pioneering off-gel methodology for protein quantification...
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Pioneering off-gel methodology for protein quantification using a dual channel (Cy3, Cy5)
Laser Induced Fluorescence detector and nanoESI-Qq-FT-ICR ECD-MS/MS
1 Chimie Organique et Macromoléculaire, UMR CNRS 8009, Protéomique, Modifications Post-traductionnelles et Glycobiologie, IFR 147, USTL, 59655
Villeneuve d'Ascq Cedex, France
2 Dionex, Voisins-le-Bretonneux, France
3 Picometrics, Toulouse, France
Caroline Tokarski,1 Claude Netter,2 Jocelyne Tahar,3 Christian Rolando1
Détection LIF double canal
2 détecteurs à fluorescence laser induite ensérie, équipés de filtres(Zetalif Evolution, Picometrics, Toulouse)
Séparation des protéines sur colonne Monolith PS-DVB d.i. 200 µm (Dionex)Séparation des peptides sur colonne PepMap C18 d.i. 75 µm (Dionex)
Développement d’un nouveau type de détecteur LIF, permettant une détectionsynchrone des deux colorants(Zetalif Discovery, Picometrics, Toulouse)
Décalage constant de l’échelle de temps entre les deux canaux, dû au capillaire de connexion entre les deux détecteurs (10 cm)
Zetalif Discovery
Sortie nano-colonne Détection dans le
capillaire
laser diode 532 nm optimisé pour la détection du Cy3laser Helium-Neon 633 nm optimisé pour la détection du Cy5
Montage colinéaire
Lentille sphérique
saphir
Photodiode proche du collimateur pour la mesureeffective de la puissance
du rayonnement laser
sensibilité et linéarité du détecteur LIF
1 attomole injectée détectée avec un bon rapport signal/bruit (estimation S/N= 13)
Cy3 dye from GE Healthcare
l’intensité de la fluorescence estlineaire sur 4 ordres de magnitude
=> Les 2 canaux ont un comportement similaire
=> la sensibilité du LIF esttrès supérieure à celle de la spectrométrie de masse (# deux ordres de grandeur)
Fluoprobes
Evaluation des colorants maleimide
GE HealthCare
Cy3 vs Cy5 : liaison ethyléniquesupplémentaire dans le colorant Cy5
Colorants Fluoprobes vs colorants GE Healthcare : un groupe CH2 en moins
détection nanoESI-Qq-FT-ICR MS en mode positif pour les deux
colorants en dépit de la présencedes groupes sulfonate
(détection peu sensible en mode négatif)
Détection LIF des colorants maleimide
Décalage en rétention dû à la séparation des colorants sur la
colonne chromatographique
100 fmol injected
Injections d’un mix Cy3 / Cy5
Emission du Cy3 sur le canal Cy5
Cross-labeling des tests et des contrôles par Cy3/Cy5 pour la validation et la quantification
Colorants et conditions de marquage
Paramètres usuels pour le marquage « à saturation » :
- Réduction des protéines : 0.4 nmol Tris-(2-carboxyethyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) par µg de protéineTampon Tris-HCl pH= 7.5, 1 h, 37°C - Marquage des protéines : 0.8 nmol de fluorophore par µg de protéine fraîchementdissout dans le DMF anhydre, 30 min , 37°C
