P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 1/15

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 теста за употреба с Autostainer Link 48 Предназначение

За употреба при ин витро диагностика.

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx е качествен имунохистохимичен анализ, който използва Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3, предназначен за използване при установяването на PD-L1 протеин във фиксирана във формалин и включена в парафин (FFPE) тъкан от недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC) с помощта на система за визуализация EnVision FLEX на Autostainer Link 48. Експресията на PD-L1 протеина се определя чрез използване на Оценка на туморната пропорция (TPS), която представлява процентното съдържание на жизнеспособни туморни клетки, показващи частично или пълно оцветяване на мембраната.

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx е показан като помощно средство при идентифициране на пациенти с NSCLC за лечение с KEYTRUDA® (pembrolizumab).

Кратко описание и обяснение Свързването на лигандите PD-1, PD-L1 и PD-L2 към PD-1 рецептора, който се намира върху Т-клетките, инхибира Т-клетъчната пролиферация и производството на цитокини. Възходяща регулация на лиганди PD-1 се среща при някои тумори и сигнализация чрез този път може да допринесе за инхибиране на активното Т-клетъчно имунно наблюдение на тумори. KEYTRUDA е хуманизирано моноклонално антитяло, което се свързва към PD-1 рецептора и блокира взаимодействието му с PD-L1 и L2-PD, освобождавайки медиираното от PD-1 пътя инхибиране на имунния отговор, включително и на анти-туморния имунен отговор. В сингенни миши туморни модели блокирането на PD-1 активността води до намаляване на туморния растеж (1).

Принцип на процедурата PD-L1 IHC 22C3 pharmDx съдържа оптимизирани реагенти и протокол, необходими за завършване на процедура за IHC оцветяване на FFPE препарати с помощта на Autostainer Link 48. След инкубация с първично моноклонално антитяло срещу PD-L1 или отрицателна контрола на реагент (NCR), препаратите се инкубират с свързващо антитяло, специфично за вида на гостоприемниците на първичното антитяло, а след това се инкубират с ready-to-use реагент за визуализация, състоящ се от вторични антителни молекули и молекули от пероксидаза от хрян, свързани по двойки към декстранов полимерен скелет. Ензимното превръщане на добавения впоследствие хромоген води до утаяване на видим продукт на реакцията на мястото на антигена. Цветът на хромогенната реакция се модифициран от реагент за усилване на хромогена. След това пробата може да бъде контрастно оцветена и покрита с покривно стъкло. Резултатите се интерпретират чрез използване на светлинен микроскоп.

Осигурени материали Всеки набор включва 19,5 mL от първично PD-L1 антитяло (около 3 µg/mL концентрация на протеин) и съдържа реагентите, необходими за извършване на 50 тест в до 15 отделни работни цикъла. Материалите, изброени по-долу, са достатъчни за 50 теста (50 слайда инкубирани с първично антитяло към PD-L1 и 50 слайда инкубирани със съответната отрицателна контрола на реагент, 100 слайда общо). Броят на тестовете се основава на използването на 2 х 150 µL за всеки слайд от всеки реагент с изключение на DAB+ и Target Retrieval Solution.

Комплектът съдържа материали, достатъчни за максимум 15 индивидуални процедури на оцветяване. Количество Описание 1 x 34,5 mL Peroxidase-Blocking Reagent

Буфериран разтвор, съдържащ водороден пероксид, детергент и 0,015 mol/L натриев азид.

1 x 19,5 mL

Първично антитяло: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3

Моноклонални миши (IgG1) анти-PD-L1 в буфериран разтвор, съдържащ стабилизиращ протеин и 0,015 mol/L натриев азид.

1 x 15 mL

Negative Control Reagent

Моноклонални миши контролни IgG антитела в буфериран разтвор, съдържащ стабилизиращ протеин и 0,015 mol/L натриев азид.

1 x 34,5 mL Mouse LINKER

Заешки вторични антитела срещу миши имуноглобулини в буфериран разтвор, съдържащ стабилизиращ протеин и 0,015 mol/L натриев азид.

1 x 34,5 mL Visualization Reagent-HRP

Декстран, свързан с молекули на пероксидаза и молекули на вторични антитела от коза срещу заешки и миши

VISUALIZATION REAGENT-HRP

LINKER, ANTI-MOUSE

NEGATIVE CONTROL REAGENT

MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 2/15

имуноглобулини в буфериран разтвор, съдържащ стабилизиращ протеин и антимикробен агент. 15 x 7,2 mL DAB+ Substrate Buffer

Буфериран разтвор, съдържащ водороден пероксид и антимикробен агент.

1 x 5 mL DAB+ Chromogen

3,3’-диаминобензидин тетрахидрохлорид в органичен разтворител.

1 x 34,5 mL DAB Enhancer

Меден сулфат във вода.

6 x 30 mL EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x

Буфериран разтвор, pH 6,1, съдържащ детергент и антимикробен агент.

15 слайда PD-L1 IHC 22C3 pharmDx контролни слайдове

Всеки слайд съдържа участъци от две зърнести, фиксирани във формалин и включени в парафин клетъчни линии: NCI-H226* с умерена експресия на PD-L1 протеин и MCF-7 с отрицателна експресия на PD-L1 протеин.

P

D-L

1 IH

C 2

2C3

ph

arm

Dx

XX

XX

X

*На д-р AF Gazdar и д-р JD Minna от NIH се изказва благодарност за техния принос за разработване на NCI-H226 (ATCC Номер: CRL-5826™) (2). Забележка: Всички включени реагенти са формулирани специално за използване с този набор. С цел да се провежда теста, както е посочено, не могат да се правят никакви замествания, различни от EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x (Code K8005). PD-L1IHC 22C3 pharmDx е пригоден за използване с Autostainer Link 48. Моля, обърнете се към ръководствата на потребителя за вашите Autostainer Link 48 и PT Link за допълнителна информация Материали, които са необходими, но не са осигурени PT Link Pre-treatment Module (Код PT100/PT101) Autostainer Link 48 (Код AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (Код K8007) Hematoxylin (Код K8008) Дестилирана или дейонизирана вода (вода с качествата на реагент) Таймер Положителни и отрицателни тъкани, за да се използват като контроли на процеса (вижте раздел „Контрол на качеството“) Микроскопски слайдове: Dako FLEX IHC микроскопични слайдове (Код K8020) или Fisherbrand Superfrost Plus заредени слайдове Покривни стъкла Трайна среда за заливка и изисквани спомагателни реагенти за заливка на покривни стъкла Светлинен микроскоп (обектив с увеличение 4x – 40x) Предпазни мерки 1. За употреба при ин витро диагностика. 2. Само за професионална употреба. 3. Този продукт съдържа натриев азид (NaN3), химично вещество, което е силно токсично в чист вид. При концентрации на

продукти, въпреки че не са класифицирани като опасни, NaN3 може да реагира с олово и мед от водопроводната система и да образува силно експлозивни натрупвания на метални азиди. При изхвърляне в канализацията използвайте обилно количество вода, за да предотвратите натрупване на метален азид във водопроводната система (3).

4. Първичното антитяло, отрицателната контрола на реагент, линкерът и реагентът за визуализация съдържат материал от животински произход.

5. Проби, преди или след фиксация, както и всички материали, изложени на тяхното влияние, трябва да се третират като материали, позволяващи пренасяне на инфекция, и да се изхвърлят, като се вземат подходящите предпазни мерки (4).

6. Използването на време, температура или методи на инкубация, различни от определените, може да доведе до неточни резултати.

7. Реагентите са разредени в оптимално съотношение. Допълнителното разреждане може да доведе до загуба на оцветяването на антигена.

8. Реагентът за визуализация, течният DAB+ хромоген и приготвеният разтвор DAB+ субстрат-хромоген могат да бъдат засегнати неблагоприятно, ако са изложени на прекомерни нива на осветеност. Не съхранявайте компоненти на системата, нито извършвайте оцветяване на силна светлина, като например пряка слънчева светлина.

9. Остатъците от парафин могат да доведат до получаване на погрешни отрицателни резултати.

КОНТРОЛНИ СЛАЙДОВЕ

EnVision™ FLEXTARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

DAB ENHANCER

DAB+ CHROMOGEN

DAB+ SUBSTRATE BUFFER

MCF-7: PD-L1 отрицателна

NCI-H226: PD-L1 положителна

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 3/15

10. Използването на количества реагент, различни от препоръчаните, може да доведе до загуба на видима имунореактивност на PD-L1.

