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RhoGTPases – Function and Regulation RhoGTPases – Function and Regulation
Thomas WielandInstitut für Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät für Klinische Medizin Mannheim
Ruprecht-Karls-
Universität
Heidelberg
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Physiological function of Rho GTPases
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Regulation of the actin cytoskeleton
Actin Vinculin Actin Vinculin
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U = TXA2-Analog
Y = Rho-Kinase Inhibitor
C3 = exoenzyme C3 transferase (C3T) from Clostridium botulinumInhibition of RhoA-C
Shape change of platelets
Klages et al. J. Cell Biol. 144 (4) 1999
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Keratinocytes
Regulation of cell-cell contacts
C3 = exoenzyme C3 transferase (C3T) from Clostridium botulinumInhibition of RhoA-C
Endothelial cellsThrombin is a strong activator of RhoA
Cadherine
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Regulation of proliferation
Neointima formation after vascular injury of a carotid artery
Y27632 = Rho Kinase Inhibitor
Shibata et al. Circulation 103(2) 2001
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Cardiac specific overexpression of RhoA in the heart
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Posttranslational modification of RhoGTPases
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Statins
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Beneficial pleiotropic effects of statins
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Activation cycle of RhoGTPases
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Rho-specific guanine nucleotide exchange factors
DH PH
Catalytic activity~200 aa
Membrane localization ?
Variable specifity for RhoGTPases
Multidomain proteins
Variable size (~ 60 to 800kd)
Variable expression patterns (ubiquitiniously to specific)
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Model of PH domain assisted GEF activity
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RhoGEFs: The Dbl family
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Regulation of RhoGEFs - Autoinhibition
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Regulation of RhoGEFs – Protein-Protein-Interaction
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Cellular Localization of RhoGEFs
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b
Experimental approaches
directpull down assay
Rac1Cdc42 Rho
GEF
GTP GTP GTP
Pak1-GST Rhotekin-GSTp6
3Rho
GEF
cont
rol
p63R
hoG
EF-D
H
Tiam
-1D
bl-D
H
RhoA-GTP
Rac1-GTP
Cdc42-GTP
total RhoA
total Rac1
total Cdc42
Direct detection of RhoGTPase activation
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rela
tive
luci
fera
se e
xpre
ssio
n control RhoGEF
0
1
2
3
4
5
+C3T
C3T
indirectluciferase reporter assay
Rac1
pSREfirefly luciferase
renilla luciferase
SRF
const.
Cdc42
Rho
GEF
Detection of RhoGTPase activation II
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Detection of RhoGTPase activation IIIFRET
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GiPCR GqPCR
Gi Gq
PMG12PCR
G12/13
p63RhoGEFp63RhoGEF LARGLARGPI3K
TIAM-1TIAM-1
RhoARhoARac1Rac1
VEGF-R
NO
cGMP
p164, Grinch, Gef10 p164, Grinch, Gef10
Focus AG Wieland
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p63RhoGEF
DH PH
580 aa
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H2O
Car
diom
yocy
tes
Non
-Car
diom
yocy
tes
H2Ol
Car
diom
yocy
tes
Non
-Car
diom
yocy
tes
p63RhoGEF Control
Hea
rtB
rain
Place
nta
Lung
Live
rSc.
mus
cle
Kid
ney
Pancr
eas
9,57,5
4,4
2,4
1,3
kb
Northern Blot:mRNA from different human
tissues
RT-PCR:Total RNA from isolated
primary rat cells
Expression of p63RhoGEFExpression of p63RhoGEF
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p63RhoGEF induces stress fiber formation
anti-c-myc
20 µm
TRITC-Phalloidin
20 µm
stress fiber
Lutz et al. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 369:540-6 (2004 )
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p63R
hoG
EF
cont
rol
p63R
hoG
EF-D
H
Tiam
-1D
bl-D
H
RhoA-GTP
Rac1-GTP
Cdc42-GTP
total RhoA
total Rac1
total Cdc42
rela
tive
luci
fera
se e
xpre
ssio
n
control p63RhoGEF
0
1
2
3
4
5
+C3T
Specificity of p63RhoGEFSpecificity of p63RhoGEF
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Upstream regulatory mechanism (1)Upstream regulatory mechanism (1)
Control M3p63 p63 + M3
0
20
40
60
80
100 Basal
Carbachol
n=8
rela
tive
luc
ifer
ase
exp
res
sio
n
Lutz et al. J Biol Chem. 280:11134-9 (2005 )
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Upstream regulatory mechanism (2)Upstream regulatory mechanism (2)re
lati
ve l
uci
fera
seex
pre
ssio
n
0
50
100
150
200
+p63
Basal GqQL G11QL Basal0
50
100
150
+p63
G12QL G13QL
M3-Ach-Receptor
Gq/11 G12/13
Contro
lp6
3
Gq
RCGq
RC+p63
G1
2QL+
p63
G1
2QL
G1
1QL
G1
1QL+
p63
G1
3QL+
p63
G1
3QL
RhoA-GTP
total RhoA
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p63
RhoG
EF
p63R
hoG
EF
p63R
hoG
EF
WB:anti-c-myc
WB:anti-Gq/11
anti-Gq/11
IP:anti-c-myc
Lysate
Con
trol
G11QLGqRC
Con
trol
Con
trol
IP:anti-EE
WB:anti-c-myc
WB:anti-Gq/11
p63-
EE-GqQL
Physical interaction of p63RhoGEF with GPhysical interaction of p63RhoGEF with Gq q in the cell in the cell
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p63 149-580
p63 149-580
Courtesy of John J. Tresmer
Physical interaction of p63RhoGEF with GPhysical interaction of p63RhoGEF with Gqq in vitroin vitro
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DH PH
p63RhoGEF580
RhoA RhoA
GTP GDP
GqPCR
Gq/11
Physiological relevance of Physiological relevance of p63RhoGEF mediated RhoA activationp63RhoGEF mediated RhoA activation
Ad p63RhoGEF+ Endothelin 1
TRITC-Phalloidin
RhoA-GTP
total RhoA
cont
rol
p63R
hoG
EFco
ntro
lp6
3Rho
GEF
+ Endothelin 1
p63RhoGEF
Neonatal Cardiomyocytes
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• p63RhoGEF is mainly expressed in heart and brain tissue.
