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Research Collection

Doctoral Thesis

Kombinatorische und evolutionäre Konzepte in der Chemiekleiner und grosser organischer Verbindungen

Author(s): Giger, Thomas Stefan

Publication Date: 1999

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-003845954

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Diss. ETH Nr. 13198

Kombinatorische und evolutionäre Konzepte in der

Chemie kleiner und grosser organischer Verbindungen

ABHANDLUNG

zur Erlangung des Titels

eines Doktors der Naturwissenschaften der

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH

Vorgelegt von

Thomas Stefan Giger

Dipl. Chem. Universität Basel

Geboren am 5. Mai 1970

in Schlieren (ZH)

Angenommen auf Antrag von

Prof. Dr. G. Folkers, Referent

Prof. Dr. S. A. Benner, Koreferent/Leiter der Arbeit

Zürich 1999

Dear Steve,

I would like to thank you for allowing me to do this research with you, for givingme a deeper insight into science, for your patience with my project and for

exciting scientific discussions (which were unfortunately rather rare but none the

less exciting when taking place). I also appreciated very much your sense of

humor, for it allowed me to give you a taste of mine. And last but not least I also

want to thank you for giving me the opportunity to stay in a foreign country for

a significant period of my life and to experience its culture and its people.

I had a great time here in the U.S. For this I want to thank all the members of the

Benner Group especially my friends Dave Liberies, Matthias Voser and Nathalie

Trabesinger.

I would like to thank Prof Dr. Eyler for allowing me to use the FT-ICR-MS. Manythanks to all the members of his group, especially to Mark Taylor and Lisa Langfor their support.

My special thanks go to Dr. Fei He in the group of Prof. Dr. Marshall at the

National High Magnetic Field Laboratory (NHMFL) in Tallahassee FL. Without

him, many of the results in the RACS-chapter (C hapter 3) would have not been

possible.

I would also like to thank the people from the MS-service: Dr. Dave Powell, Dr.

Jodie Johnson for their support and collaboration and especially Dr. Lidia

Matveeva for keeping a good sense of humor in her relentless efforts to maintain

our GC-MS.

Maria Wigger und Stephan Audétat danke ich für die gute Zusammenarbeit auf

dem Gebiet der kombinatorischen Chemie und für die vielen hilfreichen Ideen.

Bei Nathalie Trabesinger und Lee Raley möchte ich mich bedanken für die guteZusammenarbeit sowie für die grosszügige Hilfe und Geduld bei meinen ersten

Gehversuchen in der Molekularbiologie. Als gute, sehr gründliche sowie nach

ihrem eigenen Befinden sehr geduldigen Lehrerin, hat mir Nathalie fast alles

beigebracht, was ich brauchte um meine beiden Mutanten rekonstruieren zu

können.

In this context I would also like to thank David Schreiber for his help with the

reconstruction of the ancestral sequences of BS-RNase.

Bernd Eschgfäller, meinem Laborkollegen in Lei 337, sowie der Crew von Lei

452, wo ich meine molekularbiologischen Experimente durchgeführt habe,möchte ich für die angenehme und positive Arbeitsatmosphäre danken.

Nicht zuletzt möchte ich mich auch bei Heike H. Held, Matthias Voser und

Kevin Devine für die zahlreichen und sehr hilfreichen Korrekturen bedanken

Not to be forgotten should be Romaine Hughes. Without her administrative

efforts the Benner group would probably cease to exist. Her efforts and her sense

of humor helps all of us to deal with the all powerful bureaucracy.

And to Micky: I'd like to thank you for your support and for trusting me.

Inhaltsverzeichnis 1

Publikationshinweise 5

Abkürzungen 6

Abkürzungen der Aminosäuren 8

Nomenklatur 9

Bibliotheken 9

Massenspektrometrie 9

Mutanten 9

BS-RNase-Mutanten 9

Zusammenfassung 10

Summary 12

THEORETISCHER TEIL 14

I.Einleitung 15

1.1 Geschichtliche Entwicklung der kombinatorischen Chemie 17

1.1.1 Peptidbibliotheken 17

1.1.1.1 "Split and pool"-Bibliotheken 18

1.1.1.2 "Phage display"-Bibliotheken 20

1.1.2 "Small organic molecules"-Bibliotheken 20

1.1.2.1 Heterocyclen-Bibliotheken auf Festphase 20

1.1.2.2 Bibliotheken synthetisiert in Lösung ("Solution phase libraries") 21

1.2 Zielsetzung dieser Arbeit 23

2. Synthese kombinatorischer Bibliotheken 24

2.1 Die Olefin-Metathese 24

2.1.1 Synthese des Grubbs-Katalysators 27

2.1.2 Olefin-Metathese mit einzelnen Olefinen 27

2.2 Synthese von Olefin-Bibliotheken 31

2.2.1 Berechnung der Grösse einer durch die Metathese gewonnenen Olefin-Bibliothek 31

2.2.2 Modell-Bibliothek 1 32

2.2.3 Modell-Bibliothek 2 34

2.2.4 Olefin-Bibliothek 35

2.2.5 Addition von Funktionalität zu Olefm-Bibliotheken 37

2.2.5.1 Hydrazid-und Urethan-Bibliotheken 37

2.3 Umwandlung von Olefin-Bibliotheken in Bibliotheken mit anderen funktionellen Gruppen... 40

2.3.1 Epoxid-Bibliothek 40

2.3.2 Dibromid-Bibliothek 43

2.3.3 1,4-Dihydro-Pyridazin-Bibliothek 44

2.3.3.1 Reaktion mit Tetrazinen 45

2.3.4 Diol-Bibliotheken 48

2.3.4.1 Glykolspaltung 49

2.3.4.2 Acetalisierung mit Acetaldehyd 50

2.4 Gescheiterte Umwandlungsversuche 52

2.5 Schlussfolgerungen 54

3. Receptor Assisted Combinatorial Synthesis ("RACS") 55

3.1 Für "RACS" geeignete Verbindungsklassen 57

3.1.1 l,3,5-Tris-(L-Cystein-N-formyl)-benzol(38) 58

3.1.2 5,11,17,23-Tetrakis-(2-mercaptoethyl)-25126,27,28-tetrakis[(p-tolylsulfonyl)oxy]-

calix[4]aren (44) 59

3.2 Geeignete Analyse-Methodenfür "RACS"-Experimente 60

3.2.1 FT-ICR-MS 60

3.3 "Proof ofconcept" 61


3 4 "RACS"-Experimente mit Diolen..62

3 4 1 Resultate 64

3 411 Vorversuche 64

3 4 111 RNase A 64

3 4 112 Substratkomplexe von RNase A mit 5'-UMP 66

3 4 113 RNase A und Diol-Bibliothek 68

3 4 12 "RACS" mit einer Diol-Bibliothek, 5'-UMP und RNase A m Borat Puffer 69

3 4 13 Weitere "RACS"-Expenmente 70

3 4 13 1 "RACS" mit 3' AMP, 3'-CMP, 3' GMP, 3' UMP und RNase A 71

3 4 13 2 "RACS" mit 3' AMP, 3'-CMP, 3'-GMP, 3' UMP, der Diol-Bibliothek und RNase A 77

3 4 2 Schlussfolgerungen 78

3 4 2 1 Prinzipielle Probleme 78

3 4 2 2 Technische Probleme 79

3 4 2 3 Probleme mit dem gewählten Losungsansatz 79

3 4 3 Ausblick 80

4 Der Molekulare Darwinismus anhand der Entwicklung der Ribonuklease in

Wiederkauern .81

4 1 Ribonukleasen 82

4 1 1 Die RNase A 82

4 1 2 Die BS RNase 86

4 2 Evolution der Ribonukleasen.

89

4 2 1 Emschub Werkzeuge des Evolutions Biologen 89

4 2 2 Evolutionare Entwicklung der BS-RNase aus der RNase A 91

4 3 Die Resultate und deren Interpretation 96

4 3 1 Erwartungen fur die Aktivität der BS-RNase-Mutanten 96

4 3 11 Einzelstrang-RNA-Aktivitat (Poly(U)-Assay) 96

4 3 12 Katatytische Aktivität gegen Doppelstrang-RNA 96

4 3 13 Biologische Aktivität (Immunosuppressivitat) 96

4 3 14 Überlappung der N terminalen Enden (S-Peptidaustausch) 96

4 3 2 Gemessene Resultate 97

4 3 2 1 Dinukleotid Aktivität UpA-Assay 97

4 3 2 2 Einzelstrang Aktivität Poly(U)-Assay 98

4 3 2 3 Katalytische Aktivität gegen Doppelstrang RNA poly(U) poly(A) Assay 99

4 3 2 4 Destabihsierung von dsDNA (Poly(dA dT) Poly(dA-dT]) Der MBNase-Assay 100

4 3 2 5 Austausch der N-terminalen Enden (S-Peptidaustausch) 102

4 3 2 6 Biologische Aktivität (Immunosuppressivitat) MLR Assay 104

4 3 2 7 Inhibition durch das Ganghosid GM3 105

4 3 3 Wertung 107

4 4 Rekonstruktion der Mutanten.

108

4 4 1 Die Kunkel-Mutagenese 108

4 4 2 Expression und Reinigung 111

EXPERIMENTELLER TEIL 112

5 1 Materialien 113

5 1 1 Chemikalien 113

5 12Enzyme 117

5 13Baktenen 117

5 14 Medien/Losungen/Puffer 117

5 15 Verwendete Apparaturen und Gerate 119

5 16 Andere Materialien 119

5 2 Kombinatorische Chemie 120

5 2 0 Allgemeine Prozeduren 120

521 "Grubbs-Katalysator" (9) 121

5 2 11 Diazobenzyl (14) 121

5 2 12 Bis-(tncyclohexylphosphm)-benzyhden ruthemum-dichlond (Grubbs Kathalysator) (9) 121

3

5 2 2 Metathese mit einzelnen Olefinen (19) 122

5 2 3 Olefin-Bibliotheken mittels Metathese (19) 129

5 2 3 1 Modell Bibliothek 1 129

5 2 3 2 Modell Bibliothek 2 131

5 2 4 Variationen von Olefin-Bibliotheken 132

5 2 4 11,2-Epoxid-Bibhothek (22) 132

5 2 4 2 1,2-Dibrormd-Bibhothek (23) 135

5 2 4 3 Diels Aider Reaktion mit inversem Elektronenbedarf Addition von Tetrazm an eine Olefin

Bibliothek (25) 138

5 2 4 3 1 3,6 Bis mefhoxycarbonyl-1,2,4,5 tetrazm (24a) 138

5 2 4 3 2 Reaktion von 3,6-Bis methoxycarbonyl-l,2,4,5-tetrazm mit Allylbenzol 139

5 2 4 3 3 Reaktion von 3,6-Bis-methoxycarbonyl-1,2,4,5 tetrazm mit einer Olefin-Bibliothek 1,4

Dihydropyndazme (25) 140

5 2 4 4 Umwandlung von Estern m Hydrazide (20) und Urethane (21), Curtius Abbau 142

52 51,2-Dwl-Biblwtheken(27) 144

5 2 5 1 cis-l,2-Diol-Bibliotheken (27), "Sharpless-Dihydroxylierung" 144

5 2 5 2 Denvatisierung von Diol Bibliotheken 144

5 2 5 2 1 Glykolspaltung mit Perjodat 144

5 2 5 2 2 Acetalisierung mit Aldehyden 146

5 3 "RACS" (Receptor Assisted Combinatorial Chemistry) mit RNase A 150

5 3 1 Messbedingungen fur das FT ICR MS 150

5 3 2 Entsalzung von Verbindungen 150

5 3 3 Vorversuche 151

53 3 1 RNase A 151

5 3 3 2 Substratkomplex von RNase A und 5 '-UMP 151

5 3 3 3 Substratkomplex von RNase A und Diol-Bibliothek 151

5 3 4 "RACS" mit einer Diol-Bibliothek, 5' UMP und RNase A in Borat Puffer 152

5 3 5 "RACS" mit 3' AMP, 3'-CMP, 3' GMP, 3' UMP und RNase A 152

5 3 6 "RACS" mit 3'-AMP, 3' CMP, 3'-GMP, 3'-UMP der Diol Bibliothek und RNase A 153

5 4 Synthese von "RACS"-geeigneten Linkern 154

5 4 1 5,11,17,23-Tetrakis (2 mercaptoethyl)-25,26,27,28 tetrakis[(p-tolylsulfonyl)oxy]

cahx[4]aren (44) 154

5 4 11 25,26,27,28-Tetrakis-(allyloxy) cahx[4]aren (40) 154

5 412 5,ll,17,23-Tetraallyl-25,26,27,28 tetrahydroxy-calix[4]aren (41) 155

5 4 1 3 5,1 l,17,23-Tetraallyl-25,26,27,28-tetrakis[(p-tolylsulfonyl)oxy]-cahx[4]aren (42) 156

5 4 14 5,11,17,23 Tetrakis-(2-bromoethyl) 25,26,27,28-tetrakis[(p tolylsulfonyl)oxy]

calix[4]aren (43) . 157

5 4 15 5,ll,17,23-Tetrakis-(2-mercaptoethyl)-25 26,27,28 tetrakis[(p tolylsulfonyl)oxy]-

cahx[4]aren (44) 158

5 4 2 1,3,5 Tns-(-L-Cystem N formyl)-benzol (38) 159

5 5 Rekonstruktion des BS-RNase-Vorlaufer Mutanten.

160

5 51 Allgemeine molekularbiologische Methoden zur Einfuhrung der gewünschten

Mutationen. 160

55 11 Transformation von Plasmiden m kompetente Zellen 160

5 5 111 Transformation von Plasmiden in kompetente Zellen durch Elektroporation 160

5 5 112 Transformation von Plasmiden m kompetente Zellen durch Hitzeschock 160

5 5 2 Mutagenese nach Kunkel 161

5 5 2 1 Herstellung und Isolierung von Uracil Phagemiden 161

5 5 2 2 Mutagenese 162

5 5 2 3 Isolierung von Plasmiden aus Bakterien-Kulturen 162

5 5 2 4 Charakterisierung der Plasmide 163


5.5.3 Expression der Mutanten BS-RNase-TSG, und -TSG4 164

5.5.3.1 Expression mit pET23b+-Plasmiden in BL21-(DE3) 164

5.5.3.2 Proteinreinigung 164

5.5.3.2.1 Aufschluss der Zellen und der "Inclusion bodies", erste Reinigungsschritte 164

5.5.3.2.2 Affinitätssäule mit pUp-Agarose 164

5.5.3.2.3 Rückfaltung zum Dimer 165

5.5.3.2.4 Auftrennung von Monomer und Dimer 165

5.5.4 Charakterisierung der exprimierten Mutanten BS-RNase-TSGj und -TSG4 166

5.5.4.1 Konzentrationsbestimmung 166

5.5.4.2 Dinukleotid-Aktivität; UpA-Kinetik 167

5.5.4.3 Einzelstrang-Aktivität; Poly(U)-Kinetik 168

5.5.4.4 Doppelstrang-Aktivität; Poly(U)-Poly(A)-Kinetik 168

5.5.4.5 Schmelzkurve für Doppelstrang DNA; Poly(dA-dT)-Poly(dA-dT)-Kinetik; MBNase-Assay.... 169

5.5.4.6 Divinylsulfon-Assay (DVS-Assay) 169

5.5.4.7 Inhibition durch GM3 169

6. Literaturverzeichnis 170

7. Lebenslauf 181

Publikationshinweise 5

Publikationshinweise

Teile der hier vorliegenden Arbeit wurden inzwischen veröffentlicht:

Thomas Giger, Maria Wigger, Stephan Audétat, Steven A. Benner: Libraries forReceptor-Assisted Combinatorial Synthesis (RACS). The Olefin Metathesis Reaction

(1998) Synlett 688-692.

Abkürzungen 6

Abkürzungen

A AbsorptionAbb. Abbildungabs. absolut

Ac Acetyl/AcetatADA Adenosindeaminase

Amp Ampicillinanhydr. anhydrousAS Aminosäuren

B Base/Bor

BB-RNase bovine brain ribonuclease

biot. res. gr. biotech research gradeBS-RNase bovine seminal ribonuclease

Bu ButylCA carbonic anhydrasec Konzentration

Camb. Isot. Lab. Cambridge Isotope LaboratoryCAS-# chemical abstract service registry number

cert. certified gradeCM cross metathesis

cy Cyclohexyld Tage/Duplett (NMR)/Durchmesser (UV-Vis)A Hitzezufuhr/Differenz (mathematisch)Da Dalton (1 Da = 1 g/mol)DMF DimethylformamidDMSO DimethylsulfoxidDS/ds Doppelstrang/double strand

dTTP 2'-Desoxythymidin-5/-triphosphatDTT l,4-Dithio-D,L-threitolDVS Divinylsulfone Absorptionskoeffizient (UV-Vis)E. coli Escherichia coli

EI Elektrische Ionisierung/electron ionization

EDTA Ethylendiamintetraacetatelectroph. gr. electrophoresis gradeES EinzelstrangESI electro-spray ionization

Et EthylFAB fast atom bombardment mass spectrometryFT-ICR-MS fourier transform ion cyclotron mass spectrometryFT Fourier-Transformation

GC Gaschromatographie/gas chromatographyges. gesättigt

G]vl3 Monosialogangliosid GM3GST Glutathion-S-transferase

HAr aromatisches Wasserstoffatom (NMR)HPLC high pressure liquid chromatographyHV Hochvakuum, ca. 10"2 bis 10"3 bar

ID Innendurchmesser

Abkürzungen 7

IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosidJ Kopplungskonstante (NMR)Kat. KatalysatorKonz./konz. Konzentration/konzentriertX WellenlängeLB Luria-Bertani-Medium

LB* LB-superLC liquid chromatographyLit. Literatur

LM Lösungsmittelm milli/Multiplett (NMR)M Molar [mol/1]M+ Molekülion

m/z Masse pro Ladung (MS)MBNase Mung-Bean-NukleasemCPBA meta Chloroperbenzoic acid

Me MethylMLR mixed lymphocyte culture reaction

MS Massenspektrometrie/mass spectrometryMw MolgewichtN Normalität/Stickstoff/NukleosidNHMFL National High Magnetic Field LaboratoryNS NiederschlagNMR nuclear magnetic resonance spectrometryNTP Nukleosid-5'-triphosphatOD optische Dichte

P Phosphat/DruckPAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese/polyacrylamid

gel eletrophoresisPCR polymerase chain reaction

PDI Protein-Disulfidisomerase

PEG PolyethylenglykolPh PhenylPI Isoelektrischer Punkt

PMSF Phenylmethansulfonylfluoridpoly(A) Polyadenylribonukleinsäurepoly(A)- poly(U) Doppelstrang aus Polyadenyl- und

PolyuridylribonukleinsäurePoly(dA-dT)-Poly(dA-dT) Doppelstrang aus Poly-Desoxyadenyl-

Desoxythymidylsäurepoly(U) PolyuridylribonukleinsäurePr Propylpsi pounds per square inch, 1 psi = 6.89476 kPa

PUp Uridin-2',5'&3',5'-diphosphatpurif. purificationq Quartett (NMR)R nicht spezifizierte Restgruppe oder funktionelle

Gruppe/RiboseRACS receptor assisted combinatorial synthesisRCM ring closing metathesis

ROMP ring opening metathesis polymerizationRotavap Rotationsverdampfer

Abkürzungen

RNase Ribonuklease

RT Retentionszeit/ retention time (GC)RT Raumtemperaturs Sekunde/Singulett (NMR)SDS Natriumdodecylsulfatsol. solution

t Zeit/Triplett (NMR)T Temperatur/Tesla, magnetische Feldstärke

Tab. Tabelle

TE Tris-EDTA-Puffer

tech. technical gradeTHF Tetrahydrofurantorr. Torricelli (= 1mm Hg), 1 torr = 133.32 Pa

TMS TrimethylsilylTr TritylTris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanTs TosylU unit

U/Min. Umdrehungen pro Minute

u. a. unter anderem

UMP Uridin-monophosp at

UpA Uridyl-(3'->5')-adenosinUV-Vis ultraviolet-visible spectrometryv.a. vor allem

Vol. Volumen

z.B. zum Beispiel

Abkürzungien der Aminosäuren

A Ala Alanin S Ser Serin

C Cys Cystein T Thr Threonin

D Asp Asparaginsäure V Val Valin

E Glu Glutaminsäure W Trp TryptophanF Phe Phenylalanin Y Tyr TyrosinG Gly GlycinH His Histidin

1 He Isoleucin

K Lys LysinL Leu Leucin

M Met Methionin

N Asn AsparaginP Pro Prolin

Q Gin Glutamin

R Arg Arginin

Abkürzungen 9

Nomenklatur

Wo immer möglich, wurden die IUPAC-Nomenklaturregeln verwendet.

Bibliotheken

Olefin Ax und Olefin AY produzieren folgende Metathese-Produkte:

Ax^-x= ^xx

AXAY = AYAX = BXY

AYAY = BYY

Wird anschliessend eine Manipulation an diesen Olefinen ("B") durchgeführt,z.B. eine Transformation in Epoxide ("C"), bleiben die Indizes erhalten:

BXY > CXY

Massenspektrometrie

Wird in FT-ICR-MS Experimenten von mehrfach positiv/negativ geladenenMolekülionen gesprochen, so wird angenommen, dass diese die entspre¬chende Anzahl Protonen besitzen/verloren haben:

Mn±=(M±n-H)n±

Mutanten

Eine Mutation wird in der Form XZahlY angegeben, was bedeutet, dass die

AS X an einer bestimmten Stelle der Sequenz (Zahl) in die AS Y mutiert wor¬

den ist.

BS-RNase-Mutanten

TSG: N17S, C31F, T64A, K76N, T78A, R80H, Q101R,

V102A, G111E und S115Y

TSG2 N17S, C31F, T64A, K76N, T78A, R80H, Q101R,

V102A, G111E, S115Y und K55Q


V102A, G111E, S115Y und N113K


V102A, G111E, S115Y, K55Q und N113K

TSGX und TSG4 wurden exprimiert.

Zusammenfassung 10

Zusammenfassung

1. Teil (Kap. 1-3):

Die kombinatorische Chemie ist mit etwa zehn Jahren ein relativ jungerForschungszweig. Trotz ihrer kurzen Geschichte hat sie sich einen überaus

wichtigen Platz in den Forschungslabors der meisten Chemiefirmen erobert.

Man erhofft sich von ihr, dass sie das Werkzeug für die schnelle Entdeckungvon neuen Wirksubstanzen wird oder zumindest deren effiziente Weiterent¬

wicklung ermöglicht. Der Grund für diese grossen Erwartungen liegt darin,dass der Chemiker mit der kombinatorischen Chemie ein neues Produktivi¬

tätsniveau erreicht. Anstatt ein paar wenige Substanzen pro Jahr herzustellen,

vermag er nun mehrere tausend in Form einer Bibliothek in wenigen Schrit¬

ten und in kürzester Zeit zu synthetisieren.

Bei den meisten bis anhin publizierten Bibliotheken handelt es sich um

festphasengebundene Heterozyklen- oder Peptidbibliotheken. Diese Arbeit

will darum neue Wege zur Synthese von Flüssigphasen-Bibliotheken aufzei¬

gen. Mit Hilfe der Metathese-Reaktion wurde eine Olefin-Bibliothek syntheti¬siert und diese in verschiedenste andere Bibliotheken derivatisiert, u.a. eine

1,2-Diol-Bibliothek.

Weiter wurde versucht, eine neue Screening-Methode für Flüssigphasen-Bibliotheken, die sogenannte "Receptor Assisted Combinatorial Synthesis",("RACS") zu entwickeln. Das Grundprinzip ist, eine virtuelle Bibliothek aus

zwei Sub-Bibliotheken in Gegenwart eines Rezeptors zu synthetisieren. Dabei

wird das Gleichgewicht der Reaktion zum am stärksten bindenden Inhibitor

des Rezeptors hin verschoben und führt zu einer Akkumulation desselben.

Die Analyse dieser Reaktion wird bevorzugt im FT-ICR-MS durchgeführt,welches erlaubt, zwischen Rezeptor und Rezeptor-Inhibitor-Komplex zu dis¬

kriminieren.

Boratester besitzen eine ähnliche Struktur wie zyklische Phosphate. Darumkönnen sie als potentielle Inhibitoren in Metabolismen mit zyklischen Phos¬

phaten als Zwischenprodukten aufreten. Als System der Wahl wurde RNase

A, ein RNA-Nukleotid, Borat und eine 1,2-Diol-Bibliothek verwendet. Es war

auch vorgesehen im Falle eines Erfolges analoge Experimente mit BS-RNase

und einigen ihrer Mutanten durchzuführen. Leider konnten die erhofften Re¬

sultate nicht einmal mit der RNase A erzielt werden. Der Grund dafür ist

darin zu suchen, dass die Analytik noch zuwenig ausgereift ist um diese Art

von Probleme zu lösen, da die erfolgversprechendsten Methoden (z.B. FT-

ICR-MS) bei den benötigten hohen Ionenkonzentrationen versagen. In weite¬

ren Versuchen konnten mit dem FT-ICR-MS jedoch diverse nonkovalente

Komplexe zwischen RNase A und Diolen einer Diol-Bibliothek bzw. mit 3'-

und 5'-Nukleotiden beobachtet werden.

2. Teil (Kap. 4):

Die Entstehung von BS-RNase kann auf eine Genduplikation der RNase A

vor ca. 30-40 Mio. zurückverfolgt werden. Von der RNase A (Bos taurus) un-

Zusammenfassung 11

terscheidet sie sich durch ihre homodimere Struktur sowie in 23 von 124 AS.

Dass die BS-RNase im Gegensatz zur RNase A eine immunosuppressive Wir¬

kung sowie eine Antitumoraktivität aufweist, deutet darauf hin, dass die BS-

RNase diese Attribute nach ihrer Entstehung aus der RNase A in einem evo¬

lutionären Prozess gewonnen hat. In einer früheren Arbeit wurde bereits der

gemeinsame Vorfahre der BS-RNasen der Bovidae rekonstruiert. Um das Ge¬

samtbild abzurunden und um den Verlauf dieser evolutionären Entwicklungauf molekularer Ebene mitverfolgen zu können, wurde der gemeinsame Vor¬

fahre der BS-RNasen der Hirsche (Cervidae), Giraffen (Giraffidae) und Rinder

(Bovidae) rekonstruiert und charakterisiert. Die Resultate zeigen, dass bereits

kurz nach der Genduplikation gewisse charakteristische Merkmale der BS-

RNase vorhanden waren, wenn auch noch nicht so ausgeprägt. Da eine Am¬

bivalenz für die Aminosäuren 55 und 113 vorhanden war, wurden zwei

Mutanten synthetisiert; einer mit beiden AS identisch zum RNase A-Vorgän¬ger und einer mit beiden AS identisch zur BS-RNase. Dabei hat sich gezeigt,dass diese beiden Positionen, im Einklang mit früheren Arbeiten, wichtig sind

für die neuerworbenen biologischen Eigenschaften von BS-RNase. So zeigtder RNase A-ähnlichere Mutant fast durchwegs ein Verhalten, das man von

RNase A erwarten würde, während der BS-RNase-ähnlichere Mutant bereits

deutliche Merkmale seines Abkömmlings aufweist. Beiden ist jedoch eigen,dass sie ein vermindertes RNA-Hydrolyse-Vermögen besitzen. Dasselbe Mu¬

ster kann auch für die Immunosuppressivitat beobachtet werden; der RNase

A ähnliche Mutant besitzt keine, während der BS-RNase ähnliche Mutant be¬

reits eine kleine Aktivität aufweist. Es scheint, als ob die Immunosuppressi¬vitat oder Antitumoraktivität bereits früh nach der Genduplikation einen

Vorteil für den damals lebenden Wiederkäuer brachte.

Summary 12

Summary

Part 1 (Chapter 1-3):

At around ten years old, combinatorial chemistry is one of the most excit¬

ing and dynamic events to have occurred in the chemical sciences. Despite it's

comparative youth, combinatorial chemistry managed to establish itself in an

eminent position in the research laboratories of many chemical companies. It

was expected to provide a means for the fast discovery of new lead com¬

pounds, and enable their more efficient development. The reason for these

great expectations lies in the fact that the chemist is able to achieve a higherlevel of productivity. Instead of synthesizing just a few compounds per yearhe can now produce thousands of them within a few steps in form of a li¬

brary.

Most of the libraries published up to date are solidphase bound heterocycleand peptide libraries. In contrast this thesis displays new approaches to the

synthesis of solution phase libraries. An olefin library was synthesized with

the help of the metathesis reaction and then derivatized into various other li¬

braries, among them a 1,2-diol library.

The next goal was to develop a new screening method, called the "Recep¬tor assisted combinatorial synthesis" ("RACS"). The idea involves the synthe¬sis of a virtual library from two sublibraries in the presence of a receptor. The

equilibrium of the reaction between the two substrates is pulled in favor of

the two strongest binding ligands of the receptor. The result is an accumula¬

tion of the inhibitor that can be detected, preferably by FT-ICR-MS for this

method allows for the discrimination between receptor and receptor inhibitor

complex.

Borate esters have a similar structure to cyclic phosphates. They are there¬

fore potential inhibitors for reactions in which cyclic phosphates are producedas reaction intermediates. The system of choice was RNase A, an RNA nu¬

cleotide, borate and a 1,2-Diol-library. If successful we planned to do analogexperiments with BS-RNase and some of its mutants. Unfortunately this no¬

vel approach prove unsuccessful. The reasons are that the most promisinganalysis tools such as FT-ICR-MS are not working properly at the requiredhigh salt concentrations. In other experiments with FT-ICR-MS it was possiblethough to detect several non-covalent complexes between RNase A and diolsof a diol library or 3'- and 5'- nucleotides respectively.

Part 2 (Chapter 4):

The origin of BS-RNase can be traced back to a gene duplication of RNase

A about 30-40 million years ago. It differs from RNase A (Bos taurus) by its ho-modimeric structure as well as in 23 of 124 amino acids. Contrary to BS-

RNase, RNase A does not have either immunosuppressivity or antitumor acti¬

vity. From this it can be assumed that BS-RNase has gone through a period of

adaptive evolution in its short time of existence. In an earlier work the com¬

mon ancestor of the bovidae was reconstructed. To get the full picture and to

get an overview of this evolutionary development it was necessary to recon-

Summary 13

struct and characterize the common ancestor of the BS-RNase gene of deer

(Cervidae), giraffes (Giraffidae) and bovids (Bovidae). Because of an ambiguityat the positions 55 and 113 two mutants were made, one of them with both

amino acids identical to the RNase A residues and one of them with both

identical to BS-RNase. The results show that shortly after the gene duplicationsome distinctive properties of BS-RNase were already partly developed. It

was also shown that those two positions are important for the newly acquiredbiological properties of BS-RNase, in accordance with earlier work. The

mutant closer to RNase A shows more or less the same behavior that would

be expected from RNase A, whereas the other mutant shows behavior more

characteristic of BS-RNase. Both display a reduced ability to hydrolyze RNA.The same pattern of behavior was observed with immunosuppresivity and

antitumor activity. The RNase A like mutant showed none, whereas the BS-

RNase like mutant already possessed displayed some of it. In conclusion it

seems that very early after the gene duplication occurred the resultant immu-

nosuppressivity and antitumoractivity bestowed greater fitness on the ancient

organism.

14

Theoretischer Teil

1. Einleitung 15

1. Einleitung

Die Entwicklung eines neuen Medikaments ist heute ein langwieriges undäusserst kostspieliges Unterfangen. Im Durchschnitt liegt der Zeitbedarf für

diesen Prozess, vom Projektstart bis zur Bewilligung durch die Behörden, bei

zehn bis fünfzehn Jahren und kostet in der Grössenordnung von einer halben

bis dreiviertel Milliarde Schweizer Franken. Er lässt sich grob in drei Phasen

aufteilen:

a) "Lead Discovery Phase". Sie fängt an mit dem Beginn des Projektes undendet mit der Entdeckung einer ersten Wirksubstanz ("lead compound").Diese Phase dauert etwa fünf Jahre und verursacht etwa einen Zehntel der

Gesamtkosten.

b) "Lead Development Phase". Während dieser Phase wird die gefundeneWirksubstanz optimiert und der Kandidat für das endgültige pharmazeu¬tische Produkt entwickelt. Dieser Abschnitt dauert weitere drei bis fünf

Jahre und verschlingt wiederum etwa ein Zehntel des Gesamtaufwandes.

c) Klinische Phasen I-III; im Allgemeinen der teuerste Abschnitt; hier wird

das pharmazeutische Produkt auf seine Wirksamkeit und Nebenwirkun¬

gen beim Patienten getestet. In diesen Phasen wird der Beweis für die be¬

willigenden Behörden erbracht, dass dieses neue Medikament wirkungs¬voller als bereits existierende Produkte ist und dass es kein untragbaresRisiko darstellt bzw. keine schädlichen Nebenwirkungen für den Konsu¬

menten verursacht. Die klinischen Versuche tragen etwa 80 % zu den Ge¬

samtkosten bei und dauern etwa zwei bis fünf Jahre.

Von einem ökonomischen Standpunkt aus betrachtet, verursacht die klini¬

sche Phase den grössten Aufwand bei der Einführung eines neuen Medika¬

mentes. Der chemische oder biochemische Teil ("Lead discovery", "Lead de¬

velopment") ist eindeutig der kostenärmere, obwohl er am meisten Zeit bean¬

sprucht. Deswegen jedoch anzunehmen, in den ersten zwei Phasen sei keine

Effizienzsteigerung notwendig um als Unternehmen in einem verschärften

wirtschaftlichen Wettbewerb bestehen zu können, wäre äusserst gefährlich.Es ist nämlich zu bedenken, dass für eine bestimmte Krankheit keine unbe¬schränkte Anzahl von Wirksubstanzen möglich ist, welche als Medikamentein Frage kommen könnten. Es ist darum wichtig, diese Verbindungen zuerst

zu entdecken, um sie kommerziell ausbeuten zu können. Als Beispiel dafür

können Antibiotika angeführt werden. Teilweise seit bald fünfzig Jahren auf

dem Markt, haben sie einen riesigen Gewinn, sowohl für die beteiligten Fir¬

men als auch für die Gesellschaft abgeworfen. Mit zunehmender Resistenz

der bakteriellen Krankheitserreger gegen diese Verbindungen ist es jedochdringend notwendig und damit auch aus finanziellen Gründen erfolgverspre¬chend, neue Ersatzprodukte zu finden. Doch trotz hohem Forschungsauf¬wand sind fast keine neuen Antibiotika auf den Markt gekommen. Dies be¬

deutet, dass die Suche entweder mit noch höherem Aufwand und damit ver¬

bundener Verminderung des wirtschaftlichen Anreizes fortgesetzt wird oder

1. Einleitung 16

dass nach neuen Wegen gesucht wird um Wirksubstanzen ("lead com¬

pounds") zu entdecken.

Der bis heute eingeschlagene Weg um neue oder verbesserte Wirksubstan¬

zen zu finden ist seit Beginn der menschlichen Zivilisation fast derselbe ge¬blieben: Der "moderne" Forscher testet Substanzen auf ihre Wirksamkeit und

Nebenwirkungen aus, ganz so wie dies sein "Kollege" im der Antike getanhat. Der Hauptunterschied ist jedoch, dass der heutige Wissenschaftler ab¬

straktere Vorstellungen über chemische Strukturen und Vorgänge besitzt. So

haben wir heute detailliertere Vorstellungen vom Aufbau der Materie und

eine bessere Systematik in der Einteilung der Substanzen, deren Eigenschaf¬ten und Reaktionsmechanismen. Dies ermöglicht ein gezielteres Vorgehen auf

der Suche nach neuen Verbindungen. So können bekannte Wirksubstanzen

mit kontrollierten chemischen Manipulationen verändert werden und in

späteren Tests auf eine erhöhte Wirksamkeit untersucht werden.

Dank dem zunehmenden Verständnis der biochemischen Vorgänge im

Allgemeinen und der Enzymmechanismen im Speziellen, konnten mit der

Zeit Medikamente entwickelt werden, welche sich aus Übergangszustand-sanaloga ableiteten. Dieser Ansatz beruht hauptsächlich auf der Erkenntnis,dass ein Enzym den Übergangszustand stabilisiert. Nach dessen Bestimmungkann eine Analogverbindung synthetisiert werden, die an das Enzym binden

sollte, von diesem jedoch nicht abgebaut werden kann.

Mit der Zunahme der durchgeführten Strukturbestimmungen von Protei¬

nen zeigte sich, dass Substrate oder Übergangszustände oft wie massge-schneidert in ihr Protein passen. Daraus wurde das "Schloss-Schlüssel"-Prin-

zip abgeleitet: Der Inhibitor passt in das Enzym wie ein Schlüssel in das

Schloss. Mit dem Aufkommen von leistungsstarken Rechnern hoffte man, die

Entwicklung von Wirksubstanzen mit Hilfe von "Molecular Modeling"durchführen zu können ("Drug design"). Zum "Glück" blieb den Computernder Erfolg verwehrt, und die vielen Chemiker, Biologen und Pharmazeuten

konnten vorerst einmal aufatmen.

Da der Erfolgsdruck für die pharmazeutische Industrie immer grösser, da¬

für die Anzahl der einfach zugänglichen Medikamente immer kleiner wurde

und sich das rationale Entwerfen von Wirksubstanzen nicht bewährt hatte,musste ein neuer Ansatz gefunden werden um noch mehr Substanzen für

pharmakologische Anwendungen zugänglich zu machen. Dieses Ziel liess

sich einfach durch den Einsatz von Syntheserobotern und Screeningroboternerreichen. Diese haben gegenüber menschlicher Arbeitskraft den Vorteil, dass

sie Tag und Nacht arbeiten können und so ausgelegt werden, dass sie auf

kleinstem Raum mehrere hundert Synthesen bzw. "Screens" auf einmal

durchführen. Diese neue Art der Massenproduktion nennt sich "Massive par¬allel synthesis" bzw. "High through put screening" und findet zunehmende

Verwendung. Sie hat die durchschnittlichen Kosten für die Herstellung einer

neuen Verbindung von über 7500 $ (Chabala, 1993) stark verringert. Eine an¬

dere, potentiell noch effizientere Möglichkeit, um eine möglichst grosse An¬

zahl Verbindungen zu synthetisieren, besteht darin, dass anstatt hunderte

von parallel durchgeführten Analogreaktionen ein einziger Ansatz verwendet

wird, mit allen Edukten ("Building blocks") in einem Reaktionsgefäss. Die

Idee dabei ist, dass eine Mischung entsteht, in der sämtliche vorstellbaren

1. Einleitung 17

"Building Block"-Kombinationen vorhanden sind. Dieser neue Ansatz wird

"kombinatorische Chemie" ("Combinatorial chemistry") genannt und die

Produktgemische nennen sich "Bibliotheken" ("Libraries").

/ Aß! A2B! AxBj/ AiB2 A2B2 AXB2/ A1B3 A2B3 AXB3

Ai + Bj ^•

•

i=l, , x;j = l, ,y \

\ AiBy.2 AxBy.2 /

\ Aßy.! AxBy.! /

\ A^y AxBy J

Abbildung 1.1 Schema zur Veranschaulichung der Produktevielfalt ("kombinatorische Bi¬

bliothek"), die man prinzipiell aus den Ausgangsverbindungen Ax und B erhält ("BuildingBlocks"). Aj und B könnten z. B. je eine Gruppe von Amino-, und Carbonylverbindung sein.

Aus total x Verbindungen des Typs A und y Verbindungen des Typs B entstehen maximal

x-y Verbindungen.

Die kombinatorische Chemie wurde vor ca. zehn Jahren geboren und ist

somit noch ein sehr junger Forschungszweig. Ihr Erfolgspotential ist sehr

gross, verspricht sie doch ein universelles Werkzeug zur Entdeckung neuer

Wirksubstanzen zu werden. Der Weg dorthin ist jedoch noch sehr steinig,und zuerst muss noch eines der Hauptprobleme, die Analyse von komplexenGemischen, gelöst werden. Zudem ist bis heute nicht klar, welche Reaktions¬

typen und somit welche Verbindungsklassen der kombinatorischen Chemie

überhaupt zugänglich sind. Es scheint sich jedoch anhand der Fachliteratur

abzuzeichnen, dass vor allem Ester-, Amid- und Iminverbindungen bevor¬

zugte Zielverbindungen darstellen.

1.1 Geschichtliche Entwicklung der kombinatorischen Chemie

1.1.1 Peptidbibliotheken

Die kombinatorische Chemie hat in ihrer kurzen Geschichte eine bemer¬

kenswerte Entwicklung hinter sich. Die ersten Bibliotheken waren im allge¬meinen Peptid-Bibliotheken, welche auf der von R. B. Merrifield 1963 entwik-

kelten und inzwischen mehrfach verfeinerten Festphasensynthese basierten

(Merrifield, 1963). So vermochte H. M. Geysen bereits 1984 unter Verwen¬

dung von "Parallel Synthesis" Peptid-Bibliotheken mit 96 verschiedenen Se¬

quenzen auf Festphase herzustellen (Geysen et ah, 1984). Die einzelnen Se¬

quenzen waren auf "Pins" befestigt, welche wiederum an eine gemeinsameFestphase gebunden waren ("Multipin synthesis"). Idealerweise befanden

sich auf einem "Pin" nur identische Peptide. Geysen entwickelte zudem einen

wiederverwendbaren "ELISA Assay", womit Bindungsstudien zwischen den

Peptiden und Antikörpern durchgeführt werden konnten.

In einer nächsten Stufe der Entwicklung wurden dann die ersten echten

Peptid-Bibliotheken hergestellt, indem aktivierte Aminosäuren auf eine ein-

1. Einleitung 18

zige Festphase gegeben wurden (Geysen et ah, 1986). Der Nachteil dieser

Methode ist natürlich, dass in der Zusammensetzung unkontrollierbare Ge¬

mische mit Peptiden unterschiedlicher Länge entstehen, deren Analysen sehr

schwierig sind.

1.1.1.1 "Split and pool"- Bibliotheken

Der erste grosse Durchbruch in der kombinatorischen Chemie wurde 1991

von K. S. Lam mit der "Split and pool"-Methode geschaffen, die auf Vorar¬

beiten von A. Furka im Jahre 1988 beruhen (Furka et al., 1988; Furka et ah,

1991; Houghten et al, 1991; Lam et al, 1991; Sebestyen et al, 1993). Die "Splitand pool"-Methode ermöglicht die Synthese beliebig grosser Peptid-Biblio¬theken (Anzahl Produkte = Anzahl verwendete verschiedene Aminosäuren

potenziert mit der Länge der Sequenz) und deren Aufschlüsselung in weni¬

gen Schritten (Anzahl Schritte - Länge der Sequenz). Das heisst, eine Peptid-Bibliothek, synthetisiert aus den 20 natürlichen Aminosäuren, besteht bei ei¬

ner Peptidlänge von fünf Aminosäuren aus 205 (=3.2-106) verschiedenen Ver¬

bindungen und kann in fünf Schritten aufgeschlüsselt werden. Das Prinzipbesteht darin, die Bibliothek vor jedem Kopplungsschritt aufzutrennen

("Split") und die einzelnen Aminosäuren in einem separaten Reaktionsgefässan das Peptid anzukoppeln. Nach einem Waschschritt werden die verschie¬

denen Peptide erneut gemischt ("Pool") und wieder aufgetrennt. Nach der

letzten Kopplung wird nicht mehr gemischt, sondern die einzelnen Teilbi¬

bliotheken, deren letzte Aminosäure somit bekannt ist, einzeln auf ihr Ver¬

halten getestet. Zeigt sich in einer der Bibliotheken die gesuchte Aktivität,kennt man bereits die letzte Position der Sequenz der Wirksubstanz, und es

kann mit derselben Synthesemethode wiederum eine neue Bibliothek synthe¬tisiert werden, wobei die letzte Position unverändert bleibt. Daraus lässt sich

dann die zweitletzte Position bestimmen, usw. Zu bemerken ist zudem, dass

pro "Bead" nur eine Verbindung vorhanden ist und dass die Bibliotheken

entweder an der Festphase oder davon abgespaltet getestet werden können.

Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie sich prinzipiell auf alle

Arten von Verbindungen anwenden lässt, die sich aus mehratomigen Bau¬

steinen "Building blocks" zusammensetzen.

1. Einleitung 19

l."Bead"

2. "Split"

3. "Building Blocks:A, B,C" 04. "Coupling" f

5. "Pool"

6. "Split"

7. "Coupling"

8. "Pool"

9. "Split"

10. "Coupling"

11. "Screening Assay"

Abbildung 1.2 "Split and pool"-Bibliothek mit dem Umfang von 27 Verbindungen, aufgeteiltin 3 Pools, synthetisiert aus 3 Bausteinen ("Building Blocks"). Die Verbindungen besitzen die

Länge von 3 Bausteinen und die Art des letzten Bausteins jeder Verbindung ist jeweils be¬kannt. Die Screening-Assays werden getrennt mit den 3 verschiedenen Pools durchgeführt.

