Original Article | Iran J Med Microbiol. 2019; 13(5): 346-354

Year 13, Issue 5 (November & December 2019) Iranian Journal of Medical Microbiology

Iranian Journal of Medical Microbiology | ISSN:2345-4342

Optimized Method for Isolation of Nontuberculous Mycobacteria from

Hospital Aquatic Sources

Somayeh Moradi1, Mohammad Javad Nasiri2, Masoud Dadashi3, and Davood Darban-Sarokhalil1

1. FoDepartment of Microbiology, School of Medicine, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

2. Department of Microbiology, School of Medicine, Shahid beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran

3. Department of Microbiology, School of Medicine, Alborz University of Medical Sciences, Karaj, Iran

10.30699/ijmm.13.5.246

ABSTRACT

Background: Aquatic ecosystems are an important source of nontuberculous mycobacteria (NTM) that can cause different diseases in human. Since culture of mycobacteria needs long-term incubation, fast-growing microorganisms and contaminants in the environment usually prevents the isolation of mycobacteria. Here, we compare different treatment protocols and describe a method that increases the recovery and improve the culturability of NTM from aqueous samples.

Materials & Methods: A total of 35 samples from the water sources like tap water, and medical devices such as manometer, dialysis devices, nebulizers, ventilator and dental units were collected. Containers containing 50 mL of the sample were immediately transferred for culture on Lowenstein-Jensen medium to the laboratory and examined. For better isolation of NTM, different concentrations of NaOH, sodium dodecyl sulphate (SDS), cetylpyridinium chlorid (CPC), oxalic acid and cyclohexamide in culture media were examined.

Results: Culture media with 1% solution of NaOH, 3% SDS and 5% oxalic acid was completely effective to eliminate the contaminants and it also showed the lowest inhibitory effect on mycobacteria. The concentrations between 0.3 gr to 1 gr of cyclohexamide had the best inhibitory effect on growth of fungi.

Conclusion: Culture media with NaOH 1%, SDS 3%, 5% of oxalic acid and 0.3-1 gr cyclohexamide can increase the recovery and improve the culturability of NTM from aqueous samples.

Keywords: Nontuberculous mycobacteria, Hospital water sources, Isolation protocols

Received: 2019/09/22; Accepted: 2020/01/12; Published Online: 2020/01/27

Corresponding Information: Davood Darban-Sarokhalil, Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran.

Email: davood_darban@yahoo.com

Copyright © 2019, This is an original open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-noncommercial 4.0 International License which

permits copy and redistribution of the material just in noncommercial usages with proper citation.

Use your device to scan and read the article online

Introduction

Nontuberculous mycobacteria (NTM) are opportunistic pathogens for humans. More than 160 species of Mycobacterium genus have been recognized and they have high variability in the aspects of virulence, adaptation to the environment, pathogenicity, drug resistance and growth characteristics (1). A variety of NTM often widely dispersed in the environment can cause opportunistic infections in human (2-4).

Environmental resources including water, soil, dust and aerosol (5) and in many cases, water is a carrier of the bacteria. Most NTM infections can cause disease through contact with soil and water resources and human-to-human transmission is not reported until now [6]. Although the contact between the human and environmental mycobacteria is inevitable, the disease by NTM mostly related with skin defect, having previous

Gholizadeh-Hashjin A, lotfipour F, Hallaj-Nezhadi S. Quality Control of Non-Sterile Drug Product According to United States’ Pharmacopeia Instruction. Iran J Med Microbiol. 2019; 13 (5) :321-345

Download citation: BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks Send citation to: Mendeley Zotero RefWorks

Somayeh Moradi et al. 347

Year 13, Issue 5 (November & December 2019) Iranian Journal of Medical Microbiology

lung disease and disorders such as congenital and acquired immunodeficiency.

These bacteria are mostly resistant to antibiotics, antiseptics and disinfectants and are also considered as nosocomial pathogen (7). Currently, more than 20 NTM species have been identified in drinking water that are resistant to disinfectants (such as chlorine) and also tolerate a wide range of pH and temperature. In addition, NTM can survive in pipes containing flowing water due to biofilm formation, their hydrophobicity and amoeba-associated lifestyle (5, 8-13). The bacteria also were isolated from hot water systems, spas and swimming pools. Since culture of mycobacteria needs long-term incubation, fast-growing microorganisms and contaminants in the environment usually prevents the isolation of mycobacteria. For this reason, different treatment protocols were examined to increase the recovery and improve the culturability of NTM from aqueous samples.

Materials and Methods

Sample Collection

A total of 35 samples from the aquatic sources of the teaching hospitals of Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran, including tap water and medical devices such as manometer, dialysis devices, nebulizers, ventilator and dental units were collected. Approximately 50 mL of each sample was collected in a sterile glass bottle, transferred to laboratory in an icebox and examined within 24 hrs.

Sample Preparation and Culture

Water samples were centrifuged for 30 minutes at 3000 rpm. The sediment (3 mL) was transferred to two sterile containers, and was decontaminated by two methods. The first method was implemented as following: 1.5 mL of 1% NaOH and 1.5 mL of 3% SDS were added for decontamination after centrifuge and were incubated at room temperature for 30 minutes. Then, Phenolphthalein reagent and 40% phosphoric acid were added for neutralization. The tubes were then centrifuged at 3000 rpm. Supernatant was discarded and the pellet was cultured on two separate tubes containing Lowenstein Jensen (LJ) media which were then placed at 25°C and 37°C. Second method was as following: 0.05% CPC solution (cetylpyridinium chloride) with a volume equal to the sample was added after centrifugation. Samples were shaked for 20 minutes at room temperature and then centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes and supernatant was discarded. Then, 2 mL of distilled water was added to the pellet for neutralization of the remaining CPC and was further centrifuged at 3000 rpm. Finally, pellet was cultured on two separate tubes of LJ media and placed at 25°C and 37°C. Culture media were studied every 48

h for 5 months for the possible growth of colonies. Then, Acid-fast staining was performed by Ziehl-Neelsen method which confirmed the presence of Mycobacteria. Phenotipycal characteristics and molecular method were used for confirmation (14). For high contamination of samples with yeast and fungi, different concentrations of cyclohexamide were added to LJ media for primary isolation of the bacteria. Different cyclohexamide concentrations were 0.025 g, 0.05 g, 0.06 g, 0.64 g, 0.2 g, 0.3 g, 0.5 g and 1 g, were used for each 1600cc of LJ culture media.

Another treatment protocol was conducted for the isolation of colonies on contaminated LJ culture media with other bacteria or fungi by following four methods: First protocol; Mixed colonies were picked off and dissolved in 200 µL of distilled water in a sterile falcon. Then, CPC with the volume equal to the sample was added and vortexed. It was then shaken at room temperature for 30 minutes and centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. In the next step, supernatant was discarded and 200 µL of distilled water was added to the sample for washing and was again centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes. Supernatant was discarded and finally, the pellet was cultured on LJ culture media containing cyclohexamide. Second protocol; Mixed colonies dissolved in 200 µL of distilled water in a sterile falcon and 1.5 mL of 1% NaOH and 1.5 mL of 3% SDS was then added. After vortexing and shaking at room temperature for 30 minutes, phenolphthalein reagent and 40% phosphoric acid were added for neutralization. Sample was then centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. Supernatant was discarded and the pellet was cultured on LJ media containing cyclohexamide. Third protocol; mixed colonies dissolved in 200 µL of distilled water in a sterile falcon. Then, 200 µL of 5% oxalic acid was added to the solution. After vortexing, it was shaken at room temperature for 30 minutes. At that point, sample was centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. Supernatant was discarded and pellet was cultured on LJ media containing cyclohexamide. Fourth protocol; mixed colonies dissolved in 200 µL of distilled water in a sterile falcon. 1.5 mL of 1% NaOH and 1.5 mL of 3% SDS were then added. After vortexing, it was shaken at room temperature for 30 minutes. Phenolphthalein reagent and 40% phosphoric acid were added for neutralization. Sample was then centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. Supernatant was discarded and the pellet was vortexed and 200 µL of 5% oxalic acid was added. The tube was then shaken at room temperature for 40 minutes and finally, sample was centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. Supernatant was discarded and the remaining pellet was cultured on LJ media containing cyclohexamide.

Also, different culture media were used for isolation of Mycobacterium colonies from contaminated LJ media. The media was including: BHI agar culture

348 Optimized Method for Isolation of Nontuberculous Mycobacteria

Year 13, Issue 5 (November & December 2019) Iranian Journal of Medical Microbiology

media, MacConkey culture media, Blood agar containing nalidixic acid (0.056 gr per 1600 cc of culture media), Blood agar containing penicillin G (0.05 gr), Blood agar containing nalidixic acid and penicillin (0.056 gr and 0.05 gr, respectively), LJ culture media containing nalidixic acid, penicillin and cyclohexamide (0.02 gr per 1600 cc culture media).

Results

Among the used protocols, mycobacteria were isolated by the two methods that are shown in Table 1. Concentrations of 0.025, 0.05 and 0.06 were somewhat effective in reducing fungal and yeast contaminations but did not thoroughly prevent contamination. Concentrations of 0.64 to 0.2 eradicated more than half of the fungal and yeast contaminations and in

concentrations of 0.3 g and 0.5 g no fungal contamination was observed. But in some cases, small amounts of yeast and fungal contamination were still seen which were completely removed by concentration of 1 g cyclohexamide.

Treating the contaminated colonies by 1-0.05% CPC solution and 2-1% NaOH and 3% SDS protocols did not reduced the contamination. Threating with 3-5% oxalic acid reduced the contamination but was not completely removed and after several days contamination level raised and other bacterial and yeast agents grew along with Mycobacteria. Finally, 4-1% NaOH, 3% SDS and 5% oxalic acid protocol was completely removed contamination from all the treated media and mycobacteria grew purely.

Table 1. Frequency of mycobacterial isolates in water sources of the hospitals

On BHI agar, no growth was observed after two months of storage. Culture on MacConkey agar and blood agar containing nalidixic acid and penicillin. A few days after culture, Gram-negative bacteria had growth on all culture media and no growth of mycobacteria was observed. On selective LJ culture media with antibiotics, no contamination was observed and mycobacteria started growth after a month or even two months in some cases but the rate of Mycobacterial growth was lower compared to LJ media containing cyclohexamide without antibiotics (penicillin and nalidixic acid).

