production of lysergic acid derivatives in a submerged culture

7/27/2019 Production of Lysergic Acid Derivatives in a Submerged Culture

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APPuED M I C R O B I O L O G Y , N o v . 1 9 6 7 , p . 1 2 7 0 - 1 2 8 3 V o l . 1 5 , N o . 6C o p y r i g h t 1 9 6 7 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y P r i n t e d i n U . S . A .

P r o d u c t i o n o f L y s e r g i c A c i d D e r i v a t i v e s i nS u b m e r g e d C u l t u r e

I V . I n o r g a n i c N u t r i t i o n S t u d i e s w i t h C l a v i c e p s p a s p a l iJOHN P . ROSAZZA, WILLIAM J . KELLEHER, A N D ARTHUR E . SCHWARTING

P h a r m a c o g n o s y R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , U n i v e r s i t y o f C o n n e c t i c u t , S t o r r s , C o n n e c t i c u t0 6 2 6 8R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 5 May 1 9 6 7

T h e i n o r g a n i c r e q u i r e m e n t s f o r g r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n b y s u b m e r g e dc u l t u r e s o f a l y s e r g i c a c i d a l k a l o i d - p r o d u c i n g i s o l a t e o f C l a v i c e p s p a s p a l i w e r e d e t e r -m i n e d i n a d e f i n e d m e d i u m . T h e r e q u i r e m e n t f o r p e a k g r o w t h w a s e s s e n t i a l l y t h es a m e a s t h e r e q u i r e m e n t f o r m a x i m a l a l k a l o i d p r o d u c t i o n i n t h e c a s e o f p o t a s s i u ma n d m a g n e s i u m . W i t h p h o s p h o r u s , h o w e v e r , m a x i m a l g r o w t h w a s r e a c h e d a t l o w e rl e v e l s t h a n t h o s e r e q u i r e d f o r m a x i m a l a l k a l o i d p r o d u c t i o n . S u l f u r w a s r e q u i r e d i ns m a l l e r a m o u n t s f o r p e a k a l k a l o i d p r o d u c t i o n t h a n f o r m a x i m a l g r o w t h . I n t h e c a s eo f i r o n a n d z i n c , t h e r e q u i r e m e n t f o r m a x i m a l a l k a l o i d p r o d u c t i o n w a s g r e a t e r t h a nf o r g r o w t h . M a n g a n e s e a n d c o p p e r c o u l d b e s u f f i c i e n t l y d e p l e t e d t o d e m o n s t r a t et h e i r e s s e n t i a l i t y f o r a l k a l o i d p r o d u c t i o n , b u t t h e i r r e q u i r e m e n t s f o r g r o w t h c o u l dn o t b e d e m o n s t r a t e d .

A n u m b e r o f s t u d i e s h a v e d e s c r i b e d v a r i o u se f f e c t s o f m i n e r a l s a l t s o n g r o w t h a n d a l k a l o i dp r o d u c t i o n b y C l a v i c e p s s p e c i e s ( 1 4 - 1 6 , 2 3 , 3 6 ,3 7 , 4 3 ) . T h e s e i n v e s t i g a t i o n s e i t h e r w e r e c o n -d u c t e d w i t h c o m p l e x m e d i a o r f a i l e d t o t a k es p e c i a l p r e c a u t i o n s t o r e d u c e t h e c o n c e n t r a t i o no f s a l t s i n t r o d u c e d a d v e n t i t i o u s l y i n t o t h em e d i u m . C o n s e q u e n t l y , n o n e o f t h e s e s t u d i e s h a sp r o v i d e d d e f i n i t i v e r e s u l t s o n t h e r o l e o f t h e t r a c ee l e m e n t s i n g r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n .I n v e s t i g a t i o n s i n t h i s l a b o r a t o r y w i t h l y s e r g i ca c i d a l k a l o i d - p r o d u c i n g i s o l a t e s o f C . p a s p a l ih a v e c o n s i s t e n t l y r e v e a l e d a n i n v o l v e m e n t o fi n o r g a n i c s a l t s w i t h g r o w t h , a n d e s p e c i a l l y w i t ha l k a l o i d p r o d u c t i o n . I n e a r l y s t u d i e s w i t h t h eC - 6 0 i s o l a t e , s u p p l e m e n t a t i o n o f t h e b a s a lm e d i u m w i t h a c o m p l e x m i x t u r e o f i n o r g a n i cs a l t s c a u s e d a n i n c r e a s e i n b o t h g r o w t h r a t e a n da l k a l o i d p r o d u c t i o n ( 2 7 ) . D u r i n g t h e c o u r s e o fs e l e c t i o n a n d s c r e e n i n g e x p e r i m e n t s , t h e c o m -p o s i t i o n o f t h e t a p w a t e r u s e d t o p r e p a r e t h em e d i a w a s s h o w n t o h a v e a v e r y s t r o n g i n f l u e n c eo n a l k a l o i d p r o d u c t i o n ( 2 8 ) . E f f o r t s w e r e ,t h e r e f o r e , u n d e r t a k e n t o e s t a b l i s h a d e f i n e dm e d i u m f o r t h e p r o d u c t i o n o f l y s e r g i c a c i da l k a l o i d s . T h i s was a c c o m p l i s h e d b y o b t a i n i n g ac o m p l e t e a n a l y s i s ( n e u t r o n a c t i v a t i o n ) o f as a m p l e o f t a p w a t e r t h a t s u p p o r t e d h i g h a l k a -l o i d p r o d u c t i o n , c r e a t i n g a m e d i u m t h a t c o n -t a i n e d t h e a p p r o p r i a t e i n o r g a n i c s a l t s t o s i m u l a t et h e m e d i u m p r e p a r e d w i t h t a p w a t e r , a n d f i n a l l y

o m i t t i n g e a c h o f t h e i n o r g a n i c s a l t s , s i n g l y , t od e t e r m i n e w h i c h o n e s w e r e e s s e n t i a l f o r g r o w t ha n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n ( 2 1 ) . W i t h t h i s m e t h o d ,t h e r e q u i r e m e n t f o r c e r t a i n e l e m e n t s w a s e s -t a b l i s h e d , b u t t h e r e q u i r e m e n t f o r a f e w o f t h et r a c e e l e m e n t s w a s n o t c l a r i f i e d .On t h e b a s i s o f t h e s e r e s u l t s , t w o d e f i n e dm e d i a w e r e d e v i s e d ; o n e c o n t a i n e d f i v e s a l t sa n d t h e o t h e r c o n t a i n e d e i g h t s s a l t s . A s e r i e so f i s o l a t e s e l e c t i o n s w a s c o n d u c t e d w i t h e a c h o ft h e s e m e d i a . T h e s u p e r i o r i t y o f t h e e i g h t - s a l tm e d i u m o v e r t h e f i v e - s a l t m e d i u m w a s d e m o n -s t r a t e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s ( 2 1 ) .T h e s e l e c t i o n s e r i e s c o n d u c t e d w i t h t h e e i g h t -s a l t m e d i u m m a d e a v a i l a b l e s e v e r a l i s o l a t e sc a p a b l e o f p r o d u c i n g m o r e t h a n 1 , 0 0 0 , u g o ft o t a l a l k a l o i d s p e r m l i n a d e f i n e d m e d i u m . T h e s ei s o l a t e s , t o g e t h e r w i t h t h e d e f i n e d m e d i u mp r o v i d e d a v e r y c o n v e n i e n t s y s t e m f o r a p r e c i s ed e t e r m i n a t i o n o f t h e i n o r g a n i c r e q u i r e m e n t s f o rg r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n . T h e r e s u l t s o fs u c h a s t u d y a r e p r e s e n t e d i n t h i s r e p o r t .M A T E R L A L S AND METODSC u l t u r e . A n i s o l a t e o f C . p a s p a l i , n o . 3 1 o f t h e f i f t hs e l e c t i o n on t h e e i g h t - s a l t m e d i u m , w as u s e d i n t h e s es t u d i e s ( 2 1 ) . Tw o s t o c k s l a n t s o f t h i s i s o l a t e w e r e em-p l o y e d . T h e f i r s t w a s t h e o r i g i n a l s l a n t p r e p a r e d a t t h et i m e t h e i s o l a t e w a s s e l e c t e d ( 2 1 ) ; t h e s e c o n d was as l a n t , d e s i g n a t e d 1 H - 1 , p r e p a r e d f r o m t h e o r i g i n a l .A l l s l a n t s w e r e m a i n t a i n e d on p o t a t o - d e x t r o s e - a g a r( P D A ; 1 ) a t 2 t o 3 C i n t i g h t l y c l o s e d s c r e w - c a p t u b e s .

1 2 7 0


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PRODUCTION OF LYSERGIC ACID DERIVATIVEST A B L E 1 . C o n c e n t r a t i o n s o f i n o r g a n i c s a l t si n t h e e i g h t - s a l t m e d i u m

S a l t S a l t S a l t C a t i o nm o l e s / l i t e r m g / l i t e r m g / l i t e r

C a ( N O 3 ) 2 - 4 H 2 0... 1 . 2 7 X 1 0 3 3 0 0 5 0 . 9M g S O 4 * 7 H 2 0 . . . . . . 3 . 2 5 X 1 0 - 3 8 0 0 7 9Z n S O 4 * 7 H 2 O . . . . . . 1 . 7 4 X 1 0 - a 5 1 . 1 4F e S O 4 * 7 H 2 0 . . ....... 8 0 X 1 0 4 5 0 1 0C u S O 4 - 5 H 2 0 . . . . . . 2 . 0 1 X 1 0 - 6 5 1 . 2 7M n S O 4 * 4 H 2 0 . . . . . .. 4 8 X 1 0 - 5 1 0 2 . 4 6NaNO3 . . . . . . . . . . . 1 . 1 9 X 1 0 - 3 1 0 0 2 7KH2PO4a. 7 . 3 5 X 1 0 - 3 1 , 0 0 0 2 2 7 . 6a T h e f i g u r e i n c o l u m n 4 r e p r e s e n t s m i l l i g r a m so f p h o s p h o r u s p e r l i t e r .M e d i a . B a s a l m e d i u m I c o n t a i n e d 4% m a n n i t o la n d 1% s u c c i n i c a c i d ; i t w a s u s e d t o g e t h e r w i t h a p -p r o p r i a t e s a l t s f o r t h e f i r s t a n d s e c o n d s t a g e o f t h et h r e e - s t a g e s u b m e r g e d c u l t u r e p r o c e d u r e . B a s a l m e -d i u m I I c o n t a i n e d 5% m a n n i t o l a n d 3% s u c c i n i c a c i d ;i t w a s u s e d t o g e t h e r w i t h v a r i o u s s a l t s f o r t h e t h i r ds t a g e ( a l k a l o i d - p r o d u c i n g ) o f t h e s u b m e r g e d c u l t u r ep r o c e d u r e . F o r a l l f e r m e n t a t i o n s , e x c e p t t h o s e i nw h i c h m a g n e s i u m a n d s u l f u r w e r e s t u d i e d , t h e s a l t su s e d i n b o t h m e d i u m I a n d m e d i u m I I w e r e v a r i a t i o n so f t h e m i x t u r e s h o w n i n T a b l e 1 .To d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f m a g n e s i u m a n d s u l f u rs e p a r a t e l y , m o d i f i c a t i o n s o f t h e b a s a l m e d i u m h a d t ob e e m p l o y e d . T h i s w a s d o n e , i n t h e c a s e o f m a g n e s i u m ,b y a d d i n g v a r i o u s a m o u n t s o f m a g n e s i u m a s m a g -n e s i u m s u l f a t e , w h i l e a t t h e s a m e t i m e i n s u r i n g t h en o r m a l l e v e l o f s u l f u r b y a d d i n g a p p r o p r i a t e a m o u n t so f a m m o n i u m s u l f a t e . I n t h e s t u d y o f s u l f u r , t h i s e l e -m e n t w a s c o n t r i b u t e d s o l e l y b y m a g n e s i u m s u l f a t e .M a g n e s i u m w a s m a i n t a i n e d a t i t s n o r m a l l e v e l i n a l lc a s e s b y t h e a d d i t i o n o f a p p r o p r i a t e a m o u n t s o f m a g -n e s i u m s u c c i n a t e . O t h e r m e t a l s u l f a t e s w e r e r e p l a c e db y q u a n t i t i e s o f t h e i r r e s p e c t i v e n i t r a t e s s u f f i c i e n t t og i v e t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n o f c a t i o n .T h e pH o f a l l m e d i a w a s a d j u s t e d t o 5 . 2 w i t h am-m o n i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n .A l l w a t e r u s e d i n f e r m e n t a t i o n m e d i a w a s p r e p a r e db y r e d i s t i l l i n g l a b o r a t o r y - d i s t i l l e d w a t e r f r o m an a l l -g l a s s s t i l l . W a t e r t h u s p r e p a r e d w a s s t o r e d i n a l a r g e ,a c i d - c l e a n e d , P y r e x c o n t a i n e r . R e l a t i v e p u r i t y o f g l a s s -d i s t i l l e d w a t e r w a s c h e c k e d w i t h a B a r n s t e a d p u r i t ym e t e r .M a n n i t o l w a s d e m i n e r a l i z e d b y p a s s i n g a 1 0 % s o l u -t i o n o f t h i s p o l y o l t h r o u g h a c o l u m n o f an a n i o n i c -e x c h a n g e r e s i n ( D o w e x 1 - X 8 h y d r o x y l f o r m ) , a n dt h e n t h r o u g h a c o l u m n o f a c a t i o n i c - e x c h a n g e r e s i n

( D o w e x 5 0 - X 8 h y d r o g e n f o r m ) . T h i s p u r i f i e d s o l u t i o nw a s s t o r e d i n a l a r g e , a c i d - c l e a n e d P y r e x c o n t a i n e r .S u c c i n i c a c i d , p o t a s s i u m p h o s p h a t e , a n d o t h e rc h e m i c a l s w e r e r e a g e n t g r a d e . S i n g l e l o t n u m b e r s o fe a c h r e a g e n t w e r e u s e d f o r a l l o f t h e f e r m e n t a t i o n sd e s c r i b e d i n t h i s s t u d y .P r o c e d u r e . M o s t o f t h e s u b m e r g e d f e r m e n t a t i o n sw e r e c o n d u c t e d a c c o r d i n g t o t h e t h r e e - s t a g e p r o -c e d u r e d e s c r i b e d b e l o w . A s t o c k s l a n t w as r e m o v e df r o m c o l d s t o r a g e a n d u s e d t o i n o c u l a t e a f r e s h P D A

s l a n t . T h i s s l a n t w a s i n c u b a t e d f o r 7 d a y s a t 2 4 C .A f t e r t h i s p e r i o d o f t i m e , t h e e n t i r e m y c e l i a l g r o w t hw a s r e m o v e d f r o m t h e s l a n t , h o m o g e n i z e d i n as m a l l v o l u m e o f s t e r i l e m e d i u m I p l u s s a l t s , a n du s e d a s i n o c u l u m f o r 1 0 0 m l o f t h i s m e d i u m . T h i sf i r s t - s t a g e c u l t u r e w a s i n c u b a t e d o n t h e r o t a r y s h a k e ru n t i l h e a v y g r o w t h w a s e v i d e n t ( u s u a l l y 7 d a y s ) .T h e f i r s t - s t a g e c u l t u r e w a s h o m o g e n i z e d , a n d 1 0 m lo f t h e h o m o g e n a t e w a s i n t r o d u c e d a s i n o c u l u m f o r1 0 0 m l o f b a s a l m e d i u m I , p l u s s a l t v a r i a t i o n s .T h i s s e c o n d - s t a g e c u l t u r e w a s s h a k e n f o r 4 8 h r ;1 0 - m l p o r t i o n s w e r e t h e n u s e d t o i n o c u l a t e 1 0 0 m lo f b a s a l m e d i u m I I , p l u s s a l t v a r i a t i o n s . T h e t h i r ds t a g e c o n s t i t u t e d t h e a l k a l o i d - p r o d u c i n g s t a g e o f t h ef e r m e n t a t i o n p r o c e s s , a n d w a s i n c u b a t e d o n t h er o t a r y s h a k e r u n t i l a n a l y s e s s h o w e d t h a t g r o w t h a n da l k a l o i d p r o d u c t i o n h a d r e a c h e d t h e i r p e a k s .I n c e r t a i n e x p e r i m e n t s , t h e s u c c e s s i o n o f s u b -m e r g e d c u l t u r e s w a s c o n t i n u e d i n t o a f o u r t h a n d af i f t h s t a g e t o a c h i e v e s a t i s f a c t o r y d e p l e t i o n o f c e r t a i ne l e m e n t s i n t h e m e d i u m .F e r m e n t a t i o n s e m p l o y e d f o r t h e s t u d y o f K , C a ,M n , a n d Cu w e r e c o n d u c t e d i n d u p l i c a t e ; a l l o t h e r sw e r e i n t r i p l i c a t e .C o t t o n - p l u g g e d 5 0 0 - o r 1 , 0 0 0 - m l E r l e n m e y e rf l a s k s c o n t a i n i n g 1 0 0 o r 2 0 0 m l o f c u l t u r e m e d i u m ,r e s p e c t i v e l y , w e r e u s e d i n a l l f e r m e n t a t i o n s .A l l c u l t u r e s w e r e g r o w n o n a New B r u n s w i c kr o t a r y s h a k e r , m o d e l G - 5 3 , a t 2 4 C , i n t h e d a r k . T h es h a k e r w a s o p e r a t e d a t 2 5 0 r e v / m i n , a n d d e s c r i b e d ac i r c l e 5 cm i n d i a m e t e r .S t e r i l i z a t i o n . S t e r i l i z a t i o n o f c u l t u r e m e d i u m ,p i p e t t e s , a n d o t h e r i t e m s w a s a c c o m p l i s h e d b y h e a t i n gi n a n a u t o c l a v e a t 1 2 1 C , f o r 1 5 m i n .H o m o g e n i z a t i o n . Tw o h o m o g e n i z a t i o n p r o c e d u r e sw e r e u s e d i n t h e f e r m e n t a t i o n p r o c e s s : o n e t o h o m o g -e n i z e m y c e l i a l g r o w t h t a k e n f r o m f r e s h P D A s l a n t sa n d t h e o t h e r t o h o m o g e n i z e m y c e l i u m i n f u l l y g r o w nf i r s t s u b m e r g e d c u l t u r e s .H o m o g e n i z a t i o n o f m y c e l i a l g r o w t h t a k e n f r o ms l a n t s w a s a c c o m p l i s h e d b y t r a n s f e r r i n g a f r a g m e n to f m y c e l i u m t o a n 8 0 - m l h o m o g e n i z i n g c a n a l o n gw i t h a 2 0 - m l s a m p l e o f s t e r i l e , f i r s t - s t a g e c u l t u r em e d i u m . T h e m i x t u r e w a s h o m o g e n i z e d f o r 1 5 s e ca n d t h e n a d d e d t o t h e r e m a i n d e r o f t h e f i r s t - s t a g em e d i u m i n t h e f e r m e n t a t i o n f l a s k ( t o t a l v o l u m e ,1 0 0 m l ) .F u l l y g r o w n f i r s t - s t a g e c u l t u r e s w e r e h o m o g e n i z e db y t r a n s f e r r i n g t h e c o n t e n t s o f t h e f e r m e n t a t i o nf l a s k t o a 4 0 0 - m l h o m o g e n i z i n g c a n . T h e c o n t e n t s o ft h e c a n w e r e h o m o g e n i z e d f o r 1 0 s e c , a n d 1 0 m l o ft h e h o m o g e n a t e w a s u s e d t o i n o c u l a t e 1 0 0 m l o fb a s a l m e d i u m I c o n t a i n i n g s a l t v a r i a t i o n s .C l e a n i n g o f g l a s s w a r e . A l l e q u i p m e n t w a s f i r s tw a s h e d i n h o t d e t e r g e n t s o l u t i o n , r i n s e d i n t a p w a t e r ,d r i e d , a n d s u b m e r g e d i n a b a t h o f h o t , c o n c e n t r a t e dn i t r i c - s u l f u r i c ( 2 : 1 ) a c i d f o r a p p r o x i m a t e l y 1 5 m i n .T h e g l a s s w a r e w a s r e m o v e d f r o m t h i s b a t h a n d r i n s e df i v e t i m e s w i t h l a b o r a t o r y - d i s t i l l e d w a t e r , a n d f i n a l l yt w o t i m e s w i t h g l a s s - d i s t i l l e d w a t e r . A l l g l a s s w a r eu s e d f o r m e d i u m p r e p a r a t i o n , s t o r a g e , s a m p l i n g ,a n a l y s e s , a n d t h e f l a s k s i n w h i c h f e r m e n t a t i o n s werec o n d u c t e d w e r e c l e a n e d a c c o r d i n g t o t h i s p r o c e d u r e .G e n e r a l a n a l y t i c a l m e t h o d s . A B a u s c h & Lomb

1 2 7 1O L . 1 5 , 1 9 6 7


3/14

1 2 7 2 ROSAZZA, KELLEHES p e c t r o n i c - 2 0 c o l o r i m e t e r w a s u s e d i n t h e a n a l y s e sf o r t o t a l a l k a l o i d , z i n c , p h o s p h a t e , a n d i r o n . I nt h e s e a n a l y s e s , a b s o r b a n c e s w e r e m e a s u r e d i n 0 . 5 - i n c h( 1 . 3 c m ) , u n i f o r m l y r o u n d t e s t t u b e s .A C a r y d o u b l e - b e a m s p e c t r o p h o t o m e t e r , m o d e l1 5 , w a s u s e d i n t h e d e t e r m i n a t i o n s o f c o p p e r a n dm a n g a n e s e . I t s u s e i n t h e c o p p e r a n a l y s i s w a s d i c -t a t e d b y t h e s m a l l v o l u m e o f t h e f i n a l c o l o r e d s o l u -t i o n . I t s u s e i n t h e m a n g a n e s e d e t e r m i n a t i o n w a sb a s e d o n t h e a b i l i t y o f t h e i n s t r u m e n t t o a c c o m m o d a t es p e c i a l c a p i l l a r y a b s o r p t i o n c e l l s c o n s t r u c t e d a c c o r d -i n g t o t h e s p e c i f i c a t i o n s o f K e l l e h e r a n d J o h n s o n( 1 7 ) . S u c h c e l l s h a d a l i g h t p a t h o f a p p r o x i m a t e l y5 cm a n d r e q u i r e d o n l y a b o u t 0 . 5 - m l s a m p l e s f o rf i l l i n g . T h i s c o m b i n a t i o n o f l on g l i g h t p a t h a n d s m a l lv o l u m e r e q u i r e m e n t s p e r m i t t e d a p p r o x i m a t e l y a1 0 0 - f o l d i n c r e a s e i n t h e s e n s i t i v i t y o f t h e m a n g a n e s ed e t e r m i n a t i o n s .

C o n f o r m a n c e t o B e e r ' s l a w o v e r t h e c o n c e n t r a t i o nr a n g e s e n c o u n t e r e d w a s e s t a b l i s h e d f o r a l l o f t h ea n a l y s e s e m p l o y e d . A l l m e t h o d s w e r e e v a l u a t e dw i t h r e c o v e r y s a m p l e s a d d e d t o c u l t u r e f i l t r a t e s .A m e t h o d w a s n o t c o n s i d e r e d s u i t a b l e f o r u s e w i t he x p e r i m e n t a l s a m p l e s u n l e s s r e c o v e r y w a s 1 0 0 d 5 % .C on ce nt r a t i on s o f e l e m e n t s i n e x p e r i m e n t a l s a m -p l e s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e m e a s u r e d a b s o r b a n c e s ;t h e s e v a l u e s w e r e r e l a t e d t o s t a n d a r d c u r v e s b y t h ei n c l u s i o n o f r e f e r e n c e s t a n d a r d s f o r e a c h a n a l y s i s .T h e r e f e r e n c e s t a n d a r d s w e r e r u n t h r o u g h t h e e n t i r ea n a l y t i c a l p r o c e d u r e ( i n c l u d i n g w e t d i g e s t i o n ) i na l l c a s e s .S a m p l i n g p r o c e d u r e . S a m p l e s ( 5 o r 1 0 m l ) o ft h i r d - s t a g e c u l t u r e s w e r e t a k e n a t v a r i o u s i n t e r v a l sd u r i n g t h e c o u r s e o f f e r m e n t a t i o n s . M y c e l i u m w a ss e p a r a t e d f r o m c u l t u r e b r o t h b y s u c t i o n f i l t r a t i o nt h r o u g h t a r e d Whatman n o . 1 f i l t e r - p a p e r d i s c s .T h e m y c e l i u m w a s t h e n w a s h e d w i t h 3 0 m l o f d i s -t i l l e d w a t e r , d r i e d i n a n o v e n f o r 2 4 h r a t 7 0 C ,a n d w e i g h e d t o d e t e r m i n e m y c e l i a l d r y w e i g h t s .T h e f i l t r a t e w a s a n a l y z e d f o r t o t a l a l k a l o i d s a n df o r p H .S a m p l e s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f i n o r g a n i c c o n -s t i t u e n t s i n t h e m e d i u m w e r e w i t h d r a w n i m m e d i a t e l ya f t e r i n o c u l a t i o n . M y c e l i u m w a s s e p a r a t e d f r o m t h em e d i u m b y f i l t r a t i o n t h r o u g h s i n t e r e d - g l a s s f u n n e l s .T h e f i l t r a t e s w e r e p l a c e d i n 1 0 - m l , a c i d - c l e a n e d v i a l sa n d w e r e s t o r e d i n t h e f r o z e n s t a t e ( - 2 0 C ) u n t i ln e e d e d f o r a n a l y s e s . O n e o f t h e f o l l o w i n g a n a l y s e sw a s p e r f o r m e d o n c u l t u r e f i l t r a t e s o b t a i n e d i n t h i sm a n n e r : p h o s p h a t e , c o p p e r , i r o n , m a n g a n e s e , o rz i n c .A s h i n g p r o c e d u r e . O x i d a t i o n o f o r g a n i c m a t t e rp r e s e n t i n c u l t u r e f i l t r a t e s w a s a c c o m p l i s h e d b y aw e t - a s h i n g p r o c e d u r e w i t h t h e u s e o f a t e r n a r ya c i d m i x t u r e . T h i s m i x t u r e c o n t a i n e d c o n c e n t r a t e dn i t r i c , 60% p e r c h l o r i c , a n d c o n c e n t r a t e d s u l f u r i ca c i d s i n t h e p r o p o r t i o n 1 0 : 3 : 1 , r e s p e c t i v e l y ( 3 9 ) .A 5 - m l a m o u n t o f t h i s m i xt u r e w a s f o u n d t o b ea d e q u a t e f o r t h e c o m p l e t e d i g e s t i o n o f a l l t h e o r g a n i cm a t t e r c o n t a i n e d i n 1 0 m l o f t h e c u l t u r e f i l t r a t e .S a m p l e s w e r e p l a c e d i n m i c r o - K j e l d a h l d i g e s t i o nt u b e s , a l o n g w i t h 5 m l o f t h e d i g e s t i o n m i x t u r e a n da n a c i d - c l e a n e d g l a s s b e a d . T h e t u b e s w e r e p l a c e do n a r o t a r y , e l e c t r i c a l l y h e a t e d K j e l d a h l d i g e s t i o n

, AND SCHWARTING A P P L . M I C R O B I O L .a p p a r a t u s e q u i p p e d w i t h a g l a s s f u m e h o o d . T h et u b e s w e r e h e a t e d s o t h a t b o i l i n g o f t h e a c i d m i x t u r e( 1 5 - m l v o l u m e ) u s u a l l y o c c u r r e d w i t h i n 3 m i n f r o mt h e t i m e t h e d i g e s t i o n w a s i n i t i a t e d . C h a r r i n g o fo r g a n i c m a t e r i a l b e g a n a f t e r n i t r i c a c i d h a d b e e nd i s t i l l e d f r o m t h e m i x t u r e . When t h e c o n t e n t s o f t h et u b e s h a d c l e a r e d , t h e d i g e s t i o n w a s c o n t i n u e d f o ra n a d d i t i o n a l 0 . 5 h r . A t t h e e n d o f t h e d i g e s t i o np r o c e s s , a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 m l o f a m i x t u r e o f s u l -f u r i c a c i d , p e r c h l o r i c a c i d , a n d i n o r g a n i c s a l t s r e -m a i n e d i n t h e d i g e s t i o n t u b e s .F o r t h e m a n g a n e s e a n a l y s i s , i t w a s n e c e s s a r y t oe m p l o y a d i f f e r e n t d i g e s t i o n p r o c e d u r e t o a v o i d t h ei n t e r f e r e n c e c a u s e d b y i n s o l u b l e p e r c h l o r a t e s a l t s .B e c a u s e t h e l e v e l o f a c i d p r e s e n t i n t h e f i n a l a n a l y s i sm i x t u r e i s c r i t i c a l f o r t h e c o m p l e t e f o r m a t i o n a n ds t a b i l i t y o f t h e p e r m a n g a n a t e c o l o r , i t w a s n e c e s s a r yt o c o n t r o l t h e a m o u n t s o f a c i d w h i c h r e m a i n e d i n t h ed i g e s t i o n t u b e s a f t e r o r g a n i c m a t t e r h a d b e e n d e -s t r o y e d .To a c c o m m o d a t e t h e s e r e q u i r e m e n t s , t h e f o l -l o w i n g w e t - a s h p r o c e d u r e w a s e m p l o y e d .A 5 - m l a m o u n t o f a m i x t u r e o f c o n c e n t r a t e dn i t r i c - s u l f u r i c a c i d s ( 9 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s a m p l ec o n t a i n e d i n m i c r o - K j e l d a h l d i g e s t i o n t u b e s . A na c i d - c l e a n e d g l a s s b e a d w a s a d d e d , a n d t h e s a m p l e sw e r e h e a t e d o n t h e a p p a r a t u s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y .C h a r r i n g o f o r g a n i c m a t e r i a l c o m m e n c e d a f t e r a l lt h e n i t r i c a c i d h a d b e e n d i s t i l l e d f r o m t h e d i g e s t i o nm i x t u r e . C h a r r i n g w a s u s u a l l y a c c o m p a n i e d b y t h ea p p e a r a n c e o f f u m e s o f s u l f u r i c a c i d . A t t h i s p o i n t ,t h e d i g e s t i o n t u b e s w e r e r e m o v e d f r o m t h e b u r n e r s .T h i r t y p e r c e n t h y d r o g e n p e r o x i d e w a s a d d e d d r o p -w i s e t o t h e c h a r r e d m i x t u r e u n t i l t h e m i x t u r e c l e a r e d .T h e c l e a r e d m i x t u r e s w e r e r e h e a t e d o n t h e b u r n e r su n t i l c h a r r i n g c o m m e n c e d a g a i n . T h e a d d i t i o n o fh y d r o g e n p e r o x i d e w a s r e p e a t e d u n t i l t h e m i x t u r e i nt h e t u b e s r e m a i n e d c l e a r a f t e r h e a t i n g f o r 1 0 m i n .A t t h e e n d o f t h i s d i g e s t i o n p r o c e d u r e , a p p r o x i m a t e l y0 . 5 m l r e m a i n e d i n t h e d i g e s t i o n t u b e s .A l k a l o i d . T o t a l a l k a l o i d w a s d e t e r m i n e d c o l o r i -m e t r i c a l l y b y t h e m e t h o d o f M i c h e l o n a n d K e l l e h e r( 2 2 ) . O p t i c a l d e n s i t i e s w e r e o b t a i n e d a t 5 9 0 m , u .T o t a l a l k a l o i d w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e o p t i c a l d e n s i t yo f a n e r g o n o v i n e m a l e a t e s t a n d a r d a n d w a s e x p r e s s e da s e r g o n o v i n e m a l e a t e .I n o r g a n i c p h o s p h a t e . I n o r g a n i c p h o s p h a t e w a sd e t e r m i n e d b y t h e m o l y b d a t e m e t h o d o f B e r e n b l u ma n d C h a i n ( 2 ) .C o p p e r . T h i s e l e m e n t w a s d e t e r m i n e d b y a m o d i f i c a -t i o n o f t h e m e t h o d s o f B o r c h a r d t a n d B u t l e r ( 5 )a n d D i e h l a n d S m i t h ( 9 ) . B a t h o c u p r o i n e w a s e m -p l o y e d a s t h e c o l o r i m e t r i c r e a g e n t .D i g e s t e d s a m p l e s w e r e r i n s e d f r o m t h e m i c r o -K j e l d a h l t u b e s i n t o a c i d - c l e a n e d 1 2 5 - m l S q u i b b -t y p e s e p a r a t o r y f u n n e l s , w i t h s e v e r a l s m a l l p o r t i o n so f g l a s s - d i s t i l l e d w a t e r ( t o t a l v o l u m e , 1 5 m l ) . A s m a l ls q u a r e o f c o n g o r e d i n d i c a t o r p a p e r was p l a c e di n t h e s o l u t i o n s i n t h e s e p a r a t o r y f u n n e l s , a n d 2 8 %ammonium h y d r o x i d e s o l u t i o n w a s a d d e d u n t i l t h ep a p e r t u r n e d r e d . T h e n , 1 0 more d r o p s o f t h e 2 8 %a m m o n i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n w a s a d d e d t o e a c hs a m p l e . T h e s o l u t i o n w a s t r e a t e d , i n s u c c e s s i o n , w i t h2 m l o f c o p p e r - f r e e h y d r o x y l a m i n e h y d r o c h l o r i d e

- R I


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PRODUCTION OF LYSERGIC ACID DERIVATIVESs o l u t i o n ( 1 0 % a q u e o u s ) , 1 . 0 m l o f 0 . 0 1 M b a t h o c u -p r o i n e i n h e x a n o l - c h l o r o f o r m ( 1 : 9 ) , a n d e x a c t l y2 . 0 m l o f t h e h e x a n o l - c h l o r o f o r m m i x t u r e . T h e c o n -t e n t s o f t h e s e p a r a t o r y f u n n e l s w e r e t h e n v i g o r o u s l ys h a k e n a n d a l l o w e d t o s e p a r a t e . T h e a b s o r b a n c e o ft h e l o w e r , o r a n g e l a y e r , c o n t a i n i n g t h e b a t h o c u p r o i n e -c o p p e r c o m p l e x , w a s d e t e r m i n e d a t 4 7 9 m , .T h e h e x a n o l - c h l o r o f o r m ( 1 : 9 ) m i x t u r e w a s f o u n dt o b e s u p e r i o r t o t h e h e x a n o l o r i s o p e n t a n o l u s e d b yo t h e r s a s a n e x t r a c t a n t f o r t h e b a t h o c u p r o i n e - c o p p e rc o m p l e x ( 5 , 9 ) . C l o u d i n e s s d i d n o t p e r s i s t i n t h eh e x a n o l - c h l o r o f o r m m i x t u r e a s i t d i d w i t h e i t h e r o ft h e s e a l c o h o l s a l o n e . T h e a l c o h o l s a l s o t e n d e d t of o r m s t a b l e e m u l s i o n s w h e n s h a k e n w i t h t h e a q u e o u sa c i d - d i g e s t e d s a m p l e s .I r o n . I r o n w a s d e t e r m i n e d b y a c o m b i n a t i o n o f t h ep r oc e d u r e s u s e d b y D i e h l a n d S m i t h ( 1 0 ) a n d R u b i n sa n d H a g s t r o m ( 2 9 ) . B a t h o p b e n a n t h r o l i n e w a s e m -p l o y e d a s t h e c o l o r i m e t r i c r e a g e n t f o r t h e s e a s s a y s .A 5 - m l a m o u n t o f g l a s s - d i s t i l l e d w a t e r w a s a d d e dt o e a c h o f t h e d i g e s t e d s a m p l e s , a n d t h e m i x t u r e sw e r e b r o u g h t t o a b o i l . T h e s o l u t i o n s w e r e t r a n s f e r r e dt o 1 2 5 - m l S q u i b b - t y p e s e p a r a t o r y f u n n e l s , a n d t h ed i g e s t i o n t u b e s w e r e r i n s e d s e v e r a l t i m e s w i t h g l a s s -d i s t i l l e d w a t e r . T h e w a s h i n g s w e r e a d d e d t o t h es o l u t i o n s i n t h e s e p a r a t o r y f u n n e l s ( t o t a l v o l u m e i ne a c h s e p a r a t o r y f u n n e l , 2 0 m l ) . Tw o m l o f i r o n -f r e e h y d r o x y l a m i n e h y d r o c h l o r i d e ( 1 0 % a q u e o u s ) a n da s m a l l s q u a r e o f c o n g o r e d i n d i c a t o r p a p e r w e r ea d d e d t o t h e s e p a r a t o r y f u n n e l s . Ammonium h y -d r o x i d e s o l u t i o n w a s a d d e d d r o p w i s e t o t h e m i x t u r e si n t h e s e p a r a t o r y f u n n e l s u n t i l t h e i n d i c a t o r p a p e r sj u s t t u r n e d r e d . A d j u s t m e n t o f pH w a s c o m p l e t e db y t h e a d d i t i o n o f a pH 3 . 5 p o t a s s i u m f o r m a t eb u f f e r ( 4 M ) . F i v e m l o f 0 . 0 0 1 M b a t h o p h e n a n t h r o l i n es o l u t i o n [ 5 0 % ( v / v ) w a t e r - e t h y l a l c o h o l ] w a s t h e na d d e d , f o l l o w e d b y 1 0 m l o f t h e i s o a m y l a l c o h o l -c h l o r o f o r m m i x t u r e ( 1 : 9 ) . T h e c o n t e n t s o f t h e s e p a -r a t o r y f u n n e l s w e r e s h a k e n , a n d t h e l a y e r s w e r e a l -l o w e d t o s e p a r a t e . T h e l o w e r o r g a n i c l a y e r w a sw i t h d r a w n , a n d i t s o p t i c a l d e n s i t y w a s d e t e r m i n e d a t5 3 5 m p .

D i e h l a n d S m i t h ( 1 0 ) e m p l o y e d a s o d i u m a c e t a t e -a c e t i c a c i d b u f f e r i n t h e i r a s s a y p r o c e d u r e f o r t h i se l e m e n t . I n t h e s e s t u d i e s , t h i s p r o c e d u r e g a v e r e -c o v e r i e s o f 6 0 t o 90% w h e n a p p l i e d t o t h e a n a l y s i so f b r o t h c o n t a i n i n g s t a n d a r d a d d i t i o n s o f i r o n .I n v e s t i g a t i o n o f t h e p o s s i b l e c a u s e s o f s u c h l o wr e c o v e r i e s w a s u n d e r t a k e n . T h e p r e s e n c e o f o t h e rm e t a l s , s i n g l y a n d i n c o m b i n a t i o n , w a s s h o w n t oh a v e n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e r e c o v e r y o f 5 u go f i r o n . T h e s e m e t a l s a n d t h e i r c o n c e n t r a t i o n s i n1 0 m l o f c u l t u r e f i l t r a t e w e r e : m a g n e s i u m , 0 . 8 m g ;c o p p e r , 0 . 0 1 m g ; p o t a s s i u m , 2 . 7 m g ; c a l c i u m , 0 . 5m g ; m a n g a n e s e , 0 . 0 2 5 m g ; a n d z i n c , 0 . 0 1 m g . T h ee f f e c t o f pH w a s a l s o i n v e s t i g a t e d . I t was f o u n d t h a tt h e pH o f t h e s y s t e m w i t h s o d i u m a c e t a t e - a c e t i c a c i db u f f e r r a n g e d f r o m 4 . 5 5 t o 4 . 8 i n a n u m b e r o f sam-p l e s . A c c o r d i n g t o R u b i n s a n d H a g s t r o m ( 2 9 ) , r e -c o v e r i e s o f i r o n a d d e d t o s a m p l e s w e r e b e s t i n t h epH r a n g e o f 3 . 2 t o 4 . 0 . I t was t h e r e f o r e c o n c l u d e dt h a t a d i f f e r e n t b u f f e r was n e e d e d f o r t h i s a n a l y s i s .F o r m i c a c i d , w i t h a p K a o f 3 . 7 6 a n d a b u f f e r i n g r a n g ec e n t e r e d a t t h i s v a l u e was c h o s e n a s t h e new b u f f e r .

R e c o v e r i e s o f i r o n o b t a i n e d w i t h t h i s b u f f e r s y s t e ma v e r a g e d 1 0 1 % .M a n g a n e s e . M a n g a n e s e w a s d e t e r m i n e d b y ap e r i o d a t e o x i d a t i o n o f M n + 2 t o M n + 7 v a l e n c y s t a t e( 1 8 , 3 1 ) a n d c o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f t h e p e r -m a n g a n a t e c o l o r .D i g e s t e d s a m p l e s w e r e d i l u t e d w i t h 3 . 5 m l o fp h o s p h o r i c a c i d s o l u t i o n ( 1 4 5 m l o f 85% p h o s p h o r i ca c i d p e r l i t e r ) , a n d 1 5 mg o f p o t a s s i u m m e t a - p e r i o d a t ew a s a d d e d t o s a m p l e s i n t h e m i c r o - K j e l d a h l d i g e s t i o nt u b e s . T h e t u b e s w e r e r e t u r n e d t o t h e h e a t i n g a p p a -r a t u s a n d t h e c o n t e n t s w e r e b r o u g h t t o a b o i l . B o i l i n gw a s c o n t i n u e d u n t i l d e v e l o p m e n t o f t h e p u r p l ep e r m a n g a n a t e w a s n o t e d . H e a t i n g w a s c o n t i n u e d t om a i n t a i n t h e c o n t e n t s j u s t b e l o w t h e i r b o i l i n g p o i n t sf o r 3 0 m i n . S a m p l e s w e r e r e m o v e d f r o m t h e b u r n e r s ,c o o l e d , a n d d i l u t e d t o 5 . 0 m l w i t h p e r i o d a t e - t r e a t e dw a t e r . T h e s o l u t i o n s w e r e t h e n h e a t e d i n a b o i l i n gw a t e r b a t h f o r 3 0 m i n t o i n s u r e c o m p l e t e d e v e l o p m e n to f t h e p e r m a n g a n a t e c o l o r . A f t e r t h e s a m p l e s h a dc o o l e d , o p t i c a l d e n s i t i e s w e r e d e t e r m i n e d a t 5 2 3 mui n t h e c a p i l l a r y a b s o r p t i o n c e l l s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y .Z i n c . Z i n c w a s d e t e r m i n e d b y a m o d i f i c a t i o n o ft h e m e t h o d s o f B u t t s e t a l . ( 6 ) a n d S e r f a s s e t a l .( 3 4 ) . D i g e s t e d s a m p l e s w e r e r i n s e d i n t o 1 2 5 - m lS q u i b b - t y p e s e p a r a t o r y f u n n e l s w i t h s e v e r a l s m a l lw a s h i n g s o f g l a s s - d i s t i l l e d w a t e r ( t o t a l v o l u m e ,a b o u t 3 0 m l ) . Tw o m l o f s o d i u m c i t r a t e s o l u t i o n( 1 0 % a q u e o u s ) t h a t h a d b e e n r e n d e r e d z i n c - f r e e a n d2 d r o p s o f m e t h y l r e d i n d i c a t o r s o l u t i o n w e r e a d d e dt o t h e s a m p l e s . A m m n o n i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n w a st h e n a d d e d d r o p w i s e u n t i l t h e i n d i c a t o r t u r n e d y e l l o w .T h i s t r e a t m e n t w a s f o l l o w e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 m lo f p o t a s s i u m c y a n i d e ( 1 % a q u e o u s ) . G l a c i a l a c e t i ca c i d w a s t h e n u s e d t o a d j u s t t h e i n d i c a t o r t o a n e u t r a lp e a c h c o l o r ( a p p r o x i m a t e l y pH 6 ) . T h e i n d i c a t o r w a sr e m o v e d f r o m t h e s a m p l e s b y s h a k i n g t h e c o n t e n t so f t h e s e p a r a t o r y f u n n e l s w i t h 1 0 m l o f c a r b o nt e t r a c h l o r i d e w h i c h h a d b e e n d i s t i l l e d i n a n a l l - g l a s sa p p a r a t u s . T h i s c a r b o n t e t r a c h l o r i d e l a y e r w a s t h e nd i s c a r d e d . O n e m l o f b i s - 2 - h y d r o x y e t h y l d i t h i o c a r -b a m a t e ( 6 ) a n d 1 0 m l o f d i t h i z o n e i n c a r b o n t e t r a -c h l o r i d e ( 0 . 0 1 % ) w e r e a d d e d t o t h e m i x t u r e s i n t h es e p a r a t o r y f u n n e l s . T h e m i x t u r e s w e r e s h a k e nv i g o r o u s l y f o r a b o u t 3 0 s e c . A f t e r t h e t w o i m m i s c i b l el a y e r s h a d s e p a r a t e d , t h e g r e e n t o p u r p l e z i n c -d i t h i z o n a t e l a y e r ( l o w e r l a y e r ) w a s d r a i n e d i n t o ac l e a n s e p a r a t o r y f u n n e l . A s e c o n d e x t r a c t i o n w i t h a1 0 - m l p o r t i o n o f d i t h i z o n e s o l u t i o n w a s p e r f o r m e d .T h i s o r g a n i c l a y e r w a s c o m b i n e d w i t h t h a t r e m o v e di n t h e f i r s t e x t r a c t i o n . T e n m l o f s o d i u m s u l f i d es o l u t i o n ( 0 . 0 4 % a q u e o u s ) w a s t h e n a d d e d t o t h ec o m b i n e d z i n c - d i t h i z o n a t e s o l u t i o n s t o r e m o v e e x c e s sd i t h i z o n e . T h i s m i x t u r e w a s s h a k e n f o r a b o u t 1 5s e c , t h e l a y e r s w e r e a l l o w e d t o s e p a r a t e , a n d t h e u p p e ra q u e o u s l a y e r r e m a i n e d c o l o r l e s s , o r o n l y f a i n t l yy e l l o w . T h e r e d z i n c - d i t h i z o n a t e c o m p l e x s o l u t i o n sw e r e d i l u t e d t o 2 5 m l w i t h g l a s s - d i s t i l l e d c a r b o nt e t r a c h l o r i d e , a n d t h e o p t i c a l d e n s i t i e s w e r e m e a s u r e da t 5 3 5 m , u .

R E s U L T SA p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t w as c o n d u c t e d t oe s t a b l i s h t h e a p p r o x i m a t e r e q u i r e m e n t s f o r t h e

V O L . 1 5 , 1 9 6 7 1 2 7 3


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ROSAZZA, KELLEHER, AND SCHWARTINGT A B L E 2 . E f f e c t o f o m i t t i n g s i n g l e s a l t s o n g r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n b y C l a v i c e p s p a s p a l i

3 r d s t a g e c u l t u r e ( 1 : 1 0 0 d i l u t i o n ) 4 t h s t a g e c u l t u r e ( 1 : 1 , 0 0 0 d i l u t i o n ) 5 t h s t a g e c u l t u r e ( 1 : 1 0 , 0 0 0 d i l u t i o n )S a l t o m i t t e d

A g e A l k a l o i d M y c e l i u m A g e A l k a l o i d M y c e l i u m A g e A l k a l o i d M y c e l i u md a y s p g / m i g / 1 0 0 m l d a y s p g / m l g I l O / m l d a y s , u g / m l g / 1 0 0 m lNone ................ 1 0 5 8 1 2 . 3 6 1 1 1 4 7 0 2 . 4 7 0 5 2 8 4 2 . 9 9 11 0 5 9 7 2 . 4 6 1 8 3 4 4 2 . 2 9 1 5 1 8 9 2 . 8 4 0Ca(NO3)2*4H20. 1 1 . 5 8 1 0 2 . 7 1 1 1 8 . 5 5 1 0 2 . 3 5 0 a 1 3 4 9 8 2 . 1 6 41 1 . 5 8 5 6 2 . 4 6 2 1 8 . 5 3 9 7 2 . 4 5 1 a 1 2 5 1 0 2 . 2 1 31 1 . 5 7 8 8 2 . 6 7 1 1 8 . 5 3 5 2 2 . 4 3 0 a 1 1 4 5 8 2 . 0 5 0M g S O 4 * 7 H 2 0 7 1 4 5 0 . 4 1 1 7 1 0 0 . 0 4 0 D i d n o t g r o w7 1 3 4 0 . 4 0 3 7 8 0 . 0 1 3 D i d n o t g r o w6 1 2 1 0 . 4 0 1 7 9 0 . 0 1 4 D i d n o t g r o wZnSO4 * 7 H 2 0.-one 0 . 3 5 8 - None 0 . 1 8 0 T e r m i n a t e d- None 0 . 3 5 3 None 0 . 1 5 3 T e r m i n a t e dNone 0 . 3 1 0 - None 0 . 2 3 0 T e r m i n a t e d

F e S O 4 - 7 H 2 0.10 6 7 1 . 5 9 3 7 1 2 8 0 . 4 6 9 6 2 3 0 . 4 6 69 2 2 6 1 . 4 9 0 1 0 9 0 0 . 5 3 9 6 1 8 0 . 3 9 81 0 2 1 6 1 . 3 1 7 8 9 4 0 . 5 4 6 7 1 7 0 . 5 7 8C u S 0 4 * 5 H 2 0 . . . . . . . . . . 1 0 1 6 5 2 . 8 9 0 1 0 2 2 3 2 . 8 9 5 1 0 8 9 2 . 9 7 09 1 7 6 2 . 9 4 8 1 0 1 7 9 2 . 9 3 7 1 0 8 0 2 . 3 0 29 1 7 6 2 . 9 1 8 1 1 1 8 9 2 . 8 0 3 1 1 9 5 2 . 7 9 7MnSO4-4H20. 9 3 0 1 2 . 6 1 2 8 2 1 4 2 . 9 3 7 9 7 8 2 . 1 4 28 3 0 1 2 . 6 9 7 8 2 2 0 2 . 5 7 3 7 7 4 2 . 4 7 68 3 0 1 2 . 6 9 7 8 2 4 5 2 . 9 2 1 7 8 0 2 . 3 0 7NaNO3.103 3 2 . 4 2 7 1 3 4 5 3 2 . 5 8 4 9 . 5 4 3 5 2 . 0 5 31 0 4 5 8 2 . 3 8 4 1 1 5 2 6 2 . 5 6 2 9 . 5 4 5 7 2 . 2 1 3a T h e s e n u m b e r s d o n o t r e p r e s e n t p e a k v a l u e s .

e i g h t s a l t s l i s t e d i n T a b l e 1 . T h i s w a s c a r r i e do u t i n a m a n n e r s i m i l a r t o t h a t u s e d i n a n e a r l i e re x p e r i m e n t w i t h i s o l a t e n o . 2 ( 2 1 ) : e a c h s a l tw a s o m i t t e d , s i n g l y , f r o m a l l s t a g e s o f t h ef e r m e n t a t i o n b e y o n d t h e f i r s t . I n t h i s e x p e r i m e n t ,b a s a l m e d i u m I p l u s t h e e i g h t s a l t s s h o w n i nT a b l e 1 w a s u s e d f o r t h e f i r s t s t a g e ; t h e s a m eb a s a l m e d i u m c o n t a i n i n g o n l y K H 2 P O 4 w a su s e d f o r t h e s e c o n d s t a g e . B a s a l m e d i u m I Iw i t h a l l s a l t s e x c e p t o n e w a s u s e d f o r t h e t h i r ds t a g e . A l l o f t h e s e f e r m e n t a t i o n s w e r e c a r r i e di n t o a f o u r t h a n d f i f t h s t a g e i n o r d e r t o d i l u t ea d e q u a t e l y t h e s a l t s a d d e d t o t h e f i r s t - s t a g em e d i u m . T h e t h i r d a n d f o u r t h s t a g e s w e r e u s e da s i n o c u l a f o r t h e n e x t h i g h e r - n u m b e r e d c u l t u r ep r i o r t o t h e i r a t t a i n m e n t o f p e a k g r o w t h . I ne a c h c a s e , h o w e v e r , t h e s e c u l t u r e s w e r e r e t u r n e dt o t h e s h a k e r a n d p e r m i t t e d t o c o n t i n u e g r o w i n gu n t i l p e a k g r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n w e r er e a c h e d ( e x c e p t i n t h e c a s e o f c a l c i u m , a s i n d i -c a t e d ) . T h e r e s u l t s o f t h i s e x p e r i m e n t a r e s h o w ni n T a b l e 2 .T h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n T a b l e 2 w i t h i s o l a t en o . 3 1 s h o w t h a t t h e o m i s s i o n o f m a g n e s i u ms u l f a t e , z i n c s u l f a t e , o r i r o n s u l f a t e f r o m t h ec u l t u r e m e d i u m c a u s e d a d e c r e a s e i n b o t hg r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n . T h e o m i s s i o no f c o p p e r s u l f a t e o r m a n g a n e s e s u l f a t e c a u s e da d e c r e a s e i n a l k a l o i d p r o d u c t i o n b u t n o t i n

m y c e l i a l g r o w t h . I n c o n t r a s t t o t h e r e s u l t s o b -t a i n e d i n a s i m i l a r p r e v i o u s e x p e r i m e n t w i t hi s o l a t e n o . 2 ( 2 1 ) , t h e o m i s s i o n o f c a l c i u mn i t r a t e i n t h i s p r e s e n t e x p e r i m e n t d i d n o t c a u s e ad e c r e a s e i n g r o w t h o r a l k a l o i d p r o d u c t i o n . T h er a t e o f g r o w t h i n c a l c i u m - d e f i c i e n t m e d i u m w a ss i g n i f i c a n t l y r e t a r d e d , b u t a l k a l o i d p r o d u c t i o nw a s h i g h e r t h a n t h a t a t t a i n e d b y t h e c o n t r o l s .T h e o m i s s i o n o f s o d i u m n i t r a t e w a s w i t h o u ta p p r e c i a b l e e f f e c t o n g r o w t h , b u t r e s u l t e d i n ah i g h e r a l k a l o i d p r o d u c t i o n t h a n t h a t o f t h ec o n t r o l s . I n p r e v i o u s e x p e r i m e n t s w i t h i s o l a t en o . 2 , t h e o m i s s i o n o f s o d i u m n i t r a t e h a d n oe f f e c t o n g r o w t h o r a l k a l o i d p r o d u c t i o n . I ts h o u l d b e n o t e d t h e r e w a s a g r a d u a l d e c l i n e i np e a k a l k a l o i d p r o d u c t i o n b y s u c c e s s i v e s t a g e so f t h e c o n t r o l c u l t u r e s . T h i s h a d b e e n o b s e r v e dmany t i m e s i n t h e p a s t , a n d i t i s t h e r e s u l t o ft r a n s f e r . T h i s e f f e c t d e m o n s t r a t e s t h e n e c e s s i t yf o r p r e p a r i n g f r e s h i n o c u l u m f o r e a c h f e r m e n t a -t i o n .A s i d e f r o m t h e a m o u n t o f g r o w t h i n e a c hf l a s k , t h e a p p e a r a n c e o f a l l o f t h e c u l t u r e sw a s n o r m a l e x c e p t i n t h e c a s e o f t h o s e g r o w nu n d e r c o n d i t i o n s o f m a g n e s i u m a n d c o p p e rd e f i c i e n c y . N o r m a l c u l t u r e s h a v e a f a i n t y e l l o w -b r o w n c o l o r d u r i n g t h e f i r s t 2 t o 3 d a y s , t h e na s s u m e a t r a n s i e n t p i n k - b r o w n c o l o r , a n d f i n a l l yt u r n t o d e e p b r o w n o v e r t h e c o u r s e o f s e v e r a l

1 2 7 4 A P P L . M I C R O B I O L .


6/14

PRODUCTION OF LYSERGIC ACID DERIVATIVESd a y s . When m a g n e s i u m s u l f a t e w a s o m i t t e df r o m t h e m e d i u m , t h e c u l t u r e s i n t h e t h i r d a n df o u r t h s t a g e s t u r n e d b l a c k a n d e l a b o r a t e d ad a r k p i g m e n t i n t o t h e m e d i u m . T h e l a s t t h r e es t a g e s o f t h e c o p p e r - d e f i c i e n t c u l t u r e s w e r ev i r t u a l l y w i t h o u t p i g m e n t a t i o n .T h e a l k a l o i d a n d m y c e l i a l d r y w e i g h t d a t ac o n t a i n e d i n T a b l e 2 r e p r e s e n t p e a k v a l u e s .M y c e l i a l d r y w e i g h t s s h o w n i n t h i s t a b l e h a v eb e e n c o r r e c t e d f o r t h e w e i g h t s o f m y c e l i u m i n -t r o d u c e d i n t o t h e c u l t u r e f l a s k s a t t h e t i m e o fi n o c u l a t i o n . T h e t h i r d - a n d f o u r t h - s t a g e c u l t u r e sw e r e u s e d f o r i n o c u l a a f t e r 6 a n d 7 d a y s o fi n c u b a t i o n , r e s p e c t i v e l y .M a c r o - s a l t r e q u i r e m e n t s . To s t u d y m o r ep r e c i s e l y t h e i n o r g a n i c r e q u i r e m e n t s w i t h o u tt h e d i s a d v a n t a g e o f g o i n g i n t o a f o u r t h a n d af i f t h s t a g e o f t h e f e r m e n t a t i o n p r o c e s s , f i r s t - s t a g ec u l t u r e s w e r e p r e p a r e d w i t h a c o n c e n t r a t i o n o fa s a l t w h i c h w a s s h o w n b y p r e l i m i n a r y s t u d i e st o b e j u s t s u f f i c i e n t t o s u p p o r t g r o w t h o f t h eo r g a n i s n . O t h e r w i s e , t h e m e d i u m w a s a s d e -s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . V a r i a t i o n s i nt h e c o n c e n t r a t i o n o f o n l y o n e s a l t w e r e m a d ei n t h e m e d i u m e m p l o y e d f o r t h e t h i r d s t a g e o ft h e f e r m e n t a t i o n s .U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d , a l l a l k a l o i d a n dm y c e l i a l d r y w e i g h t d a t a r e p r e s e n t p e a k v a l u e s .M y c e l i a l d r y w e i g h t s h a v e b e e n c o r r e c t e d f o r t h ea m o u n t o f m y c e l i u m i n t r o d u c e d i n t o t h e t h i r d -s t a g e c u l t u r e s a s i n o c u l u m . W e i g h t s o f m y c e l i u mg i v e n i n t a b l e s , t h e r e f o r e , r e p r e s e n t t h e a m o u n to f g r o w t h t h a t t o o k p l a c e i n e a c h c u l t u r e .T h e r e s u l t s o f s t u d i e s o n t h e m a c r o - s a l tr e q u i r e m e n t s a r e e x p r e s s e d o n t h e b a s i s o f t h ea m o u n t o f a s a l t a d d e d t o t h e c u l t u r e m e d i u mr a t h e r t h a n o n t h e a m o u n t p r e s e n t . G e n e r a l l y ,t h e c o n c e n t r a t i o n s o f a m a c r o - s a l t a d d e d t o am e d i u m a r e l a r g e e n o u g h t o r e n d e r i n s i g n i f i -c a n t t h o s e e r r o r s a r i s i n g f r o m t h e s m a l l a m o u n t so f t h e e l e m e n t t h a t a r e a d v e n t i t i o u s l y i n t r o d u c e d .A n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d o n l y f o r p h o s p h a t e .T h u s , r e s u l t s r e p o r t e d f o r p h o s p h o r u s i n c l u d ep h o s p h a t e t h a t h a d b e e n a d d e d t o t h e c u l t u r em e d i u m a s w e l l a s t h a t c a r r i e d o v e r w i t h t h ei n o c u l u m . I t w a s n e c e s s a r y t o a d d K H 2 P O 4 t os e c o n d - s t a g e c u l t u r e s t o o b t a i n n o r m a l g r o w t h .P o t a s s i u m . When p o t a s s i u m w a s o m i t t e d f r o mf i r s t - s t a g e m e d i a , t h e o r g a n i s m f a i l e d t o g r o w .T h e r e f o r e , a n e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d i nw h i c h p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( m o n o b a s i c ) w a sa d d e d t o t h e f i r s t - s t a g e m e d i u m i n n o r m a l c o n -c e n t r a t i o n s a n d r e p l a c e d b y s o d i u m p h o s p h a t e( m o n o b a s i c ) i n t h e s e c o n d s t a g e . C o n t r o l f l a s k sc o n t a i n i n g 0 . 1 % K H 2 P O 4 i n b a s a l m e d i u m I Ia n d o t h e r s c o n t a i n i n g 0 . 1 % N a H 2 P O 4 w e r e e s -t a b l i s h e d f o r t h e t h i r d - s t a g e c u l t u r e . T h e r e s u l t so f t h i s e x p e r i m e n t s h o w e d t h a t p o t a s s i u m was

E - 4' = 3

2

- a l k a l o i d x 1 0 0- / ~ ~ ~ ~ 0 - -m y c e l i u m

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0P o t a s s i u m m g / 1 O O m l

F I G . 1 . E f f e c t o f p o t a s s i u m o n g r o w t h a n d a l k a l o i dp r o d u c t i o n b y i s o l a t e n o . 3 1 .n e c e s s a r y f o r g r o w t h i n t h e t h i r d s t a g e . Nog r o w t h w a s o b s e r v e d i n t h o s e f e r m e n t a t i o n sw i t h p o t a s s i u m o m i t t e d f r o m t h e m e d i u m . T h em y c e l i u m i n p o t a s s i u m - d e p l e t e d c u l t u r e s m a i n -t a i n e d i t s c h a r a c t e r a n d w a s l i k e t h a t o f t h e c o n -t r o l s w i t h r e s p e c t t o c o l o r a n d f o r m . T h e a d d i -t i o n o f p o t a s s i u m t o t h e p o t a s s i u m - d e p l e t e dc u l t u r e s a f t e r 1 1 d a y s s t i m u l a t e d g r o w t h , a n dt h e s e c u l t u r e s p r o d u c e d n e a r l y t w i c e t h e a l k a -l o i d l e v e l s p r o d u c e d b y t h e c o n t r o l s .A f i n a l e x p e r i m e n t w a s d e s i g n e d t o e s t a b l i s ht h e e f f e c t o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f p o t a s s i u mo n g r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n i n t h e t h i r ds t a g e o f t h e f e r m e n t a t i o n . P o t a s s i u m w a s e l i m i -n a t e d f r o m t h e s e c o n d a n d t h i r d f e r m e n t a t i o ns t a g e s b y e m p l o y i n g s o d i u m p h o s p h a t e a s t h ep h o s p h a t e s o u r c e . P o t a s s i u m w a s a d d e d i n v a r i -o u s a m o u n t s t o t h e t h i r d - s t a g e m e d i u m a s t h es u l f a t e s a l t . T h i s s a l t , r a t h e r t h a n t h e p h o s -p h a t e w a s u s e d b e c au s e o f r e p o r t s i n t h e l i t e r a -t u r e w h i c h l i n k e d a l k a l o i d p r o d u c t i o n t o p h o s -p h a t e d e f i c i e n c y . T h e r e s u l t s o f t h i s e x p e r i m e n ta r e p r e s e n t e d i n F i g . 1 . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a tg r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n w e r e p r o p o r -t i o n a l t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f p o t a s s i u m u pt o a p p r o x i m a t e l y 2 0 m g / 1 0 0 m l o f p o t a s s i u m .T h e c o n c e n t r a t i o n o f p o t a s s i u m a d d e d t o t h en o r m a l e i g h t - s a l t m e d i u m w a s 2 8 . 7 m g / 1 0 0 m l .T h e a d d i t i o n o f h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s ( a s t h es u l f a t e s a l t ) c a u s e d a s i g n i f i c a n t d e c l i n e i n a l k a -l o i d p r o d u c t i o n . A s e p a r a t e s t u d y i n w h i c h i n -c r e a s i n g a m o u n t s o f s u l f a t e ( a s a m m o n i u ms u l f a t e ) w e r e a d d e d t o a c o n t r o l m e d i u m s h o w e dt h a t t h i s d e c l i n e c o u l d b e a t t r i b u t e d t o e x c e s ss u l f a t e .Some g r o w t h o c c u r r e d i n c u l t u r e s t o w h i c h n op o t a s s i u m h a d b e e n a d d e d . T h i s w a s p r e s u m a b l ya r e s u l t o f t h e p r e s e n c e o f p o t a s s i u m a s a c o n -t a m i n a n t o f t h e o t h e r m e d i u m c o n s t i t u e n t s o rt h e r e p l a c e m e n t o f t h e f u n c t i o n o f p o t a s s i u mt o s o m e d e g r e e b y a n o t h e r e l e m e n t s u c h a ss o d i u m , o r a c o m b i n a t i o n o f t h e s e c a u s e s .P o t a s s i u m h a s b e e n s h o w n t o b e i n v o l v e d i nt h e f o r m a t i o n o f t r y p t o p h a n i n e x t r a c t s o f B a c i l l u ss u b t i l i s ( 3 3 ) . I t e n h a n c e s t h e a c t i v i t y o f t h e e n -

V O L . 1 5 , 1 9 6 7 1 2 7 5


7/14

ROSAZZA, K ELLEHER, AND SCHWARTING1 5

1 0ECD

Gw

O 1 0 2 0 11100 2 0 0 3 0 0 4 0 0Phosphorus m g I 1 O O m l

F I G . 2 . E f f e c t o f p h o s p h o r u s o n g r o w t h a n d a l k a l o i dp r o d u c t i o n b y i s o l a t e n o . 3 1 .zyme t h a t c o n v e r t s i n d o l e a n d s e r i n e t o t r y p t o -p h a n . T h i s r o l e b e c o m e s s i g n i f i c a n t w h e n o n ec o n s i d e r s t h a t t h e m a j o r p o r t i o n o f t h e e r g o l i n en u c l e u s i s d e r i v e d f r o m t r y p t o p h a n ( 4 2 ) .P h o s p h a t e . I n p l a n n i n g an e x p e r i m e n t t o e s -t a b l i s h t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p h o s p h a t e a n dg r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n , c o g n i z a n c e h a dt o b e g i v e n t o t h e e a r l i e r f i n d i n g t h a t p o t a s s i u mw as r e q u i r e d f o r g r o w t h . P o t a s s i u m s u l f a t e w a sa d d e d i n s u f f i c i e n t a m o u n t s t o i n s u r e t h a t a tl e a s t 2 8 m g / 1 0 0 ml o f t h e c a t i o n w as p r e s e n ti n a l l f l a s k s .T h e e f f e c t s o f p h o s p h a t e on g r o w t h a n d a l k a -l o i d p r o d u c t i o n w e r e i n v e s t i g a t e d b y a d d i n gv a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f KH2PO4 t o t h e c u l -t u r e m e d i u m . The f i r s t s t a g e o f t h e f e r m e n t a t i o nw a s c o n d u c t e d i n t h e n o r m a l manner. O n l y0 . 0 5 % 1 KH2PO4 w as a d d e d t o b a s a l medium If o r t h e s e c o n d - s t a g e c u l t u r e . Th e t h i r d s t a g e w asc o n d u c t e d w i t h various l e v e l s o f p h o s p h a t e .S a m p l e s w e r e t a k e n a t z e r o - t i m e , a n d t h e c u l t u r ef i l t r a t e s w e r e a n a l y z e d f o r t o t a l p h o s p h a t e . Th er e s u l t s o f t h i s e x p e r i m e n t are p r e s e n t e d i n F i g . 2 .G r o w t h w a s l i m i t e d when t h e p h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o n f e l l b e l o w 2 0 . 5 m g / 1 0 0 m l . T h i sl e v e l o f p h o s p h o r u s c o r r e s p o n d s t o a p p r o x i m a t e l y9 1 m g / 1 0 0 ml o f K H 2 P O 4 . A l k a l o i d p r o d u c t i o n ,on t h e o t h e r h a n d , c o n t i n u e d t o r i s e w i t h ani n c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f p o t a s s i u mp h o s p h a t e u p t o t h e maximal l e v e l ( 1 . 8 g o fKH2PO4 p e r 1 0 0 m l ) e m p l o y e d i n t h i s s t u d y .T h e s e r e s u l t s s t a n d i n s t r o n g c o n t r a s t t o t h o s e o fo t h e r s w h o f o u n d t h a t a p h o s p h a t e d e f i c i e n c yi s r e q u i r e d f o r o p t i m a l a l k a l o i d p r o d u c t i o n( 8 , 3 8 , 4 3 ) .C u l t u r e s g r o w n on m e d i a c o n t a i n i n g l e s s t h a n9 0 m g / 1 0 0 ml o f KH2PO4 became v i o l e t i n c o l o re a r l y i n t h e t h i r d s t a g e . Th e i n t e n s i t y o f t h ev i o l e t c o l o r w as g r e a t e s t i n c u l t u r e s c o n t a i n i n gt h e l o w e s t p h o s p h a t e l e v e l s , and i t r a n g e d fromd a r k p u r p l e i n p h o s p h a t e - d e f i c i e n t c u l t u r e s t o

a f a i n t v i o l e t t i n g e i n t h e m y c e l i u m o f c u l t u r e sg r o w n i n m e d i u m c o n t a i n i n g 9 0 m g / 1 0 0 m l o fK H 2 P O 4 . A s t h e f e r m e n t a t i o n p r o g r e s s e d i n t i m e ,t h e c o l o r o f t h e m e d i u m b e c a m e p r o g r e s s i v e l yd a r k e r . E v e n t u a l l y i t c h a n g e d f r o m a p u r p l e t o ab l a c k c o l o r . T h e b l a c k s u b s t a n c e w a s s h o w n t ob e p a r t i c u l a t e a n d f i l t e r a b l e .A p p e a r a n c e o f t h e v i o l e t p i g m e n t i n p h o s p h a t e -d e f i c i e n t c u l t u r e s h a s b e e n r e p e a t e d o n n u m e r o u ss u b s e q u e n t o c c a s i o n s . P i g m e n t p r o d u c t i o n r e -s u l t i n g f r o m a p h o s p h a t e d e f i c i e n c y h a s b e e nr e p o r t e d f o r P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m ( 1 3 ) .C a l c i u m . I n t h e p r e l i m i n a r y s t u d i e s w i t h i s o l a t en o . 2 , o m i s s i o n o f C a ( N 0 3 ) 2 . 4H20 f r o m t h ec u l t u r e m e d i u m c a u s e d a d e c r e a s e i n g r o w t h a n da l k a l o i d p r o d u c t i o n ( 2 1 ) . I n a s i m i l a r e x p e r i m e n tw i t h i s o l a t e n o . 3 1 , o m i s s i o n o f t h i s s a l t f r o m t h em e d i u m h a d r e l a t i v e l y l i t t l e e f f e c t o n g r o w t h b u th a d a s t i m u l a t o r y a c t i o n o n a l k a l o i d p r o d u c t i o n( T a b l e 2 ) .A n o t h e r e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d t o d e t e r -m i n e w h e t h e r c a l c i u m n i t r a t e c o u l d b e o m i t t e df r o m a l l t h r e e s t a g e s o f t h e f e r m e n t a t i o n . As l a n t o f i s o l a t e n o . 3 1 w a s u s e d t o i n i t i a t e t h ef i r s t s t a g e o f t h e f e r m e n t a t i o n . C u l t u r e s g r e w i nt h e a b s e n c e o f c a l c i u m , b u t t h e t i m e r e q u i r e d f o rm a x i m a l m y c e l i a l g r o w t h w a s a b o u t 1 2 d a y s .T h i s i s c o m p a r e d t o t h e n o r m a l d u r a t i o n o fa b o u t 7 d a y s i n t h e f i r s t s t a g e . G r o w t h o f t h es e c o n d s t a g e o n m e d i u m d e f i c i e n t i n c a l c i u ma p p e a r e d t o b e n o r m a l . Tw o m e d i a w e r e e m -p l o y e d i n t h e t h i r d s t a g e : b a s a l m e d i u m I I p l u sa l l s a l t s ( T a b l e 1 ) a s t h e c o n t r o l a n d b a s a lm e d i u m I I p l u s a l l s a l t s e x c e p t c a l c i u m . S a m p l e sw e r e n o t t a k e n a f t e r 1 3 d a y s o f g r o w t h i n t h ec a l c i u m - d e p l e t e d c u l t u r e s . A t t h i s p o i n t , n e i t h e rt h e a l k a l o i d n o r m y c e l i a l d r y w e i g h t s w e r e a tt h e i r p e a k s ( F i g . 3 ) .

T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h e d e c r e a s e i n g r o w t hr a t e b r o u g h t a b o u t b y t h e o m i s s i o n o f c a l c i u mf r o m a l l t h r e e s t a g e s o f t h e f e r m e n t a t i o n . T h ec o n t r o l i n t h i s c a s e c o n t a i n e d t h e u s u a l c o n c e n -t r a t i o n o f c a l c i u m i n t h e t h i r d - s t a g e m e d i u m ,b u t t h e i n o c u l u m w a s d e r i v e d f r o m a commonc a l c i u m - d e f i c i e n t f e r m e n t a t i o n . T h e m y c e l i a l d r yw e i g h t o f t h e c a l c i u m - d e f i c i e n t c u l t u r e s w a s o n l yo n t h e o r d e r o f o n e - h a l f o f t h a t p r o d u c e d i nc o n t r o l s ; a l k a l o i d p r o d u c t i o n w a s a p p r o x i m a t e l y30% h i g h e r . A l k a l o i d p r o d u c t i o n p e r u n i t o fd r y w e i g h t , t h e r e f o r e , w a s a p p r o x i m a t e l y 2 . 5t i m e s g r e a t e r i n c a l c i u m - d e f i c i e n t c u l t u r e s .T h e s e r e s u l t s c a n b e r a t i o n a l i z e d i n a n u m b e ro f w a y s : c a l c i u m m i g h t b e i n h i b i t o r y t o a r e a c -t i o n l e a d i n g t o t h e s y n t h e s i s o f a l k a l o i d s ; c a l -c i u m m i g h t s t i m u l a t e " g r o w t h m e t a b o l i s m "t o s u c h a n e x t e n t t h a t r e a c t i o n s l e a d i n g t o a l k a -l o i d s y n t h e s i s a r e u n a b l e t o c o m p e t e f a v o r a b l yf o r c e r t a i n common p r e c u r s o r s ; c a l c i u m m i g h t a c t

1 2 7 6 A P P L . M I C R O B I O L .


8/14

PRODUCTION OF LYSERGIC ACID DERIVATIVES

3E

711

**U*--0 U-Con:_*/ ~ ~ 0 - Ca

4

G - 2c nn t r o lI N 0 3 ) 2 d e f i c i e n t

4 0 0

3 0 0 /

1a.2 0 0 - a1 0 0

I/ 0 0 2 0 0 3 0 0H o u r sF I G . 3 . E f f e c t o f c a l c i u m n i t r a t e on g r o w t h a n da l k a l o i d p r o d u c t i o n b y i s o l a t e no. 3 1 .

t o d i s p l a c e c e r t a i n e l e m e n t s f r o m t h e i r com-p l e x e s w i t h n a t u r a l c h e l a t o r s ; t h e s e e l e m e n t s ,i n t u r n , m i g h t s t i m u l a t e " g r o w t h m e t a b o l i s m " t oa g r e a t e r e x t e n t t h a n m e t a b o l i s m l e a d i n g t oa l k a l o i d p r o d u c t i o n . F i n a l l y , t h e s e e f f e c t s m i g h tb e d u e t o t h e n i t r a t e a n i o n i n s t e a d o f t h e c a l c i u mc a t i o n . Some s u p p o r t i s g i v e n t o t h i s l a t t e r p o s -s i b i l i t y b y t h e o b s e r v a t i o n i n t h e p r e l i m i n a r ys t u d i e s t h a t t h e o m i s s i o n o f s o d i u m n i t r a t e r e -s u l t e d i n h i g h e r a l k a l o i d p r o d u c t i o n t h a n t h a ta t t a i n e d b y t h e c o n t r o l s . C a l c i u m n i t r a t e con-t r i b u t e s a b o u t t w o - t h i r d s o f t h e n i t r a t e con-t a i n e d i n t h e e i g h t - s a l t m e d i u m ; s o d i u m n i t r a t ec o n t r i b u t e s t h e r e m a i n d e r .M a g n e s i u m . T h e r e s u l t s o f a p r e l i m i n a r y s t u d yw i t h m a g n e s i u m s u l f a t e i n d i c a t e d t h a t t h e amounto f m a g n e s i u m e m p l o y e d i n t h e c o n t r o l m e d i aw as 2 0 t o 3 0 t i m e s g r e a t e r t h a n t h e amountr e q u i r e d f o r m a x i m a l g r o w t h a n d a l k a l o i dp r o d u c t i o n . I f t h i s amount w a s a d d e d t o t h ef i r s t - s t a g e c u l t u r e medium a n d o m i t t e d f r o mt h e s e c o n d - a n d t h i r d - s t a g e m e d i a , t h e c a r r y - o v e ra l o n e w o u l d p r o v i d e 2 0 t o 30% o f t h e m a g n e s i u mr e q u i r e d b y t h e t h i r d - s t a g e c u l t u r e . To o b t a i na s a t i s f a c t o r y d e p l e t i o n o f m a g n e s i u m i n t h ee x p e r i m e n t a l c u l t u r e s ( t h i r d s t a g e ) , i t w as n e c e s -s a r y , t h e r e f o r e , t o r e d u c e t h e c o n c e n t r a t i o n o fMgSO4.7H20 i n t h e f i r s t - s t a g e b a s a l medium It o 8 m g / 1 0 0 ml ( i n s t e a d o f 8 0 m g / 1 0 0 m l ) . Th es e c o n d - s t a g e medium c o n s i s t e d o f m a n n i t o l ,ammonium s u c c i n a t e , and K H 2 P O 4 , o n l y . T h i r d -s t a g e c u l t u r e m e d i a c o n s i s t e d o f t h e b a s a l mediumI I w i t h a l l s a l t s , e x c e p t M g S O 4 - 7 H 2 0 , i n t h e i ru s u a l c o n c e n t r a t i o n . M a g n e s i u m s u l f a t e w asa d d e d i n amounts s u f f i c i e n t t o g i v e 1 5 d i f f e r e n t

a l k a l o i d x 5 0

, * r n e n - i r e . _ ., .1.mycelium0 Q5 1112 3 4 5

Magnesium mgl100 m lF I G . 4 . E f f e c t o f m a g n e s i u m on g r o w t h an d a l k a l o i dp r o d u c t i o n b y i s o l a t e no . 3 1 ( s l a n t I H - 1 ) .

l e v e l s o f Mg c a t i o n per 1 0 0 m l . S u l f a t e wasm a i n t a i n e d a t i t s n o r m a l l e v e l b y a d d i n g s u f f i -c i e n t ammonium s u l f a t e t o r e p l a c e t h e s u l f a t el o s t b y t h e r e d u c t i o n o f t h e m a g n e s i u m s u l f a t el e v e l s . E a c h v a r i a t i o n w a s s t u d i e d i n t r i p l i c a t ef e r m e n t a t i o n s . T h e r e s u l t s are s h o w n i n F i g . 4 .A l k a l o i d p r o d u c t i o n i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n gm a g n e s i u m c o n c e n t r a t i o n up t o 0 . 5 m g / 1 0 0 m lo f m a g n e s i u m , a s s h o w n i n F i g . 4 ; t h i s v a l u e i sl e s s t h a n o n e - t e n t h o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f mag-n e s i u m n o r m a l l y e m p l o y e d i n t h e e i g h t - s a l tm e d i u m . M y c e l i a l g r o w t h h a d r e a c h e d a b o u t80% o f i t s p e a k v a l u e a t t h i s c o n c e n t r a t i o n .F u r t h e r i n c r e a s e s t o v a l u e s a b o v e 0 . 5 m g / 1 0 0m l b r o u g h t a b o u t a g r a d u a l d e c l i n e i n p e a ka l k a l o i d p r o d u c t i o n a n d a very s l o w i n c r e a s e i nm y c e l i a l g r o w t h .S u l f u r . I n t h e e x p e r i m e n t s w i t h s u l f u r v a r i a -t i o n s , t h e u s u a l e i g h t - s a l t m e d i u m h a d t o b em o d i f i e d t o i n s u r e a proper d e p l e t i o n o f s u l f u r .C a t i o n s n o r m a l l y a d d e d as t h e i r s u l f a t e s ( F e , C u ,Mn, a n d Z n ) w e r e a d d e d as t h e i r n i t r a t e s i na m o u n t s c a l c u l a t e d t o p r o v i d e t h e s a m e con-c e n t r a t i o n o f c a t i o n . To a v o i d a s i g n i f i c a n t i n -c r e a s e i n t h e t o t a l n i t r a t e c o n c e n t r a t i o n , s o d i u mn i t r a t e w a s r e p l a c e d b y an amount o f s o d i u mh y d r o x i d e s u f f i c i e n t t o p r o v i d e t h e s a m e con-c e n t r a t i o n o f s o d i u m i o n . S u l f u r w a s a d d e d asm a g n e s i u m s u l f a t e . A s o l u t i o n o f m a g n e s i u ms u c c i n a t e ( p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 5 0 mg o f t h em e t a l i n 1 0 ml o f a 5% s o l u t i o n o f s u c c i n i ca c i d ) w as a d d e d i n s u f f i c i e n t q u a n t i t i e s t o m a i n -t a i n t h e l e v e l o f m a g n e s i u m a t t h e v a l u e u s e d i nt h e u s u a l e i g h t - s a l t m e d i u m .T h e f i r s t - s t a g e c u l t u r e w as c o n d u c t e d on b a s a lmedium I w i t h a l l o f t h e s u l f a t e s e x c e p t mag-n e s i u m s u l f a t e r e p l a c e d b y e q u i v a l e n t amountso f n i t r a t e s . M a g n e s i u m s u l f a t e w as a d d e d i n i t su s u a l c o n c e n t r a t i o n . Th e s e c o n d - s t a g e c u l t u r ew a s c o n d u c t e d on b a s a l medium I c o n t a i n i n go n l y m a n n i t o l , ammoni um s u c c i n a t e , and p o -t a s s i u m p h o s p h a t e . T h i r d - s t a g e c u l t u r e s w e r e

V O L . 1 5 , 1 9 6 7 1 2 7 7

E


9/14

ROSAZZA, KELLEHER, A ND SCHWARTING

4

3O 2O L

O 2

a l k a l o i d x 5 0

m y c e l i u m

1 1 1L~I4S u l I f ur m g / 1 0 0 m l

F I G . 5 . E f f e c t o f s u l f u r o n g r o w t h a n d a l k a l o i d pro-d u c t i o n b y i s o l a t e n o . 3 1 ( s l a n t I H - 1 ) .c o n d u c t e d on b a s a l medium II w i t h a l l s u l f a t e se x c e p t m a g n e s i u m s u l f a t e r e p l a c e d b y e q u i v a l e n ta m o u n t s o f t h e i r r e s p e c t i v e n i t r a t e s . M a g n e s i u ms u l f a t e w as a d d e d i n amounts t h a t p r o v i d e d 1 0d i f f e r e n t l e v e l s o f s u l f u r . E a c h v a r i a t i o n w a sc o n d u c t e d i n t r i p l i c a t e . T h e r e s u l t s ar e p r e s e n t e di n F i g . 5 .A l k a l o i d p r o d u c t i o n w a s p r o p o r t i o n a l t os u l f u r c o n c e n t r a t i o n up t o a p p r o x i m a t e l y 4 mg/1 0 0 ml o f s u l f u r . F u r t h e r i n c r e a s e s i n t h e s u l f u rc o n c e n t r a t i o n t o 1 0 m g / 1 0 0 ml h a d e s s e n t i a l l y noe f f e c t on a l k a l o i d p r o d u c t i o n . T h e h i g h e s t con-c e n t r a t i o n o f s u l f u r e m p l o y e d w a s a p p r o x i m a t e l ye q u a l t o t h e c o n c e n t r a t i o n i n t h e u s u a l e i g h t - s a l tm e d i u m . M y c e l i a l d r y w e i g h t w a s g r e a t e r w i t hi n c r e a s e s i n s u l f u r c o n c e n t r a t i o n over t h e e n t i r erange e x a m i n e d . T h e s e i n c r e a s e s i n w e i g h t ,h o w e v e r , w e r e n o t p r o p o r t i o n a l t o t h e s u l f u rc o n c e n t r a t i o n over any p o r t i o n o f t h e r a n g e . T h i sb e h a v i o r r e m a i n s u n e x p l a i n e d , b u t i t m i g h t b ea t t r i b u t a b l e t o t h e a c c o m p a n y i n g c h a n g e s i n t h ec o n c e n t r a t i o n s o f m a g n e s i u m a n d s u c c i n a t e .Th e i n d e p e n d e n t v a r i a t i o n o f m a g n e s i u m ( a sM g + + ) a n d s u l f u r ( a s S 0 4 - 2 ) n e c e s s i t a t e d c h a n g e si n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f o t h e r i o n s . T h e q u e s t i o nn a t u r a l l y a r i s e s as t o t h e i n f l u e n c e o f t h e s ec h a n g e s . T h i s can b e s t b e a n s w e r e d b y an e x a m i -n a t i o n o f t h e i r m a g n i t u d e . I n t h e case o f mag-n e s i u m , t h e s u l f a t e c o n c e n t r a t i o n w as m a i n t a i n e da t i t s n o r m a l l e v e l b y t h e a d d i t i o n o f ammoniums u l f a t e . T h i s s a l t w a s c h o s e n b e c a u s e t h e mediuma l r e a d y c o n t a i n e d a r e l a t i v e l y h i g h c o n c e n t r a -t i o n o f ammonium i o n . Th e h i g h e s t c o n c e n t r a -t i o n o f ammonium s u l f a t e a d d e d w a s 4 2 . 8 8 mg/1 0 0 ml ( e q u i v a l e n t t o 1 1 . 7 m g / 1 0 0 ml o f am-monium i o n ) . P r e v i o u s a n a l y s e s o f medium II( 2 1 ) h a d s h o w n t h a t i t c o n t a i n e d 6 0 0 m g / 1 0 0 mlo f a m m o n i a n i t r o g e n o r 7 7 0 m g / 1 0 0 ml o f am-monium i o n . T h e r e f o r e , t h e p e r c e n t a g e i n c r e a s e si n ammonium i o n c o n c e n t r a t i o n as a r e s u l t o fa d d e d ammonium s u l f a t e w e r e s m a l l ( 1 . 5 % a tt h e m o s t ) .

I n t h e c a s e o f s u l f u r , t h e m a g n e s i u m c o n c e n -t r a t i o n w a s m a i n t a i n e d a t i t s n o r m a l l e v e l b ya d d i n g a p p r o p r i a t e a m o u n t s o f a s o l u t i o n o fm a g n e s i u m s u c c i n a t e t h a t c o n t a i n e d 1 0 mg o fs u c c i n i c a c i d f o r e a c h m i l l i g r a m o f m a g n e s i u m .T h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f m a g n e s i u m t h a th a d t o b e a d d e d i n t h i s m a n n e r w a s 7 . 9 0 m g / 1 0 0m l . T h e m a x i m a l a m o u n t o f s u c c i n a t e i n t r o d u c e d ,t h e r e f o r e , w a s 7 9 m g / 1 0 0 m l ; t h i s a m o u n t i ss m a l l c o m p a r e d t o t h e a m o u n t o f s u c c i n a t e ( 3 % ,w / v ) a l r e a d y p r e s e n t i n t h e m e d i u m . T h e r e p l a c e -m e n t o f t h e s u l f a t e s o f F e , C u , M n , a n d Znw i t h a m o u n t s o f t h e i r n i t r a t e s c a l c u l a t e d t o s u p p l yt h e s a m e a m o u n t o f t h e r e s p e c t i v e c a t i o n c a u s e da s m a l l i n c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f n i t r a t e .T h i s i n c r e a s e , h o w e v e r , w a s e s s e n t i a l l y c a n c e l l e db y t h e s u b s t i t u t i o n o f s o d i u m h y d r o x i d e f o rs o d i u m n i t r a t e a s a s o u r c e o f s o d i u m i o n . T h es m a l l n e t c h a n g e i n n i t r a t e c o n c e n t r a t i o n ( a b o u t0 . 1 m g / 1 0 0 m l ) i s n e g l i g i b l e c o m p a r e d t o t h ea m o u n t c o n t r i b u t e d b y t h e 3 0 m g / 1 0 0 m l o fc a l c i u m n i t r a t e .I t a p p e a r s , t h e r e f o r e , t h a t t h e m o d i f i c a t i o n so f t h e b a s a l m e d i u m I I u s e d t o s t u d y m a g n e s i u ma n d s u l f u r s e p a r a t e l y a r e n o t o f s u f f i c i e n t c o n -s e q u e n c e t o a f f e c t t h e f e r m e n t a t i o n s s i g n i f i c a n t l y .M i c r o - s a l t r e q u i r e m e n t s . E x p e r i m e n t s s i m i l a rt o t h o s e d e s c r i b e d u n d e r M a c r o - s a l t r e q u i r e m e n t sw e r e c o n d u c t e d t o e s t a b l i s h t h e m i c r o - s a l t r e -q u i r e m e n t s f o r g r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n .T h e e l e m e n t s d e s i g n a t e d a s m i c r o - m e d i u m c o m -p o n e n t s a r e m a n g a n e s e , c o p p e r , i r o n , a n d z i n c .T h e a m o u n t s o f t h e s e e l e m e n t s i n t r o d u c e d t ot h e m e d i u m a s c o n t a m i n a n t s m i g h t f r e q u e n t l yc o n s t i t u t e a s i g n i f i c a n t p o r t i o n o f t h e t o t a lr e q u i r e m e n t . E x p r e s s i o n o f r e s u l t s o n t h e b a s i so f t h e a m o u n t o f t h e e l e m e n t a d d e d , t h e r e f o r e ,b e c o m e s m e a n i n g l e s s i n s t u d i e s o f m i c r o - e l e m e n tr e q u i r e m e n t s . A q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o fe i t h e r t h e a m o u n t o f a n e l e m e n t i n t r o d u c e da d v e n t i t i o u s l y o r t h e t o t a l a m o u n t p r e s e n t i n ag i v e n m e d i u m i s e s s e n t i a l . T h e l a t t e r d e t e r m i n a -t i o n i s n o r m a l l y m o r e c o n v e n i e n t b e c a u s e i ti n v o l v e s g r e a t e r a m o u n t s o f t h e e l e m e n t s a n d i sl e s s d e m a n d i n g o n t h e s e n s i t i v i t y o f t h e a n a l y t i c a lm e t h o d .M a n g a n e s e . T h e r e s u l t s o f p r e l i m i n a r y s t u d i e sh a d s h o w n t h a t t h e o m i s s i o n o f m a n g a n e s ef r o m t h e m e d i u m c a u s e d n o s i g n i f i c a n t d e c r e a s ei n g r o w t h b u t b r o u g h t a b o u t a c o n s i d e r a b l e d e -c r e a s e i n a l k a l o i d p r o d u c t i o n ( T a b l e 2 ) . I t wasa p p a r e n t t h a t t h e d e m o n s t r a t i o n o f t h e e s s e n -t i a l i t y o f t h i s e l e m e n t f o r g r o w t h w o u l d n e c e s s i -t a t e a d d i t i o n a l e f f o r t s t o r e d u c e t h e l e v e l o f a d -v e n t i t i o u s m a n g a n e s e i n t h e m e d i u m .A t t e m p t s w e r e m a d e t o r e m o v e m a n g a n e s e b yt w o d i f f e r e n t m e t h o d s f r o m a b a s a l m e d i u m

1 2 7 8 A P P L . M I C R O B I O L .

5 1 1


10/14

PRODUCTION OF LYSERGIC ACID DERIVATIVESc o n t a i n i n g a l l o f t h e m a c r o - m e d i u m c o n s t i t u e n t s :e x t r a c t i o n w i t h d i t h i z o n e a t pH 9 . 5 , w h e r e 7 5m l o f 0 . 1 % d i t h i z o n e i n c a r b o n t e t r a c h l o r i d ew a s s h a k e n w i t h 4 0 0 m l o f t h e b a s a l m e d i u m( 2 6 ) a n d c o p r e c i p i t a t i o n o f m a n g a n e s e w i t hc o p p e r - d i e t h y l d i t h i o c a r b a m a t e ( 2 5 ) .M e d i a t r e a t e d i n t h e a b o v e m a n n e r f a i l e d t os u p p o r t g r o w t h , e v e n w h e n m a n g a n e s e w a s l a t e ra d d e d t o t h e c u l t u r e s . T h i s f a i l u r e w a s a t t r i b u t e dt o t h e p r e s e n c e o f a g r e a t e x c e s s o f ammoniump h o s p h a t e , w h i c h w a s i n t r o d u c e d a s p h o s p h o r i ca c i d a n d a m m o n i u m h y d r o x i d e i n t h e a d j u s t m e n to f pH t o v a l u e s a t w h i c h t h e e x t r a c t i o n a n d p r e -c i p i t a t i o n o f m a n g a n e s e w o u l d b e e f f e c t i v e . Nof u r t h e r a t t e m p t s t o r e d u c e m a n g a n e s e l e v e l s b yt h e s e m e a n s w e r e m a d e .

I n a f i n a l e x p e r i m e n t , c o n d u c t e d t o e s t a b l i s h t h er e l a t i o n b e t w e e n m a n g a n e s e c o n c e n t r a t i o n a n dg r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n , t h e b a s a l m e -d i u m w i t h c o m p o n e n t s p u r i f i e d i n t h e u s u a lm a n n e r w a s e m p l o y e d . I n t h i s s t u d y , t h e c o n c e n -t r a t i o n o f m a n g a n e s e s u l f a t e a d d e d t o t h e f i r s ts t a g e o f t h e f e r m e n t a t i o n w a s r e d u c e d t o 0 . 2 5m g / 1 0 0 m l . B a s a l m e d i u m I p l u s K H 2 P O 4 w a su s e d f o r t h e s e c o n d s t a g e . T h e t h i r d s t a g e w a su s e d f o r t h e s e c o n d s t a g e . T h e t h i r d s t a g e w a sc o n d u c t e d o n b a s a l m e d i u m I I p l u s t h e u s u a l c o n -c e n t r a t i o n s o f s a l t s ( T a b l e 1 ) e x c e p t m a n g a n e s es u l f a t e . M a n a g a n e s e w a s a d d e d a s i t s s u l f a t e i na m o u n t s r a n g i n g f r o m 0 t o 5 m g / 1 0 0 m l . R e s u l t so f t h i s e x p e r i m e n t a r e s h o w n i n F i g . 6 .T h e r e s u l t s p r e s e n t e d f a i l t o d e m o n s t r a t e t h ee s s e n t i a l i t y o f m a n g a n e s e f o r g r o w t h ; t h e y d o ,h o w e v e r , p r o v i d e e v i d e n c e o f i t s r e q u i r e m e n t f o ra l k a l o i d f o r m a t i o n . M a n g a n e s e h a s b e e n s h o w n t ob e r e q u i r e d b y a n u m b e r o f f u n g i . T h i s r e q u i r e -m e n t i s s m a l l : g e n e r a l l y on t h e o r d e r o f 0 . 0 0 5 t o0 . 0 1 ppm ( 7 ) . W i t h t h e m e t h o d s e m p l o y e d i n t h ep r e s e n t e x p e r i m e n t s , i t w a s p o s s i b l e t o r e d u c et h e m a n g a n e s e c o n c e n t r a t i o n i n t h e u n s u p p l e -m e n t e d m e d i u m t o 0 . 0 2 8 p p m . T h e r e f o r e , i t i sq u i t e p o s s i b l e t h a t m a n g a n e s e i s r e q u i r e d f o rg r o w t h o f t h i s o r g a n i s m b u t t h a t t h e r e q u i r e m e n ti s e x t r e m e l y l o w . T h e amount o f g r o w t h r e m a i n e de s s e n t i a l l y u n c h a n g e d w h e n t h e m a n g a n e s e c o n -c e n t r a t i o n o f t h e m e d i u m w as v a r i e d f r o m 2 . 8 t o1 , 4 0 0 , u g / 1 0 0 m l . I n c r e a s i n g t h e m a n g a n e s e c o n -c e n t r a t i o n t o 1 , 4 0 0 , g / 1 0 0 m l h a d no e f f e c t ona l k a l o i d p r o d u c t i o n .

M a n g a n e s e h a s b e e n s h o w n t o b e r e q u i r e d f o rt h e f o r m a t i o n o f s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s , g e n -e r a l l y i n a m o u n t s g r e a t e r t h a n t h o s e r e q u i r e d f o rg r o w t h o f t h e o r g a n i s m s ( 4 , 1 2 , 1 9 , 4 0 , 4 1 ) .C o p p e r . I n p r e l i m i n a r y s t u d i e s , r e d u c t i o n o ft h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s e l e m e n t t o 104 t i m e si t s n o r m a l v a l u e c a u s e d a s h a r p r e d u c t i o n i n t h ea m o u n t o f a l k a l o i d p r o d u c e d b u t h a d no e f f e c t o ni t s g r o w t h ( T a b l e 2 ) .

-4E` 3

2

a l k a l o i d x 1 0 0

m y c e l i u m

1 1 .02 0;;0 0 2 0 0 3 0 0 4Manganese g l / l 0 0 m lF I G . 6 . E f f e c t o f m a n g a n e s e o n g r o w t h a n d a l k a l o i dp r o d u c t i o n b y i s o l a t e n o . 3 1 ( s l a n t I H - 1 ) .I t w a s l a t e r f o u n d t h a t s a t i s f a c t o r y g r o w t h o c -c u f f e d i n t h e f i r s t s t a g e o f f e r m e n t a t i o n s t o w h i c hn o c o p p e r w a s a d d e d . T h i s s u g g e s t e d t h a t c o p p e rw a s f i n d i n g i t s w a y i n t o t h e m e d i u m i n a m o u n t sa d e q u a t e t o s u p p o r t g r o w t h o f t h e o r g a n i s m .A n e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d t o d e m o n s t r a t et h e n e c e s s i t y o f c o p p e r f o r g r o w t h . A l l o f t h em a c r o m e d i u m c o m p o n e n t s w e r e d i s s o l v e d i ng l a s s - d i s t i l l e d w a t e r , a n d t h e s o l u t i o n w a s t r e a t e di n t w o d i f f e r e n t w a y s t o r e m o v e c o p p e r : e x t r a c -t i o n w i t h a s o l u t i o n o f d i t h i z o n e i n c a r b o n t e t r a -c h l o r i d e ( 2 6 ) o r p r e c i p i t a t i o n w i t h h y d r o g e ns u l f i d e ( 2 5 ) . F e r m e n t a t i o n s w e r e c o n d u c t e d o n

t r e a t e d m e d i u m , a n d o n t r e a t e d m e d i u m p l u s 0 . 5mg o f C u S 0 4 - 5 H 2 0 .E x p e r i e n c e w i t h s i m i l a r a t t e m p t s t o r e m o v et r a c e s o f m a n g a n e s e f r o m t h e b a s a l m e d i u ms h o w e d t h a t t h e s u b s t a n c e s c o n t r i b u t e d b y t h er e m o v a l t r e a t m e n t s c o u l d n o t b e i g n o r e d . T h e r e -f o r e , a n u m b e r o f c o n t r o l f e r m e n t a t i o n s , e a c hc o n d u c t e d o n m e d i a r e p r e s e n t i n g v a r i o u s s t a g e so f t h e r e m o v a l p r o c e s s e s , w e r e e s t a b l i s h e d .N o n e o f t h e t r e a t m e n t s r e d u c e d t h e c o n c e n t r a -t i o n o f c o p p e r t o l e v e l s t h a t c a u s e d a s i g n i f i c a n td e c r e a s e i n g r o w t h , n o r d i d t h e y c a u s e a s u b -s t a n t i a l r e d u c t i o n i n t h e a l k a l o i d - p r o d u c i n gc a p a c i t y a s c o m p a r e d w i t h c o n t r o l s . I n a l l c a s e s ,w h e t h e r t h e y r e c e i v e d t h e s e t r e a t m e n t s o r n o t ,t h e r a t i o o f a l k a l o i d p r o d u c e d b y c o p p e r - s u p p l e -m e n t e d m e d i a t o u n s u p p l e m e n t e d m e d i a w a sb e t w e e n 6 a n d 7 . T h u s , t h e r e a p p e a r e d t o b e noa d v a n t a g e i n t h e e m p l o y m e n t o f s u c h p r o c e d u r e si n f u t u r e e x p e r i m e n t s d e a l i n g w i t h t h i s e l e m e n t .S l a n t I H - 1 w a s u s e d i n a f i n a l e x p e r i m e n t i n -v o l v i n g c o p p e r . B a s a l m e d i u m I p l u s a l l s a l t se x c e p t c o p p e r s u l f a t e w a s e m p l o y e d f o r t h e f i r s ts t a g e o f t h i s f e r m e n t a t i o n . B a s a l m e d i u m I p l u sK H 2 P O 4 , o n l y , w a s u s e d t o c a r r y t h e f e r m e n t a -t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d s t a g e . V a r i a t i o n s o fc o p p e r c o n c e n t r a t i o n w e r e e m p l o y e d i n b a s a lm e d i u m I I f o r t h e t h i r d s t a g e . C o p p e r s u l f a t ew a s a d d e d i n amounts r a n g i n g f r o m 0 t o 3 m g / 1 0 0m l . S a m p l e s o f m e d i u m o b t a i n e d i m m e d i a t e l ya f t e r t h e t h i r d - s t a g e c u l t u r e s w e r e i n o c u l a t e d were

V O L . 1 5 , 1 9 6 1 7 1 2 7 9


11/14

ROSAZZA, KELLEHER, AND SCHWARTING8

6

i " 4IC

* . o * - . , ?.0''* , a l k a l o i d x 1 0 0!~~~~I 7 m y c e l i u m*U .

0 1 0 0 ? 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0C o p p e r p g 1 1 0 0 m l

F I a . 7 . E f f e c t o f c op pe r o n g r o w t h a n d a l k a l o i d pro-d u c t i o n b y i s o l a t e no . 3 1 ( s l a n t I H - 1 ) .a n a l y z e d f o r copper; t h i s p e r m i t t e d t h e e x p r e s s i o no f r e s u l t s o n t h e b a s i s o f t o t a l copper p r e s e n t i nt h i r d - s t a g e c u l t u r e m e d i u m .I n p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , s i m p l e o m i s s i o n o fcopper f r o m t h e c u l t u r e m e d i u m d i d n o t cause ad e c r e a s e i n t h e g r o w t h o f t h e o r g a n i s m . R e m o v a lo f copper f r o m t h e b a s a l m e d i u m b y d i t h i z o n e ex -t r a c t i o n a n d h y d r o g e n s u l f i d e p r e c i p i t a t i o n a l s of a i l e d t o i n h i b i t g r o w t h o f t h e o r g a n i s m . S u c ht r e a t m e n t s , h o w e v e r , r e d u c e d p e a k a l k a l o i d pro-d u c t i o n t o a p p r o x i m a t e l y o n e - s e v e n t h t h a tr e a c h e d b y c o n t r o l s . A r e q u i r e m e n t f o r c o p p e rw o u l d b e a n t i c i p a t e d b e c a u s e o f t h e w e l l - k n o w nr o l e o f t h i s e l e m e n t i n p o r p h y r i n b i o s y n t h e s i s .T h e m e t h o d s e m p l o y e d i n t h i s p r e l i m n a r y e x -p e r i m e n t , h o w e v e r , d i d n o t p e r m i t t h e d e m o n s t r a -t i o n o f s u c h a r e q u i r e m e n t .R e s u l t s o f t h e f i n a l e x p e r i m e n t w i t h copper arep r e s e n t e d i n F i g . 7 . A n a l y s i s o f s a m p l e s o b t a i n e df r o m f r e s h l y i n o c u l a t e d c u l t u r e s s h o w e d t h a ta b o u t 5 , g / 1 0 0 m l o f copper w as p r e s e n t i n c u l -t u r e s t o w h i c h n o copper w as a d d e d . I t may b ea s s u m e d t h a t a s i m i l a r l e v e l o f copper w as p r e s e n ti n t h e m e d i a u s e d i n t h e p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s( T a b l e 2 ) .I n a d d i t i o n t o f a i l i n g t o r e a c h a g r o w t h - l i m i t i n gc o n c e n t r a t i o n o f c o p p e r , t h e s e e x p e r i m e n t s a l s of a i l e d t o e s t a b l i s h t o x i c c o n c e n t r a t i o n s o f copper,d e s p i t e t h e f a c t t h a t a l e v e l o f a p p r o x i m a t e l y s i xt i m e s t h a t u s e d i n t h e e i g h t - s a l t m e d i u m w ast e s t e d .W i t h r e g a r d t o a l k a l o i d p r o d u c t i o n , a veryd i s t i n c t e f f e c t o f copper w a s s e e n . A t t h e l o w e s tl e v e l o f copper, a l k a l o i d p r o d u c t i o n w as r e d u c e dt o l e s s t h a n h a l f o f t h a t a t t a i n e d b y copper-s u f f i c i e n t c u l t u r e s . T h e r e w a s a very s h a r p r i s e i na l k a l o i d p r o d u c t i o n w i t h i n c r e a s i n g copper con-c e n t r a t i o n s u p t o a p p r o x i m a t e l y 2 6 M g / I 0 0 m l .A t t h i s p o i n t , a l k a l o i d p r o d u c t i o n w a s a p p r o x i -m a t e l y 7 5 % o f t h e m a x i m a l v a l u e o b t a i n e d . W i t hi n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f copper u p t o a b o u t6 0 0 u g / 1 0 0 m l , t h e r e w a s a very g r a d u a l i n c r e a s ei n a l k a l o i d p r o d u c t i o n . I n t h e m i d d l e o f t h i s p o r -t i o n o f t h e c u r v e , a s h a r p d i p w a s o b s e r v e d . T h i s

d i p i s l a r g e l y t h e r e s u l t o f a s i n g l e p o i n t , a n dm i g h t , t h e r e f o r e , b e a n o m a l o u s .C o p p e r - d e f i c i e n t c u l t u r e s w e r e w h i t e o r l i g h tt a n i n c o l o r ; c o n t r o l c u l t u r e s n o r m a l l y r a n g e df r o m m e d i u m t o d a r k b r o w n i n c o l o r . T h e i n -t e n s i t y o f t h e p i g m e n t a t i o n w a s d i r e c t l y r e l a t e dt o t h e a m o u n t o f c o p p e r p r e s e n t . I n t h e s e e x -p e r i m e n t s , a n d i n m o s t o t h e r s i n t h e p a s t , h i g ha l k a l o i d p r o d u c t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h d a r kp i g m e n t a t i o n i n t h e m y c e l i a . T h e a p p e a r a n c e o fp i g m e n t a t i o n a s a f u n c t i o n o f c o p p e r c o n c e n t r a -t i o n h a s b e e n r e p o r t e d w i t h o t h e r m i c r o o r g a n i s m s( 7 , 3 5 ) . C o p p e r h a s b e e n s h o w n t o b e e s s e n t i a lf o r t h e a c t i o n o f c e r t a i n o x i d a s e s , m a n y o f w h i c hg i v e r i s e t o c o l o r e d r e a c t i o n p r o d u c t s .S e v e r a l a u t h o r s h a v e i m p l i e d o r s u g g e s t e d t h a tc o p p e r w a s i m p o r t a n t i n e r g o t a l k a l o i d b i o s y n -t h e s i s ( 1 5 , 1 6 , 2 8 , 4 3 ) . N o n e o f t h e s e , h o w e v e r ,h a s p r e s e n t e d d a t a t h a t e s t a b l i s h a r e l a t i o n s h i pb e t w e e n c o p p e r c o n c e n t r a t i o n a n d a l k a l o i d p r o -d u c t i o n . O t h e r i n v e s t i g a t o r s h a v e s h o w n t h a tc o p p e r i s r e q u i r e d ( i n a m o u n t s g r e a t e r t h a n t h o s en e e d e d f o r g r o w t h ) f o r t h e p r o d u c t i o n o f s e c -o n d a r y m e t a b o l i t e s ( 1 3 , 2 0 ) .I r o n . R e s u l t s o f t h e p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n ts h o w e d t h a t t h e d e p l e t i o n o f i r o n t o 1 0 - 4 t i m e si t s u s u a l c o n c e n t r a t i o n i n f i r s t - s t a g e c u l t u r e sc a u s e d a d e c r e a s e i n g r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c -t i o n ( T a b l e 2 ) . A n e x p e r i m e n t w a s u n d e r t a k e n t od e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o fi r o n o n g r o w t h a n d a l k a l o i d p r o d u c t i o n .When i r o n w a s o m i t t e d f r o m f i r s t - s t a g e m e d i a ,t h e o r g a n i s m f a i l e d t o g r o w . T h e r e f o r e , a f i r s t -s t a g e c u l l u r e w a s c o n d u c t e d o n b a s a l m e d i u m Ip l u s a l l s a l t s a n d F e S O 4 . 7 H 2 0 , 0 . 1 m g / 1 0 0 m l .I r o n w a s o m i t t e d f r o m t h e s e c o n d s t a g e a n d w a sa d d e d t o t h e t h i r d - s t a g e m e d i u m i n v a r y i n g c o n -c e n t r a t i o n s . Z e r o - t i m e s a m p l e s w e r e w i t h d r a w nf r o m i n o c u l a t e d m e d i a a n d w e r e a s s a y e d f o r i r o nc o n t e n t . D i f f i c u l t y i n f i l t e r i n g z e r o - t i m e s a m p l e st h r o u g h s i n t e r e d - g l a s s f u n n e l s w a s e n c o u n t e r e dw i t h t h e i r o n a s s a y . A n i r o n - c o n t a i n i n g p r e c i p i -t a t e i n t h e z e r o - t i m e s a m p l e s w o u l d n o t p a s st h r o u g h t h e f i l t e r s . T h i s p r e c i p i t a t e f o r m e d w h e na m m o n i u m h y d r o x i d e w a s u s e d t o a d j u s t t h e pHo f t h e c o m p l e t e d m e d i u m t o 5 . 2 . T h e r e s u l t o ft h i s d i f f i c u l t y w a s t h a t t h e c l e a r f i l t r a t e c o n t a i n e do n l y a f r a c t i o n o f t h e t o t a l a m o u n t o f i r o n o r i g i -n a l l y a d d e d t o t h e m e d i u m . T h e r e f o r e , a n a l y s e sf o r i r o n w e r e r u n o n s a m p l e s o f m y c e l i u m a n dc u l t u r e f i l t r a t e t o g e t h e r . T h e t o t a l b r o t h s a m p l e sw e r e m i x e d b y v

production of lysergic acid derivatives in a submerged culture

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