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PROGRAMA DOCENTE DE INVESTIGACIÓN DE LA LICENCIATURA EN:

BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

TÍTULO DEL TRABAJO: PRESENCIA DEL POLIMORFISMO T/C EN EL INTRÓN 2

DEL GEN CYP46 Y FRECUENCIA ALÉLICA DE APOE EN PACIENTES CON ENFERMEDAD ALZHEIMER TIPO

ESPORÁDICO EN MÉXICO.

Presenta: MARLENE E. MAURY ROSILLO

Asesor Interno:Dra. Adriana Morales Otal.

Asesor ExternoDra. Victoria Campos Peña.

Lugar de realización:

Hospital General de México.

Universidad Autónoma Metropolitana. Iztapalapa. División de Ciencias Biológicas y de la Salud.

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A mi ídolo número 1

Ernestina, quien además de darme la vida, hizo todo lo posible por

sacarnos adelante a mis hermanas y a mi, por enseñarme todo lo maravilloso que nos puede dar la vida y fomentar en mi

la esperanza, la fe, la sonrisa eterna y las demás actitudes y virtudes que me distinguen.

Para mis dos hermanas Miriam y Melba, dos de los pilares más importantes en mi vida, sobre todo en estos últimos 5 años, y les agradezco todo el apoyo que me han dado durante toda mi carrera en la UAM.

Edgar, muchas gracias por tu compañía y apoyo durante mas de 9 años.

También quiero dedicar este trabajo a la persona que confió en mí para formar parte de su equipo de trabajo, gracias por todo tu apoyo Vicky.




AGRADECIMIENTOS

UNAM: SDEI.PTID.05.5

Macroproyecto: Nuevas estrategias genómicas y proteómicas en salud

pública.

CONACYT: 2004-COI-129

HOSPITAL GENERAL DE MÉXICO

Dra. Susana Kofman E.

Dra. Victoria Campos P.

A todo el personal del laboratorio de genética.

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA. IZTAPALAPA

Dra. Adriana Morales O.

A todos mis profesores y compañeros de la UAM-I en especial a Adri y Eli.




ÍNDICE

Pag. INTRODUCCIÓN

Aspectos generales de la enfermedad de Alzheimer. 2 Características de la EA. 3 Genética de la EA. 6

• EA Tipo Familiar. 6 • EA Tipo Esporádica. 7

Ø CYP46. 8 Ø APOE. 10

ANTECEDENTES 12 JUSTIFICACIÓN 15 HIPÓTESIS 17 OBJETIVOS

Objetivo General. 20 Objetivos Particulares. 21

METODOLOGÍA

Extracción de ADN. 23 Análisis de CYP46. 24 Análisis de APOE. 27

RESULTADOS 29

CYP46. 31 APOE. 36 Correlación entre CYP46 y APOE. 39

DISCUSIÓN 42 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



ASPECTOS GENERALES DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

El descubridor de la Enfermedad de Alzheimer (EA) fue el neurólogo alemán Alois Alzheimer (1864-1915), quien dió a conocer el primer reporte en el año 1906 de una paciente de 51 años llamada Auguste D. Alzheimer mediante el uso de la técnica de tinción de plata, observó bajo el microscopio, el cerebro de su paciente y describió las alteraciones cerebrales características de la enfermedad; placas neuríticas y marañas neurofibrilares.2

La EA es la causa más frecuente de demencia, se considera que

ocupa del 50 al 75% del total de enfermedades demenciales. El índice de probabilidad de padecer esta enfermedad antes de los 65 años es de sólo un 0.1%, mientras que entre los 65 y 75 años dicho índice es cercano al 1% y se acentúa exponencialmente en personas mayores de 85 años de edad. 1 y 2

Demográficamente el siglo XX fue una etapa de crecimiento y de transición demográfica dando lugar al envejecimiento de la población.22 En México el aumento de personas por arriba de 60 años ha aumentado dramáticamente, y se proyecta que a mediados del presente siglo, la esperanza de vida en hombres alcanzará 82.1 años y en las mujeres llegará a 85.6 años. Esto implica que en un periodo de 75 años (1950-2025), la población mayor de 60 años se incrementará en un 1.346%, de tal manera que para el año 2025 México tendrá una población de 17.5 millones de personas mayores de 65 años.8 y 25 Las transiciones sociales, demográficas y económicas que ha experimentado nuestro país en las últimas décadas, han propiciado que un mayor número de personas llegue a la tercera edad. Particularmente a los avances registrados por la medicina se ha incrementado sustancialmente la esperanza de vida al nacer, y con ello el riesgo del deterioro intelectual durante la senectud; convirtiendo el envejecimiento en un desafío que obliga a replantear la organización y requerimientos de los servicios de salud para su atención, a fin de poder satisfacer la futura demanda.24

La EA se ha convertido en uno de los problemas prioritarios de salud

a nivel internacional8 y en este proceso, en México no existen estudios que PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



Se estima que 4.5 millones de personas en los Estados Unidos y 18 millones de personas en el mundo están afectadas por la EA. Por sus especiales características, la EA presenta unos costes indirectos e intangibles que, hacen de la enfermedad; un problema sanitario, familiar y social de repercusiones muy elevadas. Según diferentes estudios publicados en Europa, el coste anual por enfermo de Alzheimer podría rondar entre los 15,000 y 25,000 euros.18

Después de 100 años del descubrimiento de la enfermedad, aún en la

actualidad no se tiene ningún tratamiento efectivo para poder curar la EA, sobre todo por que no se sabe el por qué de la formación de las placas neuríticas y las marañas neurofibrilares.