Paramètres optimisés pour le marquage à saturation :
- Réduction des protéines : 0.8 nmol Tris-(2-carboxyethyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) par µg de protéineTampon Tris-HCl pH= 7.5, 4 h, 37°C- Marquage des protéines : 1.4 nmol de fluorophore par µg de protéine fraîchementdissout dans le DMF anhydre, 12 h, 37°C
Dessalage sur colonne de gel filtration (éliminatio n du fluorophore en excès):Evaluation des conditions d’élution (eau, ammonium bicarbonate 50 mM pH=7.0,
ammonium phosphate 50 mM pH=7.0, …)
Conditions d’élution optimisées: dessalage sur HiTrap (Sephadex G-25 Superfine, limite d’exclusion 5000), eau désionisée, 10 min
Evaluation: réduction des protéines / paramètres du marquage (quantité, durée …)+ pour peptides: étape de marquage avant ou après d igestion
Evaluation du marquage: analyse MALDI-TOF αααα-lactalbumine marquée par Cy3 / Cy5
α-lactalbumine marquée Cy3
# 8 Cy3
M+H+
m/z # 14 kDaM+2H+
2M+H+
# 8 Cy5
α-lactalbumine(100 fmol)
α-lactalbumine marquée Cy5
La protéine native n’est plus détectéeSeules les protéines marquées sont détectées
Détection en mode positif, en dépit des groupessulfonate présents dans les molécules de colorant
(importance de la matrice acide)
Evaluation du marquage pour 4 protéines:- Cytochrome C (# 12 kDa, 2 cystéines)- α-Lactalbumine (# 14 kDa, 8 cystéines)- Lysozyme (# 16 kDa, 9 cystéines)- Ovalbumine (# 42 kDa, 6 cystéines)
Evaluation du marquage: analyse MALDI-TOF digests αααα-lactalbumine marquée Cy3 / Cy5
Les 8 cystéines sont détectées avec l’incrément en masse correspondant aux tags Cy3 et Cy5
Aucune cystéine libre détectée, tous les peptides sont marqués Cy(MASCOT avec database SwissProt)
Quantification des peptides marqués en détection LIF
Digest α-lactalbumine marquée Cy3 et Cy5
100 fmol injected
100 fmol injected
Quantification des peptides avec le logiciel Chromeleon
Pourquoi les surfaces/hauteurs des pics de peptides issus d’uneprotéine unique sont-elles différentes?
Digest α-lactalbumin marquée Cy5
(100 fmol injectées)
Identification des peptides marqués détectés en LIF
GYGGVSLPEWVCTTFHTSGYDTQAIVQNNDSTEYGLFQINNK (36–77)+ 1 Cy5, GRAVY: -0.495
ALCSEKLDQWLCEK (128 - 141) + 2 Cy5GRAVY: -0.379
paramètre d’hydrophobicité GRAVY indiqué pour le peptide non marqué
Digest α-lactalbumine marquée Cy5
(100 fmol injectées)
Identification des peptides marqués détectés en LIF
CEVFR (25–29) + 1 Cy5GRAVY: 0.300
GYGGVSLPEWVCTTFHTSGYDTQAIVQNNDSTEYGLFQINNK (36–77)+ 1 Cy5, GRAVY: -0.495
FLDDDLTDDIMCVK (99-112 ) + 1 Cy5GRAVY: 0.100
ALCSEKLDQWLCEK (128 - 141) + 2 Cy5GRAVY: -0.379
IWCK (78-81) + 1 Cy5GRAVY: 0.550
LDQWLCEK (134–141) + 1 Cy5GRAVY: -0.650
IWCKDDQNPHSSNICNISCDK + 3 Cy5ou
DDQNPHSSNICNISCDKFLDDDLTDDIMCVK+ 3 Cy5 (1clivage manqué)
(candidats potentiels)
CEVFRELKDLK (25-35) + 1 Cy5, GRAVY: -0.518