• p63RhoGEF activates RhoA, but not Rac1 or Cdc42
• p63RhoGEF is activated by Gq/11 proteins.
• p63RhoGEF interacts directly with active Gq/11 proteins.
• p63RhoGEF enhances the Endothelin 1 and Phenylephrine induced RhoA activation in cardiomyocytes.
b
p63RhoGEF - Summaryp63RhoGEF - Summary
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H1-R M3-R
His
Gq/11
p63RhoGEFLARG
RhoA
G12/13 PLC/PKC
TXA2-R
U-46619
Carb
Signaling cascades involving p63RhoGEF and LARG
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Larg
Control
anti-Flag
p63
Control
anti-c-myc
DH PH588
1543
DH PHRGSPDZ
RhoA-GTP
total RhoA
Control
Larg
p63
C
p63
Larg
0
5
10
15
rela
tive
Lu
cife
rase
p63RhoGEF (p63) Dominant expression in brain and heart
LARGWidespread expression
Basal activity of p63RhoGEF and LARG
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Control
TXA2-R
TXA2-R+L
ARG
TXA2-R+p
630
25
50
75BasalU-46619 (200nM)
rela
tive
Lu
cife
rase
G12/13PCR Gq/11PCR
Control
M3-
R
M3-
R+LARG
M3-
R+p63
0
25
50
75
100
125BasalCarbachol (1mM)
rela
tive
Lu
cife
rase
GPCR induced RhoA activation mediated by p63RhoGEF and LARG
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0 5 10 15 20 250
5
10
15
20
25
30
35Largp63RhoGEF
ng Gq
rela
tive
Lu
cife
rase
Control p63RhoGEF LARG0
25
50
75
100none+GqRC+G12QL
rela
tive
Lu
cife
rase
Conclusion: Larg needs an active state receptor to induce RhoA activation, whereas p63RhoGEF needs only traces of Gq protein for its activation.
The LARG induced Rho activation requires activated GPCRs
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Gq/i
1-28aa Gi-3
29-353aa Gq
0
10
20
30
40
50
60
70re
lati
ve L
uci
fera
se
p63 - + - - - + + - - - + + - -
Larg - - + - - - - + + - - - + +
M3-R - - - + - - + - + - - + - +
Gq - - - - + + + + + - - - - -
Gq/i - - - - - - - - - + + + + +
The Larg activation ist dependent on the N-terminal part of Gq proteins
Gq Gq/i
Conclusion: p63RhoGEF and LARG apparently hold divergent binding sites for Gq
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RGS3
![Page 38: RhoGTPases – Function and Regulation Thomas Wieland Institut für Pharmakologie und Toxikologie Fakultät für Klinische Medizin Mannheim Ruprecht-Karls-](https://reader037.vdocuments.us/reader037/viewer/2022110405/56649ed95503460f94be86e8/html5/thumbnails/38.jpg)
RGS proteins contribute to the regulation of GRGS proteins contribute to the regulation of G--gated Kgated K+ + -channels-channels
ACh, 1 MControl
500 nA
25 s
Activation of GIRK by M2-AChR in Xenopus oocytes
Doupnik et al. 1997, Proc Natl Acad Sci 94:10461
Regulation by RGS3
+ RGS3
500 nA
25 s
ACh, 1 M
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RGS3 - A highly abundant protein in human heartRGS3 - A highly abundant protein in human heart
RGS3 RGS domain
1 394 519509
G binding70kDa
• RGS3 mRNA is upregulated in human HF Owen et al. 2001, Eur Heart J 22:1015
• RGS3 can be induced in NRCM by treatment with bFGF Zhang et al. 1998, J Mol Cell Cardiol 30:269
• RGS3 inhibits G-stimulated PLC activity and PI3K/Akt signaling G scavenger Shi et al. 2001, J Biol Chem 276:24293