qc tumor markers - dr. vanaki - iacld...

Dr .mehrdad vanakiConsultant of quality assurance & QMS Consultant of quality assurance & QMS in med labs

DefinitionAny macro-molecule, regardless of function can be called tumor marker

P l tidPolypeptide Protein Nucleic acidNucleic acid Enzyme HormoneHormone

An ideal tumor markerThe quality should be included

High sensitivity g yHigh specificityC b lifi dCan be qualified Safe ConvenienceL iLow price

How to identify tumor marker ? On cell

Cytochemistry, Flow cytometry

On tissueHistochemistry, Cytosol assays

In body fluidsBlood, urine, CSF, Amniotic fluidBlood, urine, CSF, Amniotic fluid

TUMOR MARKERSWhat are they?

Are substances usually proteins, that are produced by the body in response to cancer growth or by the cancer tissue itself and certain benign (noncancerous) conditionsDetected in higher than normal amounts in the bloodDetected in higher than normal amounts in the blood, urine, or body tissuesSome tumor markers are specific for one type of cancer, while others are seen in several cancer types

Measurements can be useful – when used along with x-rays, or other tests in the detection and diagnosis of some types of cancer

TUMOR MARKERSMeasurements of tumor marker levels alone Measurements of tumor marker levels alone are not sufficient to diagnose cancer for the following reasons:following reasons:

Tumor marker levels can be elevated in people with benign conditionsTumor marker levels are not elevated in every person with cancer – especially in early stages of the diseaseM k ifi i l f Many tumor markers are not specific to a particular type of cancer

:سنجش تومور مارکر ھا به تنھائی در تشخيص کانسر به داليل ذيل کافی نمی باشد ی ی ی ھسطح تومور مارکر در واکنش ھای التھابی و خوش خيم نيز افزايش می يابد - ١سطح بسياری از تومور مارکر ھا در مراحل ابتدائی و اوليه کانسر افزايش نمی يابد -٢ م٣ خاص کانسر نوع يک برای کاف ويژگ يا اختصاصيت فاقد مارکر تومور از زيادی تعداد تعداد زيادی از تومور مارکر فاقد اختصاصيت يا ويژگی کافی برای يک نوع کانسر خاص می -٣

باشند

Assay technologyMonoclonal antibody (MoAb)

Specificityd imass production

Sandwich techniqueMoAbs1 + Tumor markerMoAbs1 + Tumor markerMoAbs2 + Tracer

Sandwich TechniquesTumor markers as a antigen between two MoAbsThe first is bound onto a solid support (tubes or wells…)The second, unbound upon introduction into the assay carries the signal (tracer: radionuclide, enzyme, fluorochrome…)

S d i h t h iSandwich techniques

Tumor marker in OncologyScreening Di iDiagnosisStagingStagingPrognosisPrognosis

ScreeningScreeningTumor markers play a limited role for p ytumor screening, just because….

relatively low sensitivityl k f ifi it d l ti t t ilack of specificity and relation to tumor size

Inappropriate for the detection of small in situ cancercancerIn some cases, tumor markers can be equal to other examinations envisioned for screening

PSA & prostate cancercalcitonin & medullary thyroid cancer

DiagnosisTumor is not the key diagnostic examination, but can be a complementary sign to clinical fi di di l i ifinding or medical imaging

AFP & hepatomaSometimes implicate the existence within the tumor of an exclusive secretary histological

ti tcontingentNSE & SCLC

StagingThe tumor markers and medical imaging are complementary in the pre-therapeutic p y p pand post-therapeutic staging

P iPrognosisThe pre therapeutic level of certain tumor markerThe pre-therapeutic level of certain tumor marker can contributes a prognostic factor because of links with...

Metabolic activityTumor sizeInvasionInvasion

More valuable in that it is independent or other usual prognostic factors for the pathologyp g p gy

Allow doctors to refine therapeutic strategy by selecting groups with risk of failure response to t t ttreatment This property is one of the major aspects

f t f th t kof current use of the tumor markerCEA & colon cancerCA19 9 & tiCA19-9 & pancreatic cancerCYFRA 21-1 & lung squamous cell cancer

D iDuring treatmentHigh markers level before treatment generallyHigh markers level before treatment generally

Not only correlate very well with the therapeutic result but are sometimes superior to this result in pthe assessment of complete remission

The assay must be taking into account the marker half-life when during treatment and all post-therapeutic re-evaluation

During monitoringContribute to a valuable mean and lead to suspicion for...

local or metastasislocal or metastasiscurable recurrencemuch earlier before clinical or radiological detection

The protocol of the follow-up must be very strictCA15-3 measured every 3 months for y1 year and then every 6 months in breast cancer patient

Diagnosis or monitoring

Measuring patients’ levels of AFP, CA 19‐9, Measuring patients levels of AFP, CA 19 9, CEA, Free PSA, and Total PSA are clinically useful in the monitoring of cancersuseful in the monitoring of cancers

ClassificationCarcino-embryonic protein

AFPCEA

Carbohydrate antigenCA125CA19-9CEA

Carcino- associated proteinB2MPSA

CA19 9CA15-3SCC

PSATGTPA

HormoneCT

quality requirements relevant to all tumor markerquality requirements relevant to all tumor marker measurements

Pre-analytical requirements :choice of tumor marker, specimen type, specimen timing, sample handling. Analytical requirements :assay standardisation, internal and external quality control, interferences. Post-analytical requirements :reference intervals, interpretation and reporting of tumor marker results

Pre‐analytical quality requirements Reporting of erroneous tumor marker results is more likely to cause undue alarm to patients than is the case for many other laboratory testsother laboratory tests.The laboratory must therefore exercise extra vigilance in ensuring that

correct results are reported.correct results are reported. Errors in the pre-analytical phase reportedly occur ten

times as often as in the analytical phasethe majority of pre-analytical errors for tumor markers will be simple specimen handling errors – e.g. inappropriate sampling handling hemolyzed specimens insufficientsampling handling, hemolyzed specimens, insufficient specimens, and incorrect specimens – and their occurrence should be minimized by adherence to good laboratory practice and assessment in an effective audit cycle.

Quality requirements in the pre‐analytical phase Requirements Recommendations Comments / specific

examples examples

Analyte‐related

Type of specimen

Requirements should be checked in the product information supplied with the kit. It is the laboratory’s responsibility to provide clear advice

Serum or plasma are usually (but not always) equally laboratory s responsibility to provide clear advice

about the appropriate tube type for each test, thereby ensuring that manufacturers’ instructions are always followed.

appropriate. Gel tubes may not be suitable for some assays. Anti‐coagulating agents such as ethylene‐ diamine tetraacetic ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) may interfere in some detection methods.

Specimen stability

Tumor markers are generally stable, but serum or plasma should be separated from the clot and stored at 4°C (short‐term) or ‐30°C (long‐term) as

The stability of total and free PSA under different storage conditions is especially critical in the context of a

soon as possible. For longer term storage specimens should be stored at ‐70°C.

Heat treatment (e.g. to deplete serum complement components or to inactivate HIV) should be avoided, particularly for hCG and PSA.

especially critical in the context of a screening programmeHCG may dissociate at elevated temperature to form its free α‐ and β‐subunits

Quality requirements in the pre‐analytical phase Requirements Recommendations Comments / specific examples

Patient‐related

Test selection Ordering of tumor marker tests h ld b di l ll

NACB recommendations for use of tumor markers in routine clinical practice are should be according to locally

agreed protocols, based on established national and international guidelines. l h h

markers in routine clinical practice are summarized in Table 1, PSA should never be measured routinely in females. CA125 should never be measured routinely

Although in certain circumstances tumor markers may aid in diagnosis, speculative measurement of panels of tumor markers (“fishing”) should be discouraged

in males. CA15.3 should only be measured routinely in males with an established diagnosis of breast cancer. Interpretation of subsequent results is aided by discouraged Interpretation of subsequent results is aided by knowledge of the pre‐treatment “baseline” level

Specimen timing No strong evidence of diurnal variation for most markers, so specimens can be taken at any time of day.

. Prostatic biopsy, transurethral resection f th t t t ti

y yBlood for PSA should be taken before any clinical manipulation of the prostate. Any measurements taken too soon should be repeated Blood for CA125 should not be taken d i i hi h

of the prostate, or traumatic catheterization may markedly elevate serum PSA and/or free PSA .repeat of PSA recommended in sampling after th t during menstruation, which may

increase the serum concentration two to three‐fold. A confirmatory specimen avoiding sampling during menses should be requested

these events

Analytical quality requirements The almost universal use of automated immunoassay yanalysers for many commonly requested tests means that responsibility for analytical quality now rests largely with the diagnostic industrylargely with the diagnostic industry, which must meet quality requirements defined by national or international regulatory authorities [e.g. US Food and Drug Administration (FDA) regulations, European Commission In Vitro Diagnostics Directive (IVDD)]Diagnostics Directive (IVDD)].