DLKGYGGVSLPEWVCTTFHTSGYDTQAIVQNNDSTEYGLFQINNK (33–77) + 1 Cy5GRAVY: -0.542
DDQNPHSSNICNISCDK (82-98) + 2 Cy5, GRAVY: -1.271
L’aire du pic dépend du nombre de cystéines marquées dans la séquence
paramètre d’hydrophobicité GRAVY indiqué pour le peptide non marqué
Analyse On-line des peptides marqués: spectre MS/MS identification d’un peptide marqué avec 2 fluorophor es
y32++Cy3
A L Ccy3 S E K L D Q W L Ccy3 E Ky3
2+ +Cy3
y42++Cy3
y42+ +Cy3
y52++Cy3
y52+ +Cy3
y62++Cy3
y72++Cy3
y62+ +Cy3
y72+ +Cy3
y82++Cy3
y82+ +Cy3
y92+
+Cy3
y92+ +Cy3
y112++Cy3
y112+ +Cy3
y32+ +Cy3
y3++Cy3
y4++Cy3
y42+ +Cy3
y5++Cy3
y52+ +Cy3
b82+ +Cy3
b82++Cy3
b92+ +Cy3
b92++Cy3
b102++Cy3
b102+ +Cy3
b112+
+Cy3
b112+ +Cy3
b32+ +Cy3
b3++Cy3
b5++Cy3
b52+ +Cy3
b6++Cy3
b62+ +Cy3
b7++Cy3
b72+ +Cy3
b8++Cy3
b82+ +Cy3
*
* fluorophore avec un résidu sulfure provenant de la cystéine
spectre MS/MS montrant les ions b et y
avec tag Cy3
les cystéines marquéessont stables dans les
conditions CID MS/MS
Analyse On-line des peptides marqués
le process d’élimination à partir du peptide marqué conduit à un ion
monochargé * spécifique (observésur spectres resultant des ions
M+2H+, M+3H+…)
*
*
F L D D D L T D D I M Ccy3 V K Ky12
2++Cy3
y102+ +Cy3
y52+ +Cy3
y62+ +Cy3
y72+ +Cy3
y82+ +Cy3
y92+ +Cy3
y112++Cy3
y42+ +Cy3
y42+ +Cy5
y52+ +Cy3
F L D D D L T D D I M Ccy5 V K K
y42++Cy5
y52+
+Cy5 y52+ +Cy5
y62++Cy5
y62+ +Cy5
y72+
+Cy5
y72+ +Cy5
y82++Cy5
y82+ +Cy5
y92++Cy5
y92+ +Cy5
y102++Cy5
y102++Cy5
y112+ +Cy5
y112++Cy5
y122++Cy5
y132++Cy5
y122++Cy5
y132+ +Cy5
y4++Cy5
y4+ +Cy5
y42+ +Cy3
y42+
+Cy3
y52++Cy3
y62++Cy3 y7
2++Cy3y8
2+
+Cy3
y92++Cy3
y102++Cy3y11
2++Cy3
y122++Cy3
y132++Cy3
y132++Cy3
y4++Cy3 y5
++Cy3
Détection spécifiquedes peptides marqués:
Extraction des chromatogrammes
correspondant aux signaux contenantl’ion spécifique *
m/z 773.2343 / 799.2516
pour les peptides marquésrespectivement avec Fluoprobes Cy3 / Cy5
m/z 787.2499 */ 813.2672 *
pour les peptides marquésrespectivement avec
GE Healthcare Cy3 */ Cy5 *
Analyse On-line des peptides marqués
Proportions injectées:Digest α-lactalbumine
marquée avec Cy3/Cy5 : 1/2
*
*
Identification des peptides marqués du mélange d’ α-lactalbuminemarquée Cy3- and Cy5- (logiciel MASCOT, database SwissProt)
les peptides marqués avec 1 ou 2 Cy sont identifiés
Quantification des protéines marquées en détection LIF
α-Lactalbumine marquée Cy3 et Cy5
5 fmol injected
la quantification est facilitée du fait qu’un pic représente une protéine
Possibilité d’analyse de mélanges biologiques complexes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time [min]0
1
2
3
6x10Intens.
EIC 1161.9±0.25 +All MS
884.6575
929.7042
956.5961
997.1275
1032.8932 1076.2994
1130.0473
1161.8829
1196.35681229.7753
1283.7066
1327.7272
+MS, 10.1-10.3min #(165-169)
0
2
4
6
5x10Intens.
800 900 1000 1100 1200 1300 m/z
+MS, 10.1-10.3min #(165-169), Deconvoluted (maximum entropy)
0
2
4
6
5x10Intens.