Mit der Zeit sind dann Variationen dieses Verfahrens aufgetaucht, welche

vor allem die Identifizierung der Sequenz des aktiven Peptides zu vereinfa¬

chen suchten. Das Prinzip ist, dass mit der Kopplung der Aminosäure eine

Markiersubstanz ("Tag") an der Festphase befestigt wird. Die Bibliothek wird

für das Screening nicht von der Festphase getrennt. Das "Bead" mit dem ak¬

tivsten Peptid wird isoliert und die Aminosäuresequenz anhand der Markier¬

substanzen identifiziert. Als "Tag" ist unter anderem DNA erfolgreich ver¬

wendet worden. Die Analyse wird mittels PCR-Amplifikation des DNA-

"Tags" und anschliessender Sequenzierung durchgeführt (Brenner & Lerner,1992; Needels et al, 1993). Eine andere erfolgreiche Markiermethode ist die

1. Einleitung 20

Verwendung von Markiersubstanzen mit photolabilen Bindungsstellen, wel¬

che im GC identifiziert werden können (Borchardt & Still, 1994; Ohlmeyer et

al, 1993).

1.1.1.2 "Phage display"-Bibliotheken

Eine weitere Möglichkeit, Peptid-Bibliotheken herzustellen, ist die "Phagedisplay"-Methode. Sie beruht darauf, dass Phagen, wenn sie eine Wirtszelle

(£. coli.) befallen, diese zur eigenen Replikation missbrauchen. Wird nun die

DNA-Sequenz eines bestimmten Proteins in das Gen eines Oberflächenpro¬teins des Phagen eingebaut, entsteht mit dessen Reproduktion in der Wirts¬

zelle ein neuer Phage, der das zusätzliche Peptid an der Oberfläche exprimierthat. Wird nun anstatt einer DNA-Sequenz eine ganze Bibliothek von DNA-

Sequenzen verwendet, ergibt sich eine auf den Phagenoberflächen befestigtePeptid-Bibliothek, mit einer Peptidart pro Phage. "Phage display"-Librarieswerden hauptsächlich für Selektionsexperimente verwendet. In diesen wird

für bestimmte Merkmale, wie z.B. Bindungsaffinitäten, selektioniert. Ein sol¬

ches Experiment führt zu einer stark verkleinerten Bibliothek mit der Eigen¬schaft, dass sämtliche darin enthaltenen Verbindungen ein bestimmtes

Merkmal mehr oder wenig stark aufweisen. Diese Bibliothek wird nun ampli-fiziert und/oder zusätzlich mutiert und dann für dasselbe Selektionsexperi¬ment wiederverwendet. Wird dieser Zyklus mehrfach wiederholt, erhält man

im günstigen Fall eine kleine Sammlung von Verbindungen mit einer starken

Ausprägung des selektionierten Merkmals.

1.1.2 "Small organic molecules"-Bibliotheken

1.1.2.1 Heterocyclen-Bibliotheken auf Festphase

Da Medikamente meistens aus kleinen organischen Molekülen und eher

selten aus Peptiden bestehen, liegt es auf der Hand, dass die bisher beschrie¬

benen kombinatorischen Methoden wegen ihrer Beschränkung auf die Pep-tidsynthese nicht den von der pharmazeutischen Industrie erhofften Erfolgbrachten. Die Versuche, sich andere Verbindungsklassen zu erschliessen,führte u.a. auf die Festphasensynthese von Heterocyclen-Bibliotheken. Die

Vorteile der Festphasenreaktion gegenüber der Flüssigphasen-Synthese sind

die, dass die Ausbeuten bei der Festphasen-Reaktion bezüglich des Reaktan-

den auf der Festphase sehr hoch sind (oft über 98%), dass eine einfache Reini¬

gung möglich ist und dass deswegen fast keine Probleme mit Nebenreaktio¬

nen auftreten. Der Hauptnachteil ist jedoch der, dass sich die Festphasensyn¬these seit der Einführung durch Merrifield in den 60er Jahren nicht allzu stark

verändert hat und hauptsächlich für Peptid-, DNA- und Oligosaccharidsyn-thesen weiterentwickelt wurde.

Zu den ersten nicht-peptidischen Anwendungen zählten die Dieckman-

Cyclisierung (Crowley & Rapoport, 1976) sowie die Synthese von unsymme¬trischen Carotinoiden (Leznoff & Sywanyk, 1977) und die Vorarbeiten dazu

(Leznoff & Wong, 1973). Die ersten nicht-peptidischen Bibliotheken beruhten

hauptsächlich auf der Bildung von Amiden, eine Reaktion, mit der man be¬

reits reichlich Erfahrung in der Festphasensynthese von Peptiden hatte. Mit

der Zeit wurden immer mehr Reaktionstypen verwendet, und es scheint sich

abzuzeichnen, dass viele Reaktionen, die in Lösung ablaufen auch auf die

1. Einleitung 21

Festphase übertragen werden können. Als Ellman et al. 1992 einen Vorschlagzur Festphasensynthese von 1,4-Benzodiazepinen (4) publizierten (Bunin &Ellman, 1992), waren sie unter den ersten, welche die Synthese einer He-

terocyclen-Bibliothek ankündigten. Es dauerte allerdings weitere zwei Jahre,bis sie ihre Resultate, eine Benzodiazepin-Bibliothek mit 192 Verbindungen,der Öffentlichkeit zugänglich machen konnten(Bunin et al, 1994).

12 3 4

Abbildung 1.3 Festphasensynthese von 1,4-Benzodiazepinen (4) gemäss J. A. Ellman et al.

a) 20 % Piperidin in DMF; b) fluorierte N-FMOC-Aminosäure, 4-Methyl-2,6-di-ferf-butylpyri-din; c) 5 % Essigsäure in DMF, 60 °C; d) Litiiertes 5-(Phenylmethyl)-2-oxazolidinon in THF, -

78°C, gefolgt von einem Alkylierungsmittel und DMF

In der Zwischenzeit wurden sie jedoch von Hobbs-DeWitt et al. (Hobbs-DeWitt et al, 1993) überholt, welche ihrerseits die Synthese einer 1,4-Benzo-

diazepin- und einer Hydantoin-Bibliothek ("DIVERSOMER libraries") pu¬blizierten, ein Erfolg, der allerdings mehr auf "Massive parallel synthesis"denn auf wahrer kombinatorischer Chemie beruhte. Seit diesen Anfängen ist

eine anschwellende Flut von Publikationen erschienen mit Synthesevorschlä¬gen für alle möglichen nicht peptidischen Festphasen-Bibliotheken, wie z.B.

für Cubane, Xanthine, ß-Lactame, Pyrrolidine, Thiazolidine, Tetrahydrofu-rane, Benzopyrane, Isoxazole, Thiazole, Cyclopentane, Cyclohexane, Pipera-zine, Pyridine, Quinolone, Benzimidazole, Isoquinoline, Quinazoline, Phthal-

hydrazine, Carboline, Triazine und viele weitere (Liste entnommen aus einer

Review von K. S. Lam (Lam et al, 1997)).

1.1.2.2 Bibliotheken synthetisiert in Lösung ("Solution phase libraries")

Die Vermutung liegt nahe, dass wenn sich Bibliotheken auf Festphasensynthetisieren lassen, es auch möglich sein sollte, Bibliotheken mit herkömm¬

lichen Verfahren und Techniken in flüssiger Phase herzustellen. Einer der

grössten Nachteile der Festphasensynthese ist es, dass nur relativ kleine Men¬

gen hergestellt werden können. Zudem gibt es eine immense Anzahl an op¬timierten Reaktionen in Flüssigphase auf die zurückgegriffen werden kann,während für viele Festphasenreaktionen die genauen Bedingungen erst noch

erarbeitet werden müssen. Dabei besteht zusätzlich das nicht zu geringe Ri¬

siko, dass sich die Methode wegen zu niedrigen Ausbeuten nicht implemen¬tieren lässt.

1. Einleitung 22

So ist es doch erstaunlich, dass keine Publikationen zum Themenkreis

"Flüssigphasen-Bibliothek" für die Zeit vor 1996 zu finden sind. Unter den

ersten, die sich dieses Themas annahmen, waren D. L. Boger und Jeremy K.

M. Sanders. Boger verwendete ein Säureanhydridtemplat und addierte Funk¬

tionalität durch einfache Amid-, Ester- und Carbamatreaktionen (Boger et al,1996; Cheng et al, 1996) sowie Komplexität durch die Olefin-Metathese (Boger& Chai, 1998; Boger et al, 1997), während sich Sanders hauptsächlich mit

Umesterungen in cinchonidinähnlichen Substanzen befasst (Brady & Sanders,1997'a; Brady & Sanders, 1997b; Rowan & Sanders, 1997). Etwa zur gleichenZeit beschrieb Janda (Han & Janda, 1996) die Synthese einer Peptidoid-Bi-bliothek (genauer a-Aza-Aminosäuren-Bibliothek) in flüssiger und auf fester

Phase. Ebenfalls erwähnenswert sind Kobayashi (Kobayashi & Nagayama,1996), der bereits 1996 die Synthese einer Quinoline-Bibliothek veröffentlichte,Sim (Sim & Ganesan, 1997) mit einer Thiohydantoin- und Cook (An & Cook,1996; An et al, 1997) mit einer Polyazapyridinophane-Bibliothek.

Es ist zu beobachten, dass die Anzahl der Publikationen auf dem Gebiet

der kombinatorischen Flüssigphasen-Chemie im Vergleich zur Menge der

Publikationen auf dem Gebiet der kombinatorischen Festphasen-Chemie re¬

lativ klein ist. Dies hängt wahrscheinlich mit den vielen ungelösten Proble¬

men zusammen, die das Herstellen von kombinatorischen Bibliotheken in

flüssiger Phase mit sich bringt:

a) Die Analyse von komplexen Gemischen ist äusserst schwierig und oft un¬

befriedigend.b) Die heute verwendeten Screening-Methoden lassen es als unsinnig er¬

scheinen, Mischungen mit einer grossen Anzahl an Verbindungen auszu-

testen, da die Möglichkeit fehlt, die Wirksubstanz im Falle einer festge¬stellten Aktivität zu identifizieren. Es muss darum eine neue Methode

entwickelt werden, welche dies zulassen würde.

c) Die Anzahl der möglichen Reaktionsarten ist wahrscheinlich beschränkt,da die meisten Reaktionstypen selten für alle möglichen Produkte zu einer

gleichmässigen Verteilung führen.

d) Die Reinigung einer Bibliothek ist nicht einfach und vielfach mit einem

Verlust an Komplexität verbunden.

Die ersten beiden Punkte stellen zwei grosse Hindernisse dar, die es zu

überwinden gilt, soll der kombinatorischen Flüssigphasen-Chemie der

Durchbruch gelingen.

So scheint bis in nächster Zukunft keine befriedigende Abhilfe für das

Analyseproblem in Aussicht zu stehen. Die Methode der Wahl ist bis jetzt die

Massenspektrometrie, je nach Bedarf mit einer vorgeschalteten chromatogra¬phischen Trennung (GC, HPLC). Versucht wurden verschiedenste Methoden;u.a. Kapillar-Elektrophoresen-MS (Chu et al, 1996) und FT-ICR-MS mit Elec-

trospray-Ionisierung (ESI) (Gao et al, 1996; Wigger et al, 1997). Doch auch

hier ist die Aussagekraft begrenzt oder mit einem sehr hohen Aufwand ver¬

bunden, und ab etwa fünfzig verschiedenen Substanzen häufen sich die ana¬

lytischen Probleme. Die eindeutige Zuweisung der Signale zu den einzelnen

Verbindungen ist nicht mehr ohne weiteres möglich, und das Auflösungs¬vermögen des Gerätes stösst auch an seine Grenzen. Der kombinatorische

Chemiker scheint sich damit zufriedengeben zu müssen, dass er nur für klei-

1. Einleitung 23

nere Flüssigphasen-Bibliotheken quantitative und auch qualitative Aussagenmachen kann. Für grössere Bibliotheken bleibt nichts anderes übrig, als das

erwartete Massenspektrum zu errechnen und mit dem gemessenen zu ver¬

gleichen. Sind grosse Unterschiede festzustellen, haben wahrscheinlich uner¬

wartete Nebenreaktionen stattgefunden, oder die Umsätze waren nicht voll¬

ständig. Die einzigen anderen Auswege könnten allenfalls mehrdimensionale

Chromatographiemethoden oder die Anwendung des "Split and pool"-Ver-fahrens sein.

1.2 Zielsetzung dieser Arbeit

Das Ziel dieser Arbeit ist es, neue Synthesewege für kombinatorische Bi¬

bliotheken in flüssiger Phase ausfindig zu machen. Zudem soll versucht wer¬

den, einen Lösungsansatz für eine neuartige Screening-Methode zu entwik-

keln, welcher auf der Synthese von virtuellen Bibliotheken in Gegenwart ei¬

nes Rezeptors beruht ("Receptor assisted combinatorial synthesis", "RACS").Als Zielrezeptor der Wahl wurde hierfür RNase A gewählt, und als Bibliothek

wurden Diole als Nukleotidanaloge verwendet.

In einem zweiten Teil soll die postulierte evolutionäre Entwicklung der

Aktivität von BS-RNase, einem Abkömmling der RNase A, untersucht wer¬

den. Das Wirkungsspektrum der BS-RNase reicht von RNA-Spaltung über

Immunosuppression bis zur Antitumoraktivität. Das aufgrund von Modell¬

vorstellungen über Evolution postulierte Vorgängerenzym der heutigen BS-

RNase und der Pseudogene der Cervidae und Giraffidae soll exprimiert und auf

seine Eigenschaften hin untersucht werden.


2. Synthese kombinatorischer Bibliotheken

Um erfolgreich in einer kombinatorischen Synthese eingesetzt werden zu

können, muss ein Reaktionstyp gewisse Anforderungen erfüllen. Die wichtig¬ste von allen ist, dass er eine hohe Toleranz gegenüber möglichst vielen funk¬

tionellen Gruppen aufweist. Eine Reaktion, die nur mit Kohlenwasserstoff¬

verbindungen abläuft, ist demnach nicht geeignet. Weiter sollten keine Ne¬

benreaktionen stattfinden, da sonst bei einer allenfalls später beobachteten

biologischen Wirkung nicht klar ist, ob diese aufgrund der Produkte oder der

Nebenprodukte eingetreten ist. Es ist zudem wünschenswert, dass sämtliche

Produkte in hohen Ausbeuten auftreten und dass das thermodynamischeGleichgewicht zwischen den Produkten möglichst ausgeglichen ist. Weiter

wäre es äusserst hilfreich, wenn eine einfache Möglichkeit bestünde, die ge¬wonnenen Bibliotheken wenigstens grob reinigen zu können, ohne dass man

damit rechnen muss, Teile davon zu verlieren. Aufgrund dieses Katalogs ist

es offensichtlich, dass nicht allzu viele Reaktionstypen in die nähere Auswahl

kommen können. Auf den ersten Blick geeignet wären z.B. Amid-, Ester- und

Iminbildungen, Diels-Alder- und andere Cycloadditionen, die Benzoinkon-

densation, die Aldolkondensation, die Claisen-Esterkondensation, die Mi¬

chael-Addition und ihre Variationen, die Wittig-Reaktion und ihre Variatio¬

nen, eventuell die Heck-Reaktion und einige klassische Heterocyklen-Synthe-sen.

Aufgrund neuerer Forschungsergebnisse schien zudem eine weitere Reak¬

tion, die Olefin-Metathese, für die kombinatorische Chemie zugänglich zusein.

2.1 Die Olefin-Metathese

Vor Anfang der sechziger Jahre befasste sich niemand ernsthaft mit der

Olefin-Metathese (Blanks & Bailey, 1964; Ivin, 1983). Die Reaktion ist eine

Umlagerungsreaktion von Olefinen und führt bei unsymmetrischen Olefin zu

einem Gemisch mit allen möglichen Produkten, deren Anteile in erster Nähe¬

rung der statistischen Verteilung entsprechen, im Prinzip aber durch die

Thermodynamik festgelegt sind.

Ri /R25a

R3

Ri

R4 Kat.

FV^,R3 R2^^-R4

5b S Ri'^R3R2^R4/

R3\R4 5c 5d

Abbildung 2.1 Metathese-Reaktion. Die metallkatalysierte Reaktion führt zu einer Umlage-rung der Substituenten.


Die Reaktion ist metallkatalysiert und läuft nach einem Kettenmechanis¬

mus ab (Calderon et al, 1976; Ivin, 1983). Zuerst bildet sich aus dem Olefin

(5a) und dem Metallkatalysator ein Carben-Komplex (6a), an den ein weiteres

Olefin (5b) addiert werden kann. Das entstandene Vierring-Addukt zerfällt

unter Bildung des neuen Olefins (5c) und des neuen Metall-Carben-Komple-xes (6b).

Ri R26a

Ri

w =

Kat.= V=M

/ \R3 R4

5a

/Rs

+

Ri R2

HR3 R4

5b

R3 R4

Abbildung 2.2 Reaktionsmechanismus. Es bildet sich ein Metall-Carben-Komplex, welcher

sich an ein weiteres Olefin zu einem Vierring anlagert. Der Vierring zerfällt, und es entsteht

entweder das neue oder das alte Olefin. Der ebenfalls entstehende Metall-Carben-Komplexnimmt wieder an der Katalyse teil und addiert sich an ein neues Olefin.

Es wurden verschiedenste Systeme beschrieben, die meistens auf Wolfram-,

Molybdän- oder Rhenium-Katalysatoren beruhen. Sie ermöglichten die Durch¬

führung von Metathese-Reaktionen mit funktionalisierten Olefinen

(CH3(CH2)mCH=CH(CH2)CH2X/ X = OAc, OH, CHO, COOEt, Cl; m = 0-5, n =

4-10), wobei jedoch häufig unbefriedigende Ausbeuten erzielt wurden. An

dieser Situation änderte sich lange nicht viel. Die Metathese-Reaktion besass

nicht allzu viel Wert als Werkzeug in der organischen Synthese. In der Indu¬

strie wurde sie allerdings sehr häufig eingesetzt, um aus natürlichen Fetten

ungesättigte Fettsäuren für die Tensidproduktion herzustellen. Die Hauptan¬wendung ist bis heute jedoch die Produktion von Grundstoffen in der Petro-

und der Polymerchemie.

Zu Beginn der 90er Jahre eröffneten sich neue Perspektiven mit den Publi¬

kationen eines Carben-Molybdän-Katalysators (7) von R. R. Schrock (Schrocket al, 1990) und eines Carben-Ruthenium-Katalysators (8) von H. R. Grubbs

(Nguyen etal, 1992).

f-Pr T '-Pr

a)

P(Ph)3 PhN Ph

c-u /=ro'"mL /Uch3RO*' ^^ ^CH3

b) Ru=/

ci'lPh

R = CCH3(CF3)2 P(Ph)3

Abbildung 2.3 a) Schrock's Katalysator; basierend auf einem Molybdän-Carben-Komplex. b)Grubbs' Katalysator; basierend auf einem Ruthenium-Carben-Komplex.

Diese beiden neuen Systeme ermöglichten erstmals die Durchführung von

Metathese-Reaktionen mit funktionalisierten Olefinen, was anhand von meh-


reren Ringschluss-Studien ("Ring closing metathesis"; RCM) gezeigt werdenkonnte (Fu & Grubbs, 1992a; Fu & Grubbs, 1992b; Wu et al, 1993). Es konnten

sogar cyclische Peptide und andere Macrocyklen synthetisiert werden

(Grubbs et al, 1995; Miller et al, 1996; Miller & Grubbs, 1995). Zudem wurde

1995 eine verbesserte Form des Grubbs-Katalysators publiziert, welche ge¬

genüber der älteren Form eine erhöhte Reaktivität besitzt (Grubbs et al, 1995;Schwab et al, 1996).

PCy3

CI,, I H

Ru=

Cl'pcy3 Ph

Abbildung 2.4 H. R. Grubbs' modifizierter und verbesserter Katalysator. Der Carbenteil be¬

steht aus einem Benzyl, und die Triphenylphosphine wurden durch Tricyclohexylphosphi-nen ersetzt.

Da sich Grubbs jedoch hauptsächlich für Polymerisationen durch Ringöff-nungs-Metathese ("Ring opening metathesis polymerization", ROMP)(Benedicto et al, 1995; Hillmyer et al, 1995; Kanaoka & Grubbs, 1995; Lynn et

al, 1996; Wu & Grubbs, 1995) interessiert, wurden in seiner Gruppe keine

Versuche zur Kreuz-Metathese ("Cross metathesis", CM) unternommen. So

war unklar, ob aufgrund der Resultate aus den RCM-Experimenten eine er¬

folgreiche Synthese einer kombinatorischen Bibliothek mit "Cross metathesis"

möglich war. Eines der primären Ziele dieser Dissertation war es somit, die

Grenzen der Kreuz-Metathese zu ermitteln, um deren Eignung für die kom¬

binatorische Chemie beurteilen zu können. Dazu wurde ausschliesslich mit

dem Grubbs-Katalysator (neuere Version) gearbeitet, da dieser gegenüberdem Schrock-Katalysator den Vorteil hat, dass er in ungelöster Form weder

feuchtigkeits- noch sauerstoffempfindlich ist.

Abb. 2.5 a) Ringschluss-Metathese ("Ring closing metathesis"; RCM)b) Polymerisation durch Ringöffnungs-Metathese ("Ring opening metathesis

polymerization"; ROMP)c) Kreuz-Metathese ("Cross metathesis"; CM)


2.1.1 Synthese des Grubbs-Katalysators

Die Vorschrift für die zweistufige Synthese des Katalysators (9) war zumZeitpunkt des Beginns meiner Dissertation noch nicht publiziert und wurde

mir freundlicherweise von H. R. Grubbs zur Verfügung gestellt. Zuerst wird

zu RuCl2(PPh3)3 (15) bei -78 °C und unter Schutzgas ein zweifacher Über-

schuss Diazobenzyl (14) zugegeben. Unter sichtbarer N2-Entwicklung entsteht

das Zwischenprodukt (16). Mit der Zugabe von 2.25 Equivalenten PCy3 wer¬

den die Triphenylphosphine am Ruthenium ersetzt, und nach mehrfachem

Waschen erhält man den Katalysator in reiner Form.

PPh3 PPh3 PCy3

Abbildung 2.6 Synthese des Grubbs-Katalysators in zwei Schritten.

2.1.2 Olefin-Metathese mit einzelnen Olefinen

Um die Eignung der Olefin-Metathese für die kombinatorische Chemie

festzustellen, wurden mehrere Versuchsreihen unternommen und verschie¬

dene terminale Olefine unter gleichbleibenden Bedingungen ausgetestet. Der

Grund für die Verwendung terminaler Olefine ist die Bildung von Ethylen(17), welches aufgrund seines Übergangs in die Gasphase das Reaktions¬

gleichgewicht auf die Produktseite verschiebt.

Die Eignung des Olefins für Metathesen wurde anhand der relativen Re¬

aktionsfähigkeit bezüglich eines Standardolefins (Allylbenzol (18a)) beurteilt.

Dazu wurden die beiden Olefine (18a, 18b - u) zusammen einer Olefin-Me¬

tathese unterworfen und dann die Ausbeuten der entstandenen symmetri¬schen (19aa, 19bb - 19uu) und unsymmetrischen Produkte (19ab - 19au) be¬

stimmt.

19bb-19uu

Abbildung 2.7 Metathese-Reaktion mit Allylbenzol (18a) und einem weiteren Olefin (18b-18u). Rechts sind die erwarteten Produkte aufgeführt; die symmetrischen Produkte des Al-

lylbenzols (19aa) bzw. des verwendeten Olefins (19bb - 19uu) sowie deren Kreuzprodukte(19ab - 19au). Zudem entsteht Ethylen (17), welches in die Gasphase übergeht und damit das

Gleichgewicht der Reaktion auf die Produktseite zieht.


Da Sauerstoff und Wasser einen negativen Einfluss auf die Lebensdauer

des gelösten Katalysators haben, wird in entgastem und trockenem Lösungs¬mittel (CH2C12) unter Schutzgas (Ar) gearbeitet. Die Reaktionslösung verfärbt

sich nach ca. 10 bis 60 s. von dunkelviolett nach braun, was auf die Entste¬

hung des aktiven Carbenkomplexes zwischen Olefin und Ruthenium sowie

auf erste Abbauprodukte des Katalysators hindeutet. Da der Katalysator nur

während einer gewissen Zeit voll funktionstüchtig ist, wird die Reaktion nur

mit der Hälfte der total verwendeten Menge an Katalysator (2 mol%) gestar¬tet; der zweite Teil wird nach Ablauf der Hälfte der Reaktionszeit und nach

nochmaligem Entgasen der Reaktionslösung zugegeben. Abgebrochen wird

die Reaktion durch die Zufuhr von Luft, wobei sich die Lösung in ein tiefes

Dunkelgrün verfärbt. Die Rohprodukte werden über Silicagel filtriert und

dann direkt im GC-MS analysiert. Für die quantitative Auswertung wurde

Biphenyl als interner Standard, die Edukte sowie das symmetrische Produkt

von Allylbenzol (19aa) als externe Standards, verwendet, was die Bestim¬

mung deren Anteile ermöglichte. Da keine Nebenprodukte beobachtet wur¬

den, konnten aus diesen Werten die Mengen der anderen beiden Reaktions¬

produkte bestimmt werden. Reaktionsumsätze konnten bei folgenden Eduk-

ten beobachtet werden: Allylbenzol (18a), 4-Methylpenten (18b), 1-Hepten(18c), Allylcyclopenten (18d), Vinylnaphthalin (18e), Allylphenylsulfon (18f),Allylbutyrat (18g), Methyl-3-butenoat (18h), Ethyl-2-methyl-4-pentenoat (18i),l,2-Epoxy-5-hexen (18j), Allylanisol (18k), Safrol (181), 2-Allyloxybenzaldehyd(18m), Allylcyclohexanon (18n), Allylpentafluorobenzol (18o), 4-Fluorostyrol(18p), 3-Nitrostyrol (18q), Allylbromid (18r), 4-Penten-l-al (18s), Allylmethyl-sulfid (18t) und N-trityliertes Allylamin (18u). Die Resultate sind in Tab. 2.1

aufgeführt.


Olefin Verbindungmol % mol % mol % mol % mol %18 Nr. 18a 18b-18u 19aa 19ab-19au 19bb-19uu

^D 18a 4.4 95.6

-r 18b 1.0 35.7 19.3 42.2 1.9

^~

18c Trace Trace 2.7 94.7 2.7

-ô 18d 2.6 Trace 12.7 56.1 28.5

CC^ 18e 2.5 8.8 30.7 30.6 27.5*

-|0 18f 5.4 10.7 18.7 49.3 16.0*

0

18g 12.3 5.0 6.3 66.3 10.0

=/-^-OMe00

=-^00o

18h 17.7 3.6 1.8 68.0 8.9

18i 2.7 4.2 18.3 37.3 27.6

18J 25.3 20.6 15.8 20.1 18.2

^^ÔMe 18k 1.2 2.4 18.7 59.5 24.0

0

181 1.9 2.0 24.0 48.1 17.0*

18m 2.9 3.7 17.6 59.3 10.3

=â° 18n 27.6 22.6 7.9 31.6 8.3

iif

18o Trace Trace 8.3 83.5 6.6

ViF 18p 6.1 40.9 24.0 22.4 1.0*

*oNOa 18q 3.1 53.3 26.1 16.6 <0.5*

=^Br 18r 40.1 51.1 5.5 2.7 <0.5*

0

18s 46.0 49.9 1.9 2.1 <0.5*

^SMe 18t 46.9 48.9 2.0 2.6 <0.5*

=—NHCPh3 18u 47.0 49.0 1.5 1.9 <0.5*

Tab. 2.1 Metathese-Reaktion mit Allylbenzol (18a) und einem einzelnen Olefin (18b - 18u).Die Anteile der Produkte und Reaktanden am Rohgemisch nach 6 h Reaktionszeit sind in

mol% angegeben. Werte versehen mit einem Stern (*) stehen für Verbindungen, welche nichtdirekt im GC-MS beobachtet werden konnten, aus Gründen der Massebalance aber vorhan¬den sein müssen.

Keine Produkte konnten unter denselben Reaktionsbedingungen für

Vinylanthracen (18ba), 2,6-Dichlorostyrol (18bb), Sclareol (18bc), Nootkatone(18bd), Allyldiphenylphosphin (18be), Allylamin (18bf), Allylcyanid (18bg),


Pentennitril (18bh), Allylimidazol (18bi), 4-Vinylpyridin (18bj), N-

Vinylphthalimid (18bk), 2-(3-Pentenyl)-pyridin (18bl), Allylrhodanin (18bm)und N-Allyltrifluoroacetamid (18bn) nachgewiesen werden.

Die gefundenen Resultate stimmen nicht allzu optimistisch. Sie zeigen,dass der Grubbs-Katalysator (9) bei der Kreuz-Metathese nicht so tolerant ge¬

genüber funktionellen Gruppen ist, wie dies die bereits publizierten RCM-Experimente erwarten Hessen. Die gute Nachricht ist, dass für sämtliche Koh¬

lenwasserstoffe, ausser bei starker sterischer Behinderung (18ba), ein sehr ho¬

her Umsatz (> 85 %) zu beobachten ist. Für sauerstoffhaltige und halogenierteOlefine (18g - 18p) ist im allgemeinen eine leichte bis mittelstarke Abnahme

der Aktivität festzustellen, während bei schwefelhaltigen Edukten (18t) ein

grosser Verlust zu verzeichnen ist. Besonders unbefriedigend ist jedoch vor

allem, dass mit Ausnahme der Nitroverbindung 18q der Katalysator 9 bei al¬

len anderen stickstoffhaltigen Verbindungen (18u, 18bf - bn) nahezu vollstän¬

dig versagt.

Die Ursachen dafür sind nicht vollständig bekannt. Wahrscheinlich hängensie damit zusammen, dass die freien Elektronenpaare der Heteroatome mit

dem Ruthenium zu interagieren vermögen. Es gibt dennoch Berichte (Boger &Chai, 1998; Boger et al., 1997), wonach Metathese möglich ist für stickstoffhal¬

tige Verbindungen, allerdings nur, wenn der Abstand zwischen der Doppel¬bindung und dem verwendeten Amid mindestens vier C-Atome beträgt undeine grosse Menge Katalysator verwendet wird (20 - 25 mol%).

Unerwarteterweise wurden für vier Olefine mit relativ hohen Umsätzen

(18e, 18f, 181,18p) keine symmetrischen Produkte detektiert. Vermutlich sind

sie nicht stabil genug für GC.

Die Konsequenz ist, dass sich nur Olefinbibliotheken mit beschränkter

funktioneller Diversizität herstellen lassen. Will man zusätzliche funktionelle

Gruppen einführen, hat dies in einem späteren Schritt zu erfolgen. Verwendetwerden können zudem nur Olefine mit hoher Reaktivität, da sonst der Kata¬

lysator zu schnell neutralisiert wird.


2.2 Synthese von Olefin-Bibliotheken

In einem nächsten Schritt wurden die gewonnenen Erkenntnisse zur Syn¬these von kombinatorischen Olefin-Bibliotheken verwendet. Zuerst wurden

kleine Modell-Bibliotheken synthetisiert und charakterisiert.

2.2.1 Berechnung der Grösse einer durch die Metathese gewonnenen Ole¬

fin-Bibliothek

Es leuchtet ein, dass bei einer Olefinmetathese dasselbe Produkt entsteht,ob Ax mit A oder A mit Ax reagiert. Da zudem nur terminale Olefine ver¬

wendet werden, entsteht Ethen, welches in die Gasphase übergeht. Die An¬

zahl der entstehenden Produkte lässt sich demnach so berechnen:

Ist die Anzahl der Edukte E = n, so ist die Anzahl der Produkte P = n + (n-1) +(n-2) +

...

= n(n+l)/2.

Dies berücksichtigt nicht, dass stets ein eis- als auch ein trans-Olefin ent¬

steht, was die Anzahl der verschiedenen Produkte nochmals um den Faktor

zwei erhöht.


2.2.2 Modell-Bibliothek 1

Die erste Modell-Bibliothek wurde aus fünf Olefinen, Allylbenzol (18a), 4-

Methylpenten (18b), 1-Hepten (18c), Methyl-3-Butenoat (18h) und Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i), hergestellt. Die Olefine (0.5 - 10 mmol pro Olefin, jenach erwünschter Menge an Bibliothek) wurden in CH2C12 gelöst, zum Kata¬

lysator 9 (1 mol%) gegeben und unter Schutzgas zum Rückfluss erhitzt. Die

Vorgehensweise ist identisch mit der für einzelne Olefine.

19bc O I9hh O

o

Abbildung 2.8 Modell-Bibliothek 1, synthetisiert aus Allylbenzol (18a), 4-Methylpenten(18b), 1-Hepten (18c), Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i) und Methyl-3-Butenoat (18h). Es ent¬

stehen 15 Produkte, welche alle im GC-MS, zusammen mit den Edukten, charakterisiert wer¬

den konnten.

Die Analyse wurde nach Filtration über Silicagel mittels GC-MS durchge¬führt (GC: 10 °C/min., 50-250 °C; MS: EI+-mode). Es konnten sämtliche Pro¬

dukte anhand ihrer Massen charakterisiert werden. Zudem konnten die we¬

niger flüchtigen Edukte beobachtet werden.


100 %

CHT

OTTO

TOI

Abbildung 2.9 GC-MS Chromatogramm der Modell-Bibliothek 1. Sämtliche erwarteten Pro¬

dukte sowie die weniger flüchtigen Edukte können detektiert werden.

Bern.: Es ist sowohl das eis- als auch das trans-Produkt zu erwarten. Aus Gründen der Über¬

sichtlichkeit wird jeweils nur das cz's-Produkt aufgeführt, welches die beiden möglichen Ver¬

bindungen repräsentiert. Die dazugehörenden Pfeile zeigen mit einer Ausnahme (19bb) stets

auf ein Paar von Signalen. Weiter ist aus statistischen Gründen eine Produkteverteilung von

2:1 zugunsten des frans-Produktes zu erwarten. Diesem wird somit das grössere Signal zuge¬

ordnet. Diese Bemerkung gilt für alle hier in dieser Dissertation unter diesem Kapitel aufge¬führten Spektren.


2.2.3 Modell-Bibliothek 2

Die zweite Modell-Bibliothek wurde analog zur ersten aus fünf Olefinen,

Allylbenzol (18a), 4-Methylpenten (18b), 1-Hepten (18c), Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i) und AUylanisol (18k) hergestellt.

Abbildung 2.10 Modell-Bibliothek 2, synthetisiert aus Allylbenzol (18a), 4-Methylpenten(18b), 1-Hepten (18c), Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i) und AUylanisol (18k). Es entstehen 15

Produkte, welche alle im GC-MS, zusammen mit den Edukten, charakterisiert werden konn¬

ten.

Die Analyse wurde analog zu derjenigen der Modell-Bibliothek 1 durchge¬führt. Auch für die Modell-Bibliothek 2 konnten sämtliche erwarteten Pro¬

dukte anhand ihrer Massen nachgewiesen werden.


100 %

600 1200 1800 2400

8:02 13:02 18:02 23:02

Abbildung 2.11 GC-MS Chromatogramm der Modell-Bibliothek 2. Sämtliche erwarteten

Produkte sowie die weniger-flüchtigen Edukte können detektiert werden.

2.2.4 Olefin-Bibliothek

Nach der erfolgreichen Synthese der beiden Modell-Bibliotheken wurde

eine Bibliothek aus sämtlichen erfolgversprechenden ausgetesteten Olefinen,insgesamt 16, mit einem Umfang von 152 Verbindungen (inkl. Edukte) syn¬thetisiert. Die Olefine (Allylbenzol (18a), 4-Methylpentene (18b), 1-Hepten(18c), Allylcyclopentene (18d), Vinylnaphthalin (18e), Allylphenylsulfon (18f),Allylbutyrat (18g), Methyl-3-butenoat (18h), Ethyl-2-methyl-4-pentenoat (18i),l,2-Epoxy-5-hexen (18j), AUylanisol (18k), Safrol (181), Allylcyclohexanon(18n), Allylpentafluorobenzol (18o), 4-Fluorostyrol (18p) und 3-Nitrostyrol(18q), je 0.5 mmol, total 8.0 mmol) wurden unter Schutzgas in CH2C12 vorge¬

legt und der Katalysator (2 mol%) zugegeben. Das experimentelle Vorgehenist identisch mit demjenigen für einzelne Olefine.


Abbildung 2.12 Die für die Herstellung einer grösseren Olefin-Bibliothek mit 152 Olefinen

verwendeten 16 Edukte.

Die Analyse wurde wiederum nach der Filtration des Reaktionsgemischesüber Kieselgel mit GC-MS durchgeführt (GC: 10 °C/min., 50-250 °C; MS: EI+-

mode). Da es praktisch nicht möglich ist, mehr als 50-100 Verbindungen ex¬

plizit im GC-MS zu identifizieren, die Retentionszeiten sowie die Massen¬

spektren der in den beiden Modell-Bibliotheken lund 2 analysierten Verbin¬

dungen jedoch bereits bekannt waren, wurde diese Bibliothek auf deren An¬

wesenheit hin untersucht. Insgesamt wurden etwa 10 % aller Verbindungenidentifiziert. Da ein Teil der Olefine nicht vollständig reagiert hat, ist ein ho¬

her Eduktanteil in der Bibliothek vorhanden. Der Umsatz konnte auch durch

verlängerte Reaktionszeit nicht erhöht werden. Es wurde auch nicht versucht,durch Einsatz einer grösseren Menge Katalysator mehr Produktbildung zu

erhalten, da keine effiziente Methode zu dessen späteren Entfernung aus der

Bibliothek bekannt ist.


100 I

iwLJv_J__x'-1—r -1—I—J—I—r-

30 00

28:02

-i—i—i i i—r—r

4000

36:22

2000

19:42

Abbildung 2.13 GC-MS Chromatogramm der Olefin-Bibliothek. 10 % der erwarteten Pro¬

dukte konnten explizit detektiert werden.

2.2.5 Addition von Funktionalität zu Olefin-Bibliotheken

2.2.5.1 Hydrazid- und Urethan-Bibliotheken

Eine Möglichkeit, Stickstoff in die oben synthetisierten Bibliotheken einzu¬

führen ist die Umwandlung von Estern in Hydrazide. Der ursprüngliche An¬

satz, diese dann über eine Curtius-Umlagerung (Möller, 1957) in Urethane zu

überführen, hat sich wegen der Bildung vieler Nebenprodukte als nicht prak¬tikabel herausgestellt. Zuerst wurden wiederum einige Vorversuche durchge¬führt um die Reaktionsparameter besser bestimmen zu können. Danach

wurde eine kleine Olefin-Bibliothek (synthetisiert aus Allylbenzol (18a), 4-

Methylpenten (18b) und Ethyl-2-methyl-4-pentenoat (18i)), welche total 4

Ester enthielt (inkl. Edukt) in MeOH gelöst und mit einem grossen Über-schuss Hydrazin-Hydrat bei 80 °C zum Rückfluss erhitzt. Das überschüssigeHydrazin und das LM wurden anschliessend im HV abdestilliert, und die

Hyrazide kristallisierten nach einer gewissen Zeit aus. Die Analyse wurde

wiederum im GC-MS durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass der Um¬

satz nicht vollständig war und dass mit den Produkten auch einige wenigeNebenprodukte entstanden sind, die nicht zugeordnet werden konnten.


NHNH2

NHNH2

Abbildung 2.14 Hydrazid-Bibliothek synthetisiert aus einer Olefin-Bibliothek mit 4 Estern,basierend auf Allylbenzol (18a), 4-Methylpenten (18b), und Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i).Es wurden nur die Ester angegeben; die restlichen 5 Olefine (inkl. Edukte) sind unwichtig für

diese Derivatisierung.

100 %

TOT

18i18a

*[i#**|JU(

20i

|^W*wV

19bi

19ab

19ai

,20bi

19ii

wiWV^WWiv

19aa

20ai

vWV Wk^^^^mWrffSf^fn*,^*v^^

600 1200 1800 2400 3000 3600

8:02 13:02 18:02 23:02 28:02 33:02

Abbildung 2.15 GC-MS Chromatogramm der synthetisierten Hydrazid-Bibliothek. Drei der

vier erwarteten Hydrazide (20i, 20ai, 20bi) sind vorhanden. Das Signal von 20ii kann nicht

eindeutig zugeordnet werden. Ebenfalls vorhanden sind die anderen Mitglieder der Olefin-

bibliothek mit Ausnahme von 19bb, welches unter den herrschenden Reaktionsbedingungenverdampft.


Die Umlagerung in Urethane wurde mit Amylnitrit in HCl-gesättigtemEtOH durchgeführt. Mittels GC-MS-Analyse konnten alle erwarteten Pro¬

dukte identifiziert werden.

H2NHN

H2NHN

H2NHN

NHNH2

ONO

HCI/EtOH Etck.N

2. D (55°C), 6h J | 21 bi

NHNH2

Abbildung 2.16 Urethan-Bibliothek synthetisiert aus der obigen Hydrazid-Bibliothek.

100 X

19aa

w

19ab

19bi,

21 bi,19ai,

21 ai

UaJV~

2400

23:02

600

8:02

1200

13:02

1800

18:02

Abbildung 2.17 GC-MS Chromatogramm der synthetisierten Urethan-Bibliothek. Drei der

vier erwarteten Urethane (21i, 21ai, 21bi) sind vorhanden. Das Signal von 21ii kann nicht

eindeutig zugeordnet werden. Es können keine Hydrazide mehr nachgewiesen werden, d.h.

deren Umsetzung ist vollständig. Weiter ist die Abwesenheit von diversen Olefinen (18i, 19ii,

19bb) bemerkenswert. Zudem sind grosse Verunreinigungen festzustellen, die nicht zuge¬ordnet werden können.

Da viele Nebenprodukte zu beobachten waren, eignet sich dieses Verfah¬

ren nicht für die Diversifikation von kombinatorischen Bibliotheken. Die Ein¬

führung von Stickstoff in Olefin-Bibliotheken wurde auf der Stufe der Hy¬drazide belassen.


2.3 Umwandlung von Olefin-Bibliotheken in Bibliotheken mit

anderen funktionellen Gruppen

Da Olefine nicht allzu grosse Perspektiven als Wirksubstanzen besitzen,die Olefin-Funktionalität jedoch eine hervorragende Basis zur Einführungneuer funktioneller Gruppen liefert, liegt es nahe, die geläufigsten Reaktio¬

nen, vor allem Additionen und Cycloadditionen, anzuwenden.

2.3.1 Epoxid-Bibliothek

Für die Herstellung von Epoxiden aus Olefinen gibt es mehrere, leicht

durchzuführende Methoden. Unerwarteterweise traten bei den meisten Pro¬

bleme auf. Die am häufigsten verwendete Methode ist die Überführung in

Epoxide mit Persäuren (Prileschajew-Reaktion) (Prileschajew, 1909), wobei

mCPBA wegen ihrer Stabilität und einfachen Handhabung die erste Wahl ist.

Die Reaktionsvorschriften mit mCPBA, H202/CH3CN (Payne et al, 1961),

H202/Benzonitril (Payne et al., 1961) und H202/Ethylchloroformat (Bach et

al, 1979) lieferten zwar die erwarteten Resultate wenn sie auf einzelne Ver¬

bindungen angewendet wurden, waren aber unbrauchbar für die Synthesevon kombinatorischen Bibliotheken. Sie führten entweder zu unauflösbaren

Gemischen mit vielen Nebenprodukten oder zeigten nur bei einigen wenigenVerbindungen in der Bibliothek Umsatz. Erfolg brachte schliesslich die Epo-xidierung mit Trifluoroperessigsäure, die in situ aus Trifluoressigsäureanhy-drid und Harnstoff-Peroxid-Komplex hergestellt wurde (Cooper et al, 1990).


Abbildung 2.18 Epoxid-Bibliothek synthetisiert aus der Olefin-Modell-Bibliothek 1. Die Oxi-

dierung wurde mit Trifluoroperessigsäureanhydrid durchgeführt. Nicht detektiert wurden

22ci, 22ii und 22ih.

Die Olefine wurden unter Schutzgas zusammen mit NaH2P04 und einem

grossen Überschuss Harnstoff-Peroxid-Komplex vorgelegt und langsamTrifluoressigsäureanhydrid zugetropft. Überschüssige Persäuren wurden

beim Reaktionsabbruch mit ges. NaHC03-Lösung zerstört, wobei eine sehr

starke Gasentwicklung zu beobachten war. Die Oxidation wurde mit der oben

beschriebenen Modell-Bibliothek 1 durchgeführt, und es konnten fast 90 %

der erwarteten Produkte mit GC-MS nachgewiesen werden; nur 22ci, 22ii

und 22ih fehlten.