It is nevertheless crucial for satisfactory measurement of any analyte that laboratories independently monitor their

f f ll b th t th t lown performance carefully, both to ensure that analyzers are being used appropriately and to confirm that individual methods are performing according to specification. p g g pThis is best achieved by implementation of rigorous Internal Quality Control (IQC) and participation in well-designed Proficiency Testing [External Quality Assessment (EQA)] programs (1).

Analytical quality requirements Long-term monitoring presents major challenges as patients may change hospital and laboratories may change the tumor marker methods during the relevant time period. While ideally results obtained in different methods would be fully interchangeable, data from PT schemes confirm that this is not the case with between methodschemes confirm that this is not the case, with between-method coefficients of variation in excess of 20% still observed for some tumor markers .Major causes of observed between-method variation for these complex analytes include poor calibration differences in the specificitycomplex analytes include poor calibration, differences in the specificity of antibodies used, and differences in method design.It should be possible to achieve reasonably standardized and accurate calibration but only for those analytes for which a recognizedcalibration, but only for those analytes for which a recognized International Standard (IS) or Reference Reagent (IRR) is both available and universally adopted by diagnostic manufacturers for primary calibration of their methods. Unfortunately, as yet there are no IS for y, yany of the important CA series of tumor markers, a major gap that should be addressed urgently. Long‐term PT scheme data can also confirm the effect of successful introduction of a new IS. Data from the UK National External Quality Assessment Scheme (UK NEQAS) for PSA, for example, confirm that mean geometric coefficients of variation (which reflect scatter) decreased from 21.9% in 1995, before the 1st IRR was introduced, to 9.5% in 2004

NACB recommendations: Quality requirements for Assay Validation, Internal Quality Control and Proficiency Testing

Requirements Recommendations Comments / specific examplesq / p p

Assay validation

Well‐characterized methods

Prior to their introduction in routine clinical practice, both immunoassay and

It is critically important that methods are properly validated prior to their introduction to immunoassay and

immunohistochemicalmethods must be validated by defined and well‐

prior to their introduction to avoid misleading reports both in routine clinical practice and in the scientific literature.by defined and well

characterized protocol that meet regulatory guidelines (e.g. FDA approval in the

in the scientific literature.Failure to have done so accounts for some of the past issues with diagnostic tests, particularly for g pp

United States, CE marking in Europe).

g p yimmunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization (FISH) testing.


Requirements Recommendations Comments / specific examples

Internal Quality Control

Assessment of reproducibility

Intra‐assay variability



Internal Quality ControlQ y

Appropriate number of IQC

The number of IQC specimens included per run should allow identification of an unacceptable IQC

specimens.p

run with a given probability acceptable for the clinical application.

Specimens closely resembling

th ti

At least one authentic serum matrix control from an independent source should be i l d d i dditi t QC

Kit controls may provide an overly optimistic impression of performance, particularly if

authentic patient sera

.

included in addition to any QC materials provided by the method manufacturer

they are prepared by adding standard to an artificial matrix.



Internal Quality Control

IQC N ti d l Where clinical decision points IQC specimens of concentration appropriate

Negative and low positive controls should be included for all

Where clinical decision points are commonly employed (e.g. PSA, 4 μg/L; AFP, 5‐8 kU/L; hCG 5 U/L) IQC specimens of

to the clinical application.

tumor markers. The broad concentration range should also be covered and

hCG, 5 U/L), IQC specimens of these concentrations should be included.

IQC specimens should ideally include a high control to assess the

f dil i accuracy of dilution.



Proficiency Testing Testing PT specimens of appropriate analyte

Concentrations should assess performance

th ki

Distribution of occasional specimens of high

t ti t h k concentration over the working range concentration to check linearity on dilution and of specimens containing analyte‐free serum to check baseline free serum to check baseline security for certain analytes(e.g. AFP, hCG) is desirable.

PT PT specimens should ideally be PT specimens prepared by spiking PT specimens closely resembling

PT specimens should ideally be prepared from authentic patient sera, which for tumor markers may require dilution of

PT specimens prepared by spiking purified analyte into serum base pools provide an overly optimistic impression of between‐method

authentic patient sera

high concentration patient sera into a normal serum base pool.

impression of between method performance (e.g. for CEA, mean CVs of 14% cf 20% for pools containing patient sera)



Proficiency TestingTestingPT specimens that are

Evidence of the stability of PT specimens in transit should be available

Stability in hot climates is particularly relevant for hCG and free PSA but reliable data should

stable in transit

available. free PSA, but reliable data should be available for all tumor MARKER

h ld b d bAccurate and stable target values

The validity of the target values (u sually consensus means) should be demonstrated by assessing their accuracy,

Accuracy should be assessed by recovery experiments with the relevant International Standard . stability by repeat distribution of the same pool

d l b f d ffby assessing their accuracy, stability and linearity on dilution.

and linearity by issue of different dilutions of the same sera in the same serum base pool. Issue of PT specimens containing the IS can also f l l id h for some analytes elucidate the extent to which different methods recognisedifferent isoforms (e.g. hCG, PSA).


Requirements Recommendations Comments / specific examples Requirements Recommendations Comments / specific examples

Proficiency Testing

Assessment of assay interferences

Occasional specimens should ideally be issued to check for interference (e.g. from

The volume of sera required may preclude undertaking this for all participants, but by distributing such specimens to eg 5 users of a number of different methods

heterophilic and other antibodies, high dose hooking, etc).

users of a number of different methods valuable information about method robustness can be obtained and subsequently provided to all participants.

Evaluation of interpretation as well as technical

interpretation of the pathologist as well as the technical aspects of the test must be evaluated.

Since immunohistochemistryreports routine include an interpretive comment, the

technical results is required for PT of

accuracy of these should be rigorously and independently assessed

immunohistochemicaltests



Proficiency Testing

Interpretative exercises and surveys

Occasional surveys are desirable to compare practice

PT schemes can make a powerful contribution to

surveys in difference laboratories. national audit by highlighting

differences in reference intervals, reporting practice

d i t t ti f li i l and interpretation of clinical results,

Provision of d ti l

Incorporating regular updates to ti i t d l t

Surveys of recent literature can d h l f l hleducational

updates to all participants

participants on new developments relevant to provision of a tumor marker service is desirable and can be conveniently done in

provide a helpful monthly addition to PT reports.

yComments sections accompanying reports.

NACB recommendations: Quality Requirements for minimizing risk of method‐related errors in tumor marker results

R i t R d i C / ifi l Requirements Recommendations Comments / specific examples Type of interference

f h ld f h l f l ( hCross‐reaction of closely related

Manufacturers should provide clear information about the specificity of their

th d

Often helpful (eg when measuring PSA or hCG) but differences in recognition of th ti i f related

molecules methods. Users should be aware of the characteristics of the methods used

the cross‐reacting isoforms are likely to contribute to numerical differences in resultsmethods used. results.

High dose hook effect Laboratories

Tumor marker concentrations range over several orders of magnitude and may exceed the

tumor marker concentrations is critically important where the malignancy is potentially fatal but

should have in place defined protocols for identifying

g ycapacity of the solid‐phase. Recognition of extremely high

malignancy is potentially fatal but curable, e.g. hCG in choriocarcinoma.

de t y gspecimens that have “hooked”.

NACB recommendations: Quality Requirements for minimizing risk of method‐related errors in tumor marker results


Type of interferenceInterference Laboratories should be aware of the Falsely high or low results may be from heterophilicor human

ti

possibility of interference from heterophilic or human anti‐mouse antibodies, particularly when results are not in accord with the

y g yobtained for patient specimens containing anti‐IgG antibodies capable of reacting with antibodies

d i th anti‐mouse antibodies (HAMA)

clinical picture. Where interference is suspected this should be investigated, e.g. by re‐assaying the specimen

used in the assay. Such antibodies may be of particularly high titre in patients who have undergone treatment with y g p

1. After treatment with commercially available antibody blocking tubes 2. After addition of further immobilized normal, non‐immune

gmouse monoclonal antibodies for imaging or therapeutic purposes. Serious clinical errors as a result of failure to recognise such serum, Protein A or Protein G

3. After precipitation of immunoglobulins with polyethylene glycol (PEG)

failure to recognise such interference have been most frequently reported for hCG. A high degree of suspicion is usually g y

4. In a different method, preferably using a different methodology (egradioimmunoassay) 5. At several dilutions to assess

required for identification, which is facilitated by good communication between clinical and laboratory staff.

NACB recommendations: Quality requirements in the post‐analytical phase Requirements Recommendations Comments / specific examples Factual Factual requirements

Clinical information

Brief clinical information indicating the source of the

Such information is essential if any laboratory interpretation is to be information

from the requesting doctor

gsuspected/diagnosed malignancy and the treatment stage (e.g. post‐op) should accompany the specimen.

laboratory interpretation is to be made and may help to identify occasional laboratory errors (e.g. mis‐sampling on an analyser). p

Availability of appropriate f

Reference intervals should be appropriately derived

Reference intervals are usually most relevant for cancer patients pre‐treatment, after which the patient’s

“b li ” id h reference intervals

appropriately derived using an appropriate healthy population.

own “baseline” provides the most important reference point for interpretation of marker results. If this is well‐established, increases even t s s we estab s ed, c eases evewithin the reference interval may be significant.

