revista mexicana de ingeniería q uímica · 2019-09-30 · la vida media de las c´elulas. as...

Revista Mexicana de Ingeniería Química

CONTENIDO

Volumen 8, número 3, 2009 / Volume 8, number 3, 2009

213 Derivation and application of the Stefan-Maxwell equations

(Desarrollo y aplicación de las ecuaciones de Stefan-Maxwell)

Stephen Whitaker

Biotecnología / Biotechnology

245 Modelado de la biodegradación en biorreactores de lodos de hidrocarburos totales del petróleo

intemperizados en suelos y sedimentos

(Biodegradation modeling of sludge bioreactors of total petroleum hydrocarbons weathering in soil

and sediments)

S.A. Medina-Moreno, S. Huerta-Ochoa, C.A. Lucho-Constantino, L. Aguilera-Vázquez, A. Jiménez-

González y M. Gutiérrez-Rojas

259 Crecimiento, sobrevivencia y adaptación de Bifidobacterium infantis a condiciones ácidas

(Growth, survival and adaptation of Bifidobacterium infantis to acidic conditions)

L. Mayorga-Reyes, P. Bustamante-Camilo, A. Gutiérrez-Nava, E. Barranco-Florido y A. Azaola-

Espinosa

265 Statistical approach to optimization of ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae in the

presence of Valfor® zeolite NaA

(Optimización estadística de la fermentación etanólica de Saccharomyces cerevisiae en presencia de

zeolita Valfor® zeolite NaA)

G. Inei-Shizukawa, H. A. Velasco-Bedrán, G. F. Gutiérrez-López and H. Hernández-Sánchez

Ingeniería de procesos / Process engineering

271 Localización de una planta industrial: Revisión crítica y adecuación de los criterios empleados en

esta decisión

(Plant site selection: Critical review and adequation criteria used in this decision)

J.R. Medina, R.L. Romero y G.A. Pérez

Revista Mexicanade Ingenierıa Quımica

1

Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenierıa Quımica, A.C.

Volumen 11, Numero 1, Abril 2012

ISSN 1665-2738

1Vol. 11, No. 1 (2012) 55-73

REVISION: APLICACIONES AMBIENTALES DE MICROORGANISMOSINMOVILIZADOS

REVIEW ARTICLE: ENVIRONMENTAL APPLICATIONS OF IMMOBILIZEDMICROORGANISMS

M.A. Martınez-Trujillo y M. Garcıa-Rivero∗

Tecnologico de Estudios Superiores de Ecatepec, Laboratorio de Catalisis Enzimatica, Division de CienciasQuımicas y Bioquımicas, Av. Tecnologico s/n, Col. Valle de Anahuac, C.P. 55210, Ecatepec de Morelos, Edo. de

Mexico, Mexico.

Recibido 30 de Agosto 2011; Aceptado 16 de Diciembre 2011

ResumenEl uso de celulas inmovilizadas en el area ambiental ha sido poco explotado, a pesar de que se reconoce su potencial en labiodegradacion de contaminantes debido al incremento en la estabilidad de las celulas y la tolerancia ante ciertos compuestostoxicos. Los ensayos de biodegradacion de contaminantes organicos se han realizado principalmente en medio lıquido, y sonescasos los ensayos de biodegradacion de contaminantes en suelos, es por esto que el interes del presente trabajo se centroen revisar el estado del arte de la uso de microorganismos inmovilizados para la degradacion de contaminantes organicosen suelos. Se hace una revision de los soportes comunmente usados en la inmovilizacion de microorganismos para finesambientales, ası como de los diferentes enfoques que se han trabajado, para ası identificar posibles areas de oportunidad parafuturas investigaciones.

Palabras clave: contaminantes organicos, suelos, soportes, degradacion, bacteria, hongos.

AbstractThe use of immobilized cells in the environmental field has been slight explored despite recognizing its potential in contaminantbiodegradation due to increased tolerance to toxic compounds and the stability of the cells. The biodegradation assays of organiccontaminants have been carried out mainly in liquid medium and there are few assays in soil, therefore the interest of this workfocuses on reviewing the state of the art of using immobilized cells for degradation of organic pollutants in soils. Some advantagesof support used in the immobilization of microorganisms for environmental purposes as well as the different approaches that haveworked to identify potential areas of opportunity are also discussed.

Keywords: organic contaminants, soils, supports, degradation, bacteria, fungi.

1 Introduccion

En los ultimos anos la biotecnologıa ha tenidoimportantes avances en su aplicacion en procesosindustriales para la obtencion de productos quımicos,alimentarios y farmaceuticos, ası como en elarea ambiental. Una gran variedad de procesosindustriales son llevados a cabo mediante el usode celulas inmovilizadas, en los cuales se hanproducido compuestos tales como aminoacidos,

acidos organicos, antibioticos, esteroides y enzimas(Najafpour, 2007; Linhardt y col., 1987). Entre lastecnicas de inmovilizacion de celulas que se conocen,la adsorcion y el atrapamiento en la matriz de unsoporte polimerico sin duda son las mas utilizadas. Enla inmovilizacion por adsorcion los microorganismosse unen al soporte por interacciones ionicas, quepreferentemente deben ser materiales con grandessuperficies, tales como el carbon activado (Ehrdardt yRehm, 1985) o resinas de intercambio ionico (Jack y

∗Autora para la correspondencia. E-mail: [email protected]. 50-00-23-00, Fax 50-00-23-00 ext. 2304

Publicado por la Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenierıa Quımica A.C. 55

Martınez-Trujillo y Garcıa-Rivero/ Revista Mexicana de Ingenierıa Quımica Vol. 11, No. 1 (2012) 55-73

Zajic, 1977). La tecnica de atrapamiento es aplicablea diversos microorganismos y en esta se utilizagelatina, agar, gel de poliacrilamida, alginato decalcio, carragenina, quitosano, alcohol polivinilico osol-gel como materiales para la formacion de la matriz(Najafpour, 2007). Otros materiales comunmenteusados como soporte para la inmovilizacion sonlos residuos lignocelulosicos, cuya ventaja adicionalradica en la produccion de azucares durante suhidrolisis, lo que a su vez minimiza la generacion dedesechos (Zhang y col., 2009).

Aunque actualmente los estudios respecto a lainmovilizacion se estan enfocando en superar algunaslimitaciones tecnicas observadas durante el procesode inmovilizacion y en la busqueda de soportesde bajo costo, se tienen logros importantes en elincremento de la produccion de metabolitos y enla vida media de las celulas. Ası, el interessobre los sistemas inmovilizados ha sido crecientedebido a las numerosas ventajas que estos ofrecen,ya que permiten acortar el tiempo del proceso defermentacion, incrementar la productividad, facilitarlos procesos de separacion de productos y minimizarlos costos de produccion (Najafpour, 2007). Unadescripcion detallada de los aspectos fundamentalesde la inmovilizacion de celulas se puede encontrardentro del texto de “Biochemical Engineerig andBiotechnology” publicado por Najafpour (2007).