100 %

TOT -

1200

13:02

1 '—r1800 2400

18:02 23:02

Abbildung 2.19 GC-MS Chromatogramm der Epoxid-Bibliothek.


2.3.2 Dibromid-Bibliothek

Eine weitere einfache Möglichkeit, Olefin-Bibliotheken umzuformen, ist die

Addition von Brom an die Doppelbindung. Man gibt einen grossen Über-

schuss an Br2 zu und rührt bei RT für 10 - 20 min. Die Befreiung der Produk¬

temischung von Br2 kann durch das Einleiten von Luft bewerkstelligt werden.

Abbildung 2.20 Dibromid-Bibliothek synthetisiert aus der Olefin-Modell-Bibliothek 2. Es

konnten alle Produkte detektiert werden mit der Ausnahme von 23i, 23ii und 23kk.

Aufgrund der Instabilität von Bromiden werden bei der GC-MS-Analyseoft nur Fragmente beobachtet. ESI-MS vermag das Problem ebenfalls nicht zu

lösen da diese Methode nicht besonders gut geeignet ist, kleine organischeMoleküle zu detektieren; v. a. wegen deren Unvermögen sich in Wasser oder

Wassergemischen zu lösen. Dennoch konnten 17 von 20 erwarteten Produk¬

ten mit relativ grosser Sicherheit nachgewiesen werden. Fehlend waren nur

23i, 23ii und 23kk. Ein weiteres Indiz für eine erfolgreiche Reaktion ist zudem

die fast gänzliche Abwesenheit von Edukten, etwas was bei einer unvollstän¬

digen Reaktion oder einer mit vielen Nebenprodukten nicht der Fall wäre. Zu

beachten ist zudem, dass die Bromierung auch eine äusserst sensitive Nach¬

weismethoden für Doppelbindungen ist, ein Hinweis darauf, dass diese Re¬

aktion eigentlich immer funktionieren sollte.


2.3.3 1,4-Dihydro-Pyridazin-Bibliothek

Eine interessante Art von Reaktionen stellen die Diels-Alder-Reaktionen ([4+ 2]-Cycloaddition) mit inversem Elektronenbedarf dar. Sie zeichnen sich da¬

durch aus, dass elektronenreiche Dienophile mit elektronenarmen Dienen,anstatt wie üblich elektronenarme Dienophile mit elektronenreichen Dienen,

reagieren. Diese Umkehrung hat den Vorteil, dass sie sich auf die durch Me¬

tathese gewonnenen Olefine anwenden lässt, welche allesamt elektronen¬

schiebende Substituenten besitzen. Zwei in der Literatur beschriebene Bei¬

spiele für elektronenarme Diene sind 1,2,4,5-Tetrazine (24) und Indigo-Ver¬bindungen (26)(Boger & Patel, 1989; Carboni & R. V. Lindsey, 1959; Sauer &

Wiest, 1962).

Abbildung 2.21 Beispiele für Diels-Aider Reaktionen mit inversem Elektronenbedarf,

a) mit 1,2,4,5-Tetrazinen (24), b) mit Indigoähnlichen Verbindungen (26)

Tetrazine sind sehr reaktiv gegenüber Olefinen und darum ideale Kandi¬

daten für die Verwendung in der kombinatorischen Chemie. Als Problem hat

sich nur ihre Synthese herausgestellt, vor allem die des angestrebten 3,6-Bis-

methoxycarbonyl-l,2,4,5-tetrazins (24a). Sie basiert auf einer fehlerhaften Vor¬

schrift von Th. Curtius aus dem Jahre 1888 (Curtius & Lang, 1888), mehrfachnachgebessert von Hantzsch um 1900 (Hantzsch & Silberrad, 1900) und Cur¬

tius um 1907 (Curtius et al, 1907). Die daraus resultierende Vorschrift zur

Synthese von 3,6-Bis-methoxycarbonyl-l,2,4,5-tetrazin (24a) ist jedoch nicht

zuverlässig reproduzierbar.

Zuerst wird Bisdiazoessigsäure in stark basischer Lösung dimerisiert und

anschliessend das entstandene Natriumsalz in die freie Säure umgewandelt.Es ist sehr wichtig, dass unter starker Kühlung vorgegangen wird, da sich das

Produkt sonst unter starker Gasentwicklung zersetzt. Die anschliessende

Methylierung erfolgt problemlos, wobei zu beachten ist, dass das Auskristal¬

lisieren der Produkte sehr lange dauern kann. Die Oxidation mit As03/HN03(rauchend) zum Endprodukt erfolgt schnell und führt zu einer karminroten

Lösung, die beim Einengen gleichfarbige Kristalle ergibt.

Für spätere Diels-Alder Reaktionen mit Olefinen wird eine Lösung aus 10

mg Tetrazin pro ml CH2C12 hergestellt und im Kühlschrank aufbewahrt.


2.3.3.1 Reaktion mit Tetrazinen

Olefine reagieren mit Tetrazinen nach dem klassischen Diels-Aider Mecha¬

nismus zu einem bicyclischen Zwischenprodukt welches sich unter N2-Ab¬spaltung in ein Dihydro-Pyridazin umwandelt. Es können dabei zwei Isomere

entstehen: 1,2-Dihydro-Pyridazin und 1,4-Dihydro-Pyridazin (25), das letztere

stark dominierend. Die Cycloaddition ist geschwindigkeitsbestimmend da die

Abspaltung von N2 sehr rasch erfolgt.

COOMe

N

IN

24aCOOMe

COOMe

COOMe

CH2

CS

COOMe

HN

IN

25

COOMe

CH

I

•Ch\

COOMe

Abbildung 2.22 Reaktionsmechanismus für eine Diels-Alder Reaktion mit 3,6-Bis-methoxy-carbonyl-l,2,4,5-tetrazin (24a). Es entsteht das 1,4-Dihydropyridazin (25).

Die Reaktionvorschrift selber ist simpel. Die Tetrazin-Lösung wird vorge¬

geben und die Olefine (Modell-Bibliothek 2) zugetropft. Die Lösung verfärbt

sich sofort gelblich und es ist Gasentwicklung zu beobachten.


QflFa

18b

18c

HN-N

UeOOC—( "WcOOMe

MeOOC

MeO'

HN—N

^ î>—COOMe

OMe

OMe

OB

HN—N Ö'

COOMe

M90

cr^xxOMe

HN—N

MeOOC—l V-C00Me

\J25ÏA/

HN—N

MeOOC COOMe

HN—N

MeOOC—( ^COOMe

MeOOC

HN—N ö'

)^COOMe

HN-N

MeOOC—C "^COOMe

HN-N öMeOOC—L \ COOMe

OMe

HN—N

MzOQC—L "WCOOMe

EtO-

xO HN—N

MeOOC—( ^COOMe

OMeVleO

OMe

OMe

Abbildung 2.23 1,4-Dihydro-Pyridazin-Bibliothek synthetisiert aus der Olefin-Modell-Biblio¬

thek 2 und 3,6-Bis-methoxycarbonyl-l,2,4,5-tetrazin (24a). Es konnten alle Verbindungen de¬

tektiert werden mit der Ausnahme von 25ii, dessen Anwesenheit aufgrund des MS-Spek-trums (Abb. 2.24, Verbindung "r") nicht gesichert ist.

Die Analyse dieser Bibliothek mittels ESI-MS mit Direkteinspritzung, d.h.

ohne vorherige chromatographische Trennung, ergab, dass 19 der 20 erwar¬

teten Produkte in ungleichen Mengen gebildet worden waren. Da 1,4-Dihyro-Pyridazin leicht zwei Wasserstoffatome abspaltet, sind jeweils die entspre¬chenden aromatischen Pyridazine zu erwarten. Dass diese Verbindungenauch tatsächlich beobachtet wurden, ist ein starker Hinweis auf die richtigeStruktur der Produkte.


Abbildung 2.24 ESI-Massenspektrum der 1,4-Dihydro-Pyridazin-Bibliothek. Ein gutes Indiz

dafür, dass die gesuchte Verbindung auch wirklich vorhanden ist, ist die Anwesenheit eines

zweiten Peaks mit einer Massendifferenz von -2. Er stammt vom aromatischen Pyridazin her,welches sich leicht durch die Abspaltung von zwei Wasserstoffatomen aus dem entsprechen¬den 1,4-Dihydro-Pyridazin bildet.


2.3.4 Diol-Bibliotheken

Ein weiterer Versuch Olefin-Bibliotheken zu derivatisieren, war die Syn¬these von Diol-Bibliotheken. Die Öffnung von Epoxiden zu Diolen wurde als

erstes in Betracht gezogen, konnte allerdings wegen ausbleibenden Erfolgennicht weiter verfolgt werden. Es waren unvollständige Reaktionsumsätze und

Nebenreaktionen zu beobachten, wie z.B. die Entstehung von Ketonen. Der

zweite und zum Ziel führende Ansatz bestand in Dihyroxylierungsversuchenmit Osmiumtetroxid. Die verwendete Reaktionsvorschrift war die von Shar-

pless (Sharpless et al, 1992) entwickelte asymmetrische Dihydroxylierung. Es

handelt sich um eine homogene Katalyse mit Osmiumtetroxid, welche durch

die Zugabe des chiralen Liganden (DHQD)2PHAL (26a) oder (DHQ)2PHAL(26b) enantiomerenreine Diole mit Enantiomerenüberschüssen (ee-Werten)zwischen 95 - 99 % ergibt.

Abbildung 2.25 Die beiden chiralen Liganden, verwendet in der Sharpless Dihydroxylierung.a) (DHQD)2PHAL (26a), b) (DHQ)2PHAL (26b).

Die Reaktion findet in einem zweiphasigen System aus Wasser und t-

BuOH statt. Das Os04 wird in katalytischen Mengen verwendet. Da es nach

einem Hydroxylierungsschritt zu Os03 reduziert wird, wird es mit K3Fe(CN)6und K2C03 regeneriert. Die Enantiomerenreinheit wird erreicht, indem die

Reaktion bei etwa 0 - 4 °C durchgeführt wird. Da in meinem Fall Enantiome¬

renreinheit nicht erstrebenswert war, wurden beide Liganden verwendet. Da

in den verwendeten Modell-Bibliotheken (1 und 2) hauptsächlich nicht-ter¬

minale Olefine vorhanden sind, wurde zusätzlich Methylsulfonamid addiert,welches eine beschleunigte Hydrolyse des bei internen Olefinen stabileren

Os04-01efin-Komplexes bewirkt. Aufgearbeitet wurden die Reaktionen durch

einmaliges Extrahieren, gefolgt von einer kurzen Filtration durch Kieselgelzwecks Entfernung der chiralen Liganden. Die Folge davon war, dass eine

relativ reine Diol-Bibliothek vorlag.


Abbildung 2.26 Erwartete Zusammensetzung einer Diol-Bibliothek synthetisiert aus der Ole¬

fin-Modell-Bibliothek 1. Die einzelnen Verbindungen Hessen sich nur indirekt beobachten.

(Der ad-mix a bzw. ß für die Dihydroxylierung von 1 mmol Olefinen besteht gemäss K. B.

Sharpless aus 0.98 g K3Fe(CN)6, 0.41 g K2C03, je 5 ml H20 und t_BuOH sowie aus 3.9 mg

(DHQD)2PHAL (26a) bzw. (DHQ)2PHAL (26b).)

Das Problem mit Diolen ist jedoch, dass sie mit massenspektrometrischenMethoden nicht einfach nachgewiesen werden können. GC-MS ist ungeeig¬net, da sich die Diole im GC zersetzen. ESI-MS Methoden sind wegen der im

Vergleich zu den Verunreinigungen ungenügenden Spray- und Ionisierungs-Eigenschaften der Diole auch keine valable Option. Nur CI-MS (Methan) hat

einen direkten Nachweis der Diol-Bibliothek ermöglicht. Es konnten bei einer

Diol-Bibliothek (basierend auf der Olefin-Modell-Bibliothek 2) 15 von 20 er¬

warteten Diolen beobachtet werden. Es fehlten einzig die Diole 27a, 27b, 27c,27i und 27ak. Eine nicht zu beantwortende Frage ist natürlich diejenige, ob es

sich bei den beobachteten Massen auch tatsächlich um Molekülionen oder um

Fragmente von Verbindungen mit höheren Massen handelt. Aus diesem

Grund, und um weitere Beweise für die Vollständigkeit der Diol-Bibliothek

zu erlangen, musste ein Ausweg in Form von Derivatisierungen gefundenwerden.

2.3.4.1 Glykolspaltung

Eine einfache Nachweismöglichkeit für Diole ist deren Spaltung mit Perjo-dat. Dazu wird die Bibliothek in THF und Wasser gelöst und Perjodat zuge¬

geben. Die rohe Reaktionslösung kann direkt in das GC-MS eingespritzt unddie Aldehyde bestimmt werden. Da einige der Aldehyde sehr klein sind,wurden sie mit Dinitrophenylhydrazin derivatisiert und dann analysiert.Diese Vorgehensweise wurde für die Diol-Modell-Bibliothek 1 verwendet,und es wurden alle Aldehyde gefunden, bis auf denjenigen der vom Ethyl-2-methyl-4-pentenoat (18i) abstammt.


Abbildung 2.27 Die Glykolspaltung, angewendet auf eine Diol-Bibliothek. Ausser 18i konn¬

ten die erwarteten Aldehyde im GC-MS nachgewiesen werden.

2.3.4.2 Acetalisierung mit Acetaldehyd

Da die Glykolspaltung keine vollständige Analyse der Diol-Bibliothek er¬

laubt, wurden die Diole einer Acetalisierung mit Acetaldehyd unterworfen. In

Gegenwart einer kleinen Menge starker Säure (konz. H2S04/) wurde ein gros¬

ser Überschuss Acetaldehyd zu einer in CHC13 gelösten Diol-Bibliothek zuge¬

geben.


Abbildung 2.28 Derivatisierung einer aus der Olefin-Modell-Bibliothek 2 erhaltenen Diol-

Bibliothek mit Acetaldehyd zu Acetalen. Es konnten 17 der 20 erwarteten Acetale im GC-MS

nachgewiesen werden (fehlend: 29bi, 29ci, 29ik).

Die Auswertung wurde wiederum mittels GC-MS durchgeführt. Es konnte

gezeigt werden, dass in der aus der Modell-Bibliothek 1 entstandenen Diol-Bi¬

bliothek zwölf der zwanzig erwarteten Diole vorhanden waren. Die acht feh¬

lenden Diole leiteten sich mit einer Ausnahme vom Methyl-3-butenoat (18h)und Ethyl-2-methyl-4-pentenoat (18i) und deren Derivaten ab: Es fehlten 29b,29h, 29ab, 29bb, 29bi, 29bh, 29ch und 29hh. Es ist schwierig zu sagen, ob die

nicht beobachteten Acetale nicht vorhanden sind oder ob sie nicht stabil ge¬

nug sind. Kontrollexperimente mit Ethyl-2-methyl-4-pentenoat (18i) lieferten

zweideutige Resultate, sei es bei der Dihydroxylierung oder bei der Derivati¬

sierung.

Für die Diol-Bibliothek, welche sich aus der Modell-Bibliothek 2 ableitet,fanden sich siebzehn von zwanzig erwarteten Diolen; 29bi, 29ci und 29ik

fehlten.

Die Acetalisierung war jedoch unzureichend reproduzierbar. Nichtsdesto¬

weniger konnte der Beweis erbracht werden, dass tatsächlich eine Diol-Bib¬

liothek vorliegt, wenn man eine Olefin-Bibliothek mit der Dihydroxylie-rungsmethode von Sharpless behandelt. Leider konnte nicht nachgewiesenwerden, dass diese Methode zu einer vollständigen Diol-Bibliothek führt.


600 1200 1800 2400 3000 3600

8:03 13:03 18:04 23:04 28:05 33:05

Abbildung 2.29 GC-MS Chromatogramm der aus der Olefin-Modell-Bibliothek 2 durch

Acetalisierung erhaltenen Diol-Bibliothek. Es sind 17 von 20 erwarteten Acetale vorhanden;

(29bi), (29ci) und (29ik) fehlen.

2.4 Gescheiterte Umwandlungsversuche

Es wurden grosse Anstrengungen unternommen, zusätzliche Reaktionen

auf die synthetisierten Bibliotheken anzuwenden, um diese weiter zu deriva-

tisieren und umzuwandeln. Leider war den meisten davon kein Erfolg be¬

schieden. Bei der Anwendung auf einzelne Verbindungen funktionierten die

ausprobierten Reaktionen zwar zu vollsten Zufriedenheit, versagten aber bei

deren Übertragung auf Bibliotheken. Häufig resultierten nur uninterpretier-bare Gemische aus Nebenprodukten und Edukten. In Derivatisierungsversu-chen für Olefinbibliotheken wurden neben den bereits weiter oben beschrie¬

benen Epoxidierungsmethoden die Woodward-Dihydroxylierung(Woodward & F. V. Brutcher, 1958), diverse andere Dihydroxylierungsme-thoden, eine 1,3-dipolare Cycloaddition (Silylimide) (Achiwa et al, 1983), die

Addition von Iodisocyanat (Gebelein et al, 1969) und die Hydroxysulfenylie-rung (Bewick et al, 1985) ausgetestet.


Abbildung 2.30 Derivatisierungsversuche mit Olefin-Bibliotheken

Weiter wurde versucht, Epoxid-Bibliotheken in Diole (27) [Toluolsulphon-säure, H+], Aminoalkohole (33) [R2NMgBr (Carre et al, 1985); LiC104, HNR2(Chini et al, 1990)], Ketone (34) [BF3-Et20 (Taylor et al, 1996); Pd(OAc)2, PBu3(Kulasegaram & Kulawiec, 1994)], a-Chloroketone (35) (Raina & Singh, 1995)und a,ß-ungesättigte Carbonyle (36) [EtMgBr, FeCOs (Yamashita et al, 1979)]umzuwandeln.

33 33

HO. NHR2 HOx NHR2

Abbildung 2.31 Derivatisierungsversuche mit Epoxid-Bibliotheken

In anderen misslungenen Versuchen sollten Dibromidbibliotheken in Di¬

amine (Zwierzak, 1975; Zwierzak & Brylikowska-Piotrowicz, 1977) und Diol-

bibliotheken in Acetale sowie in Aminoalkohole (Gao & Sharpless, 1988;

Lohray et al, 1989) umgewandelt werden. Während einige wenige Acetalisie-

rungen zumindest ein paar der erwarteten Produkte lieferten (e.g. Acetalde¬

hyd), wurde mit anderen Aldehyden selten auch nur eines, geschweige denn

mehrere der erwarteten Produkte beobachtet. Im allgemeinen kann gesagtwerden, dass je mehr Funktionalität der Aldehyd besitzt, desto ungeeigneterscheint er für die Acetalisierung einer Diol-Bibliothek zu sein.


2.5 Schlussfolgerungen

Reaktionen welche für einzelne Verbindungen problemlos ablaufen, müs¬

sen sich nicht unbedingt eignen für kombinatorische Synthesen. Aufgrundder oben gezeigten Beispiele für die Synthese von kombinatorischen Biblio¬

theken in flüssiger Phase lassen sich folgende Schlussfolgerungen ziehen:

• Die verwendeten Reaktionen sollten z.B. eine möglichst grosse Toleranz

gegenüber nicht an der Reaktion beteiligten funktionellen Gruppen besit¬

zen, eine kleine Anfälligkeit gegenüber Verunreinigungen aufweisen so¬

wie eine möglichst gleichmässige Produkteverteilung ermöglichen.

• Es ist auf die Stabilität der Edukte bzw. der Produkte gegenüber den Re-

aktionsbedingunge zu achten. Reaktionen mit extremen Bedingungen, wie

(hohe Temperaturen, hohe pHs etc.) sollten vermieden werden.

• Die Analyse von komplexen Gemischen ist nicht ohne weiteres möglich.Ab etwa fünfzig verschiedenen Verbindungen wird die Charakterisierungder einzelnen Verbindungen in einer Bibliothek sehr schwierig. Zudem ist

es möglich, dass gewisse Verbindungsklassen aus technischen Gründen

nur indirekt nachweisbar sind, was eine Derivatisierungsreaktion bedingt,welche die oben angesprochenen Kriterien aufweisen sollte.

3. Receptor Assisted Combinatorial Synthesis (RACS) 55

3. Receptor Assisted Combinatorial Synthesis ("RACS")

Wie bereits im vorherigen Kapitel angedeutet, liegt eines der grössten Pro¬

bleme der kombinatorischen Chemie in der Analyse sowie im Screening vonBibliotheken. Es ist zumindest mit sehr hohem Aufwand verbunden, in Ge¬

mischen mit 50-100 Substanzen jede einzelne zu charakterisieren. Und selbst

bei kleineren Bibliotheken ist die aufzuwendende Arbeit noch relativ gross.Die besten Auswege aus diesem Problem bieten bis heute der "Split and

pool"-Ansatz sowie "Massive parallel synthesis". Beiden Methoden ist ge¬meinsam, dass die Bibliothek in verschiedenen kleineren Sub-Bibliotheken

vorliegt, die jeweils bestimmte Charakteren aufweisen und getrennt gescreentwerden.

Für Flüssigphasen-Bibliotheken eröffnet sich jedoch eine neue Möglichkeit,welche es erlaubt Bibliotheken in fast beliebiger Grösse auf biologische Akti¬

vitäten zu testen. Die Grundidee ist die, dass die Synthese einer virtuellen

dynamischen Bibliothek aus einer oder zwei Sub-Bibliotheken in Gegenwarteines Rezeptors durchgeführt wird (darum: "Receptor assisted combinatorial

synthesis", "RACS"). Dies hat den Vorteil, dass man anstatt einer thermody-namischen Produkteverteilung eine Verschiebung des Produkte-Gleichge¬wichts hin zu den potentesten Inhibitoren des verwendeten Rezeptors erhält.

Der Rezeptor entzieht die synthetisierten Inhibitoren aus dem dynamischenGleichgewicht, sobald diese synthetisiert worden sind und ermöglicht damit

dessen Neueinstellung, sprich die Synthese von weiteren Inhibitormolekülen.

Dies führt zu einer Akkumulation von Inhibitoren, die an den Rezeptor ge¬bunden sind. Der Begriff virtuelle Bibliothek rührt daher, dass gar nie alle

theoretisch möglichen Verbindungen synthetisiert werden müssen. Das dy¬namische Gleichgewicht ist von Anfang an so weit zum Inhibitor hin ver¬

schoben, dass es völlig nebensächlich wird, ob alle oder nur ein kleiner Teil

aller möglichen Verbindungen auch wirklich entstehen.


b)

Chi

ç>#

+

Dynamisches , ,—^Gleichgewicht st l-r-

I<^

£>a dl

ff

ÜJ^tf &

Potentester Inhibitor

Bindung zieht das Gleichgewichtzum potentesten Inhibitor hin

r

^5

ö5 ^?^

EK

?ä

27HZ3

&>C3C

Abbildung 3.1 Prinzipielle Funktionsweise des "Receptor Assisted Combinatorial Synthe-sis"-Prinzips ("RACS"). a) Eine erste Bibliothek (dunkel) reagiert mit einer zweiten Bibliothek

(hell) in Gegenwart eines Rezeptors, b), c), d) Im Verlaufe der Zeit akkumulieren sich die po¬tentesten Inhibitoren durch deren Bindung an den Rezeptor.

Eine Grenze für den Umfang einer dynamischen virtuellen Bibliothek wird

allerdings dadurch gesetzt, dass die Konzentration der einzelnen Verbindun¬

gen in der Grössenordnung der Dissoziationskonstante des Inhibitors liegensollte. Es ist nämlich zu beachten, dass mit der Zunahme der Grösse der Bi¬

bliothek eine Abnahme der Konzentration der einzelnen Bestandteile einher¬

geht. Zudem verlangen viele Enzyme und Rezeptoren Bedingungen, welchein der Nähe der physiologischen liegen. Dies wiederum verbietet eine allzu

hohe Konzentration an Fremdstoffen.

Diese Einschränkung ist jedoch nicht allzu dramatisch. Synthetisiert manz.B. eine virtuelle Bibliothek mit 108 möglichen Verbindungen mit einer Ge-

-i-2samtkonzentration von 10" M, so besitzt jede einzelne Verbindung eine theo--10

retische Konzentration von 10" M. Bei einem potenten Inhibitors können die

Dissoziationskonstanten durchaus noch in dieser Grössenordnung liegen.


3.1 Für "RACS" geeignete Verbindungsklassen

Werden für "RACS" geeignete Sub-Bibliotheken entworfen, darf die Wahl

der funktionellen Gruppen, durch die dann die beiden Sub-Bibliotheken wäh¬

rend dem "RACS"-Experiment gekoppelt werden, nicht zufällig sein. Sie

müssen vor allem das Kriterium der Reaktions-Reversibilität erfüllen. Sind

die Produkte zu stabil, so kann sich kein dynamisches Gleichgewicht einstel¬

len; deren Verteilung stellt sich beim Reaktionsbeginn ein und ist danach

mehr oder weniger starr. Sind die Verbindungen hingegen zu labil, vermögensie keinen Inhibitor zu bilden und können zudem nicht isoliert werden aus

dem Produktegemisch. Imide, Amide, Ester, Disulfide, Boratester und Me¬

tallkomplexe bieten sich an und werden denn auch in allen zu diesem The¬

menbereich bis jetzt publizierten Arbeiten eingesetzt (Siehe weiter unten).

Um das "RACS"-Experiment durchzuführen, hat man nun die Wahl, dass

entweder zwei verschiedene Sub-Bibliotheken mit zueinander komplementä¬ren funktionellen Gruppen (z. B. Aldehyde und Amine) verwendet werden,oder aber man benutzt ein Koppelungsstück, das zwei oder mehrere zu den

Sub-Bibliotheken komplementäre funktionelle Gruppen besitzt.

a) Ri O) R2

b)

Abbildung 3.2 a) Direkte Kopplung von zwei Bibliotheken über zwei komplementäre funk¬

tionelle Gruppen (z. B. Aldehyd und Amin); b) Kopplung von drei Bibliotheken über ein

Kopplungsstück mit jeweils komplementären funktionellen Gruppen.

Zwei im Rahmen dieser Arbeit hergestellte Kopplungsstücke, 1,3,5-Tris-(L-Cystein-N-formyl)-Benzol (38) und 5,ll,17,23-Tetrakis-(2-mercaptoethyl)-25,26,27,28-tetrakis[(/Molylsulfonyl)oxy]-calix[4]arene (44), besassen beide ein

grosses Potential für "RACS" mit Mercapto-Bibliotheken. Sie wurden in Expe¬rimenten von M. Wigger verwendet. Es war vorgesehen, Cystein-Peptidbi-bliotheken und das Kopplungsstück in Gegenwart von immobilisierter

NADH während mehreren Tagen zu inkubieren. Die Analyse wurde in einem

FT-ICR-MS durchgeführt. Leider konnten die Resultate nicht interpretiertwerden (pers. Mitteilung M. Wigger).


3.1.1 l,3,5-Tris-(L-Cystein-N-formyl)-benzol (38)

Die Synthese dieser Verbindung (38) ist einfach und besteht in der Addie¬

rung von drei S-tritylgeschützten Cysteinen an Benzoltricarbonylchloride (37)unter wasser- und sauerstoffreien Bedingungen. Als Base fungiert Pyridin.Um das "RACS"-Experiment durchzuführen, wurden die Tritylgruppen mit

CF3COOH/Triisopropylsilan unter Ar abgespaltet und 38 entsteht.

COOH

S-Tr Py

THF/RTCF3COOH

COOH

Triisopropylsilan

COOH

37 38

Abbildung 3.3 Synthese von l,3,5-Tris-(L-Cystein-N-formyl)-Benzol (38) aus Benzoltricar-

bonylchlorid (37) und Tritylcystein mit anschliessender Entschützung.


3.1.2 5,ll/17,23-Tetrakis-(2-mercaptoethyl)-25/26,27,28-tetrakis[(p-tolylsul-fonyl)oxy]-calix[4]aren (44)

Allylbromid/NahI y \ J / DiethylanilinTHF/70-72 °C* P 9 O O

OHOHHO HO

39 40

1 Ozonolyse CVNaBHJ

CHCl3/MeOH/-50 °C

,2 P(Ph)aBr,

CH3CN/CHCI3/RT

OTs OTjsO TsO

42

Abbildung 3.4 Synthese von 5,ll,17,23-Tetrakis-(2-mercaptoethyl)-25,26,27,28-tetrakis[(p-to-lylsulfonyl)oxy]-calix[4]arene (44) aus calix[4]arene (39). Die Tolylsulfonyl-Schutzgruppekonnte nicht entfernt werden, sodass eine nicht ganz genügende Wasserlöslichkeit zu ver¬

zeichnen war.

Die Synthese von 5,ll,17,23-Tetrakis-(2-bromoethyl)-25,26,27,28-tetrakis[(p-tolylsulfonyl)oxy]-calix[4]arene (43) aus calix[4]arene (39) ist in der Literatur

von C. D. Gutsche (Gutsche et al, 1983; Gutsche & Pagoria, 1985) beschrieben

und relativ einfach durchzuführen. 5,ll,17,23-Tetrakis-(2-mercaptoethyl)-25,26,27,28-tetrakis[(p-tolylsulfonyl)oxy]-calix[4]arene (44) wurde durch die

Umwandlung des Tetrabromids 43 mittels Thioharnstoff und NaOH (aq) her¬

gestellt. Man erhielt dabei zusätzlich Dimere und Produkte mit einer intra¬

molekularen Disulfidbrücke. Dies hat jedoch keine Auswirkung auf das

"RACS"-Experiment, da es sich um ein dynamisches System handelt und Di-

sulfidbrücken laufend gebildet und gebrochen werden. Das Hauptproblem ist


die ungenügende Wasserlöslichkeit der Calixarene, v.a. deswegen weil die

Tosyl-Schutzgruppe trotz mehreren Versuchen nicht entfernt werden konnte.

3.2 Geeignete Analyse-Methoden für "RACS"-Experimente

Für die Analyse von "RACS"-Experimenten mit komplexen virtuellen dy¬namischen Bibliotheken kommen bis dato nur Methoden in Frage, welchen

die Massenspektrometrie zu Grunde liegt. Chromatographische Methoden

wurden zwar auch angewendet zur Aufschlüsselung von Peptidbibliotheken,erwiesen sich jedoch bald einmal als ungeeignet für Bibliotheken aus kleinen

organischen Molekülen. Nur bei sehr kleinen virtuellen Bibliotheken können

allenfalls HPLC oder GC verwendet werden, um die bevorzugte Bildung ei¬

nes Produktes nachweisen zu können.

In unserer Gruppe wurde die Methode als die geeignetste identifiziert, in

welcher der Rezeptor mit den darauf gebundenen Inhibitoren durch Abfil¬

trieren aus dem Produktegemisch entfernt wird. Nach einer Dissoziation der

gebundenen Verbindungen können diese in einem MS bestimmt werden.

Eine andere Möglichkeit besteht in der direkten Beobachtung des RezeptorInhibitor-Komplexes nach dessen Entfernung aus dem Reaktionsgemisch.

Will man ohne Filtrierungsschritt auskommen, können auch MS-Spektrenvon Produktegemischen für Reaktionen mit und ohne Rezeptor verglichenwerden. Sind einige wenige Verbindungen bevorzugt gebildet worden, sollte

dies zu einem erkennbaren Unterschied in der Produkteverteilung führen.

Als MS-Methode der Wahl für grosse organische Verbindungen hat sich

FT-ICR-MS bewährt. Dieses Verfahren lässt die direkte Beobachtung von En¬

zymen und Enzym-Substratkomplexen zu und ermöglicht Messung von

kombinatorischen Bibliotheken mit schwereren Verbindungen wie z.B. Poly¬peptiden. (Wigger, 1998).

3.2.1 FT-ICR-MS

FT-ICR-MS steht für "Fourier-transform-ion-cyclotron-resonance-masspec-trometry". Als Ionisierungsmethoden kommen Elektrospray- (ESI), Elektro¬

nen- (EI) oder auch chemische (CI) Ionisierung in Frage.

Die Ionen werden in einem Zyklotron gefangen und weisen je nach m/z-Verhältnis unterschiedliche Cyclotron-Frequenzen auf:

ü) = (q/m) -B

(B = Betrag der Feldstärke; q = Ladung ( = z); co = Cyclotron-Frequenz des Ions)


Wird die Resonanzfrequenz (cdc) eingestrahlt, so werden sie von ihrer zy¬klischen Bahn auf eine Spiralbahn gezwungen und verursachen ein Signal auf

dem Detektor, das mittels Fourier-Transformation so verarbeitet wird, dass

das entsprechende m/z-Verhältnis bestimmt werden kann:

r(t) = (qE0/2mcoc)-t = (qE0/2B)-t

(r = Radius der Zyklotronbahn; E0 = Betrag der elektrischen Feldstärke des eingestrahltenFeldes; coc = Resonanzfrequenz des Ions und Frequenz des eingestrahlten Feldes; t = Zeit)

Wird ein ganzes Frequenzband abgefahren, können sämtliche FT-Spektrensuperpositioniert werden und man erhält ein Spektrum für einen grossenMassenbereich. Je nach Breite des Frequenzbandes kann dieser von wenigenDa bis zu mehreren hundert kDa reichen.

Trotz der nur sehr kurzen und äusserst oberflächlichen Beschreibung die¬

ser neuen Technologie erscheint es deutlich genug, dass FT-ICR-MS für die

"Receptor assisted combinatorial synthesis" geeignet ist, da es mit dieser

Technik möglich sein sollte, den Receptor-Inhibitor-Komplex vom reinen Re¬

zeptor unterscheiden zu können.

3.3 "Proof of concept"

Obwohl grosse Anstrengungen diesbezüglich unternommen wurden, ist es

bis heute niemandem gelungen, einen "Proof of concept" für "RACS" mit ei¬

ner virtuellen dynamischen Bibliothek vernünftigen Umfangs zu erbringen.Als erster versuchte sich J. M. Lehn (Hue & Lehn, 1997) daran, mit dem Re¬

sultat dass er vermutlich eine kleine Anomalie in einem HPLC-Spektrumüberinterpretierte. Aus vier Aminen und drei Aldehyden wurde in Anwesen¬

heit von Carbonic Anhydrase (CA) eine virtuelle dynamische Bibliothek mit

zwölf Verbindungen synthetisiert. Die Analyse geschah mittels HPLC. Das

Resultat wurde verglichen mit einem HPLC-Spektrum derselben Bibliothek,

synthetisiert in Abwesenheit der CA. Dabei wurde festgestellt, dass bei An¬

wesenheit von CA ein Produkte-Signal höher und deren zwei niedriger aus¬

fielen. Die Unterschiede sind allerdings sehr klein und es stellt sich die Frage,ob es sich hier nicht um ein zufälliges Resultat handelt. Zudem Hessen sich

praktisch keine Unterschiede für die Hauptprodukte feststellen, sie wurden in

gleichen Mengen gebildet, was bedeutet, dass die CA nur in kleinem Masse in

die Reaktion eingreift.

Ein weiterer interessanter Ansatz wurde von B. L. Miller (Klekota et al,1997) beschrieben. Er verwendete sechs Salicylaldimine, welche in Anwesen¬

heit von Zn+tetrahedrale Komplexe bilden. Anschliessend wurde diese vir¬

tuelle dynamische Bibliothek aus 36 Verbindungen gegen immobilisierte

poly(dT)-poly(dA) selektioniert. Es konnte dabei für die einzelnen Salicylal¬dimine eine unterschiedlich starke Affinität zur Säule festgestellt werden. Die

Negativkontrolle bestand darin, dass dasselbe Experiment, jedoch in Abwe¬

senheit von Zn2+, durchgeführt wurde.


Der Dritte im Bunde ist J. K. M. Sanders (Brady & Sanders, 1997a; Rowan et

al, in press; Rowan & Sanders, 1997). Er will aus alkaloidähnlichen Verbin¬

dungen mit einer Hydroxy-Methylester-Funktionalität durch Transesterifizie-

rung eine dynamische virtuelle Makrocyclen-Bibliothek herstellen und diese

dann in näherer Zukunft gegen diverse Rezeptoren screenen.

In unserer Gruppe hatte bis jetzt nur M. Wigger Erfolg (Wigger et al., 1997).l-Chloro-2,4-dinitrobenzol wurde gegen eine Peptid-Bibliothek der Form H-y-Glu-Cys-Xxx-OH in Anwesenheit von Glutathion-S-Transferase (GST) ge¬screent. Die Reaktion wurde am FT-ICR-MS verfolgt und lieferte ein eindeu¬

tiges Resultat: Die Chloroverbindung addierte ausschliesslich (> 95 %) an H-y

-Glu-Cys-Gly-OH, das natürliche Substrat für GST und bildete den erwarte¬

ten Inhibitor.

3.4 "RACS"-Experimente mit Diolen

1,2-Diole sind relativ häufig in biologischen Systemen anzutreffen. Sämtli¬

che auf Sacchariden oder Ribosen basierenden Verbindungen wie z.B. RNA,ATP, FAD, NADH, Polysaccharaide, Stärke etc. weisen sie auf. Man findet sie

weiter in verschiedensten Glyceriden sowie in einigen metabolitischen Pro¬

zessen wie z.B. im AS-Metabolismus (Shikimisäure (47)) und natürlich in der

Glykolyse und im Glycogenmetabolismus. Weitere Vertreter sind Epine¬phrine (48) sowie Ascorbin-Säure (Vitamin C) (49).

COOH

e) HO 49 OH

Abbildung 3.5 Verschiedene natürliche 1,2-Diole. a) Glukose (45), b) Adenosin (46), c) Shiki-

minisäure (47), d) Epinephrin (48), e) Ascorbin-Säure (Vitamin C) (49).

Diole bilden zusammen mit Boraten relativ stabile Verbindungen. Maximal

können zwei Diole an ein Borat addieren, was zur Bildung eines Diesters (51)führt, wobei das Bor-Atom eine sp -Hybridisierung aufweist. Von ihrer

Struktur her ähneln Borat-Diester somit stark derjenigen eines spiro-Ketons.Analog dazu imitieren Borat-Monoester zyklische Phosphatester (50). Ausdiesen Gründen können Borat-Diester als Modelle für auf spiro-Ketonen ba¬

sierende Inhibitoren von Enzymen betrachtet werden, die einen zyklischenPhosphatester als Zwischenprodukt oder Übergangszustand in ihrem Meta¬

bolismus aufweisen.


Abbildung 3.6 a) zyklisches Phosphat (50) als Zwischenprodukt an der Bindungsstelle eines

Enzyms, b) Borat-Diester (51) an derselben Stelle des Enzyms, diese blockierend.

Ist die genaue Zusammensetzung des Diesters (51) erst einmal bestimmt,d.h. ist die Art der Diole bekannt, kann ein stabiler Inhibitor in Form einer

Spiroverbindung synthetisiert werden.

Aufgrund der einfachen Verfügbarkeit wurde RNase A als Modellsystemausgewählt.

3 Receptor Assisted Combinatorial Synthesis (RACS) 64

3.4.1 Resultate

3.4.1.1 Vorversuche

3.4.1 1.1 RNase A

Zuerst wurde die Masse von RNase A genau bestimmt. Um die Abhängig¬keit des Protonierungsgrades von Proteinen in verschiedenen Puffern zu de¬

monstrieren, wurden zwei Messungen durchgeführt: eine in H20 und z-PrOH

und eine mit zusätzlichem 540"2 M NH4OAc. Die aus diesen Messwerten be¬

stimmte Masse fur RNase A betrug im Durchschnitt 13682.3 g/mol (± 1.6).

Intensität

2 5e+07

2 Oe+07

1 5e+07

1 Oe+07

5 Oe+06

1711 3789

1254 7149

0 Oe+00 r—r

1000

1521 2742

1955 4716

3747 1122

1500 2000 2500 3000

I I 'I '

|' f

3500

[ 'I 'I 'I I I"

I

4000 4500 m/z

Abbildung 3.7 FT-ICR-Massenspektrum von RNase A (ohne NH4OAc-Puffer) Es konnte das

M7+ (1955.5), M8+ (1711 4) und M9+ (1521 3) Molekulion beobachtet werden Die daraus

errechneten Molekulmassen fur RNase A betrugen 13681 3 g/mol, 13683 0 g/mol resp13682 5 g/molBei den Signalen uml254 7149 und 3747 1122 handelt es sich um eine Interferenzstorung(Spike) bzw um eme Verunreinigung


Intensität

5 Oe+07

4 Oe+07

3.0e+07

2 Oe+07

1 Oe+07

0 Oe+00

2281 3914

1955 2914

2737.9551

(^-^

11000 1500 2000

11 ' I '

2500 3000

' I ' i

3500 4000

1 1 ' ' ' ' I

4500 m/z

Abbildung 3.8 FT-ICR-Massenspektrum von RNase A (mit NH40Ac-Puffer). Es konnte das

M5+ (2738.0), M6+ (2281.4) und M7+ (1955.3) Molekulion beobachtet werden. Die daraus

errechneten Molekulmassen fur RNase A betrugen 13684.8 g/mol, 13682.3 g/mol und

13680.0 g/mol.


3.4.1.1.2 Substratkomplexe von RNase A mit 5'-UMP

Eine Lösung mit 10"4 M RNase A und 10"3 M 5'-UMP in H20/z-PrOH (5:1)wurde während ca. 12 h inkubiert und analysiert. Das gewonnene Spektrumzeigt hauptsächlich multiple 5'-UMP-Addukte (Abb. 3.9). Dies war zu er¬

warten, da dessen Konzentration 10 mal höher ist als diejenige von RNase A.

Intensität

4 Oe+08

3 Oe+08

2 Oe+08

1 Oe+08

0 0e+00

973 0975

649 0706

325 0424

1297 1439

JLL_L J_A

RNase A - 5'-UMP Komplexe

1621 1847l

j U_ M^

i

200 400 600 800 1000 1200 1400

t I i r

1600 1800 m/z

Abbildung 3.9 FT-ICR-Massenspektrum von RNase A und 5'-UMP Das Molekulion von 5'-

UMP (325.0) sowie dessen zweifach- (649.1 g/mol), dreifach- (973 1 g/mol), vierfach- (1297 1

g/mol) und fünffach- (1621.2 g/mol) Addukte können hauptsachlich beobachtet werden. Der

Pfeil weist auf ebenfalls zu erkennende RNase A-5'-UMP-Komplexe hin.

Mit einer etwa 10-fach kleineren Intensität konnten jedoch auch RNase A-

5'-UMP-Komplexe beobachtet werden, welche in Abb. 3.10 hervorgehobensind. Es handelt sich dabei um den RNase A-[5'-UMP]2-H20-Komplex in der

Form des M8+-Molekülions sowie den RNase A-[5'-UMP]7- [H20]5-Komplexin der Form des M9+-Molekülions.

3 Receptor Assisted Combinatorial Synthesis (RACS) 6Z

Intensität

1 2e+07

1 Oe+07

8 0e+06

6 0e+06

4 0e+06

2 0e+06

0 Oe+00

1783 6773

1783 1

1770 1780 1790 1800 m/z

Abbildung 3.10 FT-ICR-Massenspektrum von RNase A und 5'-UMP, expandierter, in Abb.

3.9 mit Pfeil markiertem Bereich

Der berechnete Wert fur das Signal des M +-Molekuhons des Komplexes aus RNase A

(13682 3 g/mol), [5'-UMP]2 (324 2 g/mol) und H20 (18 0 g/mol) betragt 1794 6 g/mol Das

gemessene Signal (rechte Signalgruppe) zeigt einen Wert von 1794 65 g/molDer berechnete Wert fur das Signal des M +-Molekuhons des Komplexes aus RNase A

(13682 3 g/mol), [5'-UMP]7 (324 2 g/mol) und [H20]5 (18 0 g/mol) betragt 1783 4 g/mol Das

gemessene Signal (lmke Signalgruppe) zeigt emen Wert von 1783 68 g/molDie Uberemstimmung mit den im Experiment gefundenen Werten ist hervorragend


3.4.1.1.3 RNase A und Diol-Bibliothek

Eine Diol-Bibliothek mit 135 Diolen, synthetisiert aus einer Olefin-Biblio¬

thek basierend auf den Olefinen 18a - 18q (ohne 18g) (siehe Kapitel 2), wurdenach einer 48 h Entsalzungsprozedur mit RNase A inkubiert und im FT-ICR-

MS gesprayt. Es wurden die M -Signale von RNase A, RNase A plus Phos¬

phat, RNase A plus einer Verbindung mit der Masse 217.2 sowie von RNase

A plus einer Verbindung mit der Masse 313.3 beobachtet. Dieses Experimentwurde von Dr. Fei He (Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Marshall) am National

High Magnetic Field Laboratory in Tallahassee (FL, USA) durchgeführt.

