صبغ والكشف المجهري للبكتيريا Microscopy and Staining

10 دكتور يوسف الشريك

المجهر تحت الشرائح فحص • - :المجهر تحت الشرائح فحص من الهدف•

:حجمها لضآلة المجردة بالعين تري ال التي الميكروبات عن للكشف •

أصغر أنها بحيث prokaryotic الخلية وحيدة نوع من البكتيريا خلية تعتبر1.

.Eukaryotic الخاليا متعددة نوع من

-.التالية بالطرق الضوئي المجهر تحت البكتيرية الخاليا عن للكشف2.

Wet mount طريقة•

عن للكشف استعماال، أكثر الطريقة هذه وتعتبر البكتيرية، اللطخة صبغ•

الحية البكتيريا تبين أنها يمكن عيوبها ومن المجهر، تحت البكتيرية

البكتيريا أشكال بين بها التفريق يمكن مميزاتها أهم ومن والميتة،

الطريقة بهذه ويمكن وغيرها،( شكل) وتنظيماتها كروية أو عصوية

الجرام لصبغة السالبة أو الموجبة، البكتيريا بين التفريق

زيت مع مكبرة عدسة يستعمل المجهر تحت البكتيرية خاليا على للكشف3. Oil immersion. بالكشف خاص

النواة غير الحقيقية

• pro·kar·y·ote

• [proh-kar-ee-oht, -ee-uh t] Show IPA

• nounany cellular organism that has no nuclear membrane, no organelles inthe cytoplasm except ribosomes, and has its genetic material in theform of single continuous strands forming coils or loops, characteristicof all organisms in the kingdom Monera, as the bacteria and blue-green algae.

النواة الحقيقية• Eukaryote

• An organism whose cells contain a nucleus surrounded by membrane and whose DNA is bound together by proteins (histones)into chromosomes

• The cells of eukaryotes also contain anendoplasmic reticulum and numerous specialized organelles not present in prokaryotes, especially mitochondria, Golgi bodies, and lysosomes.

• The organelles are enclosed in a threepart membrane(called a unit membrane) consisting of a lipid layer sandwichedbetween two protein layers.

• All organisms except for bacteria andarchaea are eukaryotes. Compare prokaryote.

-:وهما الحية البكتيرية عن الكشف لتجهيز طريقتان هناك•

.Wet mount المبتلة أو الرطبة طريقة1.

Hanging drop المعلقة النقطة طريقة2.

وترتيب شكل لدراسة الطريقة هذه تطبق Wet mount المبتلة أو الرطبة طريقة• -:التالية الطرق ها ومن الحركة، على البكتيريا قدرة واختبار البكتيرية، الخاليا

من التخلص مع التجربة، إجراء قبل أسبوع لمدة الماء، من مل 600 في التبن ينقع1. .الهوائية الفقاقيع

تكون بحيث ، النفطي الهالم من النظيفة، الشريحة منتصف في مربع إطار يعمل2. .الرقيقة الزجاجية الشريحة أبعاد نفس أبعاده،

.الرقيقة الزجاجية الشريحة منتصف في التبن، نقع محلول من واحدة، قطرة توضع3.

ويلصق ، اإلطار على تحتوي التي الزجاجية، الشريحة تقلب4. قطرة على المحتوية الرقيق، الزجاجية الشريحة بغطاء األخير

.بحذر التبن ماء

إلى الزجاجية الشريحة غطاء يصبح بحيث الشريحة تقلب5. .أعلى

كمية تقليل مع لدراستها، المجهر، تحت الشريحة توضع6. .العينية العدسة ،على الساقط الضوء

ثم ، ( X 10) قوتها بعدسة العينة في الدقيقة، األحياء تحديد7. كل عند اإلضاءة، قوة تعديل مع ، ( X 40) قوتها بعدسة . العدسة تغيير

عينة في الدقيقة، األحياء من مختلفة، أنواع وجود يالحظ8. هو كما وغيرها، كروية أو عصوية، بكتيريا وجود :مثل التبن،

.( 43) وشكل ( 3 ) و ( 2) جدول في موضح

طريقة النقطة المعلقة الختبار قدرة البكتيريا على الحركة•هدف ومبادئ هذه الطريقة مثل الطريقة الرطبة، ومن أهم •

-:التاليةمميزاتها

مراقبة حركة البكتيريا في نقطة معلقة داخل تجويف 1. زجاجي مغلق

.نادراً ما يحدث جفاف للشريحة2.