Por otra parte, las aplicaciones de la biotecnologıapara resolver problemas ambientales han permitido eldesarrollo de diversas tecnicas de biorremediacionpara suelos y aguas contaminadas, que sehan basado de forma tradicional en el uso demicroorganismos libres. Sin embargo la incorporacionde microorganismos libres en los sistemas detratamiento tiene ciertas limitaciones debidas a latoxicidad inherente de los contaminantes, ası comoa la competencia entre las poblaciones nativas ylas exogenas (Fantroussi y Agathos, 2005). Unaforma de salvar estas limitantes es a traves deluso de microorganismos inmovilizados, ya que lainmovilizacion brinda a las celulas una proteccioncontra el efecto toxico de las sustancias presentesen el medio y a la depredacion por parte de otraspoblaciones (Mishra y col., 2001). Cuando se usancelulas inmovilizadas en procesos de remocion decontaminantes se logra incrementar la tasa globalde biodegradacion, debido a las altas densidadescelulares que se alcanzan, ademas de incrementarla estabilidad y tolerancia de los microorganismosa los compuestos toxicos (Godjevargova y col., 2003;Hanaki y col., 1994). Las celulas inmovilizadas como

una alternativa tecnologica para aplicacion ambientalse han usado en agricultura, biocontrol, aplicacionde pesticidas, biodegradacion de contaminantes enaguas subterraneas (Cassidy y col., 1996) y en aguasresiduales de origen industrial (Nair y col., 2007),y en menor proporcion en suelos. Sin embargo, lamayorıa de las aplicaciones se han realizado a nivel delaboratorio.

El objetivo del presente artıculo es revisarlas aplicaciones de la inmovilizacion de diversasespecies microbianas durante la biodegradacion decontaminantes, con enfasis en la aplicacion deesta tecnologıa para la biorremediacion de sueloscontaminados con compuestos organicos.

La informacion que aquı se presenta se haorganizado en cuatro secciones. En la primera,relacionada con el uso de microorganismos en larecuperacion del ambiente, se analiza el uso delos sistemas inmovilizados a traves de la tecnologıade bioaumentacion. El analisis de publicacionesrelacionadas con el tema, permitio identificar a lasupervivencia de la poblacion microbiana introducidaal suelo como una de las principales limitantes enel exito de esta tecnologıa. Es ası como el uso demicroorganismos inmovilizados se convierte en unaherramienta para incrementar la probabilidad de suestablecimiento en el suelo. Una vez identificadala necesidad de incorporar microorganismos al sueloen forma inmovilizada se hace necesario conocer lostipos de soportes mas usados (alginato de calcio, agar,poliuretano y el sol gel) y las cualidades que estosposeen, temas que se tratan en la segunda seccion.

En la tercera seccion se discute la aplicacion demicroorganismos inmovilizados en la degradacion decontaminantes en sistemas lıquidos. Se demuestracomo el reconocido incremento en la resistencia a latoxicidad y concentracion de los compuestos en la faselıquida cobra especial importancia en la degradacionde contaminantes. Se revisan los aspectos cineticosde la degradacion de contaminantes, encontrandoseque los modelos clasicos usados en cultivo lıquido sonadecuados para explicar el consumo de contaminantes,los efectos toxicos e incluso el crecimiento quepresentan los sistemas inmovilizados. Lo anterior sehace sin perder de vista que la actividad de las celulasinmovilizadas depende de las caracterısticas de lossistemas microbianos y su interaccion con el soporte.

En la ultima seccion se hace una revisiondel estado del arte de la aplicacion de losmicroorganismos inmovilizados en el tratamientode suelos contaminados. En general los reportes serefieren a trabajos realizados a nivel de laboratorio,

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en los que se han empleado preferentemente soportesconvencionales en forma de mezclas que permitenlograr una mayor resistencia del soporte. Estosestudios han reiterado el incremento de la eficienciade las celulas inmovilizadas en la remocion decontaminantes.

2 Los microorganismos en larecuperacion del ambiente

La biodegradacion de compuestos organicos, talescomo hidrocarburos, insecticidas y plaguicidas,compuestos clorados y compuestos aromaticos, hasido ampliamente estudiada a nivel de laboratorio y enestudios de campo. Dichos estudios han demostradoque la degradacion microbiana de contaminantesen el ambiente es un proceso complejo, cuyosresultados cuantitativos y cualitativos dependen defactores abioticos y bioticos. Entre los primeros sedeben enumerar a las condiciones ambientales localescomo pH, temperatura y humedad, principalmente,ademas de la concentracion y la disponibilidaddel contaminante. Entre los factores bioticos sonfundamentales la composicion, la adaptabilidad ycapacidad fisiologica de las poblaciones microbianas.En suma, esos resultados han permitido el desarrollode las llamadas tecnologıas de biorremediacion(Boopathy, 2000).

En los ultimos anos, se ha desarrollado unaamplia variedad de tecnologıas de biorremediacion,tanto in situ como ex situ. Esas tecnologıas hansido disenadas para lograr condiciones adecuadasde cultivo e incrementar la disponibilidad de loscontaminantes y las poblaciones microbianas conreconocida capacidad de biodegradacion. A eserespecto destaca la tecnica de bioaumentacion,que se refiere a la adicion de microorganismosexogenos a un sistema para incrementar la tasay alcance de la biodegradacion. El exito de laestrategia de bioaumentacion esta determinado por lainterrelacion del microorganismo inoculado con sunuevo ambiente biotico y los factores ambientales,en terminos de su supervivencia y actividad demigracion (Mrozik y Piotrowska-Seget, 2010). Enun ambiente natural, la depredacion por protozoarioso bacteriofagos, competencia con microorganismosautoctonos por nutrientes o aceptores de electronesy la presencia de raıces que liberan compuestosorganicos, son elementos que afectan adversamentea la bioaumentacion (Fantroussi y Agathos, 2005).Varias tecnicas han sido empleadas para incrementar

la probabilidad del establecimiento, eficacia yactividad de un inoculo introducido en un ambientenatural. Esas tecnicas incluyen la inmovilizacionde microorganismos, el desarrollo de nichos quefavorezcan el crecimiento del inoculo (inoculacionen la rizosfera de una planta que es introducida enel sitio) y el uso de suelos activados (Mrozik yPiotrouska-Seget, 2010; Gentry y col. 2004a). Estaultima se refiere a partıculas de suelo que han sidoexpuestas al contaminante de interes y que actuancomo soporte para el desarrollo de una poblacionmicrobiana que puede eliminar un contaminanteen particular (Barbeau y col., 1997). Cuandose opta por la inmovilizacion de microorganismos,los resultados obtenidos han demostrado que elsoporte de inmovilizacion proporciona una efectivaproteccion al inoculo ante los microorganismosnativos. Adicionalmente, con la introduccion demicroorganismos inmovilizados se logra establecermicrositios con una poblacion microbiana unica quetrabaja de forma interactiva en la remocion delcompuesto de interes.

En relacion al uso de suelos activados comoventajas potenciales se puede mencionar el usode una poblacion naturalmente desarrollada, quepodrıa ser mas efectiva que una poblacion aislada,ya que al no haber sido cultivada fuera delsuelo no pierde su habilidad para competir en elambiente. Finalmente bajo las condiciones en lasque se desarrolla la poblacion microbiana durantelos procesos de bioaumentacion con suelos activados,serıa posible incluir microorganismos degradadoresno cultivables, que se pierden cuando se pretendeaislar microorganismos de un sitio para llevarlos a otro(Gentry y col., 2004a). Una revision mas amplia delas tecnicas que pueden incrementar la supervivenciade los microorganismos exogenos se presenta en eltrabajo publicado por Gentry y col. (2004b). A partirde lo anterior, la siguiente seccion se enfoca en larevision de los diferentes soportes utilizados para lainmovilizacion de microorganismos con aplicacion enel area ambiental, mencionando casos de aplicacion,ası como sus ventajas y desventajas.

