Bacterial zinc transporters and regulators

ResumenLa homeostasis de Zinc 2+ en las bacterias se logra por sistemas de exportacion y aceptacin que se regulan separadamente por sus propios reguladores. Se han identificado tres tipos de sistemas exportadores de Zn 2+ que protegen a las celulas de concentraciones toxicas altas de zinc:transportadores de eflujo RND de multiples farmacos

ATPasas tipo P

facilitadores de difusion cationica

Los exportadores tipo RND para zinc son encontrados solamente en algunas bacterias gram negativas; permiten una exportacion muy eficiente atraves de la membrana del citoplasma y la membrana externa de la celula.ATPasas tipo P y facilitadores de difusion cationica pertenecen a familias de proteinas que se encuentran tambin en eucariotas.Los exportadores estan regulados en las bacterias por receptores y activadores MerR o por represores ArsR. Para la captacion de alta afinidad de Zn, varios transportadores ABC dependientes de union a proteinas que pertenecen a una clase, se han identificado en diferentes bacterias. Transportadores ABC de zinc son regulados por represores Zur, que perteneces a la familia proteica Fur de reguladores de hierro. Poco se sabe de la captacion de baja afinidad de Zn en condiciones altas (*zinc-replete conditions) de zinc. Un ejemplo conocido es el sistema de absorcin de fosfato Pit, que puede cotransportar zinc +2 en E. coli. Similarmente, el cotransportador de citratp-metal CitM en Bacillus subtilis puede ayudar a suministrar zinc +2.

IntroduccinEl zinc es, para la mayora, si no todas las bacterias, un oligoelemento esencial. Muchas enzimas bacterianas contienen zinc en el centro activo o en un sitio estructuralmente importante, el gran grupo de las protenas de unin al ADN con motivos dedos de zinc, sin embargo, se encuentran principalmente en las clulas eucariotas, y rara vez en las bacterias (Clarke & Berg 1998). En 1974, Bucheder y Broda mostraron en un estudio cuidadoso que la absorcin de 65Zn2 + en Escherichia coli es energydependent, en las clulas de hambre en condiciones anxicas, la absorcin es estimulada por la glucosa y es ms fuertemente estimulada por la adicin de oxgeno.

Slo recientemente, con la disponibilidad de mtodos de gentica molecular, tener ms detalles de Zn2 + bacteriana transporte y Zn2 + homeostasis sido revelado. la
primero transportadores identificados se muestran para conferir resistencia a las altas concentraciones de Zn2 +. En muchos casos, estos transportadores exportar, adems de Zn2 +, tambin otros iones txicos tales como CD2 +, Co2 +, y Pb2 +. En eucariotas, la resistencia a altas concentraciones de Zn2 + no slo se consigue mediante la exportacin, pero tambin mediante la unin a la metalotionena. Entre las bacterias, este tipo de protenas tiene hasta la fecha slo se ha observado en las cianobacterias (Robinson et al. 1998). Tambin, de alta afinidad de zinc-absorcin
los sistemas se han detectado bacterias que ayudan a vivir en extremadamente bajas concentraciones de Zn2 +, que se encuentran, por ejemplo, en el suero de los animales y los seres humanos. Adems, hay sistemas menos bien caracterizadas de baja afinidad de captacin que contribuyen a Zn2 + de alimentacin en + rica en un Zn2, pero el medio ambiente no txico.

La figura 1 muestra una visin general de los diferentes sistemas que se encuentran en las bacterias gram-negativas que crecen en condiciones de alta, media o Zn2 + bajas concentraciones. Ejemplos de diferentes bacterias se combinan en esta figura y sern tratados en los prrafos siguientes. Lo que es notable en la figura es la falta de sistemas de captacin.
No se han identificado transportadores especficos activos con Zn2 +-condiciones repletas. Slo unos pocos sistemas inespecficos son conocidos para el transporte de Zn2 + entre otros cationes divalentes. Aunque la membrana externa tiene muchos sitios de unin para cationes bivalentes, poco se sabe cmo Zn2 + pasa a travs de esta membrana. Bacterias Gram-positivas, que no tienen una membrana externa (Figura 1), tienen muchos sitios de unin para cationes divalentes en los cidos teicoicos, los fosfatos ribitol polimricos unidos a la capa de peptidoglicano de espesor. Estos sistemas parecen actuar como intercambiadores de cationes en la superficie de las bacterias.

Sistemas de Zn2 + de exportacin (1): la difusin de cationes facilitadores
Los altamente +-resistentes bacteria Ralstonia metallidurans gram-negativas Zn2 (anteriormente Alcaligenes eutrophus) CH34, aislado a partir de un tanque de decantacin de una fbrica de cinc, tiene una concentracin inhibitoria mnima para Zn2 + de 12 mM en un medio basado en Tris. El grupo de genes czcNICBADRS encontrado en un plsmido grande determina la resistencia alta de metal mediante la codificacin de dos sistemas para la exportacin de Zn2 +, Co2 + y Cd2 + (Anton et al 1999;.. Grosse et al 1999). CzcD es un miembro de la familia facilitador de difusin de cationes y exporta estos metales travs de la membrana citoplasmtica (Anton et al. 1999).