NACB recommendations: Quality requirements in the post‐analytical phase Requirements Recommendations Comments / specific examples Factual Factual requirementKnowledge of what

percentage increase or decrease that constitutes a significant

A confirmed increase or decrease of ± 25% is frequently considered of what

constitutes a significant change

gchange should be defined and should take account of both analytical and biological variation. Laboratories should be willing and

of ± 25% is frequently considered to be of clinical significance but more work is required in this area, the importance of which has

tl b ill t t d f PSAg

able to advise on this issue. recently been illustrated for PSA

Defined protocol h

Laboratories should have a defined protocol when

This may necessitate analyzing the previous when

changing methods

changing tumor marker methods.

analyzing the previous specimen by the new method or requesting a further specimen to refurther specimen to re‐establish the baseline and/or confirm the trend in marker level.

NACB recommendations: Quality requirements in the post‐analytical phase Requirements Recommendations Comments / specific examples

Factual Factual requirements

Knowledge of tumor marker

Laboratories should be able to provide calculated tumor marker

Half‐lives are defined as the time to 50% reduction of tumor marker

half‐lives provide calculated tumor marker half‐lives for the markers for which these are relevant (e.g. AFP, hCG).

time to 50% reduction of circulating tumor marker concentration following complete removal of tumor complete removal of tumor tissue.

Objective audit of

Laboratories should be i l d i i di

This remains a priority audit of tumor marker utility

involved in on‐going audit of the clinical utility of the results they provide.

and is being considered by a number of professional professional organizations.

NACB recommendations: Quality requirements in the post‐analytical phase Requirements Recommendations Comments / specific examples Reporting Reporting requirements Cumulationof tumor

Laboratories should provide fully cumulated tumor

Helpful reports facilitate interpretation and of tumor

marker results

provide fully cumulated tumor marker results. Graphical representations may also be helpful.

interpretation and communication between laboratory and clinic. It is helpful if the reports incorporate any brief li i l i f ti il bl clinical information available, particularly dates of operation etc.

Tumor marker

Laboratories should indicate the method used marker

method used indicate the method used on the report form and highlight whether any change of method is likely change of method is likely to have affected interpretation of the trend in marker result.

NACB recommendations: Quality requirements in the post‐analytical phase Requirements Recommendations Comments / specific examples

Reporting Reporting requirements

Recommendations Laboratories should be An apparent rise in marker Recommendationsas to the appropriate frequency of tumor marker

Laboratories should be willing to advise on the frequency of monitoring and the need for

An apparent rise in marker concentration should always be confirmed by repeat measurement. tumor marker

measurements and the need for confirmatory specimens.

measurement.

Communication between laboratory and clinical staff

Laboratories should always welcome and encourage good

i i i h

Good communication facilitates appropriate use of these (and other) tests clinical staff communication with

clinical users of the service.

of these (and other) tests.

REFERENCES 1. Fleisher M, Dnistrian AM, Sturgeon CM, Lamerz R, Wittliff JL. Practice guidelines and recommendations for use of tumor markers in the clinic. Chapter 5 in: Tumor Markers: Physiology, Pathobiology, Technology, and Clinical Applications, edsDiamandis EP, Fritsche HA, Lilja H, Chan DW, Schwartz MK. AACC Press, Washington DC 2002 pp 33‐64 2. Hayes DF, Bast R, Desch CE, et al. A tumor marker utility grading system (TMUGS): a framework to evaluate clinical utility of tumor markers. J. Natl Cancer Inst. 1996; 88: 1456‐1466. St CM Li it ti f t h i f t k Ch t 6 i T M k Ph i l P th bi l 3. Sturgeon CM. Limitations of assay techniques for tumor markers. Chapter 6 in: Tumor Markers: Physiology, Pathobiology,

Technology, and Clinical Applications, eds Diamandis EP, Fritsche HA, Lilja H, Chan DW, Schwartz MK. AACC Press, Washington DC 2002 pp 65‐81. 4. Hammond EH. Quality control and standardization for tumor markers. Chapter 4 in Chapter 6 in: Tumor Markers: Physiology, Pathobiology, Technology, and Clinical Applications, eds Diamandis EP, Fritsche HA, Lilja H, Chan DW, Schwartz MK. AACC Press, Washington DC 2002 pp 25‐32. g pp 5 35. Price CP, Allard J, Davies G, Dawnay A, Duffy MJ, France M, et al. Pre‐and post‐analytical factors that may influence use of serum prostate specific antigen and its isoforms in a screening programme for prostate cancer. Ann Clin Biochem. 2001;38:188‐216 [Accessed May 30th, 2005. Available at http://www.leeds.ac.uk/acb/annals/annals_pdf/May01/188.PDF ] 6. Sturgeon CM. Practice guidelines for tumor marker use in the clinic. Clin Chem 2002; 48: 1151‐1159 7. Association of Clinical Biochemists in Ireland: Guidelines for the use of tumor markers. 3rd ed. 2005. [Accessed May 7th, 2006. Available at http://www.acbi.ie/acbi‐tmk.html] 8. Nonogaki H, FujiiS, Konishi I, Nanbu Y, Kobayashi F, Mori T. Serial changes of serum CA125 levels during menstrual cycles. Asia Oceania J Obstet Gynaecol 1994;17:369‐378 9. Muyldermans M, Cornillie FJ, Koninckx PR. CA125 and endometriosis. Hum Reprod Update 1995;1:173‐187 Si h R C hill D P R O’B i TS R i h f ifi i i i id 10. Singh R, Cahill D, Popert R, O’Brien TS.. Repeating the measurement of prostate‐specific antigen in symptomatic men can avoid

unnecessary prostatic biopsy. BJU Int 2003;92:932‐935 +11. Sturgeon CM, McAllister EJ. Analysis of hCG: clinical applications and assay

CONCLUSION

Optimal use of tumor markers prequires care and attention to detail in the pre‐analytical analytical and in the pre‐analytical, analytical and post‐analytical phases of analysis,

d h ld b hi bl i and should be achievable in laboratories fulfilling the quality

d b d hrequirements described here.

early detection

case‐finding prognosis recurrence therapy Testicular tumors

Testicular tumors

No tumor markers recommended

AFP, hCG, LDH AFP, hCG, LDH AFP, hCG, LDH AFP, hCG, LDH

Prostate cancer

PSA, cPSA, %fPSA

PSA, cPSA, %fPSA

PSA, cPSA PSA, cPSA PSA, cPSA

Colorectal cancer

FOB [In subjects >50 years old; Genetic testing


CEA CEA CEA

gin high risk subjects]

Liver cancer AFP AFP AFP AFP AFP Liver cancer AFP [In high risk subjects

AFP AFP AFP AFP

early detection

case‐finding

prognosis recurrence therapy Testicular tumors

Ovarian cancer

CA125 [Only in combination with TVUS for early

CA125 [Post‐

l

CA125 CA125 CA125

with TVUS for early detection in hereditary syndromes

menopausal women only]

Breast cancer



ER, PR, HER‐2, uPA, PAI‐1


CA 15‐3, CEA [Monitoring [ gadvanced disease]

Gastric No tumor markers No tumor No tumor markers No tumor No tumor Gastric cancer recommended markers recommended

recommended markers recommended

markers recommended

Bl dd N k N N k N N Bladder cancer






early detection

case‐finding prognosis recurrence therapy Testicular tumors

Pancreatic cancer


CA19‐9 [If used, only with CT or EUS

d i

CA19‐9 No tumor markers recommended

CA19‐9 [During palliative therapy with imaging and in an

appropriate clinical context

with imaging tests or after potentially curative surgery]

Cervical cancer

No tumor markers recommended recommended

Thyroid No tumor k

No tumor k

No tumor k

Thyroglobulin; h l b li

Thyroglobulin; h l b licancer markers

recommended markers recommended

markers recommended

thyroglobulinantibodies

thyroglobulinantibodies

PSA & Free PSATotal PSA can also be used in the early detection of prostate cancer.A d h f % F PSA id i di i i i And the use of % Free PSA aids in discriminating between prostate cancer and benign disease, thus helping to eliminate unnecessary biopsies helping to eliminate unnecessary biopsies. Therefore,it is imperative for manufacturers to provide reliable tumor marker assays which produce y pconsistent laboratory results over time.در پايداری و سلایر شماره کنترل جدول به اساليد ر ارجاع ری ي لایر و پ ر رل ول ي ب ج ع رج

فايل ضميمه

The consistency of ARCHITECT tumor markersThe consistency of ARCHITECT tumor markers was previously reported at the 2001 ISOBM meeting which covered manufactured reagent lots over one to twocovered manufactured reagent lots over one to twoyears. This study is an extension of this previous report and This study is an extension of this previous report and reviewed the consistency of tumor marker serum panel values and control values produced in an artificial matrix as reported by the ARCHITECT assays covering manufactured reagent lots over four to five yearsfour to five years.

tumor marker MethodsMethodsInternal quality control procedures at Abbott

fLaboratories require the testing of both serum panels and controls at various concentration l l th h t thlevels throughout the assay range.