11. Резултати от едно малко проучване показват подобен динамичен диапазон на PD-L1 експресия в двойки препарати от първичен и метастатичен NSCLC. Възможно е да има разлики в PD-L1 експресията в първични тумори в сравнение с метастатични локализации при един и същ пациент.

12. Големи тъканни срезове могат да изискват 3x150 µl реагент. 13. Като общо правило, не се допуска лица под 18 годишна възраст да работят с продукта. Потребителите трябва да бъдат

подробно запознати с правилните процедури за работа, опасните свойства на продукта и необходимите инструкции за безопасност. За допълнителна информация, моля, направете справка с информационния лист за безопасност (SDS).

14. Носете подходящи лични предпазни средства, за да избегнете контакт с очите и кожата. 15. Неизползваният разтвор трябва да се изхвърля в съответствие с местните, щатските и федерални разпоредби. 16. Информационен лист за безопасност се предоставя на професионалните потребители при поискване.

Опасност DAB+ Chromogen: 1 – 5% дифенил-3,3',4,4'-тетраилтетраамониев тетрахлорид H350 Може да причини рак. H341 Предполага се, че причинява генетични дефекти. P201 Преди употреба се снабдете със специални инструкции. P202 Не започвайте работа, докато не прочетете и не разберете всички предпазни мерки за безопасност. P280 Носете защитни ръкавици. Използвайте предпазни очила и предпазна маска за лице. Носете защитно

облекло. P308 + P313 ПРИ явна или предполагаема експозиция: Потърсете медицинска помощ. P405 Да се съхранява под ключ. P501 Изхвърлете съдържанието и контейнера в съответствие с всички местни, регионални, национални и

международни разпоредби.

Предупреждение EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1 – 5% Лимонена киселина H319 Предизвиква сериозно дразнене на очите. H411 Токсичен за водните организми и има дълготраен ефект. P280 Използвайте предпазни очила и предпазна маска за лице. P273 Избягвайте изпускането му в околната среда. P264 Щателно измивайте ръцете си след работа. P305 + P351 + P338

ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако имате такива и доколкото това е възможно. Продължете да промивате.

P337 + P313 Ако дразненето на очите продължава: Потърсете медицинска помощ. P501 Изхвърлете съдържанието и контейнера в съответствие с всички местни, регионални, национални и

международни разпоредби. Съхранение Съхранявайте всички компоненти на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, включително контролните слайдове, на тъмно при температура 2 – 8 °C, когато не се използват на Autostainer Link 48. Не използвайте комплекта след изтичане на срока на годност, отпечатан върху външната страна на кутията на комплекта. Ако реагентите се съхраняват при условия, различни от описаните в тази листовка, те трябва да бъдат валидирани от потребителя. Не съществуват явни признаци, които да показват нестабилност на този продукт, следователно положителни и отрицателни контроли трябва да се проведат едновременно с препаратите от пациенти. Приготвяне на препарат С препаратите трябва да се борави така, че да се запази тъкан за IHC оцветяване. Стандартни методи на обработка на тъканите трябва да се използват за всички препарати. Включени в парафин срезове Подходящи за използване са тъкани, фиксирани с формалин и включени в парафин. Алтернативни фиксатори не са валидирани и могат да дават погрешни резултати. Препоръчва се време за фиксиране от 12–72 часа в 10% неутрален буфериран формалин (NBF), обаче, едно проучване с ограничени проби показва, че времена за фиксиране от 4–168 часа в 10% NBF не променят систематично установяването на PD-L1. Времена за фиксиране от ≤3 часа могат да доведат до несигурно установяване на PD-L1. Препаратите трябва да бъдат формирани в блокчета с дебелина от 3 или 4 mm, фиксирани във формалин и дехидратирани, и просветлени в серия от алкохоли и ксилен, последвано от инфилтрация с разтопен парафин. Температурата на парафина не трябва да надвишава 60 °С. Ако тъканните FFPE блокчета са на 5 или повече години, това може да доведе до загуба на PD-L1 имунореактивност. От хистологичните препарати трябва да се приготвят срезове с дебелина 4 – 5 µm. След приготвяне на срезове тъканите трябва да бъдат залети на Fisherbrand Superfrost Plus слайдове или на Dako FLEX IHC микроскопски слайдове (Код K8020) и след това да се поставят в пещ на температура 58 ± 2 °С в продължение на 1 час. За да се запази антигенността, тъканните срезове, след като веднъж са залети върху слайдове, трябва да се държат на тъмно при температура 2–8 °С (за предпочитане) или при стайна температура до 25 °C и да се оцветят в рамките на 6 месеца от приготвянето на срезовете. Условията за съхранение и боравене със слайдовете не трябва да надвишават 25 °C във всеки един момент след заливката, за да се гарантира целостта и антигенността на тъканите.

Употребата на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx върху декалцифицирани тъкани не е била потвърдена и не се препоръчва.

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 4/15

Приготвяне на реагента Преди оцветяване трябва да се приготвят следните реагенти: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x Подгответе достатъчно количество 1x Target Retrieval Solution, Low рН чрез разреждане на Target Retrieval Solution, Low рН, 50x 1:50 с дестилирана или дейонизирана вода (вода с качествата на реагент); рН на 1x Target Retrieval Solution трябва да бъде 6,1 ± 0,2. 1x Target Retrieval Solution с pH под 5,9 може да даде погрешни резултати. Една бутилка от 30 mL от Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, разредена 1:50 ще осигури 1,5 L от 1x реагент, достатъчен да напълни един PT Link резервоар, с който ще се третират до 24 слайда при употреба. Изхвърлете 1x Target Retrieval Solution след три употреби и не го използвайте след 5 дни от разреждането. Допълнително количество EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, ако е необходимо, е на разположение под код K8005. EnVision FLEX Wash Buffer, 20x Пригответе достатъчно количество буфер за промивка чрез разреждане на буфера за промивка 20x 1:20 с помощта на дестилирана или дейонизирана вода (вода с качествата на реагент) за стъпките на промиване. Съхранявайте неизползван 1x разтвор при температура 2 – 8 ºC в продължение на не повече от един месец. Изхвърлете буферния разтвор, ако изглежда мътен. За допълнителна информация направете справка с „Ръководство на потребителя“ за вашия Autostainer Link 48.

EnVision FLEX Wash Buffer, 20x е на разположение под Код K8007.

DAB+ субстрат-хромогенен разтвор Този разтвор трябва да се смеси щателно преди употреба. Преципитат, който се развива в разтвора, няма да повлияе върху качеството на оцветяването. За да приготвите DAB+ субстрат-хромогенен разтвор, добавете 1 капка от течен DAB+ хромоген на mL of DAB+ субстратен буфер и размесете. Приготвеният субстрат-хромоген е стабилен в продължение на 5 дни, ако се съхранява на тъмно при температура 2 – 8 C. Важни забележки:

Ако използвате цяла бутилка DAB+ субстратен буфер, добавете 9 капки от DAB+ хромоген. Въпреки че етикетът гласи 7,2 mL, това е полезният обем и не отчита „мъртвия обем“ в бутилката.

Цветът на Liquid DAB+ Chromogen в бутилката може да варира от бистър до лавандулово-кафяв. Това няма да се отрази на действието на този продукт. Разредете съгласно указанията, дадени по-горе. Прибавянето на излишък от Liquid DAB+ Chromogen към DAB+ Substrate Buffer ще доведе до влошаване на положителния сигнал.