El Staphylococcus aureus Zn2 +-determinante de resistencia ZntA muestra identidad 38% a CzcD de Ralstonia eutropha (Xiong y Jayaswal 1998). Un mutante zntA es sensible a 0.5 mMZn2 + en comparacin con 5 mM de la cepa madre. ZntR, un miembro de la familia ArsR, regula la expresin de zntA. La nomenclatura es muy lamentable, ya que estas protenas ZntA y ZntR no estn relacionados con las protenas ZntA y ZntR de E. coli y otras bacterias, que se tratan ms adelante en esta revisin. Varios otros miembros de esta familia de protenas caracterizado en eucariotas tienen funciones importantes en la carga de vesculas con Zn2 + y en la exportacin de Zn2 + desde el citoplasma (Palmiter et al 1996.); En bacterias similitudes de secuencia indican una distribucin ms amplia (Paulsen y Saier 1997). Un homlogo en E. coli codificadas por ybgR tambin est presente en Zn2 + transporte (Patzer y Hantke, sin publicar).

Sistemas de Zn2 + de exportacin ( 2 ) : los exportadores de tipo RND
La protena CzcD parece ser la primera lnea de defensa de Ralstonia metallidurans contra altas concentraciones de Zn2 + , ya que en una expresin mutante czcD de los genes czcCBA es inducida y el mutante czcD es ligeramente ms sensible a Zn2 + que la cepa parental ( Anton et al . 1999 ) . Las protenas CzcA , CzcB , y CzcC forman un sofisticado sistema de transporte que exporta Zn2 + , Co2 + , y CD2 + a travs de dos membranas , la membrana citoplasmtica y la membrana externa , por lo tanto , posiblemente, tambin la proteccin del espacio periplsmico de R. metallidurans de los metales txicos . CzcA es un antiportador de cationes de protones se encuentra en la membrana citoplasmtica . CzcB parece ser una protena de conector que est lejanamente relacionado con AcrA ( 22 % de identidad de aminocidos ) , una protena situada en el periplasma como parte de una bomba de exportacin de acriflavina . CzcC tiene una relacin distante a TolC y puede conectar CzcB a la membrana externa , la formacin de un complejo de protenas CzcABC ( Rensing et al . 1997a ) . Esta disposicin permite la extrusin de los metales txicos desde el citoplasma en el medio . El sistema de exportacin de todo pertenece a la RND ampliamente distribuido (resistencia , nodulacin , divisin ) de la familia de protenas ( Tseng et al. 1999 ) . El CzcA protena por s sola y sin CzcB y CzcC permite que slo un bajo nivel de resistencia a iones metlicos. CZCS y CzcR pertenecen a la gran familia de los sensores de histidina quinasa reguladores de dos componentes . Los estudios con czcR y CZCS deleciones , fusiones lacZ y el anlisis de la sntesis de ARNm czcCBA bajo inducir y no inducir condiciones ha demostrado que CzcR / S regulan los genes CZC ( Grosse et al . 1999 ) . El sistema se indujo con 0,3 mM de Zn2 + y menos bien con 0,3 mM de Cd2 + , lo que indica una preferencia por Zn2 + .Sistemas de Zn2 + de exportacin (3): ATPasas de tipo P
ATPasas de tipo P, llamado as por la enzima aspartato fosforilada intermedia, forman una gran familia de protenas de membrana de cationes transporte que se encuentran en los eucariotas y las bacterias. Dos subgrupos relacionados con el transporte de Cu + y Ag + y Zn2 +, Cd2 + y Pb2 + (revisado por Gatti et al. 2000). Acd2 + - + andZn2 determinante de resistencia codificada por los genes cadA y CADC se ha encontrado en el plsmido de estafilococos pI258. En una cepa de Staphylococcus aureus, los genes clonados plantearon la concentracin inhibitoria mnima de Cd2 + de 0,005 mM a 2,56 mM, mientras que la concentracin inhibitoria mnima de Zn2 + se elev de 0,6 mM a 1,8 mM (Yoon y la plata de 1991). Estos valores ilustran la alta toxicidad de Cd2 + para la clula sin proteccin.