Serum control & patient The testing of serum panels imitates values expected with patient samples tested in clinical laboratories.The testing of controls validates reported patient results. S l d f ti t lSerum panels were prepared from patient samples or spiked analyte in a human serum matrix. These panels and controls were tested with eachThese panels and controls were tested with each manufactured reagent lot of AFP, CA 19-9, CEA, Free PSA, and Total PSA over four to five years. Mean values and % coefficient of variation were determined for each level of serum panels and controls.

ConclusionConclusionConsistent results between manufactured lots were demonstrated for ARCHITECT AFP CA 19-9 CEAdemonstrated for ARCHITECT AFP, CA 19-9, CEA, Free PSA, and Total PSA assays.Consistent performance over time allows plaboratorians to have greater confidence in the results they provide to physicians resulting in better

li i l d i i d t f ti tclinical decisions and management of patients. Physicians can be confident that changes in the concentrations of tumor markers inin the concentrations of tumor markers in patients’ serum is indicative of changes in the patients’ disease status and not a resultthe patients disease status and not a result of variability in assay manufacturing

طرح کيفيت پيشنھادی وھورمون ايمونولوژی ونبخش ور وژی و و و ي ش ب

برنامه اجرائی کنترل کيفی داخلی ايمونولوژی و ھورموندر رديف ھای کاری پانل ھورمون و کاربرد روزانه سرم كنترل صحت و دقت ١)

حداقل دو سطح از سه سطح ) ( SEROيا Bioradنظير کنترل صحت (ايمونولوژی ل) ا ک ھا ت ت ھت طه د تگا ن ن و رسم منحني وستگارد مر بوطه جھت تست ھای کمی واصلی )در االيزا با روش )با ھمان نمونه اول ( كنترل روزانه موارد غير طبيعي ٢)

آنااليزر ايمونو تائيدی ايمونو آنااليزر تائيدیReconfirm of abnormal result of ElISA* method with ELFA

( Vidas) or ECL

د٣) د نه ن ا ط غ نتا ا شتك ا نتا ان خ ا در موارد عدم ھمخواني نتايج با شرح تكرار نتايج غير طبيعي با نمونه جديد٣) Rechecked with newحال بيمار و سوابق نتايج قبلي بيمار

samplesample

استفاده : ) با نمونه قبلی(کنترل و تائيد نتايج نمونه ھای بيماران ۴)دو با بعدي كار رديف در بيمار كنترل عنوان به پائين يا باال نتايج با بيماران نمونه از نمونه بيماران با نتايج باال يا پائين به عنوان كنترل بيمار در رديف كار بعدي با دو از

ھدف کنترل مجدد نتايج قبلی و شناسائی منابع خطا قبل از آناليز (١Rechecked with same sample

برنامه اجرائی کنترل کيفی داخلی ايمونولوژی و ھورمون

:نکته مھم برای تست ھای با کاربری زياد نظير پانل تيروئيد رسم منحنی کنترل ل ا ل ک ط گا ا ق ا کيفی و رعايت قوانين وستگارد در دو سطح کنترل ضروری است ولی ک

برای تست ھائی با کاربرد محدود در بخش ھورمون قرار دادن يک يا دو در کند می کفايت کار قبلی ران از بيمار نمونه يک ھمراه به کنترل سرم کنترل به ھمراه يک نمونه بيمار از ران قبلی کار کفايت می کند در سرم

اين شرايط بررسی عد خوانش شده با تارگت و محدوده کنترل کفايت دارد حدود باال و پائين سرم کنترل ١.۴و بھتر است عدد خوانده شده حدود

قرار گيردگ

برنامه اجرائی کنترل کيفی داخلی ايمونولوژی و ھورمون

:٢نکته مھم توجه به رفرانس رنج قبل از ورود ھر سری اطالعات بسيار الزامی و

ضروری استا

برنامه اجرائی کنترل کيفی داخلی ايمونولوژی و ھورموندر ھر Patient mean controlمحاسبه ميانگين نتايج بيماران) ۵

و محاسبه ضريب تغييرات ماھانه تست ھا در ارتباط با برخی تست ھای رديف کاریازجمله نوسان دارای و اھميت خطاھاي T3 / TSH / Ferritinبا شناساي جھت جھت شناسايي خطاھاي T3 / TSH / Ferritinبا اھميت و دارای نوسان ازجمله

سيستماتيك قبل از آناليز يا حين آناليز

نتايج)۶ چك ايمونولوژيدلتا و Deltaھورمون Check: يج) : Delta . Checkھورمون و ايمونولوژي چ مقايسه نتايج فعلی بيمار با نتايج قبلی و پرونده بيمار با ھدف شناسائی خطا ھای (

)راندوم

: Correlation . Checkكنترل روزانه ارتباط تست ھا با يكديگر ) ٧بررسي ارتباط و ھمبستگی سطح فريتين سرم با سطح آھن سرم و مرفولوژي گلبولھاي

...و RFو ANAقرمز يا رابطه

برنامه اجرائی کنترل کيفی داخلی ايمونولوژی و ھورمونش شگ گ نگاھداری پيشگيرانه تجھيزات بخش ھورمون و ايمونواسی )٨

(Daily & weekly & monthly PM) preventive maintenanceتجھيزات ساير يا آنااليزر ايمونو يا ريدر االيزا روزانه نگاھداری و کيف نکات کيفی و نگاھداری روزانه االيزا ريدر يا ايمونو آنااليزر يا ساير تجھيزات نکاتوابسته به بخش ھورمون مطابق جدول نگاه دارنده پيشگيرانه دستگاه ھا

جديد)٩ تجھيزات يا جديد ھای روش يا جديد ھای کيت گذاری صحه و :تصديق ي ) جھيز ج ي ي ی ج ي ي روش ی ج ي ری : يق و Verification & validation of new method & equipment

از کيت دو يا آزمايش نوع يک برای آزمايشگاھی روش دو صحت و دقت ز مقايسه ي و يش ي ز وع ی ي ی بر ي ز و روش ي و . يک نوع آزمايش به شکلی يک شرکت الزاما معتبر و داری تائيديه کيفی باشد

انجام يك يا چند تست با نتيجه غير طبيعي با دو كيت االيزا متفاوت جھت مقايسه ا ه قا ائ اال ا ا نتا تگ خط ميزان خطی بودن وھمبستگی نتايج در اعداد باال و پائين و بررسی مقايسه ای زاتکرار پذيری و صحت و حساسيت و ويژگي کيت جديد االيزا با کيت معتبر و

االيزا يزمرجع رجع

چک ليست کنترل بخش ميکروبيولوژیرفرانس روش با مقايسه وسيله به نظر، مورد ھای روش PCR(آيا Western blotغيره اعتبار)و تعيين

چک ليست خود ارزيابی و کنترل بخش ھورمون و ايمونولوژیتعيين اعتبار ) و غيره PCR, Western blot(آيا روش ھای مورد نظر، به وسيله مقايسه با روش رفرانس

)Validate (می شوند؟

می شوند؟) Validate(تعيين اعتبار ) ھا-کيت تھيه کننده(آيا روش ھای مورد نظر، بر اساس دستورات سازنده کيت ھا

تعيين ) Mantle Lab(آيا روش ھای مورد نظر، به وسيله مقايسه با آزمايشگاه رفرانس يا آزمايشگاه مورد اعتماد می شوند؟) Validate(اعتبار

ھم ھا روش ساير وسيله به نظر، مورد ھای روش اعتبارآيا شوند؟-می)Validate(تعيين م ير روش ي ر ب و ور ی ري روش ب وی)Validate(يين

و اختصاصی بودن روش کار می باشد؟) آزمايش(آيا تاييد اعتبار شامل تعيين حساسيت آناليتيکال

باشد؟-آيا تاييد اعتبار شامل تداخل ھا می

باشد؟-آيا تاييد اعتبار شامل واکنش متقاطع می

آيا تاييد اعتبار شامل محدوده تشخيصی می باشد؟

شود؟ می کاليبره المللی، بين ی ملی رفرانس مواد به رديابی قابل مواد از استفاده با کار روش باشند(آيا موجود )اگر ).اگر موجود باشند(آيا روش کار با استفاده از مواد قابل رديابی به مواد رفرانس ملی ی بين المللی، کاليبره می شود؟

)نمونه ھای بيماران(آيا آزمايشگاه در برنامه ھای ملی يا بين المللی تبادل سرم شرکت دارد؟

چک ليست کنترل بخش ميکروبيولوژی

ق گ آ آ

چک ليست خود ارزيابی و کنترل بخش ھورمون و ايمونولوژی

شده است؟آيا آزمايشگاه قابل اعتمادی برای ھمکاری، شناسايی و تعيين

شود؟-می آيا نتايج پيچيده و يا مبھم، به آزمايشگاه قابل اعتماد ديگری ارسال

نتايج انجام می شود؟) درست بودن(آيا کنترل داخلی، برای بررسی دقت و صحت

کاری ھای سری تمام در کنترل، مواد شود؟)Batch(آيا می گذاشته ری ی ری م ر رل و و)Batch(ي ی