بقاء الخاليا في حالة نشطة لمدة أطول من الطريقة 3. .الرطبة

العملطريقة

تنظف الشريحة ذات التجويف تنظيفاً جيداً 1.Depression Slide مع غطائها بالماء الساخن

.والصابون إلزالة المواد الدهنية العالقة بها

النفطي الهالمتوضع أربعة نقط من الماء أو الفازلين أو 2.

.على كل زاوية من غطاء الشريحة بواسطة ناقل البيئة

قطرة من البيئة البكترية في وسط غطاء الشريحة توضع 3.

.الزجاجية الرقيقة

، الرقيقة الزجاجية الشريحة غطاء على الشريحة توضع4.

التجويف، وسط في للقطرة مقابال التجويف يكون بحيث

.الشريحة مع ملتصقا الغطاء يكون بحيث

البيئة نقطة وجود على الحفاظ مع بسرعة الشريحة تقلب5. .التجويف منتصف في البكتيرية

العدسة مستعمال المجهر، تحت المعلقة النقطة تفحص6.

الحجاب ويقفل قليال، المكثف يخفض ثم ، القوة الصغيرة

.بوضوح العينة رؤية من للتمكن اإلضاءة لتقليل جزئياً

مجال وسط في النقطة حافة لوضع الشريحة حافة تعدل7. .المجهري

بعد الزيتية، إلى ثم القوة، كبيرة إلى الصغيرة العدسة تغير8.

.الشريحة غطاء على ،السيدر زيت نقطة وضع

مع ببطء، الدقيق الضابط تحريك مع العينة، حافة تفحص9.

البكتيريا ترى حتى المكثف، بواسطة اإلضاءة، تعديل

.واضح بشكل

.المعلقة النقطة حافة عند البكتيريا، حركة الحظ10.

تجميع وطريقة البكتيرية، شكل برسم المالحظات تدون11. .حركتها ونوعية البكتيرية الخاليا

Simple Stainطريقة صبغ البسيطة البكتيرية اللطخة تحضير طريقة•

-:اللطخة تحضير من الهدف•

على النامية البكتيريا من متجانس رقيق غشاء تحضير هو1. والكشف لصبغها معينة صباغات إضافة ثم زجاجية، شريحة .المجهر تحت عليها

نوعية ولتحديد ،اللون عديمة البكتيريا بأن المعروف ومن 2. -:التالية الطريقة بأحد صبغها عملية إجراء يجب خالياها،

.البكتيرية اللطخة تحضير3.

ناحية من نوعيتها لتحديد اللطخة إلى األصباغ بعض إضافة4. .الجرام لصبغة موجبة أو سالبة

تحضير اللطخة البكتيريةطريقة والصابون، بالماء ، جيدا الزجاجية الشريحة تنظف1.

.وتجفف قطرها دائرة وترسم طرفيها؛ إحدى من الشريحة تمسك2.

.الشريحة من األسفل الوجه على سم، 1.5 المرسوم الشريحة وجه على الماء من قطرة توضع3.

.بكتيرية لطخه عمل لغرض بداخلها، الدائرة عليها الناقلة اإلبرة نهاية في ، (اللوبي )الحلقية عقدة تعقم4.

لمدة االحمرار،وتبرد درجة ،حتىبنزن موقد لهب ،على .ثواني 10

.المعقمة اإلبرة بعقدة البكتيرية، البيئة من كشطة تؤخذ5.

.سطح على الدائرة داخل بالماء، الكشطة خلط6.

.أخرى مرة المعدنية، العقدة عقم ذلك بعد7.

شريحة على السائلة، البيئة من بكتيرية لطخه تعمل8.

إلى مرتين المعدنية العقدة حجمها يكون بحيث أخرى،

،(وسلكها العقدة تعقيم يجب مرة كل وفي )مرات ثالثة

.جيدا توزيعا فيها توزيعها مع الدائرة، داخل إلى وتنقل

.أخرى مرة الحلقة تعقم9.