Cada es una ATPasa de tipo P ( Tsai et al 1992 . ) , Y CADC , importante para la resistencia completa , es una protena reguladora con similitudes a ArsR protenas , que regulan ATPasas de resistencia arsenito / Antimonite ( Shi et al 1994 ; . Rosenstein y col . 1994 ) . El sistema de transporte ada / C tambin se encuentra en la bacteria gram - negativa Stenotrophomonas maltophila y tiene 96 % de identidad de secuencia a la estafiloccica ada / C ( Alonso et al . 2000 ) . Este alto nivel de identidad de secuencia de las dos protenas indica un reciente transferencia horizontal de genes de cadA y CADC entre un gram-positivas y una bacteria gram - negativa . En Listeria monocytogenes , las protenas Cada y CADC relacionados ( 66 % y 48 % de identidad de secuencia de S. aureus Cada y CADC , respectivamente ) , son codificadas por un transposn en un plsmido y confieren slo Cd2 + resistencia y sin Zn2 + resistencia ( Lebrun et al . 1994 ) . La falta de Zn2 + resistencia pueden explicarse por la elevada resistencia intrnseca de la L. monocytogenes y B. subtilis cepas utilizadas ( a mM Zn2 + 7 y 3,5 , respectivamente) , lo que indica la presencia de Zn2 + exportadores adicionales codificados en el cromosoma. Tambin en S. aureus , la pI258 codifica protenas ada / C aument el Zn2 + nivel de resistencia slo por un factor de 3 lo que indica que la proteccin de Cd2 + puede ser la funcin principal .

La protena de E. coli ZntA, otro miembro de las ATPasas de tipo P, confiere Cd2 + y Zn2 + resistencia (Barba et al 1997;.. Rensing et al, 1997b). El contenido de Zn2 + de E. coli se ha estimado como una concentracin nominal de 0,6 mM si todo fuera gratis (Kung et al. 1976). En clulas de mamferos este valor se ha estimado en 0,2 mM (Palmiter y Findley 1995). La concentracin de libre Zn2 + es difcil de determinar, los resultados dependen de los mtodos utilizados. Los estudios in vitro sugieren que tiolato enlazado Cd2 + o Zn2 + son los mejores sustratos para ZntA (Sharma et al. 2000). En la clula, la mayora de estos metales podra ser atado como tiolatos de cistena o glutatin. La funcin principal de CadAand protenas ZntA-como parece ser la extrusin de Cd2 + y Pb2 +, Zn2 +, mientras que la exportacin parece ser slo una funcin adicional.

En Proteus mirabilis, una mutacin en un homlogo ZntA conduce a un comportamiento defectuoso enjambre con la migracin ms lenta que la cepa parental (Lai et al 1998;.. Rensing et al 1998). Esta inusual fenotipo podra surgir a travs de la homeostasis alterada Zn2 + que tiene un efecto sobre la diferenciacin de clulas enjambre.

En los seres humanos, dos ATPasas de tipo P homlogos transportar cobre. Las mutaciones en estas protenas causan trastornos del metabolismo del cobre conocido como enfermedades de Wilson y Menkes. Para estudiar los efectos de las mutaciones de la enfermedad de Wilson en E. coli, se construyeron dos mutantes con mutaciones dirigidas al sitio en ZntA, His475Gln y Glu470Ala, los homlogos humanos de los que causan la enfermedad de Wilson. Ambas protenas mutantes muestran una actividad reducida de iones metlicos-ATPasa estimulada (aproximadamente 30-40% de la actividad de tipo salvaje) y son fosforilados mucho menos eficiente que las protenas de tipo salvaje. Estos resultados sugieren que las mutaciones afectan a las principales etapas en el proceso de transporte de ambos ATPasas de tipo P (Okkeri y Haltia 1999).

Los miembros de la familia Merr / ZntR o de la familia ArsR / SMTB regulan Pb2 + , Cd2 + , Zn2 + y extrusin
El regulador de zntA en E. coli , ZntR , induce zntA la transcripcin a 19 mM Cd2 + o Zn2 + 100 M ( Noll y Lutsenko 2000 ) . Tambin Pb2 + es un inductor eficaz del sistema ( Binet y Poole 2000 ) . ZntR es un regulador MerRlike que se une como un represor para el promotor zntA ; en presencia de Cd2 + o Zn2 + , ZntR se convierte en un activador transcripcional que cambia la conformacin de la regin promotora y hace que sea un mejor sustrato para la ARN polimerasa ( Outten et al .
1999 ) .

MerR es un regulador bien estudiado de un sistema de desintoxicacin Hg2 + . Hg2 + es reconocido por el resto de aminocido C82 a partir de un monmero del dmero Merr y por C117 y C126 de la segunda monmero de Merr . En un estudio sistemtico , mut MerR se proyect para otras especificidades de metal. Las mutaciones en 11 posiciones cambian la capacidad de respuesta de Hg2 + para Hg2 + y CD2 + ( Caguiat et al . 1999 ) , haciendo que el regulador de menos especfica . Curiosamente , en estos mutantes , la respuesta a Zn2 + cambi slo ligeramente .