3 Soportes usados para inmovilizacionde microorganismos utiles en elarea ambiental

Un soporte adecuado para la inmovilizacion demicroorganismos con aplicacion en el area ambiental

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debe proporcionar condiciones apropiadas para lasupervivencia de las celulas y su funcionamiento comoinoculo, lo cual da como resultado una vida mediasuficientemente larga ası como el mejoramiento dela supervivencia y de la actividad en el suelo. Serequiere que el soporte no sea toxico, ni contaminantey que tenga una calidad constante, para permitiruna liberacion precisa de los microorganismos enel sitio de interes y eventualmente se evite ladispersion de los microorganismos (van Veen y col.,1997; Cassidy y col., 1996; Gentry y col., 2004b).Es importante aclarar que en la bioremediacion desuelos contaminados una lenta liberacion de losmicroorganismos inmovilizados puede ser ventajosa(Cassidy y col., 1996); en contraparte en los sistemasde tratamiento de aguas subterraneas o residualescontaminadas es importante mantener la estabilidaddel soporte para evitar el incremento en la formacionde lodos cuya disposicion y tratamiento puede incidiren los costos del proceso de tratamiento del agua(Juarez-Ramırez y col., 2011).

Son diversos los materiales que se han usado comosoporte para la inmovilizacion de microorganismoscon fines ambientales, entre ellos se incluyebiosolidos, suelos enmendados con carbon, arcilla,estiercol o turba. Debido a que dichos materialespresentan una gran variabilidad en su calidad ycomposicion, se ha preferido el uso de polımerosnaturales que forman matrices porosas tales como elalginato, la k-carragenina y el agar (van Veen y col.,1997). Aunque los dos primeros son consideradoscomo los mas seguros y efectivos, el alginato de calcioy el agar son los que se han utilizado de maneramas amplia. Entre los polımeros sinteticos que hansido usados como matrices para inmovilizacion con elobjetivo de emplearlos en procesos de bioremediacionse puede mencionar el poliuretano (Oh y col.,2000), el sol gel (Pannier y col., 2010; Rietti-Shati y col., 1996), poliacrilonitrilo (Yordanova, ycol., 2009), poliacrilamida (Manohar y Karegoudar,1998) y alcohol polivinilico (Chitiva y Dussan, 2003;Cunningham y col., 2004; Zhang y col., 2007).

Antes de analizar con detalle ejemplos especıficosde la aplicacion de sistemas biologicos inmovilizadosen diversos procesos del area ambiental, es necesariorevisar algunas caracterısticas generales de lossoportes que se utilizan con mayor frecuencia, lo quese hace en la siguiente seccion.

3.1 Alginato de calcio

El alginato es un componente de la pared celularde las algas pardas, esta formado por dos tipos deunidades monomericas: el acido β(1-4) D-manuronicoy el acido α(1,4)-L-guluronico. Cuando el alginato esexpuesto a la presencia de iones calcio se forma unared de entrecruzamiento con los polımeros del acidoguluronico, que permite la inmovilizacion de celulas(Smidsrød y Skjak-Brka, 1990).

La inmovilizacion de microorganismos en alginatode calcio es el metodo mas usado, debido a queen su preparacion no se requieren condiciones dereaccion extremas, es de bajo costo y de baja toxicidad(Sanjay y col., 2008; de-Bashan y Bashan, 2010). Hasido considerado como un metodo promisorio paraincrementar la degradacion de compuestos toxicosdebido a que las celulas atrapadas en el interior de lamatriz estan protegidas contra ambientes adversos, locual no sucede cuando las celulas son retenidas en lasuperficie de un soporte. Adicionalmente, las celulasinmovilizadas son facilmente liberadas al medio por ladisolucion del gel en presencia de agentes quelantesdel calcio, tales como citrato de sodio y fosfato depotasio (Mohammad y Bustard, 2008), lo cual permitecuantificar la biomasa formada.

A pesar de sus caracterısticas el uso del alginatode calcio se ha considerado adecuado solo parapruebas de laboratorio pero no para la aplicacionen campo, debido a su baja resistencia mecanica,incompatibilidad con ciertos iones y su susceptibilidada la biodegradacion (de-Bashan y Bashan, 2010). Noobstante, recientes investigaciones han sugerido que laresistencia mecanica de las perlas de alginato de calciopuede incrementarse mediante la adicion de silica,logrando la inmovilizacion de celulas e incluso debiomoleculas (Coradin y col., 2003); Otra alternativapara el uso exitoso de perlas de alginato se ha logradousando 4.9% de alginato y 4% de solucion de estronioen sistemas marinos (Moreira y col., 2006).

En la practica el alginato de calcio ha sidoampliablemente utilizado para el atrapamiento deenzimas y celulas usadas para la remocion de ionesmetalicos por absorcion en la biomasa de algas (de-Bashan y Bashan, 2010) u hongos (Xiangliang y col.,2005); remocion de colorantes (Chen y Lin, 2007) ycompuestos fenolicos (Dursun y Tepea, 2005), entreotros compuestos.

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3.2 Agar

El agar es una mezcla de polisacaridos extraıda a partirde diferentes especies de algas rojas, principalmentedel genero Gracilaria. El polisacarido fundamental esla agarosa que posee propiedades gelificantes y tieneuna estructura alternante de 3,6 anhidro-L-galactosa(3,6-AG) y D-galactosa.

El agar es ampliamente usado como aditivoalimenticio y en numerosas aplicaciones medicas,farmaceuticas y biotecnologicas (Pulz y Gross, 2004).Aunque tıpicamente se ha utilizado como agentegelificante en cultivos microbianos, su uso comosoporte para inmovilizacion de celulas se ha extendidodebido a su nula toxicidad y a las condiciones dereaccion suaves que se requieren llevar a cabo lamatriz de inmovilizacion. Entre otras ventajas, sepuede mencionar la diversidad en la formacion ylicuefaccion del gel, su estabilidad quımica y termica,y su capacidad para el entrecruzamiento (Guiseley,1989).

El agar se ha empleado exitosamente comosoporte para preparar biosensores basados enmicroorganismos para detectar bifenilos, tiosulfunatoy SDS en aguas contaminadas, y para lainmovilizacion de microorganismos usados enensayos de biodegradacion de nafatleno (Manohary Karegoudar, 1998), fenol (Juarez-Ramırez y col.,2001) y 2,4-Dinitrofenol (Kitova y col., 2004), entreotros compuestos.

3.3 Poliuretano

El poliuretano es un polımero derivado de lacondensacion de poli-isocianatos y polialcoholes.Es quımicamente inerte, completamente elastico ymecanicamente resistente a la abrasion. Una delas ventajas del poliuretano es su alta porosidad,que permite retener a las celulas sin limitacionesdifusionales para el sustrato, el producto e inclusopara el oxıgeno (Manohar y col., 2001; Kadakoly col., 2010). Los compuestos contaminantes sepueden adsorber de forma reversible al poliuretano.En consecuencia en la fase lıquida se establecenconcentraciones por debajo del nivel de toxicidad,mientras que el compuesto se mantiene disponiblepara los microorganismos, y por tanto es posible el usode una concentracion inicial mas alta a la que podrıafijarse para un cultivo de celulas libres (O’Reilly yCrawford 1989b).

Entre otras cualidades el poliuretano es defacil disponibilidad y manejo para la inmovilizacion

de microorganismos, extremadamente versatil y debajo costo, altamente estable y permite una mayorviabilidad de las celulas inmovilizadas durantevarios usos, y dadas sus caracterısticas se consideraaplicable en la destoxificacion de efluentes quecontienen contaminantes organicos (Sharanagouda yKaregoudar, 2002; Tallur y col., 2009).

