predispositions genetiques au cancer du...

COURS BIOLOGIE CELLULAIRE M1

PREDISPOSITIONS GENETIQUES au CANCER du FOIE

Angela SUTTON Université Paris 13 – UFR SMBH

OH.

radical hydroxyle

.NO

monoxyde d’azote

O2

oxygène

O2.-

anion superoxyde

ROO.

radical peroxyl

H2O2

peroxyde d’hydrogène

OH.

radical hydroxyle

ON.OO-

peroxynitrite

RNH2

Réaction de Fenton

Fe2+,

Cu2+

Réaction

d’Haber-Weiss

H2O2

SOD

e-

NOS

H+

ON.OOH

.NO2

R.

O2

BIOCHIMIE DES ERO

MISE EN EVIDENCE des ERO

PAR FLUORIMETRIE Dihydroéthidine : réagit avec l’anion superoxyde pour former de l’éthidium l excitation = 480 nm l émission = 600 nm Dichlorofluorescéine diacétate : désestérifié par les estérases cellulaires. Réagit avec le peroxyde d’hydrogène l excitation = 488 nm l émission = 525 nm

Dosage au fluorimètre ou au cytomètre de flux

PAR LUMINESCENCE

Réaction avec un système luminol

Dosage au luminomètre

ETHANOL CH3CH2OH

Voie constitutive

(cytoplasmique)

ADH NAD+

NADH, H+

CYP 2E1,

NADPH CYP

réductase

Oxydation

spontanée

CH3.CH2OH

radical

hydroxyéthyl

CH3CHO

acétaldéhyde

CH3CHO

acétaldéhyde

NADPH + O2 + H+

NADP+ + H2O

CH3.CH2OH

radical hydroxyéthyl

CH3CHO

acétaldéhyde

O2

OH.

+

Voie inductible

(microsomale)

Réaction de Fenton,

SOD, GPx, catalase

Voie mineure

(peroxysomale)

catalase

H2O2

H2O + ½ O2

CH3CHO

acétaldéhyde

NAD+

NADH, H+

CH3COO-

acétate

ALDH XO / AO

CH3COO-

acétate

O2

Chaîne respiratoire

Métabolisme de l’alcool

Altérations oxydatives des molécules

Lésions cellulaires

Apoptose ou nécrose

Lésions hépatiques

ALCOOL

Métabolisme

- ADH

- ALDH

- CYP 2E1

ERO

NADH+H+

ERO

Mitochondrie et lésions hépatiques alcooliques

OH

O2 - H2O2

MnSOD

CR

e-

Fe2+ MPO ClO-

H2O2 CAT

H2O

MnSOD: Superoxyde Dismutase à Manganèse MPO: Myéloperoxydase

GPx1: Glutathion Peroxydase 1 CAT: Catalase

Système antioxydant mitochondrial

GPx1 H2O

MnSOD

O2

.- H2O2 H2O GPx 1

OH.

Toxicité cellulaire

ALCOOL

Fe2+, Cu2+

Alcool et enzymes antioxydantes mitochondriales

Foie normal

Cirrhose

Carcinome

hépatocellulaire

BUT DES ETUDES

Facteurs génétiques ?

-Stress oxydant

-Métabolisme du fer

ALCOOL

TOXICITE HEPATIQUE DE L’ALCOOL

Maladies alcooliques du foie

MnSOD O2

.- H2O2 H2O GPx1

OH.

ALCOOL

Fe2+, Cu2+

Dimorphisme génétique

Ala/Val

MEILLEUR IMPORT MITOCHONDRIAL

ACTIVITE ENZYMATIQUE ACCRUE

Sutton et al, Pharmacogenetics 2003

Sutton et al, Pharmacogenetics and Genomics, 2005

ARN

Protéine

Structure

x

Alanine Valine

Hélice α Feuillet β

Dimorphisme génétique Ala/Val de la MnSOD

Chromosome Nucléotides AA Génotypes Activité

MnSOD

6 1183 C/T Ala/Val

Ala/Ala

Val/Val

Ala/Val

Ala

>>>

Val

CONSEQUENCES FONCTIONNELLES du DIMORPHISME GENETIQUE Ala/Val de la MnSOD

Protéasome

ARNm dégradé

Val-MnSOD

(feuillet b)

Protéine

d’ancrage Ala-MnSOD (hélice a)

ARNm Ribosome attaché

Protéine

d’ancrage

Protéasome

SUTTON A*, IMBERT A*, IGOUDJIL A, ALBANO V, CAZANAVE S, PESSAYRE D, DEGOUL F. Pharmacogenetics and Genomics. 2005,

15:311-319.

SUTTON A, KHOURY H, PRIP-BUUS C, CEPANEC C, PESSAYRE D, DEGOUL F. Pharmacogenetics, 2003, 13:145-157.

Ala-MnSOD Val-MnSOD

50 ml sang non coagulé + Ficoll

(héparine ou EDTA)

Membrane Membrane

lymphocytes

sérum

centrifugation Globules rouges

Récupération et lavage

des lymphocytes

ADN ARN

ADN PCR RFLP

Extraction automatisée d’ADN

PCR en temps réel

Principe de la PCR Amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel. A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits. Cinétique de la réaction et donc la quantification de l’ADN alors que la PCR classique ne donne que la mesure finale.

Homozygotes Allèle 1 Hétérozygotes

Allèle 1 / Allèle 2

Homozygotes Allèle 2

ALCOOL

Stéatoses

(SMa, SMi)

Cirrhose

Carcinome

hépatocellulaire

Foie sain

Altération du métabolisme des

acides gras

Peroxydation lipidique

Inflammation Fibrose

Sélection clonale Prolifération cellulaire

Différents degrés de lésions hépatiques

DEGOUL F, SUTTON A, MANSOURI A, CEPANEC C, DEGOTT C, FROMENTY B, BEAUGRAND M, VALLA D, PESSAYRE

D. Gastroenterology, 2001, 120 : 1468-1474.

LE DIMORPHISME GENETIQUE Ala/Val de la MnSOD MODULE le RISQUE de

MALADIES ALCOOLIQUES DU FOIE

Contrôles SMa SMi HA C

*

*

19% 17%

43%

58%

69%

*

SMa = stéatose macrovacuolaire (n=10) Smi = stéatose microvésiculaire (n=28) HA = hépatite alcoolique aiguë (n=12) C = cirrhose (n=13) Contrôles (n=79)

% Ala/Ala * : p < 0.05

Cirrhose

Cancer =

Carcinome hépatocellulaire

Foie sain

LE DIMORPHISME GENETIQUE Ala/Val de la MnSOD MODULE le RISQUE de CHC

NAHON P*, SUTTON A*, PESSAYRE D, RUFAT P, DEGOUL F, GANNE-CARRIE N, ZIOL M, CHARNAUX N, N’KONTCHOU G,

TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Clinical Gastroenterology Hepatology, 2005 ; 3 :292-298.

n=264 patients cirrhose alcoolique

50 0 100 150 200 250 (mois)

Ala/Ala (n=39)

Pat

ien

ts s

ans

CH

C

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Val/Val (n=40)

Ala/Val (n=83)

p = 0.014

Val/Val Ala/Val Ala/Ala p

Age (ans) 54 53 53 NS

Sexe Masculin (%) 61 63 71 NS

Alcool (g/j) 105 114 110 NS

Child-Pugh (score) 7,8 8,1 8,3 NS

Sevrage (%) 40 53 49 NS

Distribution n (%) 40 (25%) 83 (51%) 39 (24%)

MnSOD O2

.- H2O2 H2O GPx1

OH.

ALCOOL

Fe2+, Cu2+


Ala/Val


Pro/Leu

ARN

Protéine

x

Proline Leucine

ACTIVITE REDUITE

ALTERATION STRUCTURE

LIAISON AU SELENIUM

Dimorphisme Pro/Leu de la GPx1

Chromosome Nucléotides AA Génotypes Activité

GPx 1 3 593 C/T Pro/Leu Pro

>>>

Leu

Pro/Pro

Leu/Leu

Pro/Leu

MnSOD « Ala » = Ala/Ala + Ala/Val Forte activité MnSOD

GPx « Leu » = Leu/Leu + Pro/Leu Faible activité GPx

Association des dimorphismes de la MnSOD et de la GPx1

H202 H202

Faible activité MnSOD

Forte activité GPx1

Forte activité MnSOD

Faible activité GPx1

2 Val-MnSOD

2 Pro-GPx1

1 ou 2 Ala-MnSOD

1 ou 2 Leu-GPx1

2 Val-MnSOD

1 ou 2 Leu-GPx1

1 ou 2 Ala-MnSOD

2 Pro-GPx1

• 183 malades ayant une cirrhose alcoolique histologiquement prouvée, inclus au moment du diagnostic de cirrhose

• Détermination des génotypes MnSOD, GPx1 et HFE

• Recueil rétrospectif

- Données cliniques et para-cliniques : sévérité de la maladie hépatique

- Détermination de la teneur en fer intra-hépatique sur la première biopsie prouvant la cirrhose

• Recueil prospectif

- Incidence du CHC

- Délai de survenue du CHC

Influence des polymorphismes génétiques MnSOD / GPx1

2Val-MnSOD/

2Pro-GPx1

2Val-MnSOD/

1ou2Leu-GPx11ou2Ala-MnSOD/

2Pro-GPx1

1ou2Ala-MnSOD/

1ou2Leu-GPx1 P

Distribution

[N (%)]

Age (ans)

Sexe masculin

(%)

Child-Pugh

(score)

Alcool (g/j)

Sevrage (%)

8,4 7,5 8,0 7,8

53,2 51,1 53,4 54,4

113 114 116 108

87 63 71 68

24 (14) 22 (12) 67 (36) 70 (38)

54 59 46 58

NS

NS

NS

NS

NS

Caractéristiques initiales des 183 malades

MnSOD Val/Val Val/Val « Ala » « Ala »

GPx1 Pro/Pro « Leu » Pro/Pro « Leu » n 22 18 58 64

100

77

70

63

23

30

37

0

20

40

60

80

100

%

Cirrhose sans CHC

Cirrhose avec CHC

0

n=162 patients

cirrhotiques

Dimorphismes MnSOD / GPx1 et risque de CHC

2Val-MnSOD

2Pro-GPx1

2Val-MnSOD

“Leu”-GPx1

“Ala”-MnSOD

“Leu”-GPx1

“Ala”-MnSOD

“Pro”-GPx1

Mois

P = 0,0002

Mala

des s

an

s C

HC

H2O2

H2O2

Dimorphismes MnSOD / GPx1 et risque de CHC

L’ASSOCIATION des DIMORPHISMES de la MnSOD et de la GPx1 module le risque de CHC

2Val-MnSOD

2Pro-GPx1

2Val-MnSOD

“Leu”-GPx1

“Ala”-MnSOD

“Leu”-GPx1

“Ala”-MnSOD

“Pro”-GPx1

Mois

HR = 2,000

IC = 1,311 – 3,052

p = 0,001

Pat

ien

ts s

ans

CH

C

H2O2

H2O2

SUTTON A*, NAHON P*, PESSAYRE D, RUFAT P, POIRE A, ZIOL M, VIDAUD D, BARGET N, GANNE-CARRIE N, CHARNAUX

N, TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Cancer Research, 2006, 66:2844-2852.


(n=22)

(n=14)

(n=64)

(n=58)

MnSOD O2

.- H2O2 H2O GPx1

OH.

Fe2+, Cu2+

ALCOOL

Variant Ala-MnSOD Variant Leu-GPx1

MnSOD O2

.- H2O2 H2O

GPx1

OH.

Fe2+

0

20

40

60

2Val-MnSOD

2Pro-GPx1

2Val-MnSOD

“Leu”-GPx1

“Ala”-MnSOD

“Leu”-GPx1

“Ala”-MnSOD

“Pro”-GPx1

22% 28%

50% 53%

* *

1ère biopsie hépatique Coloration de Perls

L’ASSOCIATION des DIMORPHISMES de la MnSOD et de la GPx1 MODULE LE TAUX DE FER HEPATIQUE


Fer

SUTTON A*, NAHON P*, PESSAYRE D, RUFAT P, POIRE A, ZIOL M, VIDAUD D, BARGET N, GANNE-CARRIE N, CHARNAUX

N, TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Cancer Research, 2006, 66:2844-2852.

n=22 (14%) n=18 (12%) n=58 (35%) n=64 (39%) * : p < 0.05

LE DIMORPHISME Ala/Val de la MnSOD MODULE l’ACCUMULATION CELLULAIRE de FER

Val/Val-MnSOD (n=40)

Ala/Val-MnSOD (n=83)

Ala/Ala-MnSOD (n=39)

x 400

Patients cirrhose alcoolique

(n=162)

x 400

Cellules d’hépatome humain (Huh7) transfectées

Plasmide vide Val-MnSOD Ala-MnSOD

NAHON P, CHARNAUX N, FRIAND V, PROST-SQUARCIONI C, ZIOL M, BARGET N, LIEVRE N, TRINCHET JC, BEAUGRAND

M, GATTEGNO L, PESSAYRE D, SUTTON A. Free Radical Biology Medicine, en révision, 2008.

x21000

x6000

x28500

x6600

Val-MnSOD

Ala-MnSOD Ala-MnSOD

Plasmide vide

LE DIMORPHISME Ala/Val de la MnSOD MODULE l’ACCUMULATION CELLULAIRE de FER

Microscopie électronique

x21000

0

100

200

300*

Plasmide

vide Val-MnSOD Ala-MnSOD

To

tal

iro

n

(ng

/µg

of

pro

tein

)

Dosage colorimétrique

* : p < 0.05

Le DIMORPHISME Ala/Val-MnSOD MODULE-T-IL l’EXPRESSION DE PROTEINES IMPLIQUEES DANS

l’HOMEOSTASIE MARTIALE ?

TfR1

Ferritine cytosolique Ferritine mt

Frataxine

HEPATOCYTE

FER

STOCKAGE

ENTREE

FER FONCTIONNEL

Mitochondrial Cytosolique

Hepcidine

TfR2

Le DIMORPHISME Ala/Val-MnSOD MODULE-T-IL l’EXPRESSION DE GENES IMPLIQUES DANS


RT-PCR semi-quantitative

MnSOD

Le DIMORPHISME Ala/Val-MnSOD MODULE-T-IL l’EXPRESSION DE PROTEINES IMPLIQUEES DANS


Western-blot

Immunocytochimie

MnSOD

X 400

TfR1

Ferritine cytosolique Ferritine mt

Frataxine

HEPATOCYTE

FER

STOCKAGE

ENTREE

FER FONCTIONNEL

Mitochondrial Cytosolique

Hepcidine

TfR2

TRANSFECTION

MnSOD

O2.- H2O2 H2O

OH.

Fe2+, Cu2+

ALCOOL

MnSOD GPx

Ala-MnSOD Leu-GPx

Effets des dimorphismes sur l’activité des enzymes antioxydantes mitochondriales

STRATEGIES ANTIOXYDANTES ENVISAGEES

N-Acétyl Cystéine : précurseur du glutathion (utilisé en routine dans le cadre des hépatites fulminantes d’origine médicamenteuse) Augmenter les pools cytosolique et mitochondrial de GSH Accroître l’activité enzymatique de la GPx Sélénium Accroître l’activité enzymatique de la GPx Deferroxamine Chélateur du fer

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