به کار می روند؟) که نياز به تعيين غلظت يا تيتر ندارند(ھای کيفی، -ھای مثبت و منفی، برای تست-آيا کنترل

آيا غلظت يا تيتر کنترل مثبت به کار رفته، در حد قابل قبول برای روش کار مورد نظر می باشد؟

نگھداری می شوند؟ c , -20°c°70-می شوند؟ يا در آيا نمونه ھا پس از دريافت، فوراً آزمايش

آيا حل کردن، نگھداری و استفاده از مواد ليوفيليزه، شرح داده شده است؟

دارد؟ بيمار نمونه در کمپلمان کردن فعال غير به احتياج کار، روش آيا روش کار، احتياج به غير فعال کردن کمپلمان در نمونه بيمار دارد؟آيا

چک ليست خود ارزيابی و کنترل بخش ھورمون و ايمونولوژیچک ليست کنترل بخش ميکروبيولوژیشود؟- شود، آيا درجه حرارت، ثابت نگه داشته می- انجام می) Radial immunodiffusion(اگر آزمايش به روش ايمونوديفيوژن شعاعی

گيرد آيا تمامی محلول ھای رقيق کننده برای خارج کردن ذرات اضافی موجود، صاف می شوند؟- اگر آزمايش به روش نفلومتری انجام می

شود؟- اگر آزمايش به روش نفلومتری انجام می گيرد آيا برای تمامی تست ھا و سرم ھای رفرانس، بالنک گذاشته می

شود؟- ھای الزم، برای جلوگيری از تداخل آنتی بادی ھای ھتروفيل انجام می- اگر آزمايش به روش ھماگلوتيناسيون انجام می گيرد آيا احتياط ي ي ير ی م ج يون ي و روش ب يش ز یر م ج ي رو ی ی ب ی ز يری و ج ی بر زم وی

اگر آزمايش به روش ھماگلوتيناسيون انجام می گيرد آيا سوسپانسيون گلبول ھای قرمز، استاندارد شده است؟

برنامه اجرائی تضمين کيفيت ايمونولوژی و ھورمونکنان١ کا ت زش زشآ آ ن از ن ا ا کا ا ز ژ ل ن ا ھورمون و ايمونولوژی در حوزه ھای کاربردی و بر اساس نياز سنجی آموزشی آموزش مستمر کارکنان-١) بدو خدمت و حين خدمت( ھورمون و ايمونولوژی متناسب با نوع و حجم کار ارزيابی صالحيت کارکنان -٢

توسط مسئول فنی و سوپر وايزر آزمايشگاه ) حداقل ساالنه يک بار در حين خدمت (در فرکانس زمانی تعريف شده ط ش ف مبتنی بر شواھد عينی حين کار و سوابق کيفی ارائه شده توسط کارکنانش

در ھر سه حوزه پيگيري و ثبت روزانه عدم انطباق ھای بخش ھورمون و ايمونولوژی -٣مرتبط با بخش ميکرب شناسی شامل

...) ارسال نمونه معيوب از نمونه برداری نظير ظرف آلوده به دترژان و حجم ناکافی و(قبل از آناليز...)استفاده از منحنی ذخيره االيزا و عدم استفاده از کاليبراتور ھا در ھر رديف کاری (حين آناليز ...)نداشتن کامنت ھای مناسب جھت تفسير نتايج و / ثبت جابجا نتايج تست ھا در ليست کار ( پس از آناليز

ماژور در فرم عدم انطباق بخش ھمراه با ثبت الزامي اقدام اصالحي و پيشگيرانه ) خطاھاي ( ثبت عدم انطباق ھا ) الفثبت خطاي مينور در فرم عدم انطباق بخش بدون ضرورت ثبت اقدام اصالحي و پيشگيرانه) ب

ايمونولوژی-۴ و ھورمون خارجی کيفی کنترل اجرائی وژیبرنامه و و ي ون و ور رجی ی ي رل ی جر بر در ) موسسات مورد تائيد آزمايشگاه رفرانس( نمونه سرم مجھول از موسسات کنترل کيفی خارجی ٣دريافت ) الف

ماھه ۴فواصل دريافت و ارسال نمونه ھای مشکوک يا مجھول از آزمايشگاه ھای ريفرال و معتبر نظير ارسال نمونه با جواب مثبت )ب ب)ب ب جو ب و ر ير بر و ر ري ی ي ز ز جھو ي و ی و ر و ري

)ارزيابی مقايسه ای نتايج مشکوک در بخش ھورمون و ايمونولوژی( ضعيف

آزمون تائيد صالحيت پرسنل ايمونولوژی و سرولوژیتوصيه جھت اقدام اصالحیامتياز کسب شده حداکثرامتيازعنوان تست مھارتیرديف

Aمبانی کنترل کيفی داخلی ايمونوسرولوژی ی/ سرولوژی1 30منابع خطا رايج در ايمونواس10کاليبراسيون و آماده سازی اوليه210سرم کنترل دقت و صحت 310چارت ھای کنترل کيفی وستگارد410دلتا چک تست510تست مضاعف (کنترل دقت)615توانائی فرد در مستندسازی شاخص ھا715مھارت درتحليل شاخصھای آماری عدم دقت وعدم صحت8

15آشنائی با منابع رايج خطاھای سيستماتيک وراندوم 95ميانگين اطالعات بيمار10Bفن پرسنل فردی ھای مھارت Bمھارت ھای فردی پرسنل فنی20مھارت در کنترل منابع خطا قبل از آناليز1120مھارت در آماده سازی کنترلھا و معرف ھا1220سطح مھارت در سمپلينگ و پيپتينگ1320مھارت در نگاه داری ازتجھيزات ايمونواسی14تر15 به تي 20مھارت درتھيه رقت سلایر و محاس20مھارت کاربردکنترل بيماردر تست رايت/ويدال16زارحجمی17 20مھارت در کاليبراسيون دستی اب20مھارت درمصرف بھينه معرف ھا وکنترل ھا1810توانائی تفسير تستھای سرولوژی19

300جمع کل امتيازمھارت آزمون مھارتتاريخ آزمون مکان مکان آزمون مھارتیتاريخ آزمون مھارتی

تائيد مسئول فنی و مدير آزمايشگاهتائيد آزمون گيرنده

کسب 70-60% امتياز مجموع (معادل 210-180 امتياز) حدنصاب و معيار قابل قبول (تائيد صالحيت فنی )کسب امتياز 80%- 70% (معادل 240-210 امتياز) معيار خوب(صالحيت باال)

کسب امتياز باالی 80% (باالی 240 امتياز) معيار صالحيت فنی عالیپيشنھاد :

اين ارزيابی بھتراست ھر سه ماه يکبار به طور داخلی توسط ارزياب داخلی واجد صالحيت و ساالنه يکبار توسط ارزياب خارجی انجام گيردھر پرسنل فنی که دارای حدنصاب کمتر از حد تعيين شده باشد ملزم است با شرکت در کارگاه ھای آموزشی تئوری وعملی سطح اطالعات

کاربردی خويش را ارتقا بخشيده و با اعالم آمادگی به مسئول فنی و ارزياب داخلی مورد آزمون مجدد قرار گيرد تا صالحيت فنی الزم جھت پذيرش مسئوليت در آن واحد را اخذ نمايد.

Principle ofPrinciple ofiimmunoassayy

labeled materialAll immunoassays require the use of labeled material in order to measure the amount of antigen or antibody present. A label is a molecule that will react as partof the assay, so a change in signal can be measured in the blood:reagent solution.

Examples of a labelExamples of a label include a radioactive compound, an enzyme that causes a change of color in a solution, or a s bstance that prod ces lightsubstance that produces light. The label can be applied during the manufacture of the reagent to either the antibody (Ab* see Figure 1-5) or antigen (Ag*to either the antibody (Ab , see Figure 1 5) or antigen (Ag , see Figure 1-6).Immunoassay technologies utilize different formats to y gdistinguish the bound antigen-antibody complex from the free unbound label.

Competitive and NoncompetitiveCompetitive and Noncompetitive ImmunoassaysThe measurement of analyte in an immunoassay is achieved by using either

a competitiveor

a noncompetitive format.

Competitive FormatCompetitive Format

In competitive formats,In competitive formats, unlabelled analyte (usually antigen) in the test sample is measured by its ability to compete with labeled antigen in the immunoassay.The unlabeled antigen blocks the ability of the labeled

ti t bi d b th t bi di it th tib d iantigen to bind because that binding site on the antibody is already occupied.

Con’tedh i i i i l l b l d i hThus, in a competitive immunoassay, less label measured in the

assay means more of the unlabeled (test sample) antigen is present The amount of antigen in the test sample is inverselypresent. The amount of antigen in the test sample is inversely related to the amount of label measured in thecompetitive format (Figure 1-7).g

One step competitive formatp pIn the one step competitive format (see Figure 1-8), both the labeled antigen reagent (Ag*) and the unlabeled specimen (or testlabeled antigen reagent (Ag ) and the unlabeled specimen (or test sample analyte) compete for a limited amount of antibody.