نفخ دون الغرفة، حرارة درجة عند لتجف، اللطخة تترك10. .عليها الهواء إمرار أو

اللطخة بإمرار الشريحة على اللهب مرتين أو ثالثة تثبت 11.

.مرات

من بيئة سائلة وبيئة صلبة طريقة تحضير اللطخة البكتيرية على شريحة زجاجية( 44)شكل

:البكتيرية اللطخة صبغ•

كيميائية، مواد البكتيريا تصبغ التي Dyes الصباغات تعتبر •

-: مثل حامضية تكون أن أما

.1Fuchsin Acid و Eosin المكونات مع تتفاعل التي

،سيتوبالزم -:مثل الخلية في القاعدية

Crystal البنفسجية البلورات أو سفرانين مثل قاعدية أو 2.violet الحامضية الخلية مكونات مع تتفاعل التي.

(44 )الشكل في موضح هو كما اللطخة تحضير يتم•

.معدني بملقاط تمسك أو ،(45 شكل) الصبغ حامل على الشريحة وضع1.

ثانية 60 – 30 لمدة المثيلين، بأزرق اللطخة تغمر2.

الزائدة، الصبغة إلزالة بعناية المقطر، بالماء الشريحة تغسل3. .المقطر الماء قنينة أنبوب بواسطة

.لتجف وتترك للرطوبة، ماص بورق برفق، اللطخة تجفف4.

كيفية إضافة الصبغة إلى اللطخة البكتيرية( 45)شكل

المجهر تحت اللطخة فحص•

المصبوغة، اللطخة تفحص• عدسة بواسطة المجهر تحت تفحص وبعدها ، 10X قوتها

قوتها التي الزيتية بالعدسة100X.

الشيئية بالعدسة الفحص عند• الزيت يوضع ؛(الزيتية)

دون اللطخة، على مباشرة .رقيق زجاجي غطاء

أو الرسم مع المالحظات تسجل• تحت يشاهد ما لكل التصوير،

.(64 شكل )المجهر

.بذلك خاصة بأوراق الشيئية، العدسة من الزيت تجفف•

.له المناسب المكان أو صندوقه، داخل المجهر يرجع•

عليها، من الزيت الموجود ويتخلص جيدا، الشرائح تنظف•

. لحفظها المخصص الصندوق في وتحفظ

صبغ البكتريا بصبغة جرام• أن الحظ عندما ،1884 في جرام هانس الطريقة هذه اكتشف •

وتستعمل .منها الزائد من التخلص عند ،الصبغة لون تفقد البكتيريا إلى وتقسيمها ،البكتيريا وتصنيف تشخيص في الطريقة هذه

بين الفرق ويرجع .الجرام لصبغة وموجبة ، سالبة مجموعتين، .البكتيري الخلوي الجدار لمكونات والسالبة، الموجبة الصفتين

-:هي خطوات أربعة على الطريقة هذه وتعتمد• البكتيريا جميع لصبغ ،(Crystal violet ) الرئيسية الصبغة استخدام1.

.البنفسجي باللون الرئيسية الصبغة بين األيونية الروابط لزيادة ،Iodine األيودين يستخدم2.

.والبكتيريا

يستخدم الكحول األثيلي، أو األسيتون كمادة مزيلة للصبغة من بعض 3. .، بينما تحتفظ البعض منها بلونهاالبكتيريا

، في صبغ البكتيريا التي فقدت صبغتها Safranin السفرانينتستخدم مادة 4. .بالكحول أو األسيتون، باللون األحمر

تسمممى البكتيريمما التممي فقممدت لممون الصممبغة الرئيسممية بكتيريمما •سمممالبة لصمممبغة الجمممرام، أمممما التمممي احتفظمممت بلمممون الصمممبغة

.الرئيسية تعرف باسم بكتيريا الموجبة لصبغة الجرام

:الجرام نظرية آلية صبغة • -:التاليةتعتمد هذه النظرية على النقاط •

تختلف البكتيريا لتقبلها الصبغة الرئيسية والصبغة 1. .الثانوية

جدار الخلية الموجبة لصبغة الجرام؛ أكثر سمكا 2.، الجرام من جدار خلية البكتيريا السالبة لصبغة

