PCR primer design

Methee Sriprapun, PhD

(Principle and how to design primers)

Sriprapun.m@gmail.com

Objective of primer usage

• เพอใชสรางสาย cDNA เพอน าไปใชในปฏกรยา PCR • เปนจดเรมตนในการสงเคราะห DNA สายใหม

• เปนจดเรมตนในการท า DNA sequencing

http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/sequencing.html http://kem-en-tec-nordic.com/pcr-page/

Types of primer

• Oligo dT (16-20 T primer) primes at the poly-A tail of mRNA • Random hexamers: Total RNA template for cDNA • Gene specific primer: usually uses reverse primer

http://www.thermoscientificbio.com/general-reagents-and-accessories/primers-for-cdna-synthesis/

http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/cDNAproduction.html

General guidelines for primer design

• ขนาดของ primers ควรมความยาว 18-30 bp • เบส GC ใน primer แตละเสนควรมประมาณ 40-60%

• Tm ของ primer แตละเสนควรอยในชวง 55-66 C และ primers ทง 2 เสนควรมอณหภมตางกนไมเกน 2 C

• ปลาย 3’ ของ primer แตละเสนควรม G or C แตไมควรเกน 2 ตวในสวนทเปน 5 base สดทาย

• หลกเลยงการออกแบบทมเบสซ ากนหลายๆ ตว ( 3 or more) • หลกเลยงการเกด mismatch ระหวาง primer กบ template บรเวณ 3’end

General guidelines for primer design (II)

• หลกเลยง secondary structure ไดแก - Hairpin - Self-complementary (primer จบกนเองเชน F-F) - Primer-dimer

3’ 5’ DNA template

5’ 3’ ปลาย 3’ ของ primer ตองใส

• ตองตรวจสอบ primers ทออกแบบวามความจ าเพาะหรอไม blast กบ database • เมอออกแบบแลว F primer: ใชไดเลย • แต R primer: จะตองท า reverse complement กอนจง blast หรอสงสงเคราะห primer • ยกเวนบางโปรแกรมท reverse complement ใหเลยเชน

Primer-BLAST • ถา design for qPCR: PCR product ตองไมเกน300 bp)

General guidelines for primer design (III)

Avoid secondary structure

• Hairpin loop • Self-complementary

• Primer-dimer

https://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/seq_anal/primer_design/primer_design.htm

http://www.nature.com/nprot/journal /v1/n3/fig_tab/nprot.2006.247_F2.html

Calculation of Tm and annealing temperature

• Tm เปนอณหภมทท าให dsDNA ssDNA 50%

Tm= 2 x (no. of [A+T]) + 4 x (no. of [G+C])

Annealing temp. = Tm of primer - 5 http://www.gravitywaves.com/chemistry/CHEMXL153/NucleotidesCompandStruc.htm

Tm calculation quiz Tm= 2 x (no. of [A+T]) + 4 x (no. of [G+C])

Annealing temp. = Tm of primer - 5

Sequence Tm (C)

Annealing Temp. (C)

5’ GAT TAC TTG GGC AAG GCC GA 3’ 62 57 5’ ATG GGC AAT AAT TTG GGA 3’ 50 45

5’ ATT GGC AAG TTG AAG GCG GGG 3’ 64 59 5’ TTG TTG AAG AGC CCC GGA C 3’ 60 55

Reverse complement • Reverse: change nt. sequence from (5’3’) to (3’5’) • Complement with the reversed sequence • ทศทางของสายเหมอนเดม เปลยนแคล าดบ sequence • กระท าท sequence ในแตละสายเทานน (ทศการอานคงเดม)

5’CTCCAAGCTCCAAGCTCCAG 3’

Reverse: 5’GACCTCGAACCTCGAACCTC 3’

Complement: 5’CTGGAGCTTGGAGCTTGGAG 3’

ดงนนสาย reverse complement ทไดคอ :………………………………..

Courier New เปน font ทเหมาะในการพมพ sequence ทสด

How to design primers

1. Manual design

- น า sequence มาเลอกต าแหนงเอง

- น ายนทสนใจทงหมดมา alignment เลอกต าแหนงท conserve ( Universal primers) - จากนนจงน าเขาโปรแกรมตรวจสอบลกษณะของ primers เชน ความยาว, %GC, Tm, specificity to DNA target, etc. - จะเหมาะในงาน multiplex PCR หรอการออกแบบ probe ในงาน บางอยาง

Multiple sequence alignment for primers and probe design

Universal primers for PCR assay

How to design primers (II)

1. Program design

- ใชโปรแกรมชวยออกแบบ primers ตางๆ

- สะดวก รวดเรว ประหยดเวลา สามารถตงคาตางๆ ไดมาก - ไมเหมาะในการออกแบบ primers ทท า multiplex PCR - ปจจบนม program ชวยออกแบบ probe for qPCR - ไมสามารถออกแบบ primers ทมการ modified ทปลาย 5’ ได

Program for primer design

(Abd-Elsalam KA, Afr J Biotechnol 2003)

Primer design with Primer-BLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

• Developed by NCBI

• Primer3 to design PCR primers + BLAST and global alignment algorithm to screen primers

Primer-BLAST

• Primer design & BLAST primers with sequences in database • เมอม primers อยแลวแตไมทราบขนาด PCR product ตรวจสอบได • เมอม primers อยแลว BLAST ดการจบของ primers กบ template ได • ขอเสย: เนองจากโปรแกรมตองท าการ Blast หลงออกแบบ

primers ใชเวลานาน

How to use primer-BLAST

• เลอกยนทตองการออกแบบ primer ควรเลอกทเปน mRNA เพอหลกเลยงการ design ตรงสวน exon (ด organism ดวย) หรออาจเลอกยนของ pathogens ทตองการออกแบบ

• น า sequence ทสนใจ (อาจเปน FASTA, sequence อยางเดยว หรอ Accession No.) ใสโปรแกรม

• ตงคา parameter ตางๆ แลว กด Get primers

• พจารณา primers โดยดจากคา Tm, self-complementary, GC content, etc.