Процедура на оцветяване на Autostainer Link 48 разтвор Процедурни забележки Потребителят трябва да прочете внимателно тези инструкции и да се запознае с всички компоненти и апаратура преди употреба (вижте „Предпазни мерки“). Преди имунооцветяване всички реагенти трябва да достигнат стайна температура (20 – 25 °C). По същия начин всички инкубационни процедури трябва да се извършват на стайна температура. Не допускайте тъканните срезове да изсъхнат по време на процедурата на оцветяване. Изсъхнали тъканни срезове могат да покажат по-интензивно неспецифично оцветяване. Всички необходими стъпки и инкубационни времена за оцветяване са предварително програмирани в софтуера на Dako Link. Моля, обърнете се към ръководствата за потребителя на Autostainer Link 48 и PT Link за по-нататъшна информация относно програмните протоколи и зареждане на слайдове и реагенти. Забележка: Реагентите и инструкциите, предоставени в тази система, са с дизайна, разработен за оптимална работа, когато се използват препоръчаните реагенти и материали. Допълнителното разреждане на реагентите или промяна на времената или температурата на инкубация могат да доведат до неточни или противоречиви резултати. Протокол за оцветяване Моля, изберете протокол за PD-L1 IHC 22C3 pharmDx оцветяване от опциите в падащото меню на Dako Link. Всички необходими стъпки и инкубационни времена за оцветяване са предварително програмирани в Autostainer Link 48. Ако подходящите PD-L1 IHC 22C3 pharmDx протоколи не са на вашия сървър, моля, свържете се с вашия местен представител за техническо обслужване, за да получите протоколите. Стъпка 1: Процедура по депарафинизация, рехидратация и Target Retrieval (3 в 1)

За повече информация, моля, направете справка с Ръководството за потребителя на PT Link.

Задайте предварителното загряване и охлаждане на PT Link (Код PT100/PT101) до 65 °C. Задайте загряване до 97 °С за 20 минути. ►Напълнете резервоарите PT Link с по 1,5 L на резервоар от Target Retrieval Solution, Low pH, 1x работен разтвор, за да се покрият тъканните срезове.

►Загрейте предварително Target Retrieval Solution до 65 °C. ►Потопете Autostainer стойките, съдържащи залети FFPE тъканни срезове, в предварително загрят Target Retrieval Solution,

Low pH (1x работен разтвор) в PT Link резервоара. Инкубирайте в продължение на 20 минути при температура от 97 °C. ►Когато инкубирането за прицелно възстановяване е завършено и се постигне охлаждане до температурата до 65 °C, извадете всяка Autostainer стойка за слайдове заедно със слайдовете от PT Link резервоара и веднага поставете Autostainer стойката заедно със слайдовете в резервоар (например PT Link Rinse Station, Код PT109), който съдържа разреден на стайна температура буфер за промивка (Код K8007).

►Инкубирайте слайдовете в разреден на стайна температура буфер за промивка в продължение на 5 минути.

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 5/15

Стъпка 2: Процедура на оцветяване След процедура на депарафинизация, рехидратация и целево възстановяване (3 в 1), стойките Autostainer със слайдове се поставят на Autostainer Link 48. Апаратът ще извърши процеса на оцветяване чрез прилагане на подходящ реагент, наблюдение на времето за инкубация и изплакване на слайдовете между прилагане на отделните реагенти. Времената за реагентите са предварително програмирани в софтуера на Dako Link. Стъпка 3: Контрастно оцветяване Слайдовете трябва да се оцветят контрастно в продължение на 5 минути с Hematoxylin (Link) (Код K8008). Времето за инкубация с Hematoxylin е предварително програмирано в протокола. Стъпка 4: Заливка Изисква се безводна, трайна среда за заливка. Забележка: Може да се появи избледняване на оцветените слайдове в зависимост от няколко фактора, които включват контрастното оцветяване, материалите и методите за заливка и условията за съхранение на слайдовете, но не се ограничават само до това. За да се намали до минимум избледняването, съхранявайте слайдовете на тъмно при стайна температура (20 – 25 °C). Контрол на качеството Реактивите при PD-L1 IHC 22C3 pharmDx се контролират за качество чрез имунохистохимия с помощта на прицелно възстановяване и процедури на оцветяване, описани по-горе. Отклонения в препоръчаните процедури за фиксиране, обработка и включване на тъканите в лабораторията на потребителя могат да предизвикат значителна вариабилност на резултатите. Контроли на качеството трябва да се включват във всеки цикъл на оцветяване. Тези контроли на качеството са посочени в таблица 1 и включват: хистологични препарати от пациенти, оцветени с H&E; доставени от лаборатория тъкани за положителна и отрицателна контрола; и доставен от Dako слайд с контролна клетъчна линия (5). В САЩ за допълнителна информация направете справка с указанията за контрол на качеството на College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry, направете справка и с CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (5, 6, 7). Проверка на анализа Преди първоначалната употреба на система за оцветяване в диагностична процедура потребителят трябва да провери извършването на анализа, като го изследва на серия от тъкани, доставени за лабораторни нужди, с известни IHC работни характеристики, представляващи известни положителни и отрицателни тъкани. Направете справка в процедурите за контрол на качеството, описани в раздела за контрол на качеството по-горе. Тези процедури за контрол на качеството трябва да се повтарят за всяка нова партида на антитяло или при наличие на промяна в параметрите на анализа. Възможностите за отстраняване на неизправности за потенциални проблеми, техните причини и коригиращите предпазни действия са изложени схематично на таблица 10. Интерпретация на точковото оценяване – NSCLC Всички жизнеспособни туморни клетки върху целия слайд трябва да бъдат оценени и включени в оценяването на PD-L1 резултата. Минимум 100 жизнеспособни туморни клетки трябва да присъстват в слайда, оцветен за PD-L1, за препарата, за да се счита за подходящ за оценяване на PD-L1. За да оценят успешно оцветените по PD-L1 IHC 22C3 pharmDx препарати, от критично значение е да бъдат оценени подходящите клетки, да се идентифицира правилната клетъчната локализация и да се интерпретира правилно интензивността на оцветяването. Оценката на слайдовете трябва да се извърши от патолог с помощта на светлинен микроскоп. За оценяване на имунохистохимичното оцветяване и резултата е подходящ обектив с 10 – 40x увеличение. Всяко забележимо оцветяване на мембраните на туморните клетки следва да бъде включено в оценяването. Оценка за частично или пълно оцветяване на клетъчната мембрана (≥1+), което се възприема различно от цитоплазменото оцветяване. Цитоплазменото оцветяване трябва да се разглежда като неспецифично оцветяване и да се изключва при оценяването на интензивността на оцветяване. Нормалните клетки и асоциираните с тумора имунни клетки, като например инфилтриращи лимфоцити или макрофаги, не трябва да бъдат включени при оценяването за установяване на PD-L1 позитивност. Туморните препарати, оцветени с NCR, трябва да имат 0 специфично оцветяване и ≤1+ фоново оцветяване. Оценката на туморната пропорция (TPS) е процентното съдържание на жизнеспособни туморни клетки, показващи частично или пълно оцветяване на мембраната (≥1+). Препаратът трябва да се счита за PD-L1 положителен, ако TPS ≥1% от жизнеспособните туморните клетки проявяват оцветяване на мембраната с каквато и да е интензивност (т.е. ≥1+). За всеки цикъл на оцветяване, слайдовете трябва да бъдат разгледани по реда, представен в таблица 1, за да се определи валидността на цикъла на оцветяване и да бъде осъществена оценка на оцветяването на тъканната проба. Направете справка в Ръководството за интерпретация на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx за допълнителни упътвания. Допълнителни препоръки за интерпретиране на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx оцветяването 1. За да се провери оцветяването на клетъчната мембрана, използвайте обектив с увеличение 10 – 40x. 2. Различни неприцелни елементи, като например асоциирани с тумора имунни клетки (например макрофаги) и строма, могат

също се оцветяват положително за PD-L1, обаче не трябва да бъдат включени в оценяването. Таблица 1. Препоръчван ред за оценяване на слайдове Препарати Обосновка Изисквания 1. H&E (Предоставено за лабораторна употреба)

Оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) на хистологичен препарат се оценява първо, за да се прецени тъканната хистология и качеството на запазване.

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx и H&E оцветяване трябва да се осъществяват на серийни срезове от едно и също парафиново блокче на препарата. Минимум 100 жизнеспособни туморни клетки трябва да присъстват, за да бъде счетен препарата за подходящ за оценяване на PD-L1. Хистологичните препарати трябва да са интактни, добре запазени и

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 6/15

трябва да потвърждават показанието за тумор. 2. Слайд с контролна клетъчна линия (Предоставен от Dako)

Слайдът с контролни клетъчни линии, оцветен с PD-L1 първично антитяло от PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, трябва да се изследва, за да се установи, че всички реагенти функционират правилно. Слайдът с контролни клетъчни линии съдържа пелета с PD-L1-положителна клетъчна линия и пелета с PD-L1-отрицателна клетъчна линия.