Los primeros trabajos de inmovilizacion enpoliuretano emplearon prepolımeros a partir de loscuales se genero el poliuretano que contenıa a lascelulas inmovilizadas. Sin embargo, se tienenevidencias de que los grupos isocianato, producidosdurante la polimerizacion de este soporte, puedentener un efecto toxico sobre las celulas (Branyik y col.,2000), por lo que una practica comun ha sido el uso depolımeros prefabricados.

Algunas de las aplicaciones de microorganismosinmovilizados en espuma de poliuretano ha sido enla degradacion de compuestos fenolicos (O’Reilly yCrawford, 1989b), 2-metilnaftaleno (Sharanagouda yKaregoudar, 2002) y carburan fenol (Kadakol y col.,2010), por citar algunos compuestos.

3.4 Matrices de silica gel

Las matrices de silica se forman por reaccionesde hidrolisis y policondensacion que ocurren ensoluciones acuosas a temperatura ambiente, quegeneran una estructura porosa inorganica cuando lascelulas son adicionadas a una solucion de silicaprehidrolizada de tetraetoxisilicato o metoxisilicato(Bhatia y col., 2000).

La quımica sol-gel, basada en reaccionesinorganicas de polimerizacion, ha sido empleadaen diferentes areas de investigacion, y debido a lascondiciones en las cuales ocurre la reaccion puedeaplicarse para el atrapamiento de diferentes sistemasbiologicos. La principales caracterısticas de losmateriales usados en los metodos sol-gel, y que loshacen adecuados para aplicaciones en biotecnologıaambiental, son su bajo costo, su caracter hidrofılicoy su resistencia al ataque microbiano (Bhatia y col.,2000); adicionalmente son quımicamente inertes,presentan una alta estabilidad mecanica, termica yno se disuelven en solventes organicos como ocurrecon la mayorıa de los polımeros organicos (Conroy ycol., 2000; Nassif y col., 2003).

A pesar de sus caracterısticas, una desventaja delas matrices de silica gel es que durante su formacionpor procesos convencionales, se generan matrices conuna porosidad promedio menor al tamano de lascelulas comunes. A lo que se debe sumar la toxicidad

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de los alcoholes que se liberan (metanol o etanol)durante las reacciones de hidrolisis y condensacion dealcoxidos de silicio Si(OCH3)4. Con la finalidad deproteger a las celulas de la toxicidad de los compuestosque se forman durante el proceso de inmovilizacion, seha probado el uso de compuestos quımicos que, entreotras caracterısticas deseables, deben ser solubles enagua, biocompatibles y mantener la cohesion del gel(Nassif y col., 2003). El compuesto que mejoresresultados ha proporcionado es el glicerol, que inclusopuede tener un efecto en el tamano del poro y en elarea superficial del gel (Alvarez y col., 2009). Sinembargo, existen pocos estudios sobre el efecto deestos solutos compatibles sobre la estructura del gely respecto a su funcion como una fuente de nutrientespara los microorganismos inmovilizados.

Recientemente el uso del sol-gel se ha orientadoa la inmovilizacion de microorganismos para laelaboracion de biosensores de contaminantes comoel fenol (Branyik y Kuncova, 2000); la inmovilizacionde enzimas o peptidos para la deteccion de metalespesados (Bahrami y col., 2007) o compuestosorganofosforados (Dosoretz y col., 1996); y lainmovilizacion de enzimas para la conversionoxidativa de compuestos en medios organicos (Li yTakahashi, 2000), que puede ser de especial interesen el desarrollo de biocatalizadores en el campo dela quımica verde. Otra aplicacion ambiental del sol-gel, aunque no mediante el uso de microorganismos,fue la formacion de pelıculas con la incorporacion deoxido de titanio, que fueron aplicadas en la remocionfotocatalıtica de fenol en solucion acuosa (Mediana-Valtierra y col., 2005).

En nuestro grupo de trabajo se han realizadovarias pruebas para la inmovilizacion de hongos conalgunos de los soportes mencionados. Al respecto,inmovilizamos en sol-gel pellets de Phanerochaete

chrysosporium y Asperguillis niger que mantuvieronsu actividad biologica y su capacidad para producirxilanasas; ademas de haber empezado los procesosde inmovilizacion de P. chrysosporium en alginato decalcio con miras para su empleo en la degradacion defenol, y tenemos un buen avance en los estudios deinmovilizacion de Trametes versicolor en poliuretano,con lo que se ha logrado la remocion de colorantestextiles. En la Fig. 1 se muestran algunas fotografıasde los microorganismos con los que se ha trabajado.

En la siguiente seccion se hace una revisionde procesos especıficos donde se aplican losmicroorganismos inmovilizados en los diferentessoportes. A partir de lo anterior se analizan aspectosreferentes a la resistencia que estos ofrecen a losmicroorganismos con respecto a la toxicidad de loscontaminantes, para concluir la revision con el analisisde las cuestiones cineticas y difusionales que sepresentan en estos sistemas.

4 Los microorganismos inmovilizadosen la degradacion de contaminantes

Las aplicaciones de microorganismos inmovilizadosen la degradacion de contaminantes se han enfocadoprincipalmente a estudios desarrollados en mediosacuosos, que han demostrado que el material usadocomo soporte puede crear microhabitats de proteccion(en la superficie o poros del soporte), y funcionarcomo una fuente temporal de sustratos especıficospara los microorganismos introducidos (Van Veen ycol., 1997). Otra ventaja que puede listarse es lafacilidad del manejo de las celulas inmovilizadas,que permite minimizar los riesgos de contaminaciondurante el transporte, aplicacion y almacenamiento(Park y Chang, 2000).

Fig. 1. Ejemplos de hongos filamentos inmovilizados en diferentes soportes como parte de las pruebas realizadas ennuestro grupo de trabajo para la aplicacion de estos microorganismos en la remocion de contaminantes organicos.(a) T.versicolor inmovilizado en espuma de poliuretano, (b) pellets de P. chrysosporium inmovilizado en alginato decalcio y (c) pellets de A. niger inmovilizado en sol-gel.

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Tabla 1. Ejemplos de compuestos degradados por microorganismos inmovilizados

Compuesto Microorganismo Soporte Referencia

Fenol Candida alginato Hackel y col. (1975)Fenol Pseudomonas sp alginato Bettmann y Rehm (1984)Fenol Fusarium flocciferum agar, alginato,

k-carrageninapoliuretano

Anselmo y col., (1985)

4-Clorofenol Alcaligenes sp alginato Westmeier y Rehm (1985)Fenol Consorcio metanogenico agar Dwyer y col. (1986)

Compuestos aromaticos Flavobacterium poliuretano Baumgarten y col. (1987)Pentaclorofenol Flavobacterium poliuretano O’Reilly y Crawford, (1989b)

p-Cresol Pseudomonas Poliuretano alginato O’Reilly y Crawford (1989a)Clorofenol Rhodococcus sp alginato Valo y col. (1990)

4-Cloro-2-nitrofenol Cultivo mixto alginato Beunink y Rehm (1990)Pentaclorofenol P. chrysosporium alginato Lin y col. (1991)

Acrilamida Pseudomonas sp alginato Nawaz y col. (1992)Clorofenoles Cultivo mixto alginato Lee y col. (1994)

Pentaclorofenol Flavobacterium poliuretano Zhong-Cheng y col. (1994)Antrazina Pseudomonas sol-gel Rietti-Shati y col. (1996)Nafatleno Pseudomonas sp agar Manohar y Karegoudar (1998)