Otras ATPasas de tipo P como CADA estn regulados por los miembros de la superfamilia ArsR / SMTB de represores . La estructura de SMTB ha sido resuelto . Se trata de una protena represora dimrica con un motivo tpico de hlice-giro -hlice , la disposicin de las tres hlices principales y la horquilla beta es similar a la HNF-3/forkhead , CAP y protenas toxina de la difteria represor (Cook et al. 1998 ) . Sin embargo , los sitios de unin de Zn2 + no se han caracterizado bien . Ambos tipos de reguladores, ArsR / SMTB y MerR / ZntR , se encuentran tambin en relacin con otros transportadores metlicos. Cada uno de estos reguladores regula muy especficamente slo un sistema .

Transportadores de la protena de unin - dependientes ABC coche de alta afinidad absorcin del metal .
De alta afinidad sistemas de captacin de Zn2 + en bacterias Gram - negativas y gram-positivas se han caracterizado . Una de la primera descrito fue en E. coli ( Patzer y Hantke 1998 ) . Durante la seleccin de recombinantes con fusiones lacZ reguladas por hierro utilizando el fago de transposicin MUD1 , se obtuvieron fusiones regulados por la disponibilidad de Zn2 + . Las clulas que transportan estas fusiones crecen como colonias rojas en agar MacConkey con Zn2 + - quelantes de complejos , lo que indica la desrepresin de la fusin lacZ, mientras que la adicin de ZnCl2 conduce a la represin y el crecimiento de colonias de color blanco . En placas de agar de nutrientes complejos , el crecimiento de estos mutantes se inhibe by5mMEGTAor 0.4mMEDTA.When ZnCl2 se vio en discos de papel de filtro , se observa una zona de crecimiento alrededor del disco . Otros metales, como el Ni2 + , Cu2 + , Mn2 + y Fe2 + , no estimulan el crecimiento. Una zona mucho ms pequea de crecimiento se observ con Co2 + , lo que podra sustituir a Zn2 + en algunas protenas y podra reducir la necesidad de Zn2 + .

El fago MUD1 haba insertado en uno de los tres genes que codifican un transportador de protena de unin dependiente de ABC . El znuA gen ( la absorcin de zinc ) codifica una protena de unin periplsmica , znuB codifica una protena de membrana , y znuC codifica el componente ATPasa del transportador . Para probar la funcin in vivo de estos genes , 65Zn2 + captacin se midi en los mutantes ZNU y en la cepa parental . En un medio HEPESbuffered , la absorcin de 65Zn2 + es la misma para los mutantes y la cepa parental . Slo cuando las clulas fueron pre - cultivadas en presencia de 5 mM EGTA qu el mutante toma inesperadamente ms 65Zn2 + que la cepa parental , lo que podra interpretarse como la induccin de otro transportador de Zn2 + en el mutante . La adicin de EGTA 0,5 mM al medio de transporte reduce la absorcin en un factor de 10 en la cepa parental inducida , mientras que no se observa absorcin en mutantes ZNU independientemente de las condiciones de crecimiento . Por desgracia, el Zn2 + concentracin en el medio captacin no se defini exactamente . De acuerdo con Zn2 + determinaciones , que estaba por debajo de 150 nM , y el Zn2 + concentrationwas libre incluso inferior a travs de la adicin de EGTA 0,5 mM ( en presencia de 3 mM de Mg2 + ) .

La bsqueda de similitud de secuencias revel que znuA pertenece a una gran familia de protenas que reconocen ya sea Zn2 + , Mn2 + o Fe vinculante? como su sustrato ( Figura 2 ) . Las protenas de unin de los transportadores ABC se haban agrupado en ocho grupos ( Tam y Saier 1993 ) , pero ya que estas protenas de unin a metales tenan nuevas caractersticas , se define como la familia de protenas de unin por Dintilhac et al grupo 9 . ( 1997 ) . Estos autores observaron que la competencia de los mutantes adcABC de Streptococcus pneumoniae es Zn2 +- dependiente. Los mutantes con mutaciones en el opern ADC tienen una tasa de crecimiento ms baja y son competencedefective durante una etapa despus de la interaccin con el pptido estimulante de la competencia . La competencia se restaura despus de la adicin de Zn2 + en el medio qumicamente definido . La secuencia predicha ADCA es similar a la de las protenas de unin de los transportadores ABC ( 22 % de identidad a znuA ) y tiene el N - terminal de caracterstica de lpidos de anclaje se encuentra en bacterias gram-positivas . Adcb es similar a componentes de la membrana de los transportadores ABC ( 29 % de identidad a ZnuB ) , y ADCC es una protena de unin a ATP ( 36 % de identidad con znuC .)

