7.2aa.
b) Berechnung des Besetzungsgrades mit 1H-NMR-Spektroskopie
Der Assoziationsgrad konnte auch über die Kombination von UV/vis- mit 'H-NMR-
Spektren bestimmt werden.
Anhand von sich nicht überlappenden Signalen in 1 H-NMR-Spektrum (H(C10) des
Corrins bei 5,77 ppm (17) bzw. 5,74 ppm (24); Phenylprotonen des Tosylates bzw.
zusätzlich H(C10) & H(C11) bei 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)) wurden
die relativen Konzentrationen von Corrinteil und Gastmolekül festgestellt, über die
Auswertung des Absorptionsmaximums bei 580 nm die absoluten Konzentrationen
berechnet und analog 6.7.2aa von der Gastkonzentration die Löslichkeit des Gastes in
Deuteriumoxid subtrahiert sowie die Konzentrationen von Gast und Corrin zueinander
ins Verhältnis gesetzt.
6.7.3 Bestimmung des Assoziationsverhaltens in wässriger Lösung
6.7.3.1 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)
Assoziation mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-di-
cyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-
lat) (17) in wässriger Lösung
Jeweils 8,1-10"6 mol Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (10,2 mg) (24) bzw.
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (20,4 mg) (17) wurden in 5 ml H20 gelöst, die Lösungen in zwei
Portionen aufgeteilt, eine Hälfte mit 7,0 resp. 5,6 mg 9,10-Di-(brombutyloxy)-
anthracen (22) versetzt und während zehn Minuten ultrabeschallt.
52 6.7.1 & 6.8.1.3
244
Die Konzentration an 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) wurde bestimmt,
indem man von dem UV/vis-Spektrum der Probenlösung das UV/vis-Spektrum
entsprechend 6.7.2.aß gegen eine gleichkonzentrierte Lösung des reinen Corrins 17
aufnahm und aus der Absorption des resultierenden Differenzspektrum bei 265 nm die
Konzentration von 22 berechnete.
In der Lösung von 24 wurde UV/vis-spektroskopisch kein 22 detektiert, in der
Lösung von 17 lag der Gehalt an 22 bei 2,3 % der Corrinkonzentration.
Assoziation mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-di-
cyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxy-lat) (17) in wässriger Lösung unter Phasentransfer Hexan/Wasser
Je 0,4 ml 1,37-10'3 molare, wässrige Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24) bzw. Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N-",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lösung wurde zusammen mit 0,4 ml 5,42-10'3 M
9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) in Hexan mit einem Magnetrührerwährend 12 Stunden gerührt und nachfolgend UV/vis-spektroskopisch mit der
Stammlösung als Referenz gemäss der unter 6.7.2aß beschriebenen Methode
untersucht. Die Lösung von 17 wurde nach der Messung vier Stunden auf 5 °C gekühltund nochmals gemessen.
Die frisch bereitete Lösung von 17 wies einen Gehalt an 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) von 2 ± 0,4 % auf (Methodik der Konzentrationsbestimmung siehe
6.7.2aß). In der Probe mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und der auf 5 °C
gekühlten Lösung von 17 lag der Gehalt an gelöstem 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen unterhalb der Nachweisgrenze.
Assoziation mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-di-
cyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxy-lat) (17) in wässriger Lösung unter Phasentransfer Deuteromethylenchlorid/Deuteriumoxid
A.
10,1 mg (3,98-10"6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) wurden in 1,0 ml D20 gelöst,
zuerst 0,5 ml Deuteromethylenchlorid, dann 10,1 mg (2,10-10'5 mol) 9,10-Di-(4-
brombutyloxy)-anthracen (22) zugefügt und bei einer Badtemperatur von 40 °C 15
Minuten lang 50 kHz Ultraschall ausgesetzt. Das überschüssige 9,10-Di-(4-
brombutyloxy)-anthracen, das die Lösung deutlich eintrübte, liess sich durch
Zentrifugation (2500 Upm, 30 Min) abtrennen. 1 H-NMR- und UV/vis-Spektren
wurden sofort gemessen und aus den UV/vis-Spektren durch Subtraktion eines
Referenzspektrums das Spektrum für 9,10-Di-(4-brom-butyloxy)-anthracen
245
berechnet (Methode 6.7.2aß). Das 1H-NMR-53 (Abbildung 36 oben) und das UV/vis-
Spektrum zeigten übereinstimmend ein Verhältnis der Konzentrationen von 17 zu 22
von 1,0:1,0 (± 0,1) an.
Nach Lagerung während 12 Stunden bei 5 °C war die Probe stark eingetrübt und Hess
sich nach Lyophilisation, auch unter Zugabe KCN nicht in eine homogene Lösung
überführen. Das 1 H-NMR-Spektrum dieser, nach Zentrifugation (2500 Upm, 10
Minuten) homogenen Lösung wies keine Signale des 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) mehr auf (Abbildung 36 unten). Das UV/vis-Spektrum (Auswertung
gemäss 6.7.2aa) verifizierte einen Gastanteil von <5% und war mit dem des reinen
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17) praktisch identisch.
Bei Durchführung des obigen Experimentes bei einer Badtemperatur während der Be¬
schallung von 20 °C war die Assoziatbildung innerhalb der Fehlergrenze von ca. 10%
gemäss UV/vis-Spektrum reproduzierbar. Wurde dabei jedoch auf Deuteromethylen¬chlorid während der Beschallung verzichtet, waren im 1 H-NMR-Spektrum keine
Signale des 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) beobachtbar.
B.
Zu A. analoge Versuche mit einer Beschallungsdauer von 20 min führten mit 1,09-10*3 M wässrigem Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) zu keinem UV/vis-
oder 1H-NMR-spektroskopisch nachweisbarem Gehalt an Anthracen 22.
C
Es wurden 0,3 ml einer 1.15-10'3 M wässrigen Lösung von Heptakalium-dicyano-Co-
(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17)mit 0,3 ml (1,1 MO'2 M) Anthracenlösung (22) in Methylenchlorid versetzt, zwei
Stunden mit 50 kHz bei einer Badtemperatur von 40 °C beschallt und mit 2500 Upmfünf Minuten zentrifugiert. Die nun klare Lösung wurde abpipettiert und ihr UV/vis-
Spektrum gemessen. Das Differenzspektrum zur Bestimmung der Konzentration von
22 und des Assoziationsgrades wurde nach der unter 6.7.2aa beschriebenen Methode
erhalten.
Man Hess die Probe anschliessend im Dunkeln und bei 5 °C stehen und wiederholte in
Intervallen die UV/vis-Messung sowie die Auswertung über das Differenzspektrumnach dem in 6.7.2aa beschriebenen Verfahren. Abbildung 37 zeigt den über die
UV/vis-Spektren ermittelten Assoziationsgrad des Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es mit 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen als Funktion der Zeit.
Berechnung gemäss der unter 6.7.2b beschriebenen Methode
246
6.7.3.2 5'-Tosyladenosin (15)
Dicyanocobyrinat (24) und Co(ll)-cobyrinat
Assoziation der Dicyanoform (24)
Man versetzte 2,1 mg (1,68-10'6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
(24) und 12,6 mg (6,17-1 0"6 mol) 5'-0-Tosyladenosin (15) mit 0,75 ml
Deuteriumoxid, beschallte 30 Minuten mit 50 kHz in einem auf 21,0 ± 0,1 °C
thermostatisierten Ultraschallbecken, zentrifugierte bei 4*000 UpM während 15
Minuten und untersuchte die klare Lösung umgehend UV/vis- und 1H-NMR-
spektroskopisch. Der Besetzungsgrad wurde gemäss 6.7.2a<x ermittelt.
Nachfolgende schrittweise Verdünnung der Probenlösung mit jeweils ca. 0,15 bis 0,20
ml Deuteriumoxid unter Wiederholung des Sättigungsvorganges lieferte folgende
Ergebnisse:
[24]/mM Cobyrinat: Adotosylat
(24.15)
gemäss1 H-NMR
Besetzungsgrad
gemäss
UV/vis-Spektrum
2,18 6,5 : 1 0
1,76 nicht gemessen 0
1,43 4,0 : 1 0
0,91 nicht gemessen 0
Die 'H-NMR-Signale des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und des S'-
O-Tosyladenosin (15) waren bis auf die nachfolgend aufgeführten Ausnahmen
identisch mit jenen der reinen Vergleichssubstanzen (Angaben in Klammern reine
Substanzen):
[Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat]= 2,18 mM: Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat: 3,09 (3,05); 3,48 (3,45); 3,55 (3,53); 5'-0-Tosyladenosin:
5,84/ 5,85 (5,92/5,94); [Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat]= 1,43 mM:
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat keine Abweichungen; 5'-0-Tosyladenosin:
5,84 /5,85 (5,92/5,94).
Die Auftragung der Cobyrinatkonzentration vs. abs26o nm ergab eine Gerade (R2=
0,998, Achsenabschnitt 0,82). Die Absorption von 0,82 bei 260 nm im
Achsenabschnitt entspricht dabei dem bereits unter 6.7.1 experimentell bestimmten
Wert der Löslichkeit des 5'-0-Tosyladenosin in Deuteriumoxid. Die mit der
Corrinkonzentration linear ansteigende Absorption bei 260 nm impliziert eine
konstante Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin. Es wurde somit in Anwesenheit des
Cobyrinat 24 kein zusätzliches 5'-0-Tosyladenosin gelöst. Der Besetzungsgrad beträgt
daher null.
247
Assoziation der Co(ll)-Form
In einer Glove-box wurde eine Lösung von 5,8 mg (4,3-10'6 mol) Co(ll)-cobyrinat in
1,0 ml D20 mit 4,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) versetzt, die Lösung analog der
Dicyanoform gesättigt, zentrifugiert und die Mutterlauge zur Spektroskopie
abpipettiert.Nach Zugabe von KCN lag der Gehalt an S'-O-Tosyladenosin gemäss
1 H-NMR-Spektrum
(300 MHz) mit 0,51 mM beim 0,13-fachen der Cobyrinatkonzentration. Dies
entspricht der Löslichkeit von 5'-0-Tosyladenosin (15) in Deuteriumoxid (vgl.
6.7.1).
Die Probe wurde anschliessend lyophilisiert, in Deuteromethanol gelöst und die 'H-
NMR-spektroskopische Messung (300 MHz) wiederholt, die nach Auswertung mit
Methode 6.7.2b ein praktisch identisches Konzentrationsverhältnis von 0,12 ergab.
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-
hepta-(n-decyl-W'-carboxylat) und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",
N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat)
1. Experiment
Eine mit 4,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) versetzte Lösung von 11,1 mg
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17) in 1,4 ml D20 (2,81 -10"* M) wurde während 15 Minuten
Ultraschall ausgesetzt, die Lösung während fünf Minuten mit 4'000 UpM zentrifugiert
und von der nun klaren Lösung das 1 H-NMR-Spektrum aufgenommen.
Die Integrale des Signale des S'-O-Tosyladenosin zwischen 7,00-8,00 ppm (vier
Protonen des Phenylringes) zum Integral des H(C-10)-Signales des Corrins bei 5,78
ppm ergaben ein absolutes Verhältnis der Konzentrationen des Corrins 17 zur
Konzentration des Tosylates 15 von 1,00 zu 0,45.
Auf der Basis dieses Konzentrationsverhältnisses berechnet sich aus dem 'H-NMR-
Spektrum gemäss 6.7.2b der Besetzungsgrad des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N,N-,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) mit S'-
O-Tosyladenosin (15) zu 16%.
2. Experiment
Analog Experiment 1 wurden 7,7 mg S'-O-Tosyladenosin (15) zu einer Lösung von
ca. 16 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in 1,0 ml D20 gegeben (4,88-103 M), 15
min mit 50 kHz beschallt, zentrifugiert und die überstehende klare Lösung
schnellstmöglich mittels 'H-NMR- und UV/vis-Spektroskopie analysiert.
Für die nachfolgenden Messungen verdünnte man die jeweils mit der Stammlösung
vereinigten Proben mit D20 um ca. 1/4 und bestimmte UV/vis-spektroskopisch die
248
Konzentration an Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) 17. Von jeder zweiten Verdünnung wurde zudem das 1H-NMR-Spektrumgemessen.
Aus den UV/vis-Spektren errechnete man der unter 6.7.2 aa beschriebenen Methode
folgend den Besetzungsgrad.
Unter Venvendung der unter 6.7.2b beschriebenen Vorgehensweise entnahm man den
1 H-NMR-Spektren die relative Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin (15) und
berechnete erneut den Besetzungsgrad. Tabelle 13 fasst die Ergebnisse zusammen.
Tabelle 13 Assoziationsgrad in Prozent der Corrinkonzen¬
tration von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-
amido-N.N-.N-'.N-.N'-.N ,N -hepta-(n-
decyMO'-carboxylat) (17) und 5'-0-Tosyl-adenosin (15) in Deuteriumoxid
[17]/mM •15-,o,a|/•17-,o,a,gemäss
'H-NMR-
Spektrum
•»-.ou.in mM
gemässUV/vis-
Spektrum
Besetzungsgrad gemäss
'H-NMR- UV/vis-
Spektrum Spektum
4,88 0,16 0,84 7% 8%
3,81 - 1,02 nicht gemessen 15%
2,78 0,30 1,00 15% 20%
2,61 - 0,84 nicht gemessen 15%
1,50 0,46 0,69 16 % 16%
3. Experiment
Mit 4,2 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) in einer Lösung von ca. 8,4 mg Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-
lat) (17) (4,88-10'6 mol gemäss UV/vis-Spektrum) in 2,0 ml D20 wurde wie im 2.
Experiment verfahren. Tabelle 14 fasst die Ergebnisse zusammen.
Tabelle 14 Assoziationsgrad in Prozent der Corrinkonzen¬
tration von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-
amido-N,N•,N",N•",N•—,N ,N -hepta-(n-
decyMO'-carboxylat) (17) und S'-O-Tosyl¬adenosin (15) in Deuteriumoxid
[l7]/mM -15-,ota,/ [15),o,a, Besetzungsgrad gemäss
["Ul in mM
gemäss gemäss 'H-NMR- UV/vis-
'H-NMR- UV/vis- Spektrum SpektumSpektrum Spektrum
2,44 0,22 0,50 4% 2%
1,97 - 0,55 nicht gemessen 5%
249
1,67 0,40 0,68 12% 14%
1,14 - 0,71 nicht gemessen 23%
0,89 0,63 0,67 16% 25%
0,64 - 1,15 nicht gemessen 11 0%
0,48 1,7 0,99 85% 11 2%
4. Experiment
Analog dem als Experiment 2 beschriebenden Verfahren verdünnte man sukzessive eine
Lösung von ca. 5,0 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in 1,0 ml D20 (1,56-1 O*3
mol gemäss UV/vis-Spektrum), in der 5 mg S'-O-Tosyladenosin (15) suspendiert
war, und nahm jeweils nach Sättigung der Lösungen ihr UV/vis-Spektrum auf.
Die UV/vis-Spektren wurden gemäss der unter 6.7.2aa beschriebenen Methode
ausgewertet. Tabelle 15 fasst die Totalkonzentrationen des Corrins 17 und des
Tosylates 15 sowie die Ergebnisse der Auswertung der Experimente zusammen.
Tabelle 15 Assoziationsgrad in Prozent der Corrinkonzen¬
tration von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-
amido-N,N',N",N",,N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-IO'-carboxylat) (17) und S'-O-Tosyl¬adenosin (15) in Deuteriumoxid, bestimmt mit
UV/vis-Spektroskopie
[l7]/mM [15]tota|/ mM Besetzungsgrad
gemäss
UV/vis-Spektrum
1,56 0,62 11%
1,32 0,78 25%
1,10 1,04 54%
0,99 0,95 51%
0,82 1,43 120%
0,73 1,29 116%
0,63 1,17 115%
0,56 1,09 115%
0,50 1,04 11 7%
0,46 0,99 11 7%
0,43 0,95 116%
0,32 0,96 161%
0,25 1,04 234%
0,17 0,80 206%
0,11 0,70 224%
250
Abbildung 99: UV/vis-Spektren der mit 5'-0-Tosyladenosin (15) gesättigten
Lösungen von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17), Konzentrationen vgl. Tabelle 14
I I 1 1 1 1 1 L.
ppm 8 7 65432 1
Abbildung 100: ' H-NMR-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) (2,44-1 0"3 M),
D20-Lösung gesättigt mit 5'-0-Tosyladenosin (15)
251
5. Experiment
Ca. 10 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) wurden zu einer Lösung von 1,3 mg (5,12-10-7
mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) (17) in 2,8 ml D20 gegeben (1.83-10-4 M), in einem auf
21,0 ± 0,1 °C thermostatisierten Wasserbad beschallt, zentrifugiert und die
überstehende klare Lösung 'H-NMR- und UV/vis-spektroskopisch analysiert.
Die Auswertung des ' H-NMR-Spektrums mit der unter 6.7.2b beschriebenen Methode
ergab eine Konzentration an S'-O-Tosyladenosin (15) von 0,64 mM, dem 3,5-fachen
der Konzentration an 17 (0,18 mM), entsprechend einem Besetzungsgrad von 104%.
Die Auswertung des UV/vis-Spektrums gemäss 6.7.2a<x bestimmte die Konzentration
des 5'-0-Tosyladenosin (15) zu 0,69 mM, dem 3,8-fachen der Konzentration an
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17), entsprechend einem Besetzungsgrad von 130%.
6. Experiment
Die Wiederholung des 5. Experimentes ausgehend von 4,2 mg (1,7-10-6 mol)
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17) in 0,7 ml Deuteriumoxid lieferte nach analoger Auswertung
die in Tabelle 16 dargestellten Resultate.
Tabelle 16 Assoziationsgrad in Prozent der Corrinkonzen¬
tration von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-
cobamido-N.N'.N-.N-.N'-.N ,N -hepta-
(n-decyl-lO'-carboxylat) (17) und 5-0-Tos-
-yladenosin (15) in Deuteriumoxid, be¬
stimmt mit 1 H-NMR- & UV/vis-Spektroskopie
[17]/mM
2,28
1,80
1,47
'H-NMR-SpektrumVerhältnis von
5'-0-
Tosyladenosin
17 (15)
4,6
nicht
2,1
1,0
gemessen
1,0
Besetzungsgradgemäss
'H-NMR-
Spektrumb
17
UV/vis-
Spektrum3
11
0,93 nicht gemessen - 1 3
a: berechnet gemäss der in 6.7.2 aa beschriebenen Methode; b: berechnet
gemäss der in 6.7.2 b beschriebenen Methode
Abgesehen von der chemischen Verschiebung des H(C-3) bei 4,05 ppm, welches in den
Probelösungen bei 4,07 ppm beobachtet wurde, war das 'H-NMR-Spektrum des
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17) identisch mit dem Beschreibungsspektrum (vgl. 6.4.5).
252
Die chemischen Verschiebungen der Signale des 5'-0-Tosyladenosin (15)unterschieden sich in den 'H-NMR-Messungen von jenen der Beschreibungspektrenwie folgt (Werte der Beschreibungsspektren der reinen Substanzen in Klammern, vgl.
6.7.1):
Im Experiment mit [17]= 2,28 mM: 8,07/8,04 (8,14/8,17); 7,49/7,46
(7,52/7,55); 7,08/7,05 (7,13/7,10); im Experiment mit [17]» 1,47 mM:
8,07/8,04 (8,14/8,17); 7,47/7,44 (7,52/7,55); 7,06/7,04 (7,13/7,10).
Assoziation mit Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Experiment 5 wurde in einer Glove-box mit 28,1 mg (1.13-10-5 mol) Hexakalium-Co
(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)54, 4,0
mg 5'-0-Tosyladenosin (15) in 1,0 ml D20 (Phosphatpuffer, pH 7, 0,1 M)
wiederholt.
Das 1 H-NMR-Spektrum (300 MHz) der Co(ll)-Lösung zeigte sehr breite
Signalhaufen, aus denen bei 7,28 und 7,60 ppm deutlich je zwei Signale hervortraten.
Zur Oxidation und Überführung in die Dicyanoform 17 versetzte man mit 2,04
Äquivalenten KCN, lyophilisierte und löste zur' H-NMR-spektroskopischen Analyse in
0,7 ml CD3OD.
Die Integrale des Signale des 5'-0-Tosyladenosin (15) zwischen 7,00-8,00 ppm
(vier Protonen des Phenylringes) zum Integral des H(C-10)-Signales des Corrins bei
5,78 ppm ergaben ein absolutes Verhältnis der Konzentrationen des Corrins 17 zur
Konzentration des Tosylates 15 von 1,0 zu 2,0. Die Totalkonzentration an S'-O-
Tosyladenosin betrug somit 22,6 mM.
Mit der unter 6.7.2b beschriebenen Methodik errechnete sich ein Besetzungsgrad des
Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat)es (17) mit 5'-0-Tosyladenosin (15) von 196%.
6.7.3.3 Methyltosylat
Es wurden 9,0 mg (7,17-10-6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)
bzw. 18,0 mg (7,09-10"6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) mit je ca. 14 mg
Methyltosylat und 1,0 ml D20 (7,17-10"3 M bzw. 7,09-10"3 M) versetzt, die beiden
Proben gleichzeitig 25 min Ultraschall (50 kHz) ausgesetzt, gleichzeitig während 25
Minuten zentrifugiert (4000 UpM), die überstehenden Lösungen dekantiert und sofort
das 1 H-NMR-Spektrum (80 MHz) aufgenommen. Diese Prozedur wurde dreimal
54 Hergestellt aus 28,71 mg (1,13-10"5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) mit 5 pl
Essigsäure, 11,7 mg Platindioxid und Wasserstoff analog 6.5.1.
253
durchgeführt, wobei die NMR-Probe nach der Messung wieder mit dem Anteil der
Lösung vereinigt wurde, von dem sie abpipettiert worden war.
Zur Errechnung des Verhältnisses von Methyltosylat und Corrin setzte man die
Integrale des 1H-NMR-Spektrums über die Bereiche 7,00-8,00 und 1,70-1,00
(24, 21 ) bzw. 1,90-1,00 (17, 135 H) ins Verhältnis. Diese Bereiche wurden
ausgewählt, weil von 7,00 bis 8,00 ppm nur die Signale der vier aromatischen
Protonen des Methyltosylat liegen während im Bereich 1,90/1,70-1,00 ppm nur
Signale des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw. Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N-",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-
lat) (17) auftreten.
In den ersten zwei Messungen war die Lösung von 24 gemäss der oben beschriebenen
'H-NMR-Auswertung gemessen an der Corrinkonzentration 2,0-fach ([15]= 14,3
mM), die Lösung des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N' -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es (17) 4,4-fach ([15]= 31,2 mM) an
Methyltosylat konzentriert. Die Ergebnisse waren trotz der apparaturbedingten
geringen Auflösung in dem zweiten Experiment innerhalb 20 % reproduzierbar. Nach
dem dritten Durchgang jedoch zeichnete sich bedingt durch die einsetzende Hydrolyse,
es traten neue Signale bei 7,67/7,63 ppm (C3/5), 7,35/7,31 ppm (C3/5) sowie
2,35 ppm (Methyl des Tosylates) auf, ein deutlicher Anstieg der Tosylatkonzentration
ab.
Die Lösungen von 17 und 24 waren gemäss UV/vis-Spektrum in Bezug auf die
Corrinkonzentration mit 7,09 mM (17) zu 7,17 mM (24) praktisch identisch.
Dennoch besass die Lösung des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",
N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) eine doppelt so hohe Konzentration
an Methyltosylat als die Lösung des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24).
Da die exakte Löslichkeit von Methyltosylat55 bei den gewählten experimentellen
Bedingungen in Deuteriumoxid nicht bestimmt wurde, können nur Schlüsse über den
relativen Einfluss dieser beiden untersuchten Corrine auf die Löslichkeit des
Methyltosylates in Deuteriumoxid gezogen werden. Und zwar, dass die Anwesenheit von
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17) verglichen mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)
die Lösung von ca. zwei zusätzlichen Molekülen Methyltosylat ermöglicht.
55 annähernde Löslichkeit 7,7 mM (6.7.1)
254
6.8 Assoziationsexperimente mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-O-tosylat (16) als Gast
6.8.1 Total-Lumineszenzexperimente
Allgemeines zur Total-Lumineszenzspektroskopie
Die Totallumineszenz, d.h. die Summe aus Fluoreszenz und Phosphoreszenz, wurde nach der
Front-face Methode mit einer Apparatur entsprechend Abbildung 101 gemessen. Exitation im
UV-Bereich war wegen des als IR-Filter vor den Exitationsmonochromator vorgeschaltetenWasserfilters aus Fensterglas nicht möglich. Mit zwei Photomultipliern wurde die Emissionund der durch den semidurchlässigen Spiegel reflektierte Teil des Exitationsstrahles als
Referenzstrahl delektiert. Die Exitationsspektren wurden durch Division der
Emissionsspektren durch die Referenzdaten um die Wellenlängenabhängigkeit der Intensität der
als Lichtquelle verwendeten Xenonlampe korrigiert.Monochromatoren: SPEX: Model 1402; Steuerung der Monochromatoren: SPEX: Speed Con-
troler; Photomultiplier Emission: RCA Electronic Components: C 31034 A; PhotomultiplierReferenz: Hamamtsu: R 928; Counter Emission: General Radio: 1192-B; Counter Referenz:
Seyffer: Modell 150; Lampe: Osram Xenon-Hochdruckkurzbogenlampe XBO, 2500 W, T=296K.Die Apparatur wurde freundlicherweise von Prof. U. Wild, Laboratorium für physikalischeChemie der ETH Zürich zur Verfügung gestellt.
Als Schrittweite zwischen zwei Messpunkten wurde jeweils ein Drittel der durch die
Schlitzöffnungen bestimmten Spektralauflösung gewählt.Für jede Experimentserie kalibrierte man mit einer gesättigten 1,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Lösung neu. Die Fluoreszenzmessungen einer Versuchsreihe wurden direkt
hintereinander ausgeführt und sind in ihren absoluten Werten vergleichbar. Bei allen anderen
Messungen, auch wenn sie unter Optimierung des Lichtweges durchgeführt wurden, ist die
numerische Vergleichbarkeit der delektierten Impulse nicht mehr gegeben.Die mangelnde Vergleichbarkeit von mit unterschiedlichen Küvetten durchgeführten Experi¬mentserien war insbesondere durch die Spiegelpositionierung begründet, die für jede Probe
neu optimiert werden musste.
Eine ungenaue Küvettenpositionierung beeinflusst bei der verwendeten Messmethode den
Messwert um weniger als 1 %.
Die Verschiebung des Exitationsmaximums von ca. 4 nm in Abhängigkeit der Konzentration an
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat ist bei der beschriebenen Versuchsdurchführungbedeutungslos. Der Shift im Emissionsmaximum als Funktion der Konzentration des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) störte ebenfalls die Messungen nicht, da die
Lumineszenzmessungen durch Emissionsscans bei konstanter Exitationswellenlänge erfolgtenund jeweils das Emissionsmaximum ausgewertet werden konnte.
Die extreme Empfindlichkeit des Photomultipliers bedingte strikten Ausschluss von Streulicht.
Das Hintergrundrauschen bei ausgeschalteter Lampe und maximaler Öffnung sämtlicher
Blenden konnte auf maximal 460 counts/sec reduziert werden.
Der Messfehler der Lumineszenzintensität, bestimmt durch die Wurzel aus der Anzahl
Lumineszenzcounts, lag bei den vorliegenden Messungen zwischen 0,2 % und 2 % bezogen auf
das Lumineszenzmaximum der jeweiligen Messung.
255
<v
-01
MC
© IR-F
^v^wv.w.^^^m^^^k^^cy.1
MC O
Abbildung 101: Apparatur zur Messung der Totallumineszenz
B: Blende; St: Strahlenteiler; M: Spiegel; Pm: Photomultiplier; Pr:
Probenrohr; Qc: Quantenzähler
256
6.8.1.1 Totallumineszenz-Spektren von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in D20: Vergleich sauerstofffreier und sauerstoffhaltigerLösungen
In einer Glove-box wurden von je 1,0 mg mikrokristallinem 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) über je 1,4 ml Deuteriumoxid durch Beschallung mit Ultraschall der Frequenz50 kHz bei 23 °C zwei gesättigte Lösungen hergestellt, die entstehenden Suspensionen bei
4'000 UpM ausserhalb der Glove-box während fünf Minuten zentrifugiert, die Proben wieder
in die Glove-box geführt und die überstehenden, klaren Lösungen zur weiteren Verwendungabpipettiert.Eine Probe dieser sauerstofffreien Lösung wurde in der Glove-box mit Deuteriumoxid auf ca.
1/10 der Sättigungskonzentration verdünnt.
Zur Spektroskopie wurden die Lösungen in Küvetten mit einer Schichtdicke vom 0,100 cm
gefüllt, jeweils mit einem Teflonstopfen und Parafilm gasdicht verschlossen und sodann der
Glove-box entnommen.
Analog, jedoch in normaler Laboratmosphäre wurde ohne Verwendung einer Glove-box eine
sauerstoffgesättigte Lösung von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid
hergestellt.Die UV/vis- und 2D-Totallumineszenz-Spektren (Messdauer je 12 h) der drei Lösungen im
Bereich 250-380 nm (Exitation) und 305-560 nm (Emission) (Abbildung 39-42) wurden
gemessen.
Die Fluoreszenzintensitäten sauerstoffgesättigter und entgaster gesättigter Lösungen des 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) waren praktisch identisch: 02 < 15 ppm, abs26s nm=
0,851: 55'250 Counts; sauerstoffgesättigt, UV/vis-Spektrum: abs265 nm=1>024: 60'200
Counts.
Eindimensionale Emissions- und Exitationsscans im Bereich des Exitations/Emissionsmaxi-
mums (EM 340-520 nm, EX 300/320/340 nm & EX 280-360 nm, EM 410/430/450 nm)wurden jeweils von analog frisch hergestellten Lösungen mit erhöhter Sensitivität des
Spektrometers gefahren und die Lage des Emissionsmaximums aus je drei Exitationsscans
bestimmt. In Tabelle 1 sind die Lagen der Maxima der EM/EX-Matrix zusammengestellt.
Die'H-NMR-Spektren der Probenlösungen im Anschluss an die Fluoreszenzmessungen waren
mit dem Spektrum des reinen Eduktes 16 identisch.
6.8.1.2 Konzentrationsreihe von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)in D20
Zur Messung der Konzentrationsabhängigkeit der Fluoreszenzintensität wurde eine Serie von
Totallumineszenzmessungen durchgeführt.Ca. 1,4 ml Deuteriumoxid über ca. 10 mg 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) wurden
durch 15-minütige Ultraschallexposition (50 kHz) mit 16 gesättigt. Von der nach
Zentrifugation (4'000 UpM, 5 min) partikelfreien überstehenden Lösung wurde das UV/vis-
Spektrum und die Totallumineszenzspektren (Anregung 320 nm, Emissonsdetektion 340-520
nm) gemessen.
Ausgehend von diesen 1,4 ml mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigtenDeuteriumoxid wurden durch sukzessives Verdünnen mit jeweils frischen Deuteriumoxid-
Ampullen Verdünnungen von '/2,1/s, '/10,1/so der gesättigten Lösung hergestellt und analog
257
Spektroskopien. Das Hintergrundrauschen wurde für die gewählten Apparaturparameter zu
883 counts/sec bestimmt.
Abbildung 43 zeigt die Lumineszenzintensitäten dieser Lösungen als Funktion der
Konzentration. Die Zahl gemessener Impulse im Photomultiplier war bis zu abs265 nm- 0,60,
entsprechend einer halbgesättigten Lösung, lineare Funktion der Konzentration (Gerade in
Abbildung 43) und wich für höhere Konzentrationen erheblich von der Linearität ab. Die
Abweichung von der Linearität lag für die gesättigte Lösung 21% unter dem Wert, der sich aus
der Extrapolation der Lumineszenzintensitäten als Funktion der Konzentration für weniger als
halbgesättigte Lösungen ergibt.
6.8.1.3 Bestimmung der Löslichkeit von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in D20
Deuteriumoxid wurde mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt indem 1,4 ml
D20 mit ca. 10 mg 16 im auf 23,0 + 0,1 °C thermostatisierten Ultraschallbad während 15
Minuten Ultraschall der Frequenz 50 kHz ausgesetzt wurden. Nach Zentrifugation während fünf
Minuten bei 4'000 UpM war die Lösung über dem Festkörper partikelfrei und wurde UV/vis-
spektroskopisch untersucht.
Mit sechs weiteren, analogen Experimenten bestimmte sich die Löslichkeit von 16 zu 1,29-10"4 M ± ca. 4,5 % [e(1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), D20, 265 nm)= 8'100].
6.8.1.4 Hydrolyse & Stabilität von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in D20
Eine analog56 gesättigte Lösung von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in
Deuteriumoxid wurde a) sofort nach ihrer Bereitung und nach lichtgeschützter Lagerungwährend b> 24 Stunden bei 5 °C sowie c> anschliessenden sieben Tagen bei 23 ± 1 °C 'H-NMR-
(200 MHz) und UV/vis-spektroskopisch untersucht.
Innerhalb der üblichen Messfehler waren sämtliche 'H-NMR- und UV/vis-Spektren mit den
Spektren von reinem 16 identisch und wiesen auch keine Signale hydrolysierter Substanz auf.
6.8.1.5 Totallumineszenz von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und
Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat(24 & 21) und Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17 & 19)
a BlindprobeDie Exitationsspektren einer mit Deuteriumoxid gefüllten Messküvette57, Anregung 250-400
nm, Emission delektiert bei 410, 430, 450 nm, und die Emissionsspektren, Anregung 300
und 340 nm, Emissionsbereich 340-520 nm, waren mit max. ca. 330 counts/sec praktischKonstanten und identisch mit dem Hintergrundrauschen.Im UV/vis-Spektrum begann die Absorption entsprechend den Materiaieigenschaften der
eingesetzten Küvette unterhalb 300 nm, auf Werte über 0,001 zu steigen.
56 analog 6.8.1.3
57 Hellma suprasil, dx= 0,100 cm, gereinigt mit Methanol, puriss. und anschliessend mit
Aceton puriss.
258
b. Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat/Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobynnat (24 & 21)
Ca 0,7 mg (5,82 10 7 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) wurden in 0,7 ml
Deuteriumoxid gelöst (abss7g nm= 0,814, 8,31 10'4 M), in eine 0,100 cm Quartzkuvette
gefüllt, das UV/vis Spektrum und das Totaiiumineszenzspektrum (Exitation 250-450,Emission 430 & 570 nm, Emission 250-800, Exitation 285 nm) gemessen, die
Totallumineszenzmessung als zweidimensionales Exitations-Emissions-Spektrum wiederholt
und zum Schluss das 1 H-NMR-Spektrum (300 MHz) aufgenommen.Mit einer aus 0,4 mg Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat(21) und Deuteriumoxid bereiteten 1,20 10 5 M Lösung wurde bis auf den Verzicht auf das
zweidimensionale Totaiiumineszenzspektrum analog verfahren
Die Emissionsspektren der Lösungen (EM 250-750, EX 250-400) (Abbildungen 44 & 45)
zeigten bei konstanter Exitation ab 500 nm minimale, aber signifikante Zunahme der Emission
mit steigender Wellenlänge; bei konstanter Emission in den Exitationsspektren unterhalb 300
nm eine Zunahme der Counts mit fallender WellenlängeDie Fluoreszenzcounts des Probenphotomultiphers lagen mit maximal 400 counts/sec in der
Grössenordnung des Hintergrundrauschens Die UV/vis- und 'H-NMR-Spektren waren
identisch mit den Beschreibungsspektren von 24 und 21
c Heptakalium-dicyano Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)/Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17 & 19)
Ca. 3,0 mg (1,18 10"3 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)(17) wurden in 0,7 ml Deuteriumoxid gelöst und 'H-
NMR- sowie UV/vis-spektroskopiert (abssso nm« 1,227, 1,30 10 3 M). Der Bereich EX
320, EM 250-700 nm und EM 430, EX 250-450 nm wurde auf Lumineszenz geprüftMit einer aus 1,0 mg Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) und Deuteriumoxid
bereiteten 1,95 10'5 molaren Lösung wurde analog verfahren
Die UV/vis-Spektren waren identisch mit den entsprechenden Beschreibungsspektren von 17
respektive 19.
Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Dicyano- und 1,N6-Ethenoadenosylverbindung
gingen nicht über das Rauschen, d h ca 400 Counts/sec,hinaus und wiesen keine Maxima auf
(Abbildung 46 & 47) Die ' H-NMR-Spektren waren mit jenen aus den Beschreibungsansätzenbis auf durch Konzentrationsunterschiede bedingte, geringfügige Signalverschiebungenidentisch
259
6.8.1.6 Konzentrationsreihe von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
(24) und -cobamido-N,N-,N",N-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17) mit gesättigter, wässriger 1,N6-Etheno-
adenosyl-5'-0-tosylat-Lösung
3,5 ml Deuteriumoxid mit 5,1 mg (1,04-10'4 mol) 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)wurden während 15 Minuten Ultraschall ausgesetzt (50 kHz), die Suspension zentrifugiert(4'000 UpM, 5 min) und die partikelfreie Lösung vom Niederschlag abpipettiert.Man löste sodann 2,3 mg (1.91-10'6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)bzw. 5,2 mg (2,04-106 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in jeweils 0,5 ml der mit 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigten Deuteriumoxidlösung und verdünnte für die
nachfolgenden Messungen die Probe jeweils mit dergleichen 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Stammlösung, sodass Lösungen der approximativen Konzentration '/2, V3, V5,1/7,5,1'io, 1'20,1/30,1'5o, 1'75,1'ioo der anfänglichen Corrinkonzentration resultierten.
Von jeder Verdünnung wurde ein UV/vis-Spektrum und ein Totallumineszenz-Emissions¬
spektrum (Emissionsscan: 340 bis 520 nm, Exitation: 320 nm) aufgenommen sowie je zwei
Proben zusätzlich 'H-NMR-spektroskopisch (300,13 MHz) untersucht.
UV/vis-Spektren
Abbildung 48 zeigt die UV/vis-Spektren der untersuchten gesättigten 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Lösungen mit jeweils unterschiedlichem Gehalt an Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat (24).
'H-NMR-Spektroskopie
Die Signale der 1 H-NMR-Spektren der Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-Versuchs¬reihe waren die Summe der Signale aus den Spektren der reinen Substanzen 24 und 16.
Im Falle des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyMO'-carboxylat) (17) fand man das Signal von 4,07 ppm nach 4,06 ppm und von den
Signalen des 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) jene von 1,90 ppm nach 1,96 ppm und
die des Aromaten von 6,75 ppm und 7,39 ppm nach 6,82 ppm respektive 7,42 ppm geshiftet
(Tabelle 2).Hydrolyse während der Zeitdauer der Versuchsdurchführung trat nicht in 'H-NMR-spektro¬skopisch detektierbarem Ausmasse auf.
Totallumineszenzspektroskopie
Abbildung 49 zeigt die Totallumineszenzintensitäten der Emissionsspektren obiger Lösungenals Funktion der Corrinkonzentration. Die ermittelten Funktionen für Dicyano-heptakalium-
Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,
N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) waren ebenso wie die Emissionsspektren der
Stammlösungen identisch. Die Emissionsspektren der corrinhaltigen Proben zeigten im
untersuchten Bereich zwei gut erkennbare Maxima, ca. 410 und 430 nm, und entsprachendamit den Literaturdaten [142, 145, 152]. Neben den Maxima bei 430 und 410 wurde in den
Totallumineszenzspektren der Lösungen von 17 zudem eine Schulter bei ca. 380 nm
beobachtet, welche in Lösungen mit abssao nm> 2 au< 360 nm fiel. Die Breite der
Lumineszenzbanden auf halbmaximaler Höhe schwankte zwischen 90 und 75 nm.
260
6.8.1.7 Sättigung von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) &
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobamido- N, N', N", N"-,N"",N ,
N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) in Deuteriumoxid mit
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
A. orientierende Messung von Lösungen vergleichbarer Konzentration
1,6 mg (1,26.10-6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw. 3,3 mg
(1.30-10-6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N-",N-'",N ,N -
hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) wurden mit 0,8 bzw. 1,6 mg 1,N6-Etheno-5'-0-tosyladenosin (16) (1,63-10"6 mol bzw. 3.26.10"6 mol) sowie je 0,7 ml Deuteriumoxid
versetzt (9,29-10-4 M bzw. 1,55-103 M) und während zehn Minuten mit 50 kHz Ultraschall
unter Temperaturkontrolle, T= 23,0 ±0,1 °C, beschallt. Nach Zentrifugation (4'000 Upm, 10
min) liess sich eine klare Lösung vom verbleibenden, farblosen Festkörperanteilabpipettieren.Zur Bestimmung der Lumineszenzeigenschaften wurden bei 300 °K Exitationscans (Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24): von 280 bis 360 nm; Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17): von 250 bis
400 nm) mit Detektion bei 410/430/450 nm und Emissionsscans (Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24): von 340 bis 520 nm; Heptakalium-dicyano-Co(!ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat): von 300 bis 520 nm) mit
Exitation bei 300/320/340 nm gemessen. Zuletzt wurden die 'H-NMR- und UV/vis-Spektrender Proben aufgenommen. Im Falle von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) wurde ca. 0,1 mg KCN in die
Probe gegeben und erneut das ' H-NMR-Spektrum gemessen.
Aus den Absorptionswerten der UV/vis-Spektren berechnete man gemäss der unter 6.6.2aa
beschriebenen Methode die Konzentration an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) für die
Lösung von 24 zu 1,40 mM, für die Lösung von 17 zu 1,83 mM.
Die Auswertung der 'H-NMR-Spektren erfolgte entsprechend Methode 6.6.2b. Aus den
Integralen der 'H-NMR-Signale des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), die oberhalb
5,0 ppm lagen und dem C-10 Signal des Corrinteiles, beim Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) zusätzlich C-3, 19 und 8 bzw. C-3 und 19 bzw. beim Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N'-,N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17),wurden die relativen Konzentrationen der beiden Substanzen bestimmt. Die Konzentration von
[16] betrug mit 2,33 mM das 1,5-fache der Konzentration von 17, und mit 1,39 mM
ebenfalls das 1,5-fache der Konzentration von 24. Gemäss 6.6.2 ergeben sich die
Besetzungsgrade zu 10% für das Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und 60% für
das Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17).
Die 'H-NMR-Spektren lieferten die aufgrund der Charakterisierung der reinen Substanzen
(vgl. 6.4.1, 6.4.5, 6.6.2) erwarteten Signale. Tabelle 4 dokumentiert die Abweichungen der
beobachteten chemischen Verschiebungen im 1H-NMR-Shifts von der Lage der chemischen
Verschiebungen der reinen Substanzen. Hydrolyse des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)wurde im Zeitraum der Experimentsdurchführung im 'H-NMR-Spektrum nicht beobachtet.
Die Lösung von 16 mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) opaleszierte leicht, doch klarte sie sich bei Zugabevon 0,1 mg KCN sofort auf. Die 1 H-NMR-Signale des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-
261
N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17), die zuerst schmal
waren, verbreiterten sich auffallend. Bei den Signalen des Gastes verhielt es sich genau
umgekehrt.
Das Exitationsmaximum beider Probenlösungen lag bei ca. 323 nm. Während das
Emissionsmaximum in der Lösung mit 24 bei 435,9 ± 2,7 nm lag und eine Schulter bei 409 ±
2 nm zeigte, befand sich in der Lösung von 17 das Emissionsmaximum bei 434,0 ± 0,8 nm mit
einer Schulter bei 410 ± 2 nm. Die Fehlergrenze der Lage der Maxima wurde graphisch aus
den Lumineszenzspektren abgeschätzt.
Tabelle 3 (Allgemeiner Teil) zeigt die Ergebnisse der Spektrenanalyse in der Übersicht.
B. Konzentrationsreihe der Dicyanocorrine 17 & 24
2,2 mg Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und 5,0 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N",,N,"-,N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17)wurden in je 1,4 ml Deuteriumoxid gelöst, auf ca. 2,8 mM eingestellt, mit je ca. 10 mg 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) versetzt, während 15 Minuten Ultraschall ausgesetzt (50kHz, Wasserbad 23 °C), zentrifugiert (4'000 UpM, 5 min) und von den partikelfreienLösungen die Fluoreszenz-, die UV/vis- sowie die 'H-NMR-Spektren aufgenommen.Anschliessend verdünnte man die Proben dreimal je auf die Hälfte und wiederholte die Sättigungmit anschliessender spektroskopischer Untersuchung, abgesehen vom 'H-NMR-Spektrum,welches nur für die letzte Verdünnung einer Konzentrationsreihe wieder gemessen wurde.
UV/vis-Spektren
Die 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Konzentrationen wurden analog der unter 6.6.2aa
beschriebenen Methode aus den UV/vis-Spektren bei 265 nm berechnet. Tabelle 17 fasst die
Absorptionswerte der Probenlösung bei 578 bzw. 580 nm sowie die Konzentrationen an 16
zusammen (Küvettendicke dx= 0,100 cm).
Tabelle 17 i
1
(
Auswertung der UV/vis-Spektren der mit
,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)»sättigten Corrinlösunaen in D?0
I 24 [16]/mM abs 576 nm
0,210 2,408
0,198 1,263
0,271 0,820
0,285 0,604
0,265 0,413
1 7 [16]/mM abs 580 nm
1,504 2,431
1,234 1,630
0,900 0,824
0,372 0,431
262
Lumineszenz
Die Lumineszenzspektren wiesen jeweils zwei Emissionsmaxima auf, eines bei cirka 427 nm,
das zweite bei 408,5 ± 0,5 nm (Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)) bzw. 410,5
± 0,3 nm (Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat (17)) (Abbildung 102 und 103). Die Fehlergrenzen wurden wiederum
aus den Spektren graphisch abgeschätzt.
Der Verlauf der Luminszenzintensitäten als Funktion der Corrinkonzentration war identisch
mit jenem bei Verdünnung von Corrinlösungen mit an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) gesättigtem Deuteriumoxid (vgl. 6.8.1.6). Abbildung 52 (Allg. Teil) stellt die Total¬
lumineszenzintensitäten der Lösungen als Funktion der Corrinkonzentrationen graphisch dar.
Dem innerhalb der Fehlergrenzen identischen Verlauf der Lumineszenzwerte (Abbildung 52)standen deutlich erhöhte Konzentrationen an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)
gegenüber (Abbildung 51). Die Lumineszenz des durch das Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) zusätzlich
gelösten 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat war somit praktisch vollständig gequencht.
H-NMR-Spektroskopie
Die 1 H-NMR-Spektren der Lösungen aus Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und
1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) waren betreffend Lage und Integralintensität bei
allen untersuchten Konzentrationen die Summe der Signale der Spektren der reinen Substanzen
(vgl. z.B. Abbildung 104 sowie Kapitel 6.4.1 & 6.6.2).
Beim Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-
10'-carboxylat) (17) hingegen war neben minimalen Signalshifts (Tabelle 4) sowohl des
Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N' -hepta-(n-decyl-10'-carb-
oxylat) selbst und der extremen Linienbreite (0,2 ppm) der Signale in Lösungen höherer
Konzentration auch ein Shift der meisten Signale des 1 ,N6-Ethenoadenosyleinheit, insbesondere
des Phenylringes, und dem H(C-3) des Corrinringes (8 'H-NMR: 4,03 ppm) zu beobachten.
Mit fallender Konzentration von 17 bildeten sich die Linienverbreiterungen immer mehr
zurück und die Signallagen nahmen die mit den reinen Substanzen identischen Positionen ein.
Die relativen, mit den 1 H-NMR-Spektren entnommenen Intensitätsintegralen der Signale
analog 6.8.1.7A bestimmten Verhältnisse der Konzentrationen von Corrin zu 1,N6-
Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) beliefen sich zu: Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
(24): abS576= 2,408, 24:16=1,5:1; abs576= 0,413, 24:16=1:4,5; Heptakalium-dicyano-
Co(IM)-cobamido-N,N',N'-,N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17): abs58o=
2,431, 17:16=1:1,5; abs58o= 0,413, 17:16=1:5.
263
4x1 CT
3x10 -
3 2x1(To
1x1(T
yZZ.^CT^"ICN
(24)
0H
OH
VA
zr"v
^.0(16>
2.75x10^ 2.50x10 2.25x1(T 2.00x10
emission /cm-1
0
Abbildung 102: Totaiiumineszenzspektrum einer 2,56-10-3M Lösung von Dicyano-
heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) gesättigt mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)in Deuteriumoxid, Exitation: 320 nm, Emissionsscan 350-500 nm
2.75X104 2.50X104 2.25x104 2.00x104
emission /cm-1
Abbildung 103: Totaiiumineszenzspektrum einer 2,56-10-3M Lösung von Heptakalium-
dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17)
gesättigt mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid, Exitation: 320'nm,
Emissionsscan 350-500 nm
264
EQ.O.
LO
COOK
KOOC KOOC
Abbildung 104: Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24), 1,32 mM, in
Deuteriumoxid, gesättigt mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), 300,13 MHz, 300 K,
Vergleichspektren der reinen Substanzen Abbildung 20 (24) und 6.6.2 (16)
265
6.8.2 UV/vis-Experimente
a) mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat
2,1 mg Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) wurden in 0,7 ml Deuteriumoxid
gelöst und mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt indem die Lösung mit ca. 10
mg 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) versetzt und während 15 Minuten Ultraschall
der Frequenz 50 kHz ausgesetzt wurde. Von der nach Zentrifugation (4'000 UpM, 5 min)
partikelfreien Lösung über dem am Gefässboden niedergeschlagenen Festkörper wurde das 'H-
NMR- sowie das UV/vis -Spektrum aufgenommen.
Die Lösung wurde nach der Spektroskopie wieder mit dem Festkörper vereinigt, einige Zehntel
eines Milliliters Deutenumoxid zugegeben und die Sättigung sowie die spektroskopische
Analyse wiederholt Die Stammlösung wurde derart insgesamt dreimal verdünnt
Die 'H-NMR-Spektren der von suspendiertem Material durch Zentrifugation befreiten
Lösungen waren jeweils identisch mit der Summe der Spektren der reinen
Vergleichssubstanzen
In Tabelle 18 ist das gemäss 6 6.2b aus den 'H-NMR-Spektren berechnete Verhältnis der
Konzentrationen des Cobynnates 24 zum 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat dargestellt
Ebenso enthält Tabelle 18 den aus den UV/vis-Spektren gemäss der unter 6 6 2 beschriebenen
Vorgehensweise bestimmten Besetzungsgrad der Corrine
Tabelle 18 Assoziationsgrad in Prozent der Corrinkonzentration von
Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in wässriger Lösung,bestimmt mit 'H-NMR- und UV/vis-Spektroskopie
[24]/mM Cobyrinat e-Adotosylat
(24-16)
aemäss'H-NMRb
Besetzungsgrad
gemäss
UV/vis-SDektruma
2,42 1,00 . 0,67 0
1,89 - 6
1,54 1,00 1,00 5
1,22 - 1 1
a berechnet gemäss der unter 6 6.2aa beschriebenen Methode; b
berechnet gemäss der unter 6 6 2b beschriebenen Methode
266
b) mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-
(n-decyl-10'-carboxylat)
Mit 4,2 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-10'-carboxylat) (17) wurde eine dem Experiment 6.8.2a analoge Experimentreihe
durchgeführt.
Die Ergebnisse der ebenfalls analog zu a) erfolgten Auswertung sind in Tabelle 19
zusammengestellt.
Tabelle 19 Assoziationsgrad von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-amido-N,N-,N',,N-,,,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-lO'-carboxylat) (17) mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in wässriger Lösung, bestimmt mit 'H-NMR- und
UV/vis-Spektroskopie
[17]/mM Cobamidat:e-Adotosylat
(17:16)
aemäss'H-NMRb
Besetzungsgrad
gemäss
UV/vis-Spektrum8
2,10 1,12 : 1,00 43
1,70 - 135
1,32 1,00 : 1,82 125
1,11 150
a: berechnet gemäss der unter 6.6.2aa beschriebenen Methode; b:
berechnet gemäss der unter 6.6.2b beschriebenen Methode
267
6.9 Reduktionskinetik von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamidoN,N',N",N";N"';N""',N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Herstellung von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",
N"--,N'"",N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat)
Ausgehend von den Dicyanoverbindungen 17 und 24 wurden die Co(ll)-corrine
Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-lO'-carboxylat) wie folgt synthetisiert:
Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat
In einer Glove-box wurden 20,0 mg (1,59-10-5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat58 (24) in 10 ml Methanol gelöst, mit 10,4 mg Pt02 sowie 15 pl
Essigsäure versetzt und ein Wasserstoffgasballon aufgesetzt. Nachdem gemäss UV/vis-
Spektroskopie innerhalb 3,5 Stunden das Edukt quantitativ zu Co(ll)-cobyrinatreduziert war, filtrierte man die Lösung, trocknete am HV und löste den festen
Rückstand wieder in 10 ml Methanol.
UV/Vis (CH3OH, c= 2,82-10-* M)
465 ( 7'160), 398 ( 5'180), sh 358 ( 6'200), sh
314 (17'560), 266 ( 13'960)
Hexakalium-Co(ll)-cobamido- N, N', N", N"\ N"", N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)
Analog 24 wurden 55,5 mg (2,20-10"5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)59 (17) mit
41,0 mg Pt02, 10 pl Essigsäure in 4 ml Methanol innerhalb 1,5 Stunden in Wasser¬
stoffatmosphäre zu Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N'-,N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) reduziert (UV/vis-spektroskopische Kontrolle),die Lösung filtriert, am HV getrocknet und der Rückstand in 10 ml Methanol gelöst.
UV/Vis (CH3OH, c= 1,80-10-* M)
469 ( 7'310), 403 ( 4'510),sh 365 ( 6'330), sh
315 ( 17'710), 267 ( 13'200)
Die UV/vis-Spektren bei Reaktionsende zeigten keine Absorptionsmaxima oder
Schultern oberhalb 469 nm. Die erhaltenen methanolischen Lösungen der Co(ll)-corrine wurden als Stammlösungen für die nachfolgend beschriebenen
Alkylierungsexperimente eingesetzt.
Material des BeschreibungsansatzesMaterial des Beschreibungsansatzes
268
Messung der Reduktionskinetik
1. Experiment (Cofllj-cobyrinat/NaBH^Phosphatpuffer)
Zur Bestimmung der Reduktionskinetik wurde von einer 0,625 ml-Portion der
methanolischen Co(ll)-cobyrinat-Stammlösung am Rotationsverdampfer das
Lösungsmittel abgezogen und der braune Rückstand zwei Stunden am HV getrocknet.Dieser wurde anschliessend in 2,0 ml 1M Phosphatpuffer, pH 9, gelöst, in die
Messapparatur gemäss Abbildung 56 pipettiert, in den oberen Teil der Messapparatur11,4 mg (3,02-10'4M) Natriumborhydrid eingefüllt, die Apparatur unter
Verwendung von Schliffett gut verschlossen, der Schliff durch Umwickeln mit
Parafilm gesichert und die Apparatur der Glove-box entnommen.
Die Apparatur wurde in die Küvettenhalterung eines UV/vis-Spektrophotometers, das
auf 23,0 ± 0,2 °C thermostatisiert war, verbracht und nach einigen Minuten der
Temperaturangleichung ein Übersichtsspektrum der Probe gefahren:
UV/Vis (Hexanatrium-Co(ll)-cobyrinat, Phosphatpuffer, c= 1,80-10-* M)
468 ( 7-390), 403 ( 4'760), Sh 360 ( 6'200), Sh
316 ( 17'500), 267 ( 13'200)
Die Apparatur wurde dann dem Probenraum wieder entnommen, mit der Co(ll)-cobyrinat Lösung das Natriumborhydrid aus dem oberen, abgebogenen Kolben gespültund die optische Dichte der Lösung bei X= 388 nm als Zeitreihe gemessen.
Die Auswertung der experimentellen Daten (Methodik vgl. nächsten Abschnitt) ergabfür die Regression über ca. fünf Halbwertzeiten einen Wert von y=-0,019+1,706xmit R2= 0,998 aus dem sich k zu k= 11,34 min-1 M-1 errechnete.
Variierte man den Auswertungszeitraum um eine approximative Halbwertzeit
(Verlängerung bzw. Verkürzung) so änderte sich k ca. ± 1%.
2. Experiment (Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-W-carboxylatyNaBH^Phosphatpuffer)
Analog dem ersten Experiment (Cofllj-cobyrinat/NaBH^Phosphatpuffer) wurden
0,625 ml der methanolischen Stammlösung von Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) am Hochvakuum
getrocknet und nach Lösen in 2,5 ml 1M Phosphatpuffer, pH 9 in die Apparatur von
Abbildung 56 (Allgemeiner Teil) transferiert. In das Reservoir füllte man 15,8 mg
(4,16.10"4 mol) Natriumborhydrid.Die Eduktlösung wurde vor Beginn der Reaktion einige Minuten im auf 23 °C
thermostatisierten UV/vis-Spektrophotometer belassen bevor das UV/vis-Spektrumgemessen wurde.
Die Reaktion wurde analog dem Experiment 1 initiiert und die Absorption bei 388 nm
verfolgt.Die Auswertung der experimentellen Daten (Methodik vgl. nächsten Abschnitt) ergabmit dem Datensatz der ersten vier Halbwertzeiten ein k von k= 35,6 min-'M-'.
Variierte man den Auswertungszeitraum um eine approximative Halbwertzeit
(Verlängerung bzw. Verkürzung) so änderte sich k um ca. ± 5%.
269
Auch hier zeigte sich, dass während der Experimentsdauer anscheinend keine
Rückoxidation stattfindet. Das UV/vis-Spektrum des Produktes wies nämlich selbst
eine Stunde nach Konstanz des Absorptionswertes bei 388 während einiger Minuten
folgende Maxima auf:
UV/Vis (Pentanatrium-Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N""',N' -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat), Phosphatpuffer, qualitativ, dx= 0,100 cm)
687 ( 0,026) 558 ( 0,081) 463 ( 0,179),390 ( 1,000) 295 ( 1,018)
3./4. Experiment (Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyl-IO'-carboxylatyNaBH^Phosphatpuffer)
Das Experiment 2 wurde noch zweimal wiederholt (3. Experiment: 0,625 ml
Stammlösung, 2,5 ml Phosphatpuffer, 30,7 mg (8,1 MO4 mol) Natriumborhydrid;4. Experiment: 0,625 ml Stammlösung, 2,5 ml Phosphatpuffer, 15,0 mg (4,01 -10-4
mol) Natriumborhydrid).Die den ersten beiden Experimenten analog ausgewerteten experimentellen Daten der
Absorption bei 388 nm lieferte für das 4. Experiment k= 36,4 min-'M'1. Aus dem 3.
Experiment konnte k nur zu grösser als 21,4 min'M'1 abgeschätzt werden, da zu spätmit der Datenakkumulation begonnen wurde.
5. Experiment (Co(ll)-cobyrinat/NaBH4/Methanol)
Es wurde wiederum eine 0,625 ml-Portion aus der Co(ll)-cobyrinat Stammlösungabpipettiert, direkt mit 1,875 ml Methanol verdünnt in die Apparatur gemäss
Abbildung 56 gefüllt und das obere Reservoir mit 29,0 mg Natriumborhydrid beladen.
Nach dem Start der Reaktion analog den übrigen Reduktionsexperimenten wurde
wiederum die Absorption bei 388 nm beobachtet. Sie war lineare Funktion der Zeit mit
einer Steigung von 360 min'1.
Auch bei diesem Experiment war die Kinetikapparatur in der beschriebenen Form
über den Zeitraum der Kinetikmessungen anscheinend genügend dicht; selbst nach
einigen Stunden blieb das UV/vis-Spektrum der Co(l)-Lösungen der
Reduktionsexperimente unverändert:
UV/Vis (Pentanatrium-Co(l)-cobyrinat, CH3OH, c= 2,82-10-* M)
730 ( 320), 558 ( 745), 465 ( 710),sh388 (10'375), 292 ( 10'270), 244 ( 6'900)
Auswertung der Reduktionskinetik
Tabelle 5 zeigt die isobestischen Punkte der untersuchten Reaktionen. Die
Wellenlängen der maximalen Differenzen der Extinktionskoeffizienten zwischen Edukt
und Produkt sind in Tabelle 6 aufgeführt (Tabellen im Allgemeinen Teil).
270
Zur Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten wurde, da angesichts der
Reaktionsgeschwindigkeiten nur eine Wellenlänge gemessen werden konnte, die
Wellenlänge absolut grösster Differenz der Extinktionskoeffizienten, 388 nme°,gewählt. Das Zeitintervall zwischen zwei Messungen betrug 1 sec. Sekundäre Faktoren
wie die starke Blasenentwicklung bei der Reduktion der Co(ll)-corrine streuen
statistisch und störten aufgrund der grossen Anzahl Messwerte nicht.
Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k erfolgte auf der Basis des Modells
einer Reaktion pseudo-erster Ordnung. Der natürliche Logarhythmus des Quotienten
von Eduktkonzentration und Gesamtcorrinkonzentration entspricht dabei k\ der
Geschwindigkeitskonstanten pseudo-1.Ordnung, multipliziert mit der Zeit und ist'überdie Differenzen der momentanen optischen Dichte mit den optischen Dichten bei t= 0
und t= ~ zugänglich.
[Edukt]t-t-k'x t = In ( )
[Edukt]'-0
abst.o- abst-k'x t = In (1+ l 1)
abst-abst.°o
Als Werte für t= 0 und t= ~ wurden die experimentellen Daten vor Beginn und nach
Abschluss der Reaktion eingesetzt. Aus den derart erhaltenen Datensatz wurden für die
ersten vier approximativen Halbwertzeiten x1/2 lineare Regressionen berechnet.
Abbildung 105: Reduktionskinetik von Co(ll)-cobyrinat mit Natriumborhydrid in
Phosphatpuffer, 1M, pH 9; [Co(ll)-cobyrinat]= 1,08 mM, T= 23,0±0,2 °C, dx=
0,100 cm
(a) UV/vis-Spektren von Produkt und Edukt
60 Im Falle des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)
271
(b) optische Dichte bei 388 nm
4 5 6
Zeit / min
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte bei 388 nm gemäss Ansatz
pseudo-erster-Ordnung
O
o o
00 orao/o oo
0° o ^OooQo <fc
4 5
Zeit / min
10
272
Abbildung 106: Reduktionskinetik von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N
-hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit Natriumborhydrid in Phosphatpuffer, 1M, pH9; [Co(ll)-cobyrinat]= 0,91 mM, T= 23,0 ± 0,2 °C, dx= 0,100 cm
(a)
(b)
UV/vis-Spektren von Produkt und Edukt;
optische Dichte bei 388 nm
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte bei 390 nm gemäss Ansatz
pseudo-erster-Ordnung
4Zeit / min
273
6.10 Alkylierungskinetik von in situ hergestelltem
Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
In situ Herstellung der Co(l)-corrine und Durchführung der Alkyl¬
ierungskinetik
Experiment 1 a
In einer Glove-box wurden 0,625 ml der (22,0 mM) Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Stammlösung61 mit
1,67 ml Methanol verdünnt in den unteren Birnkolben der Kinetikapparatur(Abbildung 56) eingefüllt und durch Zugabe von 39,4 mg (1,04 mmol)
Natriumborhydrid unter heftiger Blasenentwicklung die nun 6,0 mM Lösung des
Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) zu
Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) re¬
duziert62. Nach dem Abklingen der Gasentwicklung wurde die Apparatur mit dem
abgebogenen Kolben, der 4,60 mg 5'-0-Tosyladenosin63 (15) als Alkylierungsmittelenthielt, verschlossen, der Schliff durch Umwickeln mit Parafilm gesichert,anschliessend die Apparatur der Glove-Box entnommen und die Lösung durch ihr
UV/vis-Spektrum im Bereich von 190 bis 850 nm charakterisiert.
Zur Initialisierung der Umsetzung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -
hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit dem festen S'-O-Tosyladenosin (15) spülteman durch Umschwenken das Alkylierungsmittel 15 mit der Corrinlösung aus dem
oberen Teil der Kinetikapparatur und rührte während 15 sec mit dem Magnetrührerbevor die UV-Küvette mit der Lösung gefüllt und mit der Messung begonnen wurde. Zu
Beginn der Messung war das 5'-0-Tosyladenosin (15) bereits gelöst.
Der Reaktionsforlschritt wurde während 90 Minuten anhand der Absorption bei einer
fixen Wellenlänge, derjenigen des Absorptionsmaximums des jeweiligen Co(l)-cobamido-N,N',N",N'", N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (388 nm)dokumentiert und anschliessend das Produkt aufgearbeitet (siehe unten). Nach 6, 17
und 90 Minuten wurde nochmals ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen(Abbildung 57). Die Küvettenhalterung des UV/vis-Spektrophotometers wurde über
die ganze Experimentdauer auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisiert.
Das UV/vis-Spektrum bei Abschluss der Alkylierungskinetik war identisch mit dem
UV/vis-Spektrum des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'", N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) aus dem Beschreibungsansatz.
61 Material aus 7.9
62 Farbumschlag nach grün63 Gewaschen analog Assoziationsexperimenten
274
Experiment 1 b
Ca. 0,5 ml der (15,9 mM) Co(ll)-cobynnat-Stammlösung64 wurden in einer Glove-
box mit 3,1 ml Methanol auf 3,6 ml einer 2,1 mM Lösung verdünnt und mit 40,6 mg
(1,08 mmol) Natriumborhydrid in der Kinetikapparatur (Abbildung 56) reduziert
Nach Abklingen der zunächst heftigen Gasentwicklung (drei Minuten) wurde der
Schliff gefettet, der mit 21,5 mg (0,051 mmol) 5'-0-Tosyladenosm (15) gefüllteobere Kolben aufgesetzt und mit Parafilm umwickelt
Das Eduktspektrum wurde in dem auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisierten
Spektrophotometer gemessen und nach Vermischung der Lösung mit dem
Alkylierungsmittel, welches sofort vollständig in Lösung ging, mit der
Absorptionsmessung bei 384 nm begonnen Nach 3, 9, 21, 95, 138 und 987 Minuten
wurde nochmals ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen (Abbildung 107)Nach 1000 Minuten brach man die Messung ab und wertete aus. Dieser Ansatz wurde
aufgrund der geringen absoluten Substanzmenge nicht aufgearbeitet
Experiment 2 a
Ca 0,650 ml Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Stammlösung65 wurden in der Glove-box am Hochvakuum bei
Umgebungstemperatur während drei Stunden getrocknet, der Ruckstand in 2,2 ml
Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) aufgenommen, mit 39,4 mg Natriumborhydrid(1,04-103 mol) reduziert und mit 4,60 mg (1,09 10 5 mol) 5'-0-Tosyladenosin(15) im auf 28,0 ± 0,5 °C thermostatisierten Spektrophotometer die Absorption bei
388 nm beobachtet Nach 13, 27, 41, 54, 69 und 150 Minuten wurde nochmals ein
vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen (Abbildung 108)Nach drei Stunden wurde aufgearbeitet und das Produkt 18 1H-NMR-spektroskopischidentifiziert
Die übrigen beiden Kinetikmessungen wurden analog mit sehr ähnlichen
Konzentrationen und absoluten Substanzmengen durchgeführt
Experiment 2 b
0,625 ml Co(ll)-cobynnat in Methanol (1,103-10'6 mol) wurden in einer Glove-
box am Hochvakuum während 4 Stunden bei Umgebungstemperatur getrocknet Der
braune Lack wurde in 2,0 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) aufgenommen und mit
9,2 mg (2,43 10'4 mol) Natriumborhydrid reduziert Sobald die heftige
Blasenentwicklung nachhess wurde die Kinetikapparatur mit einem 4,03 mg
(9,56 10-6 mol) 5'-Tosyladenosin (15) enthaltenden abgebogenen, am Schliff
gefetteten Birnkolben verschlossen Den Schliff umwickelte man noch mit Parafilm
Die Apparatur wurde in ein auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisiertes Spektrophotometerverbracht und das UV/vis-Spektrum der Lösung aufgenommen Die Reaktion wurde
sodann initialisiert, indem man mit der Lösung das Reservoir rasch durchspülteDie Absorption bei 384 nm wurde beobachtet, nach 3, 17, 68, 132, 225 und 3617
Minuten zudem ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen (Abbildung 109)Nach sechs Stunden brach man die Messung ab. Dieser Ansatz wurde sodann analog dem
Beschreibungsansatz aufgearbeitet
64 Material aus 7 9
65 Material aus 7 9
275
Experiment 3
In einer Glove-box wurde ca. 0,2 ml Co(ll)-cobyrinat (Material aus 6.9) während
vier Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet und der dunkelbraune
Rückstandin 5,0 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) aufgenommen. Die Co(ll)-cobyrinat-Lösung (1,0 mM gemäss UV/vis-Spektrum) wurde mit ca. 25 mg 5'-0-
Tosyladenosin (15) versetzt, die Probe 15 Minuten lang mit Ultraschall beschallt,
zentrifugiert und die klare Lösung abpipettiert, um sie in die Kinetikapparatur zu
füllen.
In das obere Reservoir gab man 4,6 mg (1,22-10 4 mol) Natriumborhydrid und
verschloss die Apparatur, die dann der Box entnommen wurde, mit Schliffe« und
Parafilm.
Nach der Charakterisierung des Eduktes durch ein UV/vis-Spektrum im auf 23,0 ±
0,5 °C thermostatisierten Spektrophotometer wurde das Natriumborhydrid durch
einmaliges Schwenken der Glasgefässes gelöst und sofort mit der Messung der
Absorption bei 388 nm begonnen, da die sofort einsetzende heftige Blasenentwicklungeine mechanische Durchmischung erübrigte.Nach sechs Stunden wurde das Gefäss geöffnet und das Produkt aufgearbeitet. Das 'H-
NMR-Spektrum in Deuteromethanol wurde gemessen.
Ein zweites Experiment führte man analog mit den gleichen Substanzmengen durch.
Experiment 4
In einer Glove-box wurde 0,650 ml der Co(ll)-cobyrinat-Stammlösung66 während
vier Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet, der Rückstand in 2,00
ml Phosphatpuffer (pH 9, 1 M) aufgenommen, in die Kinetikapparatur gemäss
Abbildung 56 eingefüllt und mit 54,8 mg (1,45 mmol) Natriumborhydrid zu Co(l)-cobyrinat reduziert. Nach ca. einer Minute, nachdem die Gasentwicklung nur noch sehr
schwach war, wurde die Apparatur mit dem abgebogenen Birnkolben, in dem sich 17,0
mg (0,056 mmol) 5'-Chloro-5'-desoxyadenosin befanden, verschlossen. Der Schliff
wurde nochmals mit Parafilm umwickelt.
Die Eduktlösung wurde durch sein UV/vis-Spektrum charakterisiert und die im auf 18
± 2 °C thermostatisierten Spektrophotometer nach 30 Sekunden langer
Durchmischung der vorgelegten Lösung mit dem 5'-Chloro-5'-desoxyadenosin die
Absorption bei 388 nm als Zeitreihe gemessen. Nach 6, 15, 22, 29, 45 und 180
Minuten wurde zudem nochmals ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen
(Abbildung 110).Nachdem sich die Absorption nicht mehr änderte wurde noch ein letztes vollständiges
UV/vis-Spektrum aufgenommen und sofort anschliessend der Ansatz wie nachfolgendbeschrieben aufgearbeitet.
Experiment 5
In einer Glove-box wurden 0,625 ml einer 2,64 mM Lösung von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Methanol während
vier Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet, mit 2,00 ml
Phosphatpuffer (pH 9, 1 M) aufgenommen und in die Kinetikapparatur gefüllt
66 6.9
276
(Endkonzentration gemäss UV/vis-Spektrum 0,72 mM). Nach Zugabe von 44,2 mg
(1.16.10-3 mol) Natriumborhydrid wurde heftige Blasenentwicklung beobachtet, die
nach zwei bis drei Minuten weitestgehend abgeklungen war und das Aufsetzen des mit
21,7 mg (1.16.10-4 mol) Methyltosylat gefüllten Reservoirs ermöglichte.Der Schliff wurde noch mit Parafilm gesichert und die Apparatur der Glove-box zur
sofortigen Messung entnommen.
Nach Aufnahme des UV/vis-Spektrums im auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisierten
Spektrophotometer wurde die Probenlösung in das Reservoir gespült und das
Alkylierungsmittel augenblicklich gelöst. Die Absorption bei 388 nm wurde
beobachtet. Nach 20 Minuten wurde zudem nochmals ein vollständiges UV/vis-
Spektrum aufgenommen (Abbildung 111).Ob das Methyltosylat sich bei Beginn der Reaktion homogen in Lösung befand Hess sich
aufgrund der immer noch leichten Blasenentwicklung und dem Übergang des
Methyltosylates in die flüssige Phase nicht abschätzen.
Die Reaktion war auf jeden Fall so schnell, dass zum Zeitpunkt der Erfassung des
ersten Messpunktes nach der Vermischung die Methylierung schon weitestgehendabgeschlossen war. Es wurde nur noch die Ervdphase der Alkylierung beobachtet, deren
Geschwindigkeitskonstante, wie sich aus dem grossen Achsenabschnitt der Auswertungder Daten gemäss einem Ansatz pseudo-erster Ordnung ergibt, wesentlich geringerwar als die Geschwindigkeitskonstante zu Beginn der Alkylierung.Nach fünf Stunden wurde das Gefäss geöffnet und zur Aufarbeitung des Produktes die
Lösung am Rotationsverdampfer lichtgeschützt getrocknet. Nachdem der braune
Rückstand in Phosphatpufler (1M, pH 4,5) aufgenommen worden war wurde er wie
weiter unten beschrieben aufgearbeitet und zum Schluss mit 'H-NMR Spektroskopien.
In einem zweiten Experiment wurden in einer Glove-box 0,625 ml derselben Co(ll)-
cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Stammlös-ung analog getrocknet, in Phosphatpuffer (pH 9, 1 M) aufgenommen und in die
Kintikapparatur gefüllt, jedoch mit 8,3 mg (1,28-10-3 mol) Natriumborhydrid und
9,8 mg (5,26-10'5 mol) Methyltosylat umgesetzt. Ansonsten führte man diese zweite
Messung mit anschliessender Aufarbeitung völlig analog durch.
Experiment 6
Man trocknete in einer Glove-box 0,625 ml der 2,64 mM Stammlösung von Co(lt)-
cobamido-N,N',N",N"',N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Methanol
aus Experiment 5 während vier Stunden am Hochvakuum, nahm den braunen Rückstand
in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) auf, pipettierte ihn in die Kinetikapparatur und
reduzierte mit 8,4 mg (1.30-10"3 mol) Natriumborhydrid.Nach Beendigung der Blasenentwicklung (zwei bis drei Minuten) verschloss man die
Apparatur mit dem Reservoir, in dem sich 2,40 mg (1,29-10"B mol) Methyltosylatbefanden, und sicherte den gefetteten Schliff zusätzlich mit Parafilm.
Das UV/vis-Spektrum der Edukt-Probenlösung wurde im auf 23,0 ± 0,5 °C
thermostatisierten Spektrophotometer gemessen und die Reaktion durch möglichstrasche Durchmischung der vorgelegten Lösung mit dem Methyltosylat eingeleitet. Man
beobachtete die Absorption bei 388 nm. Das Methyltosylat wurde anscheinend sofort
vollständig gelöst.Auch in diesem Experiment war die Reaktion so schnell, dass zum Zeitpunkt der
Erfassung des ersten Messpunktes nach der Vermischung die Methylierung schon
weitestgehend abgeschlossen war und nur noch die Endphase der Alkylierung beobachtet
wurde. Analog wurde ein beträchtlicher Achsenabschnitt der Auswertung der Daten
gemäss einem Ansatz pseudo-erster Ordnung erhalten (Abbildung 112).
Die Reaktionslösung konnte bereits nach einer Stunde aufgearbeitet werden.
277
Aufarbeitung und Isolation der Alkylierungsprodukte
Tabelle 8 zeigt die isobestischen Punkte der untersuchten Reaktionen. Die
Wellenlängen der maximalen Differenzen der Extinktionskoeffizienten zwischen Edukt
und Produkt sind in Tabelle 9 aufgeführt (Tabellen im Allgemeinen Teil).
Überschüssiges NaBH4 wurde mit 2,0 ml Phosphatpuffer, 1M, pH 4,5, hydrolysiertund im Falle der Reaktionsführung in Methanol das organische Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer abgezogen. Die verbleibende Lösung wurde mit kristallinem
KHC03 gesättigt und solange durch 3 ml XAD geleitet bis das Eluat vollständig entfärbt
war (ca. 2 bis 3 Durchläufe). Man wusch mit 10 ml gesättigtem KHCO3 in Wasser, 50
ml H20 und eluierte die Substanz vollständig mit 30 ml MeOH.
Das Alkylierungsprodukt wurde mit 8,0 ml Aceton aus 0,05 ml MeOH gefällt. Nach
fünfminütiger Zentrifugation bei 4000 Upm konnte die farblose Mutterlauge
abpipettiert werden. Der Niederschlag wurde mit 8 ml Aceton gewaschen und analog
abzentrifugiert. Man wiederholte die Fällung dreimal. Der Niederschlag erfolgte bei
der dritten Fällung oft nicht mehr quantitativ und hinterliess eine braune Mutterlauge.Das Produkt wurde in 0,5 ml Deuteromethanol gelöst und mit 'H-NMR (300 MHz)
Spektroskopien.Sämtliche 'H-NMR-Spektren wiesen die Signale der alkylierten Corrine entsprechendden Lagen in den Beschreibungsansätzen auf. Zusätzlich erschienen die Signale des
jeweiligen Alkylierungsmittels zu verschiedenen Anteilen, maximal jedoch in zwei
Äquivalenten.Die UV/vis-Spektren waren identisch mit den Spektren der Substanzen aus den
Beschreibungsansätzen.
Auswertung
Zur Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten wurde, da angesichts der Reaktions¬
geschwindigkeiten nur eine Wellenlänge gemessen werden konnte, analog den
Experimenten zur Reduktionskinetik der Co(ll)- zu Co(l)-corrinen, die Wellenlängeabsolut grösster Differenz der Extinktionskoeffizienten, 388 nm67, gewählt.Nur jene Datensätze wurden ausgewertet, die nicht von einer vor zehn Minuten nach
Beginn des Experimentes einsetzten Trübung oder von Reoxidation68 begleitet waren.
Halbwertzeiten wurden als halbe Differenzen zwischen den Extremwerten der UV/vis-
Spektren vor und nach der Reaktion abgeschätzt. Ausgewertet wurden die Datensätze
für die ersten 4,5 approximativen Halbwertzeiten t1/2 bei Methylierungen und eine
bis sechs approximative Halbwertzeiten bei Adenosylierungen.
67 Im Falle des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat)68 Beim KCN-Test nach Stabilisierung des UV/vis-Spektrums erscheint ein Maximum
bei 367 nm (Heptakalium-dicyano-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-
decyi-lO'-carboxylat) (17) oder -cobyrinat (24)).
278
Die Messintervalle für die in der Regel über 100 Datenpunkte wurden der
Reaktionsgeschwindigkeit angepasst. Zu Reaktionsbeginn betrug das Zeitintervall
zwischen zwei Messungen jeweils 1 sec.
Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k erfolgte auf der Basis des Modells
einer Reaktion pseudo-erster Ordnung analog der Bestimmung der Geschwindigkeits¬konstanten der Reduktion (vgl. 6.9).Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k erfolgte auf der Basis des Modells
einer Reaktion pseudo-erster Ordnung. Analog der Auswertung der Reduktionskinetik
entsprach der natürliche Logarhythmus des Quotienten von Eduktkonzentration und
Gesamtcorrinkonzentration k', der Geschwindigkeitskonstanten pseudo-1.Ordnung,
multipliziert mit der Zeit und ist über die Differenzen der momentanen optischenDichte mit den optischen Dichten bei t= 0 und t= °° zugänglich.
[Edukt]1-* I
-k'x t = In ( ) = In (—)
[Edukt]1-0 b
abs«)- abst-kx t = In (1+ I 1)
abst-abst^o
Als Werte für t= 0 und t= °° wurden die experimentellen Daten vor Beginn und nach
Abschluss der Reaktion eingesetzt.
Die Korrelationen der linearen Regressionen betrugen bei Wirt-Gast-Alkylierungenmindestens 0,953; bei Adenosylierungen des Pentanatrium-Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Wasser mindestens
0,976; bei den sonstigen Alkylierungen mindestens 0,992. Der Linearitätsbereich
erstreckte sich mit Ausnahme der Methylierung in Methanol und Posphatpuffer des
Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat), bei denen
aufgrund der hohen Alkylierungsgeschwindigkeit nur die Endphase der Alkylierunggemessen werden konnte, auf praktisch den gesamten Reaktionsverlauf.
Die Fehlergrenzen ergaben sich durch Vergleich der ausgewählen Regressionsgeradenmit jenen, welche aufgrund 1,5 x längerer Stichprobenzeiten berechnet wurden.
Bei den extrem schnellen Methylierungen wird die Geschwindigkeitskonstante aus dem
Umsatzanteil und der Zeit bis zum erstem Messwert approximiert. Die Angabe eines
Regressionskoeffizienten ist dementsprechend nicht möglich.
279
Abbildung 107: Experiment 1b: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobynnat mit S'-
O-Tosyladenosin (15) in Methanol
(a) Overlay der UV/vis-Scans 350-750 nm bei t= 0, 3, 9, 21, 95, 138 und
987 mm, dx= 0,100 cm
abs
1 o
05
optische Dichte bei 388 nm
2 8,
2 6.
2 4,
1
3
2 2,
2.
1 8.
1 6.
O
o
1 4.
1 2.
8.
6,
oo
4.
1500
Zelt / min
2000
Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung
500 1000 1500Zeit / min
2000 2500 3000
280
Abbildung 108: Experiment 2a: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15)in Phosphatpuffer, pH 9
(a) Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 13, 27, 41, 54, 69, 100 Minuten
(b) optische Dichte bei 388 nm
-T-
60 80 100
Zelt / min120 140 160
c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung
40 60 80 100 120 140 160Zeit / mm
281
Abbildung 109: Experiment 2b: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobyrinat mit S'-
O-Tosyladenosin (15) in Phosphatpuffer, 1M, pH 9
(a) Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 13, 17, 68, 132, 225, 317
Minuten
(b) optische Dichte bei 388 nm
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung
200'
3Ö0Zert/min
4Ö0' '""ilo
282
Abbildung 110: Experiment 4: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobyrinat mit 5'-
Chloro-5'-deoxy-adenosin in Methanol
(a)
-9.teaJ—
Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 6, 16, 22, 29, 45 & 180 Minuten
(b) (b) optische Dichte bei 388 nm
—i——i—i i 1 i—i 1 1 i—i 1 1 i
40 60 80 100 120 140 160 180
Zeit / min
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-
erster-Ordnung
i i i— i—i i — • i— i—i i—< i
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180Zeit / min
283
Abbildung 111: Experiment 5: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'", N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit Methyltosylat in
Phosphatpuffer, 1M, pH 9
(a) UV/vis-Spektren bei t= 0 und 35 Minuten
(b) optische Dichte bei 388 nm
~JsnsMp o o o o
6 8 10
Zeit / min
(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-
erster-Ordnung
Zeit / min
284
Abbildung 112: Experiment 6: Alkylierungkmetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",
N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit Methyltosylat in Methanol
(a) (a) optische Dichte bei 388 nm
44,
42
38
36.
34.
32
20 40 60
Zert/min
80 100 120
(b) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-
erster-Ordnung
7 5.
7.
6 5.
6
5 5.
5
4 5.
4
3 5
3
2 5
20 40 60
Zeit/min
80 100 120
285
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295
8. Anhang
8.1 Nomenklatur der Corrine
1.
Die Metallkomplexe und Organocorrine sind gemäss dem Schema
axiale Liganden-Metall(Oxidationszahl)-corrinligand
benannt.
2.
Die für die Kohlenstoffe des Corrinringes (ohne Seitenketten) gewählte Numerierung
entspricht den Empfehl-ungen der lUPAC-Kommission [153].
Die Acetyl- und Propylseitenketten sind mit zunehmendem Abstand vom Makrozyklus auf¬
steigend nummeriert. Sie erhalten zudem als Stammnamen die Nummer des direkt mit ihnen
verbunden Ringkohlenstoffes, an die die laufende Nummer angehängt wird.
296
3.
Für Cobyrinsäure und Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-
carboxylat) wurde teilweise folgende schematische Darstellung verwendet:
Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)
Die Endgruppen bestimmen sich aus dem Kontext und sind jeweils im Text explizit erwähnt.
4.
Cobester ist der Trivialname von Dicyano-Co(a,ß)-cobyrinsäure-heptamethylester.
297
8.2 Nomenklatur der Kohlenstoffatome kompletter Corrinoide
Die in der vorliegenden Arbeit gewählte Systematik der Numerierung unterscheidet sich von
der bis anhin von Marzilli et al. [106-108, 154] verwendeten, abgesehen von den
Positionen B 51 und B 61, nur im Cobinsäureteil.
Methylgruppen werden durch die Nummer des direkt gebundenen Kohlenstoffes des Ringsys¬
tems bezeichnet und in Anlehnung an Benn et al. [155] ergänzt durch die Seitenbezeichnung
A für a-seitig bzw. B für ß-seitig, je nachdem welcher Seite des Ringsystems die Methyl¬
gruppe zugewandt sind.
298
8.3 Nomenklatur der 1,N6-Ethenoadenosylverbindungen
OH OH
Der Adenosyl- bzw. 1,N6-Ethenoadenosylrest wird entsprechend der üblichen Zählweise
nummeriert [129]. Zur eindeutigen Identifikation des Adenosyl-/1,N6-Ethenoadenosyl-
restes in Organocobalamin erhält die Numerierung den Zusatz "A".
299
9. Lebenslauf
Persönliche Daten
1963 geboren am 3. Mai in Dortmund, Bundesrepublik Deutschland
Voruniversitäre Ausbildung
1969 -1973 Eichendorff Grundschule, Methler, BR Deutschland
1973 -1982 Städtisches Gymnasium Kamen, Kamen, BR Deutschland
Hochschulausbildung
1982 -1983 Universität Basel, 1. Vordiplom in Chemie
1983 -1986 ETH Zürich, Abschluss mit dipl.chem. ETH, Diplomarbeit bei Prof.
Duglio Arigoni ("Synthese der 8-13C-(9R)-Deutero-10-methylen-stearinsäure")
1988 Abschluss des Nachdiplomstudiums in Technischen Betriebswissen¬
schaften (Diplomarbeit bei Prof. Büchel "Durchlaufzeitverkürzung der
Auftragsabwicklung in der Produktelinie Druckguss", Bühler AG, Uzwil,
Schweiz)1987 -1991 Doktorand am Laboratorium für org. Chemie der ETH Zürich in der
Arbeitsgruppe PD Dr. Bernhard Kräutler, Doktorvater Prof. A.
Eschenmoser
1992 INSEAD, MBA, Fontainebleau / Frankreich
1994 Promotion an der ETH, Doktorvater Prof. Steven Benner
Sonstiges
1 982-1983 Mitglied des Vorstandes der Vereinigung der Chemiestudierenden an der
Universität Basel
1987-1988 Mitglied des Vorstandes der Vereinigung der Assistenten an den
chemischen Laboratorien der ETH Zürich (VAC)1 987-1989 Vize-Präsident der Assistentenvereinigung der ETH Zürich (AVETH)
1987-1989 Vertreter der Assistenten in der Reformkommission/Hochschulver¬
sammlung der ETH Zürich
1987-1990 Vertreter des akademischen Mittelbaus im Schweizerischen Schulrat
1990-1994 Mitglied der Weiterbildungskommission der Schweizerischen Hoch¬
schulkonferenz
1993 Mitglied des Gläubigeraussschusses der SASEA Holding in Konkurs, Genf
Zürich, den 8. April 1994