1711.41

1710 1720 1730 1740 1750 1760

Abbildung 3.11 RNase A und Diol-Bibliothek mit 135 Diolen. Bei 1711.41 liegt das M -Signalvon RNase A, bei 1723.55 das M8+-Signal von RNase A plus Phosphat, bei 1738.56 das M8+-Si-

gnal von RNase A plus einer Verbindung mit der Masse 217.2 und bei 1750.57 das M8+-Signalvon RNase A plus einer Verbindung mit der Masse 313.3. Mögliche Kandidaten welche für

einen dieser RNase A - Diolkomplexe in Frage kommen sind weiter unten aufgelistet. Zu be¬

achten sind zudem die vielen kleineren Signale, denen allerdings keine Masse zugeordnetwurde. Experiment durchgeführt von Dr. Fei He, NHMFL, Tallahassee FL, USA


Folgende in der Bibliothek vorhandenen Diole liegen in der näheren Um¬

gebung der beiden gefundenen Massen 217.2 bzw. 313.3:

Diole mit der Masse 217 ± 5

OH O

^OMe

C11H20O4Exact Mass: 216.14

OH

Diole mit der Masse 313 ± 5

OH



OH

C12HI7F02Exact Mass: 212.12

MeO'

OH O

OMe

"F C12H11F5O4Exact Mass: 314.06

OH"F C13H13F5O3

Exact Mass: 312.08

OH ^^-Q

Cl8H20°5Exact Mass: 316.13

OH

OH

C16H15N06Exact Mass: 317.09

OH

OEt

C16H22Ö6Exact Mass: 310.14

F

OH

C15H15FO4SExact Mass: 310.07

OH

N02

OH

C18H15N04Exact Mass: 309.10

Abbildung 3.12 Diole, welche im Bereich der Massen 217.2 bzw. 313.3 liegen. Da die Masse

der RNase A mit einer Genauigkeit von ±1.6 g/mol bestimmt werden kann, sollte die ver¬

wendete Bandbreite von ± 5 g/mol für die Diole in einem genügend grossen Rahmen liegen.

3.4.1.2 "RACS" mit einer Diol-Bibliothek, 5'-UMP und RNase A in Borat-Puf¬

fer

Da trotz der Beobachtung eines Diol-RNase A-Komplexes nicht klar ist, obunter "RACS"-Bedingungen eine solche Bindung ebenfalls problemlos statt¬

findet, können die Erfolgschancen für dieses Experiment mittels Zugabe eines

5'-Nukleotids erhöht werden. Nukleotide werden von RNase A relativ gutgebunden (Kj[5'-UMP] = 6 mM) und besitzen eine freie Diolgruppe (2', 3')welche für die Diesterbildung zur Verfügung steht.

Eine Diol-Bibliothek mit 135 Verbindungen (Totalkonzentration ca. 0.1 M)wurde in einer RNase Lösung (10" M) bei einer Borat Konzentration von 500

mM (pH 9.0) gelöst. Zusätzlich wurde 5'-UMP addiert (Endkonzentration: 0.1


M). Als Kontrollexperimente wurden analoge Experimente, einmal in Abwe¬

senheit des Borates und einmal in Abwesenheit von RNase A durchgeführt.

Auswertung durch FT-ICR-MS

Leider konnten die RNase A-Borat-Diester-Komplexe nicht direkt detek¬

tiert werden. Die Boratkonzentration von 500 mM war viel zu hoch um vom

MS toleriert zu werden. Selbst bei viel kleineren Konzentrationen war es nicht

möglich ein Signal zu erhalten. Zudem ist der pH-Bereich (pH 9) ungünstigwegen der Erniederung der Bindungsaffinität des Enzyms für Diole. Eine

Senkung des pH ist jedoch nicht möglich, da dies sonst zur Zerstörung des

Borat-Diesters führen würde.

Eine weitere Möglichkeit bestünde in der Abtrennung der RNase A von

der Reaktionslösung, gefolgt von einer Zerstörung des Komplexes mit an¬

schliessender Messung der Fragmente. Leider hat sich auch diese Methode

nicht bewährt, da es nicht möglich zu sein scheint Diole mit diesem Instru¬

ment zu detektieren.

Auswertung durch GC-MS

Der RNase A-Borat-Diester-Komplex wurde aus der Reaktionslösung abge¬trennt und durch eine Erniedrigung des pH zerstört. Anschliessend wurde

eine Acetalisierung der Diole mit Acetaldehyd durchgeführt und die rohe Re¬

aktionslösung im GC-MS analysiert. Dabei konnten neben dem 5'-UMP-Deri-

vat vermutlich vier weitere Acetale beobachtet werden, allerdings in weit

kleineren Mengen. Es waren dies: 29aa, 29ac, 29ak und 29bk (siehe Kapitel 2,Abb. 2.28). Dasselbe Resultat konnte jedoch auch beim Kontrollexperimentohne Borat-Puffer beobachtet werden, nicht aber bei demjenigen ohne RNase

A bzw. ohne Diol-Bibliothek. Dies bedeutet, dass diese Diole nicht von einem

RNase A-Borat-Diester-Komplex herrühren, sondern dass sie wahrscheinlich

einen Komplex mit RNase A bilden.

Aufgrund von diesen Resultaten ist es klar, dass dieser Ansatz trotz seiner

Eleganz in eine Sackgasse führt und deswegen nicht weiter verfolgt werdenkann. Zu vielfältig sind die technischen Probleme, welche mit ihm verbundensind. Das Hauptproblem liegt bei den hohen Boratkonzentrationen. Elektro-

spray-Gerät versagen bei hohen Salzkonzentrationen, da der Detektor mit Io-

nen-Cluster übersättigt wird. Was das GC-MS anbelangt, ist dessen Sensitivi-

tät einfach zu klein, um allenfalls vorhandene Unterschiede zwischen Experi¬ment und Kontrollexperiment detektieren zu können. Für eine weitere Dis¬

kussion der Probleme im Zusammenhang mit "RACS"-Experimenten siehe

Abschnitt 3.4.2 (Schlussfolgerungen).

3.4.1.3 Weitere "RACS"-Experimente

RNase A katalysiert die Hydrolyse von RNA. Das bedeutet, dass RNase A

je nach Wahl der Anfangsbedingungen gezwungen werden kann, aus 3'-Nu¬

kleotiden Dinukleotide herzustellen. Es sollte darum möglich sein, eine unter¬

schiedliche Präferenz von RNase A für das eine oder andere Dinukleotid auf¬

grund der unterschiedlichen Produktmengen festzustellen.


Eine weitere Möglichkeit für ein "RACS"-Experiment besteht darin, dass

die vier natürlichen 3'-NMPs zusammen mit einer Diol-Bibliothek in Gegen¬wart von RNase A inkubiert werden. Nach einer gewissen Zeit akkumuliert

sich ein RNase A-Inhibitor in Form eines Enzym-Substrat-Komplexes, der im

FT-ICR-MS detektiert werden kann.

HO--0-

"H H"

H

H0-

H

O OH

I0=P—OH

IOH

,0.

"h h:

H| I H

HO OH

HO-

^-°~\\H PH | 1 H

0 OHI

0=P—OH1

+ H20

0 OH

\ /

R2

Abbildung 3.15 RNase A könnte mit 3'-NMPs und Diolen einen dinukleotidähnlichen Inhi¬

bitor synthetisieren.

3.4.2.3.2 "RACS" mit 3'-AMP, S'-CMP, 3'-GMP, 3'-UMP und RNase A

RNase A als Katalysator der Hydrolyse von RNA in Nukleotide kann auch

zur Synthese von RNA benutzt werden. Die RNase würde dabei die am mei¬

sten inhibierenden Nukleotide binden und ein Dinukleotid synthetisieren.Dieses könnte dann entweder als freies Nukleotid oder aber als RNase A-

Dinukleotid-Komplex beobachtet werden.

Der Mechanismus ist in Kapitel 4 beschrieben und besteht aus zwei

Schritten; der Spaltung der RNA und der anschliessenden Hydrolyse des 2'-

3'-Cyklomonophosphates. Dieser zweite Schritt ist geschwindigkeitsbestim¬mend. Die Gleichgewichtskonstante liegt bei ca. K = 4-102 (pH 5) [2',3'-cUMP^ 3'-UMP: K = 440 ± HO; 2',3'-cCMP <-> 3'-CMP: K = 360 ± 120].

Die 3'-NMP (je 10"4 M) wurden zusammen mit RNase A (10-5 M) vorgelegt.Die Lösung wurde nach kurzer Inkubationszeit (weniger als 1 min.) direkt ins

FT-ICR-MS eingespritzt. Als Kontrollexperiment wurde die RNase A in Ab¬

wesenheit der 3'-NMPs gemessen.

Es konnten mehrere Signale beobachtet werden, die auf Komplexe von

RNase A mit einem 3'-GMP plus einem, zwei oder gar keinem Phosphatschliessen lassen. Anhand dieses Experiments entsteht der Eindruck, dass 3'-

GMP die höchste Affinität zu RNase A hat. In der Literatur wird die Inhibiti¬

onskonstante für 3'-GMP mit K; = 4 mM angegeben, während diejenigen für

3'-AMP bei ^ = 8 mM, für 3'-CMP bei IQ = 3 mM und für 3'-UMP bei K{ = 3

mM liegen (Richards & Wyckoff, 1971).


Zudem sind schwächere Signale zu finden, die auf gemischte Komplexezwischen RNase A, 3'-GMP, 3'-CMP und Phosphaten hindeuten.

Um diese Resultate zu bestätigen wurde ein Kontrollexperiment ohne 3'-

GMP durchgeführt. In den Spektren dieses Experiments sind die vermuteten

Signale für die [RNase A-3'-GMP]-Komplexe nicht mehr zu finden. Es waren

zudem keine nennenswerten Mengen an M8+-Komplexen zu beobachten. Da¬

für waren neu Signale zu finden, die auf M6/7+-[RNase A-3'-CMP-(H3P04)m]-Komplexe hinweisen, welche jedoch in kleineren Mengen vorliegen würdenals die im ersten Experiment detektierten M6/7+-[RNase A-3'-GMP-(H3P04)m]-Komplexe.

Alle anderen Signale, welche allenfalls auf einen erhofften poly-RNA-RNase A-Komplex hindeuten könnten sind jedoch ebenfalls in Messungenmit reiner RNase A zu beobachten. Es handelt sich dabei aller Wahrschein¬

lichkeit nach um Mehrfachphosphatkomplexe mit bis zu zwölf Phosphaten.

Die Spektren des oben beschriebenen Experimentes sind in den nachfol¬

genden Abbildungen dargestellt. Die Spektren links stammen vom Experi¬ment mit 3'-GMP, die Spektren rechts von demjenigen ohne 3'-GMP.

5.0-

107-

4.0-10,7

-

,7-

3.0-10

2.0-10-

1.0-10'

0.0

195527

1711

^J

20

228129

3,0-10'

2.0-10

1.0-10'

1600

1800

vAwa

i.2737.55

.A..

2000

"—r^—i

'i

2200

2400

0.0

171122

195534

2281

2600

2800

m/z

37

iiki^JMH^

\*

2738.12

1600

1800

2000

2200

2400

2600

2800

m/z

(13 n p n

Abbildung3.16aUbersichtsspektrum.ErsichtlichsinddieMs+(1

711.

20),M/+

Abbildung3.16bÜbersichtsspektrum.ErsichtlichsinddieM

(171

1.22

),

(1955.34),

M6+

(2281.30)undM5+

(2737.55)-Signale vonRNaseA

sowiederen

M7+(1955_27)/M*+

(228

1.37

)undM5+

(2738.12)-Signale vonRNaseA

sowie

KomplexemitPhosphatbzw.denvier3'-NMPs

derenKomplexemitphosphatbzw.dendrei3'-NMPs.

4.0-10'

3.0-10'

2.0-10'

1.0-10'

0.00

171120

1640

1690

1740

M^SSS.O

Myy+823.8

781.

7'/M

w;j-

959.

5

1790

5.0-107

4.0-107-

3.0-1O'

2.0-10'

1.0-10'

0.00

"r-y\

1640

171122

95.9

1740

1790

Mw+959.1

1840

m/z

Abbildung3.17aM8+

(171

1.20

).DieerrechneteMassefürRNaseA

be-

Abbildung3.17bM8+(1

711.

22).

DieerrechneteMassefürRNaseA

beträgt

trägtMw=13681.8Da.

Mw=13681.6Da.

Diefolgen

denKomplexekönnenzugewiesenwerden(exakteMassen

DiefolgendenKomplexekönnenzugewiesenwerden(exakteMassenin

inKlammern):

Klammern):

Mw

+96.4=[RNaseA-H3P04](Mw+

98.0)

Mw

+363.1=[RNaseA-3'-GMP](Mw+36

3.2)

Mw

+460.8=[RNaseA-3'-GMP-H3P04](Mw+46

1.2)

Mw

+558.0=[RNaseA-3'-GMP-(H3P04)2](Mw+55

9.2)

Mw

+781.7=[RNaseA-3'-GMP-3'-CMP-H3P04](Mw+784.4)

Mw

+823.8=[RNaseA-(3'-GMP)2-H3P04](Mw+

824.

4)

Mw

+959.5=[RNaseA-

(H3P

O4)1

0]-H

2O;(Mw

+96

2.0)

Mw

+95.9=[RNaseA-H3P04](Mw+

98.0

)

Mw

+959.1=[RNaseA-(H3PO4)10]-H2O;(Mw+

962.

0)


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Ol

Ol

Ol

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tNCOcNOO^LOtNLOOs SO

COLO CO CMLO tN 00

tN

INOS

+ + + + + + + + +

3. Receptor Assisted Combinatorial Synthesis (RACS)

Wie aus den obigen Resultaten entnommen werden kann, besitzt RNase A

eine eindeutige Präferenz für 3'-GMP und eine sekundäre Affinität für 3'-

CMP. Leider Hess sich kein "RACS"-Produkt beobachten und dieses Experi¬ment muss diesbezüglich als Fehlschlag bezeichnet werden.

Dennoch sollte ein noch weitergehendes Experiment mit einer zusätzlichen

Diol-Bibliothek durchgeführt werden, in der Hoffnung dass eine stabile,durch RNase A nicht zu hydrolysierende 3'-NMP-Diolverbindung entsteht.

3.4.1.3.2 "RACS" mit 3'-AMP, 3'-CMP, 3'-GMP, 3'-UMP, der Diol-Bibliothek und

RNase A

In diesem nächsten Versuch sollte untersucht werden, ob sich die RNase A

einen Inhibitor aus einem 3'-NMP und einem Diol synthetisieren kann. Dafür

wurde wiederum eine Lösung aus den vier 3'-NMPs (je 10"4 M), RNase A (1CT5M) und einer Diol-Bibliothek (ca. 10"4 M, basierend auf einer Olefin-Bibliothek

mit 135 Olefinen, siehe Abschnitt 2.2.4) hergestellt. Das Resultat ist identisch

mit demjenigen aus dem vorigen Versuch und besteht in der Präferenz von

RNase A für 3'-GMP.


3.4.2 Schlussfolgerungen

Trotz einigen Erfolgen (Hue & Lehn, 1997; Wigger et al., 1997), ist der

"RACS"-Idee bisher der grosse Durchbruch versagt geblieben. Es ist auch

nicht zu erwarten, dass in nächster Zukunft mit diesem Ansatz (Diole, RNase

A) der gewünschte Durchbruch zu bewerkstelligen ist. Die Gründe dafür sind

teilweise grundsätzlicher, ansatzspezifischer und technischer Natur.

3.4.2.1 Prinzipielle Probleme

Je nach verwendeten Edukten können die Ausbeuten bei vielen Reaktion¬

stypen stark variieren. Synthetisiert man eine Bibliothek, bedeutet dies, dass

die Anteile der einzelnen Vertreter innerhalb einer Bibliothek nicht gleichmä-ssig verteilt sein werden. Dies kann dazu führen, dass bei einem "RACS"-Ex-

periment nicht nach dem Inhibitor mit der kleinsten Bindungskonstante se¬

lektioniert wird.

Als ein weiteres fundamentales Problem hat sich herausgestellt (obwohleingangs dieses Kapitels als nicht problematisch deklariert), dass mit der Zu¬

nahme der Grösse der Bibliothek eine Abnahme der Konzentration der ein¬

zelnen Verbindungen einhergeht. Umso kleiner wird somit auch die Konzen¬

tration des Inhibitors in der Reaktionslösung bzw. desto potenter müssen

diese Inhibitoren sein. Besteht z.B. eine Bibliothek aus 10 Verbindungen, und

liegt diese mit einer Gesamtkonzentration von 10~2 M vor, besitzt jede ein¬

zelne Verbindung eine theoretische Konzentration von 10"6 M. Nimmt weiter

man an, dass die für das "RACS"-Experiment verwendete Reaktion eine

Gleichgewichtskonstante besitzt von K = 1 M (Bibliothek + Bibliothek2 —>Inhibitor), und trifft zudem die Einschränkung zu, dass nur ein Inhibitor

möglich ist, muss dessen Bindungskonstante 10~12 M oder weniger betragenum überhaupt selektioniert werden zu können. Eignen sich mehrere Verbin¬

dungen als Inhibitoren, z.B. deren 10, verringert sich die Bindungskonstantenoch einmal um den Faktor 10. Nicht berücksichtigt ist zudem die Tatsache,dass die Konzentrationen der Bausteine für die potentesten Inhibitoren im

Vergleich zu den anderen Bausteinen im ungünstigeren Fall tiefer, bzw. im

günstigeren Fall höher sein können. Es ist somit zwar richtig, dass in einer

virtuellen Bibliothek von ca. 108 verschiedenen Verbindungen mit grosserWahrscheinlichkeit eine Verbindung mit Inhibitoreigenschaften vorhanden

sein sollte; ob deren Bindungskonstante jedoch hoch genug ist, um überhauptselektioniert zu werden, steht auf einem anderen Blatt geschrieben.

Ein weiterer Nachteil dieses Ansatzes ist zudem, dass man auf eine relativ

kleine Anzahl von Reaktionstypen beschränkt ist, welche für "RACS" in

Frage kommen können. Vor allem müssen sie die Eigenschaften besitzen, dass

ihr Gleichgewicht auf der Produkte-, d.h. auf der Inhibitorseite (K > 1) undkeinesfalls auf der Edukte-, d.h. Bibliotheksseite (K < 1) liegt. In Bezug auf

meine Experimente mit 3'-NMPs und RNase A lag genau der zweite Fall vor

(K = 10"4 M). Deren Scheitern ist somit nicht mehr unerklärlich.

Weitaus erfolgversprechender sind "RACS"-Experimente, welche darauf

beruhen, dass das gewählte Enzym mit den zur Verfügung stehenden Bi-


bliotheken Produkte produzieren, die nicht als Inhibitor auftreten. Meist wer¬

den das nur die natürlichen Reaktionsprodukte sein, wie in den Experimen¬ten von J. M. Lehn und M. Wigger (Hue & Lehn, 1997; Wigger et al., 1997).Dies ist natürlich vom Standpunkt der "Lead-discovery" her nicht allzu

spannend, hat aber bis jetzt die einzigen brauchbaren Resultate produziert.

3.4.2.2 Technische Probleme

Eines der ungelösten Hauptprobleme ist die Analyse von grossen Biblio¬

theken durch eine geeignete Methode. Inzwischen hat sich MS etabliert und

es gibt Leute die in Vorträgen behaupten, sie könnten Substanzgemische mit

einem Umfang von mehreren hundert Molekülen charakterisieren. Es sollte

jedoch festgehalten werden, das niemand mit einem vernünftigen Aufwandfeststellen kann, ob in einer Bibliothek kleiner organischer Moleküle mit einer

theoretischen Grösse von 104 Verbindungen nun deren 5-103, 9.999-103 oder

genau 10 vorhanden sind, geschweige denn eine Aussage über deren statisti¬

sche Verteilung machen. Es ist auch nicht zu beurteilen, ob es sich bei den

anwesenden Verbindungen nun um die gewünschten Produkte, deren Iso¬

mere oder um Verunreinigungen mit derselben Masse handelt.

Was das FT-ICR-MS und ganz allgemein alle MS mit "Electro-spray" anbe¬

langt, scheinen diese Instrumente für kleine organische Moleküle nur bedingttauglich zu sein. Besitzen nämlich Moleküle keine leicht zu protonierendenoder deprotonierenden funktionellen Gruppen, lassen sie sich fast nicht de¬

tektieren und können von kleinsten Spuren von Verunreinigungen mit besse¬

ren "Spray"-Eigenschaften überdeckt werden. Dies hat sich vor allem bei den

Diol-Bibliotheken als Problem erwiesen, wo nie ein Diol, jedoch stets die Li¬

ganden und Ligandfragmente der Sharpless-Dihydroxylierungsreaktion de¬

tektiert wurden.

3.4.2.3 Probleme mit dem gewählten Lösungsansatz

Eines der grössten Probleme in diesem Projekt war die Unmöglichkeit, Diol-

Bibliotheken mit massenspektrometrischen Methoden analysieren zu können.

Sie Hessen sich stets nur in Form von Derivaten nachweisen. Die einzige Aus¬

nahme bildete nur die chemische Ionisation (CI). Mit ihr war es möglich, fast

sämtliche Diole direkt nachzuweisen. Leider lässt sich diese Methode nicht

auf "RACS" anwenden, da es nicht möglich ist, Verbindungen mit grossenMassen zu analysieren.

Ein weiteres Problem ist die Anwesenheit von Salzen. Wie Natriumionen,deren Tendenz zur Clusterbildung bei sämtlichen "Electrospray"-Methodenzu einem starken Hintergrundrauschen führt, hat natürlich das in hoher Kon¬

zentration vorliegende Borat ebenfalls einen analogen negativen Effekt auf

die Messung. Wir haben versucht RNase A in 5 mM Boratlösung im FT-ICR-

MS sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus zu analysieren.Es war leider unmöglich auch nur ein kleines Enzymsignal zu finden. Dass

somit bei einer 500 mM Boratkonzentration nichts zu sehen war liegt auf der

Hand. Ein anderes Problem mit Boraten ist zudem, dass sie sich an den Me-

talloberflächen ablagern, was zu einer Verstopfung des Gerätes führen kann.


3.4.3 Ausblick

Es stellt sich die Frage, ob sich "RACS" je verwirklichen lässt. Das Konzeptselber tönt selbst dann noch überzeugend, wenn die oben genannten Ein¬

schränkungen in die Betrachtung mit einbezogen werden. Es ist jedoch klar,dass der Weg dorthin noch lang und steinig ist. Er hängt jedoch vor allem ab

von einer massgeblichen Weiterentwicklung der analytischen Methoden und

von einer glücklicheren Wahl des Modellsystems. Eine andere Möglichkeitbesteht darin, dass die gewählten Reaktionsbediungungen näher bei den phy¬siologischen Wirklichkeiten gewählt werden, was natürlich Auswirkungenauf die in Frage kommenden Analysemethoden haben wird.

4. Der Molekulare Darwinismus anhand der Entwicklung der Ribonuklease in Wiederkäuern 81

4. Der Molekulare Darwinismus anhand der Entwick¬

lung der Ribonuklease in Wiederkäuern.

Die Darwinsche Theorie, welche die Entwicklung der Spezies durch die

natürliche Selektion der überlebensfähigsten Merkmale postuliert, ist heute in

der westlichen Welt gut akzeptiert. Niemand in der Wissenschaft, ausser er

will seinen guten Ruf riskieren, vertritt eine kreativistische Sichtweise oder

die sogar noch extremere Position der Konstanz der Arten. Sogar Rom hat das

darwinsche Model inzwischen in den Status einer erhärteten Theorie erhoben.

Die darwinistische Sichtweise wird heute vor allem durch archäologischeFunde, durch DNA-Sequenzvergleiche von sehr nahe verwandten Arten und

Unterarten, sowie durch verschiedenste gezielte Kreuz- und Zuchterfolge(Hunde) gut belegt. Zusätzlich ist es möglich innerhalb einer Art mit grosser

geographischer Ausbreitung einen divergierenden genetischen Drift auszu¬

machen, der i.a. umso unterschiedlicher wird, je mehr die räumliche Distanz

zunimmt. Dies kann soweit führen, dass eine Kreuzung bei geographischweiter voneinander entfernten Individuen nicht mehr möglich ist, während

die geographisch sich näher zueinander befindenden durchaus noch Nach¬

kommen zeugen können.

Trotzdem ist es äusserst schwierig gefallen, auf molekularer Ebene stich¬

haltige Hinweise zu finden, welche eine selektive Evolution aufzuzeigenvermöchten. Es liegt jedoch auf der Hand, dass sich die Glaubwürdigkeit der

Darwinschen Theorie bei einem weiteren Ausbleiben von Erfolgen auf die¬

sem Gebiet vermindern könnte. Darum überrascht es auch ein wenig, dass

sich hier erst seit relativ kurzer Zeit eine rege Tätigkeit ausmachen lässt. Der

Grund für dieses Versäumnis liegt wahrscheinlich darin, dass bis dato keine

effizienten Techniken zur Verfügung standen um die erforderlichen Experi¬mente in einem vernünftigen Zeitrahmen durchzuführen.

Inzwischen befassen sich jedoch mehrere Forschungsgruppen mit dieser

Problematik, u.a. M.A. Cronin (Cronin et al, 1996) und K. Chikuni (Chikuni et

al, 1995) mit K-Casein und Cytochrom b in höheren Wiederkäuern (Pecora,

Artiodactyla, Ruminata), J. Gatesy mit mitochondrischer ribosomaler DNA

(Gatesy et al, 1997; Gatesy et al, 1992) in Bovidae, Masathoshi Nei mit der

Genduplikation von Ribonuklease-Genen in Primaten (Zhang et al, 1998),Jody Hey mit dem "Gene flow" in Drosophila pseudoobscura und ihren nahen

Verwandten (Wang et al, 1997) sowie J. J. Beintema, E. Confalone und A. Fu-

ria mit der Entwicklung von RNase A und BS-RNase in Mammalia bzw. Artio¬

dactyla (Beintema et al, 1997; Beintema et al, 1986; Beintema et al, 1976; Breu-

kelman et al, 1993; Confalone et al, 1995).

Auch in unserer Gruppe ist der evolutionäre Denkansatz schon seit langerZeit stark verbreitet und wie viele andere benutzen auch wir den "Maximum

parsimony"-Ansatz um die Vorgängersequenzen von verschiedensten Pro¬

teinen zu rekonstruieren. Im Bereich unseres Interesses liegen dabei unter an¬

derem die SH2-Domäne, die Hefe, das Hämoglobin sowie vor allem die

RNase A und deren Verwandte, die BS-RNase (Benner et al, 1997; Jermann et

al, 1995; Trabesinger-Rüf et al, 1996).


4.1 Ribonukleasen

Ribonukleasen charakterisieren sich durch die katalytische Spaltung von

RNA. Sie bilden die Familie der Ribonukleasen und sind eingeteilt in die sek¬

retorischen und nicht-sekretorischen Ribonukleasen. Die nicht-sekretorischen

RNasen kommen vor allem in der Leber, der Milz, der Lunge und den Leuko¬

zyten vor. Ihre höchste Aktivität gegenüber RNA liegt bei pH 6.5-7.0. Die se¬

kretorischen RNasen werden hauptsächlich in der Pankreas exprimiert. Sie

besitzen eine optimale Aktivität bei pH 8.

Weitere Mitglieder dieser Familien sind: Säugetier Ribonukleasen, Angio-genin aus Säugetieren, Leber-Ribonukleasen aus dem Huhn, Ribonukleasen

aus dem Knochenmark und Myelomazellen des Huhns, pankreatische Ribo¬

nukleasen der Schildkröte, pankreatische Iguana-Ribonuklease, Ribonuklea¬

sen in Fröschen.

4.1.1 Die RNase A

Die Ribonuklease A (RNase A; EC 3.1.27.5) ist eines der am besten unter¬

suchten Enzyme. Die Isolierung ist so einfach und kostengünstig, dass sie ein

beliebtes Studienobjekt für eine grosse Anzahl von Forschern wurde und das

Grundmaterial für wichtige Meilensteine in der Entwicklung der Biologie lie¬

ferte. Sie wurde vor über 30 Jahren aus dem Pankreas des Rindes isoliert und

deren Aminosäuresequenz war die erste, die überhaupt bestimmt wurde

(Smyth et al, 1963). Weiter war die RNase A das zweite kristallisierte Protein

(Kunitz, 1939) und gehörte somit zu den Ersten, deren Struktur durch Rönt-

genstruktur- und NMR-Analyse aufgeklärt wurde (Kartha et al, 1967). Weiter

war die RNase A das erste Protein, das auf Festphase komplett synthetisiertwurde konnte (Gutte & Merrifield, 1969), und es konnte auch zum ersten mal

gezeigt werden, dass nach der vollständigen Denaturierung des Proteins die

Rückfaltung in den nativen Zustand erfolgen kann (Anfinsen & Haber, 1961).Zu guter Letzt ist anzumerken, dass C.B. Anfinsen, W. Stein und S. Moore ih¬

ren Nobelpreis für die Erhellung der Zusammenhänge zwischen der Funkti¬

onsweise und der Tertiärstruktur bzw. der Primärstruktur von Enzymen er¬

halten haben (Anfinsen, 1973); Erkenntnisse welche sie u.a. durch die Erfor¬

schung von RNase A gewonnen haben.

Die RNase A ist ein kleines Enzym mit einer nierenähnlichen Gestalt. Sie ist

aus 124 AS aufgebaut, besitzt eine Molmasse von Mw = 13684 g/mol, eine

Grösse von 3.7x4.5x3.4 nm und einen pl von 9.6.

Die tertiäre Struktur besteht aus drei a-Helices: Einer N-terminalen (AS 3-

13) und zwei weiteren (AS 24-55; 50-60), welche eine antiparallele ß-Faltblatt-struktur einrahmen. Vier intramolekulare Disulfid-Brücken (Cysteine: 26-84,40-95,58-110, 65-72) sind zentral für die Stabilisierung und Faltung des Mole¬

küls.


Abbildung 4.1 Bändermodell von RNase A. Die Helices sind rot und die ß-Faltblätter gelbeingefärbt.

Die RNase A findet sich in den Sekundärmagen von Wiederkäuern und

dient der endonukleolytischen Spaltung von bakterieller RNA, welche durch

die Lyse von Fermentationsbakterien freigesetzt wird. Die Abbauproduktewerden bis auf die Purine weiterverwertet. Wiederkäuer decken dadurch ca.

10-20 % ihres Stickstoffbedarfs.

Die katalysierte Hydrolyse ist eine allgemeine Säuren/Base-Katalyse der

beiden Histidine (12,119) im aktiven Zentrum; findet am Phosphodiester des

"RNA-backbones" statt und ist so spezifisch, dass die Spaltung jeweils nur

am 3'-Phosphodiester eines Pyrimidinnukleosids erfolgen kann. Sie folgt in

erster Näherung der Michaelis-Menten Kinetik (Fersht, 1985).


Bi Threonin 45

Is) Phenylalanin 120

Serin 123

Lysin 41

Histidin 12/119

Spaltung

B2 Glutamin 69

NH Aspargin 71

Glutaminsäure 111

B3 Lysin 1

Abbildung 4.2 Bindungsstellen von RNase A für das Substrat. Die Spaltung erfolgt nach ei¬

nem Pyrimidinnukleotid welches an der Positionen B^R^ bindet, (p = Phosphat, R = Ribose,

B = Base) (Parés et al, 1991).

Die Bindungsstellen des Enzyms, wo das Substrat hauptsächlich intera-

giert, wird B1R1p1 genannt. Zusätzlich dazu gibt es weitere vorgeschlageneStellen, die ebenfalls in der oben angegebenen Graphik eingetragen sind (Pa¬rés et al., 1991). Es besteht zudem die Möglichkeit einer zusätzlichen vierten

Phosphatbindungsstelle p4 in der Nähe von Arginin 85.

Die Reaktion selber besteht aus zwei Schritten (Fersht, 1985). In einem er¬

sten Schritt findet eine Transphosphorylierung von der 5'-Phosphoesterbin-

dung (pi) des nachfolgenden Nukleosids (N2= PiR2B2) zum 2'-Hyroxyl des

Pyrimidinnukleosids (N:= p0R1B1) statt und es entsteht ein zyklisches 2',3'-

Phophodiester-Zwischenprodukt. Die Fachwelt scheint sich inzwischen auch

darauf geeinigt zu haben, dass es sich beim gebildeten zyklischen Diester um

ein echtes Zwischenprodukt, stabilisiert durch Lys 41, und nicht um einen

Übergangszustand handelt. Dieses wird dann in einem zweiten geschwindig¬keitsbestimmenden Schritt wiederum an der 2'-Stelle (Rj) über einen trigona-len bipyramidalen Übergangszustand hydrolysiert. Besonders elegant ist da¬

bei, dass der zweite Schritt - auf Enzymebene betrachtet - nichts anderes als

die Umkehrung des ersten Schrittes ist und somit die Ausgangslage des En¬

zyms wiedererstellt wird.


Iis12)

~:N-

i

V"H

Pynmidin

k.H H

HN

Hl I HOH OR

(His119) [Tngonal-Bipyramidalf"

(His12)

(His 12)

(His119)

Abbildung 4.3 Mechanismus für die Spaltung von RNA durch RNase A. Zuerst wird ein zy¬klischer Phosphatester gebildet und dieser dann hydrolysiert. Die beiden Histidine wirkenals H+-Donoren und Akzeptoren (Fersht, 1985).


4.1.2 Die BS-RNase

Die "Bovine seminal RNase" (BS-RNase, EC 3.1.27.5)) wurde 1963 von G.

D'Alessio im seminalen Plasma und in den seminalen Vesikeln des Rindes

(Bos taurus) entdeckt (DAlessio & Leone, 1963). Die Konzentration in der se¬

minalen Flüssigkeit ist sehr hoch und beträgt ca. 1.5 mg/ml oder 3 %. Die

Synthese geschieht in den Samenbläschen der Nebenhoden und wird hormo¬

nell über die Testosteron-Konzentration im Blutplasma geregelt.

Die Molmasse der BS-RNase beträgt Mw = 27218 g/mol, deren pl = 10.3.

Die BS-RNase besitzt eine dimere Struktur, mit zwei identischen Unterein¬

heiten homolog zur RNase A. Die Sequenz einer Untereinheit unterscheidet

sich von derjenigen von RNase A in 23 von 124 AS.

10 20 30 40

RNase A KETAAAKFER QHMDSSTSAA SSSNYCNQMM KSRNLTKDRC

BS-RNase S GN PS L CC KM QGK

50 60 70 80

RNase A KPVNTFVHES LADVQAVCSQ KNVACKNGQT NCYQSYSTMS

BS-RNase K K T K R

90 100 110 120

RNase A ITDCRETGSS KYPNCAYKTT QANKHIIVAC EGNPYVPVHF

BS-RNase VE G K S

124

RNase A DASV

BS-RNase

Tab. 1 Angegeben ist die AS-Sequenz für RNase A und für BS-RNase. Für BS-RNase wurden

nur die 23 Mutationen eingetragen; die anderen AS sind mit denjenigen für RNase A iden¬

tisch.

Das aktive Zentrum (His 12, 119, Lys 41) sowie sämtliche in RNase A vor¬

kommenden Cystein-Reste (Cys 26, 40, 58, 65, 72, 84, 95, HO, sind in der BS-

RNase konserviert. Bis auf Lys 37 (BS-RNase: Gin) und Glu 111 (BS-RNase:Gly) sind auch sämtliche unter dem Abschnitt für RNase A aufgeführten se¬

kundären Bindungsstellen (Abb. 4.2) konserviert geblieben.

Die Sekundärstruktur der Untereinheit ist derjenigen der RNase A ähnlich.

Die beiden Untereinheiten sind über die zwei Cysteine Cys31 und Cys32 ver¬

knüpft, und zwar in der Weise, dass Cys^l mit Cys232 und Cys231 mit

Cys-,32 gebunden ist. Im N-terminalen Bereich lassen sich jedoch grosse Un¬

terschiede in der Quartärstruktur ausmachen. Es kann hier nämlich bei ca.

zwei Dritteln der BS-RNasen eine Überlappung der beiden Untereinheiten im

Bereich der AS 1-20 (S-Peptid) festgestellt werden. Entscheidend dafür ist die

stark mutierte Region AS 16-22 wo das in trans-Foim vorliegende Pro 19 das

Scharnier für die Überlappung bildet und durch die Wasserstoffbrückenbil¬

dung von Ser 18 und 21 stabilisiert wird. Wichtig ist zudem der hydrophobeKontakt zwischen den beiden Leu 28. Dieses Überlappen hat auch zur Folge,


dass die aktiven Zentren neu aus His^ und His2119 bzw. aus His212 und

His1119 gebildet werden.

Den beiden Formen können auch unterschiedliche Funktionen zugeordnetwerden. Während die nicht-überlappende BS-RNase nur für den Abbau von

RNA zu gebrauchen ist, besitzt die andere Form zusätzliche biologische Ei¬

genschaften. Eine analoge Quartärform kann auch bei aus Essigsäure lyophi¬lisierter RNase A beobachtet werden.

Die Faltung der BS-RNase zur monomeren Untereinheit erfolgt in der Zelle

mittels dem mirkosomalem Redoxsystem (Glutathion). In einem zweiten

Schritt erfolgt mit Hilfe der Protein Disulfidisomerase (PDI) die Dimerisie-

rung zum aktiven Enzym.

Abbildung 4.4 Röntgenstrukturanalysen der beiden Formen der BS-RNasen. Oben; BS-RNase

mit überlappenden N-terminalen Enden. Unten: BS-RNase mit nicht überlappenden Enden.

Die beiden Untereinheiten sind in rot bzw. blau dargestellt. Giuseppe D'Alessio et. al.

(D'Alessio et al, 1997)

Die katalytische Aktivität von BS-RNase gegenüber einzelsträngiger RNAist im Vergleich zur Aktivität von RNase A etwas tiefer obwohl der Mechanis¬

mus ähnlich ist (Floridi et al, 1972). Unterschiedlich ist jedoch das Verhalten

gegenüber poly(A), welche BS-RNase, allerdings ohne die Hydrolyse des zy¬klischen Phosphodiesters, spalten kann. BS-RNase besitzt als einzige RNase

auch allosterische Eigenschaften welche sich dadurch äussert, dass bei niedri¬

gen Substratkonzentrationen eine Konformationsänderung stattfindet, welchedas zweite aktive Zentrum ausschaltet. Erst bei höheren Substratkonzentra¬

tionen erlangt das zweite aktive Zentrum nach einer erneuten Konformati¬

onsänderung seine katalytische Fähigkeit zurück (Piccoli et al, 1988). Weiter

besitzt BS-RNase, im Gegensatz zur nativen Form der RNase A, die Fähigkeit,doppelsträngige RNA unter physiologischen Bedingungen zu hydrolysieren,ähnlich wie die aus HAc lyophilisierte dimerisierte RNase A. Dieses verän-


derte Verhalten wird hauptsächlich der Substitution von Asp 38 durch Gly 38

und von Glu 111 durch Gly 111 angelastet.

Was die biologische Aktivität angeht, wurden eine aspermatogene, eine

embryotoxische und eine immunosuppressive entdeckt.

BS-RNase wirkt bei intratestikularer Injektion in Versuchstieren wie Rat¬

ten, Mäusen, Kaninchen und Widdern cytotoxisch auf Spermien im Entwick¬

lungsstadium, nicht aber auf die Spermienstammzellen (Spermatogonien). DaBS-RNase diesen aspermatogenen Effekt selbst bei subcutaner Injektion be¬

sitzt, wird vermutet, dass sie die Blut-Testis-Schranke überwinden kann. In¬

teressanterweise, aber doch nicht ganz unerwartet, lässt sich dieser Effekt bei

Stieren nicht beobachten. Die embryotoxische Funktion konnte abgeleitet wer¬den aus der Injektion von BS-RNase in trächtige Mäuse, welche ein Sterben

der Embryonen zur Folge hatte (Matousek, 1969; Matousek & Grozdanovic,

1973; Matousek et al, 1973).

Die interessanteste Eigenschaft scheint jedoch die Immunosuppressivitatzu sein. BS-RNase hemmt die Proliferation von stimulierten T- und B-Lym-phozyten. Der Effekt beruht vor allem darauf, dass die a-Kette des Interleu-

kin 2 Rezeptors auf der T-Lymphozyten-Membran nicht exprimiert wird

(Derwenskus et al, 1989; Soucek et al, 1986; Soucek et al, 1983; Tamburrini et

al, 1990). Man vermutet, die Immunosuppressivitat bringe den Bovidae den

Vorteil, dass mit der Abschwächung der weiblichen Immunreaktion die

Spermien eine bessere Chance hätten bis zum Ei vordringen zu können.

Ein weiterer Aspekt ist die Antitumoraktivität, welche zum ersten Mal in

Mäusen, später aber auch an menschlichen Tumor-Zellen nachgewiesen wer¬

den konnten (Matousek, 1973; Vescia & Tramontano, 1981). Die Wirkung ist

selektiv: nicht infiziertes bzw. nicht transformiertes Gewebe wird nicht beein¬

trächtigt.

Eine ähnliche Eigenschaft scheint auch die Inhibition von HIV-infizierten

Leukämie-(H9)-Zellen zu sein (Youle et al, 1994). Dieser Effekt konnte auch

mit Onkogenese, einer zur BS-RNase homologen RNase erzielt werden.

Es hat sich gezeigt, dass alle diese biologischen Aktivitäten von der struk¬

turellen und katalytischen Integrität des Enzyms abhängig sind. Verschiedene

Studien, durchgeführt v.a. in unserer Gruppe vermochten die Aminosäuren

zu identifizieren (Q28L, K31C, S32C, Q55K, N62K, A64T, E111G, N113K;RNase A Mutant TM+BSI+BSIII (Haugg, 1996)), welche verantwortlich zeich¬

nen für diese Effekte (Haugg, 1996; Jermann, 1995; Opitz, 1995; Raillard-Yoon,1993; Trautwein-Fritz, 1991).

4 Der Molekulare Darwinismus anhand der Entwicklung der Ribonuklease in Wiederkäuern 89

4.2 Evolution der Ribonukleasen

Die Frage drängt sich nun auf, weshalb gerade Ribonukleasen geeignetsein sollen um eine Evolution auf molekularer Ebene verfolgen zu können.

Ribonukleasen liegen in einer grossen Vielfalt vor und besitzen teilweise nicht

nur ihre angestammte Funktion der RNA-Hydrolyse. Dies bedeutet, dass

Genduplikationen erwartet werden können und dass Phasen der positivenevolutionären Adaption auszumachen sein sollten.

r §

:= ;= Q-

Abbildung 4.5 Stammbaum der RNase-Familie. Die Information wurde hauptsächlich der

Dissertation von T. Jermann (Jermann, 1995), entnommen.

Dieser Stammbaum gilt als noch nicht gesichert. Diverse Säugetier Ribonu¬

kleasen, Angiogenin aus Säugetieren, Leber-Ribonukleasen aus dem Huhn,Ribonukleasen aus dem Knochenmark und Myelomazellen des Huhns, pan¬kreatische Ribonukleasen der Schildkröte, pankreatische Iguana-Ribonu-klease, Ribonukleasen in Fröschen, werden in der Ribonuklease-Superfamiliezusammengefasst und so deren Verwandtschaft festgelegt.

4.2.1 Einschub: Werkzeuge des Evolutions-Biologen

Eine effiziente Methode die Evolution homologer Gene zu beschreiben, lie¬

fert die "Maximum parsimony" Theorie (Fitch & Margoliash, 1967). Die zen¬

trale Annahme ist die, dass zwei homologe Proteine durch divergente Evolu¬

tion mit einer möglichst minimalen Anzahl an Mutationen aus einem gemein¬samen Vorfahrenprotein entstanden sind. Um die Sequenz dieses Vorfahren

möglichst genau zu bestimmen, werden die verfügbaren Sequenzen homolo¬

ger Proteine so angeordnet, dass sie eine möglichst hohe Übereinstimmung


zueinander haben ("Alignment"). Unter der Verwendung der oben gemach¬ten Annahme, wird der Stammbaum mit der minimalsten Anzahl an Muta¬

tionen konstruiert. Daraus kann nun die Sequenz eines Vorfahrenproteins an

einem bestimmten Divergenzpunkt Base für Base bzw. AS für AS rekonstru¬

iert werden.

Um eine möglichst breite Abstützung und damit eine möglichst hohe Ein¬

deutigkeit der rekonstruierten Sequenz zu erhalten, ist es notwendig, eine

möglichst grosse Anzahl von Sequenzen zu verwenden. Es ist dabei darauf zu

achten, dass diese möglichst gleichmässig auf die einzelnen Familien verteilt

sind, damit nicht ein kleiner Teil der Arten einen überaus grossen Einfluss auf

das Resultat ausüben kann.

K L K

DEFKGAT DEFLGAT DEFKGAT

Abbildung 4.6 Bsp. für einen "Most parsimonious tree" für drei homologe Sequenzen des

Typs DEFXGAT und für die Bestimmung der 4. AS des ältesten gemeinsamen Vorfahrens.