La protena PsaA ( neumococo superficie adhesina A) fue identificado como un segundo miembro de la agrupacin 9 protenas en S. pneumoniae ( Dintilhac et al. 1997 ) . La virulencia y la competencia de los mutantes PAAS son Mn2 +- dependiente. Las protenas estrechamente relacionadas con PsaA se han detectado en varios estreptococos caries asociadas . Las protenas FimA ( precursor de adhesina fimbrial ) y SCAA ( co - agregacin - mediar adhesina precursor ) haban sido implicados en la adhesin a monocapas de fibrina , la adhesin a la hidroxiapatita recubiertos de saliva , o de agregacin con una cepa de Streptomyces , ya que los mutantes con mutaciones en los genes respectivos mostrar una adhesin reducida y las protenas generadas anticuerpos protectores . Un doble funcin de estas protenas como protenas de unin de metal y adhesinas parece poco probable . Los mutantes con mutaciones en estos transportadores probablemente pierdan su condicin fsica necesaria para la virulencia y la adherencia. Desafortunadamente , muchos homlogos de estas protenas de unin son anotados en las bases de datos como adhesinas , que pueden ser correctos .

Una estructura cristalina de la protena de unin de PsaA Mn2 +-especfica de S. pneumoniae est disponible (Lawrence et al. 1998). Los cuatro cidos aminados H67, H139, E205 y D280 son vinculantes para el metal. Se ha sealado por Lawrence et al. (1998) que, en esta estructura, este sitio est ocupado por Zn2 + en una coordinacin tetradrica. Mn2 + se encuentra generalmente en una geometra octadrica, que es difcil de conciliar con PsaA ser una protena de unin a Mn2 +.

Troa es una protena de unin de metal en Treponema pallidum y tambin pertenece a la familia de protenas de unin de metal ABC clster 9. En la estructura cristalina, los cuatro cidos amino H68, H133, H199, D279 y se unen Zn2 + (Lee et al. 1999). En la Figura 2, es obvio que estos cuatro aminocidos estn colocados en los lugares equivalentes a las de los aminocidos implicados en la unin en la estructura de PsaA. Lee et al. (1999) sostienen que la diferencia-E205 en PsaA y H199 en Troa
-Podra ser responsable de la especificidad de sustrato de Troa para Zn2 + y PsaA para Mn2 + (Lee et al 1999;.. Deka et al 1999). Sin embargo, los genes troABC que codifican el transportador ABC de metal estn regulados por la DtxR homlogo TroR, que slo acepta Mn2 + y no Zn2 + (Posey et al. 1999), y la alta similitud con las protenas de unin con Mn2 + especificidad argumentan a favor de un Mn2 + especificidad de este sistema de transporte (Figura 2). Se necesita ms investigacin para aclarar este punto.

Un informe reciente sobre el proteinMtsA estrechamente relacionado de Streptococcus pyogenes desafa an ms la situacin . La protena de unin MtsA muestra la identidad ms de 70 % a PsaA , SCAA , y FimA , que han demostrado ser transportadores de manganeso . En contraste , recombinantMtsA no muestra una interaccin especfica con Mn2 + , pero lo hace con Cu2 + , Zn2 + , y Fe3 + in vitro, y un mutante MtsA tiene un contenido de hierro 50 % inferior y un Zn2 30 % inferior + Contenido de la cepa parental ( Janulczyk et al. 1999 ) . A partir de estos resultados , se ha postulado que los genes codifican mtsABC un sistema de transporte dependiente de la protena de unin con una especificidad de metal muy amplio para Cu2 + , Fe3 + , Zn2 + y . Experimentos de transporte con el mutante MtsA y la cepa parental deben verificar los postulados.

El sistema de transporte de YFE ( Figura 2 ) transporta el hierro y el manganeso y tambin posee una inusualmente baja especificidad ( Bearden & Perry 1999 ) . La familia de la protena de unin dependiente de los sistemas de transporte y la controversia en torno a su especificidad de metal grupo 9 ha sido discutido ampliamente por Claverys ( 2001 ) .

Sistemas de captacin de Zn2 relacionados + protena de unin dependiente en otras bacterias tambin se han caracterizado. En B. subtilis, los genes ycdHIyceA estn regulados por Zn2 + y el represor Zur. Dos lneas de evidencia sugieren que el opern ycdH codifica una alta afinidad Zn2 + transportista. En primer lugar, un mutante ycdH se altera en el crecimiento de bajo Zn2 + medio. En segundo lugar, la mutacin de ycdH altera la regulacin tanto de la yciC (un gen regulado por Zn2 + y el represor Zur) y operones ycdH de tal manera que se requieren niveles mucho ms altos de Zn2 + exgeno para la represin (Gaballa y Helmann 1998). Adems, las protenas codificadas pertenecen a la familia de la protena de unin dependiente de transportadores ABC clster de metal 9.