Един слайд с контролни клетъчни линии трябва да бъде оцветен с първично антитяло към PD-L1 във всеки цикъл на оцветяване. NCI-H226 (PD-L1-положителна контролна клетъчна линия) критерии за приемане: Оцветяване на клетъчната мембрана на ≥70% от клетките при ≥2+

среден интензитет на оцветяване. Неспецифично оцветяване <1+ интензитет. MCF-7 (PD-L1-отрицателна контролна клетъчна линия) критерии за приемане: Неспецифично оцветяване. Неспецифично оцветяване <1+ интензитет. Имайте предвид, че

понякога може да се наблюдава оцветяване на няколко клетки в клетъчната пелета на MCF-7. Приложими са следните критерии за приемане: наличието на общо ≤10 клетки с отчетливо оцветяване на плазмената мембрана или цитоплазмено оцветяване с ≥1+ интензитет в границите на клетъчна пелета на MCF-7 са приемливи.

Ако която и да е от контролните клетъчни линии не покрива тези критерии, всички резултати при препаратите от пациенти следва да се считат за невалидни.

3. Слайдове от положителна контролна тъкан (Предоставено за лабораторна употреба)

Слайдове от положителна контролна тъкан, оцветените с двете PD-L1 първично антитяло и реагент за отрицателна контрола, следва да бъдат разгледани по-нататък. Тези слайдове проверяват дали методът на фиксиране и процесът на откриване на епитоп са ефективни. Известни положителни контролни тъканите трябва да се използват само за да се следи за правилното изпълнение на обработването на тъкани и тестови реагенти, а НЕ като помощно средство при формулирането на конкретна диагноза на пробите от пациентите.

Контролите следва да са препарати от биопсия/хирургична интервенция за същото показание за тумор, като препарата от пациента, да са фиксирани, обработени и включени възможно най-скоро и по същия начин, както пробата(ите) от пациента(ите). Използвайте интактни препарати за интерпретация на резултатите от оцветяването, тъй като некротични или дегенерирали клетки често се оцветяват неспецифично. Тъканите, избрани за използване като положителни контролни тъкани, трябва да дават слабо до умерено положително оцветяване, когато се оцветяват с PD-L1, за да се помогне в откриването на фините промени в чувствителността на анализа. Две положителни контролни тъкани трябва да бъдат включени във всеки цикъл на оцветяване. Слайдове, оцветени с PD-L1: Трябва да се наблюдава наличие на кафяво оцветяване на плазмената мембрана. Неспецифичното оцветяване трябва да е ≤1+. Слайд, оцветен с реагент за отрицателна контрола: Няма оцветяване на мембраната. Неспецифичното оцветяване трябва да е ≤1+. Ако положителните контролни тъкани не успеят да покажат подходящо положително оцветяване, резултатите от изследваните препарати трябва да се считат за невалидни.

4. Слайдове с отрицателни контролни тъкани (Предоставено за лабораторна употреба)

Слайдове с тъкани за отрицателна контрола (за които се знае, че са отрицателни за PD-L1) оцветени както с PD-L1 първично антитяло, така и с реагент за отрицателна контрола, трябва да бъдат изследвани след това, за да се провери специфичността на обозначаването на целевия антиген чрез първичното антитяло. Като алтернативен вариант отрицателните части от положителната контролна тъкан могат да служат като тъкан за отрицателна контрола, но това трябва да бъде потвърдено от потребителя.

Контролите следва да са препарати от биопсия/хирургична интервенция за същото показание за тумор, като препарата от пациента, да са фиксирани, обработени и включени възможно най-скоро и по същия начин, както пробата(ите) от пациента(ите). Два слайда с тъкан за отрицателна контрола трябва да бъдат включвани във всеки цикъл на оцветяване. Слайдове, оцветени с PD-L1: Няма оцветяване на мембраната в туморни клетки. Неспецифичното оцветяване трябва да е ≤1+. Слайд, оцветен с реагент за отрицателна контрола: Няма оцветяване на мембраната. Неспецифичното оцветяване трябва да е ≤1+. Ако се появи специфично оцветяване на клетъчната мембрана в слайдовете с тъкан за отрицателна контрола, резултатите от препарата на пациента трябва да се считат за невалидни.

5. Слайд с тъкан от пациент, оцветен с използване на Negative Control Reagent

Изследвайте препарати от пациенти, оцветени с отрицателната контрола на реагент от PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Реагент за отрицателна контрола е използван на мястото на първичното антитяло и помага при интерпретация на специфично оцветяване в областта на антигена.

Липса на оцветяване на клетъчната мембрана потвърждава специфичното обозначаване на прицелния антиген чрез първичното антитяло. Неспецифичното оцветяване трябва да е ≤1+.

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 7/15

6. Слайд с тъкан от пациент, оцветен с помощта на PD-L1 първично антитяло

Изследвайте целия слайд от препарати на пациента, оцветен с PD-L1 първичното антитяло от PD-L1 IHC 22C3 pharmDx последно. Направете справка в "Кратко описание и обяснение", "Ограничения" и "Работни характеристики" за конкретната информация относно PD-L1 IHC 22C3 pharmDx имунореактивността.

Интензитета на положителното оцветяване трябва да се оценява в контекста на каквото и да е неспецифично фоново оцветяване, наблюдавано на слайд с реагент за отрицателна контрола на пациента. Както при всеки имунохистохимичен тест, отрицателният резултат означава, че антигенът не е бил установен, а не непременно, че антигенът е отсъствал в анализираните клетки/тъкани. Всички жизнеспособни туморни клетки върху целия PD-L1 оцветен слайд на пациент трябва да бъдат оценени и включени в оценката при отчитането на PD-L1. Минимум 100 жизнеспособни туморни клетки трябва да присъстват, за да бъде счетен препарата за подходящ за оценяване на PD-L1.

Общи ограничения 1. Имунохистохимията е многоетапен диагностичен процес, който изисква специализирано обучение при подбора на

подходящите реагенти, подбора на тъкани, фиксиране и обработка, подготовка на имунохистохимичен слайд и интерпретацията на резултатите от оцветяването.

2. Оцветяването на тъканта зависи от нейната обработка и процеса преди оцветяване. Неправилното фиксиране, замразяване, размразяване, измиване, изсушаване, нагряване, формиране на срезове или замърсяване с други тъкани или флуиди може да доведе до появата на артефакти, имобилизация на антителата или неправилни отрицателни резултати. Противоречивите резултати може да се дължат на разлики в методите за фиксиране и включване или на вродени несиметричности в тъканта.

3. Прекомерното или непълно контрастно оцветяване може да компрометира правилната интерпретация на резултатите. 4. Клиничната интерпретация на определен вид положително оцветяване или неговото отсъствие може да се оцени в

контекста на клиничното представяне, морфологията, както и други хистопатологични критерии. Клиничната интерпретация на определен вид оцветяване или неговото отсъствие трябва да бъде придружена от морфологични изследвания и подходящи контроли, както и от други диагностични изследвания. Квалифицираният патолог, който е запознат с използваните антитела, реагенти и методи, носи отговорност за интерпретацията на оцветения препарат. Оцветяването трябва да се извършва в сертифицирана, лицензирана лаборатория, под наблюдението на патолог, който носи отговорност за прегледа на оцветените слайдове и за гарантиране на съответствието на положителните и отрицателните контроли.

5. Тъкани от лица, заразени с вируса на хепатит В и съдържащи повърхностен антиген на вируса (HBsAg), могат да проявят неспецифично оцветяване с пероксидаза от хрян (7).

6. Реагентите може да покажат неочаквани реакции при типове тъкани, които не са изследвани преди това. Възможността за неочаквани реакции дори в изследвани типове тъкани не може да бъде напълно елиминирана поради биологичната вариабилност на антигенната експресия в неоплазми или в други патологични тъкани. Свържете се с отдел „Техническо поддръжка” на Dako относно документираните неочаквани реакции.

7. Фалшиво положителни резултати могат да се наблюдават поради неимунологично свързване на протеини или продукти на субстратна реакция. Те могат също да бъдат предизвикани от псевдопероксидазна активност (еритроцити) и ендогенна пероксидазна активност (цитохром C) (7).

8. Реагентите и инструкциите, предоставени с тази система, са предназначени за достигане на оптимални резултати. Допълнителното разреждане на реагентите или промяна на времената или температурата на инкубация могат да доведат до неточни или противоречиви резултати.

Специфични ограничения на продукта 1. Неправилни отрицателни резултати се получават от деградация на антиген в тъканите за период от време. Препаратите

трябва да бъдат оцветени в рамките на шест месеца от заливката на тъканите върху слайдове, когато се съхраняват на тъмно при температура 2–8 °С (за предпочитане), или при стайна температура до 25 °C.