• Sequence ของ primers ทง 2 เสน สามารถใชไดเลยไมตอง reverse complement

ตวอยาง ตองการออกแบบ primer เพอตรวจหายน -actin ของคน โดยใหม Tm = 60C PCR product 100-300 bp

เลอกยน -actin (human) จาก NCBI

น า sequence หรอ accession No. ใสตรงชอง PCR template

ใสหรอไมกได

ตงคา parameter ตางๆ ไดแก ขนาด PCR product และ Tm ของ primers

เปลยนเปน nr

จะใสหรอไมกได

จากนนกด Get Primers

Result

จ านวน primers ท design ออกมาไดทงหมด 5 ค

ผลทได 1. ขอมล primers และ parameters ตางๆ 2. ขนาด PCR product 3. ผล blast วา primers จบจ าเพาะกบ สงทตองการหรอไม

How to check secondary structure

OligoCalc

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

Copy sequence primer แตละเสนวางตรงน

เลอกใหเปน ssDNA

กด calculate

ตวอยางลองเอาเสน F และ R primers จากการออกแบบมาทดสอบด

Result

ได reverse complement sequence

ไดคา parameters ตางๆ

Click เพอด secondary structure

Result

Primer design with Primer3

• Online program: ปจจบนมทง Primer3 และ Primer3Plus • Primer3Plus มการพฒนาในเรองประสทธภาพของการท างาน (แตการใชโปรแกรมทง 2 ไมตางกน)

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/

ใส sequence ทตองการออกแบบ primer

กดเพอให โปรแกรม design

ตงคา parameters ตางๆ (ปกตตงแคตรงนพอ ทเหลอใชคา default)

ตวอยาง ตองการออกแบบ primer เพอตรวจหายน -actin ของคน โดยใหม Tm = 60C PCR product 100-300 bp

เลอกยน -actin (human) จาก NCBI

น า sequence ใสในชองวางทมลกศร หรอ upload FASTA file of interested sequence

ตงคา parameter ตางๆ ไดแก ขนาด PCR product และ Tm ของ primers

จากนนกด Pick Primers

โปรแกรมบอกรายละเอยดของ primers เชน Tm, %GC ขอมล secondary structure, product size

ใหขอมลต าแหนง ของ primers บน sequence

ทเราน ามาออกแบบ

ขอมล primers อนๆ ประกอบการพจารณา ของผใชงาน

ถาตองการ primers ชดไหน กกด Send to Primer3 Manager ไดเลย

ตองการ Blast กบ GenBank (แตเปนการ blast ทละเสน)

ถาตองการ check การจบกนของค primers วาจ าเพาะกบยนทตองการหรอไมสามารถ copy sequences ไปท Primer-BLAST ได (แตอาจใชเวลานาน)

ใสตรงน

เปลยนเปน nr

จะใสหรอไมกได (organism)

จากนนกด Get Primers

ถาตองการ check secondary structure เพมเตม Program OligoCalc Primers ทไดสามารถ Order ไดเลยไมตอง reverse complement ขอด: รวดเรว ประหยดเวลา ขอเสย: Blast primer ไดทละเสนเทานน ถาจะดการจบของ primers ตองใช อกโปรแกรมหนงชวย

Tips for consideration

• Program for primer design tool for prediction of primers • ผลการออกแบบ primers อาจใชไมได 100% ในการท างานจรง • Primers คแรกมกเปน primers ทดทสดทโปรแกรมเลอกให • Program for primer design เปนเหมอนเขมทศ และ tool ทอ านวยความสะดวก และ ลดระยะเวลาการท างานเทานน

• ตองมการ Optimization PCR ในการท างานจรงเสมอ !

Primer design at a glance

เลอกสงมชวต และ/หรอ ยนทสนใจจากฐานขอมลตางๆ เชน GenBank, EMBL, DDBJ, etc.

Download sequence ในรป FASTA หรอจดจ า Accession No. ของยนนน

น า sequence ไปออกแบบกบโปรแกรม Primer design ทไดเลอกไวหรอท าการออกแบบ โดยวธ manual (ถาเปน universal primer multiple sequence alignment เลอก conserve sequence)

เลอก primers ตาม condition ทผใชตองการ

พจารณา primers วาตรงตาม Guidelines of primer design หรอไม

ตรวจความถกตองของ sequence primer จากนนสงสงเคราะห primers

น ามาใชจรงกบงาน PCR หรอ RT-PCR รวมถง try condition กบ น ายาทใช

โดย: ทนพ.ดร. เมธ ศรประพนธ