Leider können für verschiedene Enzyme unterschiedliche Stammbäume

entstehen. Es ist dabei nicht immer klar, ob dies auf Grund mangelnder Ver¬

fügbarkeit von Sequenzen ist oder ob manchmal auch ein etwas unwahr¬

scheinlicherer Stammbaum mit einer leicht erhöhten Anzahl Mutationen der

Richtige sein könnte. Ebenfalls ein Problem können auftretende Divergenzenzum archäologischen Stammbaum sein. Das Problem der Verwendung des

richtigen Stammbaums scheint bis jetzt noch nicht abschliessend ausdiskutiert

geworden zu sein, und es macht den Eindruck, dass dessen Wahl der persön¬lichen Vorliebe des Einzelnen vorbehalten zu sein scheint. Ich habe mich in

meinem Fall entschlossen, den Stammbaum hauptsächlich auf archäologischeBefunde abzustellen, und ihn mit der "Maximum parsimony"-Methode fein

einzustellen.

Die "Maximum Hkelihood"-Methode (Yang et al, 1995) versucht die Wahr¬

scheinlichkeit anzugeben, mit der eine bestimmte AS an einer bestimmten

Stelle in der Sequenz vorkommt. Sie nimmt zusätzlich in Betracht, dass Mu¬

tationen nicht immer linear erfolgen und dass Rückmutationen stattfindenkönnen. So nimmt die Wahrscheinlichkeit für einen Mutationsverlauf von K—> G —> L gegenüber einem Verlauf von K —> L zu, wenn der zeitliche Ab¬

stand zwischen K und L zunimmt. Dasselbe gilt für K —> G —> K im Ver¬

gleich zu K —> K. Dennoch sind auch die Resultate, die durch diese verfei¬

nerte Methode erreicht werden, nicht immer eindeutig, und die Frage nachdem korrekten Stammbaum oder der korrekten Sequenz lässt sich selten mit

letzter Sicherheit beantworten.


Anhand der stattgefundenen Mutationen können zudem Driftrichtungenbestimmt werden. Dies geschieht in der Form, dass die Anzahl der expri-mierte Mutationen ("Non silent mutations") mit der Anzahl der nicht expri¬mierten Mutationen ("Silent mutations") verglichen werden. Liegt das Ver¬

hältnis um 1, deutet alles darauf hin, dass das Enzym seine Funktion gefun¬den hat und nur zufällige Mutationen stattfinden. Liegt es unter 1, so versucht

das Enzym seine alte Funktion wiederzuerlangen; es findet eine negativeAdaption statt. Ist das Verhältnis jedoch sehr hoch (grösser als 1), deutet dies

darauf hin, dass eine adaptive Evolution stattfindet und das Enzym eine neue

Funktion zu erlangen oder zu optimieren sucht. Es herrscht ein positiver Se¬

lektionsdruck und man hat ein Beispiel für den molekularen Darwinismus

gefunden.

4.2.2 Evolutionäre Entwicklung der BS-RNase aus der RNase A

Der Grund für die Wahl der BS-RNase und der RNase A für diese Untersu¬

chung liegt darin, dass deren Verwandtschaft sehr nahe ist, deren Funktionen

aber sehr unterschiedlich sind. Es ist darum in gewissen Evolutionsabschnit¬

ten ein hohes Verhältnis der "Non silent" zu "Silent" Mutationsraten festzu¬

stellen, was bedeutet, dass eine positive Adaption stattfindet (Trabesinger-Rüf, 1997).

Die BS-RNase entstand vor ca. 30-40 Mio. Jahren kurz nach der Abzwei¬

gung zum Kamel, aber kurz vor der Abzweigung zu den Hirschen und Giraf¬

fen, als Folge einer Genduplikation von RNase A. Zudem fand zur etwa glei¬chen Zeit eine weitere Genduplikation statt, welche zur cerebralen RNase

führte ("Bovine brain RNase"; BB-RNase). Interessanterweise fällt dieser

Zeitpunkt auch mit der Entstehung der Wiederkäuer (Ruminata) aus der Linie

der Paarhufer (Artiodactyla) zusammen.


ä>_ &

f E =

O-r

10--

20--

30--

40--

501-

Gendupl i kati on:

BS-RNase/BB-RNase

Abbildung 4.7 Stammbaum der RNase A in Artiodactyla. Eingezeichnet ist der Zeitpunkt der

Genduplikation vor knapp 40 Mio. Jahren.

Der ursprüngliche Vorteil, der von der damals lebenden Spezies aus die¬

sem Ereignis gezogen worden sein könnte, wäre derjenige gewesen, dass die

dank der Genduplikation in grossen Mengen vorhandenen RNasen, zum er¬

sten Mal eine effiziente Verdauung und Nutzung der Bakterien im Sekun¬

därmagen zuliessen. Kurze Zeit später machte sich dann die Immuno¬

suppressivitat von BS-RNase bemerkbar und es folgte eine Phase der adapti¬ven Evolution in welcher diese Eigenschaft optimiert wurde. Diese These be¬

dingt jedoch, dass die BS-RNase im gemeinsamen Vorfahren exprimiert war.

Starke Indizien für deren Richtigkeit wurden jedoch erst mit der Entdeckungeines vollständigen BS-RNase-Gens im Okapi (Lee C. Raley, pers. Mitteilung,August 1998) gefunden. Die meisten anderen Sequenzen sind nämlich Pseu¬

dogene und besitzen entweder Deletionen oder Stop-Codons. Nur das Rind

(Bos taurus) und der Gaur (Bos gaurus) weisen ein komplettes und exprimier-tes BS-RNase-Gen auf. Da auch das Okapi (Okapi johnstoni) ein vollständiges,wenn auch nicht exprimiertes Gen besitzt, lässt sich ableiten, dass mit relativ

hoher Wahrscheinlichkeit ein vollständiges Gen im gemeinsamen Vorgängervon Rind und Okapi vorhanden war. Ein weiterer Hinweis welche diese

These stützt ist der, dass die Mutationen, welche zu den Deletionen oder

Stop-Codons in den Pseudogenen der anderen Wiederkäuer geführt haben,

jeweils an verschiedenen Orten auftreten. Dies bedeutet, dass deren Vorgän¬ger ebenfalls ein fehlerfreies Gen aufgewiesen haben.

Um nun die Entwicklung der Aktivität von BS-RNase im Verlauf der Zeit

zu verfolgen, müssen gemeinsame Vorläufer-RNasen rekonstruiert und ex¬

primiert werden. In unserer Arbeitsgruppe wurden bereits grosse Anstren¬

gungen in dieser Richtung unternommen. Die bis jetzt am weitesten zurück¬

reichende Vorläufer-BS-RNase war diejenige der Bovidae von N. Trabesinger(Trabesinger-Rüf, 1997). Sie zeigte bereits einige Merkmale der BS-RNase,


teilweise jedoch weniger stark ausgeprägt. Was jedoch bis anhin fehlte war

die Rekonstruktion eines gemeinsamen BS-RNase-Vorfahren kurz nach der

Genduplikation. Dieser Mutant ist denn auch von einiger Wichtigkeit, denn

mit dessen Eigenschaften steht und fällt die Hypothese, dass mit seiner An¬

wesenheit in der seminalen Flüssigkeit ein Vorteil erzielt werde und dass

diejenigen Individuen selektioniert würden, die diesen Vorteil zu vergrössernwüssten. Um diesen Sachverhalt abzuklären wurde somit die Vorläufer-BS-

RNase der Giraffen (Giraffidae), Hirsche (Cervidae) und Rinder (Bovidae) rekon¬

struiert.

Abbildung 4.8 Evolutionsstammbaum der RNase A und der BS-RNase in Artiodactyla. Xmarkiert die Genduplikation. Y ist die zu rekonstruierende Vorfahren-RNase der Hirsche

und Rinder. Der Stammbaum für die BS-RNase besitzt aus naheliegenden Gründen die iden¬

tische Topologie wie derjenige für RNase A. Er ist deswegen nicht der "Most parsimonious"Stammbaum, sondern der zweitwahrscheinlichste.


Zur Rekonstruktion des oben verwendeten Stammbaums wurden die

RNase-Sequenzen der folgenden Paarhufer verwendet (zusammengetragenaus Swiss-Prot und verschiedenen Dissertationen):

Schwein Sus scrofa RNase A/-

Flusspferd Hippopotamus amphïbius RNase A/-Dromedar Camelus dromedarius RNase A/-Kamel Camelus bactrianus RNase A/-Giraffe Giraffa camelopardalis RNase A/BS-RNase

Gabelantilope Antilocapra americana RNase A

Rentier Rangifer tarandus RNase A

Schweinshirsch Axis porcinus RNase A/BS-RNaseHirsch Cervus eldi RNase A

Rothirsch Cervus elaphus RNase A

Damhirsch Dama dama RNase A

Elch Alces alces alces RNase A

Reh Capreolus capreolus RNase A/BS-RNase

Schaf/ Ziege Ovis aries/ Capra hircus RNase A/BS-RNase

Topi Damaliscus korrigum RNase A/BS-RNaseGnu Connochaetes taurinus RNase A

Impala Aepyceros melampus RNase A

Thomson Gazelle Gazella thomsoni RNase A

Nilgaiantilope Boselaphus tragocamelus RNase A

Elandantilope Taurotragus oryx RNase A

Gelbrückenducker Cephalophus silvicultor RNase A/BS-RNaseKudu Tragelaphus imberbis BS-RNase

Kaffernbüffel Syncerus coffer coffer RNase A/BS-RNaseWaldbüffel Syncerus coffer nanus RNase A/BS-RNase

Sumpfbüffel Bubalus arnee bubalis RNase A/BS-RNaseWaldbüffel Bubalus arnee bubalis RNase A/BS-RNaseGaur Bos gaurus BS-RNase

Rind Bos taurus RNase A/BS-RNase


Die daraus mit der "Most likelihood"-Methode und dem oben beschriebe¬

nen Stammbaum von David Schreiber rekonstruierte Sequenz lautet:

10 20 30

RNase A KETAAAKFER QHMDSSTSAA SSSNYCNQMM

Vorfahre KESAAAKFER QHMDSGSSPS SSSNYCNLMM

BS-RNase KESAAAKFER QHMDSGNSPS SSSNYCNLMM

40 50 60

RNase A KSRNLTKDRC KPVNTFVHES LADV Q AVCSQ

Vorfahre FCRKMTQGKC KPVNTFVHES LADV (K/QJ AVCSQ

BS-RNase CCRKMTQGKC KPVNTFVHES LADV K AVCSQ

70 80 90

RNase A KNVACKNGQT NCYQSYSTMS ITDCRETGSS

Vorfahre KKVACKNGQT NCYQSNSAMH ITDCRETGSS

BS-RNase KKVTCKNGQT NCYQSKSTMR ITDCRETGSS

100 110 120 124

RNase A KYPNCAYKTT QANKHIIVAC EG N PYVPVHF DASV

Vorfahre KYPNCAYKTT RAEKHIIVAC EG(K/N)PYVPVHF DASV

BS-RNase KYPNCAYKTT QVEKHIIVAC GG K PSVPVHF DASV

Tab. 2 Rekonstruierte Sequenz für die gemeinsame Vorläufer-RNase der Hirsche und der Gi¬

raffen. Die 10 Mutationen im Vergleich zur BS-RNase sind hervorgehoben. Bei den ambiva¬

lenten Stellen sind beide Möglichkeiten vermerkt.

Die rekonstruierte Sequenz besitzt auf AS-Ebene 10 Mutationen im Ver¬

gleich zur BS-RNase (N17S, C31F, T64A, K76N, T78A, R80H, Q101R, V102A,G111E und S115Y), oder 19 Mutationen im Vergleich zur RNase A (T3S, S16G,T17S, A19P, A20S, Q28L, K31F, S32C, N34K, L35M, K37Q, D38G, R39K, N62K,Y76N, T78A, S80H, Q101R, N103E). Zudem verbleiben zwei Stellen mit Am¬

bivalenzen, die eine jeweils näher zur RNase A (TSG4), die andere näher zur

BS-RNase (TSG^:

AS 55: Q (TSG4) oder K (TSG^AS 113: N (TSG4) oder K (TSG^

Zum Zeitpunkt der Rekonstruktion war die Sequenz von Okapi noch nicht

bekannt; ihre spätere Berücksichtigung ergab jedoch, dass sie keinen Einfluss

auf die Sequenz ausser einer zusätzlichen Ambivalenz für die Position AS 22

(S/N) gehabt hätte.


4.3 Die Resultate und deren Interpretation

4.3.1 Erwartungen für die Aktivität der BS-RNase-Mutanten

4.3.1.1 Einzelstrang-RNA-Aktivität (Poly(U)-Assay)

Beide Mutanten sollten im Bereich der BS-RNase liegen, da das aktive Zen¬

trum fast unverändert (GlHE) bleibt.

4.3.1.2 Katalytische Aktivität gegen Doppelstrang-RNA

Die Aktivität der Mutanten sollte unter derjenigen von BS-RNase, aber

deutlich über derjenigen von RNase A liegen. Der Grund für die Aktivitätsab¬

nahme liegt im Verlust von Gly 111, eine der beiden AS (neben Gly 38) die

verantwortlich sind für die Doppelstrang-Aktivität.

4.3.1.3 Biologische Aktivität (Immunosuppressivitat)

Es sollte zumindest für denjenigen Mutanten (TSG1) der näher zur BS-

RNase ist eine messbar erhöhte Immunosuppressivitat im Vergleich zur der¬

jenigen von RNase A festgestellt werden können, da von den acht dafür ver¬

antwortlichen AS (Leu 28, Cys 31, Cys 32, Lys 55, Lys 62, Thr 64, Gly 111, Lys113) deren fünf (Leu 28, Cys 32, Lys 55, Lys 62, Lys 113) vorhanden sind. Für

den Mutanten näher zur RNase A (TSG4) sieht die Sache schon weniger opti¬mistisch aus, da nur noch drei der acht AS vorhanden sind (Leu 28, Cys 32,

Lys 62).

4.3.1.4 Überlappung der N-terminalen Enden (S-Peptidaustausch)

Da Pro 19 und Leu 28, nicht aber Cys 31 in beiden Mutanten vorhanden ist,wird eine im Vergleich zur BS-RNase verminderte Überlappung erwartet.

4. Der Molekulare Darwinismus anhand der Entwicklung der Ribonuklease in Wiederkäuern 9_Z

4.3.2 Gemessene Resultate

4.3.2.1 Dinukleotid-Aktivität: UpA-Assay

Die beiden Mutanten (TSG1 und TSG4, 1.23-10" M) wurden auf ihre kata¬

lytische Aktivität gegenüber dem Dinukleotid Uridyl(3'—>5')Adenosin(UpA) bei verschiedenen Konzentrationen (30, 40, 50, 75 und 100 fiM) getestetund mit derjenigen von RNase A und BS-RNase verglichen.

Gemessen wird die Absorptionszunahme von Inosin bei X - 265 nm. Inosin

entsteht durch die Konversion des durch die UpA-Spaltung freigesetztenAdenosins durch Adenosindeaminase (ADA, 1 //,g/ml). Ausgewertet werdendie Daten mit einem Lineweaver-Burk Plot und so kcat und KM des ersten Re¬

aktionsschrittes bestimmt. Der Absorptionsunterschied von Adenosin und

Inosin bei X = 265 nm beträgt 8 = 7210 M'W'1.

Die gefundenen Werte für KM und kcat lagen alle tiefer im Vergleich zu

denjenigen von RNase A aber durchaus im Bereich derjenigen der BS-RNase.

Protein K* [s"1! KM [MM] ^rat/KM

RNase A(*' 769 ± 138 409 ± 78 1.9

Vorfahre TSG4 192 ± 101 93 ± 51 2.1

Vorfahre TSG-l 181 ± 73 83 ± 30 2.2

BS-RNase{*} 330 ± 114 330 ± 67 1.0

Tab. 3 Die katalytische Aktivität der rekonstruierten Mutanten gegenüber UpA im Vergleichzur Aktivität von RNase A und BS-RNase. Die Substratkonzentrationen betrugen jeweils 30,40, 50, 75 und 100 /xM und die RNase-Konzentration 1.23-10"9 M. Die Absorptionsänderungwurde bei À = 265 nm aufgenommen. Die angegebenen Werte wurden aus zwei verschiede-

nen Messreihen mit je drei Messungen pro Substratkonzentration ermittelt. In Zusammen¬

arbeit mit Lee C. Raley gemessen.


4.3.2.2 Einzelstrang-Aktivität: Poly(U)-Assay

Dieser Versuch diente der Bestimmung der katalytischen Aktivität der bei¬

den Mutanten (TSGX und TSG4, 9.19-10"9 M) gegenüber Poly(U) (20 /xg/ml).Gemessen wurde die Absorptionszunahme bei X - 260 nm, verursacht durch

die Spaltprodukte. Die Einzelstrang-Aktivität (AES ) ist definiert als:

AES = AA(x = 260 nm)/ [x min "

Y mg RNase]

für c[Poly(U)] = 20 ug/ml; T = 25 °C.

Protein Poly[U]-Aktivität

RNase A 24.0 ± 1.0

Vorfahre TSG4 10.0 ± 2.0

Vorfahre TSG-l 9.3 ± 2.3

BS-RNase 10.8 ± 2.3

Tab. 4 Die katalytische Aktivität der rekonstruierten Mutanten gegenüber Poly(U) im Ver¬

gleich zur Aktivität von RNase A und BS-RNase. Die Substratkonzentration betrug jeweils 20

/ig/ml und die RNase-Konzentration 9.19-10"9 M. Die Absorptionsänderung wurde bei X =

260 nm aufgenommen. Die angegebenen Werte wurden aus je drei Messungen pro Protein

ermittelt.

Im Vergleich zu RNase A ist die Aktivität der Mutanten wiederum niedri¬

ger, aber immer noch im Bereich der BS-RNase.

Aufgrund dieser Resultate ist ersichtlich, dass schon kurz nach der Gendu¬

plikation die in der BS-RNase vorhandene verminderte Aktivität gegenüberEinzelstrang-RNA vorhanden war. Es ist auch ersichtlich, dass dieser Um¬

stand im Verlaufe der Zeit nicht korrigiert wurde. Dies bedeutet unter dem

Gesichtspunkt der darwinschen Theorie, dass diese Eigenschaften nicht be¬

sonders wichtig waren für die Funktion des frisch entstandenen Enzyms.


4.3.2.3 Katalytische Aktivität gegen Doppelstrang-RNA poly(U)-poly(A)-As-say

BS-RNase vermag im Gegensatz zu RNase A doppelsträngiger RNA (ds-

RNA) zu spalten. Poly(U) und Poly(A) werden in H20 gelöst, bei RT hybridi¬siert und anschliessend mit Tris-Puffer auf 30 /ig/ml verdünnt. Nach der Zu¬

gabe der RNase (total 1-2 /ig/ml) wurde die Absorptionszunahme bei X = 260

nm gemessen. Die Doppelstrang-Aktivität (ADS) ist definiert als:

ADS = AA(X = 260 nm)/[X min*

J mg RNase]

für c[Poly(U)-Poly(A)] = 30 fig/ml; T = 25 °C.

ProteindsRNA-Akti-

viät

RNase A 0.6 ± 0.1

Vorfahre TSG4 1.6 ± 0.1

Vorfahre TSGX 3.3 ± 0.1

Vorfahre Bovidae(**' 3.0 ± 0.2

BS-RNaser) 4.3 ± 0.7

Tab. 5 Die katalytische Aktivität der rekonstruierten Mutanten gegenüber Poly(U)-Poly(A) imVergleich zur Aktivität von RNase A und BS-RNase. Die Substratkonzentration betrug je¬weils 30 /ig/ml und die RNase-Konzentration war 1-2 /xg/ml. Die Absorptionsänderungwurde bei X = 260 nm aufgenommen. Die angegebenen Werte wurden aus je drei Messungen

pro Protein ermittelt. In Zusammenarbeit mit Lee C. Raley gemessen.v ; Der Wert für die

dsRNA-Aktivität der Vorläufer-RNase der Bovidae wurde von N. Trabesinger-Rüf(Trabesinger-Rüf, 1997) übernommen und zu Vergleichszwecken aufgeführt.

Die BS-RNase weist im Vergleich zur RNase A eine stark erhöhte Doppel¬strangaktivität auf, während die Vorläufer-RNase der Bovidae (rekonstruiertvon N. Trabesinger) im Vergleich zur BS-RNase eine um etwa 30 % vermin¬

derte Aktivität besitzt. Die beiden Mutanten TSG: und TSG4 weisen gegen¬über von RNase A ebenfalls eine signifikant erhöhte Aktivität auf, mit der

Aktivität des TSG1-Mutanten in der Nähe der Vorläufer-RNase der Bovidae. Es

scheint, dass gleich nach der Genduplikation eine starke Selektion zur RNA-

Doppelstrangspaltung hin stattgefunden hat, während zwischen der Vorfah-

ren-RNase der Giraffen und Hirsche sowie derjenigen der Rinder sich diesbe¬

züglich nicht mehr allzu viel verändert hat. Auf jeden Fall haben die zahlrei¬

chen, in dieser Periode eingeführten Mutationen, keinen grossen Einfluss auf

die Doppelstrang-Aktivität des Proteins. Interessant ist jedoch der Unter¬

schied zwischen den Aktivitäten von TSG1 und TSG4. Hier hat der Austausch

von zwei AS (K55Q, K113N) zu einer weiteren Halbierung der Doppelstrang-Aktivität geführt. Bis anhin wurden diese AS-Positionen nur als für die Im¬

munosuppressivitat wichtig betrachtet. Dieses Resultat lässt zwei möglicheSchlussfolgerungen zu. Erstens wurde hier gezeigt, dass noch zwei weitere

Positionen neben 38 und 111 verantwortlich sind für die Doppelstrang-Akti-


vität und zweitens könnte ein Zusammenhang zwischen Doppelstrang-Akti¬vität und Immunosuppressivitat bestehen.

4.3.2.4 Destabilisierung von dsDNA (Poly(dA-dT)-Poly(dA-dT]): Der

MBNase-Assay (Ciglic, 1998).

Da RNase dsRNA zu spalten vermag, besitzt sie demzufolge auch eine he-

lixdestabilisierende Wirkung. Um nur diese zu untersuchen, kann dsDNA

verwendet werden, da diese bekanntlich durch RNase nicht hydrolysiertwird. Das Experiment der Wahl besteht nun darin, dass die entstandene

ssDNA selektiv in einem schnellen Schritt durch Mung Bean Nuclease

(MBNase) abgebaut wird. Dies bewirkt einen Anstieg der Absorption bei X =

260 nm, welcher gemessen wird. Poly(dA-dT)-Poly(dA-dT) wurde in einem

NaCl-Puffer gelöst (11.3 pig/ml), 1U MBNase zugegeben und equilibriert, bis

die Basislinie stabil war. Anschliessend wurde die RNase zugegeben und die

Absorptionsänderung während 30 min. bei X = 260 nm aufgetragen. Dieser

Assay wurde in zwei verschiedenen Versionen durchgeführt; bei niedrigerNaCl-Konzentration (50 mM) und bei physiologischer NaCl-Konzentration

(150 mM).

MBNase-Assay bei niedriger NaCl-Konzentration (50 mM)

n RNase A ( 14 /ig)

o- BS-RNase (28 /ig)

o---- Mutant TSGj (28/ig)

.a. Mutant-TSG4 (28 /ig)

0 10 20 30 40

Zeit [min.]

Abbildung 4.9 Abbau von ssDNA durch MBNase, aufgezeichnet als Absorptionszunahmebei X = 260 nm, nach der Addition von RNase bei niedriger Salzkonzentration (50 mM NaCl).

U.iJ

0.2-

0.15-

AA

fPpdIrfP

pdDonnaipaaDŒPa

Äoooooooooo,

.o<x>ooo<><><>o^ooooo

ooo0ooooooooooooooooooo

A-A-"«rf^1

a-aa-aa^s

0.1-

0.05-

0-9-


MBNase-Assay bei physiologischer NaCl-Konzentration (150 mM)

0.2-

0.15-

AA 0.1-

0.05-

-^>ooo!

^ooo*^^ <> °

.oooö°°'

,ooo-

^öDggggaDDnnuüDUÖuo a

A -A

-a

0-£0

"T"

10

1

20

Zeit [mm"

30

RNase A (14/ig)

BS-RNase (28 /ig)

Mutant TSG^ /ig)

Mutant TSG4 (28 /ig)

40

Abbildung 4.10 Abbau von ssDNA durch MBNase, aufgezeichnet als Absorptionszunahmebei X = 260 nm, nach der Addition von RNase bei physiologischer Salzkonzentration (150 mM

NaCl).

Das Resultat ist eindeutig: RNase A vermag die helikale Struktur von DNA

nur bei niedriger Salzkonzentration zu stören, ganz im Gegensatz zur BS-

RNase, wo kein Unterschied feststellbar ist in ihrem Verhalten bei unter¬

schiedlichen Salzmengen.

Die Kurvenverläufe der beiden Mutanten (TSG-l und TSG4) sind ähnlich zu

denjenigen der RNase A. Ersichtlich scheint wiederum zu sein, dass TSGa et¬

was näher zur BS-RNase ist als TSG4. Beide Vorläufer-Mutanten haben jedochbei niedrigen Salzkonzentrationen eine erheblich kleinere Aktivität als BS-

RNase und RNase A.


4.3.2.5 Austausch der N-terminalen Enden (S-Peptidaustausch)

Mit dem Divinylsulfon-Assay (Opitz, 1995) lässt sich der S-Peptidaus¬tausch an den beiden N-terminalen Enden bestimmen. Divinylsulfonsäurereagiert mit den beiden Histidinen der aktiven Zentren (His 12/His 119) undes entsteht eine kovalente Verbindung zwischen ihnen ("Cross link"). Gleich¬

zeitig wird die AS-Kette gespalten.

Abbildung 4.11 Der Mechanismus hinter dem Divinylsulfon-Assay: Michael-Addition der

Histidinreste im aktiven Zentrum von RNase an Divinylsulfon. Liegt ein N-terminaler S-Pep¬tidaustausch vor, bindet das eine Histidin von der ersten Untereinheit sowie das andere von

der zweiten an das Divinylsulfon und es entsteht eine kovalente Verbindung zwischen die¬

sen. Diese bleibt auch bestehen, wenn das Dimer denaturiert wird und sämtliche Disulfid-

brücken gebrochen sind. (Opitz, 1995)

Sind die N-terminalen Enden nicht ausgetauscht, so entsteht der "Cross

link" zwischen den Histidinen derselben Untereinheiten. Mit der Behandlungdurch ß-Mercaptoethanol werden sämtliche Disulfidbindungen zerstört; die

RNase zerfällt in ihre beiden Untereinheiten.

Sind die N-terminalen Enden ausgetauscht, entsteht der "Cross link" zwi¬

schen je einem Histidin der beiden Untereinheiten. Wird nun ß-Mercaptoe¬thanol zugegeben, so werden die beiden Untereinheiten durch die Denaturie¬

rung nicht mehr voneinander getrennt.

Bis zum vollständigen Umsatz aller Histidine (jeweils 15 /zg RNase in 50 /xl0.1 M NaOAc) mit DVS (1 /xl 10 % Lösung), was ca. 100 h (30 °C) dauert, wer¬den alle 24 h Proben (4 id) genommen, mit ß-Mercaptoethanol (1 /xl, 100 %)behandelt (30 min., RT) und bei -20 °C eingefroren. Die Analyse der Proben


geschieht auf einem mit "Silver staining" gefärbten SDS-PAGE-Gel (18 %).Der Verlauf der Reaktion kann so verfolgt werden und der Anteil des S-Pep-tidaustauschs wird anhand der letzten Fraktion mittels einer Abschätzungvon Auge bestimmt.

ProteinN-terminaler S-

Peptidaustausch [%]

RNase A

Vorfahre TSG4

Vorfahre TSGX

Vorfahre Bovidae{**]

BS-RNase(*'

«1

<5 ± 5

<10 ± 5

30 ± 5

70 ± 10

Tab. 6 Divinylsulfon-Assay. Abgeschätzter prozentualer Anteil der Proteine mit N-termina-

lem S-Peptidaustausch. In Zusammenarbeit mit Lee C. Raley gemessen. Der Wert für

den N-terminalen S-Peptidaustausch der Vorläufer-RNase der Bovidae wurde von N. Trabe¬

singer-Rüf (Trabesinger-Rüf, 1997) übernommen und zu Vergleichszwecken aufgeführt.

Auch hier kann das bereits weiter oben festgesteUte Muster beobachtet

werden. Wiederum ist der Mutant TSG1 in seinem Verhalten etwas näher zur

BS-RNase, während der Mutant TSG4 näher ist zur RNase A. Demzufolgekann für den ersten Mutanten auch eine etwas höhere Immunosuppressivitaterwartet werden.


4.3.2.6 Biologische Aktivität (Immunosuppressivitat): MLR-Assay

Die immunosuppressive Aktivität von RNase kann mittels eines "Mixed

lymphocyte culture reaction"-Assays (MLR) bestimmt werden. T-Lympho-zyten von zwei verschiedenen Kühen werden in RPMI-1640-Medium kulti¬

viert. Je lOO'OOO Zellen werden zusammen in ein Reaktionsgefäss transferiert

und während 48 h inkubiert. Danach werden 0.1 /xCurie tritiiertes Thymidin,sowie die zu bestimmende RNase zugegeben und die Kultur für weitere 24 h

inkubiert. Die Zellen werden mit einem "Cell harvester" geerntet und die Ra¬

dioaktivität in einem "Scintillation counter" bestimmt. Die gemessene Radio¬

aktivität ist ein Mass für die Immunosuppressivitat des Proteins. Pro RNase

wurden je drei parallele Messreihen bei insgesamt acht unterschiedlichen Pro¬

teinkonzentrationen (0.78 /xg/ml, 1.56 /xg/ml, 3.13 /xg/ml, 6.25 /xg/ml,12.5/xg/ml, 25.0 /xg/ml, 50.0 /xg/ml und 100 /xg/ml) durchgeführt. Zusätzlich

dazu wurden die Messungen mit Zellen einer weiteren dritten Kuh zusam¬

men mit Zellen der ersten Kuh noch einmal wiederholt. Die hier beschriebe¬

nen Messungen wurden in unserer Arbeitsgruppe von Lee C. Raley durchge¬führt und mir mündlich mitgeteilt (Mai 1999).

Protein ICRn [Mg/ml]

RNase A >100 ± 5

Vorfahre TSG4 >100 ± 5

Vorfahre TSG-l 45 ± 2

Vorfahre Bovidae 12.5 ± 3

BS-RNase 6.25 ± 1

Tab. 7 "Mixed lymphocyte culture reaction" (MLR). Angegeben ist der IC50 der verschiede¬

nen RNasen. Die Messungen wurden von Lee C. Raley durchgeführt und mir mündlich mit¬

geteilt.

Wiederum ist das bereits zuvor festgestellte Muster zu beobachten: Mit der

Änderung der beiden AS an der Position 55 und 113 von Q—>K und N—>K

resp. wird im Mutant TSG} eine für die BS-RNase charakteristische Eigen¬schaft neu eingeführt. Diese Beobachtungen bestätiten die Resultate von M.

Haugg (Haugg, 1996).


4.3.2.7 Inhibition durch das Gangliosid GM3 (Trabesinger-Rüf, 1997)

Wie bereits erwähnt, besitzt BS-RNase einen cytotoxischen Effekt und

hemmt das Wachstum von metastatischen Krebszellen. Der cytotoxische Ef¬

fekt beruht auf dem erhöhten Eindringvermögen von BS-RNase in die Zelle

und der daraus resultierenden Bindung und Hydrolyse von ribosomaler

RNA. Der Mechanismus für die Aufnahme in das Zellinnere ist nicht geklärt.Die Antitumoraktivität lässt sich dadurch erklären, dass in Zellmembranen

von transformierten Zellen ein erhöhter Anteil anionischer Glykolipide fest¬

zustellen ist. Dies ermöglicht die Bildung von Komplexe mit RGD-rezeptor-erkennenden Proteinen, welche wiederum eine zentrale Rolle spielen in der

Bindung der Krebszelle an die extrazelluläre Matrix und darum in der Bil¬

dung von Metastasen. BS-RNase bindet nun, wie die ebenfalls zur RNase-Su-

perfamilie gehörenden Lektine, anionische Glykolipide, was die Bildung des

oben beschriebenen Komplexes verhindert. Gleichzeitig dazu wird die RNA-

Hydrolyseaktivität von BS-RNase heruntergesetzt, welche dann gemessenwerden kann. Ein typischer Vertreter anionischer Glykolipide ist das Gang¬liosid GM3.

AcHN

Abbildung 4.12 Struktur von GM3. Der hydrophobe Teil (Ceramid) wird durch Fettsäuren

gebildet, der hydrophile Teil durch einen Zuckerteil mit einer Carboxylgruppe (Sialinsäure)und einer N-acetylierten Hydroxygruppe.

Die Bindung von Glykolipiden an RNase wurde bestimmt durch die Mes¬

sung der Inhibition der RNA-Hydrolyse und wurde in einem modifizierten

UpA-Assay durchgeführt. Dabei werden eine ADA (1 /xg/ml) enthaltende

UpA-Lösung (25 /xM) in NaOAc-Puffer (0.1 M pH 5) mit GM3 (20 nM) versetzt

und equilibriert. Die Absorptionsabnahme wurde bei X = 275 nm nach der

Zugabe von RNase (1.23-10"9 M) verfolgt. Die Inhibition wurde bestimmt

durch den Vergleich mit Messwerten aus einem analogen Versuch ohne GM3.


Protein Inhibition [%]N-terminaler S-

Peptidaustausch [%]

RNase A 13 «1

Vorfahre TSG4 4 <5

Vorfahre TSGX 21 <10

Vorfahre Bovidae(**' 79 30

BS-RNase(*' 45 70

Tab. 8 Inhibition von RNase durch das Gangliosid GM3 (20 nM). In Zusammenarbeit mit

Lee C. Raley gemessen.v Der Wert für den N-terminalen S-Peptidaustausch der Vorläufer-

RNase der Bovidae wurde von N. Trabesinger-Rüf (Trabesinger-Rüf, 1997) übernommen und

zu Vergleichszwecken aufgeführt.

Auch bei diesem Versuch ist derselbe Trend auszumachen wie der bereits

oben beobachte: Je weiter man zurückgeht in der Zeit, desto näher ist das

Verhalten demjenigen von RNase A ähnlich. Nur der Wert für BS-RNase fällt

aus dem Schema. Er liegt allerdings um einiges tiefer als die früher in dieser

Gruppe gemessenen Werte (Trabesinger-Rüf, 1997).


4.3.3 Wertung

Aus den oben präsentierten Daten lässt sich mit relativ grosser Sicherheit

der Trend herauslesen, dass der BS-RNase-ähnlichere Mutant (TSGlr K55,Kl13) bereits einige Merkmale der modernen BS-RNase aufwies, während der

RNase A-ähnlichere Mutant (TSG4, Q55 und N113) in seinem Verhalten viel

näher bei der heutigen RNase A liegt. Dies bedeutet:

• Diese beiden AS (K55, Kl13) sind wichtig für die diversen Eigenschaftenvon BS-RNase, v.a. für jene im Zusammenhang mit der Immunosuppres¬sion. Dies wurde jedoch bereits in vorherigen Arbeiten in dieser Gruppefestgestellt und stellt somit keine Neuigkeit dar (Haugg, 1996; Jermann,1995; Opitz, 1995; Raillard-Yoon, 1993; Trautwein-Fritz, 1991).

• Das Gen war mit grosser Wahrscheinlichkeit im damals lebenden Vorläu¬

fertier exprimiert. Diese These wird dadurch gestützt, dass die charakteri¬

stischen BS-RNase-Eigenschaften bereits sehr früh zumindest ansatzweise

vorhanden waren. Wäre das Protein nicht exprimiert gewesen, so wäre

keine so zielgerichtete Evolution hin zu seiner heutigen Form zu beob¬

achten. Zudem müssten entlang des Weges funktionsschädigende Muta¬

tionen auftreten. Nur so lassen sich auch die verschiedenen Defekte in den

heute zu findenden Pseudogenen, sowie das komplette, nicht exprimierteOkapi-Gen plausibel erklären.

• Die Mutationen von Q55K und N113K fanden relativ früh in der evolutio¬

nären Entwicklung der Ruminata statt. Da jedoch ausser den Rindern die

meisten Arten nur ein Pseudogen aufweisen, muss der Vorteil, den die

damals lebenden Tiere durch dieses zusätzliche Gen erhielten, dennoch

nicht besonders gross gewesen sein. Es wäre auch möglich, dass sie diesen

nicht effizient zu nutzen wussten und ihn darum wieder verloren.

Zusammen mit den Arbeiten von N. Trabesinger-Rüf, L. C. Raley und demhier vorgelegten Dissertationskapitel lässt sich zum ersten Mal überhaupt die

evolutionäre Entwicklung eines Proteins von seiner Entstehung bis zum heu¬

tigen Tag dokumentieren. Es lässt sich zeigen, dass das neue Protein bereits

kurz nach seiner Entstehung aus der RNase A neue Eigenschaften aufgewie¬sen hat.


4.4 Rekonstruktion der Mutanten

4.4.1 Die Kunkel-Mutagenese

Das Prinzip der Kunkel-Mutagenese (Kunkel et al, 1987) beruht darauf,dass ein einzelsträngiges uracilenthaltendes Templat-Plasmid mit der mu¬

tierten Sequenz hergestellt wird. Auf dieses Plasmid wird dann ein phospho-ryliertes Oligomer hybridisiert und die Polymerasereaktion durchgeführt.

Die zu mutierende Sequenz wird in einen geeigneten Vektor (pET23b+,Schnittstellen: NdE I, Hind III) kloniert (Haugg, 1996) und in einen E. coli

Stamm (CJ 236) transformiert, der sich durch das Fehlen von dUTPase und

Uracil N-Glykosylase auszeichnet.

Xho I(i5i[NotltiSi)EagICiBG)Hlr>d 111(173.)Sal 1(179)Hinc 11(131)Sac](i9ü)

Dra MI(Mi) ,\ ^-——l^^mLl ^Z-häo 1(233)^^^^^^

-~~^—Xbal( -G)

,. _ll(33J|

"^ Dsa Igsp)^ BpulÜ 1(19.1]— BUS [(505)~- Bsg l[3 s)

ECQ-,7 111(542)

BmH K^aiH]

Sea l(2-6i) {

Pvu 1(2651

Psl l(2al

pET-23b(+)(3665 bp)

ê-) I|3<01> ^\ q).\

'

Sap 1(1* »j

.,..,, /\ v.

^-^fllll[l3flS)Ahdlissai)-' V ^ / ^BspLUH 1(1338)

Abbildung 4.13 Struktur des Vektors pET23b+.Die BS-RNase Sequenz wurde zwischen NdE I

und Hind III (rot markiert) kloniert.

Die Bakterien werden auf einer Platte (Chloramphenicol-Agar-Ampicillin)kultiviert und davon eine Kolonie in einem Flüssigmedium (2xYT, Ampicil¬lin, Chloramphenicol) aufgezüchtet. Danach wird mit einem Helperphage(M13K07) infiziert und die Kolonie weitergezüchtet (Selektion: durch Ka-

namycin, auf Helperphage kodiert). Das einzelsträngige uracilenthaltendePlasmid wird aus dem Phagen isoliert und ein phosphorylierter Primer mit

der einzuführenden Mutation hybridisiert. In einem nächsten Schritt werdendie Polymerase- und Ligasereaktionen durchgeführt (17 DNA Polymerase, T4DNA Ligase) und das resultierende doppelsträngige Plasmid in einen neuenE. coli Stamm (DH5a) transformiert, welcher die oben erwähnten Defizite

nicht besitzt. Dadurch wird beim Aufzüchten sichergestellt, dass der uracil¬enthaltende Templatstrang (das Ausgangsplasmid) vollständig abgebautwird und nur noch Kopien des neuen Plasmids vorhanden sind. Jeweils zehnverschiedene Kolonien werden ausgewählt, gezüchtet, die Plasmide darausisoliert und zur Kontrolle sequenziert. Die Erfolgsquote beträgt etwa 60 - 80 %

pro Mutation bzw. pro verwendetem Primer.


Um den BS-RNase Mutanten TSG1 zu erhalten, muss die BS-RNase an zehn

Stellen mutiert werden:

N17S C31F T64A K7 6N T7 8A R80H Q101R

AAC17AGC TGC31TTC ACT64GCC AAA7 6AAC ACC7 8GCC CGC80CAC CAG101CGG

V102A G111E S115Y

GTG102GCG GGC111GAG TCC115TAC

Die verwendete, bereits in den gewünschten Vektor geklonte Ausgangsse¬quenz konnte freundlicherweise von N. Trabesinger-Rüf übernommen wer¬

den. Die Sequenz enthielt bereits vier Mutationen (eine davon unerwünscht;

GlllA) und entspricht der Vorläufer-RNase der Bovidae (Trabesinger-Rüf,1997):

N17S C31F GlllA S115Y

AAC17AGC TGC31TTC GGC111GCA TCC115TAC

Die gewählte Vorgehensweise sah vor, dass zuerst die Position T64A und

AlllE, dann die Position R80H, danach Q101R/V102A und schliesslich

K76N/T78A mutiert würden. Beim ersten Schritt konnte allerdings nur T64A

eingeführt werden, so dass AlllE zusammen mit R80H mutiert wurde. Die

restlichen Schritte verliefen wie geplant.

Mutationsschritt1. Primer-Sequenz

2. Sinnstrang

T64A1. 5'AAG AAA GTC GÇÇ TGC AAG AAT 3'

2. 5'ATT CTT GCA GGC GAC TTT CTT 3'

AlllE1. 5'GTG GCT TGT GAG GGT AAA CCG 3'

2. 5'CGG TTT ACC CTC ACA AGC CAC 3'

R80H1. 5 ' TCC ACC ATG CAC ATC ACA GAC 3 '

2. 5'GTC TGT GAT GTG CAT GGT GGA 3'

Q101R/V102A1. 5'AAG ACC ACC CGG GCG GAG AAA CAC 3'

2. 5'GTG TTT CTC CGC CCG GGT GGT CTT 3'

K7 6N/T7 8A1. 5 '

TAC CAG AGC AAC TCC GCC ATG CAC ATC 3 '

2. 5'GAT GTG CAT GGC GGA GTT GCT CTG GTA 3'

Tab. 9 Aufgeführt sind die verwendeten Primer Sequenzen zur Herstellung des Mutanten

TSGj. Effektiv verwendet für die Polymerasereaktion wurde jeweils der ebenfalls angegebeneSinnstrang. Die Reihenfolge der Einführung der Mutation entspricht der hier angegebenen.


Zur Herstellung des Mutanten TSG4 mussten zusätzlich zwei weitere Mu¬

tationen eingeführt werden (K55Q und K113N), was in einem Schritt durch¬

geführt werden konnte. Gleichzeitig fielen auch noch die beiden Mutanten an,

welche je nur eine der Mutationen (K55Q oder K113N) aufwiesen (TSG2 und

TSG3).

Mutationsschritt1. Primer-Sequenz

2. Sinnstrang

K55Q1. 5'GCC GAT GTT CAG GCC GTG TGC 3'

2. 5'GCA CAC GGC CTG AAC ATC GGC 3'

K113N1. 5'TGT GAG GGT AAC CCG TAC GTG 3'

2. 5'CAC GTA CGG GTT ACC CTC ACA 3'

Tab. 10 Aufgeführt sind die verwendeten Primer Sequenzen zur Herstellung des Mutanten

TSG4. Effektiv verwendet für die Polymerasereaktion wurde jeweils der ebenfalls angegebeneSinnstrang. Beide Mutationen wurden in einem Schritt eingeführt.


4.4.2 Expression und Reinigung

Das Plasmid mit der zu exprimierenden Sequenz wird in den E. coli.

Stamm BL21-(DE3) transformiert und aufgezüchtet (Übernachtkultur). Zur

Kontrolle wird aus einem Teil davon das Plasmid zurückisoliert und zur Se¬

quenzierung abgegeben. Mit dem anderen Teil wird ein Flüssigmedium (LB )

angeimpft und bis zu einer OD600 von 0.8-1.2 wachsen gelassen. Die chemi¬

sche Induzierung der Expression geschieht durch Zugabe von ITPG. Nach

vier Stunden wird abzentrifugiert und in Lysepuffer resuspendiert. Die Zellen

können nach diesem Schritt bei -80°C tiefgefroren werden.

Der Aufschluss der Zellen geschieht in einer "French Press" (bis 5000 psi;344.7 bar) und die resultierenden "Inclusion Bodies" werden nach einem

weiteren Zentrifugationsschritt in einem Denatuerierungspuffer gelöst. An¬

schliessend wird gegen eine HAc-Lösung (20 mM) dialysiert, bis die Konzen¬

tration von Guanidiniumchlorid genügend klein ist (von 6 M auf 50 - 100

mM). Der dabei ausfallende weisse NS wird abzentrifugiert und verworfen.