La protena de unin a Zn2 + Pzp1 de Haemophilus influenzae fue aislado porque es un homlogo de la protena FimA estreptoccica. Se esperaba Pzp1 ser una adhesina (vase ms arriba), pero ms tarde estudios indic una ubicacin periplsmico. La protena recombinante purificada de E. coli contiene dos iones Zn2 + por monmero. Un mutante pzp1 ha demostrado ser defectuoso en el crecimiento. Supresin se logr mediante la adicin de 100 mM de Zn2 +, mientras que ninguna supresin se obtuvo con 100 MCa2 +, Mg2 +, Cu2 +, Ni2 +, Cd2 +, Mn2 +, o Fe3 + (Lu et al. 1997). Co2 + no ha sido probado. Un mutante znuA de Haemophilus ducreyi muestra una fuerte disminucin de la virulencia (Lewis et al. 1999).

La protena Pzp1 contiene una regin extendida rica en histidina, aspartato, y los residuos de glutamato, HHEHFHEDGDHDHDHK HEHKHDHKHD HDHDHDHKHE HKHDHEHHDH DHHEGLTTNW HVW, que puede tener una funcin en la unin de Zn2 + o Zn2 + entrega a otras protenas. Es interesante observar que slo Zn2 + inequvoca protenas de unin contienen este H-, D-, y la estructura E-rico delante del motivo HXW conservada (posicin 171/173 de Pzp1 en la Figura 2). H171 est en una posicin de unin Zn2 + en las estructuras cristalinas de PsaA y Troa. Los estudios estructurales de Pzp1 en comparacin con otras protenas znuA con regiones ricas en histidina mucho ms pequeos sera interesante.

Zur es un regulador de varios sistemas de captacin de alta afinidad de Zn2 +
Con el fin de identificar el regulador de Zn2 +-dependiente de los genes ZNU en E. coli, se aislaron mutantes constitutivos y se ensayaron para la complementacin de un banco de genes de E. coli. Un gen de complementacin, yjbK del genoma de E. coli, fue identificado y nombrado zur (para la regulacin de la absorcin de zinc). La protena Zur muestra 27% de identidad de secuencia con la piel del regulador de hierro. Highaffinity 65Zn2 + transporte de la mutante zur constitutiva es diez veces mayor que la de la cepa parental no inducido (Patzer y Hantke 1998).

Por inactivacin del gen zur , se ha demostrado que Zur acta como un represor y no como un activador . Algunos mutantes alelos zur cromosmicas han sido secuenciados para correlacionar la prdida de la funcin de Zur con individualmutations . De tipo salvaje y mutante protenas Zur se han purificado a homogeneidad electrofortica. Una parte considerable de las protenas mutantes Zur , excepto Zur ? 46-91 , se acumulan en cuerpos de inclusin . De tipo salvaje y Zur Zur 46-91 formulario? Homo - y heterodmeros . La dimerizacin es independiente de iones metlicos , ya que tambin se produce en presencia de quelantes de metales ( Patzer y Hantke 2000 ) . El uso de un ensayo in vivo de titulacin en , el sitio proporcionando regulacin Zur se redujo a una regin de 31 pb en la regin promotora de znuA y znuCB . Esta ubicacin se confirm mediante ensayos de footprinting DNasa I . Una nica regin que comprende un palndromo casi perfecto est protegido , lo que indica la unin directa de Zur . Quelantes de zinc inhiben completamente la unin de Zur ADN , y la adicin de Zn2 + en concentraciones bajas mejora la unin . Zur ocupa su sitio de unin slo en la presencia de Zn2 + u otros cationes metlicos divalentes a bajas concentraciones , como se muestra por DNasa I de la huella . Zur protege un palndromo aproximada de 29 nt en cada hebra de la ZNU operatorwith un 3 ? escalonamiento de 4 nt ( Patzer y Hantke 2000 ) . Esta huella se asemeja a la de ADN tpico dmeros , como las protenas clsicas hlice-giro -hlice , por ejemplo, el represor CI del bacterifago ( Jordan & Pabo 1988 ) vinculante. El observado 3 ? escalonamiento es indicativo para la cobertura del surco menor en los extremos , pero no proporciona informacin acerca de los contactos de reconocimiento protena-DNA . Anlisis de las protenas mutantes Zur propuso un dominio aminoterminal de contactos de ADN alrededor de 65 residuos y una dimerizacin carboxi - terminal y del dominio de unin a Zn2 + . Footprinting experimentos han indicado que aunque la mayora de las protenas Zur mutantes se unen a la ZNU promotor in vitro , se observ ninguna proteccin in vivo ( Patzer y Hantke 2000 ) .