Discussion

Today, many studies emphasize on the necessity of identifying NTM in water and finding the suitable solution for controlling these contaminations (14). There are different methods for isolation of NTM from the environment but there is a need for a standard method in order to identify the biological sources contaminated with NTM. In a study conducted by Kamala et al. in 1993 in India, 6 decontamination methods were used for isolation of mycobacteria from water and soil. More positive samples were detected

by 3% SLS (Sodium Lauryl Sulfate) and 1% NaOH (15). Also, in a study conducted by Nicolas Radomski in 2009, it was shown that decontamination with 0.05% CPC for 30 minutes and culture on rich LJ media containing PANTA, reduces the growth of unwanted bacteria significantly. It was shown that decontamination with 0.05% CPC caused termination of Mycobacterium chelonae (71.1%) and Mycobacterium avium (70%). In contrast, in a study conducted by Thomson et al. it was shown that using 0.005 CPC in water samples leads to the survival of 3.6% of both M. avium and Mycobacterium intercellular (16). However, CPC could be used in different concentrations for samples with low (0.005%) or high (0.05%) contaminations (17).

In a study by Khosravi and et al. in 2016 in Khuzestan province of Iran, 77 culture positive mycobacteria were isolated from 258 hospital water samples. CPC 0.005% was used for decontamination (18). Moreover, in a study by Falsafi et al. in Iran, three methods of decontamination including 0.01% CPC, 4% NaOH and 1% NaOH+3% SDS were used and indicated that decontamination with CPC is the best method for decontamination which reduces the growth of unwanted microorganism and does not have much

Sample water Temperature Positive Negative Contaminated

NAOH+SDS 37°C 19 9 7

25°C 24 7 4

CPC 0.05

37°C 0 33 2

25°C 8 26 1

Somayeh Moradi et al. 349

Year 13, Issue 5 (November & December 2019) Iranian Journal of Medical Microbiology

inhibitory effects on NTM (19). Rahbar et al. in Iran in 2010 were studied on 120 water samples, they were able to isolate 10% of the total samples by 0.05% CPC (20).

According to the results of the current study, the use of lower concentrations of CPC was highly effective compared to 1% NaOH and 3% SDS as using 0.05% CPC resulted in less contamination and higher persistence of samples compared to NaOH and SDS. But the number samples with Mycobacterial growth was lower. Most media with CPC showed no growth which is estimated to be a result from using high concentrations of CPC which probably is more effective in lower concentrations. Meanwhile, the growth rate of mycobacteria increases by increasing cyclohexamide level in culture media and no inhibitory effect was observed in Mycobacterial growth in cyclohexamide concentration to 1 g per 1600 cc. However, concentrations of 0.3 g and 0.5 g were the most effective in the purification of NTM. Nalidixic acid was effective in the preventing the contamination of culture media and purification of mycobacteria but can somewhat prevent the growth of Mycobacteria.

Nalidixic acid has the highest inhibitory effect on NTM when the number of mycobacteria is low in the sample. Therefore, it is suggested to use nalidixic acid for purification and not for primary decontamination. In many studies conducted in Iran, 1% NaOH and 3% SDS were used same as the current study. But it seems like using low concentrations of CPC is effective in the isolation of NTM and depend on sample volume.

In conclusion, the use of NaOH 1%, SDS 3%, 5% of oxalic acid and 0.3-1 gr cyclohexamide can increase the recovery and improve the culturability of NTM from aqueous samples.

Acknowledgment

This study has been supported by Deputy of Research and Technology, Iran University of Medical Sciences. Grant No: 27867-30-01-95.

Conflict of Interest

Authors declared no conflict of interests.

Majallah-i mīkrub/shināsī-i pizishkī-i Īrān. مجله میکروب شناسی پزشکی ایران

329

های دارویی غیر استریل بر اساس دستورالعمل فارماکوپۀ ایاالت متحده کنترل کیفیت میکروبی فرآورده

*1، سمیه حالج نژادی1، فرزانه لطفی پور1عایشه قلی زاده هشجین

تبریز، ایران گروه کنترل غذا و دارو، دانشکدۀ داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، -1

اطالعات مقاله

چکیده

مقاله ۀتاریخچ

02/07/1398 :دریافت

12/10/1398پذیرش:

20/10/1398 :یننالآ انتشار

موضوع:

پزشکیشناسی میکروب

های ( فرآورده 2های استریل و ( فرآورده 1های دارویی از لحاظ وجود میکروارگانیسم، به دو گروه دسته بندی میگردند: فرآورده

شود که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و تولید آنها تحت شرایط هایی اطالق میاستریل به فرآورده غیراستریل. اصطالح

ها عاری از های غیر استریل تحت شرایط آسپتیک ناست؛ بنابرین این فرآورده آسپتیک صورت گیرد، اما تولید فرآورده

نهادهای قانونی محدودۀ مجاز میکروبی تعریف شده است. آلودگی ها توسط میکروارگانیسم نیستند؛ برای این دسته از فرآورده

فیزیکی در فرم دارویی )تغییر در ظاهر، رنگ، بو، تواند سبب تغییرات نامطلوبها میمحصوالت دارویی توسط میکروارگانیسم

گزارش هایی مبنی بر حضور گرانروی(، کاهش اثرات درمانی، ایجاد بیماری و در نهایت سلب اعتماد مصرف کنندگان شود. وجود

های دارویی غیر استریل، منجر به توجهات و تحقیقات بیشتری در این زمینه گردیده های غیرمجاز در فرآورده میکروارگانیسم

های دارویی غیر استریل براساس آخرین ویرایش فارماکوپۀ ایاالت های کنترل کیفیت میکروبی فرآورده است. در این مقاله روش

تواند به عنوان منبع موثقی برای محققان مورد بررسی قرار گرفته است که می <1111>و <62>، <61>(، فصول USPمتحده )

و شاغالن در صنعت داروسازی و آزمایشگاه های کنترل دارو، مورد استفاده قرار گیرد.

تحدههای دارویی غیر استریل، فارماکوپۀ ایاالت مکنترل کیفیت، فرآورده :هاواژه كلید

دسترسی آزاد؛ کپی برداری، توزیع و نشر برای استفاده غیرتجاری با ذکر منبع آزاد است. : مجله میکروب شناسی پزشکی ایران ©رایت کپی

مسئول: ۀنویسند

گروه کنترل غذا و دارو، ،یحالج نژاد هیسم

یدانشگاه علوم پزشک ،یداروساز ۀ دانشکد

رانیا ز،یتبر ز،یتبر

nezhadis@yahoo.com ایمیل:

مهمقد

های دارویی از دیدگاه میکروبی به دو گروه دسته بندی فرآورده

های غیراستریل. ( فرآورده 2های استریل و ( فرآورده 1گردند: می

شود که عاری از هرگونه هایی اطالق می اصطالح استریل به فرآورده

میکروارگانیسم بوده و تولید آنها تحت شرایط آسپتیک صورت گیرد،

ها تست منظور ارزیابی میکروبی این فرآورده تست صورت گرفته به

ر استریل تحت های غی . ولیکن تولید فرآورده (1)استریلیتی نام دارد

ها عاری از میکروارگانیسم شرایط آسپتیک نبوده و بنابرین این فرآورده

ها توسط نهادهای قانونی محدودۀ نیستند؛ برای این دسته از فرآورده

مجاز میکروبی تعریف شده است. این قوانین ممکن است با توجه به

نهادهای قانونی کشورهای مختلف و یا حتی کارخانجات دارویی

"تست محدودیت میکروبی "هایی جزئی داشته باشند. مختلف تفاوت

های غیر استریل نامی است که به ارزیابی محتوای میکروبی فرآورده

سازی نمونه، تست مقدماتی، شود و دارای چهار مرحلۀ: آماده اطالق می

ها و شناسایی آنها است که در ادامه هرکدام از مراحل شمارش باکتری

ح داده خواهند شد. به تفصیل شر

% 75نشان داد که 2011- 2004های ای مروری در سال مطالعه

OTCهای دارویی غیر استریل مربوط به محصوالت آوری فرآورده جمع

(over the counter و بهداشتی بوده است. اغلب جمع ) ها به علل آوری

: (2)اند ذیل صورت گرفته

( % 72وجود میکروارگانیسم خطرناک ) •

( % 15بیش از حد مجاز ) آلودگی •

های خطا در استریلیزاسیون تجهیزات و یا خطاهای کیت •

( % 7تشخیصی )

( % 5های میکروبیولوژیکی ) خطا در تست •

( % 1ایرادات پروسۀ ساخت ) •

زا، منظور از میکروارگانیسم خطرناک میکروارگانیسم بیماری

هایی خاص نظیر تولید طلب با ویژگی میکروارگانیسم فرصت

ها سین، اگزوتوکسین، اسپور و... است. این میکروارگانیسم اندوتوک

توانند تحت شرایط دمایی و تغذیه ای خاصی رشد کرده و بر می

کیفیت و ایمنی فرآورده تاثیر گزارند. آلودگی در هر مرحله از تولید

ی پزشکی ایرانشناسکروبیممجله

1398 آذر و دیـ 5ـ شماره 13سال

www.ijmm.irJournal homepage:

مقاله

ژوهشیپ

ل یاستر ری غ ییدارو یهافرآورده ی کروبی م تیفیكنترل ك | نیزاده هشج یقل شهیعا

330

تواند بیانگر خطر جدی در پروسه باشد و برای حفظ کیفیت و می

. تعداد بسیار کمی (3)گی کنترل شود بایست آلود ایمنی محصول می

از محصوالت از جمله شربت و الگزیر خاصیت پرزرواتیوی دارند. سایر

. (4)منظور بهبود ایمنی فرآورده حاوی پرزرواتیو هستند محصوالت، به

عدم رعایت شرایط آسپتیک، در رابطه با محصوالت استریل خصوصا

ارستانی نظیر های بیم در بیمارستان منجر به ظهور عفونت

سودوموناس – در پروپوفل انتروباکتر و اورئوس لوکوکوس ی استاف منظور مصارف متعدد( شده در ویال دکستروز )به انتروباکتر و آئروژینوزا

است که متاسفانه در هرکدام از این موارد دو مورد مرگ در افراد

نشان داد 2019ای مروری در سال . مطالعه (6, 5)گزارش شده است

های ( در داروخانه extemporaneous medicineداروهای تهیه شده )