Zum Überstand wird TrisOAc zugegeben, so dass der pH bei 8 bis 9 Hegt. In

einem nächsten Schritt erfolgt die Denaturierung durch die Zugabe von redu¬

ziertem und oxidiertem Glutathion und dann die Rückfaltung zum Monomer

(2 d). Danach wird der Puffer auf NaOAc (50 mM, pH = 5.0) gewechselt(Konzentrator).

Die Reinigung wird mit einer preäquilibrierten pUp-Säule durchgeführt.Man trägt das Monomer in aufkonzentrierter Form auf die Säule auf und

wäscht mit NaOAc. Anschliessend wird das Monomer durch eine Lösung mit

zunehmendem NaCl-Gradienten eluiert. Nachdem die vereinigten Fraktionen

aufkonzentriert und der Puffer auf den Rückfaltungspuffer gewechselt wor¬

den ist, wird das Monomer durch die Zugabe von DTT vollständig denatur¬

iert. Die Faltung des RNase-Mutanten in seine aktive dimere Form dauert

nach der Entfernung des DTT (PDIO-Säule) ca. 2 Wochen und findet bei 4 °C

unter ständigem Rühren statt, ist aber nicht vollständig. Zur Trennung von

Monomer und Dimer wird wiederum eine pUp-Säule verwendet. Die einzigeÄnderung im Vergleich zur ersten Säule besteht darin, dass der NaCl-Gra-

dient kleiner ist. Die dimerhaltigen Fraktionen werden kombiniert, der Puffer

auf NaOAc gewechselt und die Lösung eingeengt.

Der isolierte BS-RNase Mutant wird anschliessend auf seine Reinheit be¬

stimmt und die Konzentration ermittelt. Zur Aufbewahrung kann die Pro¬

teinlösung bei -20 °C eingefroren werden. Die Ausbeuten waren sehr unter¬

schiedlich. Für den BS-RNase-Mutanten TSGX betrug sie 4.1 mg, für den

Mutanten TSG4 0.9 mg.

5. Experimenteller Teil 112

Experimenteller Teil


5.1 Materialien

5.1.1 Chemikalien

Name (in Englisch)

1-Butanol (n-butanol)1-Heptenel,2-Epoxy-5-hexen1,3,5-Benzenetricarbonylchloride1,4-Diazabicyclo [2,2,2]octane

2-(3-Pentenyl)pyridine2-Allyloxybenzaldehyde2-Mercaptoethanol2-Propanol2-Vinylnaphthalene2,4-Dinitrophenylhydrazin2,4,6-Collidine

2,6-Dichlorostyrene3-Allylcyclohexanone3-Allylrhodanine3-Nitrostyrene4-Carboxybenzaldehyde4-Fluorostyrene4-Methyl-l-pentene4-Penten-l-al

4-Pentennitrile

4-Formylbenzaldehydeboronic acid

5-Vinyl-2-norbornene9-Vinylanthraceneoc-D-(±)-Glucosea, a -Dichloromethylmethylethera -Cyano-4-hydroxycinnamic acid

AcetaldehydeAcetic acid (glacial)Acetone

Acetonitrile

AcetylchlorideAdenosine-3'-Monophosphate (free acl

Affi-Gel 601 Boronate Gel

AgaroseAllylbromideAllylbutyrateAllylcyanideAllylmethylsulfideAllylphenylsulfoneAllylamineAllylanisole (estragole)AllylbenzeneAllylcyclopentane

Hersteller Qualität CAS-#

Fisher cert. ACS 71-36-3

Aldrich 99% 592-76-7

Aldrich 98% 10353-53-4

Lancaster 98+ % 4422-95-1

Aldrich 98% 280-57-9

Aldrich 94 % (mix) 2057-43-4

Aldrich tech. 28752-82-1

Fisher electroph. gr. 60-24-2

Fisher 99% 67-63-0

Aldrich 98% 827-54-3

Kodak (15 % H20) 119-26-6

Acros 99% 108-75-8

Aldrich 98% 28469-92-3

Aldrich 97% 94-66-6

Aldrich 99% 1457-47-2

Aldrich 96% 586-39-0

Lancaster 98% 619-66-9

Aldrich 99% 405-99-2

Aldrich 98% 691-37-2

Lancaster 97% 2100-17-6

Acros 98% 592-51-8

Lancaster 97% 87199-17-5

Aldrich 95% 3048-64-4

Aldrich 97% 2444-68-0

Acros 99+ % 492-62-6

Aldrich 98% 4885-02-3

Aldrich 97% 28166-41-8

Fisher ACS 75-07-0

Aldrich 99.99 % 64-19-7



Aldrich 99+ % 75-36-5

Sigma 99+ % 84-21-6

BioRad 25034-58-6

GibcoBRL ultra pure 9012-36-6

Aldrich 99% 106-95-6

Aldrich 99% 2051-78-7

Aldrich 98% 109-75-1

Aldrich 98% 10152-76-8

Aldrich 98% 16212-05-8

Aldrich 99+ % 107-11-9

Aldrich 98% 140-67-0

Aldrich 98% 300-57-2

Aldrich 99% 3524-75-2


Allyldiphenylphosphine Aldrich 95% 2741-38-0

Allylimidazole Aldrich 95% 31410-01-2

Allylpentafluorobenzene Aldrich 97% 1736-60-3

Aminoacetaldhydedimethylacetal Aldrich 99% 22483-09-6

Ammoniumchloride Fisher cert. ACS 12125-02-9

Ammoniumeitrate dibasic Sigma ACS 3012-65-5

Ammoniumhydroxide Fisher ACS 1336-21-6

Ampicillin (sodium salt) Fisher biot. res. gr. 69-52-3

Bacto Triptone Difco

Bacto Yeast Extract Difco

Benzaldehydetosylhydrazone Aldrich 98% 1666-17-7

Benzene Fisher ACS 71-43-2

Benzenesulfinic acid (sodium salt) Aldrich 98% 873-55-2

Benzoic acid Aldrich 99.5 % 65-85-0

Benzonitrile Sigma 99.9 % 100-47-0

Benzoylchloride Aldrich 99% 98-88-4

Benzylchloroformate Aldrich tech.; 95 % 501-53-1

Benzylamine Acros 99% 100-46-9

Bis(tricyclohexylphosphine)- Strem 97% 172222-30-9

benzylidenerutheniumdichlorideBorontrifluoride (diethyl-etherate) Aldrich redistilled 109-63-7

Boric acid Fisher electroph. gr. 10043-35-3

Bromine Fisher ACS 7726-95-6

Calcium chloride Fisher 4-20 mesh 10043-52-4

Calix[4]arene Aldrich 95% 74568-07-3

Carbontetrabromide Aldrich 99% 558-13-4

Carbontetrachloride Aldrich 99.9 % 56-23-5

Chloramphenicol Fisher biot. res. gr. 56-75-7

Chloroform Fisher cert. ACS 67-66-3

Chloroform-d with 0.05% v/v TMS Camb. Isot. Lab. 99.8 % 865-49-6

Chloromethyloctylether Aldrich 95% 24566-90-3

Chlorotitaniumtriisopropoxide Aldrich 95% 20717-86-6

cis-3-Nonen-l-ol Aldrich 95% 10340-23-5

Coomassie Blue Promega 25x sol.

(Blue Print Fast Coomassie Stain)Copper-(I)-chloride Aldrich 99.99+ % 7758-89-6

Cyclopentylmagnesiumchloride Aldrich 2.0 M 32916-51-1

(2.0 M in Et20)Cytidine-3'-Monophosphate (free acid) Sigma 99% 84-52-6

(DHQ)2 PHAL Aldrich 95+ % 140924-50-1

(DHQD)2 PHAL Aldrich 95+ % 140853-10-7

Diazald ® Aldrich 99% 80-11-5

(N-methyl-N-nitroso-p-toluenesulfon amide)Dichlorotris(triphenylphosphine)- Strem 99% 15529-49-4

ruthenium(II)Dimthylsulfoxide Fisher cert. ACS 67-68-5

Disodium Uridine 5'-Monophospate Sigma 98% 3387-36-8

Dithioeritol Fisher electroph. gr. 3483-12-3

EDTA (Disodium salt) Fisher electroph. gr .6381-92-6

Ethanol Aaper 100 % 64-17-5

Ether (Et20) Fisher ACS 60-29-7

Ethyl-2-methyl-4-pentenoate Aldrich 98% 53399-81-9


Ethylacetate Fisher cert. ACS 141-78-6

Ethylchloroformate Aldrich 97% 541-41-3

Ethylphtalate Fisher purified 84-66-2

Ethylmagnesiumbromide Aldrich 1.0 M 925-90-6

(1.0 M solution in tetrahydrofuran)

Ferrous-(II)-sulfate Fisher 99% 7782-63-0

Glutathione (ox.) Sigma 98% 27025-41-8

Glutathione (red.) Sigma 98-100 % 70-18-8

Guanidinium Hydrochloride Sigma 99+ % 50-01-1

Guanosine-3'-Monophosphate (free acid)i ICN 99% 6027-83-4

Hexane Fisher Optima 110-54-3

Hydrazin Monohydrate Fisher cert. 7803-57-8

Hydrochloric acid (HCl) Fisher cert. ACS 7647-01-0

Iodine Fisher 99.8 % 7553-56-2

Ironpentacarbonyl Aldrich 13463-40-6

Isoamylnitrite Aldrich 97% 110-46-3

Isopropyl Thio-ß-Galactoside (IPTG) Fisher biot. gr. 367-93-1

Kanamycin (Mono Sulfate) Fisher biot. res. gr. 25389-94-0

L-Cysteine Sigma 98% 52-90-4

Magnesium chloride Hexahydrate Fisher cert. ACS 7791-18-6

Magnesium sulfate Fisher enzyme gr. 10034-99-8

Methanesulfonamide Aldrich 98% 3144-09-0

Methanol Fisher cert. ACS 67-56-1

Methyl-3-butenoate Aldrich 97% 3724-55-8

Methyliodide Fisher cert. 74-88-4

Methylenechloride (CH2C12) Fisher cert. ACS 75-09-2

Monosialoganglioside GM3 Sigma 98% 54827-14-4

N-Hydroxysuccinimide-Fmoc Novabio.

N,N-Diethylaniline Aldrich 99+ % 91-66-7

N-Vinylphthalimide Aldrich 99% 3485-84-5

Nitric acid Fisher cert. ACS 7697-37-2

Nootkatone Lancaster 97 % cryst. 4674-50-4

Oxalylchloride Aldrich 98% 79-37-8

p-Tetrachloromethylcalix[4]arene J. Sigel (UCSD)p-Toluenesulfonic acid, 1-Hydrate Acros 6192-52-5

p-Toluenesulfonylchloride Aldrich 99+ % 98-59-9

Pentane Fisher cert. ACS 109-66-0

Perchloric acid 60 % Fisher ACS 60 % 7601-90-3

Petroleumether Fisher cert. ACS 8032-32-4

Phenylacetaldehyde Aldrich 90 + % 122-78-1

Phosphoric acid Fisher 85% 7664-38-2

Polyethyleneglycol 6000 Fluka pract. 25322-68-3

Polyadenylic acid(5') (potassium salt) Sigma 26763-19-9

Polyuridylic acid (5') (potassium salt) Sigma 28086-43-3

Potassium acetate Fisher enzyme gr. 127-08-2

Potassium carbonate Fisher cert. ACS 584-08-7

Polydeoxyadenylic acid- Sigma 86834-22-2

Polythymidylic acid disodium salt (Poly(dA-dT)-Poly(dA-dT))Potassium hydroxide Fisher cert. ACS 1310-58-3

Potassium osmate Dihydrate Aldrich 19718-36-6

Ruthenium-(Ill)-chloride Hydrate Aldrich 14898-67-0

S-Trityl-L-cysteine Aldrich 97% 2799-07-7


Safrole Aldrich 97% 94-59-7

Saturated Phenol Fisher biotech gr. 108-95-2

In Tris Buffer, pH 6.6 ± 2

Sclareol Aldrich 515-03-7

Silver nitrate Mallinckrodt ACS 7761-88-8

Sodium acetate Fisher enzyme gr. 127-09-3

Sodium bicarbonate Fisher cert. ACS 144-55-8

Sodium borohydride Aldrich 99% 16940-66-2

Sodium carbonate Fisher cert. ACS 497-19-8

Sodium chloride Fisher cert. ACS 7647-14-5

Sodium hydride Acros 60% 7646-69-7

60% dispersion in mineral oil, toluene soluble bagsSodium hydroxide Fisher cert. ACS 1310-73-2

Sodium methoxide Acros 95% 124-41-5

Sodium periodate Aldrich 99% 7790-28-5

Sodium sulfate (anhydrous) Fisher cert. ACS 7757-82-6

Sodium sulfite Aldrich 98% 7757-83-7

Sodium thiosulfate (Pentahydrate) Aldrich 99% 7772-98-7

Sulfuric acid Fisher ACS 7664-93-9

tert-Butanol (2-Methyl-2-propanol) Fisher cert. 75-65-0

tert-Butyldisulfide Aldrich 97% 110-06-5

Tetrahydrofuran Fisher cert. ACS 109-99-9

Thiobenzoic acid Fluka pract; -95 % 98-91-9

Tin-(IV)-chloride Fisher anhyd. 7646-78-8

Tin-(IV)-chloride Aldrich 1.0 M 7646-78-8

1.0 M solution in dichloromethane

Titanium tetrachloride Fisher purified 7550-45-0

Toluene Fisher cert. ACS 108-88-3

Tricyclohexylphosphine Strem 97% 2622-14-2

Triethylamine Fisher ACS 121-44-8

Triethyleneglycol Acros 99% 112-27-6

Trifluoroaceticanhydride Aldrich 99+ % 407-25-0

Trifluoroacetic acid Aldrich 99+ % 76-05-1

Triphenylphosphine Aldrich 99% 603-35-0

Triphosgene Aldrich 98% 32315-10-9

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane Aldrich 99.8+ % 77-86-7

Urea-hydrogenperoxide addition complexAldrich 98% 124-43-6

PUp SigmaUridine-2',5'&3',5'-Diphosphate; insolubized on cross-linked 4 % beaded

agarose, 0.65uM UDP/ml gel; activation: cyanogen bromide

UpA Sigma 97% 27531-21-1

Uridyl(3'->5')Adenosine (Ammonium Salt); 1.5 mol H20/mol UpAUridine-3'-Monophosphate (sodium salt) Sigma 99% 35170-03-7

Uridine-5'-Monophosphate Sigma 99% 58-97-9

Vinylsulfone (Divinyl sulfone) Sigma 77-77-0

Zink acetate Fisher cert. 5970-45-6


5.1.2 Enzyme

Ribonuclease A [EC 3.1.27.5] Sigma 85% 9001-99-4

Ribonuclease A [EC 3.1.27.5] Sigma >95 % 9001-99-4

Type XII-A essentially pure RNase A, essentially protease- and salt free,ca. 100 Kunitz units/mg protein

Adenosin Deaminase Calbiochem

T7-DNA Polymerase BioRad

T4-DNA Ligase BioRad

Mung Bean Nuclease 1 Promega

5.1.3 Bakterien

CJ236 BioRad

BL21-(DE3) Promega

DH5a Clontech

dutl, ungl, thi-1, rel Al/pCJ105(Cmr F)Transformation: Elektroporation

F'ompT hsdDb(rB"mB')DE3-LysogenTransformation: Hitzeschock

supE44, hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1,relAl

Transformation: Elektroporation

5.1.4 Medien/Lösungen/Puffer

LB-Medium: 10 g Bacto Trypton5 g Bacto Hefeextrakt

10 g NaCl

pro 11 Lösung

2x YT-Medium: 16 g Bacto Trypton10 g Bacto Hefeextrakt

5 g NaCl

pro 11 Lösung

LB -Medium: 16 g Bacto Trypton10 g Bacto Hefeextrakt

10 g NaCl

pro 11 Lösung

SOC-Medium: 20 g Bacto Trypton5 g Bacto Hefeextrakt

0.5 g NaCl

0.18 g KCl

0.95 g MgCl20.36 g Glukose

pro 11 Lösung

Die Medien wurden autoklaviert und bei Raumtemperatur gelagert.


LB-Amp-Agarplatten: 10 g Bacto Trypton5 g Bacto Hefeextrakt

10 g NaCl

15 g Bacto Agarpro 11 Lösung

Ampicillin wird erst zugegeben, nachdem die Temperatur auf unter 50 °C ge¬fallen ist. Die LB-Amp-Agarlösung wird in sterile Petrischalen gegossen und

bei 4 °C gelagert.

Ampicillin:Chloramphenicol:Kanamycin:

Agarosegel-Ladepuffer:

5x Proteingel-Ladepuffer:

TE:

50 mg/ml in H20 (steril filtriert)34 mg/ml in EtOH

10 mg/ml in H20 (steril filtriert)

30 % Glycerol, 0.25 % Bromphenolblau,0.25 % Xylencyanol

250 mM Tris-HCl pH 6.8,10 % SDS,0.25 % Bromphenolblau, 50 % Glycerol

10 mM Tris-HCl pH 8.0

1 mM EDTA pH 8.0

Muta Gene Phagemid In Vitro Mutagenesis Kit Version 2 - Kit:

T7 DNA Polymerase: 1 U//d, 20 mM K3P04 pH 7.4,1 mM DTT,1. mM EDTA, 50 % glycerol

T7DNA PolymeraseDilution Buffer:

T4 DNA Ligase:

lOx Annealing Buffer:

lOx Synthesis Buffer:

20 mM K3P04 pH 7.4,1 mM DTT,0.1 mM EDTA, 50 % glycerol

3 U//d, 10 mM Tris-HCl pH7.5,50 mM KCl, 1 mM DTT, 50 % glycerol20 mM MgCl2,500 mM NaCl,200 mM Tris-HCl pH 7.5

je 5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP,10 mM ATP, 100 mM Tris-HCl pH 7.4,

50 mM MgCl2,20 mM DTT

Wizard® Plus Miniprep (DNA-Purif. Sys.) - Kit:

Cell Resuspension Solution: 50 mM Tris-HCl pH 7.5,10 mM EDTA,100 jig/ml RNase A

Cell Lysis Solution:

Neutralization Solution:

0.2 M NaOH, 1 % SDS

1.32MKOAcpH4.8

Column Wash Solution: 80 mM KOAc, 8.3 mM Tris-HCl pH 7.5,40 uM EDTA, 55 % EtOH


5.1.5 Verwendete Apparaturen und Geräte

ElektroporationFT-ICR-MS

BioRad

Bruker Inst. Inc.

E. coli Pulser

47e

Supraleitender MagnetHexapol

GC-MS

Inkubator

Magnex Sei. Ltd.

Analyt. of Branf.

FinniganFisher Scientific

GCQ

LC-MS Finnigan LC-QMS Finnigan MAT 95

NMR

pH-Meter

Varian

Fisher Scientific

Genimi 300 (300 MHz)aecumet model 20

Shaker New Brunswick

Scientific Co. Ine

Incubator Shaker

UV-VIS Varian Cary 1 Bio

Zentrifugen

Pharmacia Biot.

Sorvall

Eppendorf

Ultraspec 2000

RC5B plusCentrifuge 5415C

5.1.6 Andere Materialien

DB5 MS; GC-Säule zu GC-MS

Länge: 30 m, i.D.: 0.25 mm, Film: 0.25 /ma

Diaflo Ultrafiltration Membranes YM3/YM10Gene Pulser®/E.coli Pulser Cuvette

0.1cm electrode gap

Helper Phage M13K07Mixed Bed Resin TMD-8

1:1 mixture of strong cation and anion exchange resin

Muta Gene Phagemid In Vitro

Mutagenesis Kit Version 2

OligonukleotideProteinkonzentrator (10 ml und 50 ml)PD10 Säule (Sephadex 25)Silver Stain Plus

Wizard® Plus Miniprep (DNA-Purif. Sys.)

J&W Scientific

Amicon

BioRad

BioRad

Sigma

BioRad

IDT

Amicon

Pharmacia

BioRad

Promega


5.2. Kombinatorische Chemie

5.2.0 Allgemeine Prozeduren

Alle empfindlichen Reaktionen wurden unter Ar durchgeführt. Die Glas¬

waren wurden im Ofen (120 °C) getrocknet und unter Ar auf RT aufgewärmt.Die LM wurden frisch über dem geeigneten Trocknungsmittel abdestilliert

(Et20, THF, Benzol: Na; MeOH, CH3CN, CHC13, CH2C12: CaH2). Die Entga¬sung der LM wurde durch mehrmaliges ausfrieren und auftauen unter HV

("Freeze thaw cycle") bewerkstelligt. Die verwendeten Chemikalien besassen

i.a. den höchstmöglichen Qualitätsgrad. Reaktionen im Bereich vom -60 °C

bis -78 °C wurden mit Aceton/Trockeneis-Gemischen als Kühlmittel durchge¬führt, solche im Bereich von 0 °C bis -20 °C mit Eis-Kochsalz-Kältemischun¬

gen.


5.2.1 "Grubbs-Katalysator" (9)

5.2.1.1 Diazobenzyl (14)

II=N—N—S—

H II0

"VJ~-CH3NaOMe

C—Triethylenglycol/60°C

C7H7N2 (119.15)

CH2N2

14

14

Tosylhydrazon (10.0 g, 36.45 mmol) wurde unter Argon vorgelegt. Es wur¬

den 30 % NaOMe in MeOH (8.60 ml, 63.95 mmol) sowie Triethylenglycol (57.6ml) zugegeben. Das MeOH wurde am Wasserstrahlvakuum bei 35 °C abde¬

stilliert. Danach erwärmte man unter Beibehaltung des Vakuums auf 60 °C

und rührte während 45 min weiter. Es entsteht eine orange Lösung, welche in

Eiswasser gegossen und mit Pentan extrahiert wurde. In der Pentanphase bil¬

dete sich ein weisser Niederschlag, den man durch vorsichtiges Abdekantie¬

ren entfernte. Das Pentan wurde bei 0-5 °C abdestilliert. Das tiefrote flüssigeProdukt 14 (2.26 g, 19.0 mmol; 52.1 %) lässt sich bei -80 °C aufbewahrten.

5.2.1.2 Bis-(tricyclohexylphosphin)-benzyliden-ruthenium-dichlorid(Grubbs-Kathalysator) (9)

pph3

Cl/'<ü -78°C

CH2N2 + Ru—PPh3CI*' | CH2CI2 CI*'

PPh3

14 15

Zwei Equivalente Diazobenzyl (14) (0.795 g, 6.67 mmol) wurden in CH2C12 (2ml) vorgelegt. Die Lösung wurde bis zur Verwendung bei -78 °C aufbewahrt.

Danach wurde RuCl2(PPh3)3 (15) (3.20 g, 3.34 mmol) in einen Rundkolben (100ml) mit einem Schlenk-Ventil und zwei Schliffen mit Septen unter Ar vorgelegt,über eine Kanüle entgastes CH2C12 (30 ml) zugegeben und auf -78 °C abge¬kühlt. Wiederum durch eine Kanüle gab man die Diazobenzyl-Lösung zu und

rührte für 5 min weiter. Es war eine N2-Entwicklung zu beobachten und die

Lösung verfärbte sich grünlich. Tricyclohexylphosphin, PCy3 (2.10 g, 7.49

mmol) wurde in einem Schlenkgefäss unter Ar vorgelegt und in entgastem

CH2C12 (20 ml) gelöst. Diese Lösung wurde über eine Kanüle in die Reaktions¬

lösung transferiert, welche sich darauf violett-bräunlich verfärbte. Danach

wurde die Kühlung entfernt, man Hess auf RT aufwärmen und rührte 30 min

weiter. Die Reaktionslösung wurde dann wiederum über eine Kanüle in ein

Schlenkgefäss mit Glasfritte, über welcher eine Schicht Silicagel lag, transferiert

und in einen weiteren Rundkolben mit Schlenkventil und zwei Schliffen mit


Septen filtriert. Die Glasfritte und das Silicagel wurden noch einmal mit entga¬stem CH2C12(5-10 ml) gewaschen und das LM vom Durchlauf abdestilliert

(Hochvakuum, Vorstoss mit flüssigem N2 gekühlt). Es blieb eine bräunlich¬

violette pappige Masse zurück, welche in entgastem MeOH (200 ml) aufge¬schlämmt und dieses dann mittels Kanülen-Filtration wieder abgetrenntwurde. Dieser Waschvorgang wurde wiederholt, bis das abdestillierte MeOH

nicht mehr bräunlich war. Zum Schluss wurde noch einmal mit entgastemAceton (200 ml) gewaschen. Der zurückbleibende violette Feststoff 9 (1.46 g,1.77 mmol; 53.2 %) wurde im HV getrocknet.

^-NMR:C43H72Cl2P2Ru (822.97)

(300 MHz, CDC13): S = 20.05 (s, 1H; Ru=CH); 8.45 (d, 2 H;

Ji = 7.6 Hz, J2 = 1.0 Hz; Hortho[Benzyl]); 7.55 (t, 1H;

Ji = 7.6 Hz, J2 = 1.0 Hz; Hpara[Benzyl]); 7.31 (t, 2H;

]1 = 7.6 Hz, J2 = 1.0 Hz; Hmeta[Benzyl]); 2.72-2.53; 1.87-1.65;

1.65-1.34; 1.34-1.08 (m, 66H; PCy3).

5.2.2 Metathese mit einzelnen Olefinen (19)

18b-18u

18a

CH2CI2/45 -C/6h

Gasphase

19bb-19uu

In einem Schlenkgefäss wurde das auszutestende Olefin (18b - 18u)

(1.51mmol), zusammen mit Allylbenzol (18a) (0.2 ml, 1.51 mmol) in CH2C12 (3ml) unter Ar gelöst und entgast. Danach wurden die Reagenzien durch eine

Kanüle in ein zweites Schlenkgefäss mit Rückflusskühler transferiert, welches

den Katalysator 9 (12 mg, 0.0146 mmol; ca. 1 mol%) enthielt. Danach wurde

bei 45 - 50 °C während 3 h gerührt und dann dieselbe Prozedur wiederholt:

Entgasen der Reaktionslösung, Transfer in neues Schlenkgefäss mit Rück¬

flusskühler, Katalysator 9 (12 mg); weitere 3 h bei 45 - 50 °C rühren. Insge¬samt wurden die Olefine somit mit ca. 2 mol% Katalysator bei 45 - 50 °C wäh¬

rend total 6 h behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Silicagel abfil¬

triert (ca. 2 g) und dieses mit 3-4 ml CH2C12 gewaschen. Die Reaktionskon¬

trolle, Quantifizierung und Charakterisierung der Produkte erfolgte durch

Analyse des unaufgearbeiteten Reaktionsgemisches durch GC-MS. Als inter¬

ner Standard wurde Biphenyl verwendet. 4-Methyl-penten (18b), 1-Hepten(18c), Methyl-3-butenoat (18h) und Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i) wurden

unter denselben Bedingungen, jedoch ohne Allylbenzol, ausgetestet.


Metathese mit Allylbenzol (18a):

19aa C16H16 (208.30)*H-NMR: (300 MHz, CDC13): S = 7.50-7.34 (m, ÎOH, HAr); 5.92-5.84

(m, 2H; -CH=); 3.69-3.54 (m, 4H; CH2).MS (GC-MS, EI+): RT: 18.08 min/18.18 min (cis/trans)

209 ([M+l)]+, 1.90 %); 208 (M+, 11.1 %); 117 ([M-91]+,100 %); 116 ([M-92]+, 6.20 %); 115 ([M-93]+, 17.9 %);

104 ([M-104]+, 15.3 %); 91 ([M-117]+, 29.0 %).

18a C9H10 (118.18)

RT: 6.27 min

118 (M+, 79.4 %); 117 ([M-l]+, 100%,); 91 ([M-27]+, 39.0 %);

78([M-40]+,7.06%).

Metathese mit 4-Methyl-penten (18b):

19bb C10H20 (140.27):H-NMR: (300 MHz, CDC13): 8 = 5.43-5.36 (m, 2H; -CH=, cis/trans);

1.96-1.87 (m, 4H; CH2); 1.70-1.54 (m, 2H; CH);

0.9(d/12H;J = 8.1;CH3).MS (GC-MS, EI+): RT: 5.32 min

140 (M+, 14.2 %); 97 ([M-43]+, 6.33%).18b C6H12 (84.16)

RT: unter 3 min

Metathese mit 1-Hepten (18c):

19cc C12H24 (168.32)^-NMR: (300 MHz, CDC13): 5 = 5.42-5.30 (m, 2H; -CH=); 2.1-1.9 (m,

4H; CH2); 1.52-1.15 (m, 12H; CH2); 0.9 (s, 6H; CH3).MS (GC-MS, EI+): RT: 8.43 min

168 (M+, 100 %); 167 ([M-l]+, 45.7 %); 166 ([M-2]+,31.9 %); 139 ([M-29]+, 9.96 %); 125 ([M-43]+, 17.4 %);111 ([M-57]+, 37.5 %); 97 ([M-71]+, 37.6 %);

18c C7H14 (98.19)

RT: unter 3 min

Metathese mit Allylcyclopentan (18d) und Allylbenzol (18a):

19dd C14H24 (192.34)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.00 min

192 (M+, 19.1 %); 149 ([M-43]+, 8.82 %); 135 ([M-157]+,100 %). 122 ([M-70]+, 13.2 %); 95 ([M-97]+, 39.7 %).


19ad C15H20 (200.32)MS (GC-MS, EI+): RT: 16.39 min

200 (M+, 16.6 %); 157 ([M-43]+, 3.45 %); 131 ([M-69]+,15.2 %); 118 ([M-82]+, 36.6 %); 104 ([M-96]+, 100 %).

18d C8H14 (110.20)

RT: unter 3 min

Metathese mit Vinylnaphthalin (18e) und Allylbenzol (18a):

19ee C22H16 (280.37): nicht detektiert

19ae C19H16 (244.35)MS (GC-MS, EI+): RT: 24.32 min

244 (M+, 100 %); 229 ([M-15]+, 31.0 %); 215 ([M-29]+,9.66 %); 167 ([M-75]+, 29.7 %); 154 ([M-90]+, 35.2%).

18e C12H10 (154.21)

RT: 14.33 min

154 (M+, 90.3 %); 153 ([M-l]+, 100 %);128 ([M-26]+, 8.05 %).

Metathese mit Allylphenylsulfon (18f) und Allylbenzol (18a):

19ff C16H1604S2 (336.43): nicht detektiert

19af C16H1602S (272.37)MS (GC-MS, EI+): RT: 24.10 min-25.00 min

273 ([M+l]+, 4.36 %); 245 ([M-27]+, 1.56 %); 145 ([M-127]+,3.74 %); 130 ([M-142]+, 100 %); 116 ([M-156]+, 17.4 %);104 ([M-168]+, 23.1 %).

18f C9H10O2S (182.24)

RT: 17.31 min

183 ([M+l]+, 10.3 %); 166 ([M-16]+, 4.95 %); 141 ([M-41]+,26.2 %); 117 ([M-65]+, 77.9 %); 91 ([M-91]+/M2+, 11.7 %);77 ([M-105]+, 100 %).

Metathese mit Allylbutyrat (18g) und Allylbenzol (18a):

18gg C12H20O4 (228.29)MS (GC-MS, EI+): RT: 16.17 min

141 ([M-87]+, 19.2 %); 95 ([M-133]+, 5.21 %); 71 ([M-157]+,100 %).

18ag C14H1802 (218.30)MS (GC-MS, EI+): RT: 17.25 min

130 ([M-88]+, 100 %); 115 ([M-103]+, 28.3 %);91 ([M-127]+, 17.9).


18g C7H1202 (128.17)

RT: 5.20 min

129 ([M+l]+, 31.1 %); 100 ([M-28]+, 8.0 %); 71 ([M-57]+,100 %).

Metathese mit Methyl-3-butenoat (18h):

19hh C8H1204 (172.18)^-NMR: (300 MHz, CDC13): Ô = 5.80-5.63 (m, 2H; -CH=, cis/trans);

3.68 (s, 6H; CH3), 3.10 (s, 4H; CH2).MS (GC-MS, EI+) RT: 11.17 min

173 ([M+l]+, 100 %); 141 ([M-31]+, 57.4 %); 140 ([M-32]+,14.6 %); 113 ([M-59]+, 74.1 %).

18h C5H802 (100.12)

RT: unter 3 min

Metathese mit Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i):

19ii C14H2404 (256.34)^-NMR: (300 MHz, CDC13): ô = 5.55-5.45 (m, 2H; -CH=);

4.15 (q, 4H; J = 6.8; 0-CH2); 2.64-2.40 (m, 4H, CH2);2.36-2.24 (m, 2H, CH); 1.38 (t, 6H; J = 6.8; CH3);

1.24(m,6H,CH3).MS (GC-MS, EI+): RT: 16.05 min

257 ([M+l]+); 210 ([M-46]+, 3.10 %); 182 ([M-74]+, 13.4 %);165 ([M-91]+, 60.7 %); 136 ([M-120]+, 55.9 %);108 ([M-148]+, 100 %).

18i C8H1402 (142.20)

RT: 5.59 min

143 ([M+H]+; 100 %); 127 ([M-15]+, 24.5 %); 109 ([M-33]+,13.8 %).

Metathese mit l,2-Epoxy-5-hexen (18j) und Allylbenzol (18a):

19jj C10H16O2 (168.24)MS (GC-MS, EI+): RT: 13.52 mm

169 [M+l]+, Peak enthält starke Verunreinigungen an

aro-matischen Verbindungen19aj C13H160 (188.27)MS (GC-MS, EU): RT: 16.12 min

188 (M+, 4.94 %); 171 ([M-17]+, 18.3 %); 155 ([M-33]+,16.9 %); 142 ([M-46]+, 16.0 %); 130 ([M-58]+, 100 %);115 ([M-73]+, 50.7 %); 91 ([M-97]+, 66.2 %).

18j C6H10O (98.14)

RT: unter 3 min


Metathese mit AUylanisol (18k) und Allylbenzol (18a):

19kk C18H20O2 (268.33)MS (GC-MS, EI+): RT: 23.38 min/24.23 min (cis/trans)

268 (M+, 55.2 %); 227 ([M-41]+, 7.31 %); 160 ([M-108]+,38.6 %); 147 ([M-121]+, 100 %); 121 ([M-147]+, 31.7 %).

19ak C17HlgO (238.33)MS (GC-MS, EI+): RT: 21.10 min/21.50 min (cis/trans)

238 (M+, 39.3 %); 147 ([M-15]+, 100 %);130 ([M-35]+, 40.0 %).

18k C10H12O (148.20)

RT: 10.48 min

148 (M+, 100 %); 133 ([M-15]+, 7.05 %);117 ([M-31]+, 22.8 %).

Metathese mit Safrol (181) und Allylbenzol (18a):

1911 C18H1604 (296.32)MS (GC-MS, EI+): RT: 26.35 min

296 (M+, 100 %); 255 ([M-41]+, 2.77 %); 161 ([M-135]+,59.3 %); 148 ([M-148]+, 11.7 %); 131 ([M-165]+, 34.5 %).

19al C17H1602 (252.31)MS (GC-MS, EI+): RT: 22.13 min

252 (M+, 100 %); 161 ([M-91]+, 73.1 %); 148 ([M-104]+,7.10 %); 131 ([M-121]+, 44.5 %); 103 ([M-149]+, 17.6 %).

RT: 26.35 min

296 (M+, 100 %); 255 ([M-41]+, 2.77 %); 161 ([M-135]+,59.3 %); 148 ([M-148]+, 11.7 %); 131 ([M-165]+, 34.5 %).

181 C10H10O2 (162.19)

RT: 12.15 min

162 (M+, 100 %); 131 ([M-31]+, 26.9 %);104 ([M-58]+, 20.5 %).

Metathese mit 2-Allyloxybenzaldehyd (18m) und Allylbenzol (18a):

19mm C18H1604 (296.32): nicht detektiert

19am C17H1602 (252.31)MS (GC-MS, EI+): RT: 22.29 min

234 ([M-18]+, 73.1 %); 161 ([M-91]+, 7.10 %);131 ([M-121]+, 44.5 %); 115 ([M-137]+, 17.6 %);91 ([M-161]+, 17.6 %).

18m Ci0H10O2 (162.19)nicht detektiert


Metathese mit 3-Allylcyclohexanone (18n) und Allylbenzol (18a):

19nn Q6H2402 (248.37)MS (GC-MS, EI+): RT: 22.15 min

248 (M+, 11.0 %); 230 ([M-18]+, 20.7 %); 212 ([M-36]+,6.21 %); 150 ([M-98]+, 100 %); 133 ([M-115]+, 33.8 %);98 ([M-150]+, 96.6 %).

19an C16H20O (228.33)MS (GC-MS, EI+): RT: 20.21 min

228 (M+, 4.14 %); 130 ([M-98]+, 100 %);115 ([M-113]+, 5.52 %); 91 ([M-137]+, 6.89 %).

18n C9H140 (138.21)

RT: 9.42 min

138 ([M+l]+, 100 %); 123 ([M-16]+, 28.3 %); 109 ([M-30]+,49.7 %); 95 ([M-44]+, 37.2 %).

Metathese mit Allylpentafluorobenzol (18o) und Allylbenzol (18a):

19oo C16H6F10 (388.21)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.01 min/16.37 min (cis/trans)

388 (M+, 4.2 %); 221 ([M-167]+, 0.1 %);207 ([M-181]+, 100 %); 188 ([M-200]+, 22.8 %).

19ao C16HnF5 (298.26)MS (GC-MS, EI+): RT: 17.23 min

298 (M+, 5.58 %); 220 ([M-78]+, 3.40 %); 181 ([M-117]+,2.74 %); 151 ([M-147]+, 1.89 %); 117 ([M-181]+, 100 %).

18o C9H5F5 (208.13)

RT: 5.35 min

208 (M+, 100 %); 181 ([M-27]+, 23.4 %); 158 ([M-50]+,11.0 %); 139 ([M-69]+, 5.6 %).

Metathese mit 4-Fluorostyrol (18p) und Allylbenzol (18a):

19pp C14H10F2 (216.23): nicht detektiert

19ap C15H13F (212.27)MS (GC-MS, EI+): RT: 17.12 min/18.06 min (cis/trans)

212 (M+, 100 %); 197 ([M-15]+, 27.2 %); 177 ([M-35]+,6.35 %); 134 ([M-78]+, 17.2 %); 115 ([M-97]+, 13.1 %).

18p C8H7F (122.14)

RT: 5.26 min

122 (M+, 100 %); 96 ([M-26]+, 6.21 %).


Metathese mit 3- Nitrostyrol (18q) und Allylbenzol (18a):

19qq C14H10N2O4 (270.24): nicht detektiert

19aq C15H13N02 (239.27)MS (GC-MS, EI+): RT: 22.36 min

239 (M+, 30.3 %); 222 ([M-17]+, 71.0 %); 192 ([M-42]+,100 %); 178 ([M-61]+, 23.7 %); 152 ([M-87]+, 9.15 %);115 ([M-124]+, 29.7 %).

18q C8H7N02 (149.15)

RT: 12.28 min

149 (M+, 100 %); 133 ([M-16]+, 90.3 %);119 ([M-30]+, 10.7 %); 103 ([M-46]+, 41.4 %).

Metathese mit Allylbromid (18r) und Allylbenzol (18a)

19rr C4H6Br2 (213.90): nicht detektiert

19ar C10HnBr (210.02/211.10)MS (GC-MS, EI+): RT: 14.23 min

212 ([M+2]+ 2.14 %); 209 ([M-l]+, 2.00 %); 131 ([M-80]+,100 %); 115 ([M-95]+, 13.4 %); 91 ([M-119]+, 42.4 %).

18r C3H5Br (120.98)

RT: unter 3 min

Metathese mit 4-Penten-l-al (18s) und Allylbenzol (18a):

19ss C8H1202 (140.18)MS (GC-MS, EI+): RT: 10.44 min

141 ([M+l]+ 16.9 %); 123 ([M-18]+, 90.3 %); 105 ([M-36]+,22.8 %); 95 ([M-46]+, 100 %).

19as C12H140 (174.24)MS (GC-MS, EI+): RT: 14.35 min

175 ([M+l]+, 25.5 %); 157 ([M-17]+, 100 %); 131 ([M-43]+,51.8 %); 129 ([M-45]+, 53.9 %); 91 ([M-83]+, 80.7 %).

18s C5H80 (84.12)

RT: unter 3 min

Metathese mit AUylmethylsulfide (18t) und Allylbenzol (18a):

19tt C6H12S2 (148.29)MS (GC-MS, EI+): RT: 13.47 min

149 ([M+l]+, 4.30 %); 100 ([M-48]+, 53.8 %); 86 ([M-62]+,100 %).

19at CnH14S (178.30)MS (GC-MS, Er+): RT: 10.50 min/11.46 min (cis/trans)

179 ([M+l]+, 4.81 %); 130 ([M-48]+, 100 %); 115 ([M-63]+,10.3 %); 91 ([M-121]+, 20.7 %).


18t C4H8S (88.17)

RT: unter 3 min

Metathese mit trityliertem Allylamin (18u) und AUylbenzol (18a):

19uu C42H38N2 (570.78): nicht detektiert

19au C29H27N (389.54)MS (GC-MS, EI+): RT: 39.29 min

388 ([M-l]+, 2.33 %); 243 ([M-146]+, 100 %); 228 ([M-161]+,9.31 %); 215 ([M-174]+, 5.17 %); 165 ([M-224]+, 75.9 %).

18u C22H21N (299.42)

RT: 21.00-23.00 (mehrere Peaks)300 ([M+l]+, 10.3 %); 271 ([M-28]+, 9.66 %); 243 ([M-56]+,100 %); 222 ([M-77]+, 12.4 %).

5.2.3 Olefin-Bibliotheken mittels Metathese (19)

PCy3

^ C,pCy3Ph

:CH2 45°C/6h

CH2CI2

CH2

CH2

R

18 19 17

Die Olefine (18a - 181, 18n - 18q) (total 16, je 0.50 mmol, total 8.0 mmol)wurden in einem Schlenkgefäss in CH2C12 (5 ml) gelöst, entgast und durch

eine Kanüle in ein weiteres Schlenkgefäss mit Rückflusskühler transferiert

welches den Katalysator (50 mg, 0.0608 mmol; ca. 0.75 mol%) enthielt. Wäh¬

rend 5 h wurde bei 45 - 50 °C am Rückfluss erhitzt, danach dieselbe Prozedur

wiederholt: Entgasen der Reaktionslösung, Transfer in neues Schlenkgefässmit Rückflusskühler, den Grubbs-Katalysator (100 mg, 0.116 mmol) enthal¬

tend; weitere 5 h bei 45 - 50 °C rühren. Insgesamt wurden die Olefine somit

mit ca. 2 mol% Katalysator bei 45 - 50 °C während total 10 h behandelt. Das

Reaktionsgemisch wurde über Silicagel abfiltriert (ca. 2 g) und dieses mit 3-4

ml CH2C12 gewaschen. Die Reaktionskontrolle und Charakterisierung der Bi¬

bliothek erfolgte durch Analyse des unaufgearbeiteten Reaktionsgemischesdurch GC-MS (GC: 10 °C/min, 50-250 °C; MS: EI+-mode). Bei kleineren Bi¬

bliotheken konnten sämtliche Olefine, in allerdings unterschiedlich grossen

Mengen nachgewiesen werden. Für grössere Bibliotheken begnügte man sich

mit der Identifikation von ca. 10 % der erwarteten Produkte.

5.2.3.1 Modell-Bibliothek 1

Basierend auf 5 Olefinen: Allylbenzol (18a), 4-Methylpenten (18b), 1-Hepten(18c), Methyl-3-butenoat (18h) und Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i). Die Syn¬these ist analog zu der oben beschriebenen. Es wurde je nach erwünschter


Menge an Bibliothek zwischen 0.5-10 mmol je Olefin in 5-10 ml CH2C12 ver¬

wendet. Die Menge des verwendeten Katalysators 9 betrug 1 mol%.

18b RT: unter 3 min

18c RT: unter 3 min

18c RT: unter 3 min

19bb RT: 5.35 min

18i RT: 5.59 min

18a RT: 6.27 min

19bc CnH22 (154.30)MS (GC-MS, EI+): RT: 8.24 min

154 (M+, 94.5 %); 139 ([M-15]+, 57.5 %); 126 ([M-28]+,32.9 %); 111 ([M-43]+, 61.6 %); 97 ([M-57]+, 100 %).

19bh C9H1602 (156.22)MS (GC-MS, EI+): RT: 8.57 min

157 ([M+l]+, 100 %); 125 ([M-15]+, 23.8 %);96 ([M-28]+, 11.7 %).

19cc RT: 10.27min

19ch C10H18O2 (170.25)MS (GC-MS, EI+): RT: 11.09 min

171 ([M+l]+, 100 %); 138 ([M-32]+, 33.8 %); 123 ([M-47]+,6.34 %); 109 ([M-61]+, 9.74 %); 96 ([M-74]+, 22.4 %).