Two step competitive format

In the two step competitive format, the antibody concentrationp p , yof the reaction solution is present in excess in comparison to the concentration of antigen. Antibody reagent is first incubated with specimen containing antigens of interest; thenincubated with specimen containing antigens of interest; then in the second step, labeled antigen is added. Remember that in the competitive format, less bound labeled antigen indicates more antigen present in the test sample T o step competiti emore antigen present in the test sample. Two step competitiveassay formats provide several fold improved assay sensitivity compared to one step assay formats.

Noncompetitive (Sandwich) MethodNoncompetitive assay formats generally provide the highest level of assay sensitivity and specificity and are applied to the y ymeasurement of critical analytes such as cardiac and hepatitis markers. This format is referred to as a “sandwich” assay because analyte is bound (sandwiched) between two highly specificanalyte is bound (sandwiched) between two highly specific antibody reagents (Figure 1-10).

N titiNoncompetitive assayNoncompetitive assay formats can also utilize either one step or p y ptwo step methods, as with the competitive assay.The two step assay format employs wash steps in which the sandwich binding complex is isolated andsandwich binding complex is isolated and

washed to remove excess unbound labeled reagent and any other interfering substances.gThe two step noncompetitive format usually offers the highest specificity and sensitivity of all the assay formats di d hdiscussed here.

Dr mehrdad vanakiConsultant of QMS & QA in medical labConsultant of QMS & QA in medical lab

مقدمهباشد م لومينسانس کم نام به و گرديده طراح تازگ به که تکنولوژی که به تازگی طراحی گرديده و به نام کمی لومينسانس می باشد تکنولوژی

. می باشد ) نور( و بر اساس اندازه گيری محصول نھائی مواد برخی روی بر ھا پراکسيد يا اکسيژن اثر تحت لومينسانس کمی واکنش در واکنش کمی لومينسانس تحت اثر اکسيژن يا پراکسيد ھا بر روی برخی مواد در

معدنی منجر به برگشت الکترون به مدار پايه می گردد که اين برگشت الکترون با آزاد سازی انرژی نوری بوده يا به عبارتی انرژی آزاد شده از ملکول ھا به

ميزان فوتون افشانی در واکنش .صورت توليد نور يا فوتون افشانی خواھد بود.ھای بيولومينسانس چندين برابر واکنش ھای کمی لومينسانس می باشد

ا ن ا ا ش از ان ن ل ک ش ا ميزان حساسيت روش کمی لومينسانس از روش راديوايمونواسی و زافلوئوروايمونواسی بيشتر است و حساسيت روش

شت ا ن ا انز ش از ز ن ا ن ا ئ فلوئوروايمونواسی نيز از روش انزيم ايمونواسی بيشتر فل.می باشد

١٠٩- ١٠-٢١

ا ن ا ھا ش ا ان د ش ن ت ا ه مقايسه حساسيت سنجش در انواع روش ھای ايمونواسیقا

کمی لومينسانس ١٠-٢١زپتامول ١٠-١٨ ی راديو ايمونو اسی١٠-١٢ ايمونو اسی فلوئورو

١٠-٩ اسی نسل سوم انزيم ايمونو

۵١ التکس ١٠-۵اگلوتيناسيون اگلوتيناسيون التکس

Chemiluminesenceلومينسانس سکمی ي و ی

: تاريخچه انرژی شامل که نمود پيدا تاب شب کرم در را لومينسانس کمی نور انسان بار رژی اولين ل و ب پي ب رم ر س ر ي و ی ور ن ر ين ب و

نورانی حاصل از فوتون ھای آزاد شده بدون دخالت حرارت می باشد :مفاھيم اوليه روش کمی لومينسانس ايمونواسی

نظير راديو (اصول کمی لومينسانس مشابه ساير روش ھای ايمونو اسی است با اين تفاوت که ليبل ...) فلوئوروايمونو اسی و/ آنزيم ايمونواسی / ايمونو اسی

ا ن آک ل ن ل ل شا ا ن ا کات ان ا ن ه ش فته گ بکار گرفته شده به عنوان انديکاتور ايمونو اسی شامل لومينول و آکريدينيوم يا کاايزولومينول می باشد لومينول با تاثير بر روی ملکول ھا منجر به توليد فوتون و

لومينومتر دستگاه توسط نوری ھای فوتون سنج(مجموعه يک)فوتون توسط و ر و ي و و وری ی ون و و ج(ج ون و ي ) و و سيستم فتومولتی پالير دتکتور تبديل به انرژی الکتريکی شده و به صورت

ديژيتال و کمی نشان داده می شوند

Chemiluminesenceلومينسانس سکمی ي و ی

گرچه لومينول اولين نشانگری است که مورد استفاده واقع شده ولی ايزو پراکسيد از مخلوطی افزودن با واکنش اين دارد بھتری کارآئی لومينول کارآئی بھتری دارد اين واکنش با افزودن مخلوطی از پراکسيد لومينول

ھيدروژن و يک کاتاليست اجرا می شود

Chemiluminesenceمزايای روش کمی لومينسانس نسبت به ساير روش ھای ايمونواسی

باال-١ بسيار لومينسانسحساسيت کمی :روش ر ب ي سي ب ي و ی :روش مزيت غالب روش کمی لومينسانس به ساير روش ھای ايمونو اسی حساسيت باال روش می باشد و در برخی متدھا تا حد

حساسيت کمی لومينسانس ھزاران برابر بيشتر از روش االيزا و راديو ايمونو اسی می / می باشد ) ١٠ -٢١(زپتامول باشد اين موضوع منجر به کاھش دفعات تکرار بی مورد تست ھا و مقرون به صرفه شدن اين گروه از آزمايشات

) گرديده استگ

به دليل تاثير پذيری کمتر اين روش کمی لومينسانس نسبت به ساير روش ھا دقت و تکرارپذيری مناسب -٢روش از عوامل محيطی و پايداری بيشتر معرف ھا

روش کمی لومينسانس ويژگی و اختصاصيت باال -٣کيت ھای کمی لومينسانس نسبت با راديو ايمونو اسی و االيزا نيمه عمر طوالنی و پايداری -۴

ق گ گ با روش کمی لومينسانس به دليل حساسيت و ويژگی مناسب و باال روش و گستردگی تست ھای قابل انجام -۵امکان اندازه گيری غلظت ھای بسيار پائين آناليت

روش کمی لومينسانس نسبت به ساير روش ھای ايمونواسی کم خطر و ايمن بودن-۶ ن بو ن ي و ر یم و و ي رو ير ب ب ي و ی رواز جمله کاربرد فاز استفاده از روش کمی لومينسانس به عنوان روش مرجع -٧

گازی کمی لومينسانس به عنوان ردياب در روش مرجع کروماتوگرافی گازی

خا لت ف ن ن ا ن و نداشتن محدوديت ھای روش رنگ سنجی االيزا عدم نياز به منبع نوری و فيلتر خاص -٨

تفاوت کمی لومينسانس و الکترو کمی لومينسانس CL & ECLCL & ECL

روش کمی لومينسانس انرژی اوليه جھت تھييج اتم ھا به واسط در شيميائیيک درتامينواکنش که حالی در گردد روشمی ی ي ي ي ش ر ينو ی ر ر روش ی

الکترو کمی لومينسانس انرژی اوليه جھت تھييج اتم ھا به کمک يک از حاصل الکتريک الکتروشيميائانرژی واکنش واکنش الکتروشيميائی انرژی الکتريکی حاصل از يک

تامين می گردد ه ا ال ه گش ا ات ت از در ھردو حالت پس از تھييج اتم ھا و در برگشت به حالت پايه الفوتون ساطع می گردد و فوتون ھای ساطع شده توسط فوتون

ن ش تال ژ ا ک گ از ان ت ن ل ا سنج يا لومينومتر اندازه گيری کمی يا ديژيتال می شوندن

الکترو کمی لومينسانسECLECL

اکسيداسيون الکترو شيميائی در روش الکترو کمی لومينسانس کمی توليد به منجر اکسيژنه آب حضور در آکريدين ی استر ي و جر ب يژ ور آب ا ر ين ري ر آ ا

خوانش ۴٣٠می گردد که در طول موج لومينسانس آبی رنگ گردد می گرددم

الکترود ھای دستگاه الکترو کمی لومينسانس معموال در مجاورت ل ل د الکت ط ن نتش ن فته گ ا ق ل محلول قرار گرفته و نور منتشره بين سطح الکترود و محلول ل

توسط دتکتور اندازه گيری می گردد

Classification of Chemiluminesenceلومينسانس کمی واکنش س سرعت ي و ی ش ر وا:واکنش کمی لومينسانس به لحاظ سرعت واکنش به دو گروه زير تقسيم می شوند

واکنش فالش Flash method ثانيه کامل از بين رفته و حذف می ۴الی ٢ثانيه شروع و به اوج می رسد و در طول ٣تا ٠.۵در طول