.من حيث التركيب الكيميائي

،على طبقة الجرام يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة •

، أكثر سماكًة من جدار البكتيريا بيبتدوجلوكان سميكة من (.47)الشكل أنظر السالبة لصبغة الجرام

أو السالبة الصبغة آلية تفسير يمكن النظرية، على وبناء• -:كالتالي الجرام لصبغة الموجبة

طبقة على الجرام، لصبغة الموجبة البكتيريا جدار يحتوي• مع مرتبطة السكريات متعدد ) بيبتيدوجلوكان من سميكة

جدارها، وانكماش إزالة الكحول لها يسبب التي ،(البيبتيدات تصبغ ثم ومن الرئيسية، الصبغة فقد معدل من يخفض بحيث .البنفسجي األساسي باللون

الجرام، لصبغة السالبة بكتيريا لجدار الخارجي، الغشاء يحتوي• ودهون السكريات ومتعدد البروتين، على محتوية طبقات على

من سميكة غير وطبقة السكريات، بعديد مرتبطة الكحول يقوم تم ومن خارجي، بغشاء محاطة ،بيبتيدوجلوكان

، األساسية الصبغة فقد من يزيد مما الدهون، إذابة أو بإزالة، .(األحمر) الثانوية الصبغة بلون جدارها ويتلون

العمل طريقة•

24 من أقل عمرها حديثة بيئة من البكتيرية اللطخة تحضير يجب• .ساعة

.جيداً تنظيفا شرائح ثالث تنظف–

الشرائح من شريحة كل على السفلي، السطح على دائرة يرسم– .منها كل على البيئات أسماء كتابة ،مع الثالثة

.شرحها سبق التي بالطريقة البيئات، من لكل لطخة تحضر–

-:كاآلتي وهي الصبغ طريقة•

نصف لمدة وتتركها ،Crystal violet بصبغة اللطخة تغمر1.

.دقيقة

غير بطريقة ثانية، 2 لمدة المقطر، بالماء بعناية الشريحة تغسل2. .(اللطخة على مباشرة الماء تسليط عدم ) اللطخة فوق المباشرة

لمدة اليود بمحلول اللطخة تغمر الشريحة، تجفيف بدون3. .دقيقة

إلى إثيلي كحول %95 يضاف الشريحة، غسيل بدون4. بين ما لمدة اللطخة، على لينساب ويترك الشريحة،

من كبيرة كميات خروج توقف حين إلى ثانية، 20 -10 إزالة مدة وتعتمد ،(ثوان بضع بعد غالبا) األساسية الصبغة والخبرة اللطخة، سمك أهمها كثيرة، العوامل على الكحول .وصبغها اللطخة تحضير في العملية

.دقيقتين لمدة المقطر، بالماء مباشرة الشريحة تغسل5.

.ثانية 20 لمدة وتترك ،السفرانين الثانوية الصبغة تضاف6.

وتجفف ثانية، 2 لمدة المقطر، بالماء الزائدة الصبغة تغسل7. .نشاف بورق

.لتجف تترك 8.

تفحص الشريحة بالمجهر تحت العدسات المختلفة، وتسجل •

(.48الشكل )المالحظات

Negative Stainالصبغة السالبة • الخاليا وترتيب شكل، لمعرفة السالب الصبغ استخدام يمكن•

خالياها، يشوه الذي الحراري، التثبيت تتحمل ال التي البكتيرية،

.Capsule (الحافظة ) البكتيرية السبورات ولصبغ

جدا، واضحة البكتريا تظهر السالب، الصبغ إجراء حالة في• .حولها التي الملونة للخلفية بالنسبة