2. За оптимални и възпроизводими резултати протеинът PD-L1 изисква предварително третиране с прицелно извличане, когато тъканите са рутинно фиксирани (неутрален буферен формалин) и са включени в парафин.

3. Не заменяйте реагенти от различни партидни номера на този продукт или от набори на други производители. Единственото изключение е EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH 50x, който, ако е необходимо, се предлага като Код K8005.

4. Оцветени контролни клетъчни линии трябва да се използват само за валидиране на цикъл на оцветяване и не трябва да се използват, за да се оцени реакцията на оцветяване в тъканни срезове.

5. Употребата на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx върху тъкани, поставени във фиксатор, различен от формалин, не е проверена. 6. Употребата на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx върху материал от тънкоиглена биопсия не е проверена. Оценяване на клиничния ефект Клиничната полза на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx е изследвана в многоцентрово, отворено, рандомизирано, клинично проучване, проведено, за да се оцени безопасността и ефикасността на KEYTRUDA при пациенти с напреднал NSCLC (9). Пациентите са PD-L1 положителни посредством анализ на клинично изпитване (CTA) и имат прогресия на заболяването след лечение с химиотерапия, съдържаща платина. Пациенти с EGFR или ALK геномни туморни аберации имат прогресиране на заболяването на терапия, одобрена от FDA за тези аберации, преди да получат KEYTRUDA. Пациентите са рандомизирани (1:1:1) да получат 2 mg/kg (брой участници = 344) или 10 mg/kg (брой участници = 346) от KEYTRUDA на всеки 3 седмици или 75 mg/m2 доцетаксел на всеки 3 седмици (брой участници = 343). Оценяване на състоянието на тумора се извършва на всеки 9 седмици. Основните крайни цели за ефикасност са общата преживяемост (OS) и преживяемостта без прогресиране на заболяването (PFS) посредством Критериите за оценка на отговора на солидни тумори, версия 1.1 (RECIST 1.1) въз основа на преглед от независими рентгенолози, незапознати със случаите. Въз основа на CTA общо 1033 пациенти с NSCLC са рандомизирани в проучването. За да се направи оценка на клиничната полза от PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, архивирани проби от клинични проучвания са тествани ретроспективно с PD-L1 IHC 22C3 pharmDx в референтна лаборатория в САЩ. Извън тези 1033 пациенти, туморна тъкан от 529 пациенти е ретроспективно тествана с теста PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Препаратите от 413 пациенти са били положителни за PD-L1 експресия (≥1% от жизнеспособните туморни клетки проявяват оцветяване на мембраната с какъвто и да е интензитет), а проби от 94 пациенти са били отрицателни за PD-L1 експресия (<1% от жизнеспособните туморни клетки проявяват оцветяване на мембраната с какъвто и да е интензитет). В рамките на тези 413 пациенти с положителна експресия на PD-L1, препаратите от 163 от пациентите имат висока PD-L1 експресия (≥50% от жизнеспособните туморни клетки проявяват оцветяване на мембраната с какъвто и да е интензитет).

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 8/15

Нивото на съответствие, постигнато между CTA и PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, е показано в таблица 2. Таблица 2: Съответствие на CTA спрямо PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Проценти на съответствие PD-L1

Гранични стойности

Процент на отрицателно съответствие (95% интервал на достоверност (CI))

Процент на положително съответствие (95% интервал на достоверност (CI))

CTA спрямо PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

TPS 1% 94,5% [91,4% – 96,6%] 80,0% [76,9% – 82,8%] TPS 50% 98,3% [97,1% – 99,0%] 73,2% [67,9% – 77,9%]

Сред рандомизираните пациенти, които са положителни чрез PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, демографските и други характеристики в началото на проучването са добре балансирани между лечебните групи. Средната възраст е 63 години (44% са на възраст 65 години и по-възрастни). Мнозинството от пациентите са от бялата раса (77%) и мъже (58%); изходното функционално състояние по ECOG е 0 (29%) или 1 (71%). Седемдесет и осем процента (78%) от пациентите са бивши/настоящи пушачи. Двадесет и два процента (22%) от пациентите имат плоскоклетъчна хистология и 69% имат неплоскоклетъчна хистология. Изходните и демографските характеристики по същия начин са добре балансирани във всички групи на pembrolizumab и docetaxel в течение на цялото клинично проучване. Резултатите за ефикасност са обобщени в таблица 3. KEYTRUDA демонстрира трайна клинична полза при пациенти с NSCLC с положителна PD-L1 експресията с TPS 1%, която се засилва при пациенти с висока PD-L1 експресия на TPS 50%, както това се демонстрира чрез PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Величината на ползата е сравнима с тази в цялото клиничното изпитване. Таблица 3 обобщава ключовите мерки за ефикасност в цялата популация, положителна за PD-L1 (TPS 1%), и в подгрупата с висока положителна експресия на PD-L1 (TPS 50%) за цялото клинично изпитване (положителна PD-L1 чрез СТА) и в популацията, положителна чрез PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Кривата на Kaplan-Meier за OS (TPS 1%, както е определена чрез PD-L1 IHC 22C3 pharmDx) е показана на фигура 1.

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 9/15

Таблица 3: Повлияване от KEYTRUDA при лекувани преди това пациенти с NSCLC: Цялостно клинично проучване и пациенти, положителни за PD-L1 IHC 22C3 pharmDx: PD-L1 TPS 1% и TPS 50%

Крайна цел KEYTRUDA 2 mg/kg на всеки 3 седмици

KEYTRUDA 10 mg/kg на всеки 3 седмици

Docetaxel 75 mg/m2 на всеки 3 седмици

Клинично изпитване

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Клинично изпитване

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Клинично изпитване

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

TPS 1%

Брой пациенти 344 140 346 142 343 131 OS Смъртни случаи (%) 172 (50%) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Относителен риск* (95% CI)

0,71 (0,58, 0,88)

0,54 (0,37, 0,78)

0,61 (0,49, 0,75)

0,57 (0,39, 0,82)

--- ---

p-стойност† <0,001 <0,001 <0,001 0,00115 --- --- Средна стойност (чрез медиана) в месеци (95% CI)

10,4 (9,4, 11,9)

11,8 (9,6, NA)

12,7 (10,0, 17,3)

12,0 (8,7; NA)

8,5 (7,5, 9,8)

7,5 (6,3, 9,9)

PFS‡ Събития (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Относителен риск* (95% CI)

0,88 (0,73, 1,04)

0,68 (0,50, 0,92)

0,79 (0,66, 0,94)

0,79 (0,59, 1,06)

--- ---

p-стойност† 0,068 0,00578 0,005 0,05767 --- --- Средна стойност (чрез медиана) в месеци (95% CI)

3,9 (3,1, 4,1)

4,9 (4,1, 6,2)

4,0 (2,6, 4,3)

4,0 (2,2, 4,6)

4,0 (3,1, 4,2)

3,8 (2,2, 4,2)

Общ процент на повлияване‡

ORR %§ (95% CI)

18% (14, 23)

24% (17, 32)

18% (15, 23)

20% (14, 28)

9% (7, 13)

5% (2, 11)

TPS 50%

Брой пациенти 139 56 151 60 152 47 OS Смъртни случаи (%) 58 (42%) 18 (32%) 60 (40%) 19 (32%) 86 (57%) 25 (53%) Относителен риск* (95% CI)

0,54 (0,38, 0,77)

0,45 (0,24, 0,84)

0,50 (0,36, 0,70)

0,29 (0,15; 0,56)

--- ---

p-стойност† <0,001 0,00541 <0,001 <0,001 --- --- Средна стойност (чрез медиана) в месеци (95% CI)

14,9 (10,4; NA)

Не е достигнато (9,3; NA)

17,3 (11,8; NA)

Не е достигнато (8,3; NA)

8,2 (6,4, 10,7)

7,2 (4,4, 8,3)

PFS‡ Събития (%) 89 (64%) 33 (59%) 97 (64%) 34 (57%) 118 (78%) 33 (70%) Относителен риск* (95% CI)

0,58 (0,43, 0,77)

0,47 (0,28, 0,80)

0,59 (0,45, 0,78)

0,41+ (0,24, 0,70)