CARACTERÍSTICAS DE LA EA

El factor de riesgo más importante de la EA es la edad (la prevalecía

de la enfermedad se duplica cada 5 años después de los 65 años)2; otros factores que influencían en su desarrollo son la historia familiar, el género, mutaciones genéticas y otras variables no genéticas como la educación, una dieta rica en grasas, una vida sedentaria o lesiones cerebrales, entre otras.1

La EA, es una enfermedad progresiva y degenerativa del Sistema

Nervioso Central (SNC) que disminuye las funciones intelectuales hasta interferir en la capacidad del individuo para realizar cualquiera de sus actividades diarias.45 La EA conlleva a un declive cognoscitivo global, el cual impide desarrollar múltiples funciones cerebrales como son: la memoria, el pensamiento, la comprensión, el cálculo, el aprendizaje, el lenguaje y el juicio entre otras. Las áreas del cerebro que se encuentran afectadas son los lóbulos Frontales, Temporales, Parietales y la Corteza Cerebral (Figura 1).y 30

El hipocampo es una de las primeras estructuras dañadas, lo que produce pérdida de memoria y desorientación ocasionando algunos de los PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



la corteza cerebral la cual activa, regula e integra las reacciones relacionadas con las emociones (Figura 1).1 y 30

En pacientes con EA se observa una reducción de las regiones

cerebrales involucradas en el aprendizaje y memoria que está correlacionada con un gran descenso en el metabolismo energético celular; además de la reducción en la masa celular, también se observa una disminución en su actividad debido al metabolismo dañado y homeostasis perturbada de las neuronas (Figura 2).30

Figura 1: Esquema que muestra las áreas principalmente da-ñadas por la EA como los Lóbulos Parietales, Frontales y Temporales, la corteza cerebral, el hipocampo (color verde) y la amígdala (color rojo).

Lóbulo Temporal

Lóbulo Frontal

Lóbulo Parietal

Amígdala

Corteza

Hipocampo

Figura 2: Esquema que muestra a la izquierda un cerebro de una persona sana y a la derecha la de una persona con EA avanzada. a) Disección donde se puede compara la masa cerebral y la disminución de los surcos cerebrales en una persona con EA. b) Tomografía de Emición de Positrones (PET) donde se puede ver la disminución de la actividad cerebral en un paciente con EA. En rojo y amarillo se observa la alta PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



Clínicamente el inicio de la enfermedad se caracteriza por una disminución en la percepción espacial, así como desorientación en tiempo y espacio, posteriormente se presentan problemas de afasia (supresión del lenguaje), apraxia (imposibilidad motora) y agnosia (deterioro de la memoria). En las etapas tardías se presenta un aumento en el tono muscular, desinhibición emocional notable y el hundimiento de su personalidad normal. Otros datos clínicos comunes son la perdida del control de esfínteres, disminución de peso y, finalmente, el paciente termina en estado vegetativo, producido por la severa descortificación cerebral.11

Neuropatológicamente la EA se caracteriza por la formación de dos

estructuras: las placas neuríticas extracelulares (Figura 3), constituidas principalmente por el péptido ß-Amiloide (ßA), y las marañas neurofibrilaresintracelulares (Figura 4), compuestas por la proteína tau.13, 16, 30, 38, 39 y 44

El péptido ßA se deriva de una proteína transmembranar llamada

proteína precursora de amiloide (APP); normalmente APP es cortada por proteasas conocidas como α-, β- y γ- secretasas.13 Dependiendo del sitio de corte de γ-secretasa, se origina un péptido corto de 40 aminoácidos (ßA40) o uno largo de 42/43 aminoácidos (ßA42/43). ßA40 puede circular extracelularmente y se ha visto que tiene propiedades antioxidantes, mientras que ßA42/43 es insoluble, se puede acumular formando depósitos y producir las placas neuríticas.16

Uno de los cambios iniciales en EA consiste en los depósitos

neuronales de tau.39 Tau es una proteína asociada a microtúbulos que estabiliza el citoesqueleto de las neuronas, participa en el transporte vesicular

Figura 3: Esquema que muestra un corte cerebral de un paciente con EA. Mediante la técnica de tinción en plata se puede observar la acumulación del péptido ßA en la parte exterior de las neuronas.




disociación a microtúbulos y la subsecuente desestabilización del transporte neuronal.6

La acumulación del péptido ßA y de la proteína Tau interfieren en la

actividad neuronal, impidiendo su correcto funcionamiento e interfiriendo en la sinapsis.30 La deficiente eliminación de ßA42/43 y de tau hiperfosforilada probablemente se debe a su generación altamente desproporcionada, resultando en una incontrolable formación de placas y marañas neurofibrilares, lo que a su vez provoca deterioro en las neuronas y finalmente su muerte.31

GENÉTICA DE LA EA

La EA se divide principalmente en 2 (Figura 5): Ø EA tipo familiar. Ø EA tipo esporádica.

EA TIPO FAMILIAR

Marañas neurofibrilares

Placa neurítica

Figura 4: Esquema que muestra un corte cerebral de un paciente con EA. Técnica de tinción en plata. Se puede observar la formación de las marañas neurofibrilares dentro de las células. En el exterior de las células se puede ver una placa neurítica.




desarrolla muy rápidamente, siendo el promedio de vida después de que empieza la enfermedad de 2 a 5 años. 1

Se ha descrito la presencia de mutaciones en ciertos genes asociados

con el progreso de la EA tipo familiar segregándose de manera autosómica dominante.30 Estas mutaciones se encuentran en los genes que codifican para la Proteína Precursora de Amiloide (APP), Presenilina 1 (PS1) y Presenilina 2 (PS2), localizados en los cromosomas 21, 14 y 1 respectivamente. Mutaciones en APP, PS1 y PS2 se ha visto que promueven la acumulación de ßA.3 y 4

EA TIPO ESPORÁDICA

La EA tipo esporádica se manifiesta mayoritariamente después de 75 años de edad, el deterioro cerebral es más lento y, al igual que en los casos familiares, hay lesiones en los lóbulos temporales y parietales. Sin embargo

Figura 5: Diagrama que indica cómo se divide la Enfermedad de Alzheimer y algunas de sus características.