مكونات صبغ تستطيع ال التي الحامضية، األصباغ تستعمل•

بحيث ،فقط الخلية حول الخلفية تصبغ ولكنها ،البكتيرية الخلية

بحيث الخلية، تتلون ال الوقت نفس ،وفي ملونة الخلفية تصبح

.معتم محيط في شفافة، كأجسام البكتيريا تظهر

العمل خطوات•

من والخالية النظيفة، الشرائح تستعمل• .الدهنية المواد

الصبغة من صغيرة قطرة توضع• إحدى على ،النيكروسين الحامضية،

.الشريحة طرفي

ملء الصلبة، المزرعة من عينة تؤخذ• صبغة من قطرة مع ، المعدنية العقدة

.توزيعها بدون لتجف وتترك ،نيكروسين

أخرى شريحة طرفي بأحد القطرة تلمس• يجب ويساراً، يميناً األخيرة وتحرك ،

اللطخة والصبغة،لتغطي البكتيريا توزعً لون إلى المعتم لون من بالتدريج .(49) الرمادي

.الغرفة حرارة درجة عند لتجف اللطخة تترك•

.(50) شكل المجهر تحت الشريحة تفحص•

الشيئية العدسة من زيت من وتخلص الشرائح، تغسل•

.جيدا تنظيفها بعد المناسب مكانها في األدوات تحفظ•

Acid-fast stain للحامض الثابت صبغ•

، Differential stain التفريقية الصبغ طريقة تستخدم • جنس من البكتيرية الخاليا قدرة تحديد في

Mycobacterium tuberculosis مرض تسبب ،والتي واللتان الجذام، مرض تسبب التيM. leprae و السل، عند الرئيسية، الصبغة على الحفاظ على القدرة لهما

،الكبريتيك وحامض ،األثيلي بالكحول معالجتها

عند الرئيسية، الصبغة تفقد البكتيريا أغلبية بأن وجد وقد • عائلتي أعضاء عدا بالكحول، معاملتها

Mycobacteriaceae و Norcardiaceae الرتبة من Actinomycetalesعلى خالياهم جدران تحتوي ،اللتان

تقبل ال والتي ،(Mycotic acid) الشمع تشبه دهنية مادة .الصبغات معظم من الصبغ جدرانها

العمل طريقة•

اللطخة بغمر (Ziehl-Neelsen method) طريقة وتعتمد •

كاربولفوكسين باسم تعرف بصبغة البكتيرية،

Carbolfuchsin، ويتم البكتيريا، في الصبغة دخول لتسهيل

،األثيلي الكحول – الحامض بمحلول اللطخة غسل ذلك بعد

ذلك لفعل المقاومة عدا ما الخاليا، جميع من الصبغة إلزالة

بدال المثيلين، أزرق صبغة تستخدم الوقت، نفس وفي المحلول،

. األولى الصبغة من

حامض في ، ذوبانا أكثر كاربولفوكسين صبغة أن وجد وقد هذا•

أكثر الدهون في أيضاً وتذوب الماء، من (الفينول )الكربوليك اللون كاربولفوكسين ويعطي ،األثيلي الكحول – الحامض من

.الدهن لمادة األحمر

-:كالتاليوتتم خطوات العمل •، والتي أخذت من بيئات البكتيرية تحضر اللطخة 1.

Mycobacterium phlei وE. coli.. ًوتجفف هوائيا ،

،فوق Rackتضع الشريحة المحتوية على اللطخة، على حامل 2. .حوض الغسيل

توضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح، لتثبيت الشريحة فوق 3. .الحامل

.كاربولفوكسينتضاف كميات كبيرة من صبغة 4.

، دقائق 5تسخن اللطخة والصبغة على بخار مائي يغلى لمدة 5.ويضاف مزيدا من الصبغة، كلما تطلب األمر ذلك، وال يسمح

.الصبغةبغليان

يتخلص من ورق الترشيح، وتغسل الشريحة جيداً بالماء 6. .المقطرً

بمحلول المصبوغة، اللطخة بمعالجة الصبغة، من يتخلص7. .ثانية 20 – 15 لمدة األثيلي الكحول – الحامض

.المقطر بالماء تغسل8.

.دقيقة نصف لمدة وتترك المثيلين، أزرق صبغة تضاف9.

.الترشيح بورق وتجفف المقطر، بالماء الشريحة تغسل10.

بنفس الثانية البكتيرية البيئة من أخرى، شريحة تحضر11.

.الطريقة

المالحظات وتدون المجهر، تحت الشريحتان تفحص12.