13000 14000 15000 16000 17000 18000 19000 m/z
Quantification des protéines marquées en détection LIF
All the cysteins are labeled
TIC of α-lactalbuminSaturation labeling with Cy3
MS spectrum
Deconvoluted spectrum
1301.28044
1338.12848
1431.61123
1471.64005
1590.35317
1634.823671789.01884
1839.420621884.22112
2044.46471
+MS, 0.9-4.6min #(5-17)
0.0
0.5
1.0
1.5
5x10Intens.
1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z
1195.91999
1306.00754
1386.51936
1436.31013
1476.74164
1596.01462
1640.59600
1685.073081795.13851
1847.185751890.19451
+MS, 5.5-14.0min #(20-48)
0
1
2
3
4
5
4x10Intens.
1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 m/z
α-Lactalbuminemarquée Cy3
Pic detecté : 14824.4338
10+ ion
1486.45107
0.5
1.0
1.5
2.0
4x10Intens.
1486
10+ion
1651.17141
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.04x10
Intens.
1652
9+ion
Déconvolutionprotéine:
14850.4106
14850.41061Mr (h)
0
1
2
3
4
5
4x10Intens.
14860
Analyse On-line des protéines marquées Cy3 et Cy5
Détermination de la masse moléculaire précise de la protéine avec 1 Cy-
v
α-Lactalbuminemarquée Cy5
1483.44338
1483.532281483.64330
+MS, 5.5-14.0min #(20-48)
0.4
0.6
0.8
1.0
4x10Intens.
1483.4 1483.5 1483.6 1483.7 1483.8 1483.9 m/z
Optimisation des paramètres du mode ECD : diminution du courant cathodique de façon à éviter l’échauffement de la cellule ICR, et augmentation de l’electronemission gate
On-line Electron Capture Dissociation
Diminution courant cathode => 1.5 AAugmentation electron emission time => pulse: 0.01 sSelection Ion => ici par exemple m/z = 941.7263
941.72632
1020.28715
1112.94849
1157.58799
1224.04117
1376.68904
1412.52450
+MS2(941.79999), 23.3-29.3min #(207-261)
0
1
2
3
4
5
4x10
900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z
13+12+ 11+
10+
9+
spectre ECD
Zoom 1 Zoom 2
Cytochrome C10 pmol injectées
On-line Electron Capture Dissociation
1128.88976
1142.03849
1157.58799
1179.59257
1186.584001210.73670
1219.63994
+MS2(941.79999), 23.3-29.3min #(207-261)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
4x10
1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 m/z
c104
10+
c10110+
z697+.
z919+.z39
4+.
c103
10+
z616+.
c93
9+
z838+.
z10410+.
z828+.
z949+.
z848+.
c848+
c959+ z95
9+.
z858+.
c96
9+
c555+
z747+. c76
7+
z767+. c67
6+
z989+.
1246.82620
1261.48426 1284.675081295.65537
1308.82207 1323.81302
1336.00506
1360.34900
+MS2(941.79999), 23.3-29.3min #(207-261)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4x10
1240 1260 1280 1300 1320 1340 1360 m/z
c898+
z1009+.
z787+.
c1019+
c1029+
c595+ z56
5+.c48
4+
z817+.
z938+.
z696+.
c837+
c726+
c847+c96
8+
c978+
z978+.
z595+.
c877+
z988+.
Zoom 2
Zoom 1
Conclusion
Résumé :Nouvelle méthode off-gel très sensible, combinant quantification et identification des protéinesConditions de marquage optimiséesDétection spécifique des peptides / protéines marquéesLinéaire sur 4 ordres de grandeurOptimisation top down on line en mode ECDCompatible avec les logiciels MS (Mascot etc)
Perspectives :Poursuite de l’évaluation du protocoleTests sur échantillon réels (protéines extraites de plasma humain, par ex. analyse différentielle de l’Apolipoprotéine A)