19hh RT: 11.32min

19bi C12H2202 (198.30)MS (GC-MS, EI+): RT: 11.51min

199 ([M+l]+, 100 %); 173 ([M-25]+, 24.9 %); 152 ([M-46]+,25.7 %); 137 ([M-61]+, 3.98 %); 124 ([M-74]+, 26.3 %);109 ([M-74]+, 20.3 %).

19ab C13H18 (174.29)MS (GC-MS, EI+): RT: 12.30 min

174 (M+, 64.8 %); 131 ([M-43]+, 35.8 %); 117 ([M-57]+,62.4 %); 104 ([M-70]+, 100 %); 91 ([M-83]+, 44.8 %).

19ci C13H2402 (212.33)MS (GC-MS, EI+): RT: 13.42 min

213 ([M+l]+, 100 %); 167 ([M-45]+, 7.64 %); 149 ([M-63]+,7.34 %).

19hi CnH1804 (214.26)MS (GC-MS, EI+): RT: 14.05 min

215 ([M+l]+, 100 %); 182 ([M-32]+, 16.9 %); 168 ([M-46]+,40.0 %); 155 ([M-59]+, 20.2 %); 140 ([M-74]+, 73.3 %).

19ac C14H20 (188.31)MS (GC-MS, EI+): RT: 14.18min/14.38 min (cis/trans)

188 (M+, 15.5 %); 117 ([M-32]+, 35.2 %); 104 ([M-46]+,100 %).


19ah C12H1402 (190.24)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.01/15.22 min

190 (M+, 6.81 %); 130 ([M-60]+, 100 %); 115 ([M-75]+,11.4 %); 92 ([M-98]+, 19.3 %).

19ii RT: 16.16 min

19ai C15H20O2 (232.31)MS (GC-MS, EI+): RT: 16.16 min

233 ([M+l]+, 21.1 %); 215 ([M-17]+, 3.04 %); 186 ([M-46]+,18.6 %); 158 ([M-74]+, 5.21 %); 143 ([M-89]+, 4.83 %);130 ([M-102]+, 100 %); 115 ([M-117]+, 14.4 %).

19aa RT: 18.08 min/18.18 min (cis/trans)

5.2.3.2 Modell-Bibliothek 2

Basierend auf 5 Olefinen: Allylbenzol (18a), 4-Methylpenten (18b), 1-Hepten(18c), AUylanisol (18k) und Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i). Die Vorgehens¬weise und Ansätze sind analog zu den oben beschriebenen. Zusätzlich zu den

oben detektierten Produkten (ohne die Verbindungen basierend auf 18 h)konnten beobachtet werden:

18k RT: 10.48 min

19bk C14H20O (204.31)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.54 min

204 (M+, 40.0 %); 161 ([M-43]+, 20.7 %); 147 ([M-57]+,100 %); 134 ([M-70]+, 69.0 %); 121 ([M-83]+, 35.9 %); 91

([M-113]+, 66.9 %).19ck C15H220 (218.34)MS (GC-MS, EI+): RT: 17.37 min

218 (M+, 25.2 %); 161 ([M-57]+, 4.83 %); 147 ([M-71]+,100 %); 134 ([M-84]+, 42.4 %); 121 ([M-97]+, 35.9 %); 108

([M-110]+, 16.5 %); 91 ([M-127]+, 44.8 %).19ik C16H2203 (262.35)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.50 min

262 (M+, 18.6 %); 216 ([M-46]+, 3.11 %); 188 ([M-74]+,23.0 %); 173 ([M-89]+, 5.86 %); 160 ([M-102]+, 100 %);147 ([M-115]+, 20.0 %).

19ak C17H180 (238.33)MS (GC-MS, EI+): RT: 20.53 min

238 (M+, 7.59 %); 147 ([M-91]+, 100 %); 130 ([M-108]+,47.2 %); 91 ([M-147]+, 37.9 %).


19kk C18H20O2 (268.36)MS (GC-MS, EI+): RT: 20.53 min

268 (M+, 13.1 %); 227 ([M-41]+, 3.00 %); 160 ([M-108]+,35.7 %); 147 ([M-121]+, 100 %); 134 ([M-134]+/M2+,13.0 %); 121 ([M-147]+, 40.8 %); 91 ([M-177]+, 33.8 %).

5.2.4 Variationen von Olefin-Bibliotheken

5.2.4.11,2-Epoxid-Bibliothek (22)

F3COOCOCF3 + H2NCONH2-H202

./=\ CH2CI2/0 °C

Hi M2

19 22

Eine Olefin-Bibliothek (gel. in CH2C12, 0.5 ml, ca. 1 mmol) wurde unter Ar

zusammen mit einem Harnstoff-Peroxid-Komplex (20 mmol, 1.88 g) und

Na2HP04 (2.47 g) in CH2C12 (10 ml) bei 0 °C vorgelegt. Danach Hess man

langsam Trifluoressigsäureanhydrid (5 mmol, 1.05g, 0.71 ml) in CH2C12(2 ml)zugetropfen, Hess auf RT erwärmen, rührte für weitere 15 min und brach die

Reaktion durch die Zugabe von ges. NaHC03-Lösung ab, welche so lange ad¬

diert wurde, bis keine Gasbildung mehr ersichtlich war. Die organische Phasewurde abgetrennt, die wässrige Phase noch zweimal mit CH2C12 extrahiert,die vereinigten organischen Phasen mit Na2S04 getrocknet und das LM ein¬

geengt. Vom Reaktionsgemisch wurde ein GC-MS aufgenommen und die

Anzahl der erkennbaren Produkte anhand der Molekülmassen bestimmt. 18

von 20 erwarteten Produkte konnten bestimmt werden.

Epoxid-Bibliothek synthetisiert aus der Modell-Bibliothek 1:

22b QH120 (100.16)MS (GC-MS, EI+): RT: 3.04 min

101 ([M+l]+, 1.72 %); 85 ([M-15]+, 100 %).22c C7H140 (114.19)MS (GC-MS, EI+): RT: 3.13 min

115 ([M+l]+, 2.66 %); 87 ([M-17]+, 26.1 %); 71 ([M-43]+,100 %).

22h C5H803 (116.12)MS (GC-MS, EI+): RT: 3.18 min

117 ([M+l]+, 16.7 %); 99 ([M-17]+, 26.4 %); 85 ([M-31]+,100 %).


22cc C12H240 (184.32)MS (GC-MS, EI+): RT: 7.22 min

184 (M+, 7.31 %); 169 ([M-15]+, 15.2 %); 141 ([M-43]+,4.28 %); 109 ([M-75]+, 13.1 %); 69 ([M-115]+, 100 %).

22bb C10H20O (156.27)MS (GC-MS, EI+): RT: 8.46 min

157 ([M+l]+, 1.03 %); 141 ([M-17]+, 24.7 %); 113 ([M-43]+,3.61 %); 95 ([M-61]+, 28.1 %); 71 ([M-85]+, 100 %).

22i C8H1403 (158.20)MS (GC-MS, EI+): RT: 9.47 min

157 ([M-l]+, 26.7 %); 109 ([M-49]+, 23.3 %); 83 ([M-75]+,100 %).

22a C9H10O (134.18)MS (GC-MS, EI+): RT: 10.26 min

134 (M+, 28.9 %); 119 ([M-15]+, 31.0 %); 105 ([M-29]+,41.0 %); 91 ([M-43]+, 100 %).

22bh C9H1603 (172.22)MS (GC-MS, EI+): RT: 11.04 min

173 ([M+l]+, 2.42 %); 157 ([M-15]+, 15.2 %);125 ([M-47]+, 3.45 %); 87 ([M-85]+, 100 %).

22bc CnH220 (170.30)MS (GC-MS, EI+): RT: 11.08 min

171 ([M+l]+, 7.81 %); 155 ([M-15]+, 28.5 %); 113 ([M-57]+,62.5 %); 95 ([M-75]+, 53.1 %); 83 ([M-87]+, 100 %).

22hh C8H1205 (188.18)MS (GC-MS, EI+): RT: 13.08 min

187 ([M-l]+, 1.87 %); 157 ([M-31]+, 2.05 %); 143 ([M-45]+,10.7 %); 129 ([M-59.]+, 3.71 %); 103 ([M-85]+, 6.74 %);87 ([M-101]+, 100 %).

22ab C13H180 (190.29)MS (GC-MS, EI+): RT: 14.46 min/15.15 min

175 ([M-15]+, 1.22 %); 161 ([M-29]+, 13.8 %); 147 ([M-43]+,17.9 %); 133 ([M-57]+, 71.7 %); 105 ([M-85]+, 79.3%);91 ([M-99]+, 100 %).

22bi C12H2203 (214.30)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.00 min

215 ([M+l]+, 1.09 %); 159 ([M-55]+, 1.72 %); 141 ([M-73]+,9.67%); 100 ([M-114]+, 100 %); 85 ([M-129]+, 14.5 %).

22ch C10H18O3 (186.25)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.06 min

187 ([M+l]+, 0.89 %); 153 ([M-33]+, 1.24 %); 125 ([M-61]+,3.45 %); 100 ([M-86]+, 100 %); 85 ([M-101]+, 12.4%).


22ah C12H1403 (206.24)MS (GC-MS, EI+): RT: 16.34 min

205 ([M-l]+, 0.42 %); 175 ([M-31]+, 14.2 %); 157 ([M-49]+,17.6 %); 133 ([M-73]+, 95.7 %); 105 ([M-101]+, 82.8 %);91 ([M-115]+, 100 %).

22ac C14H20O (204.32)MS (GC-MS, EI+): RT: 17.01 min

205 ([M+l]+, 1.41 %); 188 ([M-16]+, 6.17 %); 174 ([M-30]+,17.2 %); 146 ([M-58]+, 18.2 %); 128 ([M-76]+, 70.4 %);104 ([M-100]+, 100 %); 91 ([M-113]+, 90.3 %).

22aa Q6H160 (224.30)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.46/20.27 min

224 (M+, 1.02 %); 181 ([M-43]+, 26.2 %); 166 ([M-58]+,8.62 %); 133 ([M-91]+, 100 %); 105 ([M-109]+, 32.4 %);91 ([M-133]+, 33.8 %).

22ai C15H20O3 (248.31)MS (GC-MS, EI+): RT: 20.07 min

220 ([M-28]+, 8.47 %); 202 ([M-46]+, 60.4 %); 174 ([M-74]+,17.2 %); 145 ([M-103]+, 3.14 %); 121 ([M-127]+, 14.5 %);91 ([M-157]+, 100 %).

LC-MS (ESI+): Es wurden nicht alle mit dem GC-MS detektierten Sub¬

stanzen gefunden, dafür zusätzlich:

22ih CnH1805 (230.25)231 ([M+l]+)

Fehlend:

22ci C13H2403 (228.33)22ii C14H2405 (272.34)


5.2.4.21,2-Dibromid-Bibliothek (23)

Br. Br

Br2

CHCI3Ri R2 Ri R2

19 23

Eine Olefin-Bibliothek (gel. in CH2C12, 0.5 ml, ca. 1 mmol) wurde in CHC13(12.5 ml) gelöst und Br2 (0.104 ml, 2 mmol) gelöst in CHC13 (2 ml) langsamzugegeben. Man Hess während ca. 10 - 20 min rühren und engte dann das LM

ein. Vom Reaktionsgemisch wurde ein GC-MS aufgenommen und die Anzahl

der erkennbaren Produkte anhand der Molekülmassen bestimmt.

Dibromid-Bibliothek basierend auf der Modell-Bibliothek 2. Die angegebe¬nen Massen sind die minimale Masse (= M+) sowie die Molmasse.

23b C6H12Br2 (241.97/243.97)MS (GC-MS, EI+): RT: 9.28 min

243 ([M+l]+, 1.59 %); 165 ([(M+2)-79]+, 4.21 %);163 ([M-79]+, 4.76 %); 83 ([M-159]+, 100 %).

23c C7H14Br2 (255.99/257.99)MS (GC-MS, EI+): RT: 12.00 min

179 ([(M+2)-79]+, 1.90 %); 177 ([M-79]+, 2.07 %);135 ([M-121]+, 24.1 %); 97 ([M-159]+, 100 %).

23bc CnH22Br2 (312.05/314.10)MS (GC-MS, EI+): RT: 12.31 min

235 ([(M+2)-79]+, 7.05 %); 233 ([M-79]+, 6.95 %);195 ([(M+2)-119]+, 47.0 %); 193 ([M-119]+, 47.4 %);113 ([M-199]+, 21.1 %); 99 ([M-213]+, 100 %).

23bb C10H20Br2 (298.03/300.07)MS (GC-MS, EI+): RT: 13.45 min

221 ([(M+2)-79]+, 1.20 %); 219 ([M-79]+, 1.24 %);139 ([(M+2)-159]+, 17.2 %); 123 ([M-175]+, 3.79 %);97 ([M-201]+, 9.66 %); 83 ([M-215]+, 100 %).

23i C8H14Br202 (299.98/302.00)MS (GC-MS, EI+): RT: 14.44 min

223 ([(M+2)-79]+, 1.20 %); 221 ([M-79]+, 1.24 %);195 ([(M+2)459]+, 23.1 %); 193 ([M-159]+, 25.5 %);151 ([(M+2)-159]+, 20.4 %); 149 ([M-175]+, 18.6 %);113 ([M-187]+, 100 %).

23a C9H04Br2 (275.95/277.98)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.03 min

199 ([(M+2)-79]+, 63.0 %); 197 ([M-79]+, 64.1 %);171 ([(M+2)-107]+, 9.70 %); 169 ([M-107]+, 9.66 %);117 ([M-159]+, 100 %).


23k C10H12Br2O (305.97/308.01)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.30 min

214 ([(M+2)-79]+, 93.1 %); 212 ([M-79]+, 100 %);199 ([(M+2)-107]+, 35.6 %); 197 ([M-107]+, 37.2 %);171 ([(M+2)-107]+, 14.2 %); 169 ([M-107]+, 14.5 %);133 ([M-159]+, 82.8 %); 118 ([M-159]+, 23.4 %).

23cc C12H24Br2 (326.06/328.13)MS (GC-MS, EI+): RT: 16.10 min

249 ([(M+2)-79]+, 9.61 %); 247 ([M-79]+, 8.94 %); 167 ([M-

159]+, 13.0 %); 111 ([M-215]+, 100 %);97 ([M-229]+, 87.8 %).

23ab C13H18Br2 (332.02/334.09)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.00 min

334 ([M+2]+, 1.52 %); 332 (M+, 0.34 %); 173 ([M-159]+,51.7 %); 131 ([M-201]+, 23.4 %); 117 ([M-215]+, 100 %).

23ci C13H24Br202 (370.05/372.14)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.30 min

293 ([(M+2)-79]+, 5.34 %); 291 ([M-79]+, 5.52 %);263 ([(M+2)-109]+, 11.4 %); 261 ([M-109]+, 10.3 %);211 ([M-159]+, 26.2 %); 181 ([M-189]+, 49.7 %);153 ([M-217]+, 100 %); 135 ([M-235]+, 52.8 %).

23bi C12H22Br202 (356.04/358.11)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.51min

358 ([M+2]+, 3.31 %); 356 (M+, 3.79 %); 284 ([(M+2)-

74]+, 24.4%); 282 ([M-74]+, 22.6%); 263 ([(M+2)-

95]+, 6.78 %); 261 ([M-95]+, 6.89 %); 203 ([M-153]+,86.9 %); 153 ([M-203]+, 100 %).

23ac C14H20Br2 (346.03/348.12)MS (GC-MS, EI+): RT: 20.40 min

269 ([(M+2)-79]+, 1.51 %); 267 ([M-79]+, 2.07 %); 187

([M-159]+, 31.0 %); 131 ([M-215]+, 63.4 %); 117 ([M-229]+,100 %).

23ck C15H22Br20 (376.04/378.14)MS (GC-MS, EI+): RT: 21.00 min

298 ([(M+2)-80]+, 23.4 %); 296 ([M-80]+, 22.8 %);214 ([(M+2)-164]+, 24.1 %); 212 ([M-164]+, 24.9 %);160 ([M-216]+, 9.22 %); 147 ([M-230]+, 100 %).

23bk C14H20Br2O (362.08/364.12)MS (GC-MS, EI+): RT: 21.22 min

364 ([M+2]+, 17.9 %); 362 (M+, 8.61 %); 307 ([(M+2)-

57]+, 5.17 %); 305 ([M-57]+, 3.38 %); 215 ([(M+2)-

149]+, 69.8 %); 213 ([M-149]+, 70.3 %); 203 ([M-159]+,11.7 %); 134 ([M-228]+, 100 %).


23aa Q6H16Br2 (366.00/368.11)MS (GC-MS, EI+): RT: 23.10 min

368 ([M+2]+, 4.26 %); 366 (M+, 3.18 %); 207 ([M-159]+,100 %); 129 ([M-237]+, 62.8 %); 117 ([M-249]+, 51.1 %).

23ak Cl7H18Br20 (396.01/398.13)MS (GC-MS, EI+): RT: 24.11 min

318 ([(M+2)-80]+, 18.9 %); 316 ([M+-80], 22.7 %); 238

([M-159]+,2.76 %); 146 ([M-250]+, 100 %).23ii C14H24Br204 (414.04/416.15)MS (GC-MS, EI+): RT: 25.35 min

416 ([M+2]+, 0.05 %); 414 (M+, 0.04 %); 388 ([(M+2)-28]+,21.4 %); 386 ([M-28]+, 24.9 %); 294 ([(M+2)-122]+, 38.1 %);292 ([M-122]+, 38.3 %); 214 ([(M+2)-200]+, 100 %);212 ([M-200]+, 99.2 %).

23ai C15H20Br2O2 (390.02/392.13)MS (GC-MS, EI+): RT: 27.39 min

392 ([M+2]+, 42.1 %); 390 (M+, 24.1 %); 313 ([(M+2)-79]+, 14.2 %); 311 ([M-79]+, 13.8 %); 267 ([(M+2)-125]+,19.2 %); 265 ([M-125]+, 19.8 %); 232 ([M-158]+, 17.2 %);201 ([M-189]+, 100 %).

23ik C16H22Br203 (420.03/422.15)MS (GC-MS, EI+): RT: 38.24 min

422 ([M+2]+, 47.8 %); 420 (M+, 100 %); 407 ([(M+2)-15]+,18.6 %); 405 ([M-15]+, 11.3 %); 328 ([(M+2)-94]+, 15.2 %);326 ([M-94]+, 14.7 %).

fehlend:

23kk C18H20Br2O2 (426.02/428.16)


5.2.4.3 Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf: Addition von

Tetrazin an eine Olefin-Bibliothek (25)

5.2.4.3.1 3,6-Bis-methoxycarbonyl-l,2,4,5-tetrazin (24a)

CHMCOOEt^Äl

COONa

NH

NH

COONa

24a'"

COOH COOMe

H2SQ4 N^ "NH SOCI2/MeOH N^ "NH NOx N

I I -I I -IN^ .NH N^ ,NH NNH

COOH

24a"

NH

COOMe

24a1

COOMe

N

IIN

COOMe

24a

NaOH (5.25 g) wurde in H20 (7.9 ml) gelöst und Diazoessigsäureethylester(3.03 ml, 28.8 mmol) gel. in CH2C12 zur noch warmen Lösung zugegeben.Nach 15 min Rühren entstand ein bräunlich-gelber Schlamm. Man gab EtOH

(ca. 20 ml) zu und rührte während 1 h bei 90 °C. Es konnte dabei eine Ga¬

sentwicklung beobachtet werden, die entweder von einer Zersetzungsreak¬tion herrührte oder nichts anderes als das Verdampfen von CH2C12 war. Da¬

nach wurde das Bisdiazoessigsäure-Dinatriumsalz (24a'") abfiltriert und über

Nacht luftgetrocknet.

Die Hydrolyse erfolgte durch Zugabe von verdünnter H2S04 (6 ml H2S04in 13 g Wasser auf -20 °C abgekühlt). Es ist eine Gasentwicklung beobachten;

vermutlich C02, welche von einer Zersetzung herrührt. Die orange, klebrigeBisdiazoessigsäure (24a") fällt als NS aus, wurde abfiltriert und im HV ge¬trocknet. Die Säure besitzt einen HAc-ähnlichen Geruch. Die Mutterlaugewurde über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Dabei bildete sich ein NS an

weissen Kristallen bei welchem es sich ebenfalls um Bisdiazoessigsäure han¬

delte. Die Ausbeute an 24a" betrug 686 mg (3.99 mmol, 27.6 %).

In einem nächsten Schritt erfolgte die Methylierung der Bisdiazoessigsäure(24a") zum Methylester. Dafür wurden SOCl2 (0.18 ml) bei -68 °C in MeOH

(1.3 ml, wasserfrei) gelöst. Die Bisdiazoessigsäure (200 mg, 1.16 mmol) wurde

in MeOH (1.4 ml, wasserfrei) aufgeschlämmt zugegeben und die Reaktion auf

RT aufgewärmt. Nach 1 h rühren (RT) erwärmte man auf 45 °C und rührte

während weiteren 2 h. Das Produkt (24a') fiel in Form von orange-roten Kri¬

stalle aus und wurde abfiltriert. Die Mutterlauge wurde wiederum über

Nacht im Kühlschrank aufbewahrt, wobei noch einmal etwas Bisdiazoessig-säuredimethylester ausfiel. Die Ausbeute an 24a' betrug 93.4 mg (0.467 mmol,40.2 %).

Bisdiazoessigsäuredimethylester (24a') (80 mg, 0.4 mmol) wurde in CH2C12(1 ml) unter Ar vorgelegt und auf -68 °C abgekühlt. In einem anderen Kolben

mit Septum legte man As203 (0.5 g) und HN03 (90 %, 2 ml) vor und erzeugteunter Erhitzung nitrose Gase. Diese wurden über eine Kanüle in die Reakti¬

onslösung eingeleitet, welche sich sofort tiefrot verfärbte (Vorsicht: Über¬

druck; Kanüle verstopft sehr schnell). Nach kurzer Zeit wurde die Reaktion

abgebrochen, die Lösung filtriert und die Mutterlauge eingeengt. Es entstehen


karminrote, "schlammige" 3,6-Bis-methoxycarbonyl-l,2,4,5-tetrazin-Kristalle(24a). Die Ausbeute betrug 51 mg (0.26 mmol, 64 %). Zur Aufbewahrungwurden die Kristalle in CH2C12 mit einer Konz. von 10 mg /ml gelöst.

Die hier beschriebene Synthese ist aus unerklärlichen Gründen nicht im¬

mer reproduzierbar.

24a C4H6N404 (198.14)XH-NMR: (300 MHz, D20): ô = 3.78 (s, 3H; CH3); 3.75 (s, 3H; CH3).MS (GC-MS, EI+): RT: 29.16 min

180 ([M-18]+, 1.21 %); 167 ([M-31]+, 78.9 %); 149 ([M-49]+,100 %).

5.2.4.3.2 Reaktion von 3,6-Bis-methoxycarbonyl-l,2,4,5-tetrazin mit Allylben¬zol

N—N

MeOOC f y COOMe HN—N

N=N MeOOC <( y COOMe

24a *-^ (

/=\ + N2CH2CI2/RT

N ' N

25a

18a

Die Tetrazinlösung (24a) (20 mg, 0.101 mmol) wurde unter Ar vorgelegt,Allylbenzol zugegeben (13 /xl, 0.101 mmol) und während 15 min bei RT ge¬rührt. Die rote Lösung verfärbte sich gelblich und es war eine Gasentwick¬

lung (N2) zu beobachten. Das LM wurde am Rotavap eingeengt und ein GC-

MS zur Produkteverifikation durchgeführt.

25a C15H16N204 (288.30)MS (GC-MS, EI+): RT: 23.16 min

289 ([M+l]+, 1.21 %); 197 ([M-91]+, 100 %); 183 ([M-106]+,12.9 %); 165 ([M-124]+, 20.3 %).


5.2.4.3.3 Reaktion von 3,6-Bis-methoxycarbonyl-l,2,4,5-tetrazin mit einer Ole¬

fin-Bibliothek: 1,4-Dihydropyridazine (25)

24a

19

HN—N

N—N MeOOC

MeOOC P J COOMe

N=N

+

R2

CH2CI2/RT

MeOOC

Die Tetrazinlösung (24a) (10 mg, 0.051 mmol) wurde unter Ar vorgelegtund soviel von einer Olefin-Bibliothek mit 20 verschiedenen Olefinen, gelöstin CH2C12, in kleinen Portionen zugegeben, bis sich die Lösung nicht mehr

entfärbte. Danach wurde für weitere 2 h bei RT gerührt, das LM eingeengtund die Produkte in MeOH/EtOAc (1:1, 1 ml) aufgenommen. Die Analysedieser Lösung wurde mit einem LC-MS vorgenommen. Es konnten sämtliche

(ausser einem) erwarteten Produkte in allerdings unterschiedlich grossen

Mengen nachgewiesen werden. Vielfach war auch das vollaromatische Pro¬

dukt zu beobachten, welches 2 Wasserstoffatome weniger im Tetrazin-Ringbesitzt. Diese Verbindungen entstehen wahrscheinlich im GC-MS wegen den

dort herrschenden hohen Temperaturen.

Reaktion der Olefin-Modellbibliothek 2 mit 3,6-Bis-methoxycarbonyl-1,2,4,5-tetrazin (24a).

25b

MS (LC-MS, ESI+):

25c

MS (LC-MS, ESI+):

25a

MS (LC-MS, ESI+):

25bb

MS (LC-MS, ESI+):25i

MS (LC-MS, ESI+):

25k

MS (LC-MS, ESI+):

25bk

MS (LC-MS, ESI+):

C12H18N204 (254.28)255 (M+l)+, 58.9 %

253 (M-l)+, 65.4 %

C13H20N2O4 (268.31)269 (M+l)+, 59.7 %

267 (M-l)+, 100 %

C15H16N204 (288.30)289 (M+l), 27.6 %

287 (M-l)+, 75.8 %

C16H26N204 (310.39)311 (M+l)+, 57.1 %

C14H20N2O3 (312.32)313 (M+l)+, 10.7 %

311 (M-l)+, 57.1 %

C16H18N205 (318.32)319 (M+l)+, 45.0 %

317 (M-l)+, 25.8 %

C17H28N204 (324.42)325 (M+l)+, 37.3 %

5. Experimenteller Teil

25cc

MS (LC-MS, ESI+):

25ab

MS (LC-MS, ESI+):

25ac

MS (LC-MS, ESI+):

25bi

MS (LC-MS, ESI+):

25bk

MS (LC-MS, ESI+):25aa

MS (LC-MS, ESI+):25ci

MS (LC-MS, ESI+):25ck

MS (LC-MS, ESI+):25ai

MS (LC-MS, ESI+):

25ak

MS (LC-MS, ESI+):

25ii

MS (LC-MS, ESI+):25ik

MS (LC-MS, ESI+):25kk

MS (LC-MS, ESI+):

nicht detektiert:

C18H30N2O4 (338.44)339 (M+l)+, 36.3 %

337 (M-l)+, 14.8 %

C19H24N204 (344.41)345 (M+l)+, 6.84 %

343 (M-l)+, 7.14 %

C20H26N2O4 (358.43)359 (M+l)+, 15.1 %

357 (M-l)+, 18.3 %

C18H28N206 (368.42)369 (M+l)+, 8.98 %

367 (M-l)+, 5.17 %

C20H26N2O5 (374.43)375 (M+l)+, 1.26 %

C22H22N202 (378.42)377 (M-l)+, 4.04 %

C19H30N2O6 (382.45)383 (M+l)+, 14.2 %

C21H28N205 (388.46)389 (M+l)+, 19.2 %

C21H26N206 (402.43)403 (M+l)+, 2.38 %

401 (M-l)+, 1.99 %

C23H24N205 (408.26)409 (M+l)+, 3.60 %

407 (M-l)+, 5.03 %

C20H30N2O8 (426.46)427 (M+l)+, 1.26 %

C22H28N207 (432.47)433 (M+l)+, 3.21%

C24H26N206 (438.38)441 (M+2)+, 2.26 %

439 M+, 2.26 %

25ii C20H30N2O8 (426.47)


5.2.4.4 Umwandlung von Estern in Hydrazide (20) und Urethane (21); Cur¬tius Abbau

u u u

[I H2NNH2-H20 IJ Amylnitrit IIRi-^^-ORî MeOH/80 °C R,""^NHNH2 BOH-HCI/50 °C Rl^N--~^-OEt

n

19 20 21

Eine kleine Olefin-Bibliothek (synthetisiert aus Allylbenzol (18a), 4-Methyl¬penten (18b) und Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i); gelöst in CH2C12, 0.5 ml, ca.

1 mmol) mit total 9 verschiedenen Verbindungen, davon 4 Estern, wurde in

MeOH (2 ml) gelöst und Hydrazin-H20 (2.5 ml) zugegeben. Es wurde auf 80

°C erwärmt, während 2.5 h am Rückfluss erhitzt und danach das LM einge¬engt. Von diesem Reaktionsgemisch wurde ein GC-MS aufgenommen. Es wa¬

ren alle erwarteten Hydrazide (20) vorhanden, der Umsatz war teilweise je¬doch unvollständig.

Ein Teil der rohen Hydrazid-Bibliothek (1 ml) wurde weiterverwendet und

einer mit HCl ges. EtOH-Lsg (0.5 g HCl in 5 ml EtOH) zugegeben. Durch die

Zugabe von Amylnitrit (1.5 ml) wurde die Umlagerung ausgelöst. Anschlies¬

send wurde während 24 h bei 50 °C witergerührt. Die Rohbibliothek wurde

am Rotavap eingeengt um die Salzsäure und das Amylnitrit zu entfernen. Zur

Analyse wurde ein GC-MS durchgeführt, welches zeigte, dass zwar sämtliche

der erwarteten Urethane (21) vorhanden waren, dass sich aber ebenfalls eine

grosse Anzahl von Nebenprodukten gebildet hatte. Dies Hess die Nützlichkeit

der Curtius-Umlagerung in Bezug zur Erweiterung der "Structural diversity"von Olefin-Bibliotheken fraglich erscheinen und man entschied sich für die

zweitbeste Lösung um dieses Ziel zu erreichen; nämlich für die Verwendungder Hydrazide anstelle der als Urethane vorliegenden Amine.

20i C6H12N20 (128.17)MS (GC-MS, EI+): RT: 10.31 min

129 ([M+l]+, 100 %).20bi C10H20N2O (184.30)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.26 min

185 ([M+l]+, 100 %); 169 ([M-15]+, 9.02 %); 153 ([M-31]+,24.1 %); 127 ([M-57]+, 10.1 %).

20ii C10H10N4O2 (228.29)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.42 min

228 (M+, 4.74 %); 212 ([M-16]+, 2.29 %); 197 ([M-31]+,32.6 %); 165 ([M-63]+, 100 %); 137 ([M-91]+, 20.2 %).


20ai C13H18N20 (218.30)MS (GC-MS, EI+): RT: 20.22 min

219 ([M+l]+, 100 %); 201 ([M-17]+, 7.75 %); 187 ([M-31]+,37.9 %); 159 ([M-59]+, 23.1 %); 145 ([M-73]+, 7.26 %);131 ([M-87]+, 18.2 %); 117 ([M-101]+, 25.8 %);91 ([M-127]+, 21.6 %).

Urethan-Bibliothek:

21i C8H15N 02 (157.21)MS (GC-MS, EI+): RT: 7.45 min

159 ([M+2]+, 22.1 %); 159 (M+, 12.1 %); 129 ([M-28]+,3.19 %); 101 ([M-56]+, 20.3 %); 71 ([M-86]+, 100 %).

21bi C12H23N 02 (213.32)MS (GC-MS, EI+): RT: 14.46 min

214 ([M+l]+, 90.3 %); 198 ([M-15]+, 6.21 %); 168 ([M-45]+,29.1 %); 116 ([M-97]+, 100 %).

21ai C15H21N 02 (247.34)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.22 min

248 ([M+l]+, 100 %); 230 ([M-17]+, 5.48 %); 202 ([M-45]+,41.9 %); 176 ([M-71]+, 7.94 %); 159 ([M-88]+, 30.8 %);145 ([M-102]+, 11.2 %); 129 ([M-118]+, 5.29 %);116 ([M-131]+, 66.6 %); 91 ([M-156]+, 17.5 %).

21ii C14H26N204 (286.37)MS (GC-MS, EI+): RT: 20.42 min

286 ([M+l]+, 3.18 %); 269 ([M-17]+, 10.8 %); 241 ([M-45]+,25.2 %); 213 ([M-73]+, 4.59 %); 195 ([M-91]+, 12.8 %); 169

([M-117]+, 7.26 %); 152 ([M-134]+, 100 %); 126 ([M-160]+,27.9 %).


5.2.5 1,2-Diol-Bibliotheken (27)

5.2.5.1 cis-l,2-Diol-Bibliotheken (27), "Sharpless-Dihydroxylierung"

HO OH

K2Os02(OH)4, (DHQD)2PHAL/ (DHQ)2PHAL;> \ /K3Fe(CN)6/ K2C03; MeS02NH2;

*~

/ \'BuOH, H20 R-, R2

K3Fe(CN)6 (1.25 g), K2C03 (500 mg), (DHQD)2PHAL (6.0 mg),(DHQ)2PHAL (6.0 mg) - ein l:l-Gemisch aus Ad-mix-a und Ad-mix-ß ausrei¬

chend zur Dihydroxylierung von 1.25 mmol Olefinen - wurden in H20 (6 ml)und *-BuOH (6 ml) vorgelegt. MeS02NH2 (120 mg) wurde addiert, dann die

Modell-Bibliothek (gel. in CH2C12,1 ml, ca. 1 mmol) mit ihren 20 Olefinen. Die

Dihydroxylierung wurde gestartet mit K2Os02(OH)4 (2 mg). Nach 16 h rüh¬

ren bei RT wurde die Reaktion durch die Zugabe von Na2S03 (8 g) abgebro¬chen. Die Diole wurden mit EtOAc, CH2C12 extrahiert, die organischen Pha¬

sen vereinigt, das MeS02NH2 mit KOH (2 N) rückextrahiert, mit Na2S04 ge¬trocknet und die LM eingeengt am Rotavap. Da die Analyse von Diolgemi-schen im GC-MS, LC-MS und FTICR-MS aus verschiedenen Gründen nicht

praktikabel ist, mussten Diolderivate hergestellt werden und analysiert wer¬

den.

5.2.5.2 Derivatisierung von Diol-Bibliotheken

5.2.5.2.1 Glykolspaltung mit Perjodat

HO OH 0 0

\ / NalQ4 J + LJ \ THF/H20 K\ R2

Ri R2

27 28

Ein kleiner Teil der Diol-Bibliothek (27) (0.1 ml) wurde in THF (0.8 ml) ge¬löst und NaI04 (HO mg) in H20 (0.8 ml) zugegeben. Die Reaktionslösungwurde 10 min stehen gelassen, das Perjodat abfiltriert und die Rohlösung im

GC-MS analysiert. Da einige Aldehyde nicht stabil genug oder zu volatil sind,konnten nicht alle detektiert werden. Darum wurde ein Teil der Aldehydeweiterverwendet für eine Derivatisierung mit Dinitrophenylhydrazin. Dies

ermöglichte den Nachweis weiterer Aldehyhde.

r\Ri R2


Glykolspaltung einer Diol-Bibliothek synthetisiert aus der Olefin-Modell-Bi¬

bliothek 1:

28c C6H120 (100.16)MS (GC-MS, EI+): RT: 3.32min

101 ([M+l]+, 50.2 %); 99 ([M-l]+, 58.2 %); 83 ([M-17]+,71.1 %); 73 ([M-27]+, 100 %).

28h QH603 (102.09)MS (GC-MS, EI+): RT: 5.34min

103 ([M+l]+, 0.67 %); 83 ([M-15]+, 7.96 %); 71 ([M-31]+,100 %).

28a QH80 (120.15)MS (GC-MS, EF): RT: 8.10 min

121 ([M+l]+, 8.19 %); 104 ([M-16]+, 2.31 %); 91 ([M-29]+,100 %).

Fehlend:

18b C5H10O (86.13)18i C7H1203 (144.17)

Derivatisierung der Aldehyde mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin

28h' C10H10N4O6 (282.21)MS (GC-MS, EI+): 210 ([M-72]+, 100 %); 194 ([M-88]+, 3.45 %); 180 ([M-92]+,

32.4 %).28b' CnH14N404 (266.26)MS (GC-MS, EI+): 266 (M+, 0.67 %); 239 ([M-27]+, 100 %); 227 ([M-39]+,

100 %).28c' C12H16N404 (280.28)MS (GC-MS, EI+): 280 (M+, 51.6 %); 264 ([M-16]+, 4.31 %); 224 ([M-56]+,

15.3 %); 206 ([M-74]+, 80.9 %); 196 ([M-84]+, 25.1 %);177 ([M-103]+, 23.4 %); 149 ([M-131]+, 76.4 %);103 ([M-177]+, 100 %).

Nicht gefunden nach beiden Schritten: 28i


5.2.5.2.2 Acetalisierung mit Aldehyden

1HO OH 0 0 0

H l —*—- W/ \ \r3 CHCI3/65°C / \Ri R2 Hi R2

27 29

Ein kleiner Teil der Diol-Bibliothek (0.1 ml) wurde vorgelegt in CHC13 (0.5ml), dann Acetaldehyd (0.5 ml) und p-Toluolsulfonsäure (50 - 100 /ig) zuge¬

geben. Es wurde während 3 h bei 65 °C gerührt, neutralisiert mit NaOH (aq,IN), etwas mehr CHC13 zugegeben und die Phasen getrennt. Das Acetalge-misch wurde mittels GC-MS aufgetrennt und die einzelnen Acetale anhand

ihrer Molekülmassen identifiziert. Auf diese Art konnte die Anwesenheit von

etwas mehr als der Hälfte der erwarteten Diole (basierend auf der Olefin-Mo-

dellbibliothek 1) nachgewiesen werden. Bei einer anderen Diol-Bibliothek

(basierend auf der Modell-Bibliothek 2) war das Resultat besser; hier wurden

17 von 20 erwarteten Acetalen nachgewiesen.

Es wurden weitere Versuche unternommen mit anderen Aldehyden, wel¬

che allesamt fehlschlugen, dies obwohl einige von ihnen mit einem einzelnen

Diol das erwartete Produkt ergaben. Ausprobiert wurden u.a. Phenylacetal-dehyd, Furaldehyd, Phthalimidoacetaledhyd-diethylacetal, 2-Imidazol-carbo-

xaldehyd, 3,5-Dinitro-2-hydroxybenzaldehyd, Piperonal, 4-Cyanobenzalde-hyd, Pyridin-2-carboxaldehyd, Indol-3-carboxaldehyd, 2-Allyloxybenzalde¬hyd, 2,5-Dimethyl-l-phenylpyrrol-3-carboxaldehyd, 4-Trifluoromethylben-zaldehyd, 4-Carboxybenzaldehyd und 4-Formylbenzolboronat.

Folgende Acetacetale aus einer Diol-Bibliothek basierend auf der Model-Bi¬

bliothek 1 (Allylbenzol (18a), 4-Methylpenten (18b), Methyl-3-butenoat (18h),Ethyl-2-methyl-pentenoat (18i) und 1-Hepten (18c)) konnten beobachtet wer¬

den:

29b C8H1602 (144.2)MS (GC-MS, EI+): RT: 6.20 min

145 ([M+l]+, 35.2 %); 129 ([M-15]+, 44.1 %); 101 ([M-43]+,18.3 %); 83 ([M-61]+, 100 %).

29c C9H1802 (158.2)MS (GC-MS, EI+): RT: 8.52 min

159 ([M+l]+, 100 %); 143 ([M-15]+, 39.1 %); 115 ([M-43]+,23.4 %); 97 ([M-61]+, 82.8 %).


29bc C13H2602 (214.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 12.30 min

215 ([M+l]+, 18.0 %); 214 (M+, 11.1 %); 199 ([M-15]+,67.9 %); 171 ([M-43]+, 13.5 %); 157 ([M-57.]+, 12.3 %);131 ([M-83]+, 17.6 %); 113 ([M-101]+, 20.7 %);97 ([M-117]+, 100 %).

29a CnH1402 (178.2)MS (GC-MS, EI+): RT: 12.53 min

179 ([M+l]+, 10.3 %); 177 ([M-l]+, 9.66 %); 161 ([M-17]+,5.10 %); 148 ([M-30]+, 10.2 %); %); 131 ([M-47]+, 7.65 %);117 ([M-61]+, 100 %); 91 ([M-87]+, 51.4 %).

29cc C14H2802 (228.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 13.18 min

229 (M+, 31.9 %); 213 ([M-15]+, 73.1 %); 185 ([M-43]+,24.4 %); 157 ([M-71]+, 26.1 %); 125 ([M-103]+, 10.1 %);111 ([M-117]+, 73.9 %); 97 ([M-131]+, 100 %).

29ab C15H2202 (234.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 15.38/16.18 min

233 ([M-l]+, 4.62 %); 205 ([M-29]+, 4.87 %); 191 ([M-43]+,4.35 %); 174 ([M-60]+, 23.8 %); 143 ([M-91]+, 48.3 %);119 ([M-115]+, 37.2 %); 104 ([M-129]+, 100 %);91 ([M-143]+, 73.3 %).

29ii C16H2806 (316.4)MS (GC-MS, EI+): RT: 16.26 min

316 (M+, 8.34 %); 256 ([M-60]+, 9.26 %); 194 ([M-122]+,23.1 %); 174 ([M-142]+, 83.3 %); 143 ([M-173]+, 100 %).

29ac C16H2402 (248.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 17.26 min

247 ([M-l]+, 3.08 %); 219 ([M-29]+, 2.29%); 188 ([M-60]+,22.1 %); 157 ([M-91]+, 43.1 %); 119 ([M-129]+, 21.0 %);95 ([M-153]+,100 %).

29ah C14H1804 (250.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.05 min

252 ([M+2]+, 0.51 %); 192 ([M-58]+, 19.8 %); 175 ([M-75]+,13.8 %); 164 ([M-86]+, 15.5 %); 146 ([M-104]+, 16.8 %);133 ([M-135]+, 20.1 %); 104 ([M-146]+, 23.1 %);91 ([M-159]+, 100 %).

29ai C17H2404 (292.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.50 min

220 ([M-72]+, 1.74 %); 202 ([M-90]+, 13.4 %); 189

([M-103]+, 7.45 %); 173 ([M-119]+, 12.3 %); 158 ([M-134]+,12.1 %); 129 ([M-163]+, 17.5 %); 92 ([M-200]+, 100 %).


29aa C18H20O2 (268.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 20.24 min

269 ([M+l]+, 0.81 %); 239 ([M-29]+, 1.19 %); 208 ([M-60]+,5.91 %); 177 ([M-91]+, 2.21 %); 133 ([M-135]+, 100 %);117 ([M-151]+, 78.8 %); 105 ([M-163]+, 39.3 %); 91

([M-177]+, 56.3 %).

Fehlend:

29h C7H1204 (160.1)29bb C12H2402 (200.3)29i C10H18O4 (202.2)29bh CnH20O4 (216.2)29ch C12H2204 (230.3)29hh C10H16O6 (232.2)29ab C15H2202 (234.3)29bi C14H2604 (258.3)

Die folgenden Acetacetale aus einer Diol-Bibliothek basierend auf der Ole¬

fin-Modell-Bibliothek 2 konnten zusätzlich zu den oben beschriebenen (ohnedie Derivate basierend auf Methylbutenoat) nachgewiesen werden:

29bb C12H2402 (200.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 17.03 min

174 ([M-26]+, 1.04 %); 140 ([M-60]+,29.2 %); 96 ([M-104]+, 100 %).

29ab C15H2202 (234.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 18.54 min

233 ([M+-l] 1.72 %); 174 ([M-60]+, 6.90 %); 143 ([M-91]+,17.2 %); 117 ([M-117]+, 31.7 %); 104 ([M-130]+, 100 %).

29k C12H1603 (208.3)MS (GC-MS, EI+): RT: 19.25 min

208 (M+, 9.18 %); 148 ([M-60]+, 45.7 %); 121 ([M-87]+,100 %); 108 ([M-100]+, 59.3 %); 91 ([M-117]+, 32.4 %).


232 ([M-60]+, 2.09 %); 183 ([M-109]+, 12.4 %);158 ([M-134]+, 5.52 %); 130 ([M-162]+, 100 %);115 ([M-177]+, 22.1 %); 91 ([M-201]+, 51.0 %).

29bk C16H2403 (264.4)MS (GC-MS, EI+): RT: 21.54 min

264 (M+, 14.5 %); 204 ([M-60]+, 35.9 %); 149 ([M-115]+,43.1 %); 134 ([M-130]+, 28.6 %); 121 ([M-143]+, 100 %);108 ([M-156]+, 79.3 %).


29ck C17H20O3 (278.4)MS (GC-MS, EI+): RT: 24.36 min

278 (M+, 17.0 %); 218 ([M-60]+, 42.0 %); 194 ([M-84]+,17.9 %); 149 ([M-129]+, 49.0 %); 147 ([M-131]+, 49.1 %);134 ([M-144]+, 22.8 %); 121 ([M-157]+, 100 %);108 ([M-170]+, 84.3 %).