گردد فالش واکنش مثبت روشويژگی باال بسيار مول(حساسيت اتو حد به)در محدود را آن کاربرد که است است که کاربرد آن را محدود به )در حد اتو مول(حساسيت بسيار باال روشويژگی مثبت واکنش فالش

آزمايشگاه ھای مرجع و تحقيقاتی می نمايد گرانی روش و کوتاه بودن زمان واکنش است که جھت خوانش فوتون ھا ويژگی ھای منفی روش فالش

خوانش ھا فوتون شدن آزاد محض به که باشد واکنش سيستم با نزديک مجاورت در باستی دتکتور الزاما دتکتور باستی در مجاورت نزديک با سيستم واکنش باشد که به محض آزاد شدن فوتون ھا خوانش الزامابا دتکتور انجام گردد

واکنش گالو GLOW methodدقيقه پايدار و ثابت باقی می ماند ٣٠الی ٢٠دقيقه به اوج رسيده و به مدت ٧الی ٢در طول

کاربرد آن در آزمايشگاه ھای بالينی روتين است که به دليل ثبات و پايداری سيگنال ويژگی مثبت روش گالو ھای نھائی و امکان بازخوانی مجدد تست ھا در اين روش می باشد

حساسيت آن است که کمی کمتر از روش فالش می باشد ويژگی منفی روش گالو

Chemiluminesenceمعيار ھای مناسب در خريد سيستم کمی لومينسانس

ق لل ل ل خريد لومينومتر استاندارد و دارای تائيد يه بين المللی و تائيديه صحت و دقت -١در شرکت پشتيبان و آزمايشگاه ھا ) صحه گذاری (باال٢ سطح با فروش از پس خدمات و شرکت(پشتيبان اعتبار استعالم و تحقيق تحقيق و استعالم اعتبار شرکت (پشتيبانی و خدمات پس از فروش با سطح باال-٢)ترجيحا نماينده انحصاری يا اصلی/ پشتيبان از مراکز نصب شده تنوع٣ و باال اعتبار با بسته سيستم يا لومينسانس کم کيت باز سيستم بودن دارا دارا بودن سيستم باز کيت کمی لومينسانس يا سيستم بسته با اعتبار باال و تنوع -٣

گسترده در تست ھای قابل انجام ايران-۴ آزمايشگاھی ھای تعرفه با متناسب سيستم ی ھا کيت مناسب ن قيمت ير ی ي ز ی ر ب ب م ي ي ی ب ي ترجيحا استفاده از سيستم ھای فول اتوميشن کمی لومينسانس به دليل کاھش -۵

قابل مالحظه خطا ھای پرسنلی )١٠ -١۵فمتو ( دارا بودن حداقل حساسيت در روش ھای کمی لومينسانس -۶

ELISA TROUBLESHOOTINGELISA TROUBLESHOOTINGDr. mehrdad vanaki88/10/1788/10/17

تعريف و طبقه بندی روش االيزاELISA

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assayy yسنجش ايمونومتريک واکنش انتی ژن و آنتی بادی با ھدف جستجوی انتی ژن يا آنتی

بادی بواسطه آنزيم ھای ليبل شدهايمونواس انزي بندی :طبقه بندی انزيم ايمونواسی :طبقه

واکنش فاقد مرحله شستشو و جداسازی :ھموژنوس انزيم ايمونواسی -١باشد می آنزيم فعاليت تغييرات اساس بر گيری اندازه و در(بوده کاربرد ی ب زيم ي يير س يری بر ز ر (بو و ربر

) اندازه گيری سطح داروھا روش مبتنی بر فاز جامد بوده و دارای :ھتروژنوس انزيم ايمونواسی -٢

مرحله شستشو و جداسازی می باشد و انزيم در اين روش صرفا يک فعمده (انديکاتور جھت تاييد حضور کمپلکس انتی ژن و انتی بادی می باشد

باشد می گروه اين از نوع)روشھا دو اسی ايمونو انزيم ھتروژن روش روش ھتروژن انزيم ايمونو اسی دو نوع ) روشھا از اين گروه می باشد. رقابتی و غير رقابتی تقسيم می گردد

االيزا ساندويچElisa SandwichElisa Sandwich

Ab sandwich or Ag Captureدر اين روش يک آنتی ژن در بين دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گيرد و ساندويچ می گردد و شايعترين روش االيزا محسوب می گردد مثل تست

PSA/TSH/FSH/LH/HCGPSA/TSH/FSH/LH/HCGدر روش آنتی ژن کپچر يا آنتی بادی ساندويچ ملکول آنتی ژن حداقل

اشد ت تفا ک ژن آنت ه نا ا ت ا د ا دا ت بايستی دارای دو سايت يا ناحيه آنتی ژنيک متفاوت باشد اAg Sandwich or Ab Capture

اين روش که برای جستجوی آنتی بادی به کار می رود يک ملکول . آنتی بادی بين دو ملکول انتی ژن ساندويچ و کاپچر می گردد

Antibody captureAntibody captureروش)ب Antibody captureروش)ب١‐Ag sandwich or direct Ab capture

زاين روش براي تعيين سنجش آنتي بادي مورد استفاده قرار مي گيرد بدين صورت كه از ر ر ي ر ر ر ي ي ي ر ريك آنتي ژن كوت شده بر روي فاز جامد براي به دام انداختن آنتي بادي اختصاصي آن

پذيراي ھمان آنتي ) Fab( استفاده مي شود و ھمان آنتي بادي از طريق بازوي ديگر خود نتيجه در باشد م دار نشان صورت به اما بينژن در اختصاصي بادي ژن٢آنتي آنتي آنتي ژن ٢آنتي بادي اختصاصي در بين ژن اما به صورت نشان دار مي باشد در نتيجه

در اين روش آنتي بادي توتال از ھر كالس ايمونوگلوبولين ميسر .ساندويچ مي گردد يكي از اختصاصي ترين و حساس ترين روش ھا براي تشخيص آنتي بادي در است و ا ن الن ل ا آ گ ا ا ك ش ا ا ثال مثال بارز اين روش كيت اندازه گيري آنتي بادي بر عليه پالسموديوم نمونه است

.مي باشد HBs Abويواكس و ترپونماپاليدوم و ٢‐Indirect Ag Sandwich or Indirect Ab captureIndirect Ag Sandwich or Indirect Ab capture

در اين روش پس از به دام انداختن آنتي بادي توسط آنتي ھيومن گلوبولين كوت شده در كف چاھك ھا با اضافه كردن آنتي ژن اختصاصي و تشكيل كمپلكس از يك آنتي بادي

گ آ .اختصاصي نشان دار بر عليه آنتي ژن به عنوان سيستم شناساگر استفاده مي شودل

االيزا رقابتی و مھاریElisa Competetive & BlockingElisa Competetive & Blocking

: االيزا رقابتی Elisa Competetiveھ ا ا نشان غ ا نشان ا آنت ا ت آنال ھ ان(اگ ز ط)ھ ه به محيط ) ھمزمان(اگر ھردو آناليت يا آنتی بادی نشاندار و غير نشاندار با ھم

اضافه شوند روش االيزا رقابتی ناميده می شود

: االيزا مھاری Elisa Blockingنشاندا غ اد آنت ا ت آنال تدا ا(ا نه د)ن ک از شد اضافه اضافه شده و پس از يک دوره )نمونه بيمار(ابتدا آناليت يا آنتی بادی غير نشاندار

در مرحله بعدی آناليت يا آنتی بادی ) با شستشو يا بدون شستشو( انکوباسيون رنشاندار اضافه می گردد ی ر

االيزای رقابتی يا مھاریاد آنت د ا ژن آنت د ت قا ش ن ا ا ت قا شھا كه(د كه ( در روشھاي رقابتي اساس سنجش بر رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي

. براي اتصال به ليگاند با مقدار محدود استوار است) يكي از آن دو نشاندار استراگر ھر دو آناليت نشاندار و غير نشاندار با ھم به سيستم اضافه شوند روش را روش و م ي ب م ب ر ير و ر ي و ر ر

رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره .انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مھاري يا بالكينگ مي نامند

ف ق مرحله و قبل از اضافه نمودن آناليت ٢در روش مھاري ممكن است در بينبعدي شستشو انجام شود يا انجام نشود مثال بارز روشھاي رقابتي و مھاري

باشد۴T٣Tسنجش مي . مي باشدT,۴T٣سنجش:انواع روشھاي رقابتي عبارتند از

االيزای رقابتی يا مھاریژن)الف انت براي مھاري يا رقابت :روش :روش رقابتي يا مھاري براي انتي ژن)الف

رقابت بين آنتي ژن نشاندار و آنتي ژن موجود در نمونه براي اتصال به يك آنتي بادي اساس اين روش بر در اين روش مقدار آنتي بادي كوت شده بايد محدود باشد و . اختصاصي كوت شده در چاھك استوار است

آ .كالسيك به ھمين روش استوار استEIAوRIAاساس,ملكول سيگنال دھنده ھمان آنتي ژن نشاندار استگبدين معني كه آناليت نشاندار در حضور , دوز به صورت معكوس خواھد بود - در اين روش منحني پاسخ

مقادير زيادي از آناليت غير نشاتندار موجود در نمونه به مقدار كمتري به آنتي بادي متصل مي شود و در آ .نتيجه سيگنال ھم بوجود خوھھد آمدگ

محدوده تعيين آناليت با اين روش ممكن است بوسيله استفاده از مولكول نشاندار با فعاليت اختصاصي زياد توسط ) كمترين مقدار از آناليت كه قابل تشخيص خواھد بود(تقويت شود اما حداقل مقدار قابل تشخيص

طآ ظ با اين وجود غلظتھاي خيلي كم از ھاپتن ھا عموما توسط ,تمايل آنتي بادي مورد استفاده تعيين مي شود.را ھم تشخيص دھد fmolھمين روش قابل تعيين اند و حساس ترين روشي است كه مي تواند مقدار كمتر

در برخي از موارد نشاندار كردن روي خصوصيات ھاپتن اثر مي گذارد در نتيجه در روش رقابتي براي آ ك طلآ در اين نوع از سنجش ھا اين مطلب ضروري است ,تعيين آنتي ژن از يك آنتي بادي نشاندار استفاد مي شود

در اين روش آناليت موجود در نمونه با , كه فاز جامد توسط آنتي ژن با مقدار كم و ثابت پوشيده مي شوددر اينجا ھم منحني استاندار . آناليت كوت شده در چاھك براي اتصال به آنتي بادي نشاندار رقابت مي كند

ت ا ش دك ش تفاد ا ان ن ل ك ش ه ش ن ا شت ش ن ا از .از اين روش بيشتر براي سنجش به روش كمي لومينسانس استفاده مي شود,معكوش است

االيزای رقابتی يا مھاریبادي)ب آنتي براي رقابتي :روش :روش رقابتي براي آنتي بادي)ب

رقابت بين دو آنتي بادي يكي در نمونه به صورت غير نشاندار دراين روش وو يكي به صورت نشاندار شده با آنزيم برا اتصال به يكي آنتي ژن كوت شده ژن ي ي ي ب ل بر زيم ب ر ور ب ي ي و

بديھي است كه ھر چه مقدار آنتي بادي نمونه , در چاھك صورت مي پذيردبيشتر باشد انتی بادي نشاندار كمتري به چاھكھا متصل شده و سيگنال نيز

اش ك ز ن ا تان ا ن ن نت ا خ ت شاخك شاخص , كمتر خواھد بود و در نتيجه منحني استاندارد نيز معكوس مي باشد HBc &HBc Abترين مثال اين روش اندازه گيري آنتی بادی بر ضد

است

االيزاي مستقيم) DIRECT ELISA)در اين روش آنتي ژن يا آنتي بادي موجود در نمونه ي كه بايد تشخيص آنتي سپس و شود مي كوت جامد فاز سطح بر مستقيم طور به شود ي داده پس و و ي و ز ج ح يم بر ور و ب

بادي يا آنتي ژن مكمل آن كه نشان دار شده است به سيستم اضافه در صورت وجود آنتي ژن يا آنتي بادي مورد نظر در نمونه ي . ميشود

ش ا ا نا .سيگنال مناسب ايجاد مي شودگنال

اما كاربرد اين روش مشابه ايمونوفلورسانس مستقيم است قات ق ت ا كا شت ا ن تشخ ا ك ان چنداني در كيت ھاي تشخيصي ندارد و بيشتر در كارھاي تحقيقاتي ن

استفاده مي شود

االيزاي غيرمستقيم) indirect ELISA)اين روش براي تعيين آنتي بادي اختصاصي و يا تيتراسيون آنتي بادي در نمونه

. ھاي سرم مورد استفاده قرار مي گيرداساس آزمايش بدين نحو است كه معموال سرم رقيق شده به آنتي ژن ھاي كوت

آنتي ژن كوت شده . اضافه مي شود) ميكرو ول يا چاھك(شده در فاز جامد رديابي نمونه در است قرار كه است بادي آنتي به مربوط اختصاصي ژت آنتي ژت اختصاصي مربوط به آنتي بادي است كه قرار است در نمونه رديابي آنتيشود پس از افزودن نمونه و طي زمان انكوباسيون و يك مرحله ي شستشو

به چاھك اضافه مي آنتي ھيومن گلوبولين نشان دار شده با آنزيم زيم ب ر ن ين وبو ن يو يي چ بشود بر حسب اينكه چه كالسي از انتي بادي براي رديابي اھميت دارد نوع

Igآنتي مورد استفاده نيز متفاوت است مثال براي رديابي آنتي بادي كالس I G ن ھ انت Iاز G كال ا د ا I A ن ھ آنت Iاز AIgG IgGاز انتي ھيومن IgAو براي رديابي كالس IgAاز آنتي ھيومن

.استفاده مي شود

Antibody capture ELISAياختصاصيت سنجش مستقيما توسط آنتي ژن كوت شده در فاز جامد تعيين مي شود ي

و يا نسبتا خام و غير اختصاصي كه ممكن است كامال خالص و اختصاصي باشد سرم حاوي انتي بادي اختصاصي مي تواند در يك بافر براي جلوگيري از . باشد

ق ق ژن آنت ال ات نقاط اشغال از گ ل ھا ن تئ ا اخت غ جذب غير اختصاصي پروتئين ھا و جلوگيري از اشغال نقاط اتصال آنتي ژن رقيق ذ. گفته مي شودsample diluentبه چنين بافري محلول رقيق كننده نمونه . شود

Antibodyحساسيت و ويژگي چنين روشھايي مي تواند با به كار گيري روش ي ي ي ھ چ yيcapture با كاھش تداخل اثر آنتي بادي غير اختصاصي بھتر شود.

روبال ,بھترين مثالھا در مورد اين روش تعيين آنتي بادي بر عليه توكسوپالسماگ در سرم IgGوIgAو IgMويروس سيتومگال و ھليكوباكترپيلوري از كالسھاي,

بر عليه اين عوامل عموما از روش IgMالبته امروزه براي تعيين .مي باشدcapture روش در شود مي نمونه captureاستفاده در موجود ھاي بادي آنتي capture استفاده مي شود در روشcapture آنتي بادي ھاي موجود در نمونهجذب شده و سپس IgMبه روي چاھك ھاي كد شده با آنتي ھيومن IgMاز كالس

از آنتي ژن اختصاصي مربوطه كه آنزيم نشان دار شده اسنت و يا , براي تشخيص . آنتي بادي نشان دار ضد آن به صورت مزدوج استفاده مي شود

ELISA TROUBLESHOOTINGNo Signal or Weak SignalHigh BackgroundHigh BackgroundPoor DuplicateP S d d CPoor Standard CurvePoor LinearityPoor Assay SensitivityPoor CorrelationPoor CorrelationUnexpected Clinical ClassificationA t Shift i R f I t lApparent Shift in Reference Interval

ELISA Stage

No Signal or Weak Signal

E i d t

Omission of key reagents

Expire date, incorrect storage, reagent not to RT

Collection system

Scratch Inactivation, Incomplete or incorrect preparation

of chromogen

incubation

Incorrect time or temperature Wash too

of chromogen

Wrong filter

Wash too stringentInactivation of

conjugate

نظير کنژوکه در روش اجرائی کار منجر به حذف يکی از معرف ھای کليدی -١No Signal or Weak Signal

می گردد) عدم واکنش ( سيگنال منفی يا کاھش اثر ترکيب سوبسترا و کروموژن که ) افت تيتر کنژوکه غير فعال شدن کنژوگه

ت ک ف ا انت ا ا ف گ آل ل ل ه ا(ال ت که اکز در مراکزی که تعداد ( معموال به دليل آلودگی معرف ھا يا در انتھای مصر ف ھر کيت) نمونه کم بوده و کيت مکررا و در چندين نوبت مورد استفاده قرار می گيرد

استاندارد-٢ و نمونه برداشت حجمی ھای ابزار کاليبر از سيگنالخروج کاھش به ر منجر و و ی بر ج ی ر بز يبر ز ل روج ي ش جر ب نھائی می گردد به عنوان مثال اگر از منحنی استاندارد ذخيره شده در حافظه دستگاه استفاده نمائيم و ابزار حجمی در حين کار از کاليبر خارج گردد به دليل اينکه تست و حج داشت ب کاھش ت صو د شوند نم گذاشته ھمزمان کا ديف ھ د د تاندا استاندارد در ھر رديف کاری ھمزمان گذاشته نمی شوند در صورت کاھش برداشت حجم ا

نمونه درسيگنال مربوط به تست ھا کاھش و ضعف ايجاد می گردد و نتايج منفی کاذب يا مثبت کاذب بسته به نوع منحنی حاصل می نمايد

می تواند منجر به کاھش سيگنال شودخراش در کف پليت ھا -٣بر خالف دستور العمل کيت منجر به کاھش زمان ا

qc tumor markers - dr. vanaki - iacld...

Documents