A pesar de que en la EA de tipo Esporádico no se a relacionado directamente con mutaciones, algunos estudios sugieren que SNPs(Polimorfismos de Un Solo Nucleótido, por sus siglas en ingles) en ciertos genes como APOE,26 APOM,28 BACE,32 CYP46,7 IDE5 y NEP19 entre otros, pueden estar relacionados en el desarrollo de la patología actuando de forma sinérgica junto con agentes exógenos.3

En este trabajo de investigación estudiamos el polimorfismo (T/C) del intrón 2 del gen CYP46 y la frecuencia alélica de APOE. Ø CYP46

El gen CYP46 se encuentra localizado en el cromosoma 14q32.1,

codifica a la enzima 24S-Hidroxilasa Colesterol (24S-OH-Col),15 forma parte de la familia 46 del citocromo P450 e interviene en el metabolismo del colesterol en el cerebro.45

La 24S-OH-Col está localizada en la membrana de las neuronas;7 en

humanos esta enzima se encuentra exclusivamente dentro del cerebro, especialmente en la materia gris.33 y 45 Hibridación in situ del RNAm en cerebros de ratones, muestran que altos niveles de 24-hidroxilasa puede ser detectada en neuronas de la corteza cerebral, hipocampo, girus dentado y tálamo; sugiriendo que 24S-OH-Col se expresa en estructuras cerebrales que son afectadas en EA.33 Estudios inmuno-citoquímicos muestran que 24SOH-Col se expresa en algunos astrositos en cerebros normales, mientras que cerebros con EA muestran una expresión prominente en astrositos y alrededor de las placas amiloides.10

En EA la cantidad de CYP46 presente en las células neuronales

decrece, pero este decremento es en parte compensado por una inducción de la enzima en las células gliares. Un decremento en la concentración de colesterol en el cerebro puede disminuir la agregación de ßA, y se ha observado que la sobre-regulación de CYP46 en células gliares puede PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



El colesterol es el mayor componente lipídico de las membranas plasmáticas eucarióticas, les proporciona flexibilidad y estabilidad; es el precursor de la biosíntesis de ácidos biliares, así como hormonas adrenales, pituitarias y sexuales.36 El colesterol compone el 22% de la materia gris, 27.5% de la materia blanca y 27.7% de mielina en el SNC.42 La cantidad de colesterol en el cerebro es mucho más alta que en cualquier parte del cuerpo: posee el 2% del total de su peso corporal y el cerebro tiene la cuarta parte del colesterol total presente en un individuo.27

La conversión de lanosterol a 7-hidrocolesterol es la ruta mas usada

en oligodendrocitos para la biosíntesis del colesterol. Otra ruta es de lanosterol a desmosterol y finalmente colesterol.42

Altos niveles de colesterol libre han sido detectados en neuronas que

presentan marañas comparadas con marañas libres en neuronas normales, sugiriendo que el colesterol puede estar envuelto en la formación de marañas neurofibrilares.15 La acumulación de colesterol en cerebro promueve el corte de la proteína precursora de β-amiloide (APP) con la subsecuente aceleración de la degeneración neuronal. 32

El colesterol como es de síntesis local necesita ser eliminado; el

colesterol procedente de las neuronas lesionadas o muertas se convierte (por la acción de la 24-hidroxilasa o CYP46) a 24S-hidroxicolesterol, que luego es transferido a través de la barrera hematoencefálica y transportado al hígado por las lipoproteínas de baja densidad (LDL), siendo a continuación excretado en forma de ácidos biliares.32 La mayor parte del 24Shidroxicolesterol procede del colesterol cerebral, por lo que sus niveles son un reflejo del catabolismo cerebral del colesterol. Altos niveles de 24Shidroxicolesterol en la circulación puede causar neurodegeneración por desmielinización.7 Recientemente se reportó 24S-hidroxicolesterol como una potente neurotoxina in vitro y se ha visto que el aumento de este componente en líquido cefalo-raquídeo promueve la muerte neuronal.29

Se ha demostrado que el nivel de 24S-hidroxicolesterol en plasma es

elevado en la enfermedad de Alzheimer. La neurodegeneración de los PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



CYP46 es un gen candidato de riesgo para padecer EA. En un caso control se estudiaron 2 muestras independientes recolectadas en Zurich, Suiza y en el Sur de Europa, se reportó que una variación genética de CYP46 influye en la carga de β-amiloide en cerebro, niveles en líquido cefaloraquídeo de βA42, tau fosforilada y el riesgo genético de padecer EA tipo esporádico.43

Alteraciones de 24-hidroxilasa colesterol pueden modular las

concentraciones de colesterol en neuronas vulnerables, por lo tanto guiando a una composición alterada de la membrana y cambios asociados en el procesamiento de la proteína precursora de amiloide y la producción de βA.34

El polimorfismo (T/C) en el intrón 2 de CYP46 está asociado con un incremento en la prevalecía de EA tipo esporádico; este polimorfismo se encuentra entre los exones 2 y 3. Los intrones son regiones de DNA que no codifican para proteínas y probablemente regulan la expresión o el splicing alternativo del producto génico.45 Ø APOE

El gen de APOE está ubicado en el cromosoma 19q13.31, codifica la Apoliproteina E (34-kDa), la cual es muy importante para la homeostasis neuronal porque interviene en la sobrevivencia, regeneración y estabilidad microtubular; por lo tanto se le considera como un neuroprotector.34 Es sintetizado por una gran variedad de tejidos y posee la habilidad de interactuar con dos receptores hepáticos: los receptores LDL (lipoproteínas de baja densidad) y los receptores apoE.21

APOE se sintetiza en las células del encéfalo, bazo, pulmón, las

suprarrenales, ovario y riñón, así como en el hígado.17 En el cerebro es derivado de síntesis local, principalmente por las células gliares.36

Las neuronas pueden producir endógenamente colesterol o pueden

reciclar el colesterol existente por medio de APOE, ya que APOE transporta el colesterol a través de la barrera hemato-encefálica.33 y 45




Uno de los genes asociados con EA tipo Esporádico ha sido la

apoliproteína E (APOE) ε4 ya que se ha demostrado que Apoε2, ε3, pero no ε4, protegen a las neuronas contra la degeneración o muerte celular y son mas eficientes en le transporte del colesterol.7 Se ha demostrado que las placas amiloides contienen apolipoproteína E, en pacientes con EA.42

El alelo ε4 de APOE incrementa el riesgo de padecer EA tipo

Esporádico de un 40% a un 50%, aunque hay que mencionar que esta variación genética por sí sola no es suficente para predisponer al desarrollo de la enfermedad.36

Existe una interacción mutua de CYP46 con APOE4 en el riesgo de

padecer EA. CYP46(T/C) y Apoε4 están relacionados en la distribución de colesterol y además están asociados con altos niveles de βA42 y tau hiperfosfolidada en el cerebro.45

En conclusión, existe una relación entre el polimorfismo T/C del

intrón 2 de CYP46 con APOE4 en el riesgo de padecer EA. Por la tanto,

Figura 6: Diagrama que muestra las diferencias entre las tres isoformas de APOE.