البكتيريا لصبغ موجبة األحمر، باللون تصبغ التي البكتيريا13.

األزرق بلون تصبغ التي البكتيريا أما للحامض، الثابت .للحامض الثابت البكتيريا لصيغ سالبة فهي

Capsule Stain الكبسوالت صبغ• يكون عندما ) الكبسولة لتوضيح السالب، الصبغ استخدام يمكن•

بسطحها، يلتصق والذي البكتيرية، الخلية حول (دائرياً أو بيضاوياً الكبسولة كون حالة في مخاطية طبقة وتعطي لزجة، طبقة مكوناً .الشكل منتظمة غير

-:يلي ما البكتيرية الكبسوالت لصبغ أساسيات أهم من • عديد من تتكون ألنها البكتيرية، الكبسوالت صبغ الصعب من1.

.البيبتيدات وعديد السكريات، كهربائية، شحنات تحمل وال الماء، في تذوب ال الكبسوالت معظم2.

.معها ترتبط ال البسيطة الصبغات هذه فإن لذلك وبسبب تصبغ الكبسولة؛ عن الكشف في تستعمل التي الصبغ طرق أغلبية3.

.الكبسولة تصبغ وال بها، المحيط والوسط البكتيريا فقدان تسبب الحرارة ألن لتثبيتها، بالحرارة اللطخة تعامل ال4.

.الكبسولة

:العمل طريقة•

أحد من ، تمسك ثم بالهواء، وتجفف بمطهر الشريحة تنظف• .زواياها

ةبواسط ، K. pneumoniae بكتيرية بيئة من عينة تؤخذ• .اللطخة لتجهيز الشريحة سطح على وتضع الناقل، عقدة

.الحرارة استعمال بدون بالهواء، لتجف اللطخة تترك•

.دقائق 10 – 5 لمدة crystal violet بصبغة اللطخة تغمر•

للتخلص ، CuSO4النحاس كبريتات بمحلول بلطف اللطخة تغسل• . الزائدة crystal violet الصبغة من

.الشريحة محتويات تجفف•

بنفسجي، لونها الخاليا وتالحظ المجهر، تحت الشريحة تفحص• لون ويكون اللون، عديمة أو اللون، باهتة زرقاء بهالة محاطة .(52 الشكل) أيضاً لذلك بنفسجي (األرضية )الخلفية

الداخلية( السبورات) األبواغصبغ •

، داخل خلية األبواغ، لتحديد مواقع السبورات الصبغ يستخدم •الداخلية هي لألبواغالبكتيرية، ومن أكثر األنواع المكونة

-:التالية، لألسباب والباسيليس، كلوستيريديومبكتيريا

الداخلية غير نشطة، ومقاومة للظروف غير مناسبة األبواغ•، أو أي ظروف بيئة الكيماويات للبكتيريا، سواء من الحرارة أو

.أخرى

ليست وسيلة للتكاثر، وتبقى البكتيريا في حالة سكون، األبواغ• .مواتيةطالما استمرت الظروف غير

.في عملية تصنيف البكتيريا األبواغتستخدم •

.الصبغاتغير منفذة لمعظم األبواغ•

.تستعمل الحرارة لتثبيت الصباغات•

ويظهر البوغ داخل الخلية الخضرية. محاط بغالف البوغ DNA الحظ ( 53)شكل

وسوف تفقد الخلية جزء الخضري منها مع مرور الوقت

العمل طريقة•

.زجاجيتان شريحتان تنظف1.

،سابتيلس لباسيليس بكتيريتين، بيئتين من لطخه جهز2.

ساعة،72 واألخرى ساعة، 24 – 18 أحدها عمر

.بالحرارة وتثبت بالهواء، تجفف3.

اللطخة، على الترشيح ورق من صغيرة قطعة توضع4.

الكامل التبخر لمنع ،مالكايت أخضر صبغة إضافة قبل

في وعليه ،األبواغ إلى تسربها قبل وجفافها للصبغة،

غشاء تمدد على التسخين يساعد األحوال، جميع

وتبقى الداخل، إلى الصبغة بدخول ويسمح ، األبواغ .بالتبريد البوغ داخل الصبغة

MALACHITE مالكايتتغمر اللطخة بصبغة أخضر •GREEN.

