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Quantitative Proteomics of LA BacteriumQuantitative Proteomics of LA Bacterium

——Research projectResearch project

Zhang Xiaoli

2011.06.12

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1.Research approaches

2.Research project

3.Experiment routes

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1. Research approaches

1.1Stable isotope labeling In vivo (metabolic labeling)

Definition: stable isotopes are incorporated into proteins during the growth of a model organism.

(1) SILAC(stable isotope labeling with amino acid in cell culture) coupling with 2-LC-MS/MS analysis

(2)15N labelled coupling with 2-LC-MS/MS analysis

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(1) SILAC (stable isotope labeling with amino acid in cell culture)

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(2)15N labeling coupling with 2-LC-MS/MS analysis

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Advantages:

(1) little measureable deleterious effect on the growth and

development of an organism;

(2) useful for experiments involving smaller model microbes

such as lactic acid bacterium, which requires a defined

medium and a set of controlled conditions to grow;

(3) Completely labeling ——high labeling efficiency

(4) Reduce sample handling errors;

(5) simplifying quantitation;

(6) inexpensive.

Disadvantages:

Only utilize to living cells or tissues

Advantages and Disadvantages of metabolic labeling

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1.2Stable isotope labeling in vitro (chemical labeling)

Definition: stable isotopic labels are incorporated into the peptides during peptide preparation

— (1)ICAT (isotope coded affinity tags)

— (2)iTRAQ(isotope tagging for relative and absolute

protein quantitation)

— (3)18O-enriched water

All of them coupled with 2-D LC/MS-MS analysis

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(1) ICAT (isotope coded affinity tags)

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(2) iTRAQ

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(3) 18O-enriched water

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Advantages:

(1) Suitable for all types of samples

(2) Accurate quantification

Disadvantages:

(1) Undesirable by-products

(2) Incomplete labeling due to existence of chemical contaminants

(3) Increases peptide complexity

(4) Pretreatment and digestion processes may lead to differences

in parallel samples

(5) Expensive

Advantages and Disadvantages of chemical labeling

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1.3 Our employed approaches

iTRAQ

SILAC

——expensive

——inexpensive

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1.4 Utilization Conditions of SILAC

①heavy amino acids have to be essential ones;

②the living cells should be auxotrophic for the labeling

amino acids;

③the mass difference between the heavy and the normal

amino acids should be at least 4 Da;

④the selection of amino acids should match the enzyme

used for protein digestion.

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2. Research project

1. Investigating the metabolites (major amino acids ) of LA bacterium.

2. SILAC-coupled 2-D LC-MS/MS analysis of proteomics of LA bacterium with oxidative stress

3. SILAC-coupled 2-D LC-MS/MS analysis of proteomics of LA bacterium with Lactic acid or nisin stress

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3. Short-term experiment schedule

1. 2011.06.13-2011.06.26:

Determining the minimal chemical defined medium of LA bacterium.

2. 2011.06.27-2011.07.26:

Investigating the metabolites (major amino acids ) of LA bacterium.

3. 2011.07.27-2011.08.26:

Analyzing proteomics of LA bacterium with lactic acid or nisin stress.

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