232 ([M-60]+, 2.09 %); 183 ([M-109]+, 12.4 %);158 ([M-134]+, 5.52 %); 130 ([M-162]+, 100 %);115 ([M-177]+, 22.1 %); 91 ([M-201]+, 51.0 %).

Nicht gefunden:

29bi C14H2604 (258.3)29ci C15H2804 (272.4)29ik C18H20O5 (322.4)


5.3 "RACS" (Receptor Assisted Combinatorial

Chemistry) mit RNase A

5.3.1 Messbedingungen für das FT-ICR-MS

Sämtliche, ausser den entsprechend markierten FT-ICR-MS-Messungen,wurden an der University of Florida (Prof. Dr. J. R. Eyler), an einem Gerät mit

einer Feldstärke von 4.7 T durchgeführt. Es handelt sich dabei um ein "Bruker

47e external source FT-ICR-MS" mit einem horizontal abgeschirmten, supra¬leitenden Elektromagneten (4.7 T; ID = 15 cm). Die extern produzierten Ionenwerden unter anderem über einen Hexapol in die zylindrische RF-geshimmteInifinity Analyse Zelle (170 mm ,

5-10 torr) gelenkt. Die externe "Electro-

spray source" besteht aus einer beheizten rostfreien Stahlkapillare (170 mm

lang, 500 /xm ID). Eine umfassendere Beschreibung ist in der Dissertation von

Maria Wigger zu finden (p. 173 ff)(Wigger, 1998).

Beim FT-ICR-MS verwendet im NHMFL, handelt es sich um ein Instru¬

ment mit einer Feldstärke von 9.4 T. Es wird ausführlich von Senko et

aZ.(Senko et al, 1996) beschrieben.

Die Messungen selber wurden bei einer Konzentration von 10-100 /xM,entweder in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser und i-PrOH (1 : 1 bis

4:1) durchgeführt, jeweils unter leichter Ansäuerung mit HAc (1 %) bzw. Al-

kalisierung mit NEt3 (1 %).

Vor der Messung wurde das MS jeweils mit einer Referenzsubstanz (ent¬weder PEG 400, 5'-UMP oder RNase A) eingestellt, so dass bei der nachfol¬

genden Messung nur noch eine Feineinstellung vorgenommen werden muss.

5.3.2 Entsalzung von Verbindungen

Die verwendeten Lösungsmittel und Zusätze verursachten keine diesbe¬

zügliche Probleme und wurden nicht speziell behandelt.

Die RNase A wurde mit einer PDIO-Säule entsalzt, während für die Diol-

Bibliotheken eine 24 - 48 h Prozedur mit einem "Mixed bead resin" herange¬zogen wurde. 3'-NMPs wurden nicht behandelt, da sie eine ungenügende Sta¬

bilität in Wasser aufweisen; sie wurden direkt, teilweise sogar als Natrium¬

salz verwendet.


5.3.3 Vorversuche

5.3.3.1 RNase A

Entsalzte RNase A wurde auf eine Konzentration von 5-10"5 M in H20/z-PrOH (4:1) verdünnt. Kurz vor der Messung wurde mit Essigsäure angesäu¬ert (1 %) und die Verbindung eingespritzt.

Die zweite Messungen wurde bei identischer RNase A-Konzentration in

H20//-PrOH (5:1) und 5-10"2 M NH4OAc-Lösung durchgeführt. Kurz vor der

Messung wurde mit Essigsäure angesäuert (1 %) und die Verbindung einge¬spritzt. Die Detektion wurde für positive Ionen durchgeführt.

in H20/z- PrOH (4:1) 1955.5 M7+

1711.4 M8+

1521.3 M9+

in H20/z- PrOH (4:1), 5-10"2 M NH4OAc 2738.0 M5+

2281.4 M6+

1955.3 M7+

5.3.3.2 Substratkomplex von RNase A und 5'-UMP

Es wurde eine 10"4 M RNase A- und 10"3 M 5'-UMP-Lösung in H20/i-PrOH (4:1) hergestellt, während 12 h bei RT inkubiert, danach mit HAc ange¬säuert (1%) und sofort eingespritzt.

5'-UMP 325.0 M+

(5'-UMP)2 649.1 M+

(5'-UMP)3 973.1 M+

(5'-UMP)4 1297.1 M+

(5'-UMP)5 1621.2 M+

RNase A-(5'-UMP)2-H20 1794.6 M8+

RNase A-(5'-UMP)7- [H20]5 1783.4 M8+

5.3.3.3 Substratkomplex von RNase A und Diol-Bibliothek

Es wurde eine Lösung aus 10"4 M RNase A und ca. 10~3 M Diol-Bibliothek

in H20 hergestellt und nach einer ca. 1 h Inkubationszeit direkt eingespritzt.

M8+RNase A 1711.4

RNase AH3P04 1723.5

RNase A-Diol (Mw=217.2) 1738.6

RNase A-Diol (Mw=313.3) 1750.6


5.3.4 "RACS" mit einer Diol-Bibliothek, 5'-UMP und RNase A in Borat-

Puffer

5.3.5 "RACS" mit 3'-AMP, 3'-CMP, 3'-GMP, 3'-UMP und RNase A

RNase A wurde bei einer Konzentration von 10"5 M zusammen mit 3'-

AMP, 3'-CMP, 3'-GMP und 3'-UMP je 10"3M in einem Gemisch aus H20/z-PrOH (9:1) gelöst. Der Ansatz wurde ohne Inkubationszeit mit HAc (1 %) an¬

gesäuert und sofort eingespritzt.

RNase A 1711.2

RNase A-H3P04 1723.3

RNase A-3'-GMP 1756.6

RNase A-3'-GMP-H3P04 1768.8

RNase A-3'-GMP-(H3P04)2 1781.0

RNase A-3'-GMP-3'-CMP-H3P04 1808.9

RNase A-(3'-GMP)2-H3P04 1814.2

RNase A-(H3PO4)10- H20 1831.1

RNase A 1955.3


RNase A-(H3P04)2 1983.2



RNase A-3'-GMP-(H3P04)2 2035.3


RNase A-(3'-GMP)2-H3P04 2073.0

RNase A-3'-GMP-3'-CMP-(H3P04)2 2081.3

RNase A-(H3P04)12-1.5 H20 2119.2

RNase A 2281.3


RNase A-(H3P04)2 2314.3



RNase A-3'-GMP-(H3P04)2 2374.3


RNase A-(3'-GMP)2- H3P04 2418.8

RNase A-3'-GMP-3'-CMP-(H3P04)2 2428.3

RNase A-(H3P04)12- H20 2473.5


5.3.6 "RACS" mit 3'-AMP, 3'-CMP, 3'-GMP, 3'-UMP der Diol-Bibliothek

und RNase A

RNase A wurde bei einer Konzentration von 10" M zusammen mit 3'-

AMP, 3'-CMP, 3'-GMP und 3'-UMP je 10"3 M, und mit der Diol-Bibliothek (ctot= 10~5 M) in einem Gemisch aus H20/z- PrOH (9:1) gelöst. Der Ansatz wurde

ohne Inkubationszeit mit HAc (1 %) angesäuert und sofort eingespritzt.


5.4 Synthese von "RACS"-geeigneten Linkern.

5.4.1 5,ll,17,23-Tetrakis-(2-mercaptoethyl)-25,26,27,28-tetrakis[(p-tolylsul-fonyl)oxy]-calix[4]aren (44)

5.4.1.1 25,26,27,28-Tetrakis-(allyloxy)-calix[4]aren (40)

UU

39 40

NaH (60 % in Petroleum, 332 mg) wurde vorgelegt und THF (10 ml H20-frei). zugegeben. Dieses wurde zusammen mit dem Petroleum abdestilliert, so

dass das NaH rein vorlag. Anschliessend wurde wiederum THF (20 ml H20-frei) zugegeben. Danach wurde das Calix[4]aren (200 mg, 0.472 mmol) (39)addiert, wobei eine weisse, schlammartige Masse entstand und eine starke

Gasentwicklung (H2) zu beobachten war. Daraufhin wurde Allylbromid zu¬

gegeben und für 1 h am Rückfluss (T = 70 - 72 °C) gekocht. Das THF wurde

abdestilliert, H20 und CHC13 zugegeben, der gewonnene Ether extrahiert,

über Na2S04 getrocknet und das LM abdestilliert. Das Rohprodukt Hess sich

in EtOH Umkristallisieren und wurde dann im HV getrocknet (über Nacht).Es wurden 252 mg 40 (0.432 mmol, 91.4%) in Form von weissen Kristallen iso¬

liert.

40 C40H40O4 (584.76)^-NMR: (300 MHz, CDC13): 6 = 7.2-6.0 (diverse m, 16H;

HAr, CH=); 5.3-4.9 (m, 8H; CH2=);4.4-3.0 (m, 16H; CH2C=, ArCH2Ar).


5.4.1.2 5,ll,17,23-Tetraallyl-25,26,27,28-tetrahydroxy-calix[4]aren (41)

Diethylanilin

40

25,26,27,28-Tetrakis-(allyloxy)-calix[4]aren (204 mg, 0.349 mmol) (40)wurde unter Ar in Diethylanilin (3.1 ml) vorgelegt und 3.5 h bei 190 °C am

Rückfluss erhitzt. Anschliessend wurde H20 (ca. 20 ml) zugegeben und die

Reaktion mit HCl stark sauer gestellt. Dabei fielen leicht bräunliche Kristalle

aus, welche abfiltriert, in z'-PrOH umkristallisiert und dann im HV getrocknet(über Nacht) wurden. Es konnten 153 mg Produkt 41 (0.261 mmol, 74.8 %) in

Form weisser Kristalle isoliert werden.

41

:H-NMR:C40H40O4 (584.76)

(300 MHz, CDC13): ô = 10.2 (s, 1H; OH); 6.84 (s, 8H, HAr);6.0-5.78 (m, 4H,-CH=); 5.17-5.0 (m, 8H; CH2=); 4.3-4.1;

3. 4 -3.38 (br m, 8H; ArCH2Ar); 3.22 (d, 8H; J = 7.4;

CH2-CH=CH2).


5.4.1.3 5,ll,17,23-Tetraallyl-25,26,27,28-tetrakis[(p-tolylsulfonyl)oxy]-ca-lix[4]aren (42)

41 42

5,ll,17,23-Tetraallyl-25,26,27,28-tetrahydroxy-calix[4]aren (50 mg, 0.087

mmol) (41) wurde unter Ar in THF (4.2 ml, H20-frei) vorgelegt, sowie NaH

(60 % in Petroleum, 70 mg) und dann p-Toluolsulfonsäurechlorid (167 mg,0.87 mmol) zugegeben. Der Ansatz wurde während 1.5 h am Rückfluss erhitzt

(T = 70 - 72 °C), das THF am Rotavap entfernt, das Rohprodukt in CHC13 ge¬

löst und Verunreinigungen mit H20 extrahiert. Die organischen Phasen wur¬

den mit Na2S04 getrocknet, das LM eingeengt, in z'-PrOH umkristallisiert und

im HV getrocknet (über Nacht). Es wurden 65.1 mg Produkt 42 (0.054 mmol,62.4 %) in Form von leicht bräunlichen Kristallen isoliert.

42 C68H64012S4 (1201.51)^-NMR: (300 MHz, CDC13): ô = 7.83,7.80, 7.38. 7.34 (4s [AA'BB'-

system], 16H; HAr (Ts)); 6.34 (s, 8H; HAr[calixarene]);5.8-5.6 (m, 4H; -CH=); 5.04-4.78 (m, 8H; =CH2);3.82 (d, 4 H;J = 14 Hz; ArCH2Ar); 3.0 (d, 8H; J = 5.9 Hz;

Ar-CH2-CH=); 2.47 (s, 12H; CH3); 2.40 (d, 4 H; J = 14 Hz;

ArCH2Ar).


5.4.1.4 5,ll,17,23-Tetrakis-(2-bromoethyl)-25,26,27,28-tetrakis[(p-tolylsul-fonyl)oxy]-calix[4]aren (43)

OTs OTs Ts0 Ts0 OTs OTs Ts0 Ts0

42 43

1. Ozonolyse

Es wurden Tetraallyl-calix[4]aren-tetratosylat (97.6 mg, 181/mi) (42) in

CH2C12 (7 ml) vorgelegt, MeOH (1.5 ml) zugegeben und auf -50 °C abgekühlt.Danach leitete man Ozon durch, bis die Lösung blau war (ca. 5-10 min). Dar¬

auf wurde auf Ar gewechselt und fortgefahren, bis sich die Lösung wieder

entfärbte und addierte NaBH4 (97.5 mg), worauf eine Gasentwicklung ein¬

setzte. Nach 3 h Rühren bei RT wurde der Ansatz in H20 gegossen, angesäu¬

ert, mit CHC13 extrahiert und über Na2S04 getrocknet. Das LM wurde einge¬engt und das Zwischenprodukt im HV (über Nacht) getrocknet. Es entstand

ein weisslicher Schaum. Die Analyse ergab, dass noch grosse Verunreinigun¬gen vorhanden waren, ein Problem das auch in der Literatur beschrieben ist.

Aus diesem Grunde wird darauf verzichtet eine Ausbeute anzugeben.

2. Umwandlung des Alkohols in das Bromid

Zu Triphenylphosphin, das zuvor 3h im HV getrocknet worden war, gelöstin CH3CN (2 ml) und auf 4 °C abgekühlt, wurde Br2 zugegeben. Dieser Lö¬

sung wurde der oben gewonnene Alkohol, unter Ar in CH3CN (7.5 ml) und

CHC13 (1.5 ml) gelöst, beigefügt und 2 h bei RT gerührt. Das LM wurde am

Rotavap abdestilliert, das Rohprodukt in EtOH gelöst und über Nacht bei RT

weitergerührt. Es entstand ein weisser NS welcher abfiltriert und im HV

(über Nacht) getrocknet wurde. Es wurden 39.2 mg Produkt 43 (27.3 /xM, 32.9

% über beide Stufen) isoliert. Die Analyse ergab, dass noch etwas Triphenyl¬phosphin als Verunreinigung vorlag.

43 C64H60Br4O12S4 (1469.05)XH-NMR: (300 MHz, CDC13): ô = 7.80, 7.76, 7.39. 7.34 (4s [AA'BB'-

system], 16H; HAr (Ts)); 6.40 (s, 8H; HAr[calixarene]);3.85 (d, 4 H; J = 14 Hz; ArCH2Ar); 3.35 (t, 8H;

J= 7 Hz; CH2Br); 2.78 (t, 8H; J = 7 Hz; Ar-CH2);2.49 (s, 12H; CH3); 2.48 (d, 4 H; J = 14 Hz; ArCH2Ar).


5.4.1.5 5,ll,17,23-Tetrakis-(2-mercaptoethyl)-25,26,27,28-tetrakis[(p-tolylsul-fonyl)oxy]-calix[4]aren (44)

OTs OTs Ts0 Ts° OTs OTs Ts0 Ts0

43 44

Das Bromid 43 (6 mg, 4.03 /mi) wurde zusammen mit Thioharnstoff (6.6

mg, 21 eq.) in CHC13 (0.7 ml) und EtOH (1.2 ml) vorgelegt. Danach wurde

während 5 h bei ca. 65 °C gerührt und das LM abdestilliert. Der resultierende

bräunliche Feststoff wurde unter Ar in 5 N NaOH (1 ml, entgast) gelöst. Es

wurde während 2 h bei RT weitergerührt um anschliessend auf 80-90 °C zu

erwärmen und weitere 4 h zu rühren. Die Lösung wurde dann sauergestelltund mit CHCl3/EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wur¬

den mit Na2S04 getrocknet und die LM am Rotavap entfernt. Das Produkt 44

(4 mg, 75 %) wurde im HV (über Nacht) getrocknet und analysiert. Es scheint

sich dabei um eine dimere Verbindung aus zwei Calixarenen zu handeln, die

über Disulfidbrücken verbunden sind.

44 C64H64012S8 (1281.73)^-NMR: (300 MHz, CDC13): ô = 8.0-7.6, 7.4-7.3 (m, 16H, HAr [Ts]);

6.6.5-6.3 (m, 8H; HAr[calixarene]); 4.0-3.7 (br m, 4 H;

ArCH2Ar); 2.85-2.2 (m, 32H; Ar-CH2CH2 (16H),

ArCH2Ar, (4H), CH3 (12H)); 0.89 (m, 4H; SH).MS (ESI+): Monomer: 1304 (M + Na)+; 1223 (M-SH-CH2SH+Na)+,

816 (M -3Ts)+Dimer: 1257 (M-CH2SH)2+; 1240 (M-CH2SH, -SH)2+;1223 (M-CH2SH-SH-SH)2+.


5.4.2 l,3,5-Tris-(-L-Cystein-N-formyl)-benzol (38)

COOH

COOH

37 38a

S-Tritylcystein (155 mg, 0.427 mmol) wurde unter Ar vorgelegt, in THF (8ml, H20-frei) gelöst und das Säurechlorid 37 (30 mg, 0.113 mmol) zugegeben.Danach wurde Pyridin addiert (1 ml) und bei RT während 8 h gerührt. Das

THF wurde abdestilliert, Wasser zugegeben und mit HCl (konz.) wurde sauer

gestellt. Die Amide wurden mit EtOAc extrahiert, über Na2S04 getrocknet,eingeengt, sowie im HV (über Nacht) getrocknet. Es entstand ein gelblicherSchaum (38a)

38a

XH-NMR:C75H63N309S3 (1246.54)

(300 MHz, d-DMSO): 5 = 9.22, 9.18 (s, 2H; HAr[Bz]); 8.6

(s, 1H; HAr[Bz]); 7.2-7.0 (m, br s(?), 45H; HAr[Trityl]); 4.3

(br m, 3H; CH[Cys]); 2.8 (br m, 3H; CH2[Cys]).

Es fehlen 3H welche sich unter dem H20-Peak von DMSO befinden. Nicht

sichtbar sind des weiteren die SH, NH2, COOH-Peaks

MS (FAB+): 1247 (M+, 0.01 %); 1169 ([M-78]+, 0.01 %); 1002 ([M-245]\0.01 %), 243 ([M-1004]+, 100 %).

Um die Tritylgruppe abzuspalten wurde die geschützte Verbindung 38a

unter Ar in einer CF3COOH/Triisopropylsilan-Lösung (95 : 5) gelöst und 1 h

bei RT gerührt. Das LM wurde entfernt und Et20 zugegeben. Dabei löste sich

die gebildete Tritylsilylverbindung, während das Thiol 38 als Festkörper er¬

halten blieb. Es wurde abdekantiert, der Feststoff in CH3CN : H20 gelöst und

lyophilisiert.

38

MS (EST):

MS (ESI+):

C18H21N309S3 (519.58)1557 (3x[M-H], 0.1 %), 1038 (2x[M-H]", 40 %), 519 ([M-H]",100 %), 441 ([M-79]-, 5 %),416 ([M-104]", 30 %).Nur Spuren von unidentifizierbaren Verunreinigungen.


5.5 Rekonstruktion des BS-RNase-Vorläufer-Mutanten

5.5.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden zur Einfüh¬

rung der gewünschten Mutationen

5.5.1.1. Transformation von Plasmiden in kompetente Zellen

5.5.1.1.1 Transformation von Plasmiden in kompetente Zellen durch Elektro¬

poration

Die Plasmid-DNA (10 ng) wurde elektroporations-kompetenten E. coli-

Zellen (DH5a oder CJ236; 100 ul) zugegeben, die Lösung in eine eisgekühlteElektroporations-Küvette pipettiert und die Elektroporation durchgeführt. Es

wurde sofort SOC-Medium (1 ml) zugegeben und der Transformationsansatz

während 1 h bei 37 °C inkubiert. In einem letzten Schritt wurden die Zellen

(50, 100, 200 ul) auf LB-Amp-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37

°C gezüchtet.

5.5.1.1.2 Transformation von Plasmiden in kompetente Zellen durch Hitze¬

schock

Die Plasmid-DNA (100 ng) wurde kompetenten E. coli- Zellen (BL21-(DE3)); 100 ul) zugegeben, auf Eis inkubiert (10 min) und die Hitzeschockre¬

aktion durchgeführt (45 - 50 s, 42 °C). Danach wurde kurz auf Eis inkubiert (2min), SOC-Medium (900 ul) zugegeben und der Transformationsansatz wäh¬

rend 1 h bei 37 °C inkubiert. In einem letzten Schritt wurden die Zellen (50,100, 250 ul) auf LB-Amp-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C

gezüchtet.


5.5.2 Mutagenese nach Kunkel

5.5.2.1 Herstellung und Isolierung von Uracil-Phagemiden

Die Plasmid-DNA (10 ng) wurde in den E. co/z'-Stamm CJ236 (100 ul) trans¬

formiert und die Zellen auf LB-Ampicillin (50 Ltg/ml) - Chloramphenicol (30u.g/ml) -Agarplatten ausplattiert (50, 100, 200 ul) und über Nacht bei 37 °C

gezüchtet. Danach wurden einige Kolonien auf einer weiteren LB-Ampicillin-Chloramphenicol-Agarplatte ausgestrichen und wiederum über Nacht inku¬

biert. LB-Medium (5 ml), welches Chloramphenicol (15 ug/ml) und Ampicil¬lin (50 ng/ml) enthielt, wurde mit einer Kolonie angeimpft und bei 37 °C über

Nacht inkubiert ("Übernachtkultur").

2x YT-Medium (50 ml) in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben wurde mit

Ampicillin (50 ug/ml) und Chloramphenicol (15 ug/ml) versetzt und mit der

Übernachtkultur (1 ml) angeimpft. Die Lösung wurde im Shaker bei 37 ° C bis

zu einer OD600 von 0.3 - 0.4 wachsen gelassen. Danach wurde die M13K07-

Helfer-Phage (1:100 verdünnt; 50 ul) zugegeben und bei 37 °C weitergeschüt¬telt (1 h). In einem nächsten Schritt wurde Kanamycin (70 ug/ml) Medium

zugefügt und über Nacht bei 37 °C weiterinkubiert. Von einem Teil der Kul¬

turen (30 ml) wurden die Bakterien abzentrifugiert (15 min, 8000 U/min, 7000

g, SS34 Rotor, 4 °C); der Rest wurde verworfen. Zum Überstand gab man

RNase A (150 ug) zu und Hess während 30 min bei RT inkubieren. Danach

wurde mit einer NH4OAc (3.5 M)/PEG 6000 (20 %)-Lösung (7.5 ml) versetzt

und während 2 h auf Eis inkubiert. Nach einem weiteren Zentrifugations-schritt (15 min, 8000 U/min, 7000 g, SS34 Rotor, 4 °C) wurde der Überstand

abgegossen und das Phagenpellet in HaO-Puffer (200 ul) gelöst. Die Lösungwurde in ein Eppendorfgefäss (1.5 ml) überführt und weiter auf Eis inkubiert

(30 min). Danach wurde wiederum ein Zentrifugationsschritt (2 min, 14000

U/Min, 15800 g, 4 °C) durchgeführt. Das Pellet wurde verworfen. Die Pha-

genlösung (Überstand) wurde zweimal mit ges. Phenollösung (1 Vol.), einmal

mit ges. Phenollösung/CH3C1 (je 0.5 Vol.) und zweimal mit CH3C1 (1 Vol.)behandelt (Phenolysierung). Anschliessend wurde EtOH (100 %, 2.5 Vol., -20

°C) und NH4OAc (7.8 M, 0.1 Vol.) zugegeben und die uracilenthaltende Ein-

zelstrang-Phagemid-DNA während 30 min auf Eis gefällt und danach abzen¬

trifugiert (15 min, 14000 U/min, 15800 g, 4 °C). Der Überstand wurde verwor¬

fen und das DNA-Pellet bei RT getrocknet. Zur Weiterverwendung wurde

das Pellet in H20 (14 ß\) gelöst und bei -20 °C aufbewahrt.


5.5.2.2 Mutagenese

Mit Muta Gene Phagemid In Vitro Mutagenesis Kit Version 2 von BioRad:

Die uracilenthaltende Einzelstrang-Phagemid-DNA (1 /il; 0.3 pmol, 200 ng),die phosphorylierten Oligonukleotide (je 2 /iL 8 pmol) sowie der "lOx annea¬

ling buffer" (1 /il) wurden mit H20 auf ein Endvolumen von 10 /il verdünntund für 5 min auf 80 °C erwärmt. Danach wurde die Reaktionslösung; im

Heizblock belassen, die Wärmezufuhr unterbrochen und auf 30 °C abgekühlt,was ca. 40 min dauerte. Anschliessend wurde sie auf Eis gestellt und "lOx

synthesis buffer" (1 ul) zugegeben. Nach der Zugabe von T7 DNA-Polyme-rase (1 ul; 0.5 U, 1:1 verdünnt mit "T7 DNA polymerase dilution buffer") undT4 DNA Ligase (1 ul; 3 U) wurde die Reaktionslösung zuerst während 5 min

bei 4 °C, dann für 5 min bei RT und schliesslich für ein Zeitdauer von 90 min

bei 37 °C inkubiert. Die Mutagenese wurde mit der Addition von TE (90 ul)beendet. 5 ul des Ansatzes wurden in elektrokompetente DH5oc-Zellen trans¬

formiert.

5.5.2.3 Isolierung von Plasmiden aus Bakterien-Kulturen

Mit Wizard® Plus Miniprep (DNA-Purif. Sys.) von Promega:

Einige (10-20) auf LB-Amp-Agarplatten gewachsene DH5a-Kolonien wur¬

den auf einer neuen LB-Amp-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37

°C inkubiert. Davon wurden wiederum einzelne Kolonien (10) ausgewähltund je einzeln in LB-Medium (5 ml) mit Ampicillin (50 mg/ml) angeimpft.Die verschiedenen Kulturen (10) wurden über Nacht bei 37 °C geschütteltund am nächsten morgen abzentrifugiert (5 min, 6000 U/min, 5640 g, SS34-

Rotor). Das Pellet wurde in der "Cell resuspension solution" (300 ul) resus¬

pendiert und in ein Eppendorfgefäss (1.5 ml) transferiert. Nach der Zugabeder "Cell lysis solution" (300 ul) wurde die Reaktionslösung gemischt und bei

RT inkubiert (3-5 min), danach "Neutralization solution" (600 ul) zugegebenund für weitere 10 min bei RT inkubiert. Nach einer weiteren Zentrifugation(15 min, 14000 U/min, 15800 g, 4 °C) wurde der Überstand in ein neues Ep¬pendorfgefäss (1.5 ml) gegeben; der weisse NS (lysiertes Zellmaterial) wurdeverworfen. Während dem Zentrifugieren wurde das Säulenmaterial (1 ml;Wizard® Minipreps DNA Purification Resin) in die Säule pipettiert. Der

klare, zellmaterialfreie Überstand wurde mittels Vakuumapplikation auf die

Säule aufgetragen. Die Plasmide wurden mit "Column wash solution" (2 ml)gewaschen. Man Hess die Säulen trockenlaufen und zentrifugierte kurz (2min, 10000 U/min, 8176 g, RT). Danach wurde mit sterilem Wasser (50 ul) in¬

kubiert (1 min, RT). Durch Zentrifugation (20 s, 10000 U/min, 8176 g, RT) Hes¬

sen sich die Plasmide aus der Säule in ein Eppendorfgefäss eluieren.


5.5.2.4 Charakterisierung der Plasmide

Die uracilenthaltende Einzelstrang-Phagemid-DNA wurde mittels Aga-rose-Gel und Saran-Wrap auf Qualität und Quantität untersucht. Die doppel-strängigen aus DH5a- und BL21-(DE3)-Bakterien isolierten Plasmide wurden

zusätzlich auf ihre richtige Sequenz hin untersucht, ein Service der von der

University of Florida zur Verfügung gestellt wurde. Als die verwendete Me¬

thode wird die folgende angegeben: "Automated DNA-sequencing, Perkin

Elmer/Applied Biosystems Model 373A and 377; one lane sequencing pro¬cess, four dye fluorescent labeling method, real time scanning detector"


5.5.3 Expression der Mutanten BS-RNase-TSGa und -TSG4

5.5.3.1 Expression mit pET23b+-Plasmiden in BL21-(DE3)

Vier Erlenmeyerkolben (2 1) wurden mit LB -Medium (0.6 1) gefüllt und

Ampicillin (75 ug/ml), MgS04 (2 mM) und CaCl2 (0.1 mM) zugegeben. Da¬

nach wurde mit einer BL21 Übernachtkultur (10 ml) angeimpft (aus einem

weiteren Teil (5 ml) wurden die Plasmide isoliert zwecks Kontrolle der Se¬

quenz). Bei einer OD600 von 0.7-1.3 wurde die Expressionsreaktion mit IPTG

(0.4 mM) induziert. Nach einer Inkubationsdauer von 4-5 h wurde abzentri¬

fugiert (5 min, GS3-Rotor, 5000 U/min, 6000 g, 4 °C) und das Pellet sofort in

Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA; 4-5 Vol.) resuspendiert.Falls nötig wurden die lysierten Bakterien bei -80 °C gelagert.

5.5.3.2 Proteinreinigung

5.5.3.2.1 Aufschluss der Zellen und der "Inclusion bodies", erste Reinigungs¬schritte

Die lysierten Bakterienzellen wurden in einer "French Press" (5000 psi,344.7 bar) aufgeschlossen, die "Inclusion bodies" abzentrifugiert (5 min, GS3-

Rotor, 5000 U/min, 6000 g, 4 °C) und in einem Denaturierungspuffer (6 M

Guanidiniumhydrochlorid, 0.1 M DTT, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM

PMSF; 9 Vol.) resuspendiert. Diese Lösung wurde anschliessend in HAc (20mM, 4.4 1) dialysiert (Molekulargewichtsausschlussgrenze: 3500), bis die Gu-

anidinium-HCl-Konzentration 50-100 mM betrug (10-18 h.) Der weisse Nie¬

derschlag wurde abzentrifugiert (10 min, SS34-Rotor, 6000 U/min, 5640 g, 4

°C) und verworfen, während zum Überstand Tris-OAc (1 M pH 8.0, ca. 1/50Vol.) zugegeben wurde. So erreichte man eine Protein-Endkonzentration von

ca. 1 mg/ml in 20 mM Tris-HCl. Mit NaOH (2 M) wurde der pH auf 8.0 ein¬

gestellt. Zur korrekten Faltung der Monomere gab man oxidiertes (1 mM)sowie reduziertes (10 mM) Gluthathion zu und Hess die Proteinlösung wäh¬rend zwei Tagen bei 4 °C stehen. Danach wurde mittels eines Konzentrators

von Amicon (Membran: YM3/YM10) auf einen NaOAc-Puffer (50 mM pH5.0) gewechselt und die Lösung auf ca. 3-4 ml aufkonzentriert.

5.5.3.2.2 Affinitätssäule mit pUp-Agarose

Über Nacht wurde pUp-Agarose (325 mg) in NaOAc-Puffer (50 mM pH5.0) bei 4 °C gequollen, auf eine Econo-Säule (Durchmesser: 1.5 cm, Länge: 15

cm) geladen und mit NaOAc-Puffer äquilibriert (50 mM pH 5.0; 100 ml). Die

aufkonzentrierte Proteinlösung (3-4 ml) wurde auf die pUp-Säule aufgetragenund mit NaOAc-Puffer (50 mM pH 5.0; 50 ml) gewaschen. Das Protein wurde

anschliessend durch eine Lösung mit steigender NaCl-Konzentration (0.5,1,2, 4 M) in NaOAc-Puffer (50 mM pH 5.0) eluiert. Die proteinenthaltendenFraktionen (SDS-PAGE-Gel) wurden vereinigt und durch mehrmaliges Auf-


konzentrieren in NaOAc-Puffer (50 mM pH 5.0) wurde die NaCl-Konzentra¬

tion auf unter 100 mM gesenkt. Danach erfolgt der Wechsel auf Rückfal¬

tungspuffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.8).

5.5.3.2.3 Rückfaltung zum Dimer

Der Proteinlösung (2 ml) wurde DTT (38 mg) zugegeben und 1 h bei RT

inkubiert. Anschliessend wurde die Proteinlösung auf eine mit Rückfaltungs¬puffer (30 ml) preäquilibrierte PDIO-Säule aufgeladen und mit Rückfaltungs¬puffer (3 ml) eluiert. Unter ständigem Rühren in einem nicht ganz verschlos¬

senen Falcon-Tube (02-Zufuhr) Hess man das Protein während 12 d bei 4 °C

sich in seine endgültige Dimer-Form falten.

5.5.3.2.4 Auftrennung von Monomer und Dimer

Da die Dimerisierung nicht vollständigen verläuft, müssen die dimeren

von den monomeren Proteinen abgetrennt werden. Dazu wurde vom Rück¬

faltungspuffer auf NaOAc-Puffer (50 mM pH 5.0) gewechselt, und die Pro¬

teinlösung mit einem Volumen von 3-4 ml auf eine preäquilibrierte pUp-Säule aufgetragen. Die Trennung der monomeren von den dimeren Proteinen

erfolgte durch einen NaCl-Gradienten (0.1, 0.25, 0.375, 0.5, 0.75, 1 und 2 M

NaCl in NaOAc, 50 mM pH 5.0). Die Fraktionen wurden auf einem SDS-

PAGE-Gel analysiert; die dimeren Proteine eluierten dabei bei höheren NaCl-

Konzentrationen (0.5-0.75 M) als die monomeren (0.25-0.5 M). Die dimerhalti-

gen Fraktionen wurden vereinigt, aufkonzentriert und die Proteinkonzentra¬

tion bestimmt. Aufbewahrt werden die Proteinlösungen im NaOAc-Puffer

(NaOAc 50 mM pH 5.0) bei -20 °C.

Die monomerenthaltenden Fraktionen wurden ebenfalls aufkonzentriert,der Puffer auf Rückfaltungspuffer gewechselt und die Proteine erneut zum

Dimer rückgefaltet.

Die Ausbeuten für den Mutanten BS-RNase-TSGi betrugen ca. 4.1 mg, für

den Mutanten BS-RNase-TSG4 ca. 0.9 mg.

5, Experimenteller Teil 166

5.5.4 Charakterisierung der exprimierten Mutanten BS-RNase-

TSGj und -TSG4

5.5.4.1 Konzentrationsbestimmung

Die Proteinkonzentration wurde mittels UV-Absorption (X = 280 nm) be¬

stimmt.

Protein Absorption Konz.

Literatur/Theorie :

RNase A 0.73 1 mg/mlBS-RNase 0.4657o.584+1 mg/mlMutant JSG1 0.608+ 1 mg/mlMutant TSG4 0.608+ 1 mg/ml

Gemessene Absorption und daraus berechnete Konzentration:

Mutant TSGi 0.109 (1:10 verdünnt) 1.8 mg/ml (unverdünnt)Mutant TSG4 0.23 (unverdünnt) 0.38 mg/ml

Literatur (Libonati et al, 1976)+Berechnet:Es wird angenommen, dass der Absorptionskoeffizient linear korreliert mit

der Anzahl Tyrosine:

Anzahl TyrosineA(RNase) = £(RNase A)

'

C(RNase)' d

6

mit:

A = 8 • c • d; £(RNase A)= 9800 M^cm *; d = 1 cm,

Anzahl Tyrosine: RNase A: 6

BS-RNase: 8

Mutanten TSG1/TSG4: 10

Wie anhand der BS-RNase ersichtlich ist, weicht der berechnete Wert vom

gemessenen Wert um ca. 25 % ab.


5.5.4.2 Dinukleotid-Aktivität; UpA-Kinetik

UpA (5 mg) wurde in H20 (steril, 8 ml) gelöst. Die genaue Konzentration

wurde durch die Absorptionsmessung einer 1:100 verdünnten Lösung bei ei¬

ner Wellenlänge von X - 265 nm bestimmt. Eine 5.8 /iM Lösung besitzt dabei

eine Absorption von 0.137. Daraus wurde die Konzentration der UpA-Stammlösung berechnet. Falls nötig kann die Lösung bei -20 °C gelagert wer¬den.

Die UpA-Kinetik wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen von UpA(30, 40, 50, 75 und 100 uM) und einer konstanten Menge an ADA (1 /ig/ml)durchgeführt. Die Proteine wurden kurz vor der Messung auf eine Konzen¬

tration von 5 ng/ul verdünnt und auf Eis aufbewahrt. Der UpA-Cocktail (745ul) wurde in eine Quarzküvette gegeben und equilibriert, bis die Basislinie

stabil war (3 min, 25 °C). Anschliessend wurde die verdünnte Proteinlösungzugegeben (5 ul, 25 ng), die Küvette viermal invertiert und gleichzeitig die

Zeitmessung gestartet. Die Absorption wurde bei X = 265 nm in Intervallen

von 6 s während 1.5 min aufgezeichnet. Die Messungen wurden jeweils drei¬

mal wiederholt. Aus den Werten des Intervalls von 6 s bis 36 s wurden mittels

Lineweaver-Burk-Plot die Werte für KM und kcat ermittelt.

c (UpA) [/iM] 30/iM 40/iM 50 ßA 75/iM 100/xM

NaOAc [ml](1 M, pH 5)

1 1 1 1 1

UpA [ml](580 /iM)

0.517 0.689 0.862 1.293 1.724

ADA [ml](10 mg/ml)

0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

H20 [ml] 8.482 8.310 8.137 7.706 7.275

Total [ml] 10 10 10 10 10

Tab. 5.1 Herstellungvorschlag für die Reaktionslösungen zur die UpA-Kinetik


5.5.4.3 Einzelstrang-Aktivität; Poly(U)-Kinetik

Eine Reaktionslösung bestehend aus NaOAc (10 mM pH 5.0), NaCl (150mM) und Poly(U) (20 ug/ml) wurde vorbereitet und auf Eis gelagert. Manverdünnte die Proteine auf eine Konzentration von 50 ng/ul und kühlte eben¬

falls auf Eis. Der Poly(U)-Cocktail (995 ul) wurde in einer Quarzküvette equi-libriert bis die Basislinie stabil war (3 min, 25 °C). Danach wurde die ver¬

dünnte Proteinlösung (250 ng; 5 ul) zugegeben, die Küvette viermal invertiert

und gleichzeitig die Zeitmessung gestartet. Die Absorption wurde bei X - 260

nm in Intervallen von 6 s während 1.5 min aufgezeichnet. Die Messungenwurden dreimal wiederholt. Aus den Werten des Intervalls von 6 s bis 66 s

wurde die Steigung ermittelt.

Die Einzelstrang-Aktivität (AES ) ist definiert als:

aes = AA(X = 260nm)/[x min •

y mg RNase]

für c[Poly(U)] = 20 ug/ml; T = 25 °C.

5.5.4.4 Doppelstrang-Aktivität; Poly(U)Poly(A)-Kinetik

Je 1 mg Poly(U) und Poly(A) wurden in 1 ml H20 gelöst. Je 0.5 ml wurden

gemischt und so lange bei RT inkubiert (ca. 2 h), bis die Absorption (X - 260

nm) konstant war. Daraus wurde eine Stammlösung (10 ml, mit 30 ug/mlPoly(U)-Poly(A), 10 mM Tris-HCl pH 7.3, 150 mM NaCl und 2 mM MgCl2)hergestellt und auf Eis aufbewahrt. Die Reaktionslösung (995 ul) wurde in ei¬

ner Quarzküvette equilibriert (3 min, 25 °C), mit Protein versetzt (1-3 ug/5ul), die Küvette viermal invertiert und gleichzeitig die Zeitmessung gestartet.Die Absorption wurde bei X - 260 nm in Intervallen von 30 s während 5 min

aufgezeichnet. Die Messungen wurden dreimal wiederholt.

Die Doppelstrang-Aktivität (ADS) ist definiert als:

ADS = AA(À = 260m)/[x min y mg RNase]

für c[Poly(U)-Poly(A)] = 30 ug/ml; T = 25 °C.


5.5.4.5 Schmelzkurve für Doppelstrang DNA; Poly(dA-dT) Poly(dA-dT)-Kinetik; MBNase-Assay

Poly(dA-dT)-Poly(dA-dT) (A(X = 260 nm)= 25) wurden in sterilem Wasser

gelöst und auf eine Konzentration von 1.25 mg/ml verdünnt. Zur Lagerungwurde die Lösung in Aliquots aufgeteilt und bei -20 °C aufbewahrt. Für die

Messung wurde eine DNA-Lösung von 11.3 /ig/ml in einem Reaktionspuffer(20 mM NH4OAc pH 5.0, 50/150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM Zn(OAc)2)hergestellt und bei RT equilibriert. Anschliessend wurde Mung Bean Nu¬

clease (1 U, 1 /il) zugegeben und wiederum equilibriert (dauerte jeweils nur

eine kurze Zeit). Danach wurde RNase zugegeben (14 /ig für RNase A bzw. 28

/ig für BS-RNase) und die Absorptionsänderung bei X - 260 nm in Intervallen

von 1 min während 30 min aufgenommen. Die Messungen wurden je zwei¬

mal durchgeführt bei unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen (50 mM und

150 mM).

5.5.4.6 Divinylsulfon-Assay (DVS-Assay)

Die Proteine (15 ug (ca. 1 nM pro Untreinheit) in 50 /xl 0.1 M NaOAc pH5.0) wurden mit Divinylsulfon (1 /il einer 10 % Lösung in EtOH) versetzt und

für 96 h bei 30 °C inkubiert. Dem Reaktionsansatz wurden alle 24 h Fraktio¬

nen (1.2 jag, 4 /il) entnommen. Diese wurden mit ß-Mercaptoethanol (1 /iLEndkonzentration: ca. 350 mM) versetzt, Hess für 30 min bei RT reagieren undbewahrte sie dann bei -80 °C auf. Die Fraktionen wurden anschliessend auf

einem SDS-PAGE-Gel mit "Silver staining" als Färbemethode analysiert. Der

Anteil der Überlappung wurde durch den visuellen Vergleich der Monomer¬

und der Dimer-Bande abgeschätzt.

5.5.4.7 Inhibition durch GM3

Eine Reaktionslösung (20 ml) bestehend aus UpA (25 /iM ), ADA (1 /ig/ml)in NaOAc (0.1M pH 5.0) wurde hergestellt und auf Eis kühlgestellt. Weiter

wurde eine GM3-Lösung (2 /iM) hergestellt und ebenfalls auf Eis gestellt. Die

UpA-Lösung (745 /il) wurde zusammen mit 6 /il der GM3-Lösung (Endkon¬zentration : 16 pM) in einer Quarzküvette bei RT equilibriert, bis die Absorp¬tion (X = 265 nm) konstant war. Danach wurde die verdünnte Proteinlösungzugegeben (25ng, 4 /il), die Küvette viermal invertiert und gleichzeitig die

Zeitmessung gestartet. Die Absorption wurde bei X = 265 nm in Intervallen

von 6 s während 1.5 min aufgezeichnet. Die Messungen wurden dreimal wie¬

derholt. Danach wurde dasselbe Experiment ohne Gangliosid GM3 durchge¬führt. Die Inhibition konnte aus dem Absorptionsunterschied des Intervalls 6-

66 s eruiert werden:

I [%] = (l-[AA(mitGM3)/AA(ohneGM3)]) • 100 %


6. Literaturverzeichnis

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7. Lebenslauf 181

7. Lebenslauf

Personalien

Name

Geburtsdatum

BürgerortGeburtsort

Zivilstand

Militär

AHV-Nr.

Giger, Thomas Stefan

05. Mai 1970

Sevelen, SG

Schlieren, ZH

ledigLeutnant (Art Of)PzHb Bttr 1/10395.70.236.117

Ausbildung

25.6.1999

1995-1999

1990-1994

1986-1989

1983-1986

1977-1983

Doktorprüfung (bestanden)Doktorand an der ETH Zürich, Dept. Chemie

Durchführung der Doktorarbeit an der Universityof Florida in Gainesville, FL

Leitung/Koreferent: Prof. Dr. Steven A. Benner

Referent: Prof. Dr. G. Folkers (ETHZ, Pharm)Chemie-Studium an der Universität Basel (BS);Abschluss mit Diplom für Chemie.

Durchführung der Diplomarbeit in der

Arbeitsgruppe von Prof. Dr. A. Pfaltz

Besuch des Gymnasiums (Typus C) in Liestal (BL);Abschluss mit dem MaturitätszeugnisBezirksschule in Büren (SO)Primarschule in Bischofszeil (TG), Witterswil (SO),Cheadle Hulme (Manchester, GB), Nuglar (SO)

Ausbildungs- und Industrieerfahrung

Ausbildungstätigkeiten

Industrieerfahrung

Militärdienst: Abverdienen Kpl, Lt

Studium: Leitung eines Lab-Courses in

Organischer Chemie an der Univ. of Fl.

Diverse mehrwöchige Sommerpraktika bei der

Ciba Geigy (Schweizerhalle, BL)

rights / license: research collection in copyright - non ...23243/et… · 3.1.1...

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