، ويضاف مزيد من دقائق 5تسخن على البخار لمدة •

.الصبغة، كلما أحتاج األمر لذلك

، وتغسل اللطخة بالماء مناسب ترمى الورقة في مكان •

.المقطر جيداً

.لمدة نصف دقيقة السفرانينتضاف صبغة •

.تغسل الشريحة بالماء المقطر وتجفف•

(.54شكل ) تفحص الشرائح تحت المجهر•

األبواغتقارن النتائج مع شرائح الجاهزة، ويالحظ مواقع •

( .55)في الخاليا المختلفة شكل

طريقة صبغ السبورات، ومثال على مواقع المختلفة للسبورات كما ( 54)شكل

.الشكل هو موضحه في الدائرة أسفل

البكتيرية أسواط صبغ• -:يلي ما األسواط صبغ أهداف أهم من•

.األسواط مشاهدة1.

.وموقعها األسواط ترتيب2.

.البكتيريا أنواع على للتعرف األسواط تستعمل3.

-:التالية البكتيرية أسواط صبغ أساسيات أهم ومن4.

صبغها يمكن ال الكسر، وسريعة جدا، رفيعة األسواط تعتبر5. .العادية بالصباغات

.قطرها من لتزيد معينة، وصبغة تقنية إلى األسواط تحتاج 6.

أو المعلقة، القطرة طريقة عن البكتيريا، حركة مالحظة يمكن7. .األسواط، صبغ طريق عن

:طريقة العمل•

، بتنظيف األسواطيجب أخذ الحيطة والعناية الفائقة؛ لمنع فقد • .الشرائح جيداً، مع تداول البيئة البكتيرية بعناية كبيرة

، حيث تنمو البكتيريا، الصلبة اآلجارتؤخذ قطعة من وسط بيئة • .مع عدم لمس المزرعة باليد

برفق على الشريحة بحيث تكون مواجهة اآلجارتوضع قطعة • .الطبقللنمو، ترفع تلك القطعة وتعاد إلى

.تترك البكتيريا الملتصقة بالشريحة•

.تجفف بالهواء، دون استعمال الحرارة•

المثبت لمدة Tannic acid التانيكتغمر الشريحة بحامض • .عشر دقائق

.تغسل الصبغة برفق بالماء المقطر•

، Carbolfuchsin كاربولفوكسينتغمر الشريحة بصبغة •

.لمدة خمسة دقائق

.تغسل برفق بالماء المقطر•

.،وبورق الترشيحبالهواًء تترك اللطخة تجف •

(.56)تفحص الشريحة تحت المجهر وتسجل المالحظات •

صلبة شبه النمو أوساط في البكتيريا حركة• من قليلة كميات على المحتوية صلبة، شبه النمو األوساط تستخدم•

حركتها، اختبار المراد بالبكتيريا النمو الوسط ويحقن اآلجار مادة نهايتها في عقدة بدون)حقن إبرة بواسطة النمو، الوسط داخل معينة، زمنية لمدة األنابيب وتحضن ، النمو أنابيب في (57شكل

حصلت التي التغيرات المالحظة بمجرد مباشرة المالحظات وتؤخذ . الغذائي الوسط في

دائرية حلقة نهايته في توجد ال أنه الحظ الحقن إبرة (57)شكل

الغذائي، الوسط في اآلجار من القليلة التركيزات تسمح •

الطعن، منطقة خالل من محدودة بحركة البكتيريا بتحرك

منطقة في النمو تفرع حدوث نتيجة الحركة وتحدد

أمالح مثل معينــــة صبغة إضافة ويمكن الطعن، تفرع لمالحظة ،Tetrazolium salt (TTC) تترازيوليوم

.(اللون فجلي) الفاتح األحمر بلون النمو

بنفس وتسحب مستقيمة، بطريقة اإلبرة حقن يجب •

.(58شكل) جيدة نتائج على للحصول الطريقة،

الحركة على البكتيريا قدرة اختبار•

•Motility Determination

على للتعرف الحركة، على البكتيريا قدرة اختبار طريقة تستخدم • ذلك، على اختبار لها يجرى حيث ،(الجنس ) النوع مجهولة بكتيريا