Fenol consorcio microbianomixto

sol-gel Branyik y col. (1998)

Aceite Yarrowia lipolytica poliuretano Oh y col. (2000)Fenol Candida tropicalis agar Juarez-Ramırez y col. (2001)

Quinolina Burkholderia sp alginato Jianlong y col. (2001)2,4-Dinitrophenol Rhodococcus

erythropolisagar Kitova y col. (2004)

Hidrocarburos delpetroleo

Rhodococcus poliuretano Quek y col. (2006)

Fenol Pseudomonas sp agar Ahamad y Kunhi (2011)Metil ter-butil eter Aquincola tertiaricarbonis Sol gel Pannier y col. (2010)Desechos de la

molienda del olivoGeotrichum candidum Alginato Bleve y col. (2011)

En la decada de los 80’s se dio inicio a losestudios de aplicacion de celulas inmovilizadas parala degradacion de contaminantes. En la Tabla 1puede observarse que los soportes de uso comunson el alginato, el poliuretano y el agar, y en menorproporcion el sol-gel. Es importante destacar quelas bacterias son los microorganismos comunmenteempleados en los estudios realizados para degradacionde compuestos toxicos con microorganismosinmovilizados, al igual que sucede en los ensayosde biodegradacion de contaminantes con celulaslibres. Esto se explica debido a que el interes seha centrado en el papel que juegan las bacterias delsuelo en la degradacion de los compuestos, y enconsecuencia se tiene un amplio conocimiento sobre

sus rutas metabolicas y las condiciones en las queestas llevan a cabo el proceso. En contraparte, a pesarde que los hongos poseen tambien un alto potencialpara la degradacion de contaminantes poco se sabesobre las enzimas y los mecanismos implicados enel proceso de biodegradacion que llevan a cabo.Debido a lo anterior los estudios de biodegradacion decontaminantes con hongos filamentosos inmovilizadosson poco numerosos, a pesar de que el uso de estosmicroorganismos en la produccion de enzimas deinteres industrial ha sido exitoso. Por ende, podrıanrepresentar un area de oportunidad para futurasinvestigaciones.

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4.1 Resistencia a la toxicidad

Una caracterıstica fundamental de los microorganismosinmovilizados es su mayor tolerancia a altasconcentraciones de sustrato. Esta cualidad es deespecial interes cuando se emplean compuestoscontaminantes toxicos. En este sentido, losprimeros trabajos de aplicacion de microorganismosinmovilizados en el area ambiental para degradarcompuestos fenolicos, demostraron que lainmovilizacion confiere una mayor resistencia a losmicroorganismos, incluso a altas concentracionesdel contaminante, que resultan toxicas cuandoel microorganismo esta libre en la fase lıquida.Sin embargo, la respuesta difiere en funcion delmicroorganismo usado. Por ejemplo Pseudomonasputida inmovilizada en alginato de calcio tolerohasta 3 g L−1 de fenol sin inhibicion aparente, eldoble de lo que las celulas libres pudieron soportar(Bettmann y Rehm, 1984). Sin embargo, unacepa de coleccion del mismo microorganismo fuecapaz de tolerar solo 1.2 g L−1 de fenol cuandose inmovilizo en alginato de calcio (Hannaford yKuek, 1999), comportamiento similar al demostradopor Escherichia coli inmovilizada, que se inhibio enconcentraciones de fenol superiores a 1 g L−1 defenol (Keweloh y col., 1989). En contraparte, enpruebas de remocion de 4-nitrofenol (50 mg L−1) porCorynebacterium sp, la proteccion por el soporte fueevidente a partir del segundo ciclo de reutilizacion,incluso las celulas mantuvieron su actividad biologicahasta por 10 ciclos (Kotouckova y col., 1997).

Si bien, la proteccion de las celulas inmovilizadaspor el soporte es un hecho comprobado, una elevadaporosidad del soporte puede permitir que el compuestocontaminante ejerza un efecto toxico similar alobservado en un cultivo de celulas libres, como sereporto para la degradacion de tricloroetileno porBacillus sp inmovilizado en agar (Dey y Roy, 2009),o bien en el caso en el que el alginato de calcio cuandopierde estabilidad debido a la presencia de sales defosfato en el medio (Mohammad y Bustard, 2008;Keweloh y col., 1989). Aunque esta limitante puedesuperarse usando una mayor concentracion del soportedurante el proceso de inmovilizacion, se deben teneren cuenta las consecuentes limitaciones difusionales.

Por otra parte, se ha demostrado que laadsorcion de los compuestos toxicos en la matrizde inmovilizacion juega un papel importante enla reduccion de la toxicidad de estos sobre elmicroorganismo. Se puede citar por ejemplo,la adsorcion reversible del pentaclorofenol en

poliuretano (O’reilly y Crawford, 1989b) o de fenol enquitosano (Annadurai y col., 2000), en los cuales fueposible mantener en la fase lıquida concentracionesdel compuesto menores al nivel toxico. En el casode los hidrocarburos del petroleo, se ha sugeridoque el uso del poliuretano, que tiene una grancapacidad de absorcion, presenta un alto potencialen la biorremediacion de hidrocarburos en aguassuperficiales. El poliuretano puede prevenir lamigracion de los productos que flotan en la superficiey la biodegradacion por los microorganismosinmovilizados se puede llevar a cabo in situ o ex situ(Oh y col., 2000; Quek y col., 2006).

4.2 Estudios cineticos y de difusion

La cinetica de biodegradacion de contaminantes porcelulas inmovilizadas, tal como sucede en los cultivosdesarrollados con celulas libres, es afectada porel pH, la temperatura y la concentracion inicialde contaminante, pero los lımites de toleranciason mayores cuando los microorganismos estaninmovilizados (Chung y col., 2003; Dursun yTepea, 2005). Una alta concentracion de sustratoinclusive puede tener un efecto positivo en latasa de biodegradacion. Por ejemplo, ensayos debiodegradacion de fenol en un cultivo semicontinuo enun lecho fluidizado con C. tropicalis (Juarez-Ramırezy col., 2001) demostraron que en concentracionessuperiores a 1000 mg L−1, la tasa de biodegradacionde fenol por los microorganismos inmovilizados fuemayor a la de las celulas libres.

En la Tabla 2 se muestra una comparacion dela tasa de degradacion de diferentes contaminantespor sistemas microbianos diversos, tanto libres comoinmovilizados en soportes como el agar, alginato yel poliuretano. En general, cuando se compara latasa de degradacion de fenol con celulas libres einmovilizadas, se observa que a bajas concentracionesde contaminante sucede una cinetica de primer orden,de manera tal que la tasa de degradacion resulta mayorcon las celulas libres que con las inmovilizadas. Sinembargo, a mayores concentraciones de contaminanteeste efecto es inverso, y las celulas inmovilizadasresultan mejores para la remocion. A ese respecto,como se senalo antes, los soportes usados parainmovilizar a las celulas pueden ejercer una ciertaproteccion ante la toxicidad que les provoca elfenol, debido a que favorecen la formacion demicrocolonias dentro de los poros de los soportes,las cuales dificultan la difusion del contaminantedentro de los mismos (Cassidy y col., 1996); o bien

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puede suceder que la dificultad que encuentran loscontaminantes para difundirse en el soporte modifiquela concentracion real de este a la que se enfrenta elmicroorganismo, disminuyendola, por lo que alcanzande manera tardıa la condicion de saturacion (Dwyer ycol., 1986). Ambas hipotesis se refuerzan al analizarlos casos donde se utilizan contaminantes mas toxicos,como el carbofurano, el p-cresol o el 2-metilnaftaleno,en los que la tasa de degradacion del contaminantepor las celulas libres nunca fue mayor que la de lasinmovilizadas, debido probablemente al efecto toxicoque ejercen estos compuestos per se. De hecho,cuando en estos casos se emplearon las mayores

concentraciones del contaminante, se observo unaconsiderable disminucion de la velocidad de remocionpor las celulas libres, en tanto que la de las celulasinmovilizadas se incremento.