Zur est activo slo en la forma reducida . Como una protena citoplasmtica , ha reducido predominantemente en lugar de tioles oxidados disulfuros debido a las condiciones de reduccin en el citoplasma ( Gilbert 1990 ) . In vitro, los residuos de cistena de Zur se oxidan fcilmente a disulfuros , como se juzga por la migracin ms lenta en geles de SDSpolyacrylamide bajo condiciones de reduccin en comparacin con condiciones no reductoras . Oxidado Zur no se une el ADN o cantidades considerables de Zn2 + . Esto podra indicar que Zn2 + se une principalmente por algunos de los nueve cistenas encontradas en Zur . En E. coli de la piel , slo hay cuatro cistenas , todos los cuales se conservan en Zur . Al menos dos o tres iones Zn2 + por dmero se unen especficamente a Zur ( Patzer y Hantke 2000 ) . Queda por ver si uno de estos iones Zn2 + se limita para el mismo sitio en Zur como se encontr en la piel de las cistenas conservadas (posiciones 92 y 95 , . Jacquamet et al 1998) . Estos dos cistenas se encuentran en todas las protenas Fur- como excepcin los de Pseudomonas y organismos relacionados. La actividad represora de la protena Zur es Zn2 + especfica ya que la adicin de Cd2 + , Hg2 + , Pb2 + , Mn2 + , Fe2 + , Cu2 + y condujo a una desrepresin del sistema de transporte ZNU in vivo ( Patzer y Hantke 2000 ) .

Zur , como Fur , que parece ser muy extendida entre las bacterias , incluso en las bacterias gram-positivas y cianobacterias , segn lo indicado por la bsqueda de similitud de secuencias. Sin embargo, slo en algunos casos tiene un Zn2 + funcional - ha demostrado regulador dependiente. Dado que los pequeos cambios en la sequencemight cambian la especificidad de metal , predicciones siempre tienen que ser examinados . En B. subtilis , aparte de Piel y PERR ( regulador de la respuesta al estrs de perxido ) ( Bsat et al . 1998 ) , la tercera homlogo de la piel - como YqfV puede actuar como Zur ( Gaballa y Helmann 1998 ) . La similitud de secuencia a E. coli Zur no es fuerte . Un gen zur tambin se ha encontrado en L. monocytogenes ( Dalet et al . 1999 ) . Con base en la similitud de secuencias , la protena Fur propuesto en Staphylococcus epidermidis ( Heidrich et al. 1996 ) puede ser Zur lugar de Fur . Es posible que otras protenas designadas como de piel de homologueswill resultan ser protenas Zur . En muchos de los genomas secuenciados parcialmente de diversas especies bacterianas , una Zur equivalente se encuentra , por ejemplo , en cepas de Salmonella , Klebsiella pneumoniae , Yersinia pestis , Vibrio cholerae , Bordetella pertussis , Caulobacter crescentus , Pseudomonas aeruginosa , y cepas de Neisseria . Dado que estos organismos tambin poseen un sistema homloga a ZNU , se ha propuesto que estas protenas son igualmente reguladores de Zn2 + captacin . Un alineamiento revela dos grupos de protenas Zur - Uno se encuentra en las bacterias gram-negativas, la segunda en las bacterias gram-positivas. Zur a partir de bacterias gram- positiva es ms similares que Zur a partir de bacterias gram-negativas a la piel de E. coli ( Patzer y Hantke 2000 ) . No se han encontrado evidencias de la autorregulacin del Zur o por la influencia de otros reguladores sobre el Zur . Zur tiene la funcin muy limitada de la regulacin de Zn2 + captacin y el metabolismo en un entorno pobre en Zn2 + . Hasta la fecha , adems del promotor znuA , slo otros dos sitios de unin Zur han sido identificados en el cromosoma de E. coli . No se han encontrado similitudes con los genes con funcin conocida .

Sistemas de absorcin de baja afinidad Zn2 +
Poco se sabe acerca de los sistemas de captacin de baja afinidad para Zn2 + en E. coli u otras bacterias . Estos sistemas son activos a concentraciones no txicas ricos de Zn2 + cuando znuABC es reprimida por Zur . Se ha observado cotransport de metales (van Veen et al. 1994) y Zn2 + (Beard et al. 2000 ) con fosfato a travs del sistema de transporte de fosfato inorgnico Pit . Este sistema parece ser el principal responsable de la captacin de Zn2 + , pero , posiblemente, tambin bajo ciertas condiciones se cataliza el flujo de salida por intercambio metal. En B. subtilis , se han encontrado dos sistemas que se rige por Zur y Zn2 + , el transportador encima de mentionedABC YcdHI , YCEA , y la protena de la membrana YciC , que se supone que es parte de un sistema de transporte de baja afinidad por Zn2 + ( Gaballa y Helmann 1998 ) . YciC tiene similitud con nitrilo hidratasa activacin de las protenas y puede tener una funcin en la homeostasis de Zn2 + y no en el transporte , pero no se ha estudiado an ms . En B. subtilis , la protena de la absorcin de metal citrato CITM ha demostrado tener una amplia especificidad para cotransporte de Mg2 + , Ni2 + , Mn2 + , Co2 + , y Zn2 + , sin embargo , Ca2 + , Ba2 + y Sr2 + son reconocidos por el diferente pero CITH transportador homlogo ( Krom et al. 2000 ) .