Está bien establecido que la EA tipo esporádica es una enfermedad poligénica, donde varios polimorfismo genéticos están relacionados como moduladores de la susceptibilidad a padecer este tipo de enfermedad. Algunos genes propuestos son los que codifican para proteínas que están envueltos en la homeostasis lipídica, de este modo sugieren que el colesterol posee un papel muy importante en la patogénesis de la EA.9 Durante la última década diversos estudios han demostrado que en plasma, el nivel de 24S-hidroxicolesterol (metabolito por medio del cual el colesterol puede ser transportado a través de la barrera hemato-encefálica para su posterior eliminación) es más elevado en etapas tempranas en líquido céfalo-raquídeo y suero en pacientes con EA comparados con individuos controles.7, 15, 29 y 33 Existe gran evidencia experimental de que los niveles de colesterol elevados pueden incrementar la producción βA, posiblemente modulando las actividades de α-, β- y γ- secretasa en el proceso endoproteolítico de la proteína precursora de amiloide (PPA).34 Por lo tanto alteraciones de la enzima 24S-hidroxilasa colesterol provoca una deficiente eliminación del colesterol cerebral, lo que promueve una composición alterada de la membrana y cambios asociados en el procesamiento de la proteína precursora de amiloide, en la producción de βA y la hiperfosforilación de TAU en el cerebro.12 y 34

Recientemente se reportó que un polimorfismo, T/C (sustitución de Citosina por Timina) del intrón 2 del gen CYP46, el gen que codifica a la enzima 24-hidroxilasa colesterol, está asociado con el riesgo de padecer la EA,38 ya que la variación es intrónica, no está claro cómo influencia la función de la respectiva enzima correspondiente.20 Algunos estudios sugieren que esta variación resulta en una eliminación ineficiente del colesterol cerebral.29 y 34 Diferentes estudios han demostrado que el polimorfismo (T/C) del intrón 2 del gen CYP46 y la frecuencia alélica de APOE-ε4 predispone al padecimiento de la EA tipo esporádico, aunque por sí solo éste no se considera un factor de riesgo.11, 13, 16, 39 y 46 La alta deficiencia de APOE-ε4 para transportar al colesterol a través de la barrera hemato-encefálica genera PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



De acuerdo con Wang et.al, 2004, la frecuencia del alelo T de CYP46 y el genotipo TT junto con una frecuencia alélica de APOE-ε4 fueron significativamente más altas en pacientes con EA comparados con los controles, lo que sugiere que esta susceptibilidad polimórfica puede diferir en grupos étnicos heterogéneos.17, 23, 27, 42 y 43 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



En la actualidad existen en México más de 7,000,000 individuos mayores de 60 años y se espera que para mediados del siglo XXI (~2050), se tenga una esperanza de vida al nacer de 82.1 años para hombres y 85.6 años para mujeres, aumentando de este modo el riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer; ya que como se sabe, existe una correlación directa entre edades avanzadas y enfermedades crónicas, degenerativas y condiciones de incapacidad.18

En México no existe un estudio epidemiológico que permita

determinar la incidencia y prevalecía de la enfermedad.18 El mejoramiento de las condiciones generales de vida y el mayor acceso a los servicios de salud han provocado un descenso en las tasas de mortalidad por enfermedades infecciosas y un ascenso marcado de las enfermedades crónicas, siendo estas últimas las que de manera natural, afectan más a los ancianos. El incremento actual y futuro de la población anciana obliga a replantear la organización de los servicios de salud debido a que en el presente no existen centros de diagnóstico, prevención y atención que permitan a los individuos recibir un manejo adecuado.8

Es muy importante hacer un diagnóstico preciso y precoz de la EA, y

en cuanto antes se haga éste y se inicie el tratamiento, mejor será la preservación de las capacidades cognitivas.2 Aunque en la actualidad la veracidad en la que se diagnostica clínicamente la EA es cerca o mas del 90% en centros académicos internacionales.3 Mientras que en nuestro país no se cuenta con este tipo de diagnóstico, y debido a que la EA de tipo esporádico representa la mayoría de los casos, es muy importante el conocer los factores de riesgo que pudieran estar relacionados con el desarrollo de la patología; la identificación de los factores genéticos pueden tener una gran implicación clínica para futuros diagnósticos y tratamientos personalizados.35




La presencia del polimorfismo (T/C) del intrón 2 de CYP46 y el alelo

ε4 de APOE están relacionados con la presencia de la Enfermedad de

Alzhemer tipo esporádico, por lo tanto estas variaciones genéticas se

encuentran en la mayoría de los pacientes con la EA tipo esporádico,

mientras que en los controles se encuentran en menor proporción.




OBJETIVO GENERAL

Determinar la presencia del polimorfismo T/C en el intrón 2 del gen

CYP46 y la frecuencia alélica de APOE en pacientes con la Enfermedad de

Alzheimer tipo esporádico e individuos control en el Hospital General de

México.




OBJETIVOS PARTICULARES

Estandarizar mediante la técnica de PCR la amplificación del intrón

2 de CYP46 y APOE.

Analizar si en los pacientes que presentan EA de tipo esporádico e

individuos control se encuentra la presencia del polimorfismo T/C del intrón

2 de CYP46 y la frecuencia alélica de APOE mediante un análisis por

restricción.