A partir de lo anterior, se esquematizo elmecanismo mediante el cual los contaminantes sedifunden hasta llegar a las celulas inmovilizadas, paraser degradados mismo que se muestra en la Fig. 2.Este esquema parte del hecho de que generalmente lostratamientos para la degradacion de un contaminanteque se encuentra en fase lıquida se efectuan enreactores mezclados, en consecuencia el mecanismode transporte predominante es convectivo (paso 1) y

Tabla 2. Comparacion de la tasa de degradacion de contaminantes organicos entre celulas libres einmovilizadas en cultivo lıquido

Microorganismo Soporteutilizado parainmovilizar

Contaminantedegradado

Concentracioninicial del

contaminante(mgL−1)

Tasa deconsumo

celulas libres(mgL−1 h−1)

Tasa deconsumocelulas

inmovilizadas(mgL−1 h−1)

Referencia

C. tropicalis Agar al 4% Fenol 400 60 30 Juarez -800 68 50 Ramırez2000 20 85 (2001)3500 5 42

Consorcio Agar al 2% Fenol 200 14 9 Dwyerbacteriano 500 14.5 10 y col.

metanogenico 1200 7.5 8 (1986)2000 0 6

Pseudomonas Agar al 2% Fenol 500 21.9 35.7 Aneez-sp CP4 1000 15.1 36.6 Ahamad

Alginato de 500 21.9 38.5 y Kunhicalcio al 2% 1000 15.1 18.2 (2011)

Consorcio Agar Carbofurano 4425.2 17.46 19.02 KadakolAlginato 23.06 y col.

Poliuretano 30.98 (2011)Agar Carbofurano: 6637.8 8.49 29.18

Alginato fenol 33.78Poliuretano 46.09

Bacillus sp Agar p-cresol 2162.6 9.011 10.81 TallurPHN1 Alginato 11.26 y col.

Poliuretano 18.021 (2009)Alginato 4325.2 4.51 19.83

Poliuretano 36.04Agar 2-metil naftaleno 3555 35.55 41.48 Sharanagouda

Alginato 47.4 y KaregoudarPoliuretano 49.38 (2002)

Agar 7110 23.7 67.15Alginato 77.03

Poliuretano 98.83

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Fig. 2. Representacion esquematica del transporte decontaminantes en sistemas lıquidos agitados. La vistamicroscopica permite visualizar los pasos implicadosdurante el transporte: paso (1) transporte convectivodel contaminante en la fase lıquida, paso (2) transportedifusivo del contaminante dentro de la matriz delsoporte de inmovilizacion.

por tanto no limitante. Debido a lo anterior, labiodegradacion del contaminante estara solo limitadapor la difusion del contaminante y del oxıgeno dentrode la matriz del soporte (paso 2). Esto explicaque en bajas concentraciones de contaminante dentrode la matriz del soporte exista en consecuencia unabaja concentracion y por tanto una baja tasa dedegradacion. Cuando la concentracion en la faselıquida se incrementa de forma significativa entoncesen el interior del soporte se alcanzaran tambienconcentraciones mayores, pero sin llegar al nivel detoxicidad a la que se enfrentan las celulas libres.

En relacion al analisis cinetico de degradacionde contaminantes por celulas inmovilizadas, seacostumbra tomar como base los modelos cineticosque describen este proceso en cultivos con celulaslibres. Por ejemplo, el consumo de oxıgeno durantela oxidacion de metano por Hansenula polymorphafue explicado basandose en un modelo desarrolladopara describir la cinetica de difusion de oxıgeno enun pellet fungico (Hiemstra y col., 1983). Ası, seencontro que el coeficiente de difusion en la matrizde alginato de bario fue un 25% del valor reportadoen agua, y que un incremento de la densidad celularen la matriz polimerica limita la difusion de oxıgenodesde la fase lıquida hacia el interior del gel, lo quefinalmente influye en la velocidad de oxidacion delmetano por las celulas inmovilizadas. En un estudiosimilar, la oxidacion de propeno por Mycobacteriuminmovilizada en alginato de calcio fue explicada apartir del modelo de Michaelis-Menten suponiendouna cinetica de pseudo-primer orden (dado que lasconcentraciones iniciales de sustrato fueron menores

a las de la constante de saturacion) y despreciandola inhibicion por producto (Brink y Tramper, 1986).En ambos casos, se encontro que los datos predichospor el modelo se ajustan de forma adecuada a losdatos experimentales, y que la principal resistencia ala transferencia de masa ocurre en los poros.

Cuando el sustrato tiene un fuerte efectoinhibitorio sobre el crecimiento microbiano se puedeemplear el modelo de Haldane (Dwyer y col., 1986;Pallerla y Chambers, 1998; Dursun y Tepea, 2005).Sin embargo, la aplicabilidad de los modelos dependede las caracterısticas particulares del sistema. En labiodegradacion de fenol por P. putida inmovilizadaen alginato de calcio, en una concentracion de fenolsuperior a 750 ppm, se observo que el comportamientode la reaccion se desvıa del modelo de Michaelis-Menten, probablemente por efecto de la difusionintrapartıcula (Bandhyopadhyay y col., 2001). Sibien el proceso global de biodegradacion en unsistema inmovilizado esta gobernado por la difusionintrapartıcula y la reaccion quımica (Chung y col.,2003), se ha identificado a la difusion intrapartıculacomo el paso limitante (Annadurai y col., 2000). Deahı que los modelos mas acertados para describir lascineticas de biodegradacion deban considerar tanto eltermino de reaccion como el de la difusion, como es elmodelo de reaccion-difusion propuesto por Xiaoqiangy col. (2006) para describir la biodegradacion de fenolpor Alcaligenes faecalis inmovilizadas en poliuretano.Para una revision detallada sobre los principiosfundamentales de transferencia de masa en sistemas decelulas inmovilizadas se pueden consultar los trabajosrelacionados con microorganismos de interes en laindustria alimentaria (Raytchinova, 2011).

4.3 Comparacion de soportes

Aunque el tipo de soporte utilizado para lainmovilizacion puede tener efecto sobre ladegradacion de los contaminantes organicos, debidoprincipalmente a su porosidad, son escasos losestudios de comparacion de la eficiencia dedegradacion con diferentes matrices y no permitenestablecer una relacion entre el tipo de soporte y laeficiencia lograda en la biodegradacion.

En la biodegradacion de fenol con unaconcentracion inicial de 2 gL−1, en un reactor“airlift” con Pseudomonas sp inmovilizada enalginato o poliacrilamida, se encontro que la bacteriainmovilizada fue capaz de degradar el fenol en menosde dos dıas, mostrando una mayor eficiencia enpoliacrilamida, en tanto que las celulas libres no

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fueron capaces de crecer en esa concentracion defenol (Bettmann y Rehm, 1984). Posteriormente sedemostro que la degradacion de fenol ocurrio de formaefectiva en un reactor de lecho empacado, aunque sepresentaron limitaciones en la difusion del sustratohacia el interior del gel, debido al tamano del poro (1a 10 nm) de la silica gel, por lo que la degradacion fuemenos eficiente en comparacion a la obtenida cuandoel consorcio fue inmovilizado en poliuretano (Branyiky col., 2000).