من نوعان وهناك المجهري، الحقل خالل حركتها مدى مالحظة ويتم :وهما الحركة

.(آخر إلى مكان من الحركة ) فعلية حقيقة حركة–

.(ونية برا حركة) ارتجاج أو اهتزازات شكل على كاذبة حركة–

وهي الحركة على البكتيريا قدرة معرفة بها يمكن طرق عدة توجد• -:كاآلتي

Wet-Mount الرطبة الطريقة•

Hanging Drop المعلقة النقطة طريقة•

Culture Method المزرعية الطريقة•

المعلقة النقطة وطريقة المبتلة أو الرطبة طريقة شرح سبق لقد •

الوسط في اآلجار من القليلة التركيزات تسمح•

خالل من محدودة بحركة البكتيريا بتحرك الغذائي،

تفرع حدوث نتيجة الحركة وتحدد الطعن، منطقة

صبغة إضافة ويمكن الطعن، منطقة في النمو Tetrazolium تترازيوليوم أمالح مثل معينــــة

salt (TTC)، األحمر بلون النمو تفرع لمالحظة

.(اللون فجلي) الفاتح

وتسحب مستقيمة، بطريقة اإلبرة حقن يجب • .(58شكل) جيدة نتائج على للحصول الطريقة، بنفس

Isolation Techniquesالبكتيريا عزل تقنية• Streak Plate Method األطباق بتخطيط العزل طريقة •

of Isolation

-:األطباق بتخطيط البكتيريا عزل من الهدف •

من نقية، مستعمرات على للحصول الطريقة هذه تستخدم • لألسباب وذلك األخرى، األنواع من عديد على محتوية بيئة

-:التالية

االنتشار واسعة الطريقة هذه تعتبر1.

البيئة، في الدقيقة األحياء وكثافة أعداد لخفض تستخدم2. .المرغوبة غير األنواع من عزلها سهولة ثم ومن

المعروف من ) نقية مستعمرة معزولة مستعمرة كل تعتبر3. .(فقط واحد نوع من بخلية تبدأ مستعمرة كل بأن نظريا

:العمل طريقة•

:المتعامد التخطيط طريقة•

عند ،بيتري أطباق في المغذي اآلجار بيئة تصب1.

.وتتصلب لتبرد وتترك م، 45º درجة

بكترية بيئة في المعقم، المعدني الناقل عقدة تغمر2.

.منها العزل المراد المادة معلق من أو ، مختلطة

حافة عند ،اآلجار سطح على صغيرة مساحة تخطط3.

المجففة، الناقل بعقدة السطح بلمس ،بيتري طبق

اآلجار سطح يخرج ال حتى ضغط بدون

.(1المساحة )

.ثواني 5 لمدة لتبرد وتترك الناقل حلقة تعقم4.

، بيترييحرك الطبق مع فتح الغطاء الزجاجي لطبق 5.

، ويرسم على أخرى وتعاد عملية التخطيط مرة بواسطة الناقل Sخطوط على شكل حرف اآلجارسطح

بعرض الطب 2على المساحة

.يعقم الناقل مباشرة ويترك ليبرد6.

، بحيث (خطوط 7 – 6) تخطيطات اآلجاريخطط سطح 7.

تكون عمودية

.يعقم الناقل ويترك ليبرد8.

(.59شكل ) .4و 3تكرر عملية التخطيط في االتجاه 9.

Radiant Streak Method المتشععطريقة التخطيط •

.ثواني 5تعقم حلقة الناقل، وتبرد لمدة 1.

(.60)شكل خطوط كما موضح في 8– 7ترسم بواسطة الناقل 2.

.يعقم الناقل مرة أخرى ويترك ليبرد3.

، بحث تكون الخطوط متقاطعة اآلجاريخطط سطح 4.

.مع الخطوط التي سبق تخطيطها في السابق

.يعقم الناقل مرة أخرى، ويترك ليبرد5.

توضع األطباق مقلوبة في الحضانة عند درجة 6.37º ساعة 48 – 24،لمدة م.