های میکروبی بب آلودگی بیمارستان و شهری در چندین مورد به س

هایی نظیر مننژیت در افراد مصرف کنندۀ این منجر به ظهور بیماری

. مطالعۀ صورت گرفته توسط (7)اند ها گردیده گونه فرآورده

Hosseyni بر روی مراحل تولید شربت 2014و همکاران در سال

معدۀ یک شرکت دارویی در ایران حاکی از حضور برخی از

همچنین (8)های غیر مجاز در طی روند ساخت بود میکروارگانیسم

و همکاران در مورد حضور Mohammadiمطالعۀ انجام شده توسط

های آرایشی بهداشتی هشدار داد عوامل میکروبی غیر مجاز در فرآورده

Ratajczakای در کشور عربستان توسط مطالعه 2015. در سال (9)

ستریل پرداخت و نشان داد محصول غیر ا 1285و همکاران به بررسی

های غیر استریل، ضوابط میکروبیولوژیکی مورد فرآورده % 1/ 87در

تایید نیست و این مورد در رابطه با داروهایی که منشا طبیعی دارند

به مطالعاتی که تا 1. جدول شمارۀ (10)( % 5/ 7بیشتر مشهود بود )

یل در های غیراستر کنون به تست محدودیت میکروبی در فرآورده

کند. با توجه به این امر که تعداد چنین ایران پرداخته است، اشاره می

مطالعاتی بسیار اندک است و نتایج حاکی از آن است که غالب

اند، نیاز بیشتری به چنین محصوالت ضوابط فارماکوپه را برآورد نکرده

های شود. غالب آلودگی مطالعاتی در داخل کشور احساس می

واد اولیۀ غیراستریل شامل باکتری، کپک و قارچ هستند محصوالت و م

های دارویی غیر . این امر نشان میدهد که کنترل کیفیت فرآورده (2)

استریل در تمام سطوح مراحل: مواد اولیه، حین تولید، محصول نهایی

و پس از ورود به بازار نیازمند دقت باالیی است. الزم به ذکر است که

ها، تفاوت هایی ما بین برخی میکروارگانیسم در خصوص عدم وجود

)سازمان غذا و داروی آمریکا( و FDAگایدالین های مربوط به

در این مقاله . (11)خورد ( به چشم می USPفارماکوپۀ ایاالت متحده )

های دارویی غیر استریل های کنترل کیفیت میکروبی فرآورده روش

<1111>و <62>، <61>، فصول USPبراساس آخرین ویرایش

تواند به عنوان منبعی موثق توسط که می (12)بررسی شده است

های کنترل دارو، محققان و شاغالن در صنعت داروسازی و آزمایشگاه

، به USPهای مربوط به این فصول از تست مورد استفاده قرار گیرد.

هایی که های مزوفیلیک و قارچ نحوۀ شمارش کمی و شناسایی باکتری

پردازد. هدف از طراحی ست تحت شرایط هوازی رشد کنند می ممکن ا

های مادۀ اولیۀ دارو و محصول دارویی از ها بررسی ویژگی این تست

های معرفی لحاظ کیفیت میکروبی است. شایان ذکر است که روش

شده در این بخش برای ترکیباتی که خود حاوی میکروارگانیسم زنده

تند قابل استفاده نیست. همچنین منظور کاربردهای درمانی هس به

های صرفا به میکروارگانیسم USPهای معرفی شده در دستورالعمل

های خطرناک از دیدگاه اند و تمام میکروارگانیسم شاخص پرداخته

FDA (13)دهند را پوشش نمی ( فارماکوپۀ انگلستان .BP در ضمیمۀ )

، 2.6.12( در فصول EP، فارماکوپۀ اتحادیۀ اروپا ) (14) 16شمارۀ

(16) 5.02و 4.05و فارماکوپۀ ژاپن در فصول (15) 5.4.1و 2.6.13

های اخیر این اند که در چاپ به تست محدودیت میکروبی پرداخته

سازی قوانین مربوط در این حیطه بوده کتب مرجع تالش بر یکسان

های جدید بسیار جزئی های این کتب در ویرایش است، لذا تفاوت

. (17)ستند ه

: ارزیابی میکروبیولوژیک USP <1111>بررسی فصل

محصوالت غیر استریل: ضوابط پذیرش برای محصوالت دارویی و مواد

مورد استفاده در صنعت داروسازی

های غیر های بخصوصی در فرآورده حضور میکروارگانسیم

توانند منجر به کاهش یا حذف اثر دارو شوند و یا عوارض استریل می

کارخانجات داروسازی کننده ایجاد کنند. انبی مضری در فرد مصرف ج

cGMP (Current good manufacturingبایست با انجام قوانین می

practice داری و توزیع از وجود حداقل بار ( طی مراحل تولید، نگه

میکروبی در فرم نهایی اشکال دارویی اطمینان حاصل کنند.

ای غیر استریل دارویی بر اساس تعداد ه معیارهای پذیرش فرآورده

( TAMC: total aerobic microbial countهای هوازی ) تام میکروب

( و TYMC: total yeast and mold countها و مخمرها ) تعداد تام قارچ

های مشخص شده )با توجه به راه هایی برای عدم حضور ارگانیسم تست

پذیرش براساس نتایج (. همچنین معیارهای 2تجویز( است )جدول

منحصر به فرد و یا اگر تکرار صورت گرفته باشد؛ بر اساس میانگین تعداد

تکرارها است )مانند روش شمارش مستقیم در پلیت(.

8139 آذر و دی▐ 5 شمارۀ 13 سال▐شناسی پزشکی ایران مجلۀ میکروب

331

های غیر استریل در ایرانمطالعات مربوط به تست محدودیت میکروبی در فرآورده. 1جدول

نتیجه گیری مطالعه سال منبعمنبع روش

آنالیزی مشاهدات

نمونۀ مورد هدف

مطالعه

(18 ) 1378

عدم انطباق کیفیت

محصوالت با ضوابط

مربوطه

FDA, USP و BP

ها آلودگی درصد باالیی از نمونه

های گرم مثبت، توسط باسیل

و استافیلوکوکوس اورئوس

.Eهای گرم منفی )به غیر از باکتری

coli)

های دست و نمونه، کرم 8

صورت و مرطوب کنندۀ

های شده و کرمخریداری

استفاده شده توسط افراد

سالم

ارزیابی آلودگی باکتریایی

های آرایشی کرم

(19) 1388 عدم انطباق کیفیت

محصوالت با ضوابط USP

USP

TAMC>1100 cfu/mL در

- ها تمامی نمونه

سالمونال ها با آلودگی تمامی نمونه

ها عدم حضور سایر میکروارگانیسم

نمونۀ قرص، پودر و 20

کپسول

بررسی کنترل کیفیت

میکروبی برخی از اشکال

دارویی گیاهی موجود

(20) 1391

عدم انطباق کیفیت

محصوالت با ضوابط

سازمان استاندارد

سازمان استاندارد

ایران

های ایرانی، وارداتی و ودگی نمونهآل

تهیه شده در داروخانه با حداقل با

های غیر مجاز یکی از میکروارگانیسم

گیری هایی که نمونهدر تمام زمان

صورت گرفته است

نمونۀ تصادفی از 90

های داخلی، ضدآفتاب

شده در وارداتی و تهیه

داروخانه؛

ماه 6و 3در زمان صفر،

ب پس از باز شدن در

بررسی کنترل کیفیت

های میکروبی ضدآفتاب

موجود

(21) 1393

انطباق کیفیت

محصوالت با ضوابط

مربوطه

USP, EP

های پاتوژن و عدم حضور باکتری

برآورد کردن الزامات فارماکوپه برای

مادۀ اولیه

نمونۀ بنتونیت 10

استخراج شده از مناطق

مختلف ایران

ارزیابی ویژگی های

بنتونیت های ایرانی مورد

استفاده در صنایع دارویی

(22) 1393

عدم انطباق کیفیت

محصوالت با ضوابط

مربوطه

USP

میزان باکتری تام و میزان قارچ بیش

از حد مجاز اعالم گردید

در تمامی انتروباکتر آلودگی با

استافیلوکوکوس ها و آلودگی با نمونهنمونه مشاهده 7در یکی از اورئوس

گردید

5نمونۀ ضدآفتاب ) 7

2نمونۀ غیر رسمی و

فرآوردۀ رسمی(

ارزیابی محتوای میکروبی

های در برخی کرم

های موجودضدآفتاب

(23) 1393

عدم انطباق کیفیت

محصوالت با ضوابط

مربوطه

USP

نمونه و هانمونه از درصد 83%/ 3

محدوده از خارج آلودگی دارای شاهد

بودند.

قبول قارچی در قابل غیر آلودگی

ها مشاهده گردید.نمونه 42%/ 8

به آلوده ها تمامی نمونه

زا )علی بیماری هایمیکروارگانیسم

( استافیلوکوکوس اورئوسالخصوص

اند.بوده

نمونۀ غیر 6نمونه ) 7

نمونۀ رسمی( 1رسمی و

میکروبی محتوای بررسی

های پودر کرم از برخی

ودموج

. ضوابط پذیرش کیفیت میکروبی اشکال دارویی غیر استریل و مواد اولیۀ دارویی2جدول

TAMC (cfu (colony forming راه تجویز

unit)/mLor cfu/g)

TYMC (cfu/mL or

cfu/g) های خاصمیکروارگانیسم

محصوالت غیرمائی برای

مصرف خوراكی E. coli (1g or 1mL)عدم حضور 210 310

محصوالت مائی برای مصرف

خوراكی E. coli (1g or 1mL)عدم حضور 110 210

------------- 210 310 مصرف ركتالی

110 210 مصارف مخاطی S. aureus (1g or 1mL )عدم حضور

P. aeruginosa (1g or 1mL)عدم حضور

S. aureus(1g or 1mL ) عدم حضور 110 210 مصرف دندانی و لثه

ل یاستر ری غ ییدارو یهافرآورده ی کروبی م تیفیكنترل ك | نیزاده هشج یقل شهیعا

332

TAMC (cfu (colony forming راه تجویز

unit)/mLor cfu/g)

TYMC (cfu/mL or

cfu/g) های خاصمیکروارگانیسم

P. aeruginosa (1g or 1mL)عدم حضور

110 210 مصرف پوستی S. aureus (1g or 1mL )عدم حضور

P. aeruginosa (1g or 1mL)عدم حضور

110 210 مصرف بینی S. aureus (1g or 1mL )عدم حضور

P. aeruginosa (1g or 1mL)عدم حضور

110 210 مصرف گوشی S. aureus (1g or 1mL )عدم حضور

P. aeruginosa (1g or 1mL)عدم حضور

110 210 مصرف واژینال

S. aureus (1g or 1mL )عدم حضور

P. aeruginosa (1g or 1mL)عدم حضور

C. albicans (1g or 1mL) عدم حضور

های ترانس درمال، پچ

محدوده ها برای یک پچ )الیه

چسبنده و پشت آن( است

210 110 S. aureus (1g or 1mL )عدم حضور

P. aeruginosa (1g or 1mL)عدم حضور

مصرف استنشاقی )الزامات

خاصی برای فرم مایع جهت

نبوالیز، نیاز است(

210 110

S. aureus (1g or 1mL )عدم حضور

P. aeruginosa (1g or 1mL)عدم حضور

مقاوم به اسیدهای های گرم منفی عدم حضور باکتری

( 1g or 1mL) صفراوی

ماده اولیه جهت مصارف

دارویی 310 210 -------------

تفسیر نتایج به صورت ذیل خواهد بود: 2با توجه به جدول

در جدول قید cfu110 ،cfu210 ،cfu310در صورتی که تعداد

شده باشد باالترین میزان قابل قبول میکروارگانیسم در روش

عدد است و به این 2000، 200، 20کار رفته به ترتیب؛ شمارش به

ترتیب ادامه خواهد داشت.