Karigar y col. (2006) compararon la eficiencia dedegradacion de fenol (22mM) por Arthrobacter citreusinmovilizado en alginato y en agar, encontrandouna respuesta similar en la remocion de fenol yuna actividad de degradacion continua hasta por unasemana con ambos soportes. Sin embargo, en losresultados reportados en la degradacion de TCE porBacillus sp, se demostro que el alginato de calcio fueuna mejor matriz que el agar para la inmovilizaciondel microorganismo, debido a que la actividad dedegradacion se preservo por un mayor numero deciclos (Dey y Roy, 2009).

Los resultados obtenidos en la degradacion denaftaleno demostraron que la inmovilizacion dePseudomonas sp en poliuretano fue mas eficientecomparada con la obtenida usando como soportealginato de calcio, agar y poliacrilamida (Manohar ycol., 2001). Como se senalo anteriormente, debido asu resistencia mecanica y su porosidad el poliuretanofacilita la transferencia de oxıgeno, la difusion de loscompuestos y posee una mayor resistencia mecanicaque impide que las celulas se han liberadas del soportedurante el cultivo.

En otro estudio comparativo de matrices para ladegradacion de 2-metilnaftaleno por Pseudomonas spse demostro que el mejor soporte es el poliuretano,comparado contra agar, alginato y alcohol polivinılico(Sharanagouda y Karegoudar, 2002). En ese trabajo sereporto que el microorganismo inmovilizado fue capazde degradar de 25 a 50 mM de 2-metilnaftaleno y queen esas condiciones las celulas son reusables hastapor 30 ciclos sin perdida de actividad. Resultadossimilares se reportaron en la biodegradacion de p-cresol por Bacillus sp en un cultivo usando comosoportes alginato de calcio, agar, poliacrilamida ypoliuretano (Tallur y col., 2009). Las celulasinmovilizadas en poliuretano fueron reutilizadas pormas de 35 ciclos sin perdidas de actividad, y mostraronmayor tolerancia a cambios de pH, temperatura eincluso a altas concentraciones de p-cresol. Enla biodegradacion de carburan fenol por Klebsiellapneumoniae en un cultivo batch, Kadakol y col. (2010)

reportaron el agotamiento casi total del compuesto,que fue explicado en terminos de la porosidad,resistencia mecanica e hidrofobicidad del poliuretano.

En lo que respecta a la comparacion delcomportamiento de degradacion del contaminante porlas celulas inmovilizadas en los distintos soportes,los resultados indican que el poliuretano es la mejoropcion para ser utilizado como soporte para lainmovilizacion, independientemente del contaminanteutilizado. Esto puede deberse a las diferencias enla estabilidad mecanica de los diferentes soportes(Sharanagouda y col., 2002), lo que indica el potencialde estos materiales en la inmovilizacion de celulaspara empleo en el area ambiental.

De acuerdo a lo anteriormente expuesto esevidente que los modelos cineticos clasicos sonaplicables cuando en el sistema el efecto de la difusionintrapartıcula no es el paso limitante, condicion quepuede lograrse variando el tamano de poro sin que ellocomprometa la estabilidad y resistencia mecanica delsoporte.

Dentro del area ambiental, un aspecto quecontinua siendo importante es el tratamiento de sueloscontaminados. A ese respecto, el uso de sistemasinmovilizados sigue siendo un tema poco explorado,como se muestra en la siguiente seccion, dondeademas se discute lo que sucede con respecto a losproblemas de difusion en dichos sistemas.

5 Degradacion de contaminantesorganicos en suelo pormicroorganismos inmovilizados

Como se senalo anteriormente los trabajos debiodegradacion de contaminantes por celulasinmovilizadas se han realizado en medios acuosos, yaque estos se aplican comunmente en el tratamientode efluentes. En lo referente a los sistemas dedegradacion de contaminantes en suelos, pese a quese reconocen las ventajas de aplicar microorganismosinmovilizados, se tienen pocos reportes.

Con respecto al uso de soportes convencionalespara la inmovilizacion de microorganismos la listaes poco numerosa, y en general se trata de trabajosrealizados a nivel de laboratorio. Los enfoques hansido variados, por ejemplo se ha sugerido el uso desoportes multicapa, conformados por agar, alginatoo k-carragenina cubiertos de una capa protectorade poliuretano, que permiten el establecimientode condiciones adecuadas para alcanzar una alta

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densidad celular en el interior del soporte, donde losmicroorganismos pueden llevar a cabo su actividadde degradacion conforme el sustrato difunda hacia elsoporte (Middeldorp y col., 1990).

En otros trabajos se han usado las tecnicasconvencionales para la inmovilizacion de losmicroorganismos. Briglia y col. (1990) inmovilizaronRhodococcus chlorophenolicus y Flavobacteriumsp en poliuretano para estudiar la degradacionde pentaclorofenol en un suelo natural; losresultados obtenidos demostraron la mineralizaciondel pentaclorofenol en el suelo y la presenciade celulas similares a R. chlorophenolicus en elpoliuretano despues de un ano de la inoculacion. Su ycol. (2006) inmovilizaron Bacillus sp. SB02 y Mucorsp. SF06 en vermiculita por adsorcion fısica, lograndouna degradacion del 95.3% de benzo(a)pireno en42 d, resultados considerablemente mejores a loslogrados con las celulas libres. Karabika y col.(2009) realizaron pruebas en matraces Erlenmeyerde 250 mL que contenıan 50 g de suelo, adicionadocon 100 ppm de pireno y 106 celulas g−1 de suelo,inmovilizadas en una mezcla de alginato de calcioy almidon de maız. Aunque las celulas libresmostraron una mayor biodegradacion de pireno quelas celulas inmovilizadas, estas ultimas mostraron unamayor tolerancia al contaminante y mantuvieron sucapacidad de biodegradacion y su viabilidad hasta porun ano de almacenamiento a 4◦C.

El uso de alcohol polivinılico como soportepara inmovilizacion de microorganismos en el areaambiental se ha usado basicamente en sistemas detratamientos de agua aplicados a la inmovilizacionde bacterias metanogenicas (Hanaki y col., 1994)e inmovilizacion de lodos activados (Takizawa ycol., 1996), en este ultimo caso se han encontradodiversas limitaciones que han sido superadas medianteel uso de mezclas con otros agentes gelificantes.Por ejemplo, la capacidad del alcohol polivinılicopara retener suficiente humedad pudo superarse algenerar hidrogeles complejos de alcohol polivinılicoy alginato de calcio. (Doria-Serrano y col., 2002).Posteriormente este hidrogel complejo (fue aplicadopara desarrollar un sistema de degradacion de fenolcon operacion en la modalidad de cultivo continuo,aunque se reporto como una desventaja a considerarpara investigaciones futuras el hecho de que lamatriz puede ser inestable estructuralmente hablando(Hernandez-Esparza y col., 2006). Zhang y col.,(2007) mediante la adicion de ortofosfato lograronresolver la aglomeracion de las perlas de alcoholpolivinılico y la toxicidad que se presentan cuando

este se usa mezclado con acido borico. Partiendode las primeras aplicaciones ambientales del alcoholpolivinılico, Cunningham y col., (2004) demostraronsu uso exitoso en la remocion de diesel en una biopilaa escala de laboratorio al incorporar un materialhidrofobico durante la formacion de la matriz delsoporte. En este trabajo los autores sugieren queuna ventaja de este soporte es su baja degradabilidad,que puede garantizar que aunque sera eventualmentedegradado, esto no sucedera durante la fase activa debioremediacion, cuando el metabolismo microbianodebe ser encauzado a la degradacion del diesel. Si bienla resistencia mecanica del soporte fue adecuada paralas biolpilas a escala de laboratorio (con un mezcladomanual) no es posible predecir si dicha estabilidadpuede mantenerse en una escala mayor.