Hacer un análisis de correlación entre la presencia del polimorfismo

de CYP46 y la frecuencia alélica de APOE en los pacientes con EA tipo

esporádico e individuos control.




EXTRACCIÓN DE ADN Se tomaron muestras de sangre periférica (1-3ml) de 15 individuos controles y de 19 pacientes con EA en el Hospital General de México para poder hacer la purificación del ADN. La purificación se hizo por medio de un kit de purificación de ADN genómico VERSAGENETM de GENTRA.

La sangre extraída se colocó en tubos de 15 ml, se adicionaron 3 volúmenes (1:3) de la solución de lisis para eritrocitos, se incubaron los tubos durante 10 min (minutos) a temperatura ambiente, después se centrifugaron los tubos a 2500 rpm (revoluciones por minuto) durante 3 min, se desechó el sobrenadante y los botones fueron resuspendidos. Una vez resuspendidos los botones se agregaron 500 μl de la solución de lisis para los eritrocitos restantes y se mezcló. Después se transfirieron a unos tubos de 10 ml, se centrifugaron los tubos a 2500 rpm por 3 min, posteriormente se desechó el sobrenadante y al botón se le agregaron 400 μl de la solución de lisis para glóbulos blancos y 700 μl de la solución Binding, se prosiguió a colocar 600 μl de nuestra mezcla a las columnas de purificación, se centrifugaron las columnas a 12rpm durante 1min, terminada la centrifugación se colocó el resto de la solución de los tubos de lisis a las columnas, centrifugado a 12 rpm por 2 min, después se hicieron 2 lavados para eliminar DNasa, proteínas y sales; por último se agregó la solución de elusión del ADN dos veces centrifugando 1min cada elusión a 13 rpm. Terminada la extracción del ADN se alicuotaron las muestras, se observaron en un gel de agarosa al 1 % para determinar la calidad y por medio de un espectrofotómetro se calculó la concentración de ADN con la siguiente fórmula:

[ADN] = Å260 x 50 x FD Donde: [ADN] Concentración de ADN Å260 Absorbancia a 260 nanómetros FD Factor de dilución PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



ANÁLISIS DE CYP46

v Análisis Por Restricción

A partir del ADN purificado tanto de los pacientes como de los controles se amplificó una región del intrón 2 del gen de CYP46; utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para determinar la presencia del polimorfismo a estudiar. Las características de la PCR fueron las siguientes: para una reacción de 25μl se utilizó H2O MQ, Buffer PCR (10X) + MgCl (1.5mM), dNTP´s (10mM) 1.0μl, primers forward y reverse (0.2μM), ADN (100ng) y Taq polimerasa (1U). Para la desnaturalización inicial del ADN se utilizó una temperatura de 95°C por 10min, la reacción fue programada para 40 ciclos de 30seg a 95°C, 30seg a 53°C y 30seg a 72°C seguida por una extensión final de 10min a 72°C.

Los oligonucleótidos empleados fueron: • Primer F: 5’-TGA AAA CGA GTT TCC CGT CC-3’ • Primer R: 5’-GTG TGA CCA GGT AAC AGT CA-3’

Terminado el tiempo de PCR el producto se observó en un gel de

agarosa al 2% para verificar que se amplificara el fragmento deseado.

Para determinar la presencia de polimorfismos en el intrón 2 del gen de CYP46 en individuos sanos y pacientes con EA, los productos de PCR fueron cortados con la endonucleasa de restricción MspI, incubando durante 3 horas a 37°C. La región que reconoce la enzima es:

C C G G G G C C

Una vez terminado el tiempo de digestión, los fragmentos se separaron por la técnica de electroforesis utilizando geles de poliacrilamida PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



v Análisis Por PCR En Tiempo Real

Una vez que se obtuvo el ADN genómico de 19 pacientes y 15 controles se realizó la PCR en tiempo real. Esta técnica se basa en la PCR tradicional, solo que en lugar de usar solo cebadores (primers), también utiliza sondas marcadas específicas para cada polimorfismo que al unirse al ADN mandan una señal indicando la secuencia que se tiene (Figura 7). Por último, el análisis lo hace la computadora graficando la intensidad de la señal de cada sonda indicando si la muestra analizada es homocigoto o heterocigoto T y/o C. Se hace una mezcla de reacción de 25μl donde se ocupan 20ng de DNA genómico, Buffer TE (1X) Taq Man Universal PCR Master Mix (2x), las sondas marcadas (20X) y H2O MQ.

v Análisis Por Secuenciación

Para poder determinar si se encontraba el polimorfismo del intrón 2

de CYP46 se realizó la secuenciación de los productos de PCR de CYP46. El producto de PCR se purificó y después por el Método Dideoxi de Sanger se secuenciaron las muestras. Este método sólo se ocupó como un medio para verificar nuestros resultados obtenidos por la Restricción y el Tiempo Real.

Para la reacción de secuenciación de 25μl se utilizó: el producto de

PCR de CYP46, primers forward o reverse (0.2μM), Big Dae y H2O MQ. Las temperaturas para el termociclador fueron las siguientes: 96°C durante 1 min, 30 ciclos de 96°C por 35 seg, 50°C 25 seg y 60°C durante 4 min. Finalmente las muestras se desecan para resuspenderlas en 13μl de formamida y colocarlas dentro del secuenciador. Nuestros resultados se pudieron observar por medio de electroferogramas.




Figura 7: Esquema de la PCR en Tiempo Real. 1. Se muestran los componentes de la

técnica, la sonda marcada como (VIC® dye) es la que contiene el fragmento complementario del ( ) ADN templado con el alelo T, mientras que la

sonda (FAM™ dye) posee el fragmento complementario del ADN templado con el alelo C. Estas dos sondas poseen en el otro extremo una señal de paro o

fin ( ). También se muestran los cebadores F y R ( ), 2. Al separarse las dos cadenas complementarias del ADN, los cebadores y una de las sondas se unen a su cadena correspondiente, 3. Se lleva acabo la extensión ( ) por la

polimerasa ADN ( ), al alinearse la sonda se libera el fluorocromo y éste manda una señas que la computadora interpreta numéricamente y determina cual es el alelo que presentaba la muestra.




ANÁLISIS DE APOE

v Análisis Por Restricción

Para determinar la frecuencia alélica de APOE después de la obtención del ADN genómico se amplificó una región del gen mediante la técnica PCR. Las características de la PCR fueron las siguientes: para una reacción de 25 μl se utilizó H2O MQ, Buffer (10X) + MgCl (1.5mM), DMSO (10%), dNTP´s (10mM) 1.0μl, primers forward y reverse (0.2μM), ADN (100ng) y Taq polimerasa (1U). Se utilizó una pequeña prePCR con una temperatura inicial de 96°C durnte 2 min y una segunda de 94°C por 3 min. Después la reacción fue programada para 45 ciclos de 30 seg a 94°C, 20 seg a 65°C y 30 seg a 72°C seguida por una extensión final de 5 min a 72°C.

Los oligonucleótidos empleados fueron: • Primer F: 5’-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3’ • Primer R: 5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTAC-3’

Para determinar la frecuencia alélica en individuos sanos y pacientes

con EA, los productos de PCR fueron cortados con la endonucleasa de restricción CfoI, incubando durante 3 horas a 37°C. La región que reconoce la enzima es (Figura 8):

G C G C C G C G

Cuando terminó el tiempo de digestión, los fragmentos se separaron por la técnica de electroforesis utilizando geles de poliacrilamida al 15% con tinción en plata




Figura 8: PCR de APOE. Se pueden ver la secuencia amplificada por tripletes y en la parte inferior de cada renglón la secuencia de aminoácidos, la secuencia de nucleótidos GCGC es la que corta la enzima CfoI. El alelo E2 posee en las posiciones 112 y 158 una Timina (cys), E3 en la posición 112 se distingue por una Timina (cys) y en 158 una Citosina (arg), E4 se caracteriza por tener una Citosina (arg) en 112 y 158.




RELACIÓN ENTRE PACIENTES Y CONTROLES De los 19 pacientes con EA tipo Esporádico y los 15 controles del Hospital general de México la edad promedio de los pacientes fue de 66.5 años y el de los controles de 62.1 años. Dentro de nuestros 19 pacientes sólo se observaron 5 del sexo masculino y el resto fuero del sexo femenino; en los controles se obtuvieron 7 hombres y 8 mujeres (Tabla 1). Cada metodología fue analizada por separado y se observaron los siguientes resultados:

Pacientes No. Edad Sexo 1 65 F 2 82 M 3 61 F 4 62 M 5 82 M 6 76 F 7 65 F 8 70 F 9 65 F 10 85 F 11 68 F 12 81 M 13 75 M 14 80 F 15 67 F 16 41 F 17 76 F 18 64 F 19 65 F

Controles No. Edad Sexo 1 75 F 2 43 F 3 51 F 4 28 F 5 37 M 6 79 F 7 73 M 8 68 M 9 75 F 10 67 M 11 75 F 12 60 M 13 68 M 14 68 M 15 56 F

Tabla 1: Relación entre pacientes y controles con edades y sexos.




CYP46

• Al analizar nuestros geles con la digestión de MspI de la PCR de

CYP46 de todas las muestras observamos que, al tratarse de un homocigoto TT, la enzima no cortaba el producto de PCR y se apreciaba una sola banda de 285pb. Cuando la enzima reconocía un homocigoto CC se podía ver en el gel dos bandas, correspondientes a los fragmentos de 209pb y de 76pb. Cuando se trataba de un heterocigoto TC se observaba el producto de 285pbmas las dos bandas de 209pb y la de 76pb. Finalmente se encontró que: 14 de los pacientes presentaban el polimorfismo siendo T/C, mientras que los 5 restantes se observaron como homocigotos T. De los 15 controles 9 fueron homocigotos T y el resto eran heterocigotos T/C (Figuras 7-9)

Figura 7: Foto del producto de PCR de CYP46 tras la digestión de la enzima MspI de los pacientes 1-10 con EA tipo esporádica. Carril 1: Marcador de 25pb (Promega Corporation). Carril 5, 10 y 11: la enzima no corta al homocigoto TT, por lo tanto se observa el producto completo de PCR de 258pb. Carril 2-4 y 6-9: se observar un heterocigoto TC con tres bandas, una 285pb, otra de 209pb y una última de 76pb.




Figura 8: Foto del producto de PCR de CYP46 tras la digestión de la enzima MspI de los pacientes 11-19 con EA tipo esporádica. Carril 1: Marcador de 25pb (Promega Corporation). Carril 2-4 y 7-10: se observa un heterocigoto TC con tres bandas, una 285pb, otra de 209pb y una última de 76pb. Carril 5 y 6: la enzima no corta al homocigoto TT, por lo tanto se observa el producto completo de PCR de 258pb.

Figura 9: Foto del producto de PCR de CYP46 tras la digestión de la enzima MspI de los controles 1-15. Carril 1: Marcador de 25pb (Promega Corporation). Carril 2-8, 12 y 13: se observa un heterocigoto TT con una sola banda de 285pb. Carril 9-11 y 14-16: la enzima corta y se pueden apreciar 3 bandas, indicando que son heterocigotos TC.




• Dentro de la discriminación alélica por medio de la PCR en tiempo

real de CYP46 se encontró que de los pacientes, solo 1 presentaba homocigocidad al alelo C, 12 presentaban tanto el alelo C como el T y 4 fueron homocigotos T. Al analizar los controles se observó que 4 fueron homocigotos C, 3 presentaban heterogocidad CT y 8 fueron homocigotos T (Gráfica 1).

• En la secuenciación se obtuvieron los siguientes resultados: de los 11 pacientes con EA tipo esporádico 7 fueron heterocigotos T/C, 3 homocigotos T y sólo uno fue homocigoto C. De los 8 controles analizados 6 fueron homocigotos T, y 2 homocigotos C. En la figura 10 se muestran ejemplos de cómo se aprecian los electroferogramas cuando hay un homocigoto T o C y cuando se encuentra un

Gráfica 1: Comparación entre los 19 pacientes con EA (en azul) y los 15 controles (en verde) estudiados por PCR en Tiempo Real de CYP46. Dentro del óvalo morado se encuentran los homocigotos C, En el óvalo naranja están los heterocigotos CT y dentro del rosa los homocigotos T.

CYP46

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

-0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2T

C

Pacientes Controles

CC

CT

TT




Figura 10: Representación de un electroferograma. Cuando hay un homocigoto T se observa una pico en verde en la posición 209, indicando la presencia de una Adenina complementaria al ADN muestra, si en lugar de ser verde es negra entonces se trata de una Guanina y es un homocigoto C, pero si hay dos curvas sobrepuestas, es decir una color negro y otra verde, entonces se trata de un heterocigoto TC. Sobre cada curva graficada se puede observar el nucleótido correspondiente según la secuencia de cada muestra. (I) homocigoto T, (IIa y IIb) homocigoto C y (III) heterocigoto TC.

I ) IIa )

IIb ) III ) A




Al unificar nuestros resultados de la presencia del polimorfismo del intrón 2 de CYP46 con las diferentes técnicas se pudo observar lo siguiente (Tabla 2 y Gráfica 2): Ø Del total de los 19 pacientes analizados con EA tipo esporádico, 5

eran homocigotos T, 13 heterocigotos T/C y solo 1 fue homocigoto C.

Ø De los 15 controles analizados 9 fueron homocigotos T, 4 heterocigotos T/C y 2 homocigotos C.

n CYP46 T/T

CYP46 C/C

Cyp46 T/C

Pacientes 19 5 1 13 Controles 15 9 2 4

4

6

8

10

12

No.

de

Indi

vidu

os

AN ÁLISIS DE C YP46

Pac ien tesControles

Tabla 2: Presencia del polimorfismo T/C en el intrón 2 de CYP46.

Gráfica 2: En este gráfico se muestra la comparación de alelos T y/o C de CYP46 entre los 19 pacientes con EA (color azul) y los 15 controles estudiados (color amarillo).




APOE

Al observar los geles de poliacrilamida donde se reveló la frecuencia alélica de APOE de cada paciente y control, se observó que los homocigotos para el alelo 3 presentaban 4 bandas: de 91pb, 48pb, 35pb y una última y poco visible de 19pb. Los homocigotos al alelo 4 se puedieron observar con 4 bandas de: 72pb, 48pb, 35pb y 19pb. Los heterocigotos 3/4 presentaban una combinación de bandas de: 91pb, 72pb, 48pb, 35pb y 19 pb (Figura 11-14).

Figura 11: Ejemplo de cada una de las frecuencias alélicas de APOE tras la digestión de la enzima CfoI. Carril 1: Marcador de 25pb (Promega Corporation). Carril 2: APOE2/2 genera tres fragmentos (91pb, 83pb y 35pb). Carril 3: APOE3/3 contiene 4 fragmentos (91pb, 48pb, 35pb y 19pb). Carril 4: APOE4/4 posee 4 fragmentos (72pb, 48pb, 35pb y 19pb). Carril 5: APOE2/3. Carril 6: APOE2/4. Carril 7: APOE3/4.

Figura 12: Digestión de APOE con la enzima CfoI de los pacientes 1 a 10. Carril M: Marcador de 25pb (Promega Corporation). Pacientes 1 y 9: APOE 3/4, pacientes 2-8 y 10: APOE 3/3.




Figura 13: Digestión de APOE con la enzima CfoI de los pacientes 10 a 19. Carril M: Marcador de 10pb (Fermentas). Carriles 1-4, 6-9: APOE 3/3. Carril 9: APOE 3/4.

Figura 14: Digestión de APOE con la enzima CfoI de los controles 1-10. Carril M: Marcador de 10pb (Fermentas). Carriles 1, 5-7 y 10: APOE 3/3. Carriles 2-4, 8 y 9: APOE 3/4.

Figura 15: Digestión de APOE con la enzima CfoI de los controles 11-15. Carril M: Marcador de 25pb (Promega Corporation). Carriles 1, 3 y 4: APOE PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



Después de hacer el análisis de la digestión de la PCR de APOE con

la endonucleasa CfoI, se observó la siguiente frecuencia alélica de APOE (Tabla 3 y Gráfica 3): Ø De los 19 pacientes estudiados se observaron 16 homocigotos E3 y 3

heterocigotos E3/E4. Ø 8 controles, de los 15 totales, presentaron homocigocidad E3, 6

fueron heterocigotos E3/E4 y solo 1 fue homocigoto E4/E4.

n APOE 3/3

APOE 4/4

APOE 3/4

Pacientes 19 16 0 3 Controles 15 8 1 6

Gráfica 3: Gráfica en la que se muestra la comparación de alelos de APOE entre los 19 pacientes con EA y los 15 controles estudiados.

2

4

6

8

10

12

14

16

No.

de

Indi

vidu

os

ANÁLISIS DE APOE

PacientesControles

Tabla 3: Frecuencia alélica de APOE.




CORRELACIÓN ENTRE CYP46 Y APOE El paciente 1 posee tanto C como T de CYP46 y una frecuencia alélica de APOE3/4. Los pacientes 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 17, 18 y 19 presentan C y T de CYP46 y APOE3/3. Los pacientes 4, 10 y 11 presentan sólo el alelo T de CYP46 y APOE3/3. Los pacientes 9 y 15 presentan solo T de CYP46 y APOE3/4. El paciente 16 fue homocigoto C de CYP46 y APOE3/3 (Tabla 4 y Gráfica 5).

CYP46 APOE No. Restricción Tiemp. R. Secuencia Restricción 1 T/C T/C T/C 3/4 2 T/C T/C T/C 3/3 3 T/C T/C T/C 3/3 4 T/T T/T 3/3 5 T/C T/C T/C 3/3 6 T/C T/C 3/3 7 T/C T/C 3/3 8 T/C T/C T/C 3/3 9 T/T T/T T/T 3/4

10 T/T T/T 3/3 11 T/C T/T T/T 3/3 12 T/C T/C 3/3 13 T/C T/C 3/3 14 T/T T/C T/C 3/3 15 T/T T/T T/T 3/4 16 T/C C/C C/C 3/3 17 T/C T/C 3/3

Tabla 4: En esta tabla sólo se muestran los 19 pacientes con EA tipo esporádico analizados. En la primer columna de izquierda a derecha se encuentra el número de paciente, el resultado mediante la técnica de restricción, por tiempo real y secuencia de CYP46, mientras que en la última columna la frecuencia alélica de APOE.




De los 15 controles analizados, el 1, 5, 6 y 7 presentaron CYP46TT y APOE3/3. Los controles con número 2, 3, 4, 9 fueron CYP46TT y APOE3/4. Los controles 10, 13 y 14 presentaban CYP46TC y APOE3/3. El control 15 se observó como CYP46TC y APOE 3/4. Los controles 8 y 11 presentaron CYP46CC, aunque sólo el 8 fue APOE3/4 y el 11 fue APOE3/3 (Tabla 5 y gráfica 5).

CYP46 APOE

No. Restricción Tiemp. R. Secuencia Restricción

1 T/T T/T T/T 3/3 2 T/T T/T T/T 3/4 3 T/T T/T T/T 3/4 4 T/T T/T T/T 3/4 5 T/T T/T 3/3 6 T/T T/T 3/3 7 T/T T/T 3/3 8 T/C C/C C/C 3/4 9 T/C T/T T/T 3/4

10 T/C T/C 3/3 11 T7T C/C C/C 3/3 12 T/T T/T T/T 4/4 13 T/C T/C 3/3 14 T/C T/C 3/3 15 T/C T/C 3/4

Tabla 5: En esta tabla se observan los 15 controles estudiados. En la primer columna de izquierda a derecha se encuentra el número del control, la edad, el sexo, el resultado mediante la técnica de restricción, por tiempo real, secuencia de CYP46 y en la última columna la frecuencia alélica de APOE.




Gráfica 5: Gráfica que muestra la correlación entre CYP46 y APOE de los 19 pacientes estudiados y los 15 controles.

0

2

4

6

8

10

12

14

16N

o. d

e In

divi

duos

CYP46 T/T CYP46 T/C CYP46 C/C APOE 3/3 APOE 4/4 APOE 3/4

ANÁLISIS DE CORRELACIÓN ENTRE CYP46 Y APOE

PacientesControles




Cerca del 94.73% de los pacientes con EA tipo esporádico presentaban el polimorfismo T/C del intrón 2 de CYP46, de este porcentaje, el 26.31% fueron homocigotos TT y el 68.42% eran heterocigotos presentando tanto el alelo T como el C. Un 0.19% presentaba sólo el alelo C.

En los controles estudiados alrededor del 86.66% presentaban el

polimorfismo y de estos el 60% fueron homocigotos TT, el 20% eran heterocigotos TC y 0.3% presentaba sólo el alelo C.

Como se puede ver en los párrafos anteriores el polimorfismo (T/C)

del intrón 2 de CYP46 se encuentra en mayor medida en los pacientes con EA tipo esporádico. Cabe mencionar que la mayoría eran heterocigotos TC; aunque también puede presentarse el polimorfismo en los individuos control, hay una diferencia con los heterocigotos TC, ya que estos están en menor proporción en comparación con los pacientes.

Con respecto a la frecuencia alélica de APOE, el 84.21% de los pacientes estudiados eran homocigotos E3/E3, mientras que el 21.05% restante fueron heterocigotos E3/E4. No se observó ningún paciente con homocigocidad al alelo E4.

El 53.33% de los controles estudiados para la frecuencia alélica de

APOE contenían solo el alelo E3, el 40% presentaban tanto el alelo E3 como el E4 y el 6.7% contenían solo el alelo E4.

Con base a la literatura no solo el alelo E4 de APOE predispone al

desarrollo de la EA, un estudio reciente de pacientes españoles con EA presentan en su mayoría el alelo E3; lo que sugieren los autores es que APOE3 junto con CYP46T y no APOE4 es un factor de riesgo para padecer la EA.14




Nuestros resultados y la literatura sugieren que la presencia del

polimorfismo T/C del intrón 2 del gen CYP46 junto con otros factores de riesgo como la frecuencia alélica de APOE3 (en el caso de este estudio) pueden predisponer al desarrollo de la patología de EA tipo esporádico. Es muy importante mencionar que de forma independiente la presencia del polimorfismo antes estudiado de CYP46 no es un factor de riesgo para desarrollar Eatipo esporádico, de igual manera no solo presentar el alelo E3 de APOE es necesario para padecer la enfermedad, sino que ambos factores y probablemente otros que no se tomaron en cuenta para fines de este estudio como mutaciones en otros genes u otros factores exógenos (ejem.; factores ambientales o lesiones cerebrales) actúan sinérgicamente para así desarrollar la EA tipo esporádico.

A pesar de la relación entre polimorfismo y enfermedad, no se

pueden considerar nuestros resultados determinantes para poder establecer válida esta relación, por lo que se sugiere aumentar el número de individuos estudiados (controles y pacientes) y verificar por estudios inmunohistoquímicos la presencia de la enfermedad en los pacientes.




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Trabajo aprobado por los asesores de la alumna Marlene E. Maury Rosillo con matrícula 200330091 del Programa Docente de Investigación correspondiente a la Licenciatura de Biología Experimental de la División de Ciencias Biológicas de y la Salud de la UAM-I. Título del trabajo presentado: “Presencia del Polimorfismo T/C en el intrón 2 del gen CYP46 y frecuencia alélica de APOE en pacientes con Enfermedad de Alzheimer Tipo Esporádico en México.

Asesor Interno:

Dra. Adriana Morales Otal. Profesor Titular Tiempo Completo. Depto.

De Biología de la Reproducción. Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa.

Asesor Externo:

Dra. Victoria Campos Peña. Técnico Académico Titular “B”. Facultad de Medicina.

Universidad Nacional Autónoma de México. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com



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