Research Collection

Doctoral Thesis

Ein Beitrag zur papierchromatographischenAminosäurebestimmung in Holzzuckerhefe

Author(s): Vögeli, Hansjakob

Publication Date: 1957

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000091962

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ETH Library

Prom. Nr. 2702

Ein Beitrag

zur papierchromatographischen

Aminosäurebestimmungin Holzzuckerhefe

Von der

Eidgenössischen Technischen

Hochschule in Zürich

zur Erlangung

der Würde eines Doktors der technischen Wissenschaften

genehmigte

PROMOTIONSARBEIT

vorgelegt von

HANSJAKOB VÖGELI

dipl. Ing.-Agr.

von Grafenried (Kt. Bern)

Referent: Herr Prof. Dr. E. Crasemann

Korreferent: Herr Prof. Dr. H. Deuel

Juris-Verlag Zürich

1957

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Meiner Frau

und dem Gedenken meiner Mutter

Meinem hochverehrten Lehrer, Herrn Prof. Dr. E. Crasemann, unter

dessen Leitung ich die vorliegende Arbeit ausführte, möchte ich an dieser Stelle für

seine vielseitige Unterstützung meinen herzlichen Dank aussprechen. Ebenfalls dan¬

ke ich Herrn Dr. P. von Tavel, dem Leiter des Theodor-Kocher-Institutes in

Bern, wo ich während eines längeren Aufenthaltes einen Teil der papierchromato-

graphischen Untersuchungen durchführen konnte. Ferner bin ich den Herren Dr. A.

Schürch und Dr. H. Jucker für die tatkräftige Förderung meiner Untersu¬

chungen zu Dank verpflichtet. Mein Dank gehört auch den Herren H. Strübi und

J. Bischofberger, die mir wertvolle Hilfe leisteten.

- 5 -

INHALTSVERZEICHNIS

Seite

A. Einleitung und Zielsetzung 7

B. Beschreibung und grobchemische Charakterisierung der

untersuchten Hefe 8

C. Die Methodik der Aminosäurebestimmung 12

1. Die Vorbereitung der Hefe 12

a) Die Entfettung der Hefe 15

b) Die Extraktion der freien Aminosäuren 15

c) Die Hydrolyse des Hefeproteins 16

d) Die Reinigung der Hydrolysate mit Hilfe von Ionenaustauschern 17

e) Die Verteilung des Stickstoffes auf die einzelnen, bei der Vor¬

behandlung gewonnenen Fraktionen 18

2. Die papierchromatographische Trennung der Aminosäuren 20

a) Allgemeines 20

b) Die Technik der chromatographischen Trennung 22

aa) Das Papier 22

bb) Die Entwicklungskammern 22

cc) Die Wahl der Lösungsmittel 22

dd) Die Zubereitung der Lösungsmittel 24

ee) Der Arbeitsgang 25

3. Die Identifizierung und die quantitative Bestimmung der

Aminosäuren 27

a) Allgemeines 27

b) Die qualitative Auswertung der Chromatogramme 27

c) Die quantitative Bestimmung der im Papierchromatogrammgetrennt vorliegenden Aminosäuren 28

aa) Die Ausführung der quantitativen Ninhydrinreaktion auf

dem Papier 30

bb) Die Ausführung der Ninhydrinreaktion im Reagenzglas 33

cc) Die Adsorptionsverluste im Papier 37

dd) Die Verluste bei der Entfernung der Lösungsmittel 42

ee) Der Einfluss der Lokalisationsmethode auf das Ergebnisder papierchromatographischen Aminosäurebestimmung 44

4. Zusammenfassende Beschreibung der verwendeten quantitativen, 45

zweidimensionalen PapierChromatographie

D. Die Ergebnisse 47

1. Der qualitative Aminosäurenachweis in der Hefe 47

- 6 -

Seite

a) Die Aminosäuren im Alkoholextrakt 47

b) Die Aminosäuren in der alkoholunlöslichen Fraktion 51

2. Das Ergebnis der quantitativen Aminosäurebestimmung 52

a) Die quantitative Aminosäurebestimmung im Alkoholextrakt 53

b) Die quantitative Aminosäurebestimmung in der alkoholunlös¬

lichen Fraktion 57

Die Besprechung der Ergebnisse 58

Zusammenfassung 67

Literaturverzeichnis 72

- 7 -

A. EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Die Vielgestaltigkeit der Funktionen mit denen die stickstoffhaltige Fraktion

der Futtermittel am Stoff- und Energiewechsel des Tieres beteiligt ist, stellt die

Bemühung um bestimmte Aussagen über die von ihr im gegebenen Fall zu erwarten¬

de physiologische Wirkung vor Probleme besonderer Art. Bis in die jüngste Zeit

stützen sich diese Aussagen nahezu ausschliesslich auf den Tierversuch. Der andere,

unmittelbar vom Chemismus der genannten Fraktion ausgehende Weg erwies sich

noch vor kurzem als kaum gangbar. Dies war zu einem guten Teil dadurch bedingt,

dass die chemisch-analytische Bestimmung der Aminosäuren, die normalerweise im

stickstoffhaltigen Anteil der Futtermittel vorherrschen und für dessen physiologische

Wirkung ausschlaggebend sind, auf erhebliche, teilweise unüberwindlich erscheinen¬

de Schwierigkeiten stiess. Erst mit der Einführung der Papierchromatographie durch

R. Consden, A.H. Gordon und A.I.P. Martin (21) sind Möglichkeiten

eröffnet worden, die es gestatten, die chemische Bestimmung der in Naturstoffen vor¬

kommenden Aminosäuren verhältnismässig einfach und praktisch brauchbar zu ge¬

stalten, womit sich die Aussichten, die physiologische Wirkung der stickstoffhaltigen

Nahrungsfraktion auf Grund chemischer Gegebenheiten zu beurteilen, wesentlich ver¬

bessert haben.

Mit der vorliegenden Arbeit stellten wir uns die Aufgabe, den stickstoffhaltigen

Anteil und von diesem vor allem das Eiweiss einer als Futtermittel vielfach verwen¬

deten Wuchshefe (Torula utilis) einer eingehenden chemischen Analyse zu unterzie¬

hen. Im Zusammenhang damit nahmen wir uns vor, einen Beitrag zur papierchroma-

tographischen Bestimmung der Aminosäuren zu leisten und zu prüfen, ob und wie

weit diese Bestimmung Aussagen über die biologische Wertigkeit stickstoffhaltiger

Futterfraktionen erlaubt, wobei wir auf entsprechende Vorschläge und vergleichba¬

re Angaben der Literatur Bezug nahmen.

- 8 -

B. BESCHREIBUNG UND GROBCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER

UNTERSUCHTEN HEFE

Für unsere Untersuchungen wurde eine von der Holzverzuckerungs A. G. in

Ems (Graubünden) zur Verfügung gestellte, getrocknete Futterhefe (Torula utilis)

verwendet. Sie wurde nach einem Verfahren gewonnen, das sich wie folgt um¬

schreiben lässt: Holzzuckerwürze, die bei der hydrolytischen Spaltung von Holzzel¬

lulose nach dem Scholler-Verfahren anfällt, macht vorerst eine alkoholische Gä¬

rung durch, wobei die Hexosen in Aethanol übergeführt werden. Nach der Destilla¬

tion des Alkohols versetzt man die zurückbleibende Schlempe, in der noch die Pen¬

tosen des Holzes enthalten sind, mit kalium-, phosphor- und stickstoffhaltigen

Salzen. Auf diesem Nährboden wird bei intensiver Belüftung die Wuchshefe gezüch¬

tet. Diese wird anschliessend durch Zentrifugieren von der Närlösung getrennt, ge¬

waschen und auf dampfbeheizten Trommeln getrocknet.

Der grobchemische Aufbau der untersuchten Trockenhefe geht aus Tabelle 1

hervor:

Tabelle 1

Die Ergebnisse der Gesamtnährstoffanalyse der Hefe

Wasser 9,85%

In % der Trockensubstanz:

Rohasche 10,11

Rohfett 4,68

Roheiweiss 50,25

Reineiweiss 45,90

Rohfaser 2,93

Stickstoffreie Extraktstoffe 32,03

Der Reineiweisstickstoff, der nach Barnstein durch Fällung mit Kupferhydroxyd

bestimmt wurde, macht91,3 % des nach Kjeldahl ermittelten Gesamtstickstoffes

aus. Bei Anwendung weiterer Eiweissfällungsmittel' wurden folgende Anteile des

Reineiweisstickstoffes am Gesamtstickstoff ermittelt:

Mit Tannin 87,2%

Mit Trichloressigsäure 76,2 %

*) Handbuch der landwirtschaftlichen Versuchs- und Untersuchungsmethodik (Me¬thodenbuch Bd. III) Neumann Verlag, Radebeul und Berlin 1951.

- 9 -

Diese niedrigeren Werte lassen vermuten, dass nach der Barnsteinmethode auch

Nichteiweisstickstoff ausgefällt wird, eine Tatsache, auf die H. Schjerning (84)

schon vor langer Zeit aufmerksam gemacht hat.

Die Trennung des Eiweisstickstoffes vom Nichteiweisstickstoff lässt sich auch

durch Extraktion des Nichteiweisstickstoffes durchführen. Folgende Extraktionsmit¬

tel wurden geprüft:

a) Alkohol: 2 g nach R. Reichert (80) entfettete Trockenhefe wurden unter Um¬

rühren mit der zehnfachen Menge 75 %-igem Alkohol dreimal je lV2 Stunden

extrahiert.

b) Trichloressigsaure: 2 g Trockenhefe wurden nach P. Roine (81) während 4

Stunden mit der zehnfachen Menge kalter, 8 %-iger Trichloressigsäure behandelt.

Zur Vermeidung einer Hydrolyse erfolgte die Extraktion im Kühlraum.

c) Wasser: Die Extraktion erfolgte in der Weise, dass 2 g Hefe nach H . T .Mac -

pher son (57) dreimal während je 5 Minuten mit 30 cm kochendem Wasser aus¬

gezogen wurden.

Die so gewonnenen Extrakte wurden mittels Zentrifugieren und anschliessender Fil¬

tration durch einen Jena-Bakterienfilter G 5 auf 3 von den Hefezellen befreit.

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Extraktionsversuche. Der mit angegebene

«*-Aminostickstoff wurde gasometrisch nach D.D. van Slyke (95) bestimmt.

Tabelle 2

Bestimmung des Nichteiweisstickstoff s auf Grund verschiedener Extraktionsverfahren

In % des In % des lös-

Extraktionsmittel Gesamtstick- liehen Stick¬

stoffs Stoffs

Alkohol löslicher Gesamtstickstoff 12,5c<-Aminostickstoff 8,2 65,6

Trichloressigsäure löslicher Gesamtstickstoff 16,4<* -Aminostickstoff 9,8 59,8

Wasser löslicher Gesamtstickstoff 26,1<X - Aminostickstoff 9,6 36,8

Auf Grund der verschiedenen, von uns geprüften Fällungs- und Extraktionsverfahren

nahm der Anteil des Nichteiweisstickstoffes am Gesamtstickstoff der Hefe Werte an,

wie sie in Tabelle 3 zusammengestellt sind.

- 10 -

Ta belle 3

Der Anteil des nach verschiedenen Fällungs- und Extraktionsverfahren bestimmten

Nichteiweisstickstoffes am Gesamtstickstoff der Hefe

Fällung mit:

Nichteiweiss-

stickstoff in %des Gesamt¬

stickstoffs

Extraktion mit:

Nichteiweiss-

stickstoff in %des Gesamt¬

stickstoffs

Kupferhydroxyd 8,7 Trichloressigsäure 16,4

Trichloressigsäure 23,8 Wasser 26,1

Tannin 12,8 Alkohol 12,5

Die Tanninfällung und die Alkoholextraktion lieferten nahezu übereinstimmende

Werte. Einander nahekommende, jedoch bedeutend höhere Werte ergaben die Fäl¬

lung mit Trichloressigsäure und die Extraktion mit Wasser. Dabei zeigte es sich,

dass aus dem Heisswasserextrakt mit Trichloressigsäure noch eine, wenn auch nur

geringe Stickstoffmenge (0,7 % des Gesamtstickstoffes) ausfällbar war. In Ueber-

einstimmung damit steht eine Beobachtung von F.A. Cosonka (22), der erwähnt,

dass in der Hefe nach Hitzekoagulation wasserlösliches Eiweiss nachgewiesen werden

könne.

Um einen Anhaltspunkt über die Menge des mit Kupferhydroxyd nach Barn¬

stein ausfallenden Nichteiweisstickstoffes zu erhalten, wurde die Hefe vor der

Reineiweissbestimmung mit heissem Wasser extrahiert. Nach dieser Behandlung

konnten im Rückstand nur noch 78,9 % des Gesamtstickstoffes gefällt werden gegen¬

über 91,3 % bei nicht vorbehandelter Hefe. Mit der Barnsteinmethode wurden somit

12,4 % oder nach Abzug des im Wasserextrakt koagulierbaren Anteils (0,7 %) 11,7%

des Gesamtstickstoffes ausgefällt, die vermutlich nicht als Proteinstickstoff gelten

können. Untersuchungen von K. Dirr und P. Decker (27) über den Nichtei-

weisstickstoff in Holzzuckerhefe führten zu folgenden Ergebnissen:

Nichteiweisstickstoff in %des Gesamtstickstoffs

1. Trichloressigsäureextrakt 16,9

2. Nucleinsäure-Purin-Stickstoff im Rückstand 5,7

3. Nucleinsäure-Pyrimidin-Stickstoff im Rückstand 2,9

4. Lipoid-Stickstoff 0,9

Nichteiweisstickstoff 26,4

- 11 -

Mit dem mittels Trichloressigsäure extrahierten Nichteiweisstickstoff (16,9 %)

stimmt der von uns im Trichloressigsäureextrakt gefundene Stickstoffanteil (16,4 %)

sehr gut überein. Sehr gut ist auch die Uebereinstimmung zwischen dem von K.

Dirr und P.Decker bestimmten Gesamtanteil an Nichteiweisstickstoff (26,4 %)

mit dem von uns durch Wasserextraktion erhaltenen Wert (26,1 %). Hieraus darf

man den Schluss ziehen, dass die Heiswasserextraktion eine Methode darstellt, die

den in Hefe enthaltenen Nichteiweisstickstoff in guter Annäherung bestimmen lässt.

Im weitern darf gefolgert werden, dass für den Anteil des Reineiweisstickstoffes am

Gesamtstickstoff der von uns geprüften Hefe der nach Barnstein ermittelte Wert

von 91,3 % nicht verwendbar ist; diesem Anteil dürfte ein Wert von 74 bis 75 % ,

basierend auf einem Anteil an Nichteiweisstickstoff von 25 bis 26 %, weit besser

entsprechen. Zu einem ähnlichen Schluss gelangen O. v. Soden und K. Dirr

(87), die feststellen, dass der Eiweisstickstoff der Hefe kaum 80 % ihres Gesamt-

srickstoffes betrage.

- 12 -

C. DIE METHODIK DER AMINOSAEUREBESTIMMUNG

1. Die Vorbereitung der Hefe

In Nahrungs- und Futtermitteln sind neben der zu untersuchenden, stickstoff¬

haltigen Fraktion meist in grösseren Mengen andere Stoffgruppen zugegen, die den

Gang der Analyse stören. Besonders in Gegenwart von Kohlenhydraten und Fetten

besteht die Gefahr, dass einzelne Aminosäuren bei der für ihre Bestimmung erfor¬

derlichen Hydrolyse der im Untersuchungsmaterial vorhandenen Proteine beträchtli¬

che Verluste erleiden. Im Bestreben, dieser Gefahr zu begegnen, werden zwei

grundsätzlich verschiedene Verfahren zur Anwendung gebracht.

Nach dem ersten Verfahren werden die Eiweisskörper so weitgehend als mög¬

lich von allen andern Stoffen befreit, um die Verluste bei der nachfolgenden Hydro¬

lyse auf ein Minimum zu beschränken. Diese Isolierung ist jedoch ihrerseits mit oft

beträchtlichen Verlusten verbunden, denen dadurch Rechnung getragen wird, dass

das mit der isolierten Proteinfraktion erhaltenen Analysenergebnis auf das Gesamt-

eiweiss übertragen wird. Dieses Vorgehen kann jedoch grosse Fehler in sich schlies-

sen, da die Zusammensetzung des isolierten Proteins derjenigen des Gesamteiweisses

in vielen Fällen nur schlecht entspricht.

Beim zweiten Verfahren, das in neuerer Zeit vermehrt Anwendung findet, wird

das ganze Nahrungs- oder Futtermittel ohne vorgängige Isolierung der Proteine hy-

drolysiert. Diese Methode ist insbesondere Von E. I. Bigwood (3) ausgearbeitet

worden. Der die Hydrolyse störende Einfluss der Kohlenhydrate kann durch starke

Verdünnung der Proben mit 6 n Salzsäure im Verhältnis von 1 : 100 oder 1 : 200 be¬

deutend verringert werden. In Standardlösungen bekannter Zusammensetzung gelang

es Bigwood, nach einer in Gegenwart eines grossen Kohlenhydratüberschusses

vorgenommenen Hydrolyse, alle Aminosäuren mit Ausnahme von Trytophan, Cystin

und Methionin innerhalb einer Fehlergrenze von ± 5 % zu erfassen. Auch bei der

Untersuchung von Heu und Getreide erzielten E.I. Bigwood und Mitarbeiter (4)

mit diesem Verfahren gute Ergebnisse. Der in den 18 erfassten Aminosäuren vor¬

handene Stickstoff machte 80 bis 90 % des Gesamtstickstoffes aus. Der restliche

Stickstoff stammte zum grössten Teil aus nicht aminosäureartigen Stickstoffverbin¬

dungen und nur zum kleineren Teil aus Aminosäuren, die der Bestimmung entgangen

waren.

J. Brüggemann und K.Drepper (17) stellen die Forderung auf, dass in

Futtermitteln die Aminosäureanalyse ohne vorherige Isolierung des Eiweisses durch¬

zuführen sei.

- 13 -

Wir selber beabsichtigten anfänglich, vor der Hydrolyse der Hefe eine Abtren¬

nung der Kohlenhydrate vorzunehmen. Die Schwierigkeiten, die sich hierbei ergaben,

waren derartig, dass wir den Versuch, das Eiweiss zu isolieren, als aussichtslos

aufgaben. Bei der Trockenhefe liegen insofern besondere Verhältnisse vor, als ihr

Eiweiss von einer sehr widerstandsfähigen Zellwand eingeschlossen wird. Um bes¬

sere Voraussetzungen für die Abtrennung des Eiweisses zu schaffen, versuchten wir,

allerdings vergeblich, die Hefezellen mit flüssiger Luft zu sprengen. Aehnlichen

Schwierigkeiten begegneten D. D i r r und O. v. Soden (26) bei ihren Untersu¬

chungen über die Lipoide der Hefe. Anderseits gelang esR.J. Block und D.

Bolling (6), die Hefezellen mit Kohlensäureschnee zu zerstören.

Die von E. Kofranyi (48) entwickelte Methode zur Trennung von Eiweiss

und Kohlenhydraten ist uns leider zu spät zur Kenntnis gekommen, weshalb sie in

unsern Versuchen nicht geprüft wurde. Nach diesem Verfahren werden die Kohlen¬

hydrate ohne die Rohfaser mittels einer das Eiweiss schonenden Hydrolyse mit

Ameisensäure in Lösung gebracht. Nach Abtrennung der Rohfaser durch Filtration

werden das Eiweiss und die freien Aminosäuren nach C. Neuberg und J. Kerb

(72) mit Quecksilberacetat gefällt und anschliessend mit Salzsäure hydrolysiert. Das

Quecksilber wird sodann als Sulfid aus dem Hydrolysat ausgefällt. Obschon sowohl

bei der Fällung nach Neuberg und Kerb als auch bei der nachfolgenden Ausfäl¬

lung des Quecksilbers gewisse Verluste, zum Teil selektiver Natur, entstehen,

scheint die Methode vielversprechend zu sein.

Um Hydrolysenverluste zu vermindern, versuchten wir wenigstens einen Teil

der störenden Nichteiweisstoffe aus der Hefe zu entfernen. Zu diesem Zweck extra¬

hierten wir vorerst die Fettstoffe mit Aether; dann wurden die freien Aminosäuren

durch Extraktion mit wasserhaltigem Alkohol vom Eiweiss getrennt, wobei sich auch

ein Teil der störenden Kohlenhydrate entfernen liess. Anschliessend wurde die Hefe

nach H.T. Macpherson (57) mit heissem Wasser behandelt (vgl. Seite 9),

wobei 18,2 % der Hefetrockensubstanz, vermutlich zum grössten Teil in Form von

Glykogen, in Lösung gingen. Im nicht hydrolysierten Wasserextrakt waren ausser

einer Spur von Glutathion weder freie Aminosäuren noch Oligopeptidefestzustellen.

Das Glutathion hat sich demnach im Alkohol nicht vollständig gelöst, eine Beobachtung,

die auch von O. Lindan und E. Work (56) gemacht wurde. Der Heisswasseraus-

zug enthielt eine geringe Menge mit Trichloressigsaure ausfällbaren Stickstoffs, der

sich auf Grund einer Hydrolyse und papierchromatographischen Prüfung als Eiweiss-

stickstoff erwies. Folgende Aminosäuren konnten ermittelt werden: Alanin, Arginin,

Asparaginsäure, Cystin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Leucin, Lysin, Methionin,

Phenylalanin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin. Damit Hessen sich mit Ausnahme

von Prolin und Isoleucin alle Aminosäuren nachweisen, die auch im sauren Hydroly¬

sat des mit Heiswasser nicht extrahierbaren Hefeproteins gefunden wurden.