El uso de celulas inmovilizadas tambien se haextendido a sistemas de tratamiento de dos fases,como es el reactor de suelo en suspension a nivel delaboratorio. Li y col. (2005) estudiaron la remocionde fenantreno y pireno por la bacteria Zoogloea spinmovilizada en un soporte compuesto por alcoholpolivinilico, alginato de sodio y carbon activado. Sedemostro que al introducir las celulas inmovilizadasen el reactor con un suelo no esterilizado, labiodegradacion de los compuestos era el doble de laobtenida con las celulas libres, y ligeramente menora la obtenida cuando se uso un suelo esterilizado.Wang y col. (2008) inmovilizaron Trichoderma sp.,A.niger y Fusarium sp. en un soporte compuestopor alcohol polivinilico, alginato de sodio y carbonactivado, para probarlos en la degradacion de pirenoy benzo(a)pireno como pares o trıadas. En un cultivode suelo en suspension con una concentracion de 100mg kg−1 la mejor degradacion (81% de pireno y 43%de benzo(a)pireno despues de 240 h) se logro con lamezcla de A. niger y Fusarium sp. Esos resultadosdemostraron que los hongos inmovilizados fueron maseficientes que las celulas libres suspendidas para labiodegradacion de los compuestos.

Otras alternativas han sido el uso de arcillas para lainmovilizacion de Alcaligenes sp A 7-2 aplicado en labiodegradacion de 4-clorofenol en un suelo arenoso,usando un percolador (Balfanz y Rehm, 1991) o enun reactor de lecho empacado (Westmeier y Rehm,1987). Este ultimo sistema tambien fue aplicado enla degradacion de 2-cloroetanol por P. putida US2(Overmeyer y Rehm, 1995) y acido dicloroacetico porXanthobacter autotrophicus (Meusel y Rehm, 1993).

Se puede mencionar tambien el trabajo de Rubilary col., (2011), en el que emplearon P. chrysospoiurmy Anthracophyllum discolor inmovilizados en granos

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de trigo para remover pentaclorofenol de un suelo conuna concentracion inicial de 350 mg Kg de suelo−1.Los investigadores reportaron un incremento de labiodegradacion en ensayos realizados en matracescon suelo contaminado, y senalaron que en el casoparticular de los hongos de la pudricion blanca, losmateriales lignocelulosicos usados como soporte parainmovilizacion tambien pueden funcionar como fuentede nutrientes, y por ende promover la produccion deenzimas asociadas a la degradacion de contaminantes,ademas de dar proteccion a la celula ante diferentescondiciones de estres.

A traves del analisis de los trabajos citadoses evidente que existe una falta de informacionsobre el transporte de contaminantes en sistemasinmovilizados cuando se realizan estudios debiodegradacion en suelos. Sobre todo el panoramapodrıa tornarse mas complejo cuando en el sistema seusan soportes de tipo hidrofılico y los contaminantesson hidrofobicos. Considerando esta incompatibilidadCunningham y col., (2004) incorporaron unmaterial oleofılico en la preparacion del soporte deinmovilizacion, que favorecio el consumo del diesel,sin embargo los autores reconocen que hay muchoscuestionamientos no resueltos acerca de la difusividadde los n-alcanos dentro de la matriz del soporte.

En la Fig. 3 se muestra una representacionesquematica en la transferencia de masa de uncontaminante hidrofobico que esta sorbido en unsuelo y que debe difundir hacia el soporte donde seencuentran los microorganismos. En sistemas solidosconvencionales cuando el contaminante esta sorbidoen los microporos del suelo se sabe (Medina-Morenoy col., 2009) que el paso limitante es la difusionen los poros de la matriz del suelo (paso 1), peroen los sistemas inmovilizados como se describe acontinuacion puede presentarse otro paso limitante.Una vez que el contaminante ha sido transportadohacia la fase lıquida circundante a la partıcula desuelo, la presencia de agentes de tension superficialproducidos por los microorganismos, puede favorecersu disolucion y difusion en la fase liquida (paso 2)para alcanzar el soporte. En este punto surge unaresistencia adicional en los sistemas inmovilizados.El compuesto es transportado solo por difusion travesde los poros del soporte (paso 3). En la matriz delsoporte los contaminantes pueden quedar sorbidos enla pared del poro a traves de sus componentes polares,dejando los extremos no polares en el espacio poroso.Aquı, la presencia de tensoactivos puede incrementarla transferencia de masa favoreciendo el consumo ytransporte difusivo de contaminantes a traves de la

matriz del soporte para llegar a los microorganismos.El esquema antes propuesto puede ser valido para

cualquier sustrato insoluble, incluyendo el oxıgeno.Los problemas difusionales que se mencionan puedenminimizarse a traves del control del tamano delporo del soporte optimizando los procesos deinmovilizacion.

Fig. 3. Representacion esquematica del transportedifusivo de contaminantes en sistemas solidos. Lavista microscopica permite visualizar los pasosimplicados durante el transporte: paso (1) transportedentro de la partıcula de suelo, paso (2) transporte en lafase lıquida y paso (3) transferencia dentro de la matrizdel soporte de inmovilizacion.

ConclusionEl uso de microorganismos inmovilizados ha sidoampliamente explorado, tanto a nivel industrial comode investigacion, pero en el campo de la biotecnologıaambiental aun queda mucho por hacer. En lo querespecta a los soportes que se han utilizado paraeste fin, el poliuretano podrıa considerarse comoel mas eficiente, debido a su alta resistencia yporosidad. Sin embargo, tambien se han probadodiversos soportes de tipo natural, por considerarse masadecuados debido a su biodegradabilidad. Aunquedichos soportes han mostrado su factibilidad parainmovilizar microorganismos y usarlos en distintosprocesos ambientales, todavıa existe la necesidad deprofundizar en los estudios que permitan mejorarsu resistencia mecanica, o bien en la busqueda demicroorganismos que eventualmente puedan degradarel poliuretano, y que al ser incorporados en elsistema de inmovilizacion garanticen la desapariciondel soporte del sitio a tratar una vez que se haconcluido la fase de degradacion del contaminante.

En lo referente a los aspectos cineticos, auncuando ya se ha trabajo en el tema, se requiere eldesarrollo de estudios minuciosos de los fenomenosde transferencia y de los aspectos cineticos querigen el consumo de contaminantes en sistemasinmovilizados, para la generacion de expresiones y

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modelos matematicos que expliquen la degradacion decontaminantes en sistemas de tratamiento de aguas ysuelos contaminados.

Por ultimo, aunque se han aprovechado lasbondades del uso microorganismos inmovilizados enalgunos procesos ambientales, son pocos los estudiosde aplicacion de estos en suelo, debido probablementea las complicaciones que podrıan encontrarse al llevarlos procesos a un tratamiento a gran escala. Mas aun,es necesario realizar pruebas en campo que permitanestablecer la factibilidad tecnica y economica del usode microorganismos inmovilizados para remover delsuelo compuestos contaminantes de forma segura yfactible, con lo que sera posible el desarrollo de lastecnologıas adecuadas para tal fin.

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