Replicación del DNA

Replicación cromosoma circular E.coli

Replicación cromosoma circular E.coli

OriC E. coli

Secuencia rica en T-A

Mutantes termocondicionales

wt

40oCdnaB, dnaC

control

H3

T

t

wt

b

a30oC

30oC

dnaA

1) Nucleasa + DNA Ori

2) pp dna A + DNA Ori

3) pp dnaB + DNA Ori

4) pp dnaC + DNA Ori 245

1 2 3 4

1

Conclusión: Dna A reconoce el sitio de inicio de la replicación

Secuencia del origen de replicación bacteriano

Región de los treceámeros

(tres repeticiones de 13

nucleótidos), 70% AT4 Nonámeros o cajas dnaA

Proteína DnaA

• Monómero 52kDa

• Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas

dnaA

• Estequiometria de 20 subunidades de DnaA por oriC

• Une ATP y lo hidroliza a ADP en forma dependiente de DNA• Une ATP y lo hidroliza a ADP en forma dependiente de DNA

• Complejo DnaA-ATP mayor afinidad por el DNA

• Una vez abiertos los treceámeros DnaA se sienta en las

cadenas sencillas

Reconocimiento del oriC

DnaA reconoce el origen, lo activa

y lo protege

DnaB

• Monómeros de 50kDa que

forman un homohexámero

• Actividad de helicasa

• Dominios para :

� Unión a DNA de cadena

doble

� Unión a DNA cadena sencilla

• Dna C homohexámero que

permite la llegada de DnaB

• ATPasa: al hidrolizar ATP

pierde afinidad por DnaB

Dna C

� Unión a DNA cadena sencilla

� Interacción con la proteína

DnaC

� Hidrólisis de ATP

La helicasa rodea una de las hebras del DNA dúplex y se desplaza rompiendo

puentes de hidrógeno, logrando la apertura de la doble hélice por exclusión

estérica. Una hebra es retenida en el interior del anillo y la otra es excluida.

DnaB -DnaC

SSB

Las proteínas SSB se unen con alta

afinidad al DNA de cadena sencilla y lo

protegen de nucleasas y de asociaciones

intracatenarias

Reconocimiento y

activación del oriC

Resumen

La replicación del DNA requiere un cebador

• Dna G. Primasa

• RNA polimerasa

• Sintetiza cebador de• Sintetiza cebador de

≈ 12nt

• Primasa reconoce a DnaB

DNA Pol I

• A. Kornberg

• primera polimerasa descrita

• Péptido de 103 kDa

• Dependiente de molde de

• DNA

• Dirección de la síntesis 5´-3´

• Requiere extremo 3 ´OH

Actividades de la DNA polimerasa I

• Mutantes de E.coli en el gen de la Pol I son “viables” por lo

tanto la DNA polI no es la principal enzima replicativa

• La DNApolIII es la principal enzima en la replicación del DNA

DNA polimerasas bacterianas

Enzima gen Polimerización

5´-3’

Actividad

exonucleasa3´-5´Actividad

exonucleasa

5´-3´

Función

principal

I polA + + + Reparación

II polB + + - Reinicio de la

replicación,

reparación

III polC + + - Replicasa

Subunidades de la DNApolimerasa III de E.coli

sub # por

holoenzima

Mr Función

dnaE α 2 132,000 Subunidad catalítica

dnaQ ε 2 27,000 Proofreading

holE θ 2 10,000 Acoplador

dnaX τ 2 71,000 Dimerización

Núcleo de la

polimerasa

dnaX τ 2 71,000 Dimerización

dnaX γ 1 52,000

holA δ 1 35,000

holB δ´ 1 33,000

holC χ 1 15,000

holD ψ 1 12,000

dnaN β 4 37,000 Procesividad

Abrazadera que

carga las

subunidades β al

DNA

Complejo γ ó

complejo τ

• Fidelidad se refiere al seguimiento exacto de la secuencia

de DNA que sirve como molde

• La fidelidad de la replicación en bacterias: ≈10-8 a 10-10• La fidelidad de la replicación en bacterias: ≈10 a 10

• Procesividad # de nucleótidos que se sintetizan en un

solo evento de unión. Una enzima procesiva agrega muchos.

• Distributividad. Se refiere a la síntesis que avanza

agregando pocos nucleótidos por evento de unión

Formación de la

holoenzima

Procesividad de la DNApolimerasa III

L a procesividad de la DNApolII aumenta de

50nts a más de 50,000nts gracias a las

subunidad β

La replicación es semidiscontinua

Fragmentos de Okazaki 1200-2000 nt

Interrupción de la replicación de la cadena retrasada

El molde de la cadena

retrasada se debe doblar

para parecer que va en la

misma dirección que la misma dirección que la

cadena adelantada

RNasa H ayuda a remoción del cebador pero

no es eficiente eliminando desoxinucleótidos

(el último del cebador)(el último del cebador)

DNA polimerasa I ayuda a remover el

cebador, actividad exonucleasa 5´-3´Actividad de polimerasa reemplaza los

nucleótidos eliminados ≈17

DNA ligasa cataliza la

formación de enlace

fosfodiéster

DNA ligasa

Topoisomerasas

Topoisomerasas ITopoisomerasa I

Topoisomerasa III

Topoisomerasas IITopoisomerasa II

(DNA Girasa)

Topoisomerasa IV

Toposiomerasas I

• Topoisomerasas II

Girasa

• Topoisomerasas II

Topo IV Decatenasa

Termino de la replicación

Síntesis del DNA

• Semiconservativa

• Dependiente cebador de RNA

• Semidiscontinua

• Bidireccional

Inicio de la replicación en eucariotes

Inicio de la replicación en eucariotes

Polimerasas de eucariotesDNA polymerases undertake replication or repair

DNA polymerase Function Structure

α High fidelity replicases

Nuclear replication

Polimerasa-primasa

350kDa tetramer

δ Nuclear replication

Cadena discontinua

250kDa tetramer

ε Nuclear replication

Cadena continua

350kDa tetramer

γ Mitochondrial replication 200kDa dimer

β High fidelity repair

Base excision repair

39kDa monomer

ζ Low fidelity repair

Thymine dimer bypass

Heteromer

η Base damage repair Monomer

ι Requiered in meiosis Monomer

κ Deletion and base substitution monomer

Cdt1

Proliferating Cell Nuclear Antigen

PCNA

�Proteína 29kDa

�Incrementa procesividad

de la DNApol delta ≈ 40

�Forma un trímero

alrededor del DNAalrededor del DNA

Pol ε

Polδ

Terminación en eucariotes

El dilema de los cromosomas lineales

Terminación en eucariotes

Telomeros

Terminación en eucariotes

Telomerasa

Terminación en eucariotes

Telomerasa