--- ---

p-стойност† <0,001 0,00221 <0,001 <0,001 --- --- Средна стойност (чрез медиана) в месеци (95% CI)

5,2 (4,0, 6,5)

5,9 (4,2, 9,0)

5,2 (4,1, 8,1)

4,8 (2,8, NA)

4,1 (3,6, 4,3)

3,9 (2,0, 4,3)

Общ процент на повлияване‡

ORR %§ (95% CI)

30% (23, 39)

37% (25, 52)

29% (22, 37)

28% (18, 41)

8% (4, 13)

4% (1, 15)

* Съотношение на риска (KEYTRUDA в сравнение с docetaxel) въз основа на стратифицирания пропорционален модел на

риска на Cox † Въз основа на стратифициран логаритмичен рангов тест ‡ Оценено чрез BICR с помощта на RECIST 1.1 § Всички повлияли се са частично повлияни ¶ Въз основа на пациенти с най-добро цялостно повлияване като потвърдено пълно или частично повлияване

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 10/15

Фигура 1: Крива на Kaplan-Meier за обща преживяемост по лечебни групи (TPS 1% чрез PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, популация с намерение за лечение)

Проведени са допълнителни анализи за надеждност, за да се вземе предвид потенциалното въздействие на липсващи данни, появили се при пациенти с положителен резултат на теста с PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, но които могат да са отрицателни чрез CTA. Пациенти с такива резултати от теста са част от популация с предназначение/стремеж за диагноза (ITD) на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx; все пак те са изключени от клиничното изпитване поради отрицателни резултати от CTA скрининг. За да се отразят тези липсващи данни, е проведен анализ на чувствителност, за да се разбере правдоподобния диапазон за съотношението на риска (HR), оценено въз основа на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx в субпопулациите с TPS 1% и с TPS 50% в съответствие с рамката на ITD, за да се провери съгласуваността с наблюдавания HR въз основа на включване в проучването съгласно CTA. Резултатите на анализа за чувствителност на HR показват, че оценките на HR са надеждни за каквото и да е предполагаемо отслабване на лечебния ефект в съответствие с рамката на ITD.

Време в месеци брой участници

Docetaxel 75 mg/m2 Q3W

MK – 3475 2 mg/kg Q3W

MK – 3475 10 mg/kg Q3W

Docetaxel 75 mg/m2 Q3W MK – 3475 2 mg/kg Q3W MK – 3475 10 mg/kg Q3W

Обща преживяемост

(%)

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 11/15

Оценяване на не-клиничния ефект Специфичност на аналитичната чувствителност Аналитичната чувствителност на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx е тествана върху 127 единични случая на FFPE препарати от недребноклетъчен белодробен карцином (NSCLC) в стадий I до IV, като се използва налична на пазара партида. Оценката на PD-L1 експресията демонстрира оцветяване в широк спектър от 0 – 100% положителни туморни клетки и 0 – 3 интензитет на оцветяване. Нормални тъкани: Таблица 4 обобщава имунореактивността на Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 върху препоръчван панел от нормални тъкани. Оцветяване на плазмената мембрана се наблюдава върху имунни клетки и клетки с епителен произход. Оцветяване на цитоплазмата с отбелязано при някои клетъчни типове, но не се отчита като положително оцветяване. Всички тъкани са фиксирани във формалин и включени в парафин и оцветени с PD-L1 IHC 22C3 pharmDx в съответствие с инструкциите в листовката на продукта. Не са наблюдавани неочаквани резултати в изследваните клетъчни типове или типове тъкани. Наблюдаваното оцветяването е в съответствие с докладваната литература за PD-L1 IHC експресия в нормални тъкани (10, 11).

Таблица 4: Кратко описание на реактивността на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx с нормални тъкани Тип тъкан (бр. изследвани)

Положително оцветяване на плазмената мембрана: тъканните елементи

Положително оцветяване на цитоплазмата: тъканните елементи

Неспецифично оцветяване

Бъбрек (3) 1/3 Тубуларен епител 0/3 0/3 Бял дроб (3) 3/3 Алвеоларни макрофаги 0/3 0/3 Главен мозък (3) 0/3 0/3 0/3 Гърда (3) 0/3 0/3 0/3 Далак (3) 2/3 Макрофаги 0/3 0/3 Кожа (3) 0/3 0/3 0/3 Колон (3) 2/3 Макрофаги 0/3 0/3 Костен мозък (3) 3/3 Мегакариоцити 3/3 Мегакариоцити 0/3 Малък мозък (3) 0/3 0/3 0/3 Матка (3) 0/3 0/3 0/3 Мезотелиални клетки (2) 0/2 0/2 0/2 Мускулатура, скелетна (3) 0/2 0/2 0/2 Мускулатура, сърдечна (3) 0/3 0/3 0/3 Надбъбречна жлеза (3) 0/3 1/3 Медуларни клетки 0/3 Нерв, периферен (3) 0/3 1/3 Съединителна тъкан/съдове 0/3 Панкреас (3) 0/3 0/3 0/3 Паращитовидна жлеза (3) 1/3 Жлезист епител 0/3 0/3 Простата (2) 2/2 Епител 0/2 0/2 Сливица (3) (3/3) Епител на криптите

2/3 Герминативен център (макрофаги)

0/3 0/3

Слюнчена жлеза (3) 0/3 0/3 0/3 Стомах (3) 2/3 Лимфоцити

1/3 Стомашни жлези 1/3 Стомашни жлези 0/3

Тестикул (3) 0/3 0/3 0/3 Тимус (3) (3/3) Медуларен епител 0/3 0/3 Тънко черво (3) 0/3 0/3 0/3 Хипофиза (3) 1/3 Предна хипофиза

1/3 Задна хипофиза 1/3 Предна хипофиза 1/3 Задна хипофиза

0/3

Хранопровод (3) 0/3 0/3 0/3 Черен дроб (3) 1/3 Макрофаги

1/3 Хепатоцити 0/3 0/3

Шийка на матката (3) 1/3 Епител 0/3 0/3 Щитовидна жлеза (3) 0/3 0/3 0/3 Яйчник (3) 0/3 0/3 0/3

Неопластична тъкан: Таблица 5 обобщава имунореактивността на Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 върху панел от неопластични тъкани. Оцветяване на плазмената мембрана се наблюдава върху имунни клетки и клетки с епителен произход. Оцветяване на цитоплазмата с отбелязано при някои клетъчни типове, но не се отчита като положително оцветяване. Всички тъкани са фиксирани във формалин и включени в парафин и оцветени с PD-L1 IHC 22C3 pharmDx в съответствие с инструкциите в листовката на продукта. Не са наблюдавани неочаквани резултати в изследваните препарати от тумори. Наблюдаваното оцветяването е в съответствие с докладваната литература за PD-L1 IHC експресия в неопластични тъкани (10-13).

Таблица 5: Кратко описание на реактивността на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx при неопластична тъкан

Тип тумор Локализация PD-L1 положителни/общо N=159

Аденокарцином

Бял дроб 1/4 ГИ, с метастази в бял дроб 0/1 Глава и шия, твърдо небце 0/1 Гърда, DCIS 0/2 Гърда, инвазивен дуктален 0/7 Гърда, инвазивен дуктален с метастази в лимфен възел

0/1

Жлъчен мехур 1/5 Колон 0/5 Колон, муцинозен 0/1 Колон, с метастази в черен дроб 0/1 Матка, ендометриум 0/3 Матка, светлоклетъчен 0/1 Панкреас 0/2 Панкреас, дуктален 0/3 Приложение 0/1

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 12/15

Тип тумор Локализация PD-L1 положителни/общо N=159

Простатен 0/5 Ректум 0/4 Слюнчна/паротидна жлеза 0/2 Стомах 0/6 Стомах, муцинозен 0/1 Тънко черво 0/2 Хранопровод 0/1 Шийка, ендоцервикален тип 0/1 Щитовидна жлеза, папиларен 0/3 Щитовидна жлеза, фоликуларен 0/1 Щитовидна жлеза, фоликуларен-папиларен 0/1 Яйчник 0/1 Яйчник, ендометриален 0/1 Яйчник, муцинозен 0/1 Яйчник, серозен 0/1

Аденокортикален карцином Надбъбречна жлеза 0/1 Астроцитом Главен мозък 0/3 Базалноклетъчен карцином Кожа 0/1 Бъбречноклетъчен карцином Папиларен Бъбрек 0/1 Светлоклетъчен Бъбрек 0/6 Глиобластом Мозък 0/1 Дребноклетъчен карцином Бял дроб 0/1 Ембрионален карцином Тестикули 0/1 Епендимом Мозък 0/1

