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POSTERS

The effectiveness of oral vaccination (OV) campaigns in wildlife is usually assessed by the quantification of rabies antibodies and the detection of a biomarker.

Samples of wild animals are usually taken by hunters in rabies vaccinated areas. Most of the time, rabies antibodies are detected in body fluids collected by puncturing the heart or thoracic / abdominal cavities of animals killed or found dead. The assessment of rabies antibodies has technical difficulties, leading to inadequate monitoring of the effectiveness of OV.

The sampling method must be simple, practical, reliable and usable under any field condition. Samples need easy transport conditions and serological testing should work on samples of poor quality. ELISAs allow quick and easy detection of rabies antibodies in large-scale screening programmes.

We have designed a new method based on the use of Filter Paper (FP) to collect blood samples in the field coupled with the BioPro ELISA kit. It is the first time this method is used to detect rabies antibodies in wild animal. To validate this new approach, a feasibility study was carried out in ANSES-Nancy laboratory on field and experimental samples.

SPECIFICITY

Naive caged foxes and raccoon dogs: The specificity for FP blood samples reached 100 % in foxes and 96.7 % in raccoon dogs.

Only one FP eluate had a PB value of 59.6 %. Field samples: The specificity for FP blood samples reached 94.4 %.

For two samples, PB values were very close to the threshold (40.2 % and 47.8 %).

FP method shows high specificity (i.e. the proportion of

uninfected individuals testing negative) in both species in

experimental and in field conditions.

REPEATABILITY

Coefficients of variation were low for positive samples (high and

low rabies antibody titre) in both species and did not exceed

3.4%. Variation was also limited in negative samples (SD ≤ 3.8%),

demonstrating the reliability of the sampling method.

CONCORDANCE BETWEEN THE FP AND THE CONVENTIONAL VENIPUNCTURE BLOOD

COLLECTION METHODS

FP eluates titrated with the BioPro ELISA VS sera titrated with the FAVN

test: The overall agreement between the FP sampling method (on eluates titrated by ELISA) and conventional venipuncture method (on sera titrated by FAVN test) was 92% for fox samples and 95% for raccoon dog samples.

FP eluates titrated with the BioPro ELISA kit VS sera titrated with the

BioPro ELISA kit: The concordance between the BioPro ELISA results on FP eluates and sera was 95% for fox samples and 91% for raccoon dog

samples.

FP blood and serum samples showed concordant results

regardless of the method of titration used on the sera (FAVN test

or BioPro ELISA kit).

FILTER PAPER SELECTION

A method of micro-sampling using FP has already been validated in the ANSES-Nancy laboratory for the detection of rabies antibodies in bats. Choice of the FP according to the following parameters:

Its strength It has to resist to tear after impregnation No retention of rabies antibodies during the elution step No cross-interference of the FP with the results

For fox and raccoon dog blood samples, a surface of 7.5 cm2 was

considered sufficient for serological testing.

Selection of FP marketed by Bio-Rad (Mini Trans-Blot Filter Paper,

cat. No170-3932).

SAMPLES

Field samples: They were collected with FPs directly from various parts of the body of the shot foxes (shoulder, abdomen, thorax, head, heart, back, neck, etc.) The use of FPs has several advantages:

No need to transport the carcasses as FP is used directly in the field, nor to open the carcasses.

Blood is taken by pressing the FP from the wound caused by the gunshot. Each impregnated FP is put in individual plastic bag to avoid

cross contamination.

Method using FP to collect blood sample is cleaner

than the puncturing method

1

8

7

6

5

4

3

2

Use of filter paper blood samples for rabies

antibody detection in foxes and raccoon dogs Marine Wasniewski

Contact du projet : MARINE WASNIEWSKI sera présente le : mercredi 26 novembre 2014

ANSES-Nancy Laboratoire de la rage et de la faune sauvage - Technopôle Agricole et Vétérinaire, Domaine de Pixerécourt, Bâtiment H, CS 40009, F-54220 Malzéville Tél : 03.83.29.89.50 – Fax : 03.83.29.89.58 – Email : [email protected]

Partenaires du projet : ELIZ, Entente de Lutte Interdépartementale contre les Zoonoses, Domaine de Pixérécourt. Bât.G, 54220 Malzéville

Mercredi 26 novembre 2014

RESULTS

CONCLUSION AND PERSPECTIVES

MATERIALS AND METHODS

INTRODUCTION

According to this study, the new tool developed at ANSES Nancy (blood on filter paper associated to BioPro ELISA) seems to be a valuable and reliable

alternative to the conventional blood sampling and serum testing using seroneutralisation tests for monitoring the efficacy of oral vaccination campaigns of wildlife against rabies. Moreover, this method using FP is cost-

effective and very easy to use in field conditions. However, it should be necessary to assess the robustness and the

reproducibility of this new tool by testing and validating it in field conditions, i.e. during oral vaccination campaigns.

If necessary, a new cut-off could be defined for FP blood samples in further validation studies.

The effect of long term storage of dried blood samples at different temperatures should also be evaluated.

Acknowledgements: We would like to thank warmly the serological team and the Atton experimental station team for their technical assistance during all the feasibility study

Experimental samples: They were taken in our experimental station on foxes and raccoon dogs. The blood were collected on two vials:

One was used to impregnate the FP

The second was used to obtain the serum.

SEROLOGICAL TESTS

FAVN test: Seroneutralisation test on cells

BioPro Rabies ELISA Ab kit

ANALYSIS

Specificity, repeatability and concordance

Optimisation et validation d’une méthode de détermination par ICP-MS de titane provenant de nanoparticules de TiO2 manufacturées dans les matériaux biologiques Sandrine Millour, Yacine Nia, Laurent Noël, Thierry Guérin

Contact du projet : Laurent, NOEL Laboratoire de sécurité des aliments 23, Avenue du Général de Gaulle F-94706 MAISONS ALFORT CEDEX Phone: +33 (0)1 49 77 26 90; email: [email protected]


1 – Digestion : Extraction assistée par micro-ondes de Ti présent sous forme de NP TiO2 dans les matrices biologiques ; Avantages : Rapide, facile avec de bon taux de récupération 49Ti retenu pour la quantification du Ti par ICP-MS 2 – Détection: quantification de Ti après extraction [Ti] = 60 % [TiO2] - Bibliographie + Partenaires Nanogenotox : 47Ti et 49Ti - Travaux préliminaires : réalisés sur des matrices biologiques supplémentées par Ti confirmant que 49Ti est l’isotope le moins interféré

La validation a été réalisée sur les cinq MRI, les critères de performance (linéarité, LQ, justesse, répétabilité, reproductibilité de la fidélité intermédiaire) ont démontré que l'utilisation d'un mélange de HNO3/HF, la digestion par micro-ondes en système fermé pour la préparation de l'échantillon et la détection par Q-ICP-MS permettait une quantification précise de Ti présent comme NP de TiO2 dans des échantillons biologiques dans les deux modes standard et CCT à des niveaux de concentration près de la limite de quantification de 0,10 mg/kg. La validation de la méthode a été soutenue par des CQI appropriés pour atteindre un niveau de qualité satisfaisant en analyse de routine.

Analyse des MRI (ex : rein) avant et après ajouts avec différents modèles d’ICP-MS (nouvelle génération, avec différents modes permettant d’éliminer les interférences)

Dans le cadre du GT7 du projet européen NANOGENOTOX, sur l’identification des organes compétents pour tester la génotoxicité basée sur la détermination de l'exposition d'organes de TiO2, SiO2 et nanotubes de carbone, l'objectif de ce travail est d'optimiser et de valider une méthode d'analyse pour la détermination de titane (Ti) sous forme de TiO2 dans des échantillons biologiques utilisant la détection Q-ICP-MS.

mailto:[email protected]�

INTRODUCTION La fièvre aphteuse (FA) est un risque sanitaire majeur pour l’élevage des pays industrialisés pertes économiques, impact épidémiologique et social.

Question : Comment le décideur en santé publique choisit

une stratégie de contrôle en cas d’épizootie de FA ?

~ perception du risque : risque neutre stratégie optimale en moyenne vs aversion au risque stratégie la moins variable ~ impact considéré : coûts directs, pertes à l’export, opinion

publique (nombre d’abattages)

Stratégies de contrôle considérées : MÉTHODOLOGIE 1 - Modèle de simulation de FA en France basé sur des données d’élevages et de mouvements d’animaux 7350 simulations : 7 stratégies x 21 régions x 50 points d’introduction 2 - Calcul de la moyenne et de la variance d’impact des épizooties simulées : coûts directs, pertes à l’export, nombre

d’abattages

RÉSULTATS National :

Neutre : PV pour les coûts directs et le nombre d’abattages et

SV pour les pertes export

Aversion : PV pour les coûts directs et le nombre d’abattages

et SPV pour les pertes export

Régional : CONCLUSION Pas de stratégie optimale unique au niveau national et régional pour optimiser l’impact économique (coûts directs et pertes export) et social (nombre d’abattages).

Forte variabilité des stratégies d’abattage et faible

variabilité des stratégies de vaccination (sauf pour les pertes à l’export)

La perception du risque du décideur et les différents

impacts qu’il peut considérer doivent être pris en compte.

La décision au niveau régional permet de prendre en

compte les conditions locales de l’épidémie.

Impact de la perception du risque sur la prise de décision

concernant le contrôle d’épidémies de fièvre aphteuse

Maud MARSOT (LSAn, EPI), Séverine Rautureau (BSA, DGAL), Benoit Durand (LSAn, EPI)

Zone logo

Contact du projet : Maud MARSOT sera présente le 26 novembre 2014 Coordonnées complètes du contact : 01.49.77.22.53 – [email protected]

Partenaires du projet : DGAL


Abattage Vaccination

Stratégie foyers préventif préventive suppressive

SO = sanitaire oui non non non

PS = abattage préventif oui 1 km(1)+(2) non non

PV = vaccination préventive oui non 10 km(1)+(2) non

SPS = PS sélectif oui 1 km(2) non non

SPV = PV sélective oui non 10 km(1) non

SPSV = PS + PV sélectifs oui 1 km(2) 10 km(1)+(2) non

SV = vaccination suppressive oui non non 1 km(1)+(2)

(1) bovins+ porcs reproducteurs (2) petits ruminants + porcs non-reproducteurs

Ralph Steadman – Illustration de « La ferme des animaux" (G. Orwell)

S = sensible L = en latence I = excrétion sub-clinique J = phase clinique R = immun/guéri 3 forces d’infection : - intra-lot λw - inter-lot λb - environmentale λe

Neutre

Aversion

Coûts directs Nombre d’abattages Pertes export

Neutre

Aversion

OBJECTIF Le développement d’un test ELISA capable de détecter spécifiquement l’alpha-synucléine associée à la maladie (αSD) a été réalisé dans le modèle de souris M83, surexprimant l’alpha-synucléine humaine mutée en A53T, présentant spontanément une dégénérescence associée à des troubles moteurs.

Le test ELISA permet de discriminer facilement les souris M83 âgées et malades (> 8 mois) de celles jeunes et en bonne santé (2-5 mois), en utilisant des anticorps dirigés contre l’alpha-synucléine phosphorylée en sérine129 (pSer129) marqueur de la maladie, ou contre différentes séquences principalement C-terminale de l’αs.

ACCÉLÉRATION DE TYPE PRION DE LA

MALADIE SUR LE MODÈLE M83 Une accélération de la synucléopathie est observée après inoculation intra-cérébrale d’extraits de cerveaux de souris M83 symptomatiques contenant l’αSD à des souris M83 jeunes suggérant un mécanisme de type prion de la propagation d’αSD.

L’étude des cerveaux de souris M83 inoculées à main levée au niveau striato-cortical montre également une forte détection dans la région caudale du cerveau (mésencéphale, tronc cérébral) et dans la moelle épinière (Mougenot 2012, Bétemps 2014).

DISTRIBUTION NEURO-ANATOMIQUE L’αSD est détectée chez une souris M83 de 11 mois présentant des signes cliniques avec une forte immunoréactivité dans la région caudale du cerveau (mésencéphale, tronc cérébral) et dans la moelle épinière, conformément aux données connues dans ce modèle (Giasson Neuron 2002, Luk J Exp Med 2012).

La détection d’αSD est réalisée à partir d’homogénats de cerveaux de souris M83 âgées, préparés en tampon riche en NaCl, sans étape de concentration pour le test ELISA, à la différence du Western blot qui requiert une ultracentrifugation en présence de sarkosyl pour détecter la protéine (Mougenot Neurobiol Aging 2012).

INOCULATION STÉRÉOTAXIQUE Dans le modèle M83, une inoculation dans l’hippocampe est réalisée afin de suivre la propagation d’αSD par immunohistochimie, Western blot et ELISA.

A la différence de l’injection striato-corticale, l’injection dans l’hippocampe permet en plus d’un marquage dans la région caudale du cerveau, une détection d’αSD avec les 3 méthodes au site d’inoculation, dans l’hippocampe, et plus spécifiquement du côté inoculé (Hi-I).

0

25

50

75

100

0 200 400 600 800

M83 non-inoculées Hi

Me Cv

TC

C I

Hi Cv TC ME

actine

20

40

30

Injection d’un lysat de cerveau de M83 symptomatique

WB

ELISA

40 30

20

BO Cx St Hi Me Cv TC ME

WB

Etude par un test ELISA de la propagation de l’alpha-synucléine pathologique

dans le cerveau de souris transgénique M83, un modèle de la maladie de

Parkinson D. Bétemps, J. Verchère, S. Brot, A.L.Mougenot*, D. Gaillard, L. Lakhdar, S. Legastelois*, T. Baron.

Contact du projet : Dominique BETEMPS sera présente le : 26/11/2014 Anses- Laboratoire de Lyon, 31 avenue Tony Garnier, 69364 Lyon cedex07 Mail: [email protected] Partenaire du projet : * Indicia Production, La Parlière, Saint Genis l’Argentière


M83 âgée Signes

cliniques

Entre 10 et 22 mois Médiane 14,5 mois

pSer129

IHC

ELISA αSD

Souris symptomatiques Souris asymptomatiques

M83 inoculées

BO: bulbes olfactifs, Cx: cortex, Hi: hippocampe, St: striatum, Me: mésencéphale, Cv: cervelet, TC: tronc cérébral, ME: moelle épinière

Inoculation

ELISA M83 âgée

Signes Cliniques

M83 6 semaines

mois

jours

pSer129

actine

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2 2 3 3 5 5 11 12 16 16

DO

45

0 n

m

syn514

clone 42

LB509

AS11

pSer129

4D6

8A5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

BO Cx Hi St Me Cv TC ME

DO

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0 n

m

LB509

pSer129

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Hi-C Hi-I Cv TC ME

DO

450

nm

LB509

pSer129

Profil anatomique

de l’accumulation

d’αSD

Cv Cx

TC

BO

Hi Mes

St Thal

Hyp

Luk et al, JEM 2012

Détection

d’αSD par

ELISA

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

BO Cx Hi St Me Cv TC ME

DO

45

0 n

m

LB509 pSer129

Courbe de survie

Quantification of the extracellular matrix of the Listeria monocytogenes

biofilms of different phylogenic lineages with optimization of culture conditions

Graziella Bourdin , Irina Sadovskaya, Christine Faille, Yann Guérardel

Contact du projet : Graziella BOURDIN sera présente le 26/11/14 Anses LSAl site Boulogne sur mer Tél: 03 21 99 25 00 - Fax: 03 21 99 17 25 - EMail: [email protected] Partenaires du projet :ULCO, INRA, Université Lille 1, CNRS, Région Nord Pas de

Calais


INTRODUCTION Listeria monocytogenes is an opportunist pathogen that causes listeriosis. Few data on the matrix composition of L.

monocytogenes biofilms are available. However it is well-known that the extracellular matrix plays an important role in biofilm development, resistance to chemicals and to detachment.

The purpose of this study was to quantify the extracellular matrix of Listeria monocytogenes biofilm. A preliminary study was carried out to establish a relationship between phylogenetic lineage of 27 strains and their ability to form biofilm in various conditions. RESULTS

Lineage II strains produced significantly more biofilm than lineage I strains. In microtitre plates assay, biofilm quantities were. The amount of exopolymers in the extracellular matrix and the pH values were significantly higher in TSBYE than in MCDB 202 medium. The exception was the ScottA strain that presented similar pH values and exopolymer contents in both media. Proteins were the most abundant exopolymer components, followed by DNA and polysaccharides.

MATERIALS AND METHODS The different analyses of strain biofilm was reported on the figure.

CONCLUSION Biofilm production was clearly affected by environmental conditions, such as medium composition and temperature. Herein, we demonstrated that the EPS extracted from the biofilm of L. monocytogenes were in majority composed of proteins and that the polysaccharide content was generally lower than the DNA content. Finally, the ability of lineage II strains to form biofilm and the presence of non-cultivable bacteria in the biofilm, indicate that risks from Listeria biofilm must be taken seriously in sensitive food environments.

Acknowledgments: This project is part of a French research program, called ARCIR, which was supported by grants from the Région Nord-Pas de Calais and the FEDER program (Fonds Européen de Développement Régional). We are grateful to G. Leleu and C. Couvreur (ANSES Boulogne-sur-Mer) and G. Ronse (INRA Villeneuve d’Ascq) for their technical assistance. Reference of this study (2013) Journal of Applied Microbiology 114 (4) , pp. 1120-1131.

Vaccination du canard de Barbarie contre le virus de l’influenza aviaire H5N1 hautement pathogène : intérêt de l’association de deux vaccins recombinants Éric NIQUEUX, Olivier GUIONIE, Michel AMELOT, Véronique JESTIN

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Contact du projet : Éric NIQUEUX sera présent le : 26 novembre 2014 Coordonnées complètes du contact : laboratoire de Ploufragan-Plouzané, unité VIPAC 02 96 01 62 59 – 02 96 01 62 63 – [email protected] Partenaires du projet : Merial SAS, CODA-CERVA (BE), AHVLA (UK), VMRI (HU), CAO-VDD (HU), Diasource ImmunoAssays (BE), Epixis SA (FR) Le projet NOVADUCK a reçu le soutien financier de la Commission européenne (FP6)


CONTEXTE ET OBJECTIFS L’influenza aviaire (IA) hautement pathogène (HP) H5N1 est enzootique dans plusieurs pays d’Asie et en Égypte, constituant une menace majeure au niveau mondial pour la santé animale et pour la santé publique. L’infection des populations de canards domestiques représente un risque accru de circulation, de ré-émergence et de mutation de ce virus. Toutefois, les vaccins inactivés classiques contre l’IAHP H5N1 ont une efficacité limitée chez le canard (nécessitant d’utiliser des doses élevées et de multiples rappels), et ne permettent ni une stratégie DIVA ni une administration de masse. Le présent travail porte sur l’évaluation de l’intérêt en conditions expérimentales de programmes de vaccination contre le virus IAHP H5N1, chez le canard de Barbarie EOPS, associant de nouveaux vaccins recombinants.

EXPÉRIMENTATION Après épreuves virulentes avec un virus IAHP H5N1 :

suivi des signes cliniques et de la mortalité (pendant 13 j), et suivi de l’excrétion oro-pharyngée et cloacale,

par quantification de l’ARN viral et corrélation avec dose infectieuse.

Suivi des réponses immunitaires humorales avant épreuve, par test IHA H5 clade 2.2.1 et ELISA H5 / NP :

absence d’anticorps détectables en IHA H5, 1 sujet positif en ELISA H5 / 35 sujets vaccinés au total, et absence d’anticorps détectables en ELISA NP (DIVA), pour les canards vaccinés avec les vaccins recombinants (NDV-H5, FP-H5).

PROTECTION CLINIQUE OPTIMALE Après épreuve virulente à 9 semaines : le vaccin NDV-H5 seul et l’association FP-H5 + NDV-H5 assurent une protection complète contre toute mortalité (avec de rares signes cliniques pouvant persister exceptionnellement). Après épreuve virulente à 12 semaines : seule l’association FP-H5 + NDV-H5 assure une protection clinique complète, comparable au groupe vacciné avec le vaccin inactivé Re-5.

CONTRÔLE DE L’EXCRÉTION VIRALE

L’association vaccinale FP-H5 + NDV-H5 permet une meilleure réduction de l’excrétion virale oro-pharyngée, comparée à la vaccination par NDV-H5 seul : à 4 jours et 5,5 jours après épreuve virulente à 9 semaines, et à 2,5 et 4,5 jours après épreuve virulente à 12 semaines. Cette réduction est au moins équivalente à celle observée après vaccination avec le vaccin inactivé Re-5.

Les différents protocoles vaccinaux testés induisent également une réduction de l’excrétion du virus par voie cloacale à des niveaux équivalents entre eux.

J 2 J 15 9 sem. - -

épreuve IAHP NDV-H5 -

FP-H5 NDV-H5

J 2 J 15 12 sem. - -

épreuve IAHP

NDV-H5 - FP-H5 NDV-H5

- Re-5

épreuve IAHP : H5N1 HP A/mute swan/France/06299/2006, clade 2.2.1

Étude de protocoles vaccinaux chez le canard de Barbarie EOPS

0% 20% 40% 60% 80%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

12

13

taux

de

mor

talit

é

Jours après épreuve

Témoins non vaccinés

NDV-H5

FP-H5 + NDV-H5

Re-5

Mortalité observée après épreuve IAHP H5N1 à 12 semaines

CONCLUSION ET PERSPECTIVES Cette étude démontre l’efficacité (abolition de la mortalité, réduction de la morbidité et réduction de l’excrétion virale) et l’intérêt, en conditions expérimentales chez le caneton de Barbarie, d’un protocole de vaccination précoce (2 j d’âge) contre le virus IAHP H5N1 utilisant des vaccins recombinants exprimant des hémagglutinines H5 d’origines différentes. Ce protocole peut être approprié pour une administration de masse, avec primovaccination FP-H5 in ovo au couvoir et rappel NDV-H5 administré dans l’eau de boisson. L’intérêt et l’actualisation de ce protocole devront être confirmés vis-à-vis d’autres clades (circulant actuellement) du virus IAHP H5N1.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0

2

4

6

8

NDV-H5 : vaccin NDV + HA / H5N1 HP A/turkey/Turkey/1/2005, clade 2.2.1

FP-H5 : vaccin FPV + HA / H5N8 HP A/turkey/Ireland/1983

Re-5 : vaccin inactivé réassortant obtenu par génétique inverse, H5N1 HP

A/duck/Anhui/1/2006, clade 2.3

Titr

e vi

ral

(log 1

0 Eq.

EID

50/m

l)

% é

chan

tillo

ns p

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5/5

9/9

8/8

8/8

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9/9

7/8

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6/8

0/1

1/9

0/8

0/8

0/1

0/8

0/8

0/8

A B B

C A

B C C

A

B B B

Mesure de l’excrétion virale oro-pharyngée après épreuve à 12 s.

La filière apicole européenne

27 pays européens 2 questionnaires; données de 2010; 1 base de données

1 laboratoire de référence européen pour la santé des abeilles

Marie-Pierre CHAUZAT1,2, Laura CAUQUIL², Stéphanie FRANCO²,

Pascal HENDRIKX1, Magali RIBIERE- CHABERT² 1Unité de coordination et d’assistance à la surveillance, ANSES, Direction des Laboratoires, Maisons-Alfort, France. ²Unité de Pathologie de l’Abeille, ANSES, Laboratoire de Référence européen et national pour la santé des abeilles, Sophia Antipolis, France

European Union Reference Laboratory for Honeybee Health

[email protected]

Plus d’information voir Chauzat et al. PLOS ONE. 2013. 8 (11) :e 79018.

Pourcentage des apiculteurs professionnels en Europe. Voir la

publication pour la définition “d’apiculteurs professionnels”.

Production europeénne de miel en 2010.

Mortalité des colonies (%)

Austriche 16.2b – 16.4b

Belgique 27.6a

Danemark 11c

Estonie 18.6 c

Finlande 13 c - 24 c

France 20 b - 20 c

Allemagne 9,2 a – 16.3 a

Hongrie 30 d - 39 c

Ireland 22 b - 17 b

Italie 19 b – 22.5 d

Lithuanie 20 c

Pays Bas 23 a

Norvège 9 c

Polande 15 c - 17 b

Roumanie 0.01 d – 4.9 d

Slovakie 7.5 b - 15 c

Slovénie 12 d - 23 c

Suède 24.5 c

Royaume Uni 12 d - 14 c

Mortalité des colonies d’abeilles en Europe en 2010, données

(pourcentage) fournies par les NRLs

Origin des données. a: Projects de surveillance locaux ;

b: Questionnaire Coloss ; c: Associations d’apiculteurs;

d: Services vétérinaires

Apport de l’appréciation quantitative des risques en complément à

l’investigation des toxi-infections alimentaires collectives : application à la TIAC

à Salmonella Typhimurium monophasique 4,5,12: i: – dans les steaks hachés

Guillier L., Danan C., Bergis H., Delignette-Muller M.-L., Granier S., Rudelle S., Beaufort A. and Brisabois A.

Contact du projet : Laurent GUILLIER . [email protected] Partenaires du projet : ANSES, Laboratoire de sécurité des aliments ; Université de Lyon 1, CNRS, UMR5558, LBBE


1. CONTEXTE DE L’ÉTUDE

En octobre 2010, de nombreux cas de salmonelloses sont survenus à Poitiers (restauration collective scolaire). L’enquête efficace menée par les services en charge de l’investigation des TIACs a permis d’identifier la source alimentaire, le nombre de cas et la souche impliquée (Raguenaud et al., 2012). 3. DONNÉES COMPLÉMENTAIRES POUR

IDENTIFIER LES CAUSES L’idée de notre projet était de compléter les informations manquantes à l’aide d’analyses microbiologiques quantitatives et de modèles.

2. QUESTIONS EN SUSPENS APRÈS

L’INVESTIGATION DE LA TIAC

Si l’origine des cas de salmonellose a été identifiée, l’enquête rétrospective n’a pas permis d’expliquer l’ampleur de cette TIAC. Plusieurs hypothèses subsistaient sans pouvoir les vérifier.

4. UN MODÈLE D’AQR POUR COMBINER

LES INFORMATIONS DISPONIBLES

En réunissant dans un modèle d’appréciation quantitative des risque l’ensemble des informations issues de l’investigation et les données et modèles quantitatives complémentaires, il a été possible de déterminer les déterminants majeurs de la TIAC.

r p

N0ij

mR sR

Rij

w

doseij

pinfijpill_infij

pillij

Nilli

Variabilité j (1:nexposed)

Incertitude i (1:5000)

5. CONCLUSIONS DE L’ÉTUDE La principale cause de la TIAC est en lien avec les niveaux exceptionnels de contamination dans les steaks crus (jusqu’à 104 MPN/g). La virulence de la souche impliquée n’est pas différente des autres souches connues. Les pratiques de cuisson n’ont pas été mal appliquées (elles auraient permis la maitrise de niveaux plus bas et usuels de contamination).

6. PERSPECTIVES

Pratiques de cuisson ?

Plusieurs erreurs ?

554 malades Quelle(s) cause(s)

?

Références : Guillier et al. (2013). Int J Food Microbiol 166(3): 471-478. Raguenaud et al. (2012). Eurosurveillance 17. Teunis et al. (2010). Int J Food Microbiol 144(2): 243-249.

Appréciation quantitative des risques

Epidémiologie

Amélioration :Relation dose-réponse

Causes des TIACs

Attribution des sources

nombre malades (554)

nombre d’exposés (1559)=36%

Identification du lot de steaks hachés surgelés à l’origine des cas de salmonellose

Salmonella Typhimurium4,5,12:i:−

Enquête épidémiologique approfondie

Identification de la souche impliquée

Pratiques de cuisson ?

Niveau de contamination ?

Virulence ?

Dénombrements (et modélisation) de

Salmonella dans les produits

rappelés : N0

Modélisation de l’inactivation de

Salmonella dans les conditions

similaires à celles appliquées en restauration scolaire : R

Utilisation de la loi dose-réponse (Teunis

et al., 2010) :, , ,

Dose ingérée Infection Maladie

Pinf Pill/inf

Pill=Pill/inf.Pinf

Relation entre l’exposition à Mycobacterium bovis chez les sangliers

et la distribution des foyers de tuberculose dans les élevages bovins

Céline RICHOMME (LRFSN, SEEpiAS), Aurélie COURCOUL (LSAn, Epi), Benoit DURAND (LSAn, Epi)

et Maria-Laura BOSCHIROLI (LSAn, UZB – LNR Tuberculoses)

Contact du projet : Céline RICHOMME (LRFSN) & Maria-Laura BOSCHIROLI (LSAn) [email protected], 03.83.48.88.64 ; [email protected], 01.49.77.13.21 Partenaires du projet : LSAn (Antoine Drapeau, Yannick Corde), SaBio-IREC, Espagne (Mariana Boadella), Office national de la chasse et de la faune sauvage (Jean Hars, Ariane Payne), DGAl BSA(Alexandre Fediaevsky)


CONTEXTE ET OBJECTIFS

- La tuberculose bovine (TB) : une zoonose causée principalement par Mycobacterium bovis, une bactérie du complexe de Mycobacterium tuberculosis (MTC). - Le sanglier (Sus scrofa) : un acteur important à considérer dans l'épidémiologie de la TB pour potentiellement établir des programmes de surveillance et de lutte contre cette maladie. - Un test ELISA indirect bPPD: récemment mis au point en Espagne pour mesurer l’exposition des sangliers aux bactéries du complexe MTC ; en conditions expérimentales, test corrélé positivement aux lésions de TB chez les sangliers .

Objectif 1 : éprouver le test ELISA sur des échantillons de différentes sérothèques pour évaluer rétrospectivement l'exposition des sangliers au complexe MTC en France.

Objectif 2 : déterminer si cette exposition peut être mise en relation avec les foyers bovins de TB. Au final évaluer si le test ELISA pourrait être utilisé comme un outil de surveillance de la TB chez les sangliers à l’échelle populationnelle. MATÉRIEL ET MÉTHODE 1 – SERUMS : 2080 sangliers au total, dont - 1653 collectés entre 2000 et 2004 dans 55 dép., lors de l’enquête nationale Fédé. chasseurs – ONCFS - DGAl – Anses - 427 en 2009 et 2010, avec • 285 de 5 dép., étude trichine ONCFS – FDC - DGAl - Anses • 142 de Corse, enquête hépatite E Anses - INRA.

4 dép. avec éch. aux deux périodes (12, 35, 64, 2B) (n = 451). Commémoratifs : commune (n= 2008), sexe (1063 M, 943 F), classe d'âge (655 juvéniles, 1363 adultes). 2- TEST iELISA bPPD (TB-ELISA®, Vacunek, Espagne)

Basé sur l’utilisation d’un dérivé de protéine bovine purifiée Deux valeurs seuils utilisées : - 0,2, recommandé par fabricant. Sp : 96,43%; Se: 72,6% - 0,5 obtenu par courbe ROC pour Sp 100% ; Se : 65% 3 – ANALYSE DES DONNEES

- Test des facteurs âge et sexe par test de Fischer. - Analyse des distances entre les sangliers (centre commune) et leurs plus proches foyers bovins entre 2000-2010 (centre commune ; n=803) par méthode de bootstrap : 1000 permutations aléatoires des résultats sérologiques de sanglier avec hyp. nulle = statut sérologique des sangliers indépendant de la distance au foyer bovin le plus proche.

RESULTATS La distance moyenne entre les sangliers positifs et leur foyer bovin le plus proche est significativement plus faible que celle attendue sous l'hypothèse nulle de l’analyse par bootstrap. Pour plus de détails sur l’étude : PlosOne, 8(10): e77842.

PERSPECTIVES En plus de décrire pour la première fois la séroprévalence globale et la répartition géographique de l’exposition au MTC des sangliers en France, nous montrons une bonne cohérence

spatio-temporelle entre les sangliers séropositifs et les

foyers de TB chez les bovins, en particulier au seuil de 0,5. Notons que ces résultats ne permettent aucunement de déterminer si les sangliers sont réservoir ou non de la maladie. En revanche ils indiquent que le test ELISA pourrait être utilisé à une échelle populationnelle comme un premier outil de

surveillance de la TB chez les sangliers, suivi d’éventuelles investigations complémentaires combinant examens lésionnels et de bactériologie. Toutefois certains séropositifs peuvent être dus à une exposition à d’autres bactéries du complexe MTC comme M. microti, agent causal de la tuberculose de petits rongeurs assez répandue dans l’environnement, et non pas exclusivement à M. bovis. Des études permettant de préciser

la réactivité de l’ELISA à M. microti notamment sont donc nécessaires (travail en cours).

Figure 1 : répartition des sangliers séropositifs et séronégatifs au test ELISA bPPD.

(a) seuil 0,2 (b) seuil 0,5

mailto:[email protected]




HippoKAMP : Evaluation du potentiel thérapeutique de peptides

antimicrobiens équins contre les principaux agents pathogènes du cheval

CAUCHARD Séverine

Contact du projet : Séverine CAUCHARD sera présent le : 26/11/2014 Anses, Laboratoire de Pathologie équine Tél : 02 31 79 22 76 Email: [email protected] Partenaires du projet : Université de Caen Basse-Normandie, Université de Kiel (Allemagne), Vétoquinol.


OBJECTIFS Dans le contexte toujours plus préoccupant de l’apparition d’antibiorésistances, l’objectif de ce projet est de proposer une méthode de traitement alternative à l’antibiothérapie classique contre les principaux agents pathogènes équins, et ce, par la recherche de candidats peptides in silico jusqu’à la réalisation des tests in vivo. Stratégie expérimentale

AUTRES CANDIDATS PEPTIDES Sur 12 autres peptides sélectionnés, 7 peptides ont franchi les étapes de renaturation. Les études de cytotoxicité ont ensuite permis de mettre en évidence 3 peptides d’intérêt dont l’activité antibactérienne a également été évaluée.

NK-4, un nouveau peptide non cytotoxique et possédant une action antibactérienne, DEFA5 et DEFA16, deux peptides non cytotoxiques, ne présentant pas d’action antibactérienne directe (action immunomodulatrice à investiguer).

eCATH1, UN PEPTIDE PROMETTEUR Un peptide non cytotoxique actif in vitro… Indépendamment du profil d’antibiorésistance des souches testées, eCATH1 s’est révélé actif contre R. equi, Pseudomonas spp., K.

pneumoniae, E. coli, S. enterica. (Schlusselhuber et al. 2014 FEMS Microbiol. Letters 350:216-22)

Activité trypanocide contre T. b. brucei, T. evansi et T. equiperdum (IC50: 9,5 µM), avec un mécanisme d’action impliquant une perméabilisation membranaire et une altération mitochondriale.

…et actif in vivo dans un modèle expérimental de

rhodococcose.

PERSPECTIVES Optimisation de la méthode de production des peptides

Deux stratégies sont explorées:

- Production par voie recombinante (pSUMO) - Optimisation et réduction de la taille des peptides prometteurs (6 versions synthétisées de 14 à 17 aa, 4 peptides retenus)

Evaluation de l’effet immunomodulateur et anti-infectieux

des 8 peptides retenus - Quantification des cytokines produites in vitro

- Mise en place d’un modèle de screening in vivo

Approfondissement du mécanisme d’action des peptides - Etude transcriptomique - Collaboration avec l’équipe « Antibio-résistance » (Unité U2RM, Université de Caen).

x 12,000

x 120,000

x 30,000

x 100,000

Sélection de 13

peptides équins

• Synthèse chimique

• Renaturation*

• Caractérisation*

Evaluation de l’effet

immunomodulateur

• Cytokines in vitro

(PBMC équines)

• Screening in vivo

(chimiotactisme)

Evaluation de la

cytotoxicité

• Activité hémolytique

• Effets sur lignées cellulaires

Evaluation du

spectre d’action

• CMI / IC50

• Cinétiques d’action

• Effet sur bactéries, parasites, virus

Evaluation de l’effet

anti-infectieux

• Challenge infectieux (modèle murin)

Candidats retenus

• Optimisation de la production/séquence

• Transfert industriel

Microscopie électronique à balayage (A) et à

transmission (B) de Trypanosoma equiperdum

traités avec eCATH1 ou le diluant (contrôle

négatif). Addition d’eCATH1 à la concentration causant ~80% inhibition de la prolifération (19 µM, 60 µg/ml) pendant 15 min (A) ou 5 min (B). Des pores membranaires, un gonflement, une altération des membranes cytoplasmique et mitochondriale sont observés.

0

50

100

0 20 40 60 80 100

% C

yto

toxic

ité

Concentration peptides (µg/ml)

Nisine

eCATH1

NK1

NK2

NK3

NK4

DefA5

DefA16

*Collaboration Département de Biochimie de l’Université de Kiel.

Etape 1:

Chimiotactisme Etape 2:

Bactéricidie

Etape 3: Action

thérapeutique

- Analyses cellulaires - Voie d’administration - Cytokines produites

- Dénombrement (UFC)

- Charge bactérienne - Signes cliniques et survie

Tableau des CMI (µg/ml) obtenues selon la méthode

de microdilution (CLSI 2009).

Cytotoxicité in vitro des peptides sur cellules

RK13. Les valeurs représentent la moyenne et l’écart-type d’échantillons en triplicat d’un essai représentatif de 3 expériences différentes.

Contrôle Contrôle eCATH1 eCATH1 A/ B/

Diminution >99% UFC dans la rate et le foie (2 log10) des souris traitées à 1 mg/kg → Résultats similaires avec 10 mg/kg de rifampicine → Effet synergique eCATH1 + rifampicine. (Schlusselhuber et al., 2013 AAC 57:4615-21)

Contrôle

eCATH1

Rif.

Rif.+

eCATH1

Foie


Utilisation du Profil d’Exactitude pour Valider une Méthode PCR en temps réel afin de Quantifier les Bactéries dans les Féces. Saint-Cyr Manuel, Perrin-Guyomard Agnès, Houée Pamela, Vasseur Maleck, Laurentie Michel

Contact du projet : Michel Laurentie sera présent le : 26 novembre 2014 10 B rue Claude Bourgelat, 35306 Fougères cedex 02 99 17 27 47, Fax : 02 99 94 78 80


OBJECTIFS Dans cette étude, nous avons réalisé la validation d’une technique de PCR en temps réel permettant d’estimer les concentrations bactériennes dans des échantillons fécaux à l’aide du profil d’exactitude.

A l’inverse de la validation classique, l’exactitude permet d’étudier simultanément deux caractéristiques fondamentales : la justesse et la fidélité. PRINCIPE DU PROFIL D EXACTITUDE Le profil d’exactitude (PE) est un outil statistique qui permet de confronter un intervalle d’acceptabilité à un intervalle de tolérance. Un intervalle de tolérance est un intervalle dans lequel est définie une probabilité d’obtenir en routine une proportion d’échantillon (i.e. 95 % d’échantillon quantifié avec une garantie de 95 %

Le principe est d’utiliser les caractéristiques classiquement étudiées (justesse, fidélité) et de calculer un intervalle en ayant défini une probabilité d’acceptabilité (e.g. 90 %) pour les analyses effectuées en routine. Ce principe est applicable pour toutes les méthodes à variable quantitative.

MATÉRIEL & MÉTHODES Quatre cibles bactériennes représentatives de l’ensemble des bactéries se trouvant dans le tractus digestifs ont été choisies : Bacteroides fragilis, Bifidobacterium adolescentis, Enterococcus faecium et Escherichia coli.

Des échantillons fécaux stériles, obtenus à partir de rats axéniques ont été dopés avec une quantité connue d'espèces bactériennes (7.21 to 10.24 log10 UFC équivalent par gramme de féces) RÉSULTATS/CONCLUSION La méthode est validée pour B. fragilis et E. coli. Les limites de quantification sont respectivement de 8.20 et 7.43 log10 UFC/g de fèces. En revanche, la méthode n'est pas valide pour la quantification des bactéries E. faecium et B. adolescentis. Un biais systématique est observé pour E. faecium. Il est corrigé en appliquant un facteur de correction de + 0.63.

En revanche la méthode ne peut-être validée pour B. adolescentis car le biais n’est pas constant. Elle ne peut-être utilisée que pour détecter la présence de la bactérie. En conclusion le PE est un outil de validation mais également de diagnostic des sources d’erreurs.

GRAM + GRAM -

SYBR GREEN

TAQMAN

Enterococcus faecium

Bifidobacterium adolescentis Bacteroides fragilis

Escherichia coli

Extraction qPCR Analyse

3 séries ; 3 niveaux conc/série ; 3 extract/conc/série ; 2 répétitions qPCR/extract

biais

biais

Fèces

ADN extrait

PCR quantitative

Limite d’acceptabilité λ

0

Conc

Biais

Biais = 0

LOQ >

-λ

Erreur systématique + Erreur aléatoire (justesse) (fidélité)

+λ

Limite d’acceptabilité λ Intervalle de tolérance β

LOQ <

biais

LOQ : 8.20 log10 CFU/g de fèces

LOQ : 7.21 log10 CFU/g de fèces LOQ : 7.43 log10 CFU/g de fèces –Application facteur de correction +0.63 log10 CFU/g

– Utilisation en détection

biais

Critères de performance : -justesse, -fidélité, - LOQ - (LOD) .

exactitude

Ragondins et rats musqués sentinelles de la présence d’Echinococcus

multilocularis dans les nouvelles zones d’endémies.

FRANCK BOUÉ, GÉRALD UMHANG, JEAN-MARC BOUCHER, GÉRALD GUEDON AND CÉLINE RICHOMME


MATERIELS ET MÉTHODES

RÉSULTATS

CONCLUSIONS

Ragondin Rat Musqué

Département Infecté Analysés Infecté Analysés

Orne 1 (1,0%) 101 0 68

Calvados 0 56 2 (6,5%) 31

Manche 1 (3,8%) 26 0 63

1. Zone d’étude et sites de capture

Sélection par randomisation de 5 sites

2/3 rivière 1/3 marais

1Km

2. Capture des rongeurs

selon une méthode de piégeage adaptée de celle dite « de Chizé » De Septembre à décembre 2010

3. Prélèvements et analyses des échantilons

Recherche macroscopique de protoscolex dans le kyste (indice de fertilité du Identification moléculaire du parasite par recherche d’ADN et séquençage génique sur locus mitochondrial permettant d’établir un diagnostic pour les différentes espèces de ténia dont E. multilocularis.

Les organes (foie) qui présentaient des kystes ont été prélevés lors d’une autopsie. Conservés à -20°C ils ont été tranférés au LRFSN en fin de saison de piégeage.

Au total, 845 rongeurs aquatiques ont été piégés, dans les 12 départements participants (563 ragondin et 281 rat musqué). Parmi les 53 ragondins et les 108 rats musqués qui présentaient un kyste hépatique, nous avons identifié 2 ragondins, provenant de la Manche et de l’Orne, et 2 rats musqués, provenant du Calvados, porteurs de la forme larvaire d’Echinococcus multilocularis

Parmi les 157 autres rongeurs aquatiques présentant des kystes sur le foie, 120 étaient porteurs de Taenia non transmissibles à l’Homme. Un fort niveau d’infection par T. taeniaformis a été observé chez les rats musqué (31.4% alors que l’infection est plus faible chez les ragondin (1.7%).

n T.

taeniaformis

T.

mustelae

T.

polyacantha T. martis

Ragondin 533 1,7% (9) 1,1% (6)

0,9% (5) 0,2% (1)

Rat

musqué 283 31,4% (89) 2,1% (6) 2,1% (n=5) 0

Le fait d’avoir mis en évidence 4 rongeurs aquatiques infectés par E. multilocularis n’implique pas que les rongeurs aquatiques soient pour autant une menace directe d’EA pour l’Homme ou l’environnement, en raison de leur position comme hôte intermédiaire dans le cycle parasitaire (la contamination de l’environnement se faisant par les œufs de parasites présents dans les fèces de l’hôte définitif, le renard principalement). Les faibles prévalences observées ici sont en accord avec celles mesurées chez le renard dans les mêmes départements. Le rat musqué, même mort, semble peu présent dans le régime alimentaire du renard, aussi son rôle comme hôte intermédiaire de l’échinococcose doit être considéré comme faible, même si nous avons mis en évidence qu’il pouvait héberger des kystes fertiles. Les rongeurs aquatiques apparaissent comme des bio-indicateurs de la présence d’E. multilocularis dans l'écosystème et sont donc des indicateurs du risque local d’EA pour les hôtes intermédiaires et surtout pour l’Homme en tant qu’hôte accidentel.

Contact du projet : Franck BOUE Unité Surveillance et Eco-Epidémiologie

des Animaux Sauvages

Laboratoire de la rage et de la faune sauvage Nancy

CS 40009 54220 Malzéville cedex

Partenaires du projet : - Ministère de l’agriculture - Les Fédérations Départementales des Groupements de Défense contre les Organismes Nuisibles (FDGDON) des régions de Basse-Normandie, Bretagne, Pays de la Loire. - Les Laboratoires Départementaux d’Analyses (LDA) des départements concernés

par le programme.

Building a molecular Listeria monocytogenes database to centralize and

share typing data from food, environmental and animal strains throughout

Europe Benjamin Félix a, Corinne Danan a, Ivo VanWalle b, Renaud Lailler a,ThomasTexier c, Bertrand Lombard a, Anne Brisabois a,

Sophie Roussel a

a: University Paris-Est, ANSES, Laboratory for Food Safety, European Union Reference Laboratory for Listeria monocytogenes,

94706 Maisons-Alfort, France

b: ECDC, European Centre for Disease Prevention and Control, Food- andWaterborne Diseases and Zoonoses Programme,

Tomtebodavägen 11 A, 17183 Stockholm, Sweden

c: University Paris-Est, ANSES, Information Technology Services, 94706 Maisons-Alfort, France

Contact du projet : Benjamin, FELIX ; sera présent le : 26 Novembre 2014 Laboratory for Food Safety, Maisons Alfort site, Unit “Salmonella, E.coli, Listeria” SEL Listeria Team , Project leader, 23, Avenue du Général de Gaulle, 94706 MAISONS ALFORT CEDEX, Téléphone: +33 1 49 77 28 29 Partenaires du projet : ECDC, EFSA, DG SANCO, steering committee NRLs


BACKGROUND

The European Union Reference Laboratory (EURL) for Listeria

monocytogenes (Lm) coordinates in 2014, a network of 37 National Reference Laboratories (NRLs) in Europe.

The EURL has set up a molecular European typing database for Lm (EURL Lm DB) since 2012. It includes epidemiological and typing data (PFGE, serotype) on strains isolated from food, environmental or animal strains. It is shared within the NRL network [1].

CURATION

• Accepts or rejects the profiles

• Adds validated profiles

• Troubleshooting and technical advices to partners on protocol and gel analysis.

THE EURL LM DATA BASE

• Hosted by the EURL

• Steering committee: 8 NRLs, EURL, EFSA, ECDC

• Data processing platform based on an evolution of the PulseNet USA communication scripts.

• Used to share and analyze the typing data obtained in the frame of the European coordinated monitoring program on the prevalence of Lm in certain ready-to-eat foods in Europe.

• For a given NRL, the condition to access the database is to have successful participation in the most recent EURL PFGE Proficiency testing Trial [2,3].

• Using the EURL Lm DB aims encourages NRLs to use widely their national databases and to strengthen national surveillance

CONCLUSIONS

•The EFSA has initiated the set up of food, environment and animal molecular typing database for the main food-borne pathogens. It will start in 2016. In this context, EFSA benefits of the EURL expertise.

•Currently, used in combination with databases on human strains, the EURL Lm DB is integrated into the European surveillance system.

•The EURL Lm DB is reflecting part of the genetic diversity of food Lm strains. As a powerful tool for the research purposes it will be useful for the European research whole genome sequencing (WGS) projects carried out within the Anses “Listeria “ team (Anses/DTU PhD project ; “COMPARE” H2020 5 years project ; EFSA- 2 years project).

References

[1] Félix, et al. (2014). Building a molecular Listeria monocytogenes database to centralize and share typing data from food, environmental and animal strains throughout Europe. Journal of Microbiological Methods. 104:1-8.

[2] Felix et al. (2013). Pulsed-Field Gel Electrophoresis Proficiency Testing Trials: Toward European Harmonization of the Typing of Food and Clinical Strains of Listeria monocytogenes. Foodborne Pathog Dis.10:873-881

[3] Félix et al. (2012). Pulsed-Field Gel Electrophoresis, Conventional, and Molecular Serotyping of Listeria monocytogenes from Food Proficiency Testing Trials Toward an Harmonization of Subtyping at European Level. Foodborne Pathog Dis 9, 719-726.

EURL Lm European Union Reference Laboratory for Listeria monocytogenes

Fluorescence amplified fragment length polymorphism compared to

Pulsed Field Gel Electrophoresis for Listeria monocytogenes subtyping

Sophie Roussela, Benjamin Félixa, Kathie Grantb, Trinh Tam Daoa, Anne Brisaboisa, Corinne Amarb

a: University Paris-Est, ANSES, Laboratory for Food Safety, European Union Reference Laboratory for Listeria monocytogenes,

94706, Maisons-Alfort, France

b: PHE Colindale, London, UK, Public Health England, Gastrointestinal Bacteria Reference Unit, 61 Colindale Avenue, London,

UK.

Contact du projet :Sophie Roussel ; sera présente le : 26 Novembre 2014 Laboratory for Food Safety, Maisons Alfort site, Unit “Salmonella, E.coli, Listeria” SEL Listeria Team , Project leader, 23, Avenue du Général de Gaulle, 94706 MAISONS ALFORT CEDEX, Téléphone: +33 1 49 77 28 29 Partenaires du projet : PHE, DG SANCO


BACKGROUND

• A Standardized PFGE protocol [1] is routinely used in the EURL for the surveillance of Listeria monocytogenes (Lm) isolated from foods, animals and the environment.

• Since 2008, the UK-NRL for Lm has used fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism (fAFLP) for the routine surveillance of Lm isolated from human cases and food.

• The EURL is the leader laboratory for evaluate new typing methods and deploy them through the European National Reference Laboratories (NRL) network.

• This study compares fAFLP with PFGE for typing Lm [2 ] .

RESULTS

• A common PHE/Anses panel of 109 Lm isolates from either human cases of listeriosis (outbreaks or sporadic cases), foods, food processing environments and animals were selected.

• Strains known to be epidemiologically related with another were found to have unique PFGE and fAFLP types .

• The discriminatory ability of fAFLP was similar to that of PFGE (Table 1).on a panel of 97 no epidemiologically related strains.

• We set up a dictionary linking PFGE/fAFLP types.

CONCLUSIONS

The fAFLP protocol used by UK-NRL is an alternative to PFGE to type Lm.

Before deploying fAFLP through the European NRL network, this method needs to be fully standardized and its reproducibility assessed by proficiency test trials. The FAFLP/PFGE dictionary will be used in the coming months to select the strain panel of interest for the collaborative Anses/PHE/SSI research project. This two years project founded by EFSA aims to evaluate, by Whole Genome Sequencing, the genetic diversity among the strains of food and clinical strains in Europe (OC/EFSA/BIOCONTAM/2014/01) References [1] Félix B, Brisabois A, Dao TT, Lombard B, Asséré A, Roussel S: 2012. The use of Pulsed Field Gel Electrophoresis in Listeria monocytogenes subtyping : harmonization at the European Union level. In: Gel Electrophoresis : Principles and Basics. Edited by INTECH, vol. 1, Japan; 2012: 241-254. [2] Roussel S, Félix B, Grant K,, Dao TTD, Brisabois A, Amar C. 2013. Fluorescence Amplified Fragment Length Polymorphism (fAFLP) compared to PFGE for Listeria monocytogenes sub-typing. BMC Microbiology 13 :14, 1-10.

EURL Lm European Union Reference Laboratory for Listeria monocytogenes

Lineages Serogroup / serotype Nb of isolates Nb of PFGE types PFGE discimination 1 Nb of fAFLP types fAFLP discrimination 1

IVb 35

IIb 11

IIa 45

IIc 5

III 4a 1 1 n/a 1 n/a

Total: 97 82 0.996 76 0.993

I

II

Table 1: PFGE and fAFLP typing results

1: Index of discrimination calculated according to the Simpson’s index of diversity

36

45

0.988

0.995

33

43

0.981

0.989

Coronaviroses et transmission inter-espèces : modèle des coronaviroses félines et canines Pham-Hung d’Alexandry d’Orengiani, Duarte Lidia, Pavio Nicole, Le Poder Sophie

Contact du projet :Sophie Le Poder,sera présent le : 26/11 AM [email protected] Tél : 01 43 96 73 25 Partenaires du projet EPICOREM (ANR) : Vabret Astrid (u. Caen-basse-Normandie), Le-Gouil Mériadeg (Institut Pasteur), Montchatre-Leroy Elodie (ANSES Nancy), Eterradossi Nicolas (ANSES Ploufragan), Guérin Jean-Luc (ENVT) Projet CoVetLab (PEDV, HKU15): ANSES Plougragan (Y. Blanchard), Danemark, Suède, Hollande, Royaume-Uni


β-actin

Cellules canines T- gp3 gp3-Δ1 gp3-

Δ2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

gp3 gp3-Δ1 gp3-Δ2

Fold

Exp

ress

ion

Cellules félines

Transmissions interspécifiques de Coronavirus félins et canins Différents génotypes de CoV sont décrits dans les espèces canines et félines. Leur étude phylogénétique montre que certains sont issus de double recombinaison due à des transmissions virales entre les 2 espèces. Nos études d’épidémiologie moléculaire des CoV infectant le chat a révélé l’existence de nouvelles souches comportant un gène d’origine féline mais un gène N d’origine canine ainsi q’un gène accessoire ORF3 canin mais sous forme tronquée.

Conclusions et perspectives - L’étude de la fonction des différentes formes de gp3 se poursuit par une étude des voies de stress du RE. -Les souches félines et canines vont faire l’objet d’autres études phylogéniques par séquençage haut débit -Le programme ANR EPICOREM (2014-2017) étudie les CoV dans différents écosystèmes de la faune sauvage à l’Homme en incluant les carnivores domestiques.

FCoV I

FCoV II

Pol S M N E Pol S M N

ORF3

CCoV-I E

CCoV-IIb

CCoV-IIa

S, TGEV

CCoV-A76

ORF3Δ1 or Δ2

GP3 s’exprime en cellules canines mais peu en cellules félines Afin de déterminer l’impact des délétions de gp3 dans l’adaptation de CoV à l’espèce féline, les différentes formes de gp3 ont été exprimées et caractérisées par expression transitoire en cellules canines et félines.

GP3 et ses formes mutées se localisent dans le RE malgré l’absence de signal de rétention Par étude de co-localisation entre des marqueurs sub-cellulaires et les différentes formes de GP3, nous avons pu déterminer que les protéines étudiées étaient retenues dans le RE en cellules félines et canines.

β-actin 0

2

4

6

8

10

12

14

16

gp3 gp3-Δ1 gp3-Δ2

Fold

Exp

ress

ion

Gp3

Anti-Flag Merge Anti-Calnexin

Gp3-Δ1

Gp3-Δ2

T-


Emergence d’un nouvel Orthobunyavirus en Europe : Le virus

Schmallenberg Gouzil Julie, Sailleau Corinne, Bréard Emmanuel, Laloy Eve, Garnier Annabelle, Viarouge Cyril, Fablet Aurore, Damien Vitour, Stéphan Zientara

Contact du projet : Stéphan Zientara sera présent le : 26.11.2014

[email protected] Partenaires du projet : ID-vet


DEVELOPPEMENT D’UN TEST ELISA

Bréard E, et al. (2013) Validation of a Commercially Available Indirect Elisa Using a Nucleocapside Recombinant Protein for Detection of Schmallenberg Virus Antibodies. PLoS ONE 8(1).

INFECTION CHEZ LE CHIEN

ETUDE DU FACTEUR DE VIRULENCE NSs

DBD NSs

AD Target

pPC97_NSsSBV

pPC86_cDNA

Leu

TrpGal4 UAS

Cellular cDNA libraries (spleen, brain)

Gal4 UAS

Y187

Growth in selective environment

- Leu / - Trp / - Ura

Transformation

Ura 3DBD

NSs

Target

AD

Gal4 UAS

8 putative cellular partners

• Interactions confirmation (IP, GST-pull down)

• Study of these interactions functions on SBV replication

DBD NSs

AD Target

pPC97_NSsSBV

pPC86_cDNA

Leu

TrpGal4 UAS


Gal4 UAS DBD NSs

AD Target

pPC97_NSsSBV

pPC86_cDNA

Leu

TrpGal4 UAS


Gal4 UAS

Y187

Growth in selective environment

- Leu / - Trp / - Ura

Transformation

Ura 3DBD

NSs

Target

AD

Gal4 UASUra 3

DBD

NSs

Target

AD

Gal4 UAS

8 putative cellular partners

• Interactions confirmation (IP, GST-pull down)

• Study of these interactions functions on SBV replication

SYSTÈME DE GENETIQUE INVERSE

But du projet : Identifier les partenaires cellulaires du facteur de virulence NSs afin d’identifier les mécanismes

moléculaires impliqués dans la virulence et la pathogénèse du SBV. Méthode : Crible double-hybride en levure qui a permis d’identifier 8 interactants cellulaires de la NSs. Les interactions devront être confirmées ainsi leur rôle

fonctionnel sur le cycle de réplication du SBV. Viral genomic segments

pPol T7 L pPol T7 L

pPol T7 M pPol T7 M

pPol T7 S

pPol T7 SΔNSs

pPol T7 S

pPol T7 SΔNSs

Recombinant SBVRecombinant SBV

BSR-T7

Transfection

BSR-T7

Transfection

NN

NN

NN

rSBVΔNSsrSBVΔNSs

L

MS

L

MS

L

MS

L

MS

L

MS

rSBV

L

MS

L

MS

L

MS

L

MS

L

MS

rSBV

rSBV ΔNSs

N

Actin

rSBV ΔNSs

N

Actin

Massimo Palmarini and Mariana VarelaUniversity of Glasgow

Ifnar-/- 4days p.i. EDTA blood

SBV RNA Ct values in IFNAR KO mice (day 4 p.i.)

048

1216202428323640

WT DNSsSBV WT SBVΔNSs

SBV RNA Ct values in IFNAR KO mice (day 4 p.i.)

048

1216202428323640

WT DNSsSBV WT SBVΔNSs

Recombinant SBVwt / ΔNSs strains both induce a strong viremia in Ifnar-/- miceRecombinant SBVwt / ΔNSs strains both induce a strong viremia in Ifnar-/- mice

rSBVΔNSsrSBVΔNSs

L

MS

L

MS

L

MS

L

MS

L

MS

rSBV

L

MS

L

MS

L

MS

L

MS

L

MS

rSBV

Sailleau C et al, (2013) Schmallenberg virus infection in dogs, France, 2012. Emerg Infect Dis, 19 (11).

But du projet : Développer une souche de SBV délétée de la protéine NSs (SBVΔNSs) afin d’évaluer son potentiel vaccinal Méthode : Les souches sauvages et ΔNSs ont été caractérisées in vitro et in vivo dans le modèle murin

IFNAR-/-. Chaque virus recombinant est capable d’induire une virémie chez l’animal. Une confirmation de l’établissement de la virémie chez l’ovin ainsi qu’une étude de l’induction d’anticorps protecteurs est en projet.

But du projet : Recherche du virus Schmallenberg chez un chiot présentant des troubles neurologiques.

But du projet : Développer et valider un outil de diagnostic

sérologique, rapide et spécifique, pour le diagnostic de

masse, pour toutes espèces sensibles (Coll. IDVET)

Méthode : détection spécifique d’anticorps dirigés contre la protéine recombinante N du virus Schmallenberg.

10 mars 2012 : Mise bas de 4 chiots avec ataxie, torticolis

Mi-avril : mort de 3 chiots (épilepsie)

Race : Malinois Envoi du chiot vivant à l’ENVA-UMES 18 juin : Euthanasie

Négatif (PCR) :

Coronavirus Neospora caninum Toxoplasma gondii Parvovirus

Histologie :

Signes cliniques sur chiots :

Evocateurs de ceux observés sur nouveau-nés des ruminants atteints de SBV pendant gestation

+

séroneutralisation et ELISA SBV :

mère et 1/7 chiennes de l’élevage: positives

+ RT-PCRSBV :

Cerveau du chiot euthanasié: positif

Encephalopathie dégénérative avec vacuolisation neuronale

Méthode:

Cas rare d’infection chez le chien

Contamination par Toxoplasma gondii des viandes de boucherie consommées

en France et les risques pour la sécurité sanitaire des alimentes

Radu Blaga, Dominique Aubert, Catherine Perret, Regine Geers, Myriam Thomas, Vitomir Djokic, Tamara Ducry, Annie Alliot,

Lenaig Halos, Anne Thebault, Benoit Durand, Corinne Danan, Isabelle Villena, Pascal Boireau

Contact du projet : Radu BLAGA sera présent le : 26.11.2014 UMR BIPAR, Anses-Enva-Upec, 23 av. du General de Gaulle, 94700 Maisons-Alfort Tel: 01 43 96 72 15 Fax: 01 43 96 71 90 email: [email protected] Partenaires du projet : CNR Toxoplasmose, USC Epitoxo, Reims; Direction Générale de l’Alimentation


OBJECTIFS Estimer la séroprévalence de l'infection par Toxoplasma gondii des viandes ovines, bovines et porcines destinées à la consommation en France, afin de fournir des données en vue de l'évaluation de l'exposition de la population. Identifier les facteurs de risque de portage chez l'animal (âge, origine géographique, sexe, type de production, etc.) et caractériser les génotypes de Toxoplasma gondii présents chez les ovins, bovins et porcins. Tableau 1 : Résultats du plan de surveillance 2007 de la contamination par T. gondii des viandes ovines

RESULTATS Le taux de séroprévalence se situe, selon l’espèce et l’origine

des viandes, entre 2,46% pour les porcelets hors-sol et 69,5% pour les ovins adultes, mais avec des facteurs de variation importants, le principal étant lié à l'âge de l'animal. Pour les porcs une association significative a pu être mise en évidence entre la séroprévalence de la toxoplasmose et le type de production (P=0,004), un porc plein-air ayant 5,4 fois plus de chances d'être séropositif qu'un porc hors-sol.

Tableau 3 : Résultats du plan de surveillance 2013 de la contamination par T.gondii des viandes porcines

MATÉRIEL ET MÉTHODES Des échantillons de cœurs et de diaphragmes ont été collectés

chez 425 ovins, 2349 bovins et 1549 porcins dans des abattoirs français, et analysés selon l’âge des animaux, leur origine

géographique et le type d’exploitation. Au Marché d’Intérêt

National de Rungis, 376 et 562 carcasses d’ovines et bovines

importées ont également été prélevés. Un titrage des anticorps spécifiques par la technique d’agglutination directe haute

sensibilité (ADHS) a été effectué sur tous les prélèvements. Tableau 2 : Résultats du plan de surveillance 2009 de la contamination par T.gondii des viandes bovines Concernant l’origine géographique des échantillons, de fortes

variations de prévalence ont été mises en évidence autant chez les ovins (fig.1) que chez les bovins, mais pas chez les porcs. Des parasites vivants ont été retrouvés dans 11,9% des carcasses ovines d'origine française, parmi lesquelles 30% étaient des carcasses d’agneaux. Deux isolats (2/207) ont pu

être mis en évidence chez les bovins. L’isolement des parasites

vivants a pu être réalisé à partir de 41 carcasses de porc. Le génotype II a été identifié pour l'ensemble des souches.

Figure 1 : Répartition géographique de la séroprévalence T.gondii chez les agneaux (PS 2007, ovin)

Résultats

Ovins d’origine française Ovins importés

(MIN Rungis)

Agneaux (<12 mois)

Adultes Total Agneaux

(<12 mois)

Adultes

Total

Nombre

d’échantillons

analysés

336 82 425 276 98 376

Séroprévalence

[IC95]*

13,10% [10–7]

69,50% [59–8]

24% [20–8]

15,90% [12–11]

50% [40–

60]

24,70% [21–29]

Résultats

Bovins d’origine française

(abattoirs)

Bovins importés

(MIN Rungis)

Veaux (<250 j.)

Adultes Total Veaux

(<250 j.) Adultes Total

Nombre

d’échantillons

analysés

573 1775 2349 225 337 562

Séroprévalence

[IC95]*

2,50% [1–4]

15% [13–17]

11% [9–12]

6% [3–10]

34% [30–40]

22% [18–26]

Résultats

Porcs hors-sol Porcs plein-air

Porcelet (<25 kg)

Charcutier Réform

e Total

Porcelet (<25 kg)

Charcutier

Réforme Total

Nombre

d’échantillons

analysés

126 963 237 1326 5 195 7 207

Séroprévalence

[IC95]*

2,46% [2,1-2,6]

2,85% [2,7-2,9]

13,41% [13,1-13,9]

3% [2,9-3,1]

- -

6,30% [5,8-6,5]

- -

5,8% [5,5-6,1]

CONCLUSION Cette étude a permis d’estimer le niveau d'infection toxoplasmique des viandes de boucherie (espèces ovine, bovine et porcine) en France, pour lequel on ne disposait d'aucune donnée récente.

Ditylenchus dipsaci, nématode des tiges de la luzerne:

Analyse de Risque Phytosanitaire (zone Europe)

Corinne SARNIGUET, Laboratoire de la Santé des Végétaux unité de nématologie


RÉFÉRENCES: • Avis de l’Anses (16/04/2013) relatif à l’analyse de risque phytosanitaire Ditylenchus dipsaci sur luzerne. Saisine n° 2012-SA-0086 • Raphaëlle Mouttet, Abraham Escobar-Gutiérrez, Magali Esquibet, Laurent Gentzbittel, Didier Mugniéry, Philippe Reignault, Corinne Sarniguet and Philippe Castagnone-Sereno (2014). Banning of methyl bromide for seed treatment: could Ditylenchus dipsaci again

become a major threat to alfalfa production in Europe ? Pest Management Science, 2014; 70: 1017–1022.

1.CONTEXTE

Ditylenchus dipsaci (photo 1) est un nématode très dommageable sur cultures de luzerne (photo 2), il se conserve sur semences (survie jusqu’à 20 ans). L’Union Européenne règlemente D. dipsaci sur semences de

luzerne (annexe IIA2 directive UE 2000/29) et jusqu’en 2010 imposait le traitement au bromure de méthyle pour le commerce des semences. Depuis l’interdiction de ce produit en 2010, la commercialisation de semences indemnes est devenue quasi impossible. Dans ce contexte, une Analyse de Risques Phytosanitaires

(ARP) a été initiée. Cette ARP est une expertise issue de collectifs d’experts, réalisée selon la norme NF X 50-110 (Anses, 2013). Elle comprend une évaluation du risque puis des propositions de gestion du risque phytosanitaire au niveau de l’UE.

2.EVALUATION DES RISQUES

3.GESTION DES RISQUES

4.CONCLUSIONS DE L’ARP

- Le risque lié à l’introduction de D. dipsaci sur semences de luzerne n’est pas acceptable.

- Aucune mesure de gestion ou combinaison de mesures ne permet de garantir une efficacité totale.

Bien que le parasite soit présent dans toute la zone ARP (UE), la commercialisation des semences est risquée car les solutions alternatives ne garantissent pas à 100% l’absence de nématodes.

Reclasser D. dipsaci comme « parasite non réglementé » est une stratégie risquée étant donnée la méconnaissance des seuils de nuisiblité et l’absence de bibliographie récente sur le sujet (Mouttet et al, 2014)

Photo 2: Dégâts au champ Photo 1: Ditylenchus dipsaci ♂

• largement répandu dans la zone ARP Distribution du parasite

• semences = filière d’entrée très probable

Probabilité d’entrée dans la zone ARP

• forte probabilité (climat et distribution de la plante hôte)

Probabilité d’établissement dans

cette zone

• dissémination probable à vitesse limitée (sans intervention humaine)

Probabilité de dissémination

• refus de lots de semences contaminées

conséquences économiques

• méconnaissance avérée des seuils de nuisibilité

• bibliographie des années 80 • absence d’études de génétique de population

Incertitudes

Utilisation de variétés à

haut niveau de résistance

Rotation, examen des parcelles en

culture, analyse des semences.

Traitements chimiques

Thermothérapie à la vapeur

chaude

Méthodes mécaniques (nettoyage

semences par brossage)

-Aucune méthode appliquée seule ne permet l’éradication des

nématodes, même l’utilisation de variétés résistantes, les lignées ne

sont pas pures.

-Les traitements chimiques et la thermothérapie ne sont pas

homologués.

-En cas de faible infestation, possibilité de ne pas détecter le nématode lors d’analyses sur

semences (sensibilité de la méthode < 100%).

Evaluation de ces

alternatives:

Alternatives:

Etude des infections récurrentes à virus influenza A en élevage porcin

Gaëlle Simon1, Séverine Hervé1, Eric Eveno2, Nicolas Barbier1, Florent Eono2, Virginie Dorenlor2, Mathieu Andraud2, Claire

Camsusou2, François Madec2, Nicolas Rose2

1Unité Virologie Immunologie Porcines, 2 Unité Epidémiologie et Bien-être Porcin, Laboratoire de Ploufragan-Plouzané

Contact du projet : Gaëlle SIMON, sera présent le : 26 novembre Anses, Laboratoire de Ploufragan-Plouzané, Unité VIP Zoopôle Les Croix, BP 53, 22440 Ploufragan 02.96.01.01.63 – [email protected] Partenaires du projet : DGAL, Comité Régional Porcin de Bretagne


OBJECTIFS

L’épidémiosurveillance des virus influenza porcins (VIP) et l’étude de leur dynamique ont révélé au cours des dernières années une augmentation apparente de phénomènes grippaux dits « récurrents », se traduisant par une persistance des virus en élevage et conduisant à des infections répétées sur toutes les bandes. Afin d’objectiver les facteurs favorisant ces formes épidémiologiques de la grippe en élevage porcin, un programme de recherche a été mené conjointement par les unités d’épidémiologie et de virologie porcines du Laboratoire de Ploufragan-Plouzané. Une étude longitudinale spécifique a ainsi été mise en place dans des élevages bretons sélectionnés.

MATERIEL ET METHODES

* 3 élevages (A,B,C) naisseur-engraisseurs, 3 bandes/élevage, 40 animaux/bande suivis individuellement (issus de 10 truies vaccinées Gripovac3® - différents rangs de portées) (360 porcs au total) * Suivi sérologique mensuel par tests IHA * Si syndrome grippal : > Sérologie IHA à J0 et J21 > Suivi clinique et virologique, quotidien de J0 à J5, 1 jour sur 2 de J8 à J14 : température rectale, observation, écouvillonnage nasal pour détection et sous-typage des VIP par RT-PCRs

MANIFESTATIONS CLINIQUES, RESULTATS VIROLOGIQUES ET SEROLOGIQUES

CONCLUSION

Des épisodes grippaux, confirmés par la détection de virus influenza A, ont été observés au moins une fois sur chacune des cohortes suivies. Ces épisodes surviennent à âge fixe, le plus souvent en post-sevrage, et sont corrélés à une augmentation des fréquences d’éternuements et de toux quinteuses. Des virus H1N1 ou H1N2 des lignages européens enzootiques et leurs réassortants ont successivement, et parfois simultanément, été identifiés en fonction des bandes étudiées, suggérant une co-circulation à l’échelle de l’élevage, de la bande, voire de l’individu, ce qui favorise les phénomènes de réassortiment entre virus. Une variabilité de dynamique d’infection (données non montrées) et de mise en place de la réponse immunitaire humorale ont été observées selon les élevages, ces deux éléments étant fortement conditionnés par la conduite des animaux, l’âge à l’infection et le niveau d’immunité maternelle. Pour plus de détails : Rose N. et al. (2013) Dynamics of influenza A virus infections in permanently infected pig farms: evidence of recurrent infections, circulation of several swine influenza viruses and reassortment events. Veterinary Research, 44, 72.


La Plateforme IdentyPath de l’Anses : une plateforme nationale d’identification et de typage des agents pathogènes basée sur le développement des approches de qPCR haut et moyen débits Fach Patrick, Delannoy Sabine, Woudstra Cédric

Zone logo

Contact du projet : Patrick, FACH sera présent le : 26/11/2014 Coordonnées complètes du contact : Tél: 0149772813 – Fax: 0149772695 –Email: [email protected] Partenaires du projet : les laboratoires de l’Anses


IDENTYPATH: PLATEFORME NATIONALE L’ANSES s’est engagée dans une démarche de transversalités et de mutualisation des compétences avec la création de la plateforme IdentyPath qui est une plateforme nationale d’identification et de typage des agents pathogènes basée sur la mutualisation et le développement des approches de qPCR haut et moyen débits.

AU CŒUR DES MISSIONS DE L’ANSES Ce projet de création de la PF IdentyPath est un projet d’importance pour l’Anses car il répond à la nécessité de développement d’outils de diagnostic rapides, sensibles et de large spectre pour la réalisation des missions de référence, d’expertise et de surveillance des laboratoires de l’Agence.

ENJEUX AU NIVEAU NATIONAL Le développement d’approches innovantes pour l’identification et la caractérisation des agents infectieux: développer des méthodes génomiques pour l’identification ou le typage (recherche de clone, caractère pathogène, antibiorésistance, etc) qui peuvent être construit selon une approche syndromique (pathologies respiratoires, neurologique, intestinales) ou par agents (par exemple E. coli pathogènes). La mise au point et la validation de nouvelles technologies: être en capacité de fournir, en cas d’urgence locale, nationale ou internationale, des méthodes innovantes de type "PCR on chip" pour caractériser rapidement et précisément des agents pathogènes avec possibilité de favoriser leur transfert à une échelle industrielle comme ce fut le cas avec E. coli O104:H4 où nous avons pu rapidement mettre à disposition une méthode de dépistage qui a été diffusée par le LRUE.

la détection des émergences à caractère zoonotique avant la contamination humaine: pouvoir être en mesure d’effectuer une comparaison fine de clones d’origine animale, alimentaire et humaine afin de mieux définir les notions de «souches épidémiques» et de «souches pathogènes» à risque pour l’homme ou pour l’animal.

BILAN SCIENTIFIQUE

Zone logo

- Projets européens (WP leader AniBioThreat), Programme NRBC, CoVetLab, …

- Grande visibilité de la PFT à l’extérieur de l’Anses (multiples partenariats)

- LNR associé botulisme aviaire (Nomination DGAL en Décembre 2011)

- Rôle déterminant dans la crise E. coli O104:H4 (Méthode de référence pour l’UE)

- Brevets EHEC 2012, 2013; Publications; Communications scientifiques …

- Formation,Training School_COST (accueil de stagiaires, PhD Texas Tech, ….)

- Workshop « High throughput » à FOOD MICRO 2014

Plateforme MALDI-TOF : organisation et activités Benoit Gassilloud

Contact du projet : Benoit GASSILLOUD sera présent le : 26 novembre 2014 LHN-ANSES, 40 rue Lionnois Nancy 54000 Tél: 03 83 38 87 25 Email : [email protected] Partenaires du projet : Référents des laboratoires présentés dans l’organigramme


PRÉSENTATION

Le spectromètre de masse de la plate-forme est un outil mutualisé à disposition de toutes les entités de l’Agence pour opérer des analyses qui s’inscrivent soit (i) dans le cadre de diagnostics ponctuels programmés ou en cas d’urgence soit (ii) dans le cadre de projets de recherches. Cette technologie peut être employée pour effectuer de l’identification de micro organismes; du sous-typage ou la détermination d’une activité métabolique (exemple antibiorésistance).

Deux questionnaires peuvent être utilisés selon qu’il s’agisse d’une sollicitation dans le cadre d’un projet ou dans le cadre d’une analyse en urgence Ces questionnaires sont disponibles sur l’espace collaboratif de la plateforme. Une fois renseignés, ils sont automatiquement transmis aux agents de la plate-forme, qui procèdent à l’examen de la recevabilité de la demande en relation avec le demandeur. Si la demande est recevable, la planification des analyses est opérée grâce au système de réservation en ligne. (Procédure générale ANSES/PR3/6/02)

SÉQUENCE ANALYTIQUE

ORGANISATION DE L'ACTIVITÉ

SOLLICITATION

Plate-forme nationale d’Analyses Statistiques (PAS) pour la détermination des performances des méthodes analytiques et des essais interlaboratoires Laurentie Michel

Contact du projet : Michel Laurentie sera présent le : 26 novembre 2014 10 B rue Claude Bourgelat, 35306 Fougères cedex 02 99 17 27 47, Fax : 02 99 94 78 80


CONTEXTE De par la nature de leurs missions de laboratoires de référence, les laboratoires de l’Anses sont amenés à mettre en œuvre des méthodes statistiques dans des contextes et avec des objectifs divers. Une plate-forme nationale « Analyses Statistiques » est créée, en appui aux laboratoires de l’Agence et permettant une référence dans le traitement des statistiques inférentielles pour la validation des méthodes analytiques et les traitements statistiques des essais inter-laboratoires. RÔLE ET MISSIONS Soutien (Méthodologique, Conseil, Aide à la décision) Former et informer sur les évolutions des statistiques appliquées dans les domaines des EILA et des validations

Expertiser et réaliser des audits des dossiers ou des analyses statistiques réalisées Apporter un soutien lors des audits d’accréditation des laboratoires : rôle de référent statistique national Assurer une veille scientifique, réglementaire et normative Coordonner, rédiger des guides et des documents de travail

FONCTIONNEMENT La plateforme PAS est une plateforme méthodologique qui dispose d’un espace collaboratif sur l’Intranet de l’Anses et une adresse contact. Un comité de pilotage se réunit une fois par an. Les demandes se font en utilisant la demande d’appui qui doit être envoyée à l’adresse [email protected] BILAN/CONCLUSION En 2013 le bilan montre des demandes d’appui (DA) essentiellement pour les EILAs. Ceci est lié au fait de la mise en place d’un guide d’aide au traitement statistique des données issues des EILAs

Le nombre de DA devrait augmenter en 2015 suite à l’édition d’un guide sur l’harmonisation des validation de méthodes analytiques incluant les approches statistiques.

Note d’organisation de la plateforme

PAS

PAS

∑=

=n

i ixnx1

1

2

1)(12 ∑

=−=

ni

xixnnσ

Former et informer Expertiser/réaliser des audits

∑=

=n

i ixnx1

1

2

1)(12 ∑

=−=

ni

xixnnσ

-3 -2 -1 0 1 2 3

1 représentant de la DSL 1 représentant de la DQ 4 scientifiques de l’Anses représentant des valences différentes : •1 scientifique méthodes biologiques •1 scientifique méthodes physico-chimiques •1 scientifique santé végétale •1 scientifique santé animale 1 membre expert extérieur spécialisé dans l’analyse statistique, issu d’un laboratoire de recherche le responsable de la plateforme

Formulaire d’Appui

Comité de Pilotage

Figure 2 : bilan par nature de la DA

Figure 3 : bilan des DA par laboratoire

Figure 1 : bilan par champs d’application


Plateforme d’imagerie cellulaire à haut contenu informatif (ASPIC)

Kevin HOGEVEEN, Toxicologie des Contaminants, ANSES Laboratoire de Fougères, 10 B rue Claude Bourgelat, 35306

Fougères

Zone logo Contact du projet : Kevin HOGEVEEN sera présent le : 26.11.2014 Coordonnées complètes du contact : Tél: 02 99 17 27 51 Fax: 02 99 94 78 80 Email : [email protected]


ABSTRACT Fin 2012, l’Anses s’est doté d’un Arrayscan VTi, un microscope à fluorescence automatisé. Cette technologie de pointe vise l’analyse multiplex de très nombreux paramètres de manière informatisée et leur quantification grâce à des logiciels de traitement d’images. Equipé d’un module cellules vivantes (régulation de la température, CO2 et humidité), l’Arrayscan VTI permet aussi d’effectuer des analyses cellulaires pendant des expériences de longue durée. Cet appareil offre des moyens d’imagerie et d’analyse multiparamétrique à haut contenu informatif (High Content Analysis) pour l’obtention de données quantitatives.

OBJECTIFS DE LA PLATEFORME -Développer des outils prédictifs de toxicologie conçus pour évaluer un éventail de fonctions cellulaires (cytotoxicité, génotoxicité, neurotoxicité, inflammation, stress oxydant, perturbations endocriniennes…). L’analyse à haut contenu est particulièrement adaptée pour étudier des effets combinés, des réponses obtenues pour de faibles doses en raison des capacités d’analyse fines ou bien encore pour des effets chroniques. -De mettre à disposition des scientifiques de l’établissement un outil d’analyse d’image à haut débit pour visualiser des marqueurs fluorescents.

EQUIPEMENTS

Lecteur ArrayScan VTi : - Banc optique Axio Observer Z1 (Zeiss) complètement automatisé.

- 5X, 10X, 10X (0.45) Plan Apochromat, 20X, 40X

- Plateau XY avec insert de plaques automatisé

- Light Engine : Source lumineuse d’excitation produit par des LED -Bleus [365(50)/535(45)] Hoechst , DAPI. -Verts [475(40)/535(45)] FITC, GFP, Alexa Fluor 488. -Oranges [535(35)/590(35)] TRITC, Cy3, Alexa Fluor 546 -Rouges profonds [575(25)/640(30)] Texas red, Alexa Fluor 594 -Rouges lointains [630(50)/695(55)] Cy5, DRAQ5, Alexa Fluor 647

- Lecteur de codes à barres automatisé pour la traçabilité des échantillons.

- Module chambre d’incubation contrôlant la température, le CO2 et l’humidité

pour les études cinétiques et les analyses en temps réel.

- Cellomics Store et HCS Explorer sur serveur Oracle

ANALYSES ET APPLICATIONS Génotoxicité: gH2AX, 53BP1, Comètes, Micronoyau Cytotoxicité: Caspase-3

Cycle cellulaire: Ki-67, pH3, intensité nucléaire Inflammation: NF-kB Stress oxydatif: Nrf-2, CellROX Xénobiotique : Translocation AhR Spot Detector : Détection et comptage de spots (récepteurs, bactéries..) Translocation : Translocation intracellulaire de cibles multiples. Neurotoxicité: Caractérisation des cellules neuronales Motilité cellulaire: motilité cellulaire et les distances parcourues pour chaque cellule Morphologie cellulaire: mesure de la taille, forme, distribution des cellules, et composants

subcellulaires.

PROJETS EN COURS NANoREG projet Européen Nanomatériaux

SOLNANOTOX projet ANR Nanomatériaux SOMEAT projet ANR contaminants alimentaires, multiexposition, chronique

CLIMPHYC projet de thèse ANSES phycotoxines, mélanges

GENOTOXAMINES projet de thèse amines aromatiques COMEBACk projet de thèse ANSES phycotoxines, mélanges

PUBLICATIONS DE LA PLATEFORME

Geiger M, Desanglois G, Hogeveen K, Fessard V, Leprêtre T, Mondeguer F, Guitton Y, Hervé F, Séchet V, Grovel O, Pouchus YF, Hess P. Cytotoxicity, fractionation and dereplication of extracts of the dinoflagellate Vulcanodinium rugosum, a producer of pinnatoxin G. Mar Drugs. 2013 Sep 2;11(9):3350-71.

Ferron PJ, Hogeveen K, Fessard V, Le Hegarat L. Comparative analysis of the cytotoxic effects of okadaic acid-group toxins on human intestinal cell lines. Mar Drugs. 2014 Aug 21;12(8):4616-34.

Huguet A, Hatton A, Villot R, Quenault H, Blanchard Y, Fessard V. Modulation of chromatin remodelling induced by the freshwater cyanotoxin cylindrospermopsin in human intestinal caco-2 cells. PLoS One. 2014 Jun 12;9(6)

Tarantini A, Lanceleur L, Mourot M, Lavault M-T, Jarry G, Hogeveen K, Fessard V. Toxicity,

genotoxicity and proinflammatory effects of amorphous nanosilica in the human intestinal Caco-2 cell line (submitted)

Ferron PJ, Hogeveen K, Desousa G, Rhamani R, Dubreil E, Fessard V, Le Hegarat L. In vitro

studies of the hepatotoxic effects of marine toxins in human HepaRG cells and focus on the role of CYP3A4. (submitted)


posters - ansesposters the effectiveness of oral vaccination (ov) campaigns in wildlife is usually...

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