14 -

Die Feststellung, wonach Protein in Lösung ging, liess den von der Heiss-

wasserbehandlung erhofften Vorteil als hinfällig erscheinen. Sie hätte zwei statt nur

eine Hydrolyse erfordert, was vermutlich mit zusätzlichen Verlusten verbunden ge¬

wesen wäre; dies veranlasste uns, auf die Heisswasserbehandlung zu verzichten.

Da die Kohlenhydrate nur teilweise entfernt wurden, musste mit einer Bildung

stickstoffhaltiger Huninstoffe gerechnet werden, die, wie die Proteinisolierung,

ebenfalls zu Verlusten führt. So wird Tryptophan bei der in Gegenwart von Kohlen¬

hydraten stattfindenden sauren Hydrolyse vollständig zerstört, während es nach T.

Kotake (50) in reiner Form gegenüber einer Säurebehandlung unempfindlich ist.

Bei der alkalischen Hydrolyse schädigen Kohlenhydrate das Tryptophan nur wenig.

Besonders empfindlich ist in Gegenwart von Kohlenhydraten sowohl bei saurer

als auch bei alkalischer Hydrolyse das Cystin. Deshalb ist nach J. Brüggemann

und K. Drepper(17) seine quantitative Bestimmung in Futtermitteln noch sehr

fragwürdig. Wie die gleichen Autoren mitteilen, erlitt Methionin bei der sauren

Hydrolyse in einem kohlenhydratfreien Medium keine Verluste, während in Gegen¬

wart von Kohlenhydraten Einbussen von 10 % festgestellt wurden. Dagegen sollen

die basischen Aminosäuren bei der sauren Hydrolyse, auch wenn Kohlenhydrate zu¬

gegen sind, nur wenig geschädigt werden. Im Widerspruch hiezu steht der Befund

von G.R. Tristram (94), wonach Arginin und Histidin bei der in Anwesenheit

von Kohlenhydraten durchgeführten sauren Hydrolyse bis zu 20 % zerstört wurden.

Dass bei der in Gegenwart von Kohlenhydraten stattfindenden sauren Hydrolyse Ver¬

luste an Tryptophan, Cystin und Methionin auftraten, wird auch von J.P. Dustin

und Mitarbeitern (30) erwähnt.

J. Brüggemann und K. Drepper konnten bei der sauren Hydrolyse

folgende, zu kohlenhydrathaltigen Futtermitteln zugesetzte Aminosäuren quantitativ

wiederfinden: Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Leucin, Isoleucin, Valin und Prolin.

Im weiteren sei eine Feststellung von R. J. Evans und Mitarbeiter (31) erwähnt,

wonach Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin und Threonin bei der sauren Hydro¬

lyse in Anwesenheit von Kohlenhydraten keine oder nur geringe Verluste erleiden.

Nach M. S. Dünn (29) soll die Gegenwart von Kohlenhydraten und Fetten bei der

sauren Hydrolyse auf folgende Aminosäuren keinen schädlichen Einfluss ausüben:

Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Leucin, Isoleucin, Lysin,

Phenylalanin, Threonin und Valin. Auf Grund ihrer Untersuchungen gelangten J. P.

Dustin und Mitarbeiter (30) zum Schluss, dass sich die Hydrolysenverluste bei Zu¬

satz von Kohlenhydraten gegenüber der Hydrolyse von reinem Eiweiss bei keiner

von 15 geprüften Aminosäuren (Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure,

Prolin, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin,

Lysin, Arginin) um mehr als 3 % erhöhten, sofern in starker Verdünnung gearbeitet

wurde.

- 15 -

Die zitierten Beobachtungen anderer Autoren, wonach die Hydrolyse von Pro¬

teinen in Gegenwart von Kohlenhydraten die Mehrzahl der Aminosäuren nur wenig

schädigt und wonach störende Einflüsse begleitender Kohlenhydrate auf die empfind¬

licheren Aminosäuren bei entsprechender Verdünnung wesentlich herabgesetzt wer¬

den können, Hessen es uns als angezeigt erscheinen, die Hydrolyse der Hefe ohne

vorherige Isolierung des in ihr enthaltenen Proteins durchzuführen. Das Vorgehen

gestaltete sich wie folgt:

a) Die Entfettung der Hefe

In der Hefe liegt ein beträchtlicher Teil des Fettes in Form von Lipoproteiden

vor, die sich mit Aether nicht extrahieren lassen. R. Reichert (80) empfiehlt

vor der Extraktion die Lipoproteide nach folgendem Verfahren zu spalten: 1 g Trok-

3kenhefe wird mit 20 cm 95 %-igem Methanol 1 Stunde am Rückflusskühler gekocht.

Nach dem Abdampfen des Methanols trocknet man die Hefe während einer Stunde bei

95 C und extrahiert anschliessend im Soxhletapparat während 12 Stunden mit Aether.

Methanolaufschluss und Aetherextraktion werden einmal wiederholt. Beide Aether-

extrakte werden vereinigt und nach Abdampfen des Aethers im Vakuum getrocknet.

Ausser den Phosphatiden sollen nach diesem Verfahren keine stickstoffhaltigen Ver¬

bindungen in den Extrakt gelangen.

Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, ergaben unsere Untersuchungen je nach der

verwendeten Methode für den Fettgehalt der Hefe stark voneinander abweichende

Werte.

Tabelle 4

Der Fettgehalt der Hefe, bestimmt nach verschiedenen Extraktionsmethoden

Fettgehalt in % der Tr. Subst.

Extraktion mit Aether während 24 Stunden 4,18

Extraktion mit Aether während 48 Stunden 4,68

Extraktion nach R. Reichert 9,85

Wir entschlossen uns die Hefe nach der Methode von R. Reichert zu entfetten.

b) Die Extraktion der freien Aminosäuren

Aus analytischen und physiologischen Gründen ist es angezeigt, die freien und

die im Eiweiss gebundenen Aminosäuren getrennt zu bestimmen. Obschon die Daten

- 16 -

der Tabelle 2, Seite 9 zeigen, dass mit Trichloressigsaure am meisten 0<-Amino-

stickstoff extrahiert werden kann, wählten wir zur Extraktion der freien Aminosäuren

75 %-igen Alkohol, da sich der so gewonnene Auszug einfacher verarbeiten liess.

Wie die in Tabelle 5 angeführten Ergebnisse erkennen lassen, ist die Entfettung

der Hefe vor der Alkoholextraktion unerlässlich.

Tabelle 5

Der aus nicht entfetteter und entfetteter Hefe mit Alkohol extrahierbare Stickstoff

Extrahierter Stick- Extrahierter e* -Amino-

stoff in % des Ge- Stickstoff in % des Ge¬

samtstickstoffs samtstickstoffs

Nicht entfettete Hefe 7,0 5,2

Nach Reichert entfettete Hefe 12,5 8,2

Die bessere Stickstoffausbeute nach Entfettung der Hefe lässt vermuten, dass die

Vorbehandlung die Durchlässigkeit der Hefezelle für den Alkohol verbessert.

Die Extraktion der freien Aminosäuren wurde wie folgt ausgeführt: 1 g ent¬

fettete Trockenhefe wurde dreimal je 1V2 Stunden und jedesmal mit der zehnfachen

Menge 75 %-igem Alkohol unter Umrühren ausgezogen. Die drei Auszüge wurden

alsdann vereinigt, zentrifugiert und zur Abtrennung der restlichen Zellen durch ein

Bakterienfilter G 5 auf 3 filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedickt und in

32 cm 10 %-igem Isopropanol aufgenommen. Um zu prüfen, ob der Alkoholextrakt

neben freien Aminosäuren auch Peptide enthalte, wurden einige Proben nach dem

Eindicken 12 Stunden mit 30 cm 6 n HCl bei 100° C hydrolysiert. Darauf wurde zur

Entfernung der Salzsäure eingedampft, zweimal mit Wasser versetzt und wieder

3eingedampft; schliesslich wurde der Rückstand in 2 cm 10 %-igem Isopropanol auf¬

genommen. Die Prüfung des hydrolysierten Extraktes nach van Sly ke zeigte im Ver¬

gleich zum nicht hydrolysierten Auszug eine kaum merkbare Zunahme des OC-Amino-

stickstoffes, was beweist, dass infolge der Alkoholbehandlung nur unbedeutende

Mengen an Peptiden in Lösung gingen.

Sowohl die hydrolysierte als auch die nichthydrolysierte Lösung konnte ohne

weitere Reinigung papierchromatographiert werden.

c) Die Hydrolyse des Hefeproteins

Die zur vollständigen Hydrolyse des Hefeeiweisses benötigte Zeit wird in der

Literatur sehr verschieden angegeben. Was die saure Hydrolyse mit 6 n HCl be¬

trifft, so liegen folgende Angaben vor:

- 17 -

H. Fink und F. Just (33) dehnten die Hydrolysedauer bei Torulahefen

auf 120 bis 140 Stunden aus. H. Kraut und F. Schlottmann (52) hydrolysier-

ten Nährhefe 3 bis 4 Tage. K. Dirr undO.v. Soden (25) erachten diese Zei¬

ten als viel zu lang und geben als optimale Dauer 10 Stunden an.

In unsern Versuchen überprüften wir die Vollständigkeit der Hydrolyse durch

Berechnung des Quotienten o( -Aminostickstoff100

Gesamtstickstoff

Wir fanden, dass eine Hydrolyse von 24 Stunden genügt, um eine vollständige Auf¬

spaltung des Hefeeiweisses zu erreichen.

Zur Gewinnung des sauren Hydrolysates, in dem mit Ausnahme des Trypto¬

phans alle Aminosäuren bestimmt werden konnten, wurde folgendes Vorgehen ge¬

wählt: 0,2 g Trockenhefe, die entfettet und in der auf Seite 9 beschriebenen Weise3

mit Alkohol extrahiert worden waren, wurden in 40 cm 6 n HCl aufgenommen und

24 Stunden auf dem Oelbad bei schwachem Sieden hydrolysiert. Nach Entfernung der

Huminstoffe durch Filtration wurde das Hydrolysat, um die Salzsäure zu vertreiben,

nach jeweiliger Wasserzugabe dreimal im Vakuum zur Tockne eingedampft.

Damit das Tryptophan bestimmt werden konnte, musste die Hefe einer alkali¬

schen Hydrolyse unterworfen werden. 0,2 g Trockenhefe wurden nach erfolgter Ent-

3fettung und Alkoholextraktion in 1 cm 5 n NaOH aufgenommen und in einem zuge¬

schmolzenen Glasrohr 18 Stunden bei 100 C hydrolysiert. Anschliessend wurde mit

5 n HgSO. neutralisiert.

d) Die Reinigung der Hydrolysate mit Hilfe von Ionenaustau¬

schern

Eine direkte Verwendung der Hefehydrolysate für die papierchromatographi-

sche Analyse erwies sich nicht als vorteilhaft, da die Qualität der Chromatogramme

infolge der in grösseren Mengen vorhandenen, störenden Begleitstoffe sehr zu wün¬

schen übrig liess. Es musste deshalb eine Reinigung der Hydrolysate mit Hilfe von

Ionenaustauschern vorgenommen werden.

Wir stützten uns in unsern Versuchen vor allem auf die Erfahrungen von P.

Boulanger und Mitarbeiter (15), von P. Boulanger und G. Biserte (16)

und von G. Biserte und R. Scriban (5).

In Anlehnung an diese Arbeiten verwendeten wir als Kationenaustauscher Zerolit 225,

ein Polystyrolharz mit aktiven SO„H-Gruppen. Durchfliessteinaus biologischem Ma¬

terial hergestelltes Hydrolysat einen Kationenaustauscher, so werden nicht nur die

mineralischen Kationen, sondern auch die Aminosäuren, die in schwach saurer Lö¬

sung ebenfalls als Kationen vorliegen, gegen dieH-Ionendes Harzes eingetauscht,

18

während die Anionen und die elektrisch neutralen Substanzen die Kolonne passieren.

Die nur leicht festgehaltenen Aminosäuren können mit 1 n Ammoniak wieder eluiert

werden, während die stärker gebundenen mineralischen Kationen zurückbleiben. Die

Aminosäuren werden in einer schmalen Zone vor der Ammoniakfront hergetrieben und

erscheinen fast gleichzeitig mit dem Ammoniak im Eluat.

Zur quantitativen Gewinnung der eluierten Aminosäuren genügt es, vor und nach dem

Durchbruch der Ammoniakfront, deren Lage in einem Blindversuch bestimmt wird,3

je 30 bis 50 cm Eluat aufzufangen. Nach P. Boulanger und G. Biserte (16)

soll es möglich sein, mit Ammoniak alle Aminosäuren quantitativ zu eluieren. Ein¬

zig die quantitative Erfassung des Arginins soll oft auf Schwierigkeiten stossen. Zur

Kontrolle dieser Angaben Hessen wir eine aus den 18 bekanntesten Aminosäuren be¬

stehende Mischung durch eine Zerolitkolonne laufen. Nach der Elution mit Ammo¬

niak konnten wir in einer Doppelbestimmung 99,0 und 98,3 % des in der ursprüngli¬

chen Lösung festgestellten OC-Aminostickstoffs wiederfinden. Demnach darf mit

einer quantitativen Elution der Aminosäure gerechnet werden.

Im einzelnen gestaltet sich das Vorgehen, wie folgt:

Das im Vakuum eingedampfte Hydrolysat, das nach Entfernung der Huminstof-

3fe insgesamt 12,05 mg Stickstoff enthielt, wurde in 15 cm destilliertem Wasser

aufgenommen und mit einer Geschwindigkeit von 15 bis 20 Tropfen pro Minute durch

eine Zerolitsäule von 20 mm Durchmesser und 5 cm Höhe fliessen gelassen. Da-

3rauf wurde mit 100 cm destilliertem Wasser nachgewaschen und anschliessend mit

1 n Ammoniak eluiert. Die letzten, vor dem Erscheinen der Ammoniakfront ausflies-

3 3senden 30 cm und die nachfolgenden 30 cm wurden gemeinsam aufgefangen und im

3Vakuum eingedampft. Schliesslich wurde der Rückstand in 3 cm 10 %-igem Isopro-

panol aufgelöst. Die so erhaltene Lösung wurde zur Herstellung der Papierchromato-

gramme verwendet.

Das alkalische Hydrolysat wurde in analoger Weise gereinigt.

e) Die Verteilung des Stickstoffes auf die einzelnen, bei der

Vorbehandlung gewonnenen Fraktionen

Der in der Fettfraktion bestimmte Stickstoff machte 0,90 % des Gesamtstick¬

stoffes der Hefe aus. Er stellt nach R. Reichert (80) ausschliesslich Phosphatid-

stickstoff dar.

- 19 -

Die alkohollösliche Fraktion wies folgende Verteilung des Stickstoffes auf:

In % des Gesamt- In % des lösli-

stickstoffs chen Stickstoffs

der Hefe

Löslicher Gesamtstickstoff 12,48

Löslicher o< -Aminostickstoff 8,19 65,63

Ammoniakstickstoff 0,32 2,54

Der grösste Teil des löslichen Stickstoffs lag offenbar in Form von Aminosäu¬

ren vor. Da die gasometrische Bestimmung des Stickstoffs nach D.D. van Slyke

(95) nur den ©<-Aminostickstoff erfasst, lässt sich mit dieser Methode bei verschie¬

denen Aminosäuren nur ein Teil ihres Stickstoffgehaltes bestimmen (z.B. Trypto¬

phan 1/2, HistidinV3, Argininl/4); der Prolinstickstoff entgeht ihr vollständig. Der

gesamte Anteil des in den freien Aminosäuren enthaltenen Stickstoffes wird somit

wesentlich mehr betragen haben als die bestimmten 65,63 %.

Nach P. Roine (81) ist es sehr fraglich, ob in der Hefe freies Ammoniak

vorkommt. Da Roine als Lösungsmittel Trichloressigsäure verwendete, hält er da¬

für, dass möglicherweise das von ihm im Extrakt gefundene Ammoniak während der

Extraktion abgespalten worden sei. Bei Verwendung von Alkohol als Extraktionsmit¬

tel dürfte eine solche Abspaltung kaum eintreten. Eher scheint in unserem Falle die

andere, von Roine erwähnte Möglichkeit zuzutreffen, wonach in der Hefe nachweis¬

bares, freies Ammoniak aus Ueberresten der an den Hefezellen haftenden Nährlö¬

sung stamme.

In der alkoholunlöslichen Fraktion wurde folgende Verteilung des Stickstoffs

festgestellt:

In % des Gesamt- In % des alkoholun-

stickstoffs löslichen Stickstoffs

der Hefe

Alkoholunlöslicher Stickstoff 86.28

«X-Aminostickstoff 58,98 68,36

Huminstickstoff*^

3,22 3,72

Ammoniakstickstoff 6,42 7,41

*) Stickstoff im Hydrolysenrückstand.

- 20 -

Bezogen auf den Gesamtstickstoffgehalt der Hefe, muss mit einem Anteil an Nicht-

eiweisstickstoff von 25 bis 26 % gerechnet werden (vgl. Seite 11). Hievon finden

sich in der extrahierten Fettfraktion und im alkohollöslichen Anteil 13,38 %, so

dass in der alkoholunlöslichen Fraktion noch ungefähr 12 % Nichteiweisstickstoff

vorliegen müssen. Dieser Anteil tritt hauptsächlich in den oben stehenden Daten für

den Ammoniakstickstoff und wahrscheinlich bis zu einem gewissen Grade auch in den

Daten für den Huminstickstoff in Erscheinung. Ferner ergab sich aus Tabelle 2, Sei¬

te 9, dass die freien Aminosäuren durch die von uns vorgesehene Alkoholextraktion

nicht vollständig aus der Hefe herausgelöst werden. Der 12 % betragende Anteil an

Nichteiweisstickstoff muss demnach ausser aus Ammoniak- und Huminstickstoff auch

aus Stickstoff freier Aminosäuren bestanden haben. Immerhin erweist sich dieser

Anteil an freien Aminosäuren im Vergleich zu dem im Hefeprotein gebundenen Stick¬

stoff als sehr bescheiden.

2. Die papierchromatographische Trennung der Aminosäuren

a) Allgemeines

Das von R. Consden, A.M. Gordon und A. J. P. Martin (21)

ausgearbeitete Verfahren der Papierchromatographie, das von uns für die weitere

Auftrennung der Eiweisshydrolysate angewandt wurde, beruht wahrscheinlich vor¬

wiegend auf der unterschiedlichen Verteilung der Komponenten eines Gemisches zwi¬

schen zwei flüssigen Phasen. Das Papier dient zur Fixierung der einen, d. h. der

stärker polaren Phase (meist Wasser), an der eine zweite weniger polare Phase

(organische Phase) vorbeiströmt. Je grösser die Löslichkeit einer Komponente in

der organischen Phase ist, desto rascher wandert sie. Umgekehrt ist aber auch eine

gewisse Löslichkeit in der stärker polaren Phase (Wasserlöslichkeit) erforderlich,

um die Bildung abgegrenzter Flecke zu gewährleisten.

Als Ausdruck für die Wanderungsgeschwindigkeit eines Stoffes dient der R_-Wert,

der wie folgt definiert ist:

_

_

Wanderungsstrecke der Substanz

Wanderungsstrecke der Lösungsmittelfront

Sofern die Papiersorte und die Lösungsmittel definiert sind, lassen sich die

Chromatogramme reproduzieren, so dass die R_-Werte zur Charakterisierung ei¬

ner Substanz dienen können.

- 21

Je mehr Komponenten ein Gemisch enthält, desto schwieriger ist dessen voll¬

ständige Auftrennung in einzelne, sauber begrenzte Flecke. Besondsrs dem eindi¬

mensionalen Verfahren, bei dem das Chromatogramm nur in einer Richtung ent¬

wickelt*) wird, sind bezüglich Trennschärfe enge Grenzen gesetzt.

Da die eindimensionale PapierChromatographie, verglichen mit dem zweidi¬

mensionalen Verfahren, weniger Zeit bedarf und als weiteren Vorteil die parallele

Entwicklung verschiedener Proben auf dem gleichen Papierbogen ermöglicht, wo¬

durch die Identifizierung der getrennten Stoffe erleichtert wird, ist versucht worden,

dieses Verfahren zu verbessern, um so eine befriedigende Trennung aller Amino¬

säuren zu erzielen. J.K. Miettinen und A.I. Virtanen (61) konnten eine

wesentliche Verbesserung der Trennschärfe dadurch erzielen, dass sie kontinuier¬

lich chromatographierten, d. h. die Entwicklung fortsetzten, nachdem das Lösungs¬

mittel den unteren Blattrand erreicht hatte. Bei dieser Methode muss das Chromato¬

gramm jedoch 5-8 Tage oder länger in der Entwicklungskammer verbleiben, wo¬

durch das Arbeitstempo stark verlangsamt wird. Ein anderes Verfahren zur Ver¬

besserung der Trennschärfe bei der eindimensionalen Chromatographie ist von E.

F. McFarren(58) vorgeschlagen worden. Gestützt auf die pH-Abhängigkeit der

R-p-Werte polarer Substanzen, gelang es ihm, durch Pufferung der Aminosäurelö¬

sung, des Papiers und des Lösungsmittels auf verschiedene pH-Werte, eine saube¬

re Trennung von 19 Aminosäuren zu erhalten. Die Trennschärfe dieser Methode be¬

stätigte sich auch in unsern Versuchen, doch zeigte es sich, dass bei der quantita¬

tiven Auswertung mit Hilfe der Ninhydrinreaktion Trübungen auftraten, die das Pho-

tometrieren verunmöglichten. Leider genügte auch dieses Verfahren nicht, um die

in der Hefe, d.h. vor allem in der alkohollöslichen Fraktion besonders zahlreich

vorhandenen Aminosäuren vollkommen zu isolieren.

Eine befriedigende Auftrennung von kompliziert zusammengesetzten Eiweiss-

hydrolysaten zum Zweck einer nachfolgenden quantitativen Auswertung scheint vor¬

läufig nur nach dem zweidimensionalen Verfahren möglich zu sein, bei dem das

Chromatogramm in zwei senkrecht zueinander stehenden Richtungen entwickelt wird.

Dieses Verfahren, für das wir uns entschlossen, wird nachfolgend ausführlich be¬

schrieben.

*) Die Bezeichnung "entwickeln" wird nachfolgend ausschliesslich für den Lauf des

Chromatogramms verwendet; es sei jedoch vermerkt, dass von andern Autoren

in Anlehnung an die Photographie oft auch die Sichtbarmachung der Flecke mit

Hilfe einer Farbreaktion als "entwickeln" bezeichnet wurde.

- 22 -

b) Die Technik der chromatographischen Trennung

aa) Das Papier

In unseren Untersuchungen wurde ausschliesslich Whatman-Papier verwendet,

wobei für qualitative Zwecke entweder Nr. 4 oder Nr. 1, für quantitative Bestim¬

mungen nur das Papier Nr. 1 mit mittlerer Laufzeit gewählt wurde, da letzteres

kleine, scharf begrenzte Flecke gibt. Für die Trennung mit Butanol-Phenol be¬

nützten wir stets ganze Bogen (181/4 x 221/2 inch).

bb) Die Entwicklungskammern

Zur Verhinderung der Verdunstung des Lösungsmittels müssen die Chromato-

gramme in geschlossenen Behältern oder Kammern in einer mit dem Lösungsmittel

gesättigten Atmosphäre entwickelt werden. Grundsätzlich sollte für jedes verwendete

Lösungsmittel eine separate Entwicklungskammer zur Verfügung stehen, damit nicht

nach jedem Lauf das Lösungsmittel gewechselt werden muss. Wird in grossen Kam¬

mern mit ganzen Whatman-Papierbogen gearbeitet, so gelingt es meist nicht, vor der

Verwendung eines neuen Lösungsmittels die letzten Spuren des vohergehenden zu

entfernen. Wird wie bei unseren Untersuchungen ein Butanollauf von einem Phenol¬

lauf gefolgt, so tritt bei Vorhandensein von Butanolrückständen eine ausgeprägte brau¬

ne Front auf, deren Zacken sich oft weit ins Blatt hineinziehen, so dass diejenigen

Aminosäuren mit den grössten Rp,-Werten (Leucin, Methionin, Valin, Phenylalanin,

Prolin und Arginin) in ihrem Lauf gestört werden. Wir verwendeten deshalb für je¬

des der beiden Lösungsmittel eine getrennte Kammer, von denen eine aus paraffinier-

tem Holz mit zwei Glasfenstern, die andere aus Glasscheiben in einem Metallrahmen

gebaut war.

Das Sättigungsmittel (wässerige Phase) wurde in eine Porzellanschale auf dem

Boden der Kammer gebracht. Die gläsernen Küvetten für die Aufnahme des Lösungs¬

mittels wurden im Verlauf der weiteren Untersuchungen durch solche aus Polyaethylen

ersetzt. Diese Küvetten bewährten sich ausgezeichnet.

cc) Die Wahl der Lösungsmittel

Bei der Auswahl der Lösungsmittel für quantitative, chromatographische Ei-

weissuntersuchungen sind folgende Gesichtspunkte zu beachten:

1. Die R_-Werte der zu untersuchenden Stoffe sollten sich im gewählten Lösungs¬

mittelsystem um mindestens 0,05 unterscheiden und nicht über 0,9 liegen (H .

Hellmann (41).

- 23 -

2. Die Lösungsmittel dürfen keine chemischen Veränderungen der Aminosäuren, die

zu fehlerhaften Ergebnissen führen, verursachen.

3. Bei aufeinanderfolgender Verwendung zweier verschiedener Lösungsmittel, wie

sie bei der zweidimensionalen Chromatographie meist vorkommt, besteht die Ge¬

fahr, dass Rückstände des ersten Lösungsmittels den Lauf des zweiten beein¬

trächtigen. Aus diesem Grunde muss das erste Lösungsmittel so beschaffen sein,

dass es aus dem Papier entfernt werden kann, ohne dass Verlust«- an Aminosäu¬

ren entstehen.

4. Das zweite Lösungsmittel darf den Nachweis und die quantitative Bestimmung der

Aminosäuren nicht stören. In den meisten Fällen ist es notwendig, dieses voll¬

ständig aus dem Papier zu entfernen, was wiederum ohne Verluste an Aminosäuren

zu geschehen hat.

Nach J. K. Miettinen und A.I. Virtanen (61) erfüllen Pyridin, Lutidin

(2, 4-Dimethylpyridin) und Collidin (2, 4, 6-Trimethylpyridin), die früher oft als

Lösungsmittel zur Trennung der Aminosäuren verwendet wurden, die genannten An¬

forderungen nur teilweise, was u.U. zu fehlerhaften Ergebnissen führt. Bei nicht

sachgemässer Anwendung kann auch Phenol Verluste an Aminosäuren verursachen.

Aliphatische Alkohole, wie vor allem Propanol und Butanol, die den zuvor genannten

Lösungsmitteln überlegen sind, haben die Pyridinabkömmlinge in der Papierehramato-

graphie der Aminosäuren weitgehend verdrängt. Einzig das Phenol liess sich bisher

durch kein leichter flüchtiges Lösungsmittel mit gleich grossem Auflösungsvermögen

ersetzen.

Nach Prüfung verschiedener Lösungsmittel entschieden wir uns für das folgende

von S.M. Partridge (74) empfohlene Paar:

1. Lauf: n-Butanol - Eisessig - Wasser (4:1:5)

2. Lauf: Mit Wasser gesättigtes Phenol

Mit diesen zwei Lösungsmitteln konnten im absteigenden Lauf alle in der Hefe

nachgewiesenen Aminosäuren, ausser Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin

und Valin, vollständig getrennt werden. Die Trennung der letzteren erfolgte aufstei¬

gend nach R.A. Boissonas (12) mit Hilfe der nachfolgend aufgeführten Lösungs¬

mittel:

1. Lauf: Tertiäres Butanol - Methyläthylketon - Wasser (4:4:2)

2. Lauf: Tertiäres Butanol - Methanol - Wasser (4:5:1)

Im Gegensatz zu unserem Vorgehen wird in den meisten Fällen bei Verwendung

des erstgenannten Lösungsmittelpaares das Phenol im ersten und das Butanol im

- 24 -

zweiten Lauf eingesetzt. Diese Reihenfolge erfordert jedoch eine restlose Entfernung

des Phenols nach dem ersten Lauf. Bei qualitativem Arbeiten, bei dem Verluste an

Aminosäuren keine Rolle spielen, kann dies leicht durch Erhitzung auf höhere Tem¬

peraturen erreicht werden. Folgt der Trennung jedoch eine quantitative Auswertung

der Chromatogramme, so müssen die Papierbogen, um das Phenol ohne Verluste an

Aminosäuren vollständig entfernen zu können, bei 45 C vorgetrocknet, anschliessend

mit Aether ausgewaschen und schliesslich 24 Stunden bei Zimmertemperatur nachge¬

trocknet werden. Wird in abgekürztem Verfahren das Phenol nach dem ersten Lauf

nicht restlos entfernt, so tritt im zweiten Lauf mit Butanol hinter der Lösungsmittel¬

front eine zweite gelbe Front auf, welche die Entwicklung der Aminosäuren stark

hemmt und deren Trennung beeinträchtigt (auch von R. J. Block (10) beobachtet).

Das eben erwähnte Vorgehen erweist sich meist als zu umständlich. Es hat

sich deshalb als vorteilhafter erwiesen, das Butanol im ersten Lauf zu verwenden,

besonders deshalb, weil dieses die günstige Eigenschaft besitzt, Verunreinigungen,

die den Phenollauf stören, aus dem Papier herauszulösen und sie an seiner Front

vor sich herzutreiben. Dieser einer Waschung der Blätter gleichkommende Prozess

schafft somit günstige Voraussetzungen für den nachfolgenden Phenollauf und bewirkt,

dass die als Folge von Verunreinigungen an der Phenolfront auftretende braune Zone

*)

nur noch schwach in Erscheinung tritt '.

dd) Die Zubereitung der Lösungsmittel

Die Reinheit der Lösungsmittel bildet eine wichtige Voraussetzung für das Ge¬

lingen der chromatographischen Trennung. Besondere Sorgfalt erfordert die Zube¬

reitung des Phenols. Dieses wurde nach G. Stampa (90) über Aluminiumspänen

bei Normaldruck destilliert und durch Zusatz von 10 % doppelt destilliertem

*) Beim Phenollauf wird oft an der Lösungsmittelfront eine braunschwarze Zone

beobachtet. Diese tritt im basischen Milieu verstärkt auf und kann u.U. die

Bestimmung der am weitesten wandernden Aminosäuren beeinträchtigen. Die

Bildung dieser aus Verunreinigungen bestehenden Zone wird durch das im Papier

in Spuren vorhandene Kupfer katalysiert. Durch Zusatz einiger Kristalle von

Kaliumcyanid zur Sättigungslösung lässt sich die katalytische Wirkung des Kup¬fers jedoch weitgehend unterbinden (R.Consden (21) ). Nach A. M. Smith

(85) kann die Bildung der dunkelbraunen Phenolfront auch durch Zusatz von

Ameisensäure zum Lösungsmittel und von Ammoniak zum Sättigungsmittel ver¬

hütet werden, da anscheinend das entstehende Ammoniumformiat mit Kupfer ei¬

ne Komplexverbindung eingeht. In unseren Untersuchungen zeigte es sich, dass

durch dieses Vorgehen die dunkle Front fast gänzlich zum Verschwinden gebrachtwerden kann. Dagegen hat es den Nachteil, dass das Ammoniumformiat nach dem

Lauf im Trockenschrank bei 80° C verdampft werden muss, wobei gewisse Ami¬

nosäuren bei Anwesenheit von Phenol geschädigt werden können. In unseren wei¬

teren Untersuchungen wurde deshalb auf den Zusatz von Ameisensäure verzich¬

tet.

- 25 -

*)Wasser ' verflüssigt. Das auf diese Weise gewonnene Produkt erwies sich als sehr

rein und liess sich während längerer Zeit als Stammlösung aufbewahren. Bei Bedarf

wurde diese Stammlösung in einem Schütteltrichter mit doppelt destilliertem Wasser

im Verhältnis 1 : 1 gesättigt, worauf die spezifisch schwerere Phase, das wasserge¬

sättigte Phenol, als Lösungsmittel zur Entwicklung des Chromatogrammes, die

leichtere Phase, das phenolgesättigte Wasser, zur Sättigung der Kammerluft ver¬

wendet wurde.

Beim n-Butanol erübrigte sich eine Destillation. Nach dem Vorschlag von S.

M. Partridge (74) wurden jeweils vier Teile Butanol und ein Teil Eisessig mit

fünf Teilen Wasser im Schütteltrichter gesättigt. In diesem Falle diente die leichte¬

re Phase, das mit Wasser gesättigte Butanol, als Lösungsmittel, während die schwe¬

rere Phase, das mit Butanol gesättigte Wasser, zur Sättigung des Kastens Verwen¬

dung fand.

Beide Lösungsmittel wurden jeweils am Vorabend ihrer Verwendung hergestellt

und über Nacht stehen gelassen. Es empfiehlt sich, die Lösungen bei der Mischung

im Schütteltrichter nicht zu stark zu schütteln, um Trübungen zu vermeiden, da die¬

se auch bei längerem Stehenlassen nicht mehr verschwinden und nur noch durch wei¬

tere Zusätze von etwas Phenol bzw. Butanol-Eisessig geklärt werden können.

Um einer nachträglichen Entmischung in der Küvette vorzubeugen, soll die

Sättigung der Lösungsmittel nicht im Chromatographierraum, sondern in einem et¬

was kühleren Lokal erfolgen. Sie soll für alle Untersuchungen bei annähernd gleicher

Temperatur stattfinden, damit die RF-Werte, die wie H. B. Bull (18), G. N.

Kowkabany undH.G. Cassidy (51) gezeigt haben, von der Konzentration des

Lösungsmittels abhängen, nicht allzu grosse Schwankungen aufweisen.

Da die R_-Werte der polaren Aminosäuren eine starke pH-Abhängigkeit zeigen,

wurde zur besseren Trennung der basischen Aminosäuren dem Sättigungsmittel je-3

weils 1 cm Ammoniak zugesetzt.

Bei der Zubereitung des zweiten Lösungsmittelpaares wurde nach den Vor¬

schriften von R.A. Boissonnas (12) verfahren.

ee) Der Arbeitsgang

Die zu analysierenden Aminosäurelösungen wurden mit einer Mikropipette auf

das Papier aufgetragen. Um möglichst kleine Flecke zu erhalten, wurden für quan-

3titative Bestimmungen 2 bis 3 mm nicht überschritten, während für qualitative

*) Bei Verwendung von doppelt destilliertem Wasser tritt die braune Phenolfront

schwächer auf als bei einfach destilliertem. O.J. Draper und A.L.Pol-

lar d (28) verwenden sogar dreifach destilliertes Wasser.

- 26 -

Untersuchungen, bei denen die Fleckengrösse keine Rolle spielt, Mengen von bis

3zu 5 mm aufgetragen wurden. Zeigte es sich, dass die aufgetragenen Lösungsmen¬

gen nicht genügend Aminosäuren enthielten, so wurde die Auftragung nach einer je¬

weiligen Zwischentrocknung wiederholt, bis der für die Bestimmung notwendige Ge¬

halt an Aminosäuren erreicht war. Saure Lösungen wurden nach dem Auftragen neu¬

tralisiert, indem nach R. C onsden(21) der noch nasse Fleck während kurzer Zeit

Ammoniakdämpfen ausgesetzt wurde.

Die Papierbogen wurden alsdann in der Kammer in der Weise entwickelt, dass

das Butanol parallel zur breiten Seite, das Phenol parallel zur schmalen Seite lief .

Zwischen dem Butanol- und dem Phenollauf wurden die Papierbogen in einem Trok-

kenschrank mit Abzug bei 45 C getrocknet und hernach die Ansammlung von Ver¬

unreinigungen an der Butanolfront dadurch entfernt, dass das Blatt 2 bis 3 cm hin-

ter der Front abgeschnitten wurde . Die phenolhaltigen Papierbogen, die nicht für

eine quantitative Auswertung vorgesehen waren, wurden bei 100 C getrocknet, wäh¬

rend die für die quantitative Auswertung bestimmten Bogen eine schonendere Behand¬

lung erfuhren (vgl. S.43 ). Zur besseren Trennung der basischen Aminosäuren bei

quantitativer Bestimmung war es erforderlich, das Butanol nicht nur bis zum Er¬

reichen des unteren, ausgezackten Blattrandes laufen zu lassen, sondern den Lauf

um das Doppelte zu verlängern. Die gleiche Massnahme erwies sich im Phenollauf

zur Trennung von Glycin und Serin als notwendig.

Die Trennung von Leucln und Isoleucin, Phenylalanin und Methionin mit dem

zweiten Lösungsmittelpaar wurde, wie erwähnt, gemäss den Vorschriften von R .A.

Boissonnas(12) durchgeführt. Eine zufriedenstellende Trennung von Leucin und

Isoleucin wurde jedoch nicht erreicht, auchnicht, wenn wir die Lösungsmittelpaare

doppelt so weit laufen Hessen, als vom Autor angegeben wird.

Oft wird empfohlen, die Bogen vor der Zugabe des Lösungsmittels einige Stun¬

den in der gesättigten Atmosphäre hängen zu lassen. Weder J. F. Thompson(92) noch wir konnten jedoch einen ins Gewicht fallenden Vorteil dieses Vorge¬hens feststellen, weshalb wir davon absahen.

Zur Erkennung der Butanolfront muss diese entweder vor dem Eintrocknen mar¬

kiert oder nach dem Trocknen mit ultravioletten Strahlen zum Fluoreszieren ge¬

bracht werden. Statt die Front abzuschneiden, kann sie auch dadurch entfernt

werden, dass man das Butanol nach Erreichen des ausgezackten Randes während

kurzer Zeit abtropfen lässt. Hierdurch wird jedoch die exakte Bestimmung der

R„-Werte erschwert.

- 27 -

3. Die Identifizierung und die quantitative Bestimmung der

Aminosäuren

a) Allgemeines

Sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Auswertung der Aminosäu-

ren-Chromatogramme diente die Ninhydrin-Reaktion.

Das Ninhydrin (Triketohydrinden) dehydriert die Aminosäuren zu Iminosäuren

und geht dabei selbst in den entsprechenden sekundären Alkohol, Hydrindantin, über.

Die Iminosäuren zerfallen hierauf spontan in die nächstniedrigeren Aldehyde, in C02und NH3. Letzterer bildet durch Kondensation mit dem noch vorhandenen Ninhydrin

und dem Hydrindantin den bekannten blauen Farbstoff. Unterhalb pH 2,5 unterbleibt

diese Kondensation, so dass keine Farbstoffbildung stattfindet. Bei diesen Bedingun¬

gen tritt die abgespaltene Aminogruppe als Ammoniak auf, der nach Entfernung des

überschüssigen Ninhydrins gemessen werden kann. Eine weitere Auswertungsmög¬

lichkeit der Ninhydrinreaktion besteht in der Messung der abgespaltenen Kohlensäu¬

re.

b) Die qualitative Auswertung der Chromatogramme

Zur qualitativen Auswertung der Chromatogramme diente uns die mit Nin¬

hydrin auftretende Farbreaktion. Nach Verdampfung des grössten Teils des Phenols

bei 100 C wurden die Chromatogramme unter Zuhilfenahme eines Zerstäubers mit

einer 0,1 %-igen Lösung von Ninhydrin in wassergesättigtem n-Butanol bespritzt und

5 bis 10 Minuten bei 80 bis 100 C erhitzt,womit die Blaufärbung eintrat. Es ist

vorteilhaft, die Blätter nach dem Erhitzen noch 12 bis 24 Stunden bei Zimmertem¬

peratur hängen zu lassen, da hierdurch die Farbflecken an Intensität gewinnen, so

dass auch in geringen Mengen vorkommende Aminosäuren noch festgestellt werden

können.

Das wichtigste Hilfsmittel zur Identifizierung der von den verschiedenen Amino¬

säuren gebildeten Farbflecke ist die Unterschiedlichkeit der R_-Werte (vgl. Seite 20).

Es hat sich aber gezeigt, dass der R^-Wert ein und derselben Aminosäure nur be¬

dingt als charakteristische Konstante betrachtet werden darf, indem er in Abhängig¬

keit vom Chemismus und der Konzentration des Lösungsmittels, vom pH und von

andern Faktoren eine gewisse, wenn auch meist nur geringfügige Variabilität auf¬

weist, eine Tatsache, die bei der Identifizierung der Aminosäuren einige Unsicher-

*) A.R. Patton(75) führt die Farbreaktion bei Zimmertemperatur durch, wozu aber

18 bis 28 Stunden benötigt werden. Dieses Vorgehen ist vor allem bei Lösungen un¬

bekannter Zusammensetzung zu empfehlen, um zu verhindern, dass Aminosäuren,die ev. nur in Spuren vorhanden sind, bei der Erhitzung in Anwesenheit von Phenol

zerstört werden.

- 28 -

heit schafft (G. N. Kowkabany (51), A. J. Landua (55) und ihre Mitarbeiter).

Man darf immerhin erwarten, dass die Mehrzahl der Ursachen, die zu Schwankun¬

gen der einzelnen R_,-Werte führen, weitgehend ausgeschaltet werden, wenn man

stets unter möglichst gleich bleibenden Bedingungen arbeitet. Da ausserdem diese

Ursachen die verschiedenen R-,-Werte meist in gleicher Weise verändern, wird

durch sie die relative Lage der einzelnen Aminosäureflecke kaum beeinflusst. Ein¬

schränkend ist zu bemerken, dass eine durch Veränderung des pH bedingte Variabili¬

tät der R_-Werte nur bei den sauren und basischen Aminosäuren zur Geltung kommt,

woraus sich, entgegen dem zuvor Gesagten, Verschiebungen in der relativen Lage

der Flecke ergeben können, die nicht zu vernachlässigen sind. Im allgemeinen darf

jedoch festgestellt werden, dass die meisten Aminosäuren auf Grund ihrer RF-Wertebzw. auf Grund der gegenseitigen Lage ihre Flecke recht gut identifiziert werden

können. Schwierigkeiten treten allerdings auf, wenn Eiweisskörper vorliegen, die

20 und mehr verschiedene Aminosäuren enthalten.

c) Die quantitative Bestimmung der im Papier ehr omatogramm

getrennt vorliegenden Aminosäuren

Nicht lange nach der Veröffentlichung der grundlegenden Arbeit von R.

Consden und Mitarbeitern (21) wurden Versuche zur quantitativen Auswertung des

papierchromatographischen Trennungsverfahrens in Angriff genommen. Ein wichti¬

ger Beitrag hierzu haben S. Moore und H.W. Stein(67) geleistet, indem sie

die Reaktionsbedingungen, die zur Ninhydrinfärbung führen, untersuchten. Sie konn¬

ten feststellen, dass bereits geringe Mengen Sauerstoff genügen, um das im Laufe

der Reaktion entstehende Hydrindantin wieder zu Ninhydrin zu oxydieren, womit eine

quantitative Farbstoffbildung verhindert wird. Durch Zusatz von Hydrindantin gelang

es ihnen, diesen Oxydationseffekt zu kompensieren, so dass die zuvor beschriebene

Kondensation mit dem abgespaltenen Ammoniak ungestört zustande kam. Statt Hy¬

drindantin kann auch ein anderes Reduktionsmittel z.B. Zinn-Ü-Chlorid, zugesetzt

werden. Nach den genannten Autoren erreicht die Farbreaktion zwischen pH 4,5 und

5,5 ein Maximum.