Интерстициалом Колон 0/1 Ректум 0/1 Тънко черво 0/1

Карцином Назофарингеален, NPC 0/1

Карцином с клетки тип "пръстен с камък"

Карцином на колона с клетки тип "пръстен с камък" с метастази в яйчника

0/1

Колон 0/1

Лейомиосарком Меки тъкани, гръдна стена 0/1 Пикочен мехур 0/1

Лимфом Анапластичен голямоклетъчен Лимфен възел 0/1 Дифузен B-клетъчен Лимфен възел 0/4 Неходжкинов Лимфен възел 1/1 Ходжкин Лимфен възел 2/2 Медуларен карцином Щитовидна жлеза 0/1 Медулобластом Мозък 0/1 Мезотелиом Перитонеум 0/1 Меланом Носна кухина 0/1

Ректум 0/1 Менингиом Мозък 0/2 Невробластом Ретроперитонеум 0/1 Неврофибром Меки тъкани, долна част на гърба 0/1 Остеосарком Кости 0/2

Плоскоклетъчен карцином

Бял дроб 1/2 Глава и шия 0/2 Кожа 0/2 Матка 0/1 Плоскоклетъчен карцином на хранопровода с метастази в лимфен възел

0/1

Хранопровод 0/7 Шийка 2/5

Преходноклетъчен карцином Бъбрек 0/1 Пикочен мехур 0/6

Примитивен невроектодермален тумор (PNET)

Ретроперитонеум 0/1

Рабдомиосарком Меки тъкани, ембрионален 0/1 Простатен 0/1 Ретроперитонеум 0/1

Семином Тестикули 0/2

Синовиален сарком Тазова кухина 0/1 Сперматоцитом Тестикули 0/2 Тимом Медиастинум 1/1 Тумор на островните клетки Панкреас 0/1 Феохромоцитом Надбъбречна жлеза 0/1 Хепатобластом Черен дроб 0/1 Хепатоклетъчен карцином Черен дроб 0/5 Хондросарком Кости 0/1 Хордом Тазова кухина 0/1

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 13/15

Повторяемост/външна възпроизводимост Повторяемостта и възпроизводимостта на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx са оценени при Dako и три външни центъра за изследване. Данните от изпълнението са представени на таблици 6 – 9. При проучванията за повторяемост, извършени при Dako, отрицателен процент на съответствие (NPA), положителен процент на съответствие (PPA) и цялостно съответствие (OA) се установяват за границата ≥ 1% и за границата ≥ 50%, както е показано в таблица 6 и на таблица 7. Тъй като проучванията за повторяемост водят до 100% съответствие, интервалите на достоверност са изчислени с помощта на метода за оценка на Wilson въз основа на броя на независимите сравнения по двойки. При външните проучванията за възпроизводимост отрицателен процент на съответствие (ANA), положителен процент на съответствие (APA) и процент на цялостно съответствие (OA) се установяват за границата ≥ 1% и за границата ≥ 50%, както е показано по-долу в таблица 8 и на таблица 9. Средните съответствия са изчислени, тъй като не съществуват естествени източници в параметрите за възпроизводимост, като например център и наблюдател. Интервали на достоверност за средните съответствия са пресметнати с помощта на "бутстрап" метод на персентилите. (Отбележете, че проучванията за повторяемост не са анализирани с помощта на модифицирани интервали на достоверност, тъй като гореспоменатите не могат да се пресмятат върху данни с нулево несъответствие.) Таблица 6: Повторяемост на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx при изследване в един център (≥1%)

Проучване за повторяемост

Диагностична граница Дизайн на проучването % Съответствие (95% CI)

Между отделни апарати

≥1% Всеки от 16 препарата с NSCLC (8 PD-L1-отрицателни и 8 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван върху всеки от шестте Autostainer Link 48 апарата.

NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Между отделните оператори

≥1% Всеки от 16 препарата с NSCLC (8 PD-L1-отрицателни и 8 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван, като са използвани шестима анализатори, работещи с един Autostainer Link 48 апарат.

NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Между отделни дни

≥1% Всеки от 16 препарата с NSCLC (8 PD-L1-отрицателни и 8 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван през шест непоследователни дни върху един Autostainer Link 48 апарат.

NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Между отделни партиди ≥1% Всеки от 16 препарата с NSCLC (8 PD-L1-отрицателни и 8 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван при три повторни изследвания и с всяка от три различни партиди реагенти върху Autostainer Link 48 апарат.

NPA 98,6% (96,0-100%) PPA 98,6% (95,7-100%) OA 98,6% (95,8-100%)

В рамките на един работен цикъл

≥1% Всеки от 16 препарата с NSCLC (8 PD-L1-отрицателни и 8 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван с шест повторения в рамките на един работен цикъл на Autostainer Link 48 апарат.

NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

В рамките на един ден ≥1% Всеки от 16 препарата с NSCLC (8 PD-L1-отрицателни и 8 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван при два работни цикъла в рамките на един ден, като това е повтаряно в течение на три дни, върху Autostainer Link 48 апарат.

NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

NPA= Процент на отрицателно съответствие; PPA= Процент на положително съответствие; OA=Цялостно съответствие Таблица 7: Повторяемост на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx при изследване в един център (≥50%)

Проучване за повторяемост

Диагностична граница Дизайн на проучването % Съответствие (95% CI)

Между отделни апарати

≥50% Всеки от 16 препарата с NSCLC (10 PD-L1-отрицателни и 6 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван върху всеки от шестте Autostainer Link 48 апарата.

NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Между отделните оператори

≥50% Всеки от 16 препарата с NSCLC (10 PD-L1-отрицателни и 6 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван, като са използвани шестима анализатори, работещи с един Autostainer Link 48 апарат.

NPA 100% (92,7-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Между отделни дни

≥50% Всеки от 16 препарата с NSCLC (10 PD-L1-отрицателни и 6 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван през шест непоследователни дни върху един Autostainer Link 48 апарат.

NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Между отделни партиди ≥50% Всеки от 16 препарата с NSCLC (8 PD-L1-отрицателни и 8 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван при три повторни изследвания и с всяка от три различни партиди реагенти върху Autostainer Link 48 апарат.

NPA 100% (92,6-100%) PPA 100% (92,6-100%) OA 100% (96,2-100%)

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 14/15

Проучване за повторяемост

Диагностична граница Дизайн на проучването % Съответствие (95% CI)

В рамките на един работен цикъл

≥50% Всеки от 16 препарата с NSCLC (10 PD-L1-отрицателни и 6 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван с шест повторения в рамките на един работен цикъл на Autostainer Link 48 апарат.

NPA 100% (92,9-100%)PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

В рамките на един ден ≥50% Всеки от 16 препарата с NSCLC (10 PD-L1-отрицателни и 6 PD-L1-положителни) с диапазон на експресия на PD-L1 IHC е тестван при два работни цикъла в рамките на един ден, като това е повтаряно в течение на три дни, върху Autostainer Link 48 апарат.

NPA 100% (88,3-100%)PPA 100% (82,4-100%) OA 100% (92,4-100%)

NPA= Процент на отрицателно съответствие; PPA= Процент на положително съответствие; OA=Цялостно съответствие

Таблица 8: Повторяемост на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx при изследване в три външни центъра (≥1%) Проучване за

възпроизводимост Диагностична

граница Дизайн на проучването % Съответствие (95% CI) Между отделни центрове

≥1% Всеки един от 36 препарата с NSCLC (16 PD-L1-отрицателни и 20 PD-L1-положителни) с диапазон на PD-L1 IHC експресия е изследван през пет непоследователни дни. Анализът между отделните центрове е извършен между три центъра върху общо 2700 сравнения по двойки.

ANA 94,8% (90,3 – 98,4%)APA 95,5% (91,2 – 98,7%) OA 95,2% (90,8-98,6%)

Вътре в един център ≥1% Всеки един от 36 препарата с NSCLC (16 PD-L1-отрицателни и 20 PD-L1-положителни) с диапазон на PD-L1 IHC експресия е изследван през пет непоследователни дни при един от трите центъра по проучването. Анализът вътре в един център е извършен за три центъра върху общо 1080 сравнения по двойки.

ANA 96,2% (94,1-97,5%)APA 96,7% (95,0-97,9%) OA 96,5% (95,2-97,4%)

Между отделни наблюдатели

≥1% Оценяване на 62 препарата от NSCLC (28 PD-L1-отрицателни и 34 PD-L1-положителни) с диапазон на PD-L1 IHC експресия, оцветени с PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, е извършено от трима патолози, по един във всеки от трите центъра по проучването през три непоследователни дни. Анализът между отделните наблюдатели е извършен между три центъра върху общо 1674 сравнения по двойки.

ANA 85,8% (79,3-91,8%)APA 88,2% (82,2-93,3%) OA 87,1% (81,0-92,6%)

При един наблюдател ≥1% Оценяване на 62 препарата от NSCLC (28 PD-L1-отрицателни и 34 PD-L1-положителни) с диапазон на PD-L1 IHC експресия, оцветени с PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, е извършено от трима патолози, по един във всеки от трита центъра по проучването, през три непоследователни дни. Анализът при един наблюдател е извършен за три центъра върху общо 558 сравнения по двойки.

ANA 93,7% (90,0-96,1%)APA 94,8% (91,6-96,7%) OA 94,3% (92,0-95,9%)

ANA=Средно отрицателно съответствие; APA=Средно положително съответствие; OA=Цялостно съответствие

Таблица 9: Повторяемост на PD-L1 IHC 22C3 pharmDx при изследване в три външни центъра (≥50%) Проучване за

възпроизводимост Диагностична

граница Дизайн на проучването % Съответствие (95% CI) Между отделни центрове

≥50% Всеки един от 36 препарата с NSCLC (21 PD-L1-отрицателни и 15 PD-L1-положителни) с диапазон на PD-L1 IHC експресия е изследван през пет непоследователни дни. Анализът между отделните центрове е извършен между три центъра върху общо 2700 сравнения по двойки.

ANA 90,3% (84,4-95,2%)APA 85,2% (75,6-92,9%) OA 88,3% (81,4-94,3%)

Вътре в един център ≥50% Всеки един от 36 препарата с NSCLC (21 PD-L1-отрицателни и 15 PD-L1-положителни) с диапазон на PD-L1 IHC експресия е изследван през пет непоследователни дни при един от трите центъра по проучването. Анализът вътре в един център е извършен за три центъра върху общо 1080 сравнения по двойки.

ANA 91,9% (88,8-94,8%) APA 87,6% (82,5-92,2%) OA 90,2% (86,3-93,7%)

Между отделни наблюдатели

≥50% Оценяване на 62 препарата от NSCLC (30 PD-L1-отрицателни и 32 PD-L1-положителни) с диапазон на PD-L1 IHC експресия, оцветени с PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, е извършено от трима патолози, по един във всеки от трите центъра по проучването през три непоследователни дни. Анализът между отделните наблюдатели е извършен между три центъра върху общо 1674 сравнения по двойки.

ANA 92,6% (87,8-96,7%)APA 92,8% (88,1-96,8%) OA 92,7% (88,1-96,8%)

При един наблюдател ≥50% Оценяване на 62 препарата от NSCLC (30 PD-L1-отрицателни и 32 PD-L1-положителни) с диапазон на PD-L1 IHC експресия, оцветени с PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, е извършено от трима патолози, по един във всеки от трита центъра по проучването, през три непоследователни дни. Анализът при един наблюдател е извършен за три центъра върху общо 558 сравнения по двойки.

ANA 96,4% (94,0-98,5%)APA 96,5% (94,3-98,6%) OA 96,4% (94,3-98,6%)

ANA=Средно отрицателно съответствие; APA=Средно положително съответствие; OA=Цялостно съответствие

P03928BG_03/SK00621-2/2016.11 стр. 15/15

Отстраняване на неизправности Таблица 10: Отстраняване на неизправности Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 1. Без оцветяване на слайдове 1a. Грешка при програмиране.

1a. Потвърдете, че програмата PD-L1 IHC 22C3 pharmDx е избрана за програмиране на слайдовете.

1b. Липса на реакция с DAB+ субстрат-хромогенен разтвор (DAB)

1b. Уверете се, че DAB+ субстрат-хромогенният разтвор е приготвен правилно.

1c. Натриев азид в буфер за промивка. 1c. Използвайте само Dako Wash Buffer (Код K8007). 1d. Деградация на контролен слайд 1d. Проверете срока на годност и условията за

съхранение на комплекта върху външната страна на опаковката.

2a. Слабо оцветяване на слайдове от препарат.

2a. Използван е неподходящ метод на фиксиране.

2a. Уверете се, че са използвани само одобрени фиксатори и методи на фиксиране.

2b. Слабо оцветяване на слайдове от препарат или положителна клетъчна линия на предоставения от Dako контролен слайд.

2b. Неадекватно целево възстановяване.

2b. Уверете се, че процедурата за предварително третиране 3 в 1 е правилно извършена.

3. Прекомерно фоново оцветяване на слайдовете.

3a. Парафинът не е отстранен напълно.

3a. Уверете се, че процедурата за предварително третиране 3 в 1 е правилно извършена.

3b. Слайдовете са изсъхнали, докато се зареждат на Autostainer Link 48.

3b. Уверете се, че слайдовете се запазват навлажнени с буфер, докато се зареждат и преди започването на работен цикъл.

3c. Неспецифично свързване на реагенти към тъканни срезове.

3c. Проверете за правилното фиксиране на пробата и/или наличието на некроза.

4. Тъканта се отделя от слайдовете. 4. Употреба на неправилни микроскопски слайдове.

4. Използвайте Dako FLEX IHC микроскопични слайдове (Код K8020) или заредени слайдове (като например Fisherbrand Superfrost Plus).

5. Прекомерно силно специфично оцветяване.

5a. Използван е неподходящ метод на фиксиране.

5a. Уверете се, че са използвани само одобрени фиксатори и методи на фиксиране.

5b. Използван е неподходящ буфер за промивка.

5b. Използвайте само Dako Wash Buffer (Код K8007).

6. Target Retrieval Solution става мътен на вид, когато се загрява.

6. Когато се загрява Target Retrieval Solution става мътен.

6. Това е нормално и не оказва влияние върху оцветяването.

ЗАБЕЛЕЖКА: Ако проблемът не може да бъде отнесен към някоя от горепосочените причини или ако предложението за корективни действия не реши проблема, моля, свържете се с отдел „Техническа поддръжка“ на Dako за допълнително съдействие. Допълнителна информация относно техники за оцветяване и приготвяне на препарат може да се намери в ръководството за обучение на Dako: Immunohistochemical Staining Methods (Методи за имунохистохимично оцветяване) (5) (на разположение от Dako). Източници 1. Keytruda® package insert. 2. R. Phelps, et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplement (1996) 24:32-91. 3. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures

for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976.

4. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2000.

5. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013.

6. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999.

7. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B s surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626.

8. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. New Eng J Med 2015; 372:2018-28.

9. Herbst RS, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet online 2015 Dec 19.

10. Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunol 2007(19); 7:813. 11. Brown JA, Dorfman DM, Ma F-R, Sullivan EL, Munoz O, Wood CR, et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on Dendritic

Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production. J Immunol 2003; 170:1257. 12. Cooper WA, Tran T, Vilain RE, Madore J, Seliger CI, Kohonen-Cornish M, et al. PD-L1 expression is a favorable prognostic factor

in early stage non-small cell carcinoma. Lung Cancer 2015; 89:181. 13. Chen B, Chapuy B, Ouyang J et al. PD-L1 Expression Is Characteristic of a Subset of Aggressive B-cell Lymphomas and Virus-

Associated Malignancies. Clin Cancer Res 2013; 19:3462-3473.

Каталожен номер Ограничение на температурата Медицинско изделие за ин-витро диагностика

Производител Код на партидатаСъдържанието е достатъчно за извършване на <n> теста

Използвайте доНаправете справка с указанията за употреба

Оторизиран представител в Европейската общност

PT0020/ Rev C

Dako North America, Inc.6392 Via RealCarpinteria, California 93013 USA

Tel 805 566 6655Fax 805 566 6688Technical Support 800 424 0021Customer Service 800 235 5763

Dako Denmark A/SProduktionsvej 42DK-2600 Glostrup Denmark

Tel +45 4485 9500Fax +45 4485 9595

www.dako.com

Издание 11/16