ZraG y ZraH regulan la proteina vinculante a Zn2 + ZraP
En E. coli la Zn2 + protena de unin periplsmica ZraP ( designacin anterior YjaI ) haba sido postulado para ser inducida por el ZntR homlogo PMTR de Proteus mirabilis ( Noll et al . 1998 ) . E. coli transformadas con un plsmido PMTR - codificacin crece mejor en la presencia de 1 mM de Zn2 + de la misma cepa transformada slo con el vector . Adems , ms ZraP se produce por el PMTR - que contiene la cepa de E. coli . Estudios recientes realizados por Leonhartsberger et al. ( 2001 ) indican que los efectos observados pueden ser indirectos . Su trabajo ha revelado que zraP es inducida por la autoregulated dos histidina quinasa reguladora ZraS componente del sistema / R codificada a una distancia de 237 pb a partir de zraP . ZraS , con la secuencia de la firma de un sensor de quinasa , se encuentra en la fraccin de membrana , y la unin especfica de la ZraR activador a la regin promotora de zraP y zraSR se ha demostrado . Adems de ser un Zn2 + periplsmico protena de unin , la funcin de ZraP es desconocido . Puede ser que sea una protena de unin a Zn2 + que protege las enzimas periplsmicas fromhigh Zn2 + concentraciones o puede ser un sensor de la concentracin de Zn2 + en el periplasma que se informa a ZraS . ZraS entonces actuara como transmisor de la seal , y ZraR podra inducir una protena desconocida , adems de ZraP y ZraS / R. La pregunta sigue siendo si otros genes estn regulados por ZraS / R. En qu medida contribuye a la CITM Zn2 + alimentacin en presencia de citrato no se conoce.

Es EDDS un zincophore ?
[ S, S ] de cido disuccnico de etilendiamina ( EDDS ) es producida por Amycolatopsis orientalis bajo Zn2 + - Condiciones lmite ( Zwicker et al 1998 . ) Y complejos de Zn2 + y otros cationes divalentes . EDDS es un ismero de la EDTA quelante bien conocido y est estructuralmente relacionada con ciertos siderforos ( quelantes de hierro ) . Los siderforos son producidos por bacterias y hongos en condiciones de hierro limitante . Los siderforos se unen especficamente Fe3 + ; estos complejos son absorbidos por los sistemas de transporte especficos que se encuentran en casi cada tipo de bacteria ( Braun et al 1998 . ) . Del mismo modo , es posible que A. orientalis utiliza EDDS como un zincophore para satisfacer sus demandas Zn2 + . Prueba experimental de esta hiptesis es insuficiente. E. coli es incapaz de utilizar Zn2 + unido a EDDS ( Patzer y Hantke 1998 ) .

Conclusiones
Transportadores de zinc han sido encontrados en las siguientes familias de protenas : RND transportadores de eflujo de mltiples frmacos , ATPasas de tipo P , facilitadores de difusin de cationes para la exportacin del txico Zn2 metal + , la protena de unin dependiente de ABC transportador y fosfato de metal o citrato cotransportadores para el captacin de Zn2 + necesaria para el crecimiento . Es notable que casi cada sistema est regulado por su propio regulador . En E. coli , tres reguladores - ZntR , ZraS / R , y Zur - son conocidos para responder a Zn2 + . Esto es claramente diferente de la regulationwhere hierro de la piel ( o DtxR en ciertas bacterias gram- positiva ) acta como un regulador global de muchos genes relacionados con la captacin de hierro y la respuesta al estrs oxidativo ( Hantke y Braun 2000 ) . Reguladores Zn2 + - dependiente de los sistemas de exportacin derepress o activan por encima de 0,1 mM Zn2 + , mientras que las protenas Zur - como derepress el sistema de absorcin por debajo del 10 M Zn2 + .

Es sorprendente que los informes sobre la especificidad de metal de diferentes transportadores ABC de unin a protenas dependientes que se encuentran en las bacterias patgenas son tan contradictorios. En las estructuras cristalinas de PsaA y Troa , Zn2 + se encuentra en el sitio de unin de metal , aunque las observaciones in vivo y la regulacin indican que Mn2 + es el sustrato principal ( Claverys 2001 ) . Es posible que estos transportadores son relativamente inespecfica porque el host regula sus Me2 + concentraciones dentro de ciertos lmites . Este entorno constante puede permitir la aplicacin "incontrolada" de diferentes cationes divalentes por el patgeno . Dado que estos sistemas tienen un impacto importante en la virulencia de los patgenos , este campo seguir siendo un tema de investigacin y los resultados se esperan con impaciencia .