این جدول لزوما جامع و فراگیر نیست و ممکن است حضور

سۀ تولید ها با توجه به ماهیت مواد اولیه و پروبرخی میکروارگانیسم

های قیدشده در مورد ارزیابی قرار گیرد. عالوه بر میکروارگانیسم

های بازیابی شده نیز ، اهمیت سایر میکروارگانیسم2جدول

صورت ذیل بررسی شود:بایست بهمی

نحوۀ استعمال محصول: خطراتی که با توجه به راه مصرف •

تواند متوجه فرد شود )راه چشمی، بینی، مسیر می

تنفسی(

ماهیت محصول: قابلیت محصول برای پرورش باکتری و •

اینکه آیا محصول، پرزرواتیو کافی برای جلوگیری از رشد

ها در خود دارد یا خیر.میکروب

روش استفاده •

تواند از نوزاد به کودک جمعیت هدف: ریسک خطر می •

متفاوت باشد.

استفاده از مواد تضعیف کنندۀ سیستم ایمنی: همانند •

استروئیدهاکورتیکو

وجود بیماری، زخم، آسیب به ارگان خاص •

های شمارش میکروبی: تستUSP <61>بررسی فصل

مالحظات كلی

بایست تحت شرایط استریل تمام آزمایشات انجام شده می

انجام شوند تا از ورود میکروارگانیسم خارجی در حین انجام تست

عالیت ضد جلوگیری شود. در صورتی که فرآوردۀ دارویی حاوی ف

بایست حذف یا خنثی شود. میکروبی باشد، اثر مادۀ ضد میکروب می

شوند، کننده به این منظور استفاده می در صورتی که مواد خنثی

بایست از تاثیرگذاری آنها بر حذف مادۀ ضد میکروبی و عدم می

ها اطمینان حاصل کرد )تا از بروز سمیت آنها بر روی میکروارگانیسم

کاذب جلوگیری شود(. نتیجۀ منفی

سازی نمونه از مواد فعال سطحی )از در صورتی که هنگام آماده

بایست عدم سمیت آن ها( استفاده شده باشد، می قبیل سورفکتانت

کننده تعیین شود. برای میکروارگانیسم و سازگاری آن با مادۀ خنثی

8139 آذر و دی▐ 5 شمارۀ 13 سال▐شناسی پزشکی ایران مجلۀ میکروب

333

های شمارشروش

های مختلفی برای شمارش بار میکروبی وجود دارند؛ روش

ها در پلیت، فیلتراسیون و های شمارش کلونیاز جمله: روش

MPN(. در این بین روش most probable number) MPNروش

نسبت به سایر روش ها از صحت کمتری برخوردار است، هرچند

تواند هایی خاص با بار میکروبی پایین میبرای فرآورده

ترین روش باشد. مناسب

انتخاب روش شمارش به فاکتورهای مختلفی از جمله ماهیت

فرآورده و محدودۀ میکروبی مجاز برای آن فرآورده وابسته است.

بایست است که روش شمارش منتخب می نکتۀ حائز اهمیت این

قادر به انجام تست بر روی تعدادی کافی از نمونه باشد تا بتوان

دربارۀ کیفیت میکروبی محصول قضاوت نمود.

سازی نمونهگام اول: آماده

سازی نمونه به خصوصیات فیزیکی محصول روش آماده

برای سازیهای آمادهدارویی مد نظر وابسته است. در ادامه روش

های اند. اگر هیچ یک از روشهر فرم دارویی به تفکیک قید شده

بایست روش جایگزین مناسبی توسط بخش نبود، میذیل رضایت

محقق تعیین شود.

محصوالت محلول در آب: محصول مدنظر در محلول بافری

یا محیط pH 2/7، بافر فسفات با pH 7پپتون با -سدیم کلراید

شود ازئین دایجست براث حل یا رقیق میکشت مایع سوی بین ک

توان را می pHشود(. در صورت نیاز اعمال می 10به 1)غالبا رقت

توان کافی نبود، می 1:10تنظیم نمود. اگر رقت 8-6در محدودۀ

های کنندۀ استفاده شده در مرحلۀ اول، رقتتوسط مادۀ رقیق

ست به نحوی بایها میسازی نمونهبیشتر را اعمال نمود. رقیق

صورت گیرد که خطاهای احتمالی به حداقل میزان خود کاهش

بینی باشند، بدین منظور روش یافته و میزان این خطاها قابل پیش

.(24)شده باید معتبرسازی شود استفاده

محصوالت غیر چرب نامحلول در آب: از محصول مدنظر در

pH 2/7ات با ، بافر فسفpH 7پپتون با -محلول بافری سدیم کلراید

سوسپانسیون تهیه 1:10یا سوی بین کازئین دایجست براث با رقت

توان برای بهبود سوسپانسیونه شدن موادی که شود. میمی

ترپذیری ضعیفی دارند از مواد فعال سطحی )همچون پلی سوربات

را در pHتوان ( استفاده کرد. در صورت نیاز می1g/Lبا غلظت 80

توان کافی نبود، می 1:10نمود. اگر رقت تنظیم 8-6محدودۀ

های کنندۀ استفاده شده در مرحلۀ اول، رقتتوسط مادۀ رقیق

بیشتر را اعمال نمود.

توان در ایزوپروپیل محصوالت چرب: این محصوالت را می

میریستات )استریل شده با فیلتراسیون( حل کرده و یا محصول را

استریل یا یک مادۀ فعال 80ت با حداقل مقدار مورد نیاز پلی سوربا

سطحی غیرمهاری دیگری مخلوط نمود. در صورت نیاز و برای

( داد C°40توان مخلوط را حرارت مالیم )کمتر از اختالط بهتر می

باال برد، جهت ثابت C45°توان حتی دما را تا و در موارد استثنا می

حلۀ گیرد. مرنگه داشتن دما حمام آبی مورد استفاده قرار می

بایست با دقت انجام پذیرد. پس از این مرحله؛ از همزدن می

شود ای که از قبل گرم شده به حدی به نمونه افزوده میکنندهرقیق

از محصول اولیه حاصل شود. در حالی که دما در 1:10تا رقت

ترین زمان ممکن برای تشکیل امولسیون ثابت نگه داشته کوتاه

های شود. ممکن است رقتزده می شده است؛ نمونه با دقت هم

کنندۀ منتخب حاوی غلظت مناسب برابری دیگر توسط رقیق 10

استریل یا یک مادۀ فعال سطحی غیرمهاری 80از پلی سوربات

دیگر تهیه شوند.

مایعات یا جامدات داخل فرم آیروسل: این محصوالت را

توان بصورت آسپتیک به یک دستگاه غشای فیلتری یا ظرف می

های بعدی منتقل کرد. در ادامه گیری داری استریل برای نمونه گهن

گیری شده توان از کل محتوا و یا تعداد معین از دوزهای اندازهمی

ها استفاده شود.از هر ظرف، جهت انجام تست

های پوستی ترنس درمال: در مورد این دسته از اشکال پچ

ه شوند )الیۀ دارویی ابتدا پوششهای محافظ پچ باید برداشت

ها طوری روی یک شیشه یا سینی پالستیکی آزادکننده(، سپس پچ

استریل قرار میگیرند که قسمت چسبندۀ آنها رو به باال قرار گیرد.

این قسمت چسبندۀ پچ با مواد استریل متخلخلی همچون گاز

ها به یکدیگر جلوگیری شود. استریل پوشانده شده تا از چسبیدن پچ

می پچها به حجم مناسبی از مادۀ رقیق کننده که حاوی در نهایت تما

کننده چون پلی سوربات/لسیتین هستند، منتقل شده مواد غیرفعال

شود.دقیقه به شدت هم زده می 30و این مخلوط حداقل به مدت

مقدار مورد نیاز از شکل دارویی برای انجام تست

سی سی از محصول تست 10گرم یا 10برای هر نمونه

شود )مگر اینکه در مونوگراف مربوطه عدد دیگری قید شده می

10های ترنس درمال های مایع و جامد، پچباشد(. برای آئروسل

بایست تست شوند.عدد پچ می 10عدد ظرف حاوی آئروسل یا

ل یاستر ری غ ییدارو یهافرآورده ی کروبی م تیفیكنترل ك | نیزاده هشج یقل شهیعا

334

بایست تست شود تحت شرایط ممکن است مقداری که می

ذیل کاهش یابد:

ص، کپسول، تزریقی( مقدار دارو در هر واحد دارویی )قر •

باشد یا مقدار در هر گرم یا mg1کمتر یا مساوی

لیتر )برای فرم هایی که در واحد دوز ارائه نمی میلی

باشد. در چنین مواردی مقداری از 1mgشوند( کمتر از

بایست تست شود نباید از مقدار ماده موثرۀ نمونه که می

حصول سی سی از م 10گرم یا 10واحد، 10دارویی در

دارویی کمتر باشد.