Auf Grund ihrer Untersuchungen teilen S. Moore und H.W. Stein (67)

folgende Arbeitsvorschrift für die Durchführung der Farbreaktion mit:

3 3Citratpuffer pH 5: 21,008 g Citronensäure in 200 cm n NaOH lösen und auf 500 cm

ergänzen.

3Ninhydrinlösung: 0, 80 g SnCl, • 2 H„0 in 500 cm Citratpuffer lösen und zu einer

Lösung von 20 g Ninhydrin in 500 cm Methylcellosolve zugeben.

Diese Lösung kann unter Stickstoff längere Zeit aufbewahrt werden.

- 29 -

Von der gepufferten Ninhydrinlösung werden 1 bis 2 cm zu der zu bestimmenden

Aminosäurelösung in ein Reagenzglas gegeben und 20 Minuten im siedenden Wasser¬

bad erhitzt. Nach dem Erkalten wird mit einem Gemisch von gleichen Teilen Propanol

und Wasser verdünnt und bei 570 myu photometriert. S. Moore und H.W. Stein

(67) bestimmten die Aminosäuren, die sie mit Hilfe einer Stärkesäule in Verbindung

mit einem Fraktionensammler trennten, mit einer Genauigkeit von ± 1 %.

A. J. Landua und J. Awapara (54) versuchten die Erfahrung von Moore

und Stein in dem Sinne zu verwerten, dass sie das Reagens dieser zur quantitati¬

ven Auswertung von Papierchromatogrammen verwendeten. Dabei zeigte es sich,

dass bei direkter Anwendung der Ninhydrinlösung auf Papier ein hoher Blindwert

auftritt, der eine befriedigende Auswertung verunmöglichte. R.A. Boissonnas

(14) wies nach, dass der Papierblindwert ausschliesslich auf Adsorption von Am¬

moniumionen der Luft zurückzuführen ist. Durch Behandlung des Papiers mit einer

1 %-igen Lösung von KOH in Methanol werden diese Ammoniumionen entfernt, so

dass kein Blindwert des Papiers mehr auftritt. Auch für den stets in Erscheinung

tretenden Blindwert der Ninhydrinlösung sind in ihr enthaltene Ammoniumionen ver¬

antwortlich. Die durch diese verursachte Farbstoffbildung erreicht nach Boisson¬

nas bei pH 4, 7 ein Minimum. Er verwendet deshalb einen Acetatpuffer von pH 4,7

(1 Teil n NaOH + 1 Teil 2n Essigsäure). Boissonnas empfiehlt auch, die Reagenzien

von Moore und Stein in geringerer Konzentration zu verwenden (0,5 % Ninhydrin

und 0, 5 g SnCl, • 2 H,0 pro Liter). Die Genauigkeit der von Boissonnas abgeänder¬

ten Methode soll bei der Untersuchung von Eiweisshydrolysaten + 5 % betragen.

Ein weiterer Versuch, das Reagens von Moore und Stein zur quantitativen Auswertung

von Papierchromatogrammen einzusetzen, stammt von L. Fowden (39). Er ver¬

wendet eine 4 %-ige, mit Hydrindantin gesättigte Lösung von Ninhydrin in Methyl-

cellosolve und eine Citratpufferlösung mit 0,16 % SnCL, • 2 HgO im Verhältnis 1 : 1.

Die Entfernung der Ammoniumionen aus dem Papier nimmt Fowden im Reagens¬

glas vor, in welchem die ausgeschnittenen Aminosäureflecke über Nacht einer Alka¬

libehandlung mit nachfolgender Neutralisation ausgesetzt werden. Die Genauigkeit die¬

ser Methode wird mit i 5 % angegeben.

A.M. Smith undA.H. Agiza (86) stellen schliesslich folgende drei verschie¬

dene Lösungen her, die erst unmittelbar vor der Reaktion zu gleichen Teilen im

Reagensglas gemischt werden:

Citratpuffer nach Moore und Stein ,

Ninhydrinlösung: 550 mg Ninhydrin in 100 cm CitratpufferZinnchlorid: 0,5 g SnCl, in 250 cm3 Citratpuffer

Auch dieses Reagens lässt sich für die quantitative Auswertung von Papierchromato¬

grammen verwenden. In reiner Form ins Reagensglas gebrachte Aminosäuren sollen

mit ihm mit einer Genauigkeit von t 1 bis 2 % bestimmbar sein.

Nach unserem Dafürhalten erschien die Methode von R.A. Boissonnas

- 30 -

(14) für die quantitative Bestimmung von Aminosäuren im Anschluss an ihre papier-

chromatographische Trennung am besten geeignet zu sein. Sie besitzt den Vorteil,

eine geringe Konzentration, d. h. verhältnismässig kleine Mengen des sehr teuren

Ninhydrins zu benötigen; gleichzeitig ermöglicht sie, den Blindwert des Papiers

auf einfachem Wege zu eliminieren. Wir konnten zudem beobachten, dass sich die

mit dem Acetatpuffer versehene Lösung von Boissonnas bei Aufbewahrung weniger

leicht blau färbt als die Ninhydrinlösung von Moore und Stein; unter Stickstoff ist sie

monatelang haltbar. Indem wir uns grundsätzlich für die Methode von Boissonnas

entschlossen, versuchten wir, die von ihm angegebene Farbreaktion direkt auf dem

Papier durchzuführen; anderseits arbeiteten wir nach seiner Vorschrift im Reagens¬

glas.

aa) Die Ausführung der quantitativen Ninhydrinreaktion auf dem Papier

Die direkte Ausführung der quantitativen Ninhydrinreaktion auf dem Papier

ist mit grossen Messchwierigkeiten verbunden. Folgende Methoden sind hierfür

vorgeschlagen worden:

A. Polson und Mitarbeiter (77) chromatographierten neben der zu untersu¬

chenden Aminosäuremischung eine Standardmischung bekannter Zusammensetzung

in verschiedenen Verdünnungen ( spot-dilution method). Ein Vergleich der Flecken-

grösse und der Farbintensität des Versuchschromatogrammes mit dem Standard-

chromatogramm erlaubte es, den Aminosäuregehalt im Untersuchungsmaterial ab¬

zuschätzen. Wie R.B. Fisher und Mitarbeiter (37) gezeigt haben, ist es auch

möglich, eine quantitative Bestimmung auf Grund der Fleckengrösse allein auszu¬

führen, da die Fläche der Flecke sich zum Logarithmus der Konzentrationen pro¬

portional verhält.

Verschiedentlich versuchte man eine direkte quantitative Auswertung der Chro-

matogramme in der Weise, dass die Aminosäureflecke auf dem Papier mit Hilfe ei¬

nes Densitometers photometriert wurden ( R. J. Block (9), H.B. Bull und

Mitarbeiter (18), R.R. Redfield undG.E.S. Bar r on (78), E.F

.Mc-

Farren und J.A. Mills (59) .Wie J. F. Thompson und Mitarbeiter (92)

gezeigt haben, ist jedoch der Anwendungsbereich dieser Methode sehr beschränkt.

Unsere Versuche, die Aminosäuren auf dem Papier quantitativ direkt zu be¬

stimmen, haben zu keinen brauchbaren Ergebnissen geführt. Beispielsweise fan¬

den wir mit Alanin sehr verschiedene Werte, je nachdem die Farbreaktion auf dem

Papier oder im Reagenzglas erfolgte:

- 31 -

Extinktion

(relative Werte)

Farbreaktion auf dem Papier 100

Farbreaktion im Reagenzglas 65

In beiden Fällen wurde nach den Vorschriften von Boissonnas gearbeitet, wobei

wir jedoch den Papierblindwert nicht mit Hilfe der von ihm empfohlenen KOH-Be-

handlung, sondern in nachfolgend angegebener Weise eliminierten. Die Papierbogen

wurden mit der Ninhydrinlösung von Boissonnas bespritzt und 15 Minuten im Trok-

kenschrank auf 90 C erhitzt. Die Farbflecke und zwei gleich grosse ungefärbte, zur

Bestimmung des Papierblindwertes vorgesehene Zonen wurden dann ausgeschnitten,

mit einem Pyridin-Wasser-Gemisch extrahiert und photometriert. Da das Lösungs¬

mittel beim Erhitzen ziemlich rasch eintrocknet, weshalb die Farbreaktion nur wäh¬

rend einer kurzen Zeit vor sich gehen kann, wäre zu erwarten gewesen, dass die

direkte Bestimmung auf dem Papier einen eher niedrigeren Wert ergeben würde als

die Bestimmung im Reagenzglas. Eine einleuchtende Erklärung, warum unser Be¬

fund im Gegensatz zu dieser Erwartung steht, vermögen wir nicht anzuführen. Die

Vermutung, es könnte der höhere Wert bei der direkten Bestimmung dadurch zu¬

standegekommen sein, dass bei dieser vermehrt, die Blaufärbung verstärkendes

Ammoniak aus der Luft aufgenommen worden sei, fällt dahin, da dieser Einfluss

durch die zuvor erwähnte Bestimmung des Blindwertes ebenfalls eliminiert wurde.

Im Zusammenhang mit unserem Befund seien einige Ergebnisse von J. F.

Thompson und Mitarbeiter (92) angeführt, die zeigen, dass sich Modifikationen

im Erhitzen der Papierchromatogramme auf die quantitative Bestimmung verschie¬

dener Aminosäuren unterschiedlich auswirken.

Tabelle 6

Die Ninhydrinreaktion verschiedener Aminosäuren in Abhängigkeit von der

Temperaturbehandlung des Papierchromatogrammes

( nach J.F. Thompson und Mitarbeiter)

Relative Farbintensitäten

Temperatur der trockenen Atmosphäre Temperatur der alkoholge¬sättigten Atmosphäre

40° C 60° C 80° C 60° C

Alanin 1,000 0,942 0,737 0,696Serin 1,000 8,811 0,508 1,061Threonin 1,000 1,000 0,695Glycin 1,000 1,046

- 32 -

Bemerkenswert ist das Ergebnis, wonach Alanin beim Erhitzen des Papier¬

chromatogrammes in trockener Luft höhere, Serin dagegen niedrigere Werte ergab

als beim Erhitzen in alkoholgesättigter Atmosphäre. J. F. Thompson und Mit¬

arbeiter erklären diese Erscheinung damit, dass Alanin mit Ninhydrin wesentlich

rascher reagiert als Serin, so dass die Beschränkung der Reaktionsdauer durch das

Eintrocknen des Lösungsmittels beim Alanin weniger zur Geltung kommt als beim

Serin. Im übrigen geht aus den von Thompson gewonnenen Daten hervor, dass beim

Erhitzen des Papierchromatogrammes in trockener Atmosphäre die Farbbildung der

geprüften Aminosäuren im allgemeinen umso schwächer ausfiel, je höher die ge¬

wählte Temperatur war. Da das von Thompson und Mitarbeitern verwendete Sprüh¬

mittel (0,5 %-ige Ninhydrinlösung in Butanol) kein Reduktionsmittel enthielt, dürfte

dieser Temperatureinfluss nicht nur infolge eines rascheren Eintrocknens der Lösung,

sondern auch dadurch zustande gekommen sein, dass entstandenes Hydrindantin in

Gegenwart von Luftsauerstoff bei höherer Temperatur vermehrt in das farblose Nin¬

hydrin zurückoxydiert wurde. In unsern Versuchen mit der Lösung nach Boisson-

nas (14) scheinen höhere Temperaturen, d.h. Temperaturen zwischen 100 und

110 C die Farbbildung eher begünstigt als beeinträchtigt zu haben (Tabelle 7). Dass

selbst Temperaturen um 110 C keine geringere Farbintensität zeitigten als Tempe¬

raturen von 90° C, hing offenbar nicht nur damit zusammen, dass die Lösung von

Boissonnas weniger rasch eintrocknet als die von Thompson verwendete, sondern

auch damit, dass jene Lösung als Reduktionsmittel Zinnchlorid enthält (vgl. Seite

29).

Tabelle 7

Die Ninhydrinreaktion in Abhängigkeit von der Erhitzungstemperatur des

Papierchromatogrammes

Relative Farbintensitäten (4 Wiederholungen)

ire Phenylalanin LysinTemperatur Alanin Asparagii

°C

90 100 100

100 109 123

110 103 115

115 87 116

100 100

117 121

135 120

121 108

Um einem u. U. nachteilig wirkenden, vorzeitigen Eintrocknen des Lösungs¬

mittels vorzubeugen, versuchten wir, die Papiere in einer wasserdampfgesättigten

Atmosphäre zu erhitzen. Die Streifen wurden zu diesem Zweck in den Hals eines

- 33 -

grossen Erlenmeyerkolbens gehängt, in dem während der Erhitzung ständig Dampf

entwickelt wurde. Um störendes Ammoniak zu binden, wurde in einer besondern

Versuchsreihe dem Kolben etwas Schwefelsäure zugesetzt. Die Ergebnisse finden

sich in Tabelle 8.

Tabelle 8

Die Ninhydrinreaktion in Abhängigkeit trockenen bzw. feuchtenErhitzens der Blätter

Relative Werte (5 Wiederholungen)

Art des Erhitzens Alanin Asparaginsäure Phenylalanin Lysin

Trocken (ca. 100°C) 100 100 100 100

Dampf 124 148 151 90

Dampf+ H2S04 128 118 72

Mit Ausnahme des Lysins liegen die Relativwerte aller Aminosäuren beim Er¬

hitzen im Dampf höher als bei trockener Behandlung. Der Zusatz von HgSO. lässt

durchwegs eine Reduktion der nach Danjpfbehandlung erhaltenen Daten erkennen.

Allgemein war festzustellen, dass unsere auf die direkte Bestimmung Bezug

nehmenden Ergebnisse eine sehr grosse Streuung aufwiesen und nur schlecht repro¬

duzierbar waren. Oft traten unerklärliche Werte auf, so dass wir uns schliesslich

veranlasst sahen, die Voruntersuchungen über die quantitative Auswertung der Nin¬

hydrinreaktion auf dem Papier aufzugeben. Wie J.F. Thompson und Mitarbei¬

ter (92) später zeigen konnten, kann die Ninhydrinreaktion auf dem Papier nur dann

quantitativ gestaltet werden, wenn das Erhitzen unter völligem Ausschluss von Sauer¬

stoff in einer mit Alkohol gesättigten Kohlensäureatmosphäre erfolgt. Sie haben zu

diesem Zweck eine entsprechende Apparatur entwickelt und damit gute Resultate er¬

zielt.

bb) Die Ausführung der Ninhydrinreaktion im Reagenzglas

Bei der Ausführung der Ninhydrinreaktion im Reagenzglas folgten wir mit weni¬

gen Abweichungen den zu Beginn dieses Abschnittes (vgl. Seite 29) diskutierten Vor¬

schriften von R.A. Boissonnas (13, 14). In Abweichung von diesen wurden je¬

doch die Blätter nach der zweidimensionalen Trennung der Aminosäuren nicht mit

einem Stempel bedruckt (vgl. S. 44), sondern mit einer 0,1 %-igen Ninhydrinlösung

in Butanol besprüht und so lange im Trockenschrank erhitzt, bis die Aminosäure¬

flecke ganz schwach sichtbar waren und umrandet werden konnten. Zwecks Eliminie-

- 34 -

rung des Blindwertes wurden die Blätter, der Vorschrift von Boissonnas folgend,

mit einer 1 %-igen KOH-Lösung in wasserfreiem Methanol bespritzt und 15 Minuten

bei 45 C getrocknet. Hierdurch lässt sich der auf die Anwesenheit von Ammonium¬

ionen im Papier zurückzuführende Blindwert vollständig eliminieren, was aus den in

Tabelle 9 angeführten, auf reinem Papier gewonnenen Ergebnissen erkannt werden

kann.

Tabelle 9

Die Eliminierung des Blindwertes nach der Methode von Boissonnas in reinem Papier

Erhitzungstemperatur Dauer der Erhitzung Extinktionskoeffizient0 C Minuten (Mittelwert aus 5 Bestimmungen)

40 15 0,111

60 15 0,117

60 15 (erst nach 4 Stun- 0,111den gemessen)

Blindwert der Ninhydrinlösung 0,109

Wie Tabelle 9 zeigt, war die Eliminierung des Papierblindwertes auch dann noch

wirksam, wenn die Blätter nach der Behandlung noch längere Zeit der Luft ausge¬

setzt wurden. Auch in diesem Fall war kein Anstieg des Blindwertes zu beobachten.

Im Gegensatz zu dem Ergebnis der Tabelle 9 gelang es bei der zweidimensio¬

nalen Trennung der Aminosäuren aus Hefehydrolysaten nur ausnahmsweise, den

Papierblindwert durch KOH-Behandlung dem Lösungsmittelblindwert anzugleichen,

weshalb es sich als notwendig erwies, aus jedem Chromatogramm drei Papierstük-

ke zur Bestimmung einer Blindwertkorrektur auszuschneiden. Leider zeigte es sich,

dass zwischen den Blindwerten dieser 3 Stücke oft ziemlich grosse Abweichungen

auftraten, wodurch die Genauigkeit der photometrischen Bestimmung beeinträchtigt

wurde.

Bei der Ninhydrinreaktion im Reagenzglas gingen wir, wie folgt, vor:

Die Reagenzgläser mit den ausgeschnittenen Aminosäureflecken und zwei leere Glä-

3ser zur Bestimmung des Blindwertes des Reagens werden mit je 5 cm Ninhydrinlö¬

sung versehen. Nachdem man sich vergewissert hat, dass die Papierstücke voll¬

ständig in die Reagenslösung eintauchen, werden die Gläser mit Glashütchen zu¬

gedeckt und 20 Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach sofortigem Abkühlen

3werden 5 cm einer Wasser-Propanolmischung im Verhältnis 1 : 1 zugegeben. Es

folgt gutes Schütteln oder besser mehrmaliges Kippen, worauf in einem Spektropho-

tometer (wir verwendeten ein Beckmann-Instrument) bei 570 m u. (Prolin 440 mu. )

die Extinktion der Lösung gegen Wasser gemessen wird.

- 35 -

Da bei der Reaktion mit Ninhydrin die verschiedenen Aminosäuren je Mol nicht

die gleiche Farbintensität geben, musste für jede einzelne ein Eichwert bestimmt

werden. Die zu diesem Zwecke hergestellten Standardlösungen enthielten 0,1 Mikromo-3

le in 5 mm . Als Lösungsmittel diente nach R. J. Block (10) 10 %-iger Isopropyl-

alkohol. Schwerlösliche Aminosäuren, wie Cystin, Tyrosin und Glutaminsäure, wur¬

den durch Ansäuern mit Salzsäure oder durch stärkere Verdünnung in Lösung ge¬

bracht. Zur Beseitigung des Blindwertes wurden die in Mengen von 0,1 bis 0,3 Mi-

kromolen auf das Papier aufgetragenen Aminosäureflecke mit 1 %-iger Kalilauge in

Methanol behandelt (vergl. Seite 34). Anschliessend wurden die Flecke ausgeschnitten

und im Reagenzglas nach der oben beschriebenen Methode verarbeitet.

Auf diese Weise erhielten wir die in Tabelle 10 wiedergegebenen Extinktions¬

koeffizienten. Nach einem Vorschlag von S. Moore und W.K. Stein (67) wur¬

den die Extinktionskoeffizienten der Aminosäuren auf denjenigen von 0,1 Mikromole

Leucin gleich 1 bezogen (Tabelle 10, 2. Kolonne).

Tabelle 10

Die absoluten und relativen Extinktionskoeffizienten der Aminosäuren

Extinktions- Relative Werte (Extinktionskoeffizient von

koeffizient Leucin = 1)für 0,1 Mi¬ eigene Moore Boissonnas Smith

kromole Arbeit und

Stein

und

Agiza

Alanin 0,205 1,00 1,01 1,01 0,85<* -Aminobuttersäure 0,202 0,99jf -Aminobuttersäure 0,192 0,94 1,00Arginin 0,182 0,89 1,00 1,08 0,88Asparaginsäure 0,184 0,90 0,88 0,93 0,86Citrullin 0,220 1,08 1,03Cystin 0,200 0,98 1,04 0,79Glutaminsäure 0,190 0,93 1,05 0,93 0,89Glycin 0,204 1,00 1,01 1,00 1,00Histidin 0,184 0,90 1,04 0,95 0,88Isoleucin 0,204 1,00 1,00 1,00 1,00Leucin 0,204 1,00 1,00 1,00 1,00Lysin 0,228 1,12 1,12 1,09 0,90Methionin 0,206 1,01 1,00 1,00 0,88Ornithin 0,273 1,34Phenylalanin 0,194 0,95 0,88 0,94 0,93Prolin 0,051 0,25 0,26Serin 0,200 0,98 0,94 0,95 0,96Threonin 0,192 0,94 0,92 0,94 0,81Trytophan 0,143 0,70 0,72 0,73 0,89Tyrosin 0,186 0,91 0,88 0,90 0,89Valin 0,208 1,02 1,02 1,00 0,81Asparagin 0,184 0,90 0,94Glutamin 0,210 1,03 0,99

- 36 -

Ein Vergleich unserer in Tabelle 10 angeführten Relativwerte mit den Werten

von Moore und Stein sowie mit denen von Boissannas lässt für alle Amino¬

säuren ausser für Arginin eine recht gute Uebereinstimmung erkennen. Grösser ist

die Anzahl der ins Gewicht fallenden Differenzen, die sich zwischen unsern Relativ¬

werten und denjenigen von A.M. Smith und H.H. Agiza (86) ergaben. Diese

sind auf Grund einer Methode ermittelt, die von den ursprünglichen, auf S. Moore

und W. H. Stein (67) zurückgehenden Vorschriften ziemlich abweicht.

Wie der Zusammenstellung in Tabelle 11 entnommen werden kann, liegt die Ge¬

nauigkeit der kolorimetrischen Ninhydrinmethode, wenn einzelne Aminosäuren in rei¬

ner Form vorliegen und wenn nach der zuvor angeführten Vorschrift im Bereich von

0,2 Mikromolen gearbeitet wird, zwischen - 1 und ± 2 %.

Tabelle 11

Die Versuchsfehler bei der kolorimetrischen Bestimmung einzelner Aminosäuren

nach der Ninhydrinmethode

Extinktion Standardabweichung(Mittel aus 10 Bestimmungen) in % des Mittelwertes

Alanin 0,410 1,97Glutaminsäure 0,380 1,76Leucin 0,408 1,53Lysin 0,456 2,09

R.A. Boissonnas (14) gibt für seine im Bereich von 0,1 bis 0, 5 Mikro¬

molen durchgeführten Versuche eine Genauigkeit der kolorimetrischen Ninhydrinme¬

thode von+ 1 % an.

Wie bereits erwähnt (Seite 33), können auch mit der direkten Bestimmung auf

dem Papier gut reproduzierbare Werte gefunden werden, sofern, wie dies J. F.

Thompson und Mitarbeiter (92) taten, die Farbreaktion in anaerober CO,-Atmos¬

phäre durchgeführt wird. Die genannten Autoren fanden die in Tabelle 12 zusammen¬

gestellten Versuchsfehler.

- 37 -

Tabelle 12

Die Versuchsfehler bei der Ausführung der Ninhydrinreaktion auf dem Papier nach

J.F. Thompson und Mitarbeiter

Standardabweichung in % des Mittelwertes

Glutaminsäure 2,34Serin 0,97Glycin 2,20Threonin 1,75Alanin 1,68Leucin 2,40

A.M. Smith und H.H. Agiza (86) bestimmten die Aminosäuren auf dem Pa¬

pier mit einer Genauigkeit von 1 bis 3 %.

Wie im folgenden Abschnitt dargelegt werden soll, können die bei zweidimen¬

sionaler Chromatographie aufgetragenen Aminosäuren nie vollständig wiedergefun¬

den werden; es bleiben von Aminosäure zu Aminosäure wechselnde Anteile im Pa¬

pier zurück. Dies hat zur Folge, dass die in Tabelle 10 angeführten Extinktions¬

koeffizienten (Spalte 1) nicht direkt als Eichwerte benützt werden können. Sie mussten

gemäss den in Tabelle 13, Seite 38, Spalte 2, gemachten Angaben korrigiert werden.

cc) Die AdsorptionsVerluste im Papier.

Bei einer ein- oder gar zweidimensionalen Entwicklung der Aminosäuren tre¬

ten im Papier regelmässig Adsorptionsverluste auf. Die Grösse dieser Verluste

variiert von einem Chromatogramm zum andern. Dies hat besonders bei der zwei¬

dimensionalen Chromatographie grosse Streuungen zur Folge, da bei dieser Metho¬

de die für einen Mittelwert notwendigen Einzelbestimmungen nicht auf dem gleichen

Blatt durchgeführt werden können. Exaktere quantitative Bestimmungen sind in der

Papierchromatographie dann möglich, wenn, was nur bei der eindimensionalen Chro¬

matographie möglich ist, neben der Analysenlösung gleichzeitig eine Standardlösung

mit entwickelt werden kann.

Die von uns mit verschiedenen reinen Aminosäuren nach zweidimensionaler

Entwicklung mit Butanol und Phenol erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusam¬

mengestellt (Seite 38).

Wie aus Tabelle 13 hervorgeht, wurden nach zweidimensionaler Entwicklung

85 bis 97 % der aufgetragenen reinen Aminosäuren wiedergefunden. Weniger als

90 % fanden wir bei folgenden Aminosäuren: Aminobuttersäure, Arginin, Histidin,

Lysin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Glutamin.

- 38 -

Tabelle 13

Die Genauigkeit der kolorimetrischen Ninhydrinmethode nach zweidimensionaler

Entwicklung reiner Aminosäuren

Alanin

<X -Aminobuttersäure

% -Aminobuttersäure

ArgininAsparaginsäureCitrullin

CystinGlutaminsäure

GlycinHistidin

Isoleucin

Leucin

LysinMethionin

Ornithin

PhenylalaninProlin

Serin

Threonin

TryptophanTyrosinValin

Glutamin

Asparagin

enge: 0,2 Mikromole. Mittel aus 5 Bestimmungen)

Extinktions¬ Wiedergefundene Standardabweichungkoeffizient Menge in % in % des Mittelwerts

0,399 97,2 3,770,380 94,0 3,840,340 88,6 5,270,321 88,3 5,370,335 91,1 2,880,408 92,8 3,380,362 90,4 4,670,349 91,9 3,440,383 93,8 6,250,320 87,0 4,930,383 93,9 4,170,390 95,6 5,530,393 86,2 8,090,387 93,9 4,120,524 95,9 3,980,362 93,4 4,530,093 91,0 5,140,356 89,0 3,370,329 85,7 6,060,255 89,3 4,210,315 84,6 7,310,386 92,8 4,880,374 89,1 5,470,333 90,5 8,23

Die verhältnismässighohen Verlust an basischen Aminosäuren werden durch die

bei diesen Aminosäuren häufig vorkommende unscharfe Fleckenbildung bedingt. Auch

J.F. Thompson und F.C. Steward (93) haben grosse Verluste an Threonin

und Serin beobachtet; sie führen sie darauf zurück, dass diese Hydroxysäuren stark

hydrophile Eigenschaften besitzen und deshalb stärker als die andern Aminosäuren

in der Wasser-Zellulose-Phase haften bleiben.

Wie aus Tabelle 13 weiterhin ersichtlich ist, liegt die Standardabweichung zwi¬

schen 2,88 % und 8, 23 %. Eine Abweichung von über 5 % weisen Y -Aminobuttersäu¬

re, Arginin, Glycin, Leucin, Lysin, Prolin, Threonin, Tyrosin, Glutamin und

Asparagin auf.

Ausführliche Untersuchungen über die Genauigkeit der Aminosäurebestimmung

und die Verluste an Aminosäuren bei ein- und zweidimensionaler Chromatographie

sind von L. Fowden (38) ausgeführt worden. Nach eindimensionaler Entwicklung

- 39 -

mit Phenol hat dieser Autor 98 % der aufgetragenen Menge wiedergefunden, nach

zweidimensionaler mit Phenol und Butanol-Eisessig 92 %. In einer weiteren Arbeit

berichtet L. Fowden (39), dass bei sachgemässer Behandlung der eindimensio¬

nalen Phenolchromatogramme 89 bis 101 % der aufgetragenen Mengen (8 mg ©< -

Aminostickstoff) wiedergefunden werden konnten, wobei die Standardabweichung

zwischen 0,8 % und 4,2 % lag. Einzig Glutamin, Histidin und Lysin fielen durch be¬

sonders schlechte Ausbeute auf. Bei Verwendung von nur 2 mg OC-Aminostickstoff

fand L. Fowden 92 bis 102 % der aufgetragenen Mengen verschiedener Aminosäuren

wieder, wobei die Standardabweichung innerhalb 1 und 5,9 % lag.

Bei zweidimensionaler Chromatographie ergaben sich aus L. Fowdens Unter¬

suchungen die in Tabelle 14 wiedergegebenen Verhältnisse.

Tabelle 14

Die Versuchsfehler bei der zweidimensionalen Chromatographie

(Nach L. Fowden)

Wiedergefundene Menge Standardabweichung(Mittel aus 8 Bestimmungen) in % des Mittelwertes

Arginin 100 5,6Leucin 96 3,8Valin 96 3,4Phenylalanin 93 4,5Alanin 99 2,0Threonin 100 2,4Glycin 102 7,6Serin 102 6,6Glutaminsäure 92 2,2Asparaginsäure 95 3,8

Was die wiedergefundenen Mengen betrifft, so zeigen unsere in Tabelle 13 an¬

geführten Werte im Vergleich zu den von L. Fowden gefundenen beträchtlich nach un¬

ten gehende Abweichungen für die Aminosäuren Arginin, Glycin, Serin und Threonin.

Besser ist ganz allgemein die Uebereinstimmung der Standardabweichungen.

Die in unseren Versuchen nach zweidimensionaler Entwicklung festgestellten

Verluste von bis zu 15 % können entweder durch Adsorption der betreffenden Amino¬

säuren im Papier oder durch deren Kontakt mit den Lösungsmitteln zu stände gekom¬

men sein. Nach den Angaben von L. Fowden (39) sowie von J. F. Thompson

und F.C. Steward (93) sind allerdings bei Verwendung von Phenol keine oder nur

ganz geringe Kontaktverluste nachweisbar. L. Fowden gelangt ausserdem zum Schluss,

dass die Menge der wiedergefundenen Aminosäuren unabhängig von der zurückgelegten

Strecke sei, d.h., dass während des Laufes von denwandernden Aminosäuren keine Reste

- 40 -

im Papier zurückbleiben. Im Gegensatz dazu stellen J.F. Thompson und F.

C. Steward (93) nach eindimensionaler Entwicklung mit Phenol grosse Verluste

fest (Tabelle 15).

Tabelle 15

Aminosäureverluste bei eindimensionaler Entwicklung der Chromatogramme in

Phenol

(Nach J.F. Thompson und F.C. Steward)

Wiedergefundene Menge in %

Glutaminsäure 88

Threonin 84

Alanin 87

Serin 88

Leucin 92

Indem Thompson und Steward die Verluste je zurückgelegte Wegeinheit berech¬

neten (Tabelle 16), gelangten sie zum Schluss, dass diese Verluste zum weitaus

grössten Teil durch Adsorption verursacht wurden.

Tabelle 16

Prozentuale Verluste an Aminosäuren pro cm zurückgelegtem Weg

(Nach J.F. Thompson und F.C. Steward)

Lösungsmittel Behandlung Glutaminsäure Threonin Alanin Leucin Serin

Phenol — 1,78 1,43 0,39 0,67 1,07Phenol Säure 0,37 0,62 0,08 0,30 0,42Phenol Wasser 0,41 0,71 0,18 0,67 0,55

Es wird angenommen, dass die Adsorptionsverluste unter anderem durch Qxy-

dationsprodukte des Phenols, vor allem aber durch im Papier enthaltene wasserlösli¬

che Substanzen verursacht werden. Indem das Papier gewaschen wird, wobei jedoch

ein nachheriges Puffern der Blätter erforderlich ist, werden die Verluste auf ein Mini¬

mum beschränkt.

Unsere eigenen Untersuchungen zur Frage der Adsorptionsverluste im Papier

ergaben folgendes:

- 41 -

Valin, Leucin und Methlonin wurden mit Butanol-Eisessig-Wasser, dessen

Front 35 cm zurücklegte, eindimensional entwickelt. Um anders geartete Verluste

zu vermeiden, wurde die Lokalisation an Hand von Parallelstreifen durchgeführt.

Ausser den Flecken wurden auch die zurückgelegten Strecken auf das Vorhandensein

von Aminosäuren geprüft. Das Ergebnis dieser Untersuchung geht aus Tabelle 17

hervor.

Wie die in Tabelle 17 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, waren die Adsorp¬

tionsverluste bei Verwendung von Butanol im allgemeinen wesentlich kleiner, als

sie von J.F. Thompson und F.C. Steward (93) mit Phenol allein gefunden

wurden. Der Blindwert der Laufstrecken erscheint gegenüber dem Blindwert des

Papieres nicht erhöht, was bedeutet, dass auf der Laufstrecke zurückgebliebene

Aminosäuren nicht nachgewiesen werden konnten.

Tabelle 17

Die Verluste an Aminosäuren im Papier nach eindimensionaler Entwicklung im

Butanol

(Aufgetragene Menge: 0,2 Mikromole. Mittel aus 5 Bestimmungen)

Extinktion Wiedergefun- Verlust pro cm Weg Blindwert der

dene Menge Laufstrecke in

% % % des Papier-blindwertes

Valin 0,410 98,5 0,10 96

Methionin 0,389 94,5 0,36 102

Leucin 0,389 95,4 0,23 105

Ein zweiter Versuch wurde mit Phenol als Lösungsmittel durchgeführt. Wir

trugen 0, 2 Mikromole Valin in vierfacher Wiederholung auf und Hessen das Lösungs¬

mittel 30 cm laufen. Unmittelbar nach beendetem Lauf wurde die gleiche Menge Va¬

lin wieder in vier Punkten auf das noch feuchte Blatt aufgetragen, ohne sie laufen zu

lassen. Die unter sonst gleichen Bedingungen durchgeführten Messungen ergaben die

in Tabelle 18 enthaltenen Daten.

- 42 -

Tabelle 18

Durch den Lauf verursachte Valinverluste

Vor dem Lauf aufgetragen Nach dem Lauf aufgetragen

Extinktion Wiedegefundene Extinktion WiedergefundeneMenge in % Menge in %

0,394 94,7 0,408 98,0

Auch Tabelle 18 lässt einen nur geringen Adsorptionsverlust erkennen. Die ge¬

fundene Differenz von 3,3 % entspricht einem Adsorptionsverlust von 0,14 % je cm

zurückgelegten Weges.

Zusammenfassend geht aus unseren Untersuchungen hervor, dass wohl Ad¬

sorptionsverluste auftreten, wobei diese aber nicht so gross waren, dass die im Pa¬

pier zurückgebliebenen Aminosäuren sich photometrisch nachweisen Hessen. In kei¬

nem Falle überstiegen die Verluste bei den von uns untersuchten Aminosäuren 0,50

% pro cm zurückgelegten Weges.

dd) Die Verluste bei der Entfernung der Lösungsmittel

Im allgemeinen herrscht die Tendenz, bei der Papierchromatographie leicht

flüchtige Lösungsmittel zu verwenden, die mühelos und ohne Verluste an Aminosäu¬

ren zu verursachen, aus dem Papier entfernt werden können. Das einzige schwerer

flüchtige Lösungsmittel, für das bis jetzt kein ebenbürtiger Ersatz gefunden werden

konnte, ist das Phenol, dessen Entfernung aus dem Papier besondere Vorsichtsmass-

nahmen erfordert, wenn Verluste möglichst vermieden werden sollen. Solche entste¬

hen vor allem dann, wenn die Blätter, um das Lösungsmittel zu entfernen, auf über

50° C erhitzt werden. Anderseits stört, wie Tabelle 19 zeigt, nicht entferntes Phenol

die Farbreaktion im Reagenzglas.

Tabelle 19

Der Einfluss des Phenols auf die Ninhydrinreaktion im Reagenzglas

(Aufgetragene Menge: 0,2 Mikromole. Mittel aus 5 Bestimmungen)

Phenol nicht entfernt Phenol entfernt

Extinktion Extinktion

absolut in % des Eichwertes absolut in % des Eichwertes

Leucin 0,392 96 0,396 97

Valin 0,304 73 0,386 93

Phenylalanin 0,288 74 0,372 96

Tyrosin 0,308 83 0,364 98

- 43 -

Wenn Phenol im ersten Lauf verwendet wird, ist seine Entfernung notwendig,

um den zweiten Lauf nicht zu stören; wenn es im zweiten Laufe Anwendung findet,

muss es eliminiert werden, damit keine Beeinträchtigung der Farbreaktion im

Reagenzglas auftritt.

Die Entfernung des Phenols kann auf verschiedene Weise erfolgen. Am ein¬

fachsten lässt sie sich bewerkstelligen, indem man die Blätter bei Zimmertempera¬

tur hängen lässt; doch dauert es 48 Stunden und länger, bis sich alles Phenol ver¬

flüchtigt hat. L. Fowden (39) findet nach der Trocknung phenolhaltiger Blätter

während einer Stunde bei 80 C nur noch 75 % der aufgetragenen Aminosäuren wieder

und schlägt vor, um Verluste zu vermeiden, die Blätter bei Zimmertemperatur vor¬

zutrocknen und dann das restliche Phenol mit Aether auszuwaschen. R.A. B o i s -

sonnas (12) entfernt das Phenol, indem er die Blätter während 10 Minuten auf 60°C

erhitzt und anschliessend mit Aether auswäscht. In den nach dieser Vorschrift behan¬

delten Chromatogrammen konnten wir mit Ferrichlorid noch beträchtliche Mengen

an Phenol nachweisen. A.M. Smith undA.H. Agiza (85) entfernen das Phe¬

nol, indem sie zwei Stunden bei Zimmertemperatur trocknen und anschliessend wäh¬

rend vier Minuten auf 80 C erhitzen. Auch in den nach diesem Verfahren behandel¬

ten Blättern konnten wir jedoch noch Phenol feststellen.

Da das Auswaschen der Blätter mit Aether eine die Aminosäuren schonende Mass¬

nahme darstellt, versuchten wir es in der Weise durchzuführen, dass wir die Pa¬

pierbogen, nachdem sie bei 50 C vorgetrocknet worden waren, drei- bis viermal

unter einem Glasstab durch die mit Aether beschickte Chromatographierküvette

durchzogen. Das Phenol liess sich aber auf diese Weise nicht vollständig entfernen,

da die Aethermenge in den Küvetten zu gering war. Hingegen gelang es uns, das Phe¬

nol rasch und ohne die Bestimmung der Aminosäuren zu beeinträchtigen dadurch zu

entfernen, dass wir die Blätter dämpften. Es genügt schon, die Blätter in der Kapelle

drei bis vier Stunden über ein Gef äss mit siedendem Wasser zu hängen. Bei diesem

Vorgehen besteht jedoch die Gefahr, dass die Blätter zu nass werden. Es ist deshalb

besser, sie direkt heissem Dampf auszusetzen, wobei sich das Phenol in kurzer Zeit

verflüchtigt. Von den auf ein phenolhaltiges Papier aufgetragenen und heissem Was¬

serdampf ausgesetzten Aminosäuren wurden im Mittel von fünf Bestimmungen die in

Tabelle 20 angeführten Mengen wiedergefunden.

- 44 -

Tabelle 20

Der Einfluss der Heisswasserdampfbehandlung auf die Ergebnisse der chromatogra¬

phischen Aminosäurebestimmung

Es wurden wieder gefunden%

Valin 99,7Leucin 102,3Phenylalanin 98,2Methionin 100,5Tryptophan 97,9

Die Werte der Tabelle 20 lassen erkennen, dass die Behandlung der Chroma-

togramme mit heissem Wasserdampf, die zu einer vollständigen Entfernung des

Phenols führt, keine wesentlichen Verluste an Aminosäuren verursacht. Für unse¬

re Untersuchungen wurde deshalb dieses Verfahren gewählt.

ee) Der Einfluss der Lokalisationsmethode auf das Ergebnis der papierchromatogra-

phischen Aminosäurebestimmung

Bei der quantitativen Auswertung eindimensionaler Chromatogramme lässt

sich die Lage der Aminosäuren mit Hilfe eines Parallelchromatogrammes leicht

feststellen, wobei man die Aminosäuren ohne irgendwelche weitere Beeinflussung

aus dem Papierbogen ausschneiden kann.

Bei zweidimensionalen Chromatogrammen müssen die Aminosäuren vor dem

Ausschneiden irgendwie sichtbar gemacht werden, was meistens mit Hilfe einer

verdünnten Ninhydrinlösung geschieht. Da aber die Farbreaktion auf dem Papier

nicht streng quantitativ verläuft, so treten bei dieser Methode Verluste auf. Indem

eine möglichst verdünnte Ninhydrinlösung verwendet wird, lassen sie sich auf ein

Minimum beschränken.

A.J. Landua und J. Awapara (54) empfehlen für die Lokalisierung

der Aminosäureflecken eine 0,05 %-ige Ninhydrinlösung. A. M. Smith und A. H.

Agiza (85) arbeiten mit einer 0,1 %-igen Lösung und erhitzen auf 80 C während

zwei Minuten. R.A. Boissonnas (13) bringt mittels eines mit zahlreichen Me¬

tallspitzen versehenen Stempels eine 3 %-ige Ninhydrinlösung in einem Gemisch von

tertiärem Butanol, Glyzerin und Wasser auf das Papier. Nach dieser Behandlung ge¬

nügt es, die Blätter während einiger Sekunden über einem Infrarotstrahler zu erhitzen,

um die Aminosäureflecken durch einzelne kleine Punkte kenntlich zu machen. Die

durch dieses Lokalisationsverfahren zerstörte Aminosäuremenge soll weniger als

1 % betragen. Eine weitere Möglichkeit der Lokalisation besteht darin, dass die

- 45 -

Blätter 10 bis 15 Minuten bei 100° C erhitzt und alsdann ultraviolett bestrahlt werden,

wobei die Aminosäuren als fluoreszierende Flecke erscheinen. Da die verhältnis¬

mässig hohe Temperatur zu Verlusten führen kann und da schwache Aminosäure¬

flecke oft nicht erkannt werden können, ist der Anwendungsbereich dieser Methode

beschränkt. A. Pereira und J.A. Serra (76) bestimmten immerhin nach die¬

sem Verfahren verschiedene Aminosäuren in minimalen Mengen quantitativ. L.

Fowden (39) der ebenfalls nach dieser Methode arbeitete, fand, obschon er 15 Mi¬

nuten bei 100 C erhitzte, keine messbaren Verluste.

In unseren Versuchen verwendeten wir zur Lokalisation eine 0,1 %-ige Ninhy-

drinlösung und erhitzen die Blätter bei 80 C solange, bis die Aminosäureflecke

eben sichtbar wurden.

4. Zusammenfassende Beschreibung der verwendeten quantita¬

tiven, zweidimensionalen Papier ehr omatographie

Die in den vorhergehenden Abschnitten gemachten Ausführungen haben gezeigt,

dass bei der quantitativen Auswertung zweidimensionaler Chromatogramme Schwie¬

rigkeiten auftreten. Um diese nach Möglichkeit auszuschalten, hat sich auf Grund

unserer Vorversuche das folgende Vorgehen als zweckmässig erwiesen:

1. Zweidimensionale Trennung der Aminosäuren mit den beiden Lösungsmittelpaa¬

ren (Seite 23):

1. Lauf: n-Butanol-Eisessig-Wasser 1. Lauf: tert. Butanol-Methyläthylketon-

2. Lauf: Phenol-Wasser oder2 JSftert. Butanol-Methanol-Wasser

Die Entfernung des Phenols muss besonders vorsichtig erfolgen, sollen Amino¬

säureverluste vermieden werden. Als sehr schonend und trotzdem wirksam hat

sich die Behandlung der Chromatogramme mit heissem Dampf erwiesen (Seite

43).

2. Zwecks Lokalisation der Aminosäuren werden die Chromatogramme mit einer

0,1 %-igen Ninhydrinlösung besprüht und anschliessend kurz auf 80 C erhitzt

(vergl. oben).

3. Um den Blindwert der Papiere zu eliminieren, genügt es in der Regel, wenn die

Blätter gleichmässig mit einer 1 % KOH-Lösung in Methanol bestäubt und wäh¬

rend 15 Minuten bei 45° C getrocknet werden; bei der Analyse des Hefehydroly-

sates erweist es sich als notwendig, aus jedem Chromatogramm drei Papierstücke

auszuschneiden, um mit diesen eine Blindwertkorrektur zu bestimmen (Seite 34).

- 46 -

4. Die ausgeschnittenen Aminosäureflecke werden zusammen mit 5 cm gepufferter

Ninhydrinlösung nach R.A. Boissonnas in Reagenzgläser gegeben und wäh¬

rend genau 20 Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt. Alsdann werden die Glä-

3ser sofort im kalten Wasser gekühlt, worauf man die Lösungen mit 5 cm eines

Propanol-Wasser-Gemisches verdünnt und photometriert; der Blindwert des Lö¬

sungsmittels wird in gleicher Weise bestimmt (Seite 34).

5. Da bei der zweidimensionalen Entwicklung nicht zu vernachlässigende Verluste an

Aminosäuren auftreten, müssen die Eichwerte der einzelnen Aminosäuren entspre¬

chend korrigiert werden (Seite 38).

- 47 -

D. DIE ERGEBNISSE

1. Der qualitative Aminosäurenachweis in der Hefe

Vorerst wurde sowohl die alkohollösliche (vergl. Seite 16) als auch die alkohol¬

unlösliche Fraktion der Hefe nach den in Abschnitt C beschriebenen Methoden quali¬

tativ auf das Vorkommen der verschiedenen Aminosäuren untersucht. Einen zusam¬

menfassenden Ueberblick über das Ergebnis dieser Untersuchung vermittelt Abbil¬

dung 1, Seite 48.

a) Die Aminosäuren im Alkoholextrakt

Ueber die im nicht-hydrolysierten Alkoholextrakt enthaltenen, freien Amino¬

säuren gibt Abbildung 2, Seite 49, Auskunft. Mit Ausnahme von Cystin, Histidin,

Methionin und Tryptophan erwiesen sich sämtliche Aminosäuren, die im Hefeprotein

selbst festgestellt wurden, auch als frei vorkommend; es betrifft dies Alanin, Argi-

nin, Glutaminsäure, Glycin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Serin,

Threonin, Tyrosin und Valin. Zusätzlich wurden im Extrakt noch folgende stickstoff¬

haltige Verbindungen gefunden: ß -Alanin, o( -Aminobuttersäure, Y -Aminobutter-

säure, Citrullin, Ornithin, ausserdem die beiden Amide Asparagin und Glutamin so¬

wie das Tripeptid Glutathion. Dazu kamen zwei unbekannte Flecke, nämlich Nr. 27

und Nr. 28 der Abbildung 1.

Abbildung 3, Seite 49, gibt Aufschluss über die Aenderungen, die infolge der

Hydrolyse des Alkoholextraktes eintraten. Die beiden Amide Asparagin und Gluta¬

min wurden in die entsprechenden Säuren umgewandelt, während sich das Glutathion

in seine drei Bestandteile Cystin, Glutaminsäure und Glycin auflöste.

Mit Hilfe der Papierchromatographie sind in pflanzlichen Geweben neben den

seit langem bekannten, am Aufbau der Proteine beteiligten Bausteine eine ganze An¬

zahl weiterer, meist nur frei auftretender Aminosäuren gefunden worden. Ebenso

hat sich ergeben, dass zahlreiche Aminosäuren, deren Vorkommen vor der Anwendung

der Chromatographie als sehr selten betrachtet wurde, allgemein verbreitet sind.

Das/3 -Alanin, das dieser Gruppe angehört, ist in neuerer Zeit häufig nachgewiesen

worden. R.G. Westall (97) fand es in den Wurzeln von Beta vulgaris, A.C.

Hulme und W. Arthington (46) isolierten es aus Aepfeln, ferner W. Stepka

und Mitarbeiter (91) aus Grünalgen. Im nicht-hydrolysierten Extrakt der Hefe konn¬

ten wir es kaum feststellen; es trat aber nach der Hydrolyse wesentlich deutlicher in

Erscheinung, was wir nicht mit Sicherheit begründen können. ß> -Alanin ist meistens

- 48 -

Phenolo 5

200 28

o 1=9 „14/15

- „4 o17/25

16o

13o

O

23

• 3

08

ol8

oll

o2

ol

27

o 24

-

»22

o7 »12

o21

- 26

o 10

1 I

9'

°6

1... i i i i

.. Butanol

0.1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0.7 0,8

Abbildung 1 Karte der in der Hefe nachgewiesenen Aminosäuren nach zweidimen¬

sionaler Trennung mit Butanol und Phenol.

1 Alanin

2 /a -Alanin

3 o«. -Aminobuttersäure

4 jf -Aminobuttersäure

5 Arginin6 Asparaginsäure7 Asparagin8 Citrullin

9 Cystin

10 Glutaminsäure

11 Glutamin

12 Glycin13 Histidin

14 Isoleucin

15 Leucin

16 Lysin17 Methionin

18 Ornithin

19 Phenylalanin20 Prolin

21 Serin

22 Threonin

23 Tryptophan24 Tyrosin25 Valin

26 Glutathion

27 Homoserin ?

28 Unbekannt

- 49 -

(0SO

I

*

Butanol

Abbildung 2 Verteilung der im nicht-hydrolysierten Alkoholextrakt enthaltenen frei¬en Aminosäuren.

#

Ab

sr(D3O

Jk

•

Butanol

Abbildung 3 Verteilung der Aminosäuren im hydrolysierten Alkoholextrakt.

- 50 -

nur als freie Aminosäure nachgewiesen worden, kommt aber in den beiden Dipepti-

den Carnosin und Anserin und in der Pantothensäure vor. Die Vermutung liegt nahe,

dass es in der Hefe nicht frei, sondern in einer dieser Bindungen vorliegt. Auch O.

L i n d a n und E . Work (56) konnten /3 -Alanin im Alkoholextrakt von Bäckereihefe

erst nach durchgeführter Hydrolyse nachweisen.

Die X -Aminobuttersäure ist neuerdings in fast allen pflanzlichen Geweben ge¬

funden worden. Auf eine Aufzählung der einschlägigen Arbeiten muss hier verzichtet

werden. Es sei einzig auf eine Untersuchung von L . J. R e e d (79), der diese Säure

in einem Hefeextrakt nachweisen konnte, aufmerksam gemacht. Sehr zahlreich sind

auch die Berichte über das Vorkommen von c< -Aminobuttersäure in Extrakten

pflanzlicher Herkunft.

Das Citrullin konnte von uns mit Sicherheit im nicht-hydrolysierten Hefe¬

extrakt mit Hilfe von p-Dimethylaminobenzaldehyd nach C . E . Dent (24) identi¬

fiziert werden. Durch die Hydrolyse wurde es offenbar weitgehend denaturiert. J.

K. Miettinen und A.I. Virtanen (62), die das Citrullin in den Wurzeln

von Alnus nachgewiesen haben, stellten fest, dass es durch saure Hydrolyse zu ei¬

nem grossen Teil in Ornithin umgewandelt wird. Diese Umwandlung spiegelt sich in

den Abbildungen 3 und 4 sowie in den Ergebnissen der quantitativen Untersuchungen

der Hefe (Tabelle 21, Seite 53), deutlich wieder. Der Ornithinfleck hat nach der

Hydrolyse auf Kosten des Citrullins stark zugenommen. Neuerdings ist das Citrullin

auch von C.B. Coulson (23) im Aethanolextrakt von Luzerneheu und von J. Ko-

1 o u s e k und C.B. Coulson (49) in Samen von verschiedenen Wiesenpflanzen ge¬

funden worden.

Ornithin wird verschiedentlich als eine in Pflanzen frei vorkommende Verbin¬

dung erwähnt. K. Miettinen undA.J. Virtanen (62) stellten es in Alnus

fest. Ein Hinweis auf das mögliche Vorkommen von Ornithin in pflanzlichem Mate¬

rial (Zuckerrübe) findet sich auch bei J. Vavruch (96). J. Close und Mitar¬

beiter (20) wiesen Ornithin in Manioc nach, doch scheint es in diesem Falle während

der Zubereitung des Materials durch die Einwirkung von Arginase auf Arginin gebil¬

det worden zu sein.

In unmittelbarer Nähe des Alanins und Threonins wurde von uns nach der Hydroly¬

se ein äusserst schwacher Fleck (Nr. 27 der Abbildung 1) sichtbar. Trug man den Ex¬

trakt konzentrierter auf, wurde er vom Alanin und Threonin teilweise überdeckt. Ein

Bericht von J. K. Miettinen und Mitarbeitern (63) über das Vorkommen von

Homoserin in Erbsenpflanzen brachte uns auf den Gedanken, es könnte sich beim

Fleck Nr. 27 ebenfalls um Homoserin gehandelt haben. Versuche mit reinem Homo¬

serin zeigten, dass sich dieses mit jenem Fleck tatsächlich zur Deckung bringen

liess. Einer quantitativen Bestimmung war er nicht zugänglich.

- 51 -

Der andere, mit Nr. 28 bezeichnete Fleck konnte nicht identifiziert werden.

Möglicherweise handelte es sich um Aethanolamin, das von J.K. Miettinen

und A.J. Virtanen (62) in geringen Mengen in den Wurzeln von Alnus festge¬

stellt wurde. Weiter könnte auch die von J. K. Miettinen und Mitarbeitern

(63) aus Erbsenpflanzen isolierte Piperidin-2-Carboxylsäure in Frage kommen.

Diese beiden Verbindungen besitzen in Phenol annähernd die gleichen Rf-Werte wie

unser Fleck Nr. 28.

O. Lindan und E.Work (56) haben die Zusammensetzung der aethanol-

löslichen und der aethanolunlöslichen Fraktion von Bäckerei und Brauereihefe un¬

tersucht. Mit wenigen Ausnahmen stimmen die von uns mit Torula utilis erhaltenen

Ergebnisse der qualitativen Analyse mit ihren Angaben überein. Bemerkenswert ist,

dass auch sie das Vorkommen von oC - und % -Aminobuttersäure sowie von ß -Alanin

nachweisen konnten. In Abweichung von unserer Analyse fanden die genannten Auto¬

ren unter den freien Aminosäuren auch Histidin, während Citrullin und die Verbin¬

dung Nr. 27 von ihnen nicht beobachtet wurde. Sie erhielten allerdings aus Bäckerei¬

hefe einen unbekannten Fleck, der gemäss seinem Rf-Wert in Phenol Citrullin dar¬

stellen könnte. Auch Lindan und Work fanden unter den freien Aminosäuren Cystin,

Methionin und Tryptophan nicht vor.

b) Die Aminosäuren in der alkoholunlöslichen Fraktion

Die Hauptmenge der Aminosäuren in der alkoholunlöslichen Fraktion wird

durch das Hefeprotein geliefert. Nach der sauren Hydrolyse des Rückstandes der

Alkoholextraktion waren die folgenden Aminosäuren nachweisbar (vergl. Abbildung

4, Seite 52): Alanin, Arginin, Isoleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin,

Serin, Threonin, Tyrosin und Valin. Im alkalischen Hydrolysat wurde zusätzlich

das Tryptophan nachgewiesen.

Dieses Ergebnis deckt sich fast vollständig mit demjenigen, das O. Lindan

und E. Work (56) bei der Analyse von Brauereihefe gefunden haben. Ein Unterschied

zu unserem Befund zeigt sich immerhin darin, dass die genannten Autoren im Pro¬

tein der Brauereihefe Ornithin feststellten. Anderseits konnten sie von den durch uns

im Alkoholextrakt zusätzlich bestimmten Aminosäuren nur das ß -Alanin nachweisen.

K. Felix und J. Pendel (32) fanden im Eiweiss von Torula utilis auch Oxy-

prolin. Dass diese Aminosäure in Hefe zugegen ist, wurde unseres Wissens bis jetzt

durch keine weitere Arbeit bestätigt.

- 52

w

jP(P

f

-Butanol

Abbildung 4 Verteilung der Aminosäuren in der alkoholunlöslichen Fraktion.

2. Das Ergebnis der quantitativen Aminosäurebestimmung

Um die Aminosäuren unserer Hefen quantitativ bestimmen zu können, wurden

die verschiedenen Hefelösungen je nach dem Gehalt an der zu bestimmenden Amino-

3säure gemäss der in Abschnitt C beschriebenen Methode in Mengen von 5 bis 20 mm

aufgetragen. Um möglichst kleine Flecke zu erhalten, erfolgte nach einem je 2 bis

33 mm zählenden Auftrag eine Zwischentrocknung. Die Ergebnisse der quantitativen

Analyse wurden in Gramm Aminosäurestickstoff, bezogen auf 100 Gramm Totalstick¬

stoff, ausgedrückt. Die einzelnen Werte stellen Mittelwerte aus drei bis fünf Einzel¬

bestimmungen dar. Da eine saubere Trennung von Leucin und Isoleucin, wie schon

erwähnt (Seite 26), nicht zu erreichen war, ist es durchaus möglich, dass die ange¬

gebenen Werte für die beiden Aminosäuren mit einer gewissen gegenseitigen Ver¬

schiebung behaftet sind.

- 53 -

a) Die quantitative Aminosäurebestimmung im Alkoholextrakt

Auch die quantitative Bestimmung wurde sowohl im nicht-hydrolysierten als

auch im hydrolysierten Alkoholextrakt ausgeführt. In Tabelle 21, sind die Ergebnis¬

se zusammengestellt.

Tabelle 21

Der Aminosäuregehalt des Alkoholextraktes

g Aminosäure-N auf 100 g Extrakt-N

nicht hydroly- hydrolysier- Zunahme nach

sierter Extrakt ter Extrakt der Hydrolyse

Alanin 10,86 12,02 1,16fi> -Alanin Spur 0,16 0,16e< -Aminobuttersäure 0,13 0,25 0,12X -Aminobuttersäure 0,79 X

Arginin 5,24 X

Asparaginsäure 2,13 3,39 1,26Asparagin 2,99 -

Citrullin 4,13 X

Cystin 0,72 0,72Glutaminsäure 17,58 25,80 8,22Glutamin 12,09 -

Glycin 0,74 3,26 2,52Histidin - -

Isoleucin 0,37 0,40 0,03Leucin 0,47 0,54 0,07Lysin 1,52 1,91 0,39Methionin - -

Ornithin 1,10 2,07 0,97Phenylalanin 0,61 X

Prolin 1,87 X

Serin 1,76 1,96 0,20Threonin 1,33 1,80 0,47Tryptophan - -

Tyrosin 0,52 X

Valin 1,84 X

x = gleicher oder kleinerer Wert - = nicht vorhanden

Wie bereits im ersten Teil dieser Arbeit gezeigt wurde (Seite 16), trat nach

der Hydrolyse des Alkoholextraktes kaum eine Zunahme des o^ -Aminostickstoffes

ein, was zu beweisen schien, dass Peptide im Extrakt nur in geringer Menge ent¬

halten waren. Der o^-Aminostickstoff ist jedoch hinsichtlich dieser Aussage nicht

ganz zuverlässig, da das Ergebnis seiner Bestimmung möglicherweise als Differenz

- 54 -

zwischen entstandenen Hydrolysenverlusten und den durch Aufspaltung von Peptiden

neu hinzugekommenen <* -Aminosäuren in Erscheinung tritt. Die quantitative papier-

chromatographische Analyse ergab denn auch, dass nach der Hydrolyse zahlreiche

Aminosäuren mehr oder weniger deutlich zugenommen hatten (vergl. Tabelle 21,

Seite 53).

Der Anstieg an Cystin, Glutaminsäure, Glycin und Asparaginsäure ist einerseits auf

die Spaltung des Glutathions, anderseits auf die Umwandlung von Asparagin und Glu¬

tamin zurückzuführen. Aus dem Anstieg des Glycinstickstoffes um 2,52 % nach der

Hydrolyse lässt sich, vorausgesetzt, dass kein Glycin aus andern Peptiden stammte,

ein Glutathiongehalt der Hefetrockensubstanz von 0,52 % berechnen. J. C .Som o-

gyi (88) gibt ganz allgemein für Hefe einen Glutathiongehalt der Trockensubstanz

von 0,5 bis 0,7 % an, während H. Fink und F.Just (34) für Torulahefen einen

solchen von 0,43 bis 0,46 % mitteilen. Der Cystingehalt des hydrolysierten Extrak¬

tes liegt allerdings weit unter dem aus der berechneten Glutathionmenge zu erwarten¬

den Wert, was offenbar damit zusammenhängt, dass ein Teil dieser Aminosäure bei

der Hydrolyse zerstört wurde.

Auch die nach der Hydrolyse festgestellte Zunahme des Asparaginsäurestick-

stoffes, die, bezogen auf den Gesamtextraktstickstoff, 1,26% betrug, stimmt nicht

ganz mit dem Wert überein, der sich gemäss dem Asparagingehalt hätte ergeben

sollen (1, 50 %). Im weitern ist zu bemerken, dass die durch die Hydrolyse des Gluta¬

mins herbeigeführte Zunahme des Glutaminsäurestickstoffs 6,05 statt 8,22 % hätte

betragen sollen. Die Differenz zum gemessenen Wert von 8,22 % dürfte, vorausge¬

setzt, dass keine anderen glutaminsäurehaltigen Peptide vorhanden waren, auf die

aus dem Glutathion stammende Glutaminsäure zurückzuführen sein. Das Glutathion

hätte somit 2,17 % Glutaminsäurestickstoff geliefert, ein Wert, der nicht schlecht

mit der zuvor diskutierten und 2,52 % betragenden Zunahme an Glycinstickstoff

übereinstimmt. Die nach der Hydrolyse festgestellte Zunahme des Ornithins kann auf

Grund der schon erwähnten Untersuchung von K. Miettinen und A.I. Vir-

tanen (62) Seite 50) auf die Umwandlung von Citrullin zurückgeführt werden.

Die aus Tabelle 21 hervorgehende Zunahme der übrigen Aminosäuren deutet

darauf hin, dass in der alkohollöslichen Fraktion noch weitere Peptide vorhanden

waren. O. Lind an und E. Work (56) stellten nach der Hydrolyse des von ihnen

untersuchten Extraktes eine Vergrösserung der Flecke von Alanin, ß -Alanin, o< -

Aminobuttersäure, V -Aminobuttersäure, Arginin, Asparaginsäure, Cystin, Gluta¬

minsäure, Glycin und Lysin fest. Nach unsern Untersuchungen nahm der Anteil dieser

Aminosäuren infolge der Hydrolyse ebenfalls zu, mit Ausnahme der Y -Aminobutter¬

säure und des Arginins, deren Anteil unverändert blieb. Dagegen beobachteten wir,

abweichend von dem Ergebnis der erwähnten Autoren, auch eine Zunahme an Leucin,

Isoleucin, Serin und Threonin.

- 55 -

Am Aufbau des nicht-hydrolysierten Alkoholextraktes sind zahlreiche Amino¬

säuren beteiligt, doch liegt die Hauptmenge des Aminosäurestickstoffes in Form nur

einiger weniger Aminosäuren vor. Die Glutaminsäure bestritt in unserem Falle

17,58 %, das Glutamin 12,09 % und das Alanin 10,86 % des Aminosäurestickstoffs

dieser Fraktion, was zusammen für diese drei Aminosäuren 40, 53 % ergibt. Eine

weitere Gruppe von Aminosäuren des nicht-hydrolysierten Extraktes ( ß, -Alanin,o<-und ^-Aminobuttersäure, Glycin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin) beteilig¬

ten sich je mit weniger als 1 % am Aminosäurestickstoff. Die übrigen Aminosäuren

waren zu 1 bis 6 % an der Zusammensetzung dieser Stickstoffraktion beteiligt.

Wie wir hat auch P . Roine (81) die Zusammensetzung der löslichen Stick¬

stoffraktion von Torula untersucht und dabei festgestellt, dass das Wachstumssta¬

dium und insbesondere die Ernährung der Hefe den Gehalt an löslichem Stickstoff

und dessen Zusammensetzung stark beeinflussen. Diese Feststellung mag es er¬

klärlich machen, warum die in Tabelle 22 zusammengestellten Untersuchungsergeb¬

nisse verschiedener Autoren grosse Unterschiede erkennen lassen.

Tabelle 22

Verteilung einzelner Fraktionen des löslichen Hefestickstoffes im nicht-hydrolysier¬

ten Extrakt

In % des löslichen Gesamt-N:

Roine (76)

Torulahefe

Normal- N-arm er- N-arme Hefe

hefe nährte Hefe mit (NH.)„SO.

ernährt4* *

Lindan Eigene Unter-

und suchungenWork(51)

Brauerei Torulahefe

hefe

Amid-N

Dirkarbonsäure-N

8

27

5

25

35

20

5

815,119,7

N-der basischen

Aminosäuren25 15 5 11 6,8

Alanin-N 10 5 25 4 10,9

Neben der unterschiedlichen Ernährung und der verschiedenen Herkunft der Hefen,

dürfte für die aus Tabelle 22 hervorgehende Unterschiedlichkeit der Ergebnisse auch

der Umstand verantwortlich sein, dass die Analysen nach verschiedenen Methoden

durchgeführt wurden. P. Roine bestimmte die Glutaminsäure, die Asparaginsau-

- 56 -

re, das Glutamin und das Asparagin einzeln. Der Glutaminsäurestickstoff macht nach

seinen Angaben im nicht-hydrolysierten Extrakt einer normal ernährten Hefe 94 % des

Dikarbonsäurestickstoffs und der Glutaminstickstoff 79 % des Amidstickstoffs aus.

In unsern Untersuchungen lauten die entsprechenden Zahlen für Glutaminsäure 89,2

% und für Glutamin 80,2 %.

In Tabelle 23, Spalte 1 ist von jeder Aminosäure der Tabelle 21 jeweils der

Tabelle 23

Der Aminosäuregehalt der Holzzuckerhefe

g Aminosäurestickstoff in 100 g Stickstoff

der der der

alkohollösli¬ alkoholunlösli¬ Gesamt]

chen Fraktion chen Fraktion

Alanin 12,02 5,11 5,91

[i> -Alanin

o<- -Aminobuttersäure0,16 0,020,25 - 0,03

Jf -Aminobuttersäure 0,79 - 0,10Arginin 5,24 8,65 8,12Asparaginsäure 2,13 6,81 6,41Asparagin 2,99 - 0,37Citrullin 4,13 - 0,52Cystin 0,72 0,54 0,56Glutaminsäure 19,75 7,78 9,18Glutamin 12,09 - 1,51Glycin 3,26 4,30 4,12Histidin - 3,67 3,17Leucin 0,54 5,09 4,46Isoleucin 0,40 2,38 2,10Lysin 1,91 10,23 9,06Methionin - 0,73 0,63Ornithin 1,10 - 0,14Phenylalanin 0,61 2,31 2,07Prolin 1,87 2,19 2,12Serin 1,96 3,45 3,22Threonin 1,80 4,13 3,78Tryptophan - 0,92 0,79Tyrosin 0,52 1,09 1,01Valin 1,84 5,08 4,61

Total 76,08 74,46 74,01

höhere der im hydrolysierten bzw. im nicht-hydrolysierten Extrakt gefundenen Wer¬

te eingetragen worden. Nur bei den Dikarbonsäuren und beim Ornithin mussten der

Aufspaltung der Amide bzw. des Citrullins wegen die kleineren Werte des nicht-

hydrolysierten Extraktes berücksichtigt werden. Der im nicht-hydrolysierten Extrakt

- 57 -

bestimmte Glutaminsäureanteil wurde um den vermutlich aus dem Glutathion stam¬

menden Glutaminsäurestickstoff von 2,17 % erhöht.

Nach Tabelle 23 macht der gesamte, im Alkoholextrakt papierchromatogra-

phisch bestimmte Aminosäurestickstoff unter Einschluss der Amide 76,08 % des

löslichen Stickstoffes aus. Der aus dieser Analyse berechnete ©< -Aminostickstoff,

der bei der Bestimmung nach Slyke reagieren würde, nimmt mit 58,97 % am lösli¬

chen Stickstoff teil. Bei dieser Berechnung wurde ausser dem gesamten C* -Amino¬

stickstoff auch der in der to -Stellung vorhandene Stickstoff des Lysins und des

Ornithins zu 95 % berücksichtigt. Gemessen an dem im Alkoholextrakt nach van

Slyke bestimmten o< -Aminostickstoff (65,63 %, Seite 19) sind somit 89,85 % des

&s-Aminostickstoffs wiedergefunden worden.

Der Anteil des identifizierten am totalen Stickstoff der alkohollöslichen Frak¬

tion macht insgesamt 78,62 % aus (76,08 % Aminosäurestickstoff + 2,54 % Am¬

moniakstickstoff, Seite 19). Der Rest dürfte zum grössten Teil aus Nucleotidstick-

stoff bestanden haben, der nach P. Roine (81) in Normalhefe zu 18 % am lösli¬

chen Stickstoff beteiligt ist. Diese Zahl darf immerhin in Anbetracht der Abhängig¬

keit des Nucleotidstickstoffanteiles von den Ernährungsbedingungen der Hefe nicht

vorbehaltlos auf unsere Untersuchung übertragen werden, umso mehr, als Roine

die lösliche Fraktion durch Extraktion mit Trichloressigsäure gewann.

b) Die quantitative Aminosäurebestimmung in der alkoholunlös¬

lichen Fraktion

Aus dem früher gesagten (Seite 19) ging hervor, dass der Hauptanteil der al¬

koholunlöslichen Stickstoffraktion unserer Hefe als polypeptidisch gebunden zu be¬

trachten ist.

Der quantitative Aufbau der aus 18 Aminosäuren bestehenden alkohollöslichen

Fraktion ist aus Tabelle 23, Seite 56, Spalte 2, ersichtlich. An ihrem Stickstoff

beteiligte sich der papierchromatographisch bestimmte Aminosäurestickstoff mit

74,46 %. Aus diesem Aminosäureanteil lassen sich 62, 61 % o< -Aminosäurestick¬

stoff berechnen (vergl. oben), was 91,59% des in der hydrolysierten, alkohol¬

unlöslichen Fraktion tatsächlich bestimmten o< -Aminostickstoffes (68,36 %, Seite

19) ausmacht. Unter Einrechnung des Huminstickstoffes (3,72 %, Seite 19) und des

Ammoniakstickstoffes (7,41 %, Seite 19) sind in der alkoholunlöslichen Fraktion

85,59 % des in ihr enthaltenen Stickstoffes identifiziert worden.

- 58 -

E. DIE BESPRECHUNG DER ERGEBNISSE

Bei der nachfolgenden Besprechung stützen wir uns auf die in Tabelle 23,

Spalte 3 enthaltenen Daten, welche sich auf die Zusammensetzung der gesamten, in

der Hefe enthaltenen Stickstoffraktion beziehen. In Tabelle 24, Seite 59, werden die¬

se Daten einigen Angaben der Literatur gegenübergestellt.

Die zum Teil recht grossen Unterschiede zwischen den in Tabelle 24 aufgeführ¬

ten Analysen könnten sich einerseits aus der Verschiedenheit des Untersuchungs¬

materials, anderseits aus der Ungleichheit der angewandten Untersuchungsmethodik

erklären lassen. Da nach H . Fink und F . Just (33) Bierhefe und Torulahefe

und nach R .J. Block und D. Bolling (7) Bierhefe und Bäckereihefe in Be¬

zug auf den Aminosäuregehalt des Proteins nur wenig voneinander abweichen, dürften

die in Tabelle 24 zutage tretenden Differenzen im allgemeinen weniger durch die

Unterschiedlichkeit des Untersuchungsmaterials als durch Unterschiedlichkeiten in

der Methodik der Aminosäurebestimmung verursacht worden sein (vergl. dagegen

Seite 64).

Von den angeführten Autoren haben einzig K. Nehring und E. Schwert-

feger (71) die quantitative Bestimmung der Aminosäuren grundsätzlich nach der

gleichen Methode wie wir durchgeführt (Spalte 2 der Tabelle 24). Ein Vergleich mit

ihren Ergebnissen zeigt, dass unsere Werte für Histidin, Tryptophan, Methionin

und Cystin ziemlich tiefer liegen (bezogen auf unsere Daten, 20 % und mehr). Die¬

ser Unterschied mag zum Teil auf die verschiedene Aufarbeitung des Materials zu¬

rückzuführen sein. Im Gegensatz zu der von uns angewandten Hydrolyse, die 24

Stunden dauerte, hydrolysierten Nehring und Schwertfeger nur 12 Stunden, für die

Bestimmung des Cystins sogar nur 5 Stunden, was sich offenbar auf die Erfassung

der genannten Aminosäuren vorteilhaft auswirkte. Das Tryptophan, dessen Anteil

wir aus dem alkalischen Hydrolysat erhielten, wurde von Nehring nach H . Roth

und P. Schuster (83) direkt im Protein bestimmt. Im übrigen zeigen unsere Er¬

gebnisse eine recht gute Uebereinstimmung mit den von Nehring und Schwertfeger

gefundenen Werten.

J.W. Spanyer und A.T. Thomas (89) bestimmten den Aminosäurege¬

halt von Brauereihefe nach eindimensionaler Trennung mit Hilfe eines Densitometers

direkt auf dem Papier (Spalte 3 der Tabelle 24). Ihre Befunde für einige Aminosäu¬

ren, z.B. für Alanin, Glutaminsäure und Glycin sind auffallend tief, während für den

Methioningehalt ein verhältnismässig hoher Wert angegeben wird. O. Lindan und

E.Work (56) verwendeten für ihre Untersuchungen das "spot-dilution"-Verfahren,

das nur als halbquantitativ angesehen werden darf (Spalte 4 der Tabelle 24). Dies ist

(32)

Pendl

J.

und

Felix

K.

9)(33)

Just

F.

und

Fink

H.

6)(8

9)Thomas

A.T.

und

Spanyer

J.W.

3)

(11)

Block

J.

R.

8)(5

2)Schlottmann

F.

und

Kraut

H.

5)(71)

Schwertfeger

E.

und

Nehring

K.

2)

(53)

Cheldelin

V.H.

und

Kurth

E.F.

7)(5

6)Work

E.

und

O.Lindan

4)Analyse

Eigene

1)

5,99

4,34

4,67

77

2,99

3,98

4,61

Valin

1,38

1,57

3,22

1,12

4,04

0,49

3,47

2,93

1,35

2,5

0,9

26

34

1,21

2,20

1,01

3,40

1,01

0,79

3,78

Tyrosin

Tryptophan

Threonin

2,77

2,09

2,39

2,31

331

433

3,83

2,01

1,74

3,22

2,12

2,07

Serin

Prolin

Phenylalanin

0,76

3,26

1,17

8,39-9,59

9,97

11,6

11,4

10,8

8

0,8

8

1,29

8,02

0,96

8,18

0,14

0,63

9,06

Ornithin

Methionin

Lysin

2,14

1,51

5,01

4,01

5,08

4,80

4,67

4,80

5,26

4,1

537

537

3,20

2,20

2,54

7,54

4,67

4,46

2,10

3,17

Leucin

Isoleucin

Histidin

5,71

70,3

12

7

11

1,28

4,22

4,12

1,51

9,18

Glycin

Glutamin

Glutaminsäure

0,42

0,80

1,71

1,6

1,50

0,5

1,25

0,4

0,67

0,56

0,52

0,37

Cystin

Citrullin

Asparagin

1,81

5,20

8,04-10,05

11,79

10,92

11,3

7

100,2

850,1

3,55

6,63

9,09

6,41

8,12

0,10

eäur

agins

Aspar

Arginin

-Aminobuttersäure

Jf

5,56

0,05

9

0,4

0,4

92,85

0,03

0,02

5,91

-Aminobuttersäure

o<

-Alanin

ßAlanin

hefe

Torula-

9

Hefe

8

hefe

Torula-

7

kerhefe

Holzzuk-

6

hefe

Bier¬

5

hefe

hefe

Brauerei¬

Bäckerei-

4

hefe

Bier¬

3

hefe

Futter¬

2

util

is)

(Torula

hefe

Holzzucker¬

1

Hefeartun

ten)

(s.

Autor

Gesamt-N)

g100

auf

Aminosäure-N

(Gramm

Hefen

verschiedener

Aminosäuren

an

Gehaltes

des

Vergleich

24

Tabelle

- 60 -

vermutlich der Grund, warum einzelne Werte dieser Autoren von den Ergebnissen

der andern Analysen besonders stark abweichen.

Dass offenbar für die Uebereinstimmung bzw. Nichtübereinstimmung der in Ta¬

belle 24 wiedergegebenen Resultate die Methodik der Aminosäurebestimmung ent¬

scheidender war als die Art des Untersuchungsmaterials, geht deutlich aus dem Ver¬

gleich der Analysen von H. Kraut und F. Schlottmann (52) einerseits und

von H. Fink und F. Just (33) anderseits hervor (Spalte 5 und 6 der Tabelle 24).

Beide Analysen wurden nach der gleichen Methode, nämlich nach der Methode van

Slyke durchgeführt, wobei ihre Ergebnisse fast durchweg sehr gut übereinstimmen,

obwohl es sich in einem Falle um Bierhefe, im andern um Holzzuckerhefe handelte.

F.A. C o s o n k a (22) hält allerdings die eben genannte Methode für Hefe,

ihres hohen Gehaltes an Purin- und Pyrimidinstickstoff wegen, als nicht sehr geeig¬

net. H. Fink und F. Just (35) weisen selbst darauf hin, dass die Cystinbe-

stimmung nach der van Slyke-Methode den unzuverlässigsten Wert ergebe. E .F

.

Kurth und V.H. Cheldelin (53) arbeiteten mit Hilfe mikrobiologischer Me¬

thoden und erzielten dabei Resultate, die mit einigen Ergebnissen anderer in Tabel¬

le 24 zitierten Autoren recht gut übereinstimmen (Spalte 7 der Tabelle 24). Die in

Spalte 8 und 9 der Tabelle 24 angeführten Daten wurden mit Hilfe von Methoden ge¬

wonnen, auf deren Beschreibung wir hier verzichten können.

Im Vergleich zu den in Tabelle 24 enthaltenen Literaturangaben liegt die Mehr¬

zahl der von uns gefundenen Werte eher an der unteren Grenze. Dies dürfte wenigstens

teilweise mit der von uns verwendeten Methode der Papierchromatographie zusam¬

menhängen, die eine gute Isolierung der zu bestimmenden Aminosäuren gestattete,

so dass Fremdsubstanzen, die beispielsweise bei Fällungsreaktionen leicht mit

eingeschlossen werden, kaum mitbestimmt wurden.

Bei der Eiweissbausteinanalyse ist den essentiellen Aminosäuren be¬

sondere Aufmerksamkeit zu schenken, da diese für den ernährungsphysiologischen

Wert eines Proteins entscheidend sind. Wie aus chemischen Analysen und Fütter¬

ungsversuchen geschlossen werden kann, nimmt das Hefeeiweiss eine Zwischen¬

stellung zwischen tierischem und pflanzlichem Eiweiss ein. Nach einer Zusam¬

menstellung von H. Kraut und F. Schlottmann (52) (Tabelle 25, Seite 61)

weist das Hefeeiweiss im Vergleich zu tierischem Eiweiss einen geringeren

Histidin-Tryptophan- u.U. auch Tyrosingehalt auf. Umgekehrt übertrifft das Hefe¬

eiweiss pflanzliches Eiweiss beträchtlich in seinem Gehalt an Arginin und Lysin.

- 61 -

Tabelle 25

Der Gehalt der Hefe und anderer Lebensmittel an essentiellen Aminosäuren

(Aminosäure-N in % des Gesamt-N)

Fleisch Kasein Lactalbumin Hefe Roggen Kartoffel

Arginin 12,6 7,4 7,2 11,0 7,6 8,3Histidin 10,4 6,2 4,6 3,0 2,1 3,8Lysin 7,5 10,3 12,2 11,4 1,2 3,9Cystin 1,5 0,2 1,3 1,6 0,2 3,1Tryptophan 1,2 1,5 1,5 0,9 0,9 ?

Tyrosin ? 5,3 ? 2,5 1,2 2,0

Ein wichtiges Ziel der qualitativen und quantitativen Aminosäurebestimmung

besteht darin, in Ergänzung oder an Stelle von Tierversuchen Aussagen über die

biologische Wertigkeit der Stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion zu erlauben. Im fol¬

genden soll erörtert werden, inwieweit dieses Ziel verwirklicht werden kann.

Verhältnismassig einfach scheint sich die Beurteilung der biologischen Wertig¬

keit einer stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion bzw. eines Proteins auf Grund der

chemischen Analyse in der Weise zu gestalten, dass man den ermittelten Gehalt an

essentiellen Aminosäuren dem Aminosäurebedarf der betreffenden Tierart direkt

gegenüberstellt. Damit diese Methode zu brauchbaren Ergebnissen führt, müssen

jedoch verschiedene Voraussetzungen erfüllt sein. Zu diesen gehören u. a. die Kennt¬

nisse, in welchem Umfange die in einem Futter festgestellten Aminosäuren ausnutzbar

sind; vor allem aber ist es notwendig, dass man über den Bedarf der verschiedenen

Tierkategorien an essentiellen Aminosäuren möglichst gut unterrichtet ist. Gerade

in dieser Beziehung bestehen heute noch grosse Lücken. Bis jetzt sind umfassende

Daten betreffend den Bedarf an essentiellen Aminosäuren nur am Kücken und Ferkel

sowie an der Ratte gewonnen worden. (Tabelle 26,Seite 62).

Am besten ist der Aminosäurebedarf der Ratte abgeklärt. Diesem Bedarf

kommt, wie neuere Untersuchungen gezeigt haben, allgemeinere Bedeutung zu. So fan¬

den E.T .

M e r t z und Mitarbeiter (60), dass Ferkel mit einer Aminosäuremischung,

in der die Proportionen der einzelnen Komponenten denjenigen entsprachen, die für

die Ratte optimal sind, ein ausgezeichnetes Wachstum aufweisen. Auch der von A.A.

Albanese (1) ermittelte Aminosäurebedarf des Säuglings ist demjenigen der Ratte

ähnlich.

Eine neue Methode zur Beurteilung des ernährungspysiologischen Wertes der

stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion auf Grund der Bausteinanalyse besteht darin,

dass das Ergebnis dieser Analyse mit einem möglichst vollwertigen Bezugseiweiss,

z.B. Eiereiweiss, verglichen wird. Dieser Vergleich führt zunächst zur Berechnung

- 62 -

Tabelle 26

Bedarf an essentiellen Aminosäuren bei Kücken, Ferkel und Ratte

Nach F.B. Morrison (68) nach W.C. Rose

Kücken Ferkel säugende Ratte

in % des in % des in % des

Futters Futters Futters

Lysin 1,00 1,00 1,0Leucin 1,40 0,60 0,8Valin 0,80 0,40 0,7Phenylalanin 1,60 0,46 0,7Methionin 0,70 0,22* 0,6Isoleucin 0,60 0,70 0,5Threonin 0,60 0,40 0,5Histidin 0,15 0,20 0,4Arginin 1,70 0,20 0,2Tryptophan 0,15 0,20 0,2Glycin 1,00 — —

* Normaler Cystingehalt vorausgesetzt

des sog. Eiproteinverhältnisses (EPV):

FPV -

Aminosäure im Versuchsprotein .„„

Aminosäure im Eiprotein

K. Nehring (69) verwendet anstelle des Eiproteins Kuhmilchprotein als

Bezugseiweiss und ermittelt daraus das Milchproteinverhältnis (MPV) wie folgt:

MPVAminosäure im VersuchsproteinAminosäure im Milchprotein

100

H. Mitchell und R. J. Block (64) greifen zum Zwecke der Bewertung

eines Proteins auf Grund der Eiweissbausteinanalyse nur die Aminosäure mit

dem kleinsten Eiproteinverhältnis heraus und berechnen dann den sog. "chemical

score". B . L . Oser (73) ermittelt einen EAA-Index (essential amino acid index),

indem er das Eiproteinverhältnis aller essentiellen Aminosäuren (n) heranzieht und

folgende Formel verwendet:

EAA-Index y EPV • EPV.

a bEPV_

Methionin und Cystin sowie Leucin und Isoleucin werden in dieser Formel jeweils

nur als eine Aminosäure gerechnet.

K. Nehring (70) schlägt neuerdings vor, als Bezugseiweiss für die Bewer¬

tung von Eiweissfuttermitteln nicht die Kuhmilch, sondern die Sauenmilch heranzuziehen.

In Tabelle 27, Seite 63 finden sich Angaben über den Gahalt der verschiedenen

in Frage kommenden Bezugsproteine an essentiellen Aminosäuren und die daraus auf

Grund unserer Hefeanalyse berechneten EAA-Indexe.

- 63 -

Tabelle 27

Berechnung des EAA-Indexes der Holzzuckerhefe

Aminosäuregehalt der Bezugsproteine und der Hefe in % des Roh¬

proteins

Vollei Kuhmilch Sauenmilch Holzzuckerhefe

Block Block Beacon Beacon eigene Arbeit

(11) (11) (2) (2)

Lysin 7,0 8,7 8,53 7,39 7,56Leucin 9,2 11,0 9,20 8,03 6,68Isoleucin 7,7 7,5 5,85 4,24 3,14Valin 7,2 7,0 7,12 5,04 6,17Phenylalanin 6,3 5,5 4,76 3,49 3,90Methionin 4,0 3,2 2,65 1,36 1,07Cystin 2,4 1,0 - - 0,76Threonin 4,3 4,7 4,35 3,54 5,15Histidin 2,4 2,6 2,70 2,18 1,87Arginin 6,6 4,2 3,53 5,72 4,04Tryptophan 1,5 1,5 - - 0,92

EAA-Index der

Holzzuckerhefe 66,7 72,7 76,2 88,7

BegrenzendeAminosäuren:

1.* Methionin

Cystin

Methionin

Cystin

Methionin Arginin

2.** Leucin Leucin Leucin Methionin

Isoleucin Isoleucin Isoleucin

* Kleinste EPV- bzw. MPV-Werte** Nächst höhere EPV-bzw. MPV-Werte

Wie aus Tabelle 27 hervorgeht, ist die Höhe des EAA-Indexes je nach der Wahl

des Bezugsproteins sehr variabel. Mit Kuhmilch werden allgemein höhere Werte er¬

zielt als mit Eiereiweiss. Auffallend ist der von uns berechnete hohe Index bei Ver¬

wendung von Sauenmilcheiweiss als Bezugsgrösse, was auf deren im allgemeinen

geringeren Gehalt an essentiellen Aminosäuren zurückzuführen ist. K. Nehring

(70) gibt für Brauereihefe bei Verwendung von Eiereiweiss als Bezugsgrösse einen

EAA-Index von 70,6 an. In einer weiteren Arbeit berechnen K. Nehring und E.

Schwertf eger (71) für Futterhefe einen EAA-Index von 73. Es wurde bereits da¬

rauf hingewiesen (Seite 60), dass die Mehrzahl der von uns bestimmten Aminosäure¬

werte, verglichen mit den Angaben der Literatur, eher an einer untern Grenze liegen,

64 -

weshalb der von uns berechnete EAA-Index niedriger ausfiel als der von Nehring

und Schwertfeger ermittelte.

Es erhebt sich die wichtige Frage, inwieweit die auf chemischem Wege gewon¬

nenen Ergebnisse mit den Resultaten der biologischen Prüfung von Hefeeiweiss über¬

einstimmen. C.W. Hughes undS. H äuge (45) geben auf Grund ihrer Versuche

an wachsenden Ratten für getrocknete Brauereihefe, die 10 % der Ration ausmachte,

eine biologische Wertigkeit von 61 an. J.A. Goyco und F . Äsenjo (40) be¬

stimmten ebenfalls in einem Versuch mit wachsenden Ratten ausser der biologischen

Wertigkeit einer Brauereihefe auch diejenige von zwei Torulahefen, wobei die Braue¬

reihefe höhere Werte lieferte, wie die folgenden Zahlen zeigen:

Torulahefe Brauereihefe

Biologische 48 g.. „

ßq„

Wertigkeit 4Ö'0 '6 b9'd

K. Felix und J. Pen dl (32) stellten in einem Versuch mit Ratten bei 10 % Toru-

la utilis in der Gesamtration eine biologische Wertigkeit des Hefeeiweisses von 63

bis 66 fest; diese Wertigkeit konnten sie durch Zulage von Cystin auf 70 bis 77 erhö¬

hen.

Es Hegen auch Tierversuche vor, in denen das Hefeeiweiss mit einem Standard-

Eiweiss, meist Milch- oder Ei-Eiweiss, verglichen wurde. Im Vergleich zu Milchei-

weiss bestimmten H. Fink und H. Hock (36) in Versuchen mit Ratten den

Wachstumswert verschiedener Hefearten mit folgenden Relativzahlen:

Brauereinährhefe 84 %Entbitterte Brauereihefe 54 %Torulahefe auf Strohhydrolysat 64 %Torulahefe auf Buchenholz

Sulfitablauge 33 %Torulahefe auf Holzzucker 34 %

Ferner gibt A. Hock (43) für eine auf Sulfitablauge gezüchtete Torulahefe im

Vergleich zu Milcheiweiss einen Wachstumswert von 70 % an. In einem weiteren

Versuch von A. Hock (44) Hessen sowohl eine Brauereihefe als auch eine Torula¬

hefe eine Relativzahl von etwa 70 % feststellen.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die im Tierversuch ermittelten Da¬

ten für den biologischen Wert des Hefeeiweisses ausserordentlich variieren. Es ist

kaum anzunehmen, dass diese Variabilität nur auf Unterschieden und Ungenauigkeiten

der angewandten Versuchsmethodik beruht. Vielmehr muss angenommen werden, dass

zwischen den einzelnen Hefearten und selbst innerhalb derselben Art, vermutlich vor

- 65 -

allem als Folge ungleicher Wachstumsbedingungen, biologische Wertigkeitsdifferen¬

zen bestehen, die realer Natur sind. Auf Grund des früher Gesagten (vergl. Seite

59) darf vermutet werden, dass diese Differenzen im allgemeinen weniger als Folge

eines unterschiedlichen Aminosäuremusters denn als Folge einer unterschiedlichen,

durch zahlreiche Faktoren bedingten Ausnützbarkeit dieses Musters in Erscheinung

tritt. Diese Vermutung erhärtet die an sich nicht neue Feststellung, wonach Aussa¬

gen über die biologische Wertigkeit der stickstoffhaltigen Nahrungsfraktion, die sich

ausschliesslich auf qualitative und quantitative Aminosäurebestimmungen stützen,

nicht ohne stark einschränkende Vorbehalte gemacht werden dürfen. Anderseits ist

ohne weiteres anzuerkennen, dass die chemische Analyse der stickstoffhaltigen

Nahrungsfraktion hinsichtlich deren biologische Wertigkeit wertvollste Anhaltspunkte

zu liefern vermag und dass diesen Anhaltspunkten ein um so grösserer Aussage¬

wert zukommt, je umfassender und zuverlässiger die Analyse ist, auf die sie sich

stützen.

Hinsichtlich der in Tabelle 27 angeführten Werte für die kleinsten EPV bzw.

EMP und für den EAA-Index, welche Werte geeignet sein sollen, die biologische

Wertigkeit des Hefeeiweisses mit einiger, wenn auch keineswegs absoluter Sicher¬

heit charakterisieren zu lassen, sei noch folgendes bemerkt:

Als begrenzende Aminosäuren in der von uns untersuchten Hefe (Aminosäuren

mit dem kleinsten EPV- bzw. MPV-Wert) kommen nach Tabelle 27, Seite 63, je

nach der Wahl des Bezugsproteins Methionin, Cystin, ferner Leucin, Isoleucin und

Arginin in Betracht. NachK. Nehr ing (70) sind Phenylalanin, Leucin und Me¬

thionin, nach H.H. Mitchell und R. J. Block (65) Methionin und Cystin die¬

jenigen Aminosäuren, die die biologische Wertigkeit des Hefeeiweisses begrenzen.

Im Tierversuch wurde von verschiedenen Versuchsanstellern Methionin/Cystin als

begrenzend ermittelt. A. Hock und H .Fink (42) konnten die Wachstumswir¬

kung von Brauerei- und Holzzuckerhefe bei jungen Ratten durch eine Cystinzulage

in der Höhe von 2 % des verfütterten Nahrungseiweisses bedeutend erhöhen. A.A.

Klose und H.L. Fevold (47) erzielten sowohl bei wachsenden Ratten als auch

bei Kücken durch eine Zulage von Methionin eine wesentliche Steigerung der Wachs¬

tumswirkung des Proteins von Brauerei- und Torulahefe. J. S. C h i a o und W. H.

Peter son (19) fanden bei verschiedenen Heferassen beträchtliche Unterschiede

im Gehalt an Cystin und Methionin. Torulahefen wiesen allgemein einen tieferen Ge¬

halt an schwefelhaltigen Aminosäuren auf als Brauereihefen. Wie A. Hock (44)

bemerkt, wäre es nicht richtig, die beobachtete grosse Variabilität der biologischen

Wertigkeit des Hefeeiweisses allein mit einem unterschiedlichen Gehalt an schwefel¬

haltigen Aminosäuren erklären zu wollen. Sicher spielen noch andere Faktoren eine

wichtige Rolle.

- 66 -

VonR.J. Block und H.H. Mitchell (8), von H. H. Mitchell und

R.J. B1 o c k (65) sowie von H. Mitchell (66) ist die Korrelation zwischen

chemischer und biologischer Bestimmung der Proteinqualität berechnet worden. In

der letzterwähnten Arbeit fand Mitchell eine sehr enge Korrelation sowohl zwi¬

schen dem "chemical score" als auch zwischen dem "EAA-Index" und der im Tier¬

versuch bestimmten biologischen Wertigkeit. Die Korrelationskoeffizienten betragen

für den "chemical score" 0, 828 und für den "EAA-Index" 0,959. Unter bestimmten,

hier nicht näher zu diskutierenden Voraussetzungen (definierte Ausnützbarkeit des

Aminosäuremusters, definierter Bedarf des Tieres) kann die chemische Analyse

von Proteinen, obschon sie einen groben Eingriff in den nativen Zustand des Ei-

weisses darstellt und mit zahlreichen Fehlerquellen behaftet ist, zu Ergebnissen

führen, die der im Tierversuch bestimmten biologischen Wertigkeit sehr nahekom¬

men.

- 67 -

F. ZUSAMMENFASSUNG

Eine auf Holzzuckerschlempe gezüchtete Futterhefe wurde qualitativ und

quantitativ einer papierchromatographischen Aminosäureanalyse unterzogen. An¬

gaben über die grobchemische Zusammensetzung der Hefe, im besondern über ihren

Gehalt an Nichteiweiss- und Eiweisstickstoff (nach verschiedenen Methoden bestimmt)

finden sich auf Seite 8 bis 11 dieser Arbeit.

Um den störenden Einfluss von Begleitstoffen, vor allem von Kohlenhydraten

auszuschliessen, wurde versucht, das Hefeprotein vor seiner Hydrolyse zu isolie¬

ren. Nachdem wir diesen Versuch als aussichtslos aufgegeben hatten (Seite 12 bis

13), erfolgte die Aufbereitung der Hefe in der Weise, dass sie mit kochendem Metha¬

nol und mit Aether entfettet und hierauf mit 75 %-igem Alkohol behandelt wurde, wo¬

bei die freien Aminosäuren und wenigstens ein Teil der störenden Kohlenhydrate in

Lösung gingen (Seite 13 bis 16). Die extrahierte Hefe wurde alsdann mit 6 n Salz¬

säure bzw. mit 5 n Natronlauge (Bestimmung des Tryptophans) hydrolysiert (Seite

16 bis 17), worauf eine Reinigung des Hydrolysates mit Hilfe einer Zerolit-225-Säule

erfolgte (Seite 17 bis 18).

Die papierchromatographische Trennung der Aminosäuren erfolgte zweidimen¬

sional. Mit dem Lösungsmittelpaar Butanol-Eisessig-Wasser ( 1. Lauf) und Phenol-

Wasser ( 2. Lauf) konnten absteigend alle in der Hefe vorkommenden Aminosäuren

bestimmt werden mit Ausnahme von Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin und

Valin, die nach R. A. Boissannas aufsteigend mit dem Lösungsmittelpaar ter¬

tiäres Butanol-Methyläthylketon-Wasser (1. Lauf) und tertiäres Butanol-Methanol-

Wasser (2. Lauf) isoliert wurden (Seite 23).

Zur quantitativen Bestimmung der Aminosäuren benütztenwir die colorimetri-

sche Ninhydrin-Methode, indem wir das durch Boissonnas abgeänderte Reagens von

S. Moore undW.H. Stein benutzten. Die Aminosäureflecke wurden nach vor¬

heriger Markierung ausgeschnitten, alsdann im Reagenzglas der Ninhydrinreaktion

unterzogen und anschliessend photometriert, wobei die Blindwerte des Papieres und

des Reagens zu eliminieren waren. Da bei der zweidimensionalen Trennung nicht

zu vernachlässigende Verluste an Aminosäuren im Papier auftreten, mussten die

Eichwerte der einzelnen Aminosäuren (Tabelle 10, Seite 35) entsprechend korri¬

giert werden. Eine zusammenfassende Beschreibung der quantitativen Aminosäure¬

bestimmung findet sich auf Seite 45 dieser Arbeit.

Verschiedene Vorversuche bezogen sich auf den Gebrauch der Entwicklungs¬

kammer (Seite 22), sowie auf die Wahl, Zubereitung und Verwendung der Lösungs¬

mittel (Seite 22 bis 26). Besonders einlässlich wurde die Durchführung der Nin¬

hydrinreaktion auf dem Papier und im Reagenzglas geprüft (Seite 28 bis 45).

68 -

Ergebnisse und Diskussion

1. Die Verteilung des Sickstoffes auf die alkohollösliche und alkoholunlösliche Frak¬

tion gestaltete sich, bezogen auf den gesamten Stickstoff der Hefe, wie folgt (Sei¬

te 19):Alkohollösliche Alkoholunlösliche

Fraktion % Fraktion %

Gesamtstickstoff 12,48 86,28ex. -Aminostickstoff 8,19 58,98Ammoniakstickstoff 0,32 6,42Huminstickstoff - 3,22

Der Anteil an alkoholunlöslichem Nichteiweisstickstoff betrug rund 12 %

(Seite 20), während auf den ätherlöslichen (Phosphatid-) Stickstoff 0,90 % ent¬

fielen (Seite 18).

2. Im Alkoholextrakt konnten mit Ausnahme von Cystin, Histidin, Methionin und

Tryptophan sämtliche im eigentlichen Hefeprotein enthaltenen Aminosäuren auch

als frei vorkommend nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden. Zusätzlich

waren im Extrakt noch folgende, stickstoffhaltige Verbindungen vorhanden: ß -

Alanin, <sc-und tf-Aminobuttersäure, Citrullin, Ornithin, die beiden Amide As-

paragin und Glutamin, das Tripeptid Glutathion und zwei unbekannte Verbindun¬

gen, wovon die eine möglicherweise Homoserin gewesen sein konnte (Abbildung 1,

Seite 48 und Tabelle 21, Seite 53). Obschon die Hydrolyse des Extraktes einen

kaum messbaren Anstieg des oc-Aminostickstoffes ergeben hatte, nahmen zahl¬

reiche Aminosäureflecke nach der Behandlung mit 6 n Salzsäure an Intensität zu,

ein Hinweis, dass im Extrakt neben Glutathion noch andere Peptide vorhanden

waren (Seite 53 bis 54).

3. In der alkoholunlöslichen Fraktion, die weitgehend polypeptidischer Natur ist,

sind die folgenden 18 Aminosäuren nachgewiesen und quantitativ bestimmt wor¬

den: Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Cystin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin,

Leucin, Isoleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin,

Tryptophan, Tyrosin und Valin (Abbildung 1, Seite 48 und Tabelle 23, Seite 56).

4. Identifiziert wurden

vom alkohollöslichen vom alkoholunlöslichen

Stickstoff Stickstoff

als Aminosäurestickstoff

(einschliesslich Amidsticksto«) 76,08% 74,46%Ammoniakstickstoff 2,54% 7,41%Huminstickstoff - 3/72 %

Insgesamt 78,62% 85,59%

- 69 -

Der nicht identifizierte Stickstoff dürfte zum grössten Teil aus Nucleotid-

stickstoff bestanden haben (Seite 57).

5. Tabelle 24, Seite 59 enthält einen Vergleich des Ergebnisses der von uns durch¬

geführten Aminosäurebestimmung mit dem Ergebniss von Aminosäurebestimmun¬

gen, die andere Autoren in verschiedenen Hefearten vorgenommen haben.

6. Es wird der Aussagewert der Bausteinanalyse hinsichtlich der biologischen Wer¬

tigkeit des Hefeeiweisses diskutiert (Seite 61 bis 66). Der auf Grund unserer Ana¬

lyse nach B .L . Os e r, berechnete "EAA-Index" führte je nach Wahl des Be¬

zugsproteins (Vollei, Kuhmilch, Sauenmilch) zu Werten, die zwischen 67 und 89

liegen (Tabelle 27, Seite 63). Als den "EAA-Index" begrenzende Aminosäuren,

d.h. als Aminosäuren mit dem kleinsten Ei- bzw. Milchproteinverhältnis (EPV

bzw. MPV) erwiesen sich in der von uns untersuchten Hefe, je nach Art des Be¬

zugsproteins mehr oder weniger ausgeprägt, Methionin und Cystin, ferner Argi-

nin, Leucin und Isoleucin (Tabelle 27, Seite 63).

- 70 -

SUMMARY

A study has been made on the qualitative and quantitative amino acid compo¬

sition of a feed yeast grown on woode pulp molasses. Information on its proximate

chemical composition, prineipally on its content of non-protein- and protein-nitrogen

determined according to different methods is found on pages 8 to 11.

Trying to exclude interfering effects of carbohydrates attempts have first been

made to isolate the yeast protein prior to hydrolysis (pages 12 to 13). After this

procedure had shown to be unsatisfactory, the yeast was treated with boiling methanol,

ether, and 75 % ethanol in order to remove at least a part of the interfering carbo¬

hydrates (pages 13 to 16). After extraction the yeast was hydrolized with 6 N-hydo-

chloric acid or with 5 N-sodium hydroxide (determination of tryptophan) (pages 16 to 17).

Finally the hydrolysate was purified by running it through a Zerolite-225-column

(pages 17 to 18).

All amino acid of the yeast butleucine, isoleucine, Phenylalanine, methionine, and

valine were separated by descending two-dimensional paper chromatography using

as solvent pair butanol-acetic acid-water (Ist run) and phenoj-water (2nd run). For

the Separation of the above mentionned amino acids the ascending method of R. A.

Boissonnas with butanol-methyl-ethylketone-water (1 st run) and tertiary butanol-

methanol-water (2nd run) was used (page 23).

The quantitative determination of the amino acids was made by the colorimetric

ninhydrin method, using the reagent of S. Moore and W .

H . Stein as altered

by Boissonnas. Corrections were made for the blank values of the paper and reagent,

and for the losses of amino acids in the paper (table 10, page 35; page 45).

In several preliminary experiments the developing Chamber (page 22), solvents

(pages 22 to 26) and the ninhydrin reaction on paper and in the test tube (pages 28 to

45) were tested.

Results and discussion

1) The distribution of the total nitrogen between alcoholsoluble and -insoluble frac-

tions was as follows:

alcoholsoluble alcoholinsoluble

fraction fraction

Total nitrogen % 12.48 86.28

oc -amino nitrogen % 8.19 58.98

Ammonia nitrogen % 0.32 6.42

Humine nitrogen % - 3.22

- 71 -

The alcoholinsoluble nonprotein nitrogen amounted to about 12 % (page 20), the

ethersoluble (Phosphatid) nitrogen to 0.90 % (page 19).

2) In the alcohol extract all the amino acids present in yeast, with the exception of

cystine, histidine, methionine and tryptophan, were also present in free form.

Additional amino acids found in the extract were: ß -alanine, oc- and Sf-amino

butyric acid, citrulline, Ornithine, the amides asparagine and glutamine, the tri-

peptide glutathione, and two unknown Compounds, one of them possibly homoserine

(figure 1, page 48 and table 21, page 53). Although the hydrolysis of the extract

gave an amost not measurable increase of c<-amino nitrogen, many amino acid

spots grew in intensity after treatment with 6 N-hydrochloric acid, suggesting that

the extract contained other peptides besides glutathione (pages 53 to 54).

3) The alcoholinsoluble fraction, which consisted principally of Polypeptides, contai¬

ned the following amino acids: Alanine, arginine, aspartic acid, cystine, glutamic-

acid, glycine, histidine, leucine, isoleucine, lysine, methionine, Phenylalanine,

Proline, serine, threonin, tryptophan, tyrosine, and valine (figure 1, page 48 and

table 23, page 56).

4) Our analyses gave the following recoveries of nitrogen:

Amino acid nitrogen %(including amide nitrogen)

Ammonia nitrogen %

Humine nitrogen %

Total % 78.62 85.59

The non-identified fraction appears to have consisted mainly of nucleotide

nitrogen (page 57).

5) In table 24, page 59 the results of our amino acid determination are compared

with figures from the literature.

6) The usefulness of the amino acid analysis for evaluating the biological value of

yeast protein is discussed on pages 61 to 66. The "EAA-index" as calculated from

our analyses according to B.L

.O s e r gave values between 67 and 89, depending

on the reference protein (whole egg, cow milk, sow milk) (table 27, page 63). The

amino acids limiting the "EAA-index" for yeast were, depending on the choice of

reference protein (egg protein, milk protein), methionine and cystine, to a lesser

extent arginine, leucine and isoleucine (table 27, page 63).

alcoholsoluble alcoholinsoluble

nitrogen nitrogen

76.08 74.46

2.54 7.41

- 3.72

- 72 -

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Lebenslauf

Als Bürger von Grafenried (BE) bin ich, Hansjakob Vögeli, am 3. Januar 1923

in St. Stephan geboren worden. Nach dem Besuch der Primarschule in Krauchthal

trat ich ins Gymnasium von Burgdorf ein und erwarb 1942 das Maturitätszeugnis.

Die Studienzeit an der Eidgenössischen Technischen Hochschule schloss ich im Jah¬

re 1947 mit dem Diplom eines Ingenieur-Agronomen ab. Es folgten einige Jahre der

praktischen Betätigung auf einem landwirtschaftlichen Grossbetrieb in Ependes, an

der landwirtschaftlichen Schule Rütti und am Institut Rosenberg in St. Gallen. Von

1950 - 1953 arbeitete ich als Assistent unter Herrn Prof. Dr. E. Crasemann

an der vorliegenden Arbeit. Anschliessend war ich während drei Jahren an der Eid¬

genössischen Landwirtschaftlichen Versuchsanstalt Oerlikon tätig. Im vergangenen

Jahr übernahm ich eine Stelle bei der Vereinigung Schweizerischer Futtermittel¬

fabrikanten in Coppet.