برای موادی که بعنوان مواد فعال دارویی استفاده می •

شوند وقتی مقدار نمونه خیلی کم باشد یا سایز بچ بسیار

گرم یا 1000کوچک باشد )به عنوان مثال کمتر از

کل بچ باشد %1سی سی(، مقدار تست شده باید 1000

ای مگر اینکه مقادیر کمتری توصیه شده باشد. بر

باشد )مانند 200هایی که تعداد کل کمتر از محصول

های آزمایشی در مطالعات بالینی(، حجم نمونه به نمونه

هایی که تعداد واحد دارو )برای محصول 1واحد یا یک 2

یابد. نمونه یا باشد( کاهش می 100کل کمتر از

صورت تصادفی از بایست بههای مورد آزمایش مینمونه

های در دسترس انتخاب بندییا بسته حجم کل ماده

دست آوردن مقدار مورد نیاز، محتوای شوند. برای به

بندی با یکدیگر مخلوط تعداد مناسب از هر بسته

شوند.می

گام دوم: تست مقدماتی

ها و رقیق سازیتلقیح باکتری به نمونه

هدف از این مرحله پی بردن به حذف اثر مادۀ ضد میکروبی،

سازی نمونه( شده در مرحلۀ قبلی )بخش آمادههای تهیهدر نمونه

است. به همین دلیل به نمونۀ مد نظر و نمونۀ کنترل )بدون مادۀ

تست شونده( مقادیر کافی از سوسپانسیون باکتری اضافه شده تا

حاصل شود. حجم سوسپانسیون باکتری cfu 100تعداد کمتر از

از حجم محصول رقیق شده باشد. %1باکتری نباید بیشتر از

جهت نشان دادن بازیابی قابل قبول میکروبی از محصول،

بایست از نمونه استفاده شود. زمانی کمترین فاکتور رقت ممکن می

که این امر به دلیل عدم خنثی شدن فعالیت ضدمیکروبی پرزرواتیو

های دیگری امتحان یت کم ممکن نبود، باید پروتوکلیا محلول

شوند. اگر اثر ضد میکروبی پرزرواتیو همچنان باقی مانده باشد،

بایست پس از های باکتری میافزودن دوبارۀ سوسپانسیون

سازی، رقیق سازی یا فیلتراسیون مجدد پرزرواتیو صورت خنثی

گیرد.

خنثی سازی/ حذف فعالیت ضدمیکروبی

های تهیه شده های رشد یافته در نمونه میکروارگانیسمتعداد

اند با تعداد که مطابق مرحلۀ قبل رقیق شده و سپس انکوبه شده

شوند. های نمونۀ کنترل مقایسه میمیکروارگانیسم

بایست اصالح در صورتی که رشد مهار شده باشد، روش می

شامل توانند شود تا نتایج معتبر حاصل شود. اصالحات روش می

موارد زیر باشند:

کننده یا محیط کشتافزایش رقیق .1

کننده خاص یا عمومی به مادۀ افزودن مادۀ خنثی .2

کنندهرقیق

فیلتراسیون .3

های قیدشدهترکیبی از روش .4

كننده: مواد خنثی

کننده ممکن است برای خنثی کردن فعالیت مواد خنثی

توانند مواد می(. این 3عوامل ضد میکروبی استفاده شوند )جدول

کنندۀ منتخب افزوده شوند. در قبل از استریلیزاسیون به رقیق

کننده استفاده شود، کارایی و عدم سمیت صورتی که از مواد خنثی

بایست ثابت شود. برای اثبات این آنها بر روی میکروارگانیسم می

شود.کننده استفاده میامر از نمونۀ بالنک حاوی مادۀ خنثی

وش مناسبی برای خنثی کردن یافت نشد، عدم رشد اگر هیچ ر

باکتری به خاصیت میکروب کشی محصول دارویی نسبت داده

توان صریحا اعالم کرد که آلودگی شود. با وجود این اطالعات می می

صورت های بخصوصی که به محصول دارویی با آن دسته از باکتری

این نکته حائز شوند محتمل نیست. اما دستی به محصول افزوده می

تواند رشد اهمیت است که با وجود اینکه محصول می

را مهار کند، اما ممکن است USPهای تعیین شده در میکروارگانیسم

اند مهار نشودقید نشده USPهایی که در رشد میکروارگانیسم

فیلتراسیون غشایی:

µm45 /0بدین منظور فیلترهای غشایی با سایز کمتر از

شود که کارایی شوند. نوع جنس فیلتر طوری انتخاب می استفاده می

فیلتر، توسط اجزاء داخل نمونۀ مورد آزمایش، تحت تاثیر قرار نگیرد.

8139 آذر و دی▐ 5 شمارۀ 13 سال▐شناسی پزشکی ایران مجلۀ میکروب

335

های لیست شده یک نوع فیلتر غشایی برای هرکدام از میکروارگانیسم

شود. استفاده می

cfuیی از شده را )اگر مقدار باال مقدار مناسب از نمونۀ آماده

گرم از محصول یا کمتر( فیلتر کرده و 1انتظار رود؛ ترجیحا معادل

شود. کننده شستشو داده می فیلتر با حجم مناسب از رقیق

، غشای فیلتر به سطح محیط کشت سوی TAMCبرای تعیین

غشای فیلتر به TYMCبین کازئین دایجست آگار و برای تعیین

شود. پلیت مطابق شرایط ال داده می سطح سابرود دکستروز آگار انتق

گیرد.انکوبه شده و سپس شمارش انجام می 4جدول

ها در حضور محصول بازیابی میکروارگانیسم

USPشده در های لیست برای هرکدام از میکروارگانیسم

( <62>گیرد که در ادامه )فصل های جداگانه ای صورت می تست

گونۀ میکروارگانیسمی اشاره خواهند شد. در تست شمارش، صرفا

شود.که اضافه شده، شمرده می

هاگام سوم: شمارش میکروارگانیسم

Pour plate methods این روش حداقل در دو پلیت انجام :

عنوان نتیجه پذیرد و میانگین تعداد میکروارگانیسم در دو پلیت به می

ای که تحت شرایط سی سی از نمونه 1شود. در این روش گزارش می

USP سازی و خنثی نمونه، تلقیح باکتری، رقیق سازی )آمادههایی تهیه شده است، وارد پلیت سازی/حذف فعالیت ضدمیکروبی(

سی سی سوی بین کازئین 15-20شده و سپس با cm9با قطر

دایجست آگار یا سابرود دکستروز آگار مذاب که حرارت آن کمتر از

°C45 بعاد پلیت استفاده شده شود. در صورتی که ا است، مخلوط می

شود. برای بزرگتر باشد؛ مطابق با آن محیط کشت بیشتری افزوده می

حداقل دو پتر دیش 4هر میکروارگانیسم لیست شده در جدول

شود.استفاده می

صورت گرفته و میانگین 4انکوباسیون مطابق شرایط جدول

باتوجه تعداد میکروارگانیسم در دو پلیت محاسبه میشود، در نهایت

در نمونۀ cfuبه حجم انتخاب شده از نمونه در ابتدای کار؛ تعداد

شود.اصلی محاسبه می

Surface spread method : این روش حداقل در دو پلیت انجام

پذیرد و میانگین تعداد میکروارگانیسم در دو پلیت به عنوان می

ه شود. در این روش ابتدا محیط کشت جامد تهی نتیجه گزارش می

-cm9 ،20های با قطر برای پلیت .شود شده و سپس نمونه افزوده می

سی سی از سوی بین کازئین دایجست آگار یا سابرود دکستروز 15

به هر پلیت اضافه شده و زمان داده C45°آگار در دمای حدود

شود تا جامد شود. در صورتی که ابعاد پلیت استفاده شده بزرگتر می

ها در شود. پلیت حیط کشت بیشتری افزوده می باشد؛ مطابق با آن م

شوند. کابینهایی با جریان هوای المینار یا در انکوباتور خشک می

در این جا نیز برای هر میکروارگانیسم لیست pour plateمانند روش

شود. حجم نمونۀ حداقل دو پلیت استفاده می 4شده در جدول

ست که بر روی سطح لیتر ا میلی 0/ 1استفاده شده در این روش

شده و پس از انکوباسیون، شمارش مشابه محیط کشت جامد پخش

پذیرد.روش پور پلیت انجام می

از دو روش قبلی کمتر MPN: دقت و صحت روش MPNروش

ها( است و نتایج غیر قابل اتکا )خصوصا در رابطه با شمارش قارچ

ه تحت شرایطی ک TAMCبدست می آید. این روش برای شمارش

هیچ روش دیگری موجود نباشد مورد استفاده قرار می گیرد.

از 10روش کار به این صورت است: حداقل سه سری رقت

گرم برداشته 1لیتر یا میلی 1شود، سپس از هر سری نمونه تهیه می

لیتر از محیط کشت سوی بین کازئین دایجست براث میلی 9- 10با

توان از مواد فعال سطحی چون شوند. در صورت نیاز می رقیق می

نندۀ پرزرواتیو استفاده نمود. پس یا مواد غیر فعال ک 80پلی سوربات

لولۀ تلقیح شده خواهیم 9برابری، 10از سه بار مرحلۀ رقیق سازی

به مدت حداکثر C 35-30°ها در دمای (. تمام نمونه 1داشت )شکل

دلیل ماهیت روز انکوبه خواهند شد. در صورتی که تفسیر نتایج به 3

ر محیط کشت محصول، مشکل و یا نامطمئن بود، کشت ثانویه د

روز در 2- 1براث یکسان یا سوی بین کازئین دایجست آگار به مدت

همان دما صورت خواهد گرفت و از این نتایج استفاده خواهد شد. از

یا mLها در هر برای تعیین تعداد محتمل میکروارگانیسم 5جدول

g شود.از محصول استفاده می.

ضد میکروبی مداخله کنندهعوامل رایج جهت خنثی کردن مواد . 3 جدول

مواد مداخله كننده كنندههای خنثیمواد یا روش

گلوتارآلدهید، ترکیبات جیوه سدیم هیدروژن سولفیت )سدیم بی سولفیت(

ترکیبات فنولیک، الکل، آلدهیدها و سوربات سازیرقیق

آلدهید گالیسین

هاها(، بیس بی گوانیدینپاراهیدروکسی بنزوات )پارابن(، QACsترکیبات آمونیوم چهارتایی ) لسیتین

ل یاستر ری غ ییدارو یهافرآورده ی کروبی م تیفیكنترل ك | نیزاده هشج یقل شهیعا

336

مواد مداخله كننده كنندههای خنثیمواد یا روش

ها، ید، پارابنQACs پلی سوربات

ترکیبات جیوه تیوگلیکوالت

ها، آلدهیدهاترکیبات جیوه، هالوژن تیوسولفات

EDTA های منیزیم و كلسیمیون

(ATCC :American Type Culture Collectionهای مورد آزمایش. )میکروارگانیسمسازی و استفاده از حوۀ آماده. ن4 جدول

تقویت رشد تناسب روش شمارش در حضور محصول

TYMC TAMC TYMC TAMC میکروارگانیسم سازی گونۀ تستآماده

سوی بین کازئین دایجست

MPNآگار/

سوی بین کازئین دایجست

براث100 cfu ≥

°C 35-30 مساوی کمتر

روز 3

سوی بین کازئین

دایجست آگار یا

سوی بین کازئین

دایجست براث100 cfu ≥

°C 35-30 کمتر

روز 3مساوی

سوی بین کازئین

دایجست آگار یا سوی بین

کازئین دایجست براث

°C 35-30

ساعت24-18

Staphylococcus aures

such as ATCC 6538

سوی بین کازئین دایجست

MPNآگار/

سوی بین کازئین دایجست

براث100 cfu ≥

°C 35-30 کمتر مساوی

روز 3

سوی بین کازئین

دایجست آگار یا

سوی بین کازئین

دایجست براث100 cfu ≥

°C 35-30 کمتر

روز 3مساوی

سوی بین کازئین

دایجست آگار یا سوی بین

کازئین دایجست براث

°C 35-30

ساعت24-18

Pseudomonas aeruginosa

such as ATCC 9027

سوی بین کازئین دایجست

MPNآگار/

سوی بین کازئین دایجست

براث100 cfu ≥

°C 35-30 کمتر مساوی

روز 3

سوی بین کازئین

دایجست آگار یا

سوی بین کازئین

دایجست براث100 cfu ≥

°C 35-30

روز 3کمتر مساوی

سوی بین کازئین

بین دایجست آگار یا سوی

کازئین دایجست براث

°C 35-30

ساعت24-18

Bacillus subtilis such as

ATCC 6633

سابرود دكستروز

آگار100 cfu ≥

°C 25-20

روز 5كمتر مساوی

سوی بین کازئین دایجست

آگار

100 cfu ≥ °C 35-30 کمتر مساوی

روز 5

MPNغیر قابل استفاده :

سابرود دکستروز آگار 100 cfu ≥

°C 35-30 کمتر

روز 5مساوی

سوی بین کازئین

دایجست آگار 100 cfu ≥

°C 35-30 کمتر

روز 5مساوی

سابرود دکستروز آگار یا

سابرود دکستروز براث

°C 25-20

روز 3-2

Candida Albicans such as ATCC 10231

سابرود دكستروز

آگار100 cfu ≥

°C 25-20 كمتر

روز 5مساوی

دایجست سوی بین کازئین

آگار

100 cfu ≥ °C 35-30 کمتر مساوی

روز 5

MPNغیر قابل استفاده :

سابرود دکستروز آگار 100 cfu ≥

°C 25-20

روز 5کمتر مساوی

سوی بین کازئین

دایجست آگار 100 cfu ≥

°C 35-30 کمتر

روز 5مساوی

سابرود دکستروز آگار یا

پوتیتو دکستروز آگار

°C 25-20

زمانی که روز و یا تا 7-5

اسپورولیشن خوبی حاصل

شود

Aspergillus brasiliensis such as ATCC 16404

8139 آذر و دی▐ 5 شمارۀ 13 سال▐شناسی پزشکی ایران مجلۀ میکروب

337

MPNنمای کلی از روش . 1شکل

MPNهای محتمل در نمونه توسط روش عداد میکروارگانیسم. ت5 جدول

نشانگر رشد میکروارگانیسم هستند( تعداد لوله های كدر شده از هر سری رقت )كه از محصول mlیا gدر هر MPN %95حد اطمینان

از محصول در هر لوله mLیا gتعداد

4/9-0 >3 001 /0 01 /0 1 /0

5/9-1/0 3 0 0 0

10-1/0 3 1 0 0

17-2/1 1 /6 1 1 0

17-2/1 2 /6 0 2 0

35-4 4 /9 0 3 0

20-3/1 6 /3 0 0 1

17-2/1 2 /7 1 0 1

35-4 11 2 0 1

20-3/1 4 /7 0 1 1

35-4 11 1 1 1

35-4 11 0 2 1

38-5 15 1 2 1

38-5 16 0 3 1

35-5/1 9.2 0 0 2

35-4 14 1 0 2

ل یاستر ری غ ییدارو یهافرآورده ی کروبی م تیفیكنترل ك | نیزاده هشج یقل شهیعا

338

نشانگر رشد میکروارگانیسم هستند( تعداد لوله های كدر شده از هر سری رقت )كه از محصول mlیا gدر هر MPN %95حد اطمینان

38-5 20 2 0 2

38-4 15 0 1 2

38-5 20 1 1 2

94-9 27 2 1 2

40-5 21 0 2 2

94-9 28 1 2 2

94-9 35 2 2 2

94-9 29 0 3 2

94-9 36 1 3 2

94-5 23 0 0 3

104-9 38 1 0 3

181-16 64 2 0 3

104-9 38 0 1 3

199-17 75 1 1 3

360-30 120 2 1 3

380-30 160 3 1 3

360-18 93 0 2 3

380-30 150 1 2 3

400-30 210 2 2 3

990-90 290 3 2 3

990-40 240 0 3 3

1980-90 460 1 3 3

4000-200 1100 2 3 3

1100< 3 3 3

ارزیابی محصوالت

در روش فیلتراسیون غشایی باید فیلتر استفاده شده قابل

ها مطابق پروتوکل قید شده انتقال بر روی محیط کشت باشد. نمونه

آماده گردیده و مقدار مناسب از آنها را به هر کدام از دو فیلتر انتقال

داده و سپس فیلتر می شوند. متعاقب آن هر فیلتر توسط روش

یکی از TAMCود. برای تعیین مقدار ش مناسبی شستشو داده می

فیلترها به سطح سوی بین کازئین دایجست آگار منتقل گردیده و

شود و برای تعیین انکوبه می C 35-30°روز در دمای 5- 3به مدت

8139 آذر و دی▐ 5 شمارۀ 13 سال▐شناسی پزشکی ایران مجلۀ میکروب

339

فیلتر دیگر به سطح سابرود دکستروز آگار منتقل TYMCمقدار

. مقدار شود انکوبه می C°25-20روز در دمای 7- 5گردیده، به مدت

cfu/mL یاcfu/g ها توسط پس از انکوباسیون و شمارش تعداد کلونی

هنگام ارزیابی پچهای ترنس دستگاه کلونی کانتر قابل محاسبه است.

حجم کل نمونۀ آماده شده توسط دو % 10درمال؛ بصورت جداگانه

یکی از TAMCشود. برای تعیین مقدار فیلتر استریل، فیلتر می

ح سوی بین کازئین دایجست آگار و برای تعیین مقدار فیلترها به سط

TYMC شود.فیلتر دیگر به سطح سابرود دکستروز آگار منتقل می

نمونه مطابق پروتوکل مناسب آماده شده Pour plateدر روش

شود. پلیت سوی بین و برای هر سطح رقت حداقل دو پلیت تهیه می

و پلیت C35-30°ای روز در دم 3- 5کازئین دایجست آگار به مدت

انکوبه C25-20°روز در دمای 5- 7سابرود دکستروز آگار به مدت

دهیم های با رقت مشابه را انتخاب کرده و نشان می شود. پلیت می

TYMCو برای 250کمتر از TAMCکه بیشترین تعداد کلونی برای

است. میانگین شمارش پلیت ها را محاسبه کرده و تعداد 50کمتر از

cfu/mL یاcfu/g شود. محاسبه می

نمونه مطابق پروتوکل مناسب آماده Surface spread در روش

شود و حداقل دو پلیت برای هر محیط کشت و هر سطح رقتی می

ها همانند cfuباید فراهم شود. مراحل انکوباسیون و محاسبۀ تعداد

گیرد.صورت می Pour plateروش

نمونه مطابق پروتوکل Most probable numberدر روش

روز در دمای 3- 5شود. تمام لوله ها به مدت مناسب آماده می

°C35-30 انکوبه خواهند شد. در صورت نیاز با استفاده از روش

مناسبی کشت ثانویه انجام خواهد گرفت. برای هر سطح رقتی تعداد

هایی که میکروب در آنها رشد کرده ثبت شده و تعداد محتمل لوله

شود. حد تعیین می 5طبق جدول gیا mLمیکروارگانیسم در

لی و حداکثری از تعداد بیانگر مقادیر حداق % 95اطمنیان

کند که با اطمینان ای را بیان می میکروارگانسیم است و در واقع بازه

توان در مورد تعداد میکروارگانیسم در نمونه اظهار نظر کرد. ، می 95%

به عنوان مثال در صورتی که از هرسری رقت ها، دو لوله از سه لوله

توان اظهار کرد که می %95(، با اطمینان 5کدر شده باشند )جدول

هستند. cfu/gیا cfu/mL 9- 94ها در بازۀ تعداد میکروارگانیسم

تفسیر نتایج

TAMC مساوی با تعدادcfu یافت شده در محیط کشت سوی

شود. در صورتی که کلنی بین کازئین دایجست آگار در نظر گرفته می

های قارچ در این محیط کشت یافت شود، آنها بعنوان جزئی از

TAMC .در نظر گرفته می شوندTYMC مساوی با تعدادcfu یافت

شود، اگر شده در محیط سابرود دکستروز آگار در نظر گرفته می

های باکتری در این محیط کشت یافت شوند به عنوان جزیی کلونی

رود مقدار شوند. زمانی که انتظار می در نظر گرفته می TYMCاز

TYMC ول باشد، امکان دارد سابرود بیشتر از مقادیر قابل قب

دکستروز آگار حاوی آنتی بیوتیک استفاده شود.

انجام شود، MPNدر صورتی که شمارش با استفاده از روش

است. TAMCمقدار محاسبه شده معادل

های های میکروارگانیسم : تست USP <62>بررسی فصل

مشخص شده

های شناساییتست

در صورتی که میکروارگانیسمی در محیط کارخانه، مواد اولیۀ

بایست تعیین هویت دارو، آب یا محصول نهایی مشاهده شود می

های شناسایی معمول شامل شناسایی براساس شود. تست

ای، کوکسی، تجمع های مورفولوژیکی کلونی یا سلول )میله ویژگی

میزی گرم یا سایر آ ها و...(، رنگ ها، اسپور، تحرک سلول سلول

های بیوشیمیایی کلیدی )نظیر آمیزی های افتراقی و واکنش رنگ

.( 25) پذیرد تست اکسیداز، کاتاالز، کوآگوالز و...( صورت می

های معرفی شده در این بخش، به تعیین حضور، عدم تست

های خاص، تحت شرایطی که حضور یا وقوع محدود میکروارگانیسم

ردازد.پ توصیف خواهند شد می

هاهای باكتری تهیۀ سویه

همان طور که در ادامه توضیح داده خواهد شد،

بایست مورد ها می سوسپانسیونهای پایدار و استاندارد شدۀ سویه

seed lot cultureاستفاده قرار گیرند. بدین منظور تکنیک

maintenance (seed lot system مورد استفاده قرار می ) .گیرد

ها، های زندۀ استفاده شده برای تلقیح نمونه ارگانیسم بنابرین میکرو

بار پاساژ داده شوند. 5نباید بیش از

های هوازیمیکروارگانیسم

های هوازی مورد استفاده در تست به میکروارگانیسم 6جدول

صورت به بایست های باکتری می هرکدام از گونه پردازد. شناسایی می

جداگانه در ظروفی که حاوی سوی بین کازئین دایجست براث یا سوی

C35-30 ،24-18°بین کازئین دایجست آگار است رشد کنند )

بصورت جداگانه در سابرود دکستروز آگار یا کاندیدا آلبیکنز ساعت(.

روز(. C 25-20 ،2-3°بایست رشد کند ) سابرود دکستروز براث می

ل یاستر ری غ ییدارو یهافرآورده ی کروبی م تیفیكنترل ك | نیزاده هشج یقل شهیعا

340

(NCTC :National Collection of Type Culturesهای هوازی مورد استفاده در تست شناسایی )گانیسممیکروار. 6جدول

NCTC یهواز یهاسمیکروارگانیم

such as ATCC 6538 Staphylococcus aures

such as ATCC 9027 Pseudomonas aeruginosa

such as ATCC 8739 Escherichia coli

such as ATCC 14028 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium or,

such as NCTC 6017 as an alternative, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony

such as ATCC 10231 Candida albicans

از نمونه mlیا gتعداد محتمل باکتری در هر -تفسیر نتایج . 7 جدول

نتایج برای هر مقدار از محصول

mL1/0یا mL01/0 g1/0یا mL001/0 g01/0یا mL g001/0یا gتعداد محتمل باكتری در هر

+ + + 310بیش از

+ + - 210و بیشتر از 310كمتر از

+ - - 110 و بیشتر از 210كمتر از

- - - 10كمتر از

یا محلول بافری pH 7پپتون با - محلول بافری سدیم کلراید

شود. ها استفاده می برای تهیۀ سوسپانسیون باکتری pH 2 /7فسفات با

نگه داری شود تا C 8-2°در صورتی که این سوسپانسیون در دمای

ساعت قابل استفاده است. 24-2

CLOSTRIDIA Clostridium sporogenes (Cl. Sporogenes) such as

ATCC 11437 or ATCC 19404 (NCTC 532).

و تحت در محیط کشت تقویت شده بایست می کلستریدیا گونۀ

ساعت(. C 35-30 ،48-24°هوازی رشد کند ) شرایط بی

استفاده از سوسپانسیون پایدار اسپورها برای تلقیح، روش

.Clهای رویشی سازی سوسپانسیون تازۀ سلول جایگزین تهیه و رقیق

Sporogenes شود. سوسپانسیون پایدار اسپور ها در دمای محسوب می

°C 8-2 استفاده از داری است. ای قابل نگه به مدت زمان معتبر شده

شود. های شناسایی توصیه می نمونۀ کنترل منفی در انجام تست

خصوصیات محیط كشت در تحریک یا مهار رشد باكتری

های تست بررسی ویژگی محرک رشد بودن محیط كشت

مقدار مناسبی از محیط کشت توسط حجم کمی از مایع:

شود. پس از ( آلوده می 100cfuمیکروارگانیسم مدنظر )کمتر از

انکوباسیون در شرایط مشخص و کوتاه ترین زمان توصیه شده، رشد

واضح میکروارگانیسم در مقایسه با قبل از تلقیح باکتری بیانگر کارایی

مناسب محیط کشت است.

های ی محرک رشد بودن محیط كشت تست بررسی ویژگ

، هر پلیت توسط مقدار surface spreadبا استفاده از روش جامد:

مناسبی از میکروارگانیسم مدنظر آلوده خواهد شد. پس از انکوباسیون

در شرایط مشخص و کوتاه ترین زمان توصیه شده، رشد واضح

کارایی مناسب میکروارگانیسم در مقایسه با قبل از تلقیح باکتری بیانگر

محیط کشت است.

تست بررسی ویژگی مهار كنندۀ رشد بودن محیط

مقدار مناسبی از محیط کشت را توسط های جامد/مایع: كشت

شود. ( آلوده می 100cfuحجم کمی از میکروارگانیسم مدنظر )حداقل

ترین زمان توصیه شده، پس از انکوباسیون در شرایط مشخص و کوتاه

سم نباید مشاهده شود. رشد میکروارگانی

با استفاده تست بررسی ویژگی تمایز دهندۀ محیط كشت:

، هر پلیت توسط مقدار مناسبی از surface spreadاز روش

8139 آذر و دی▐ 5 شمارۀ 13 سال▐شناسی پزشکی ایران مجلۀ میکروب

341

( آلوده خواهد شد. پس از 100cfuمیکروارگانیسم مدنظر )کمتر از

ترین زمان توصیه شده، انکوباسیون در شرایط مشخص و کوتاه

بایست مشابه های ظاهری می از لحاظ ویژگی دست آمده های به کلونی

های صورت گرفته باشد تا محیط کشت مورد تایید واقع شود. تست

تناسب روش تست

برای هر محصول جدیدی که قرار است مورد تست واقع شود،

پذیرد. هر کدام مراحل تهیۀ نمونه که پیشتر توضیح داده شد، انجام می

صورت جداگانه به محیط قیدشده به های های میکروارگانیسم از گونه

شوند و تعداد میکروارگانیسم نباید از کشت توصیه شده افزوده می

100cfu ها در کمترین زمان انکوباسیون توصیه شده بیشتر باشد. تست

های بایست با ویژگی پذیرند. میکروارگانیسم مدنظر می صورت می

عالیت مشخص خود شناسایی شود. در صورت حضور هر گونه ف

بایست اصالحات الزم روی پروسه صورت ضدمیکروبی فرآورده، می

ای قابل خنثی کردن نبود، گیرد. اگر فعالیت ضدمیکروبی فرآورده

شده قادر به رشد های ممنوع شود که میکروارگانیسم گیری می نتیجه

در این فرآورده نیستند.

بررسی محصوالت از لحاظ وجود یا عدم وجود

رم منفی مقاوم به اسیدهای صفراوی های گ باكتری

1شود )طوری که نباید کمتر از تهیه می 1:10نمونه با رقت

گرم از محصول آزمایش شود(. رقیق کنندۀ منتخب سوی بین کازئین

کننده؛ دایجست براث است. پس از مخلوط کردن نمونه با رقیق

گیرد که ، تا زمانی صورت می C 25-20°انکوباسیون در دمای

ساعت 5ها احیا شوند )نه اینکه تکثیر گردند( این زمان کمتر از کتری با

ساعت است. 2بوده و اغلب

منظور بررسی عدم حضور باکتری، مانند مرحلۀ قبل حجمی به

شود )مگر در موارد استثنا( گرم باشد تهیه می 1از محصول که معادل

Enterobacteria Enrichment Brothو به محیط کشت مغذی

Mossel شود. انکوباسیون در دمای انتقال داده می°C35 -30 به مدت

ساعت صورت میگیرد. سپس کشت ثانویه بر روی محیط 48-24

صورت میگیرد )انکوباسیون Violet Red Bile Glucose Agarکشت

°C35 -30 ،48 -24 ساعت(. در صورتی محصول مورد قبول است که

رشد هیچ گونه کلنی مشاهده نشود.

توان رقتهای مختلفی از نمونۀ اصلی هت کمی کردن نتایج می ج

Enterobacteria Enrichment Brothرا در محیط کشت مغذی

Mossel تهیه نمود. به عنوان مثال رقت هایی که معادلg1 /0 ،g01 /0 ،

g001 /0 0/ 001لیتر، میلی 0/ 01لیتر، میلی 0/ 1)و یا معادل

از نمونۀ اصلی باشند. مانند مرحلۀ قبلی انکوباسیون در دمای لیتر( میلی

°C35 -30 ساعت انجام خواهد گرفت. سپس کشت 24- 48به مدت

صورت Violet Red Bile Glucose Agarثانویه بر روی محیط کشت

7ساعت(. مطابق جدول C35 -30 ،24-18°میگیرد )انکوباسیون

های تعداد محتمل باکتری تفسیر می شود )به مواردی که در رقت

های باال رشدی مشاهده پایین رشد کلونی صورت گرفته و در رقت

بایست توجه شود(. نشده می

E. coli (Escherichia coli)مراحل تست شناسایی برای

1طوری که معادل از محصول تهیه نموده 1:10نمونه را با رقت

سی سی از محصول شود، پس از انتقال به محیط کشت 1گرم یا

-18مغذی سوی بین کازئین دایجست براث و اختالط با آن، به مدت

شود. انکوبه می C35 -30°ساعت در دمای 24

سی سی از محیط کشت 1بعد از انکوباسیون، : کشت ثانویه

ی محیط کشت مک سی س 100سوی بین کازئین دایجست براث به

ساعت(؛ در C44 -42 ،48-24°کانکی براث منتقل شده )انکوباسیون

نهایت از این محیط کشت به پلیت حاوی محیط کشت مک کانکی

(. C35 -30°ساعت، 18- 72شود )انکوباسیون آگار منتقل می

محصول زمانی مورد قبول است که رشد هیچ گونه : تفسیر

یی منفی باشد. کلونی مشاهده نشود و تست شناسا

Salmonella مراحل تست شناسایی برای

فصل >نمونه را همانند مراحل توضیح داده شده در بخش قبلی

10تهیه کرده و باید مقداری از محصول استفاده شود که معادل <61

سی سی باشد. پس از انتقال نمونه به محیط کشت سوی 10گرم یا

24-18بین کازئین دایجست براث و اختالط با آن، نمونه به مدت

شود. ه می انکوب C°35-30ساعت در دمای

لیتر از محیط کشت سوی بین کازئین میلی 0/ 1کشت ثانویه:

Rappoport Vassiliadisسی سی محیط کشت 10دایجست براث به

Salmonella Enrichment Broth ساعت 18- 24منتقل شده به مدت

شود. سپس انتقال به محیط انکوبه می C35 -30°در دمای

صورت گرفته و به مدت Xylose lysine Deoxycholate Agarکشت

شود. انکوبه می C35 -30°ساعت در دمای 72-18

های قرمز با یا بدون مرکز با رشد کلونی سالمونال حضور : تفسیر

های شناسایی تکمیلی تایید شود که توسط تست سیاه رنگ مشخص می

می شوند. محصول زمانی مورد قبول است که رشد کلونی با ویژگی های

های شناسایی تکمیلی منفی باشد. ه نشود و تست قید شده مشاهد

ل یاستر ری غ ییدارو یهافرآورده ی کروبی م تیفیكنترل ك | نیزاده هشج یقل شهیعا

342

Pseudomonas aeruginosa مراحل تست شناسایی برای

از محصول طوری تهیه نموده که حداقل 1:10نمونه را با رقت

سی سی یا مقداری که 10گرم از محصول شود. سپس از 1معادل

شود تا با سی سی از محصول باشد استفاده می 1گرم یا 1معادل

حجم مناسبی از محیط کشت مغذی سوی بین کازئین دایجست براث

رمال مورد تست قرار مخلوط شود. هنگامی که پچهای ترانس د

شود تا میگیرد، حجمی از نمونه توسط فیلتر غشایی استریل، فیلتر می

سی سی 100معادل یک نمونۀ تهیه شده از پچ شود و سپس به

شود محیط کشت مغذی سوی بین کازئین دایجست براث منتقل می

شود. انکوبه می C35 -30°ساعت در دمای 24-18و به مدت

ز این مرحله به محیط کشت ستریماید آگار کشت ثانویه: پس ا

شود. انکوبه می C35 -30°ساعت در دمای 18- 72منتقل شده به مدت

را سودوموناس ائروژینوزا تفسیر: رشد کلونی؛ امکان حضور

شوند. های شناسایی تکمیلی تایید می کند و توسط تست مطرح می

محصول زمانی مورد قبول است که رشد کلونی مشاهده نشود و

های شناسایی تکمیلی منفی باشد. تست

Staphylococcus aureus مراحل تست شناسایی برای

از محصول را طوری تهیه نموده که حداقل 1:10نمونه با رقت

سی سی یا مقداری که 10گرم از محصول شود. سپس از 1معادل

شود تا با حجم مناسبی سی سی باشد استفاده می 1گرم یا 1معادل

از محیط کشت مغذی سوی بین کازئین دایجست براث مخلوط شود.

گیرد، حجمی از های ترانس درمال مورد تست قرار می هنگامی که پچ

شود تا معادل یک نمونۀ تر می نمونه توسط فیلتر غشایی استریل، فیل

سی سی محیط کشت مغذی 100تهیه شده از پچ شود و سپس به

18- 24شود و به مدت سوی بین کازئین دایجست براث منتقل می

شود. انکوبه می C35 -30°ساعت در دمای

کشت ثانویه: پس از این مرحله به محیط کشت مانیتول سالت

C35 -30°اعت در دمای س 18-72آگار منتقل شده و به مدت

شود.انکوبه می

های زرد یا سفید که توسط هالۀ زرد رنگی تفسیر: رشد کلونی

را مطرح میکند استافیلوکوکوس اورئوس احاطه شده اند؛ امکان حضور

های شناسایی تکمیلی تایید می شوند. محصول زمانی و توسط تست

های شناسایی مورد قبول است که رشد کلونی مشاهده نشود و یا تست

تکمیلی منفی باشد.

Clostridia مراحل تست شناسایی برای

از محصول تهیه نموده )حداقل حجم تام 1:10نمونه را با رقت

سی سی از 2گرم یا 2سی سی( به طوری که حداقل معادل 20

محصول شود، سپس نمونه را دو قسمت کرده؛ به طوری که هرکدام

دقیقه 10سی سی باشند، یکی از این دو قسمت به مدت 10حداقل

شود. قسمت دیگر نک می شود و سریعا خ حرارت داده می C°80در

حرارت داده نشود.

سی 1گرم یا 1سی سی یا مقداری که معادل 10کشت ثانویه:

سی از محصول باشد را برای هر کدام از آن دو قسمت، با مقدار مناسبی

مخلوط کرده و تحت Clostridiaاز محیط کشت تقویت شده برای

ساعت انکوبه 48- 72، به مدت C35 -30°شرایط بی هوازی در دمای

ها کشت ثانویه به می شوند. پس از انکوباسیون برای هر کدام از نمونه

انجام می پذیرد سپس تحت شرایط Columbia Agarمحیط کشت

شوند. ساعت انکوبه می 48- 72، به مدت C35 -30°هوازی در دمای بی

ای )با یا بدون های میله تفسیر: رشد بی هوازی باکتری

هستند و کلستریدیا کاتاالز منفی، بیانگر حضور اندوسپور(، تست

شوند. محصول زمانی های شناسایی تکمیلی تایید می توسط تست

های شناسایی مورد قبول است که رشد کلونی مشاهده نشود و یا تست

تکمیلی منفی باشد.

Candida albicans مراحل تست شناسایی برای

هر محصول تهیه نمونه مطابق پروتوکل شرح داده شده برای

سی سی 1گرم یا 1سی سی یا مقداری که معادل 10شده، سپس

شود تا با حجم مناسبی از محیط از محصول یا بیشتر باشد استفاده می

- 3کشت مغذی سابرود دکستروز براث مخلوط شود، سپس به مدت

انکوبه میشود. C35 -30°روز در دمای 5

کشت ثانویه: کشت ثانویه بر روی محیط کشت سابرود

-C35°ساعت در دمای 4-24دکستروز آگار انجام گرفته و به مدت

شود.انکوبه می 30

کاندیدا تواند بیانگر حضور های سفید می تفسیر: رشد کلونی شوند. های شناسایی تکمیلی تایید می باشد و توسط تست آلبیکنز

است که رشد کلونی مشاهده نشود و یا محصول زمانی مورد قبول

های شناسایی تکمیلی منفی باشد. تست

های کشت از لحاظ محرک رشد، مهار به ویژگی محیط 8جدول

پردازد کنندۀ رشد و نشان دهندۀ باکتری می

8139 آذر و دی▐ 5 شمارۀ 13 سال▐شناسی پزشکی ایران مجلۀ میکروب

343

های کشتنواع محیطهای محرک رشد، مهار کنندۀ رشد و نشان دهندۀ باکتری برای ایژگی. و8جدول

تست/محیط كشت ویژگی گونۀ باكتری

ی گرم منفی مقاوم به اسیدهای صفراویهاباكتریتست برای

E. coli محرک رشد Enterobacteria Enrichment Broth Mossel

P. aeruginosa

S. aureus مهاری

E. coli نشانگرمحرک رشد و Violet Red Bile Glucose Agar

P. aeruginosa

Escherichia coli تست برای

E. coli محرک رشد MacConkey Broth

S. aureus مهاری

E. coli نشانگرمحرک رشد و MacConkey Agar

salmonellaتست برای

Salmonella enterica subsp. enterica

serovar Typhimurium or محرک رشد

Rappaport Vassiliadis Salmonella

Enrichment Broth

Salmonella enterica subsp. enterica

serovar Abony

S. aureus مهاری

Salmonella enterica subsp. enterica

serovar Typhimurium or Xylose Lysine Deoxycholate Agar نشانگر محرک رشد و

Salmonella enterica subsp. enterica

serovar Abony

Pseudomonas aeruginosaتست برای

P. aeruginosa محرک رشد Cetrimide Agar

E. coli مهاری

aureus Staphylococcusتست برای

S. aureus نشانگرمحرک رشد و Mannitol Salt Agar

E. coli مهاری

Clostridiaبرایتست

Cl. sporogenes محرک رشد Reinforced Medium for Clostridia

ل یاستر ری غ ییدارو یهافرآورده ی کروبی م تیفیكنترل ك | نیزاده هشج یقل شهیعا

344

تست/محیط كشت ویژگی گونۀ باكتری

Cl. sporogenes محرک رشد Columbia Agar

albicans Candidaتست برای

C. albicans محرک رشد Sabouraud Dextrose Broth

C. albicans نشانگر محرک رشد و Sabouraud Dextrose Agar

.

گیرینتیجه

بایست از لحاظ بار میکروبی در های غیراستریل می فرآورده

محدودۀ مجاز خود بوده تا آسیبی متوجه مصرف کنندگان نشده و

های خطرناک را پایداری فرآورده نیز بر هم نریزد. میکروارگانیسم

و <61>هایی که به تفصیل در فصول توان با استفاده از روش می

ها شرح نمونه و چگونگی انجام تست سازی در رابطه با آماده <62>

داده شده است شمارش کرده و شناسایی نمود. ولیکن صنایع

بایست داروسازی با توجه به شرایط تولید و محصول تولیدی خود، می

واقع نشده اند USPهایی که در لیست توجه خود را به میکروارگانیسم

ایین ممکن است نیز معطوف نمایند. محصوالت مشابه با فعالیت آبی پ

کننده های آلوده مقاوم به تکثیر باکتری باشند اما میکروارگانیسم

ممکن است زنده مانده و پتانسیل آلوده کردن محصول را داشته باشند.

و پیشگیری از آلودگی در حین تولید منجر به cGMP رعایت اصول

ت شود که از کیفیت و پایداری بهتری برخوردار اس تولید محصولی می

کند. با کنندگان را جلب می و در نتیجه رضایت و اعتماد بیشر مصرف

توجه به این امر که تعداد مطالعات مربوط به ارزیابی محصوالت غیر

استریل از لحاظ بار میکروبی در کشور ایران بسیار اندک هستند، نیاز

شود. بیشتری به انجام چنین مطالعاتی در داخل کشور احساس می

ردانیتشکر و قد

Nicole Vu ،Rخود را از تشکر و تقدیر مراتب نویسندگان

Jessica وThomas C به دلیل اینکه از برگردان مقاله ایشان در

دارند.بخشی از این نوشتار استفاده شده است اعالم می

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض منافع گزارش نشده است.

Referance 1. Rimbara E. Hugo and Russell's Pharmaceutical

Microbiology. 8th ed. Willey-Blackwell publisher;

2012.

2. Vu N, Lou J, Kupiec T. Quality control analytical

methods: Microbial limit tests for nonsterile

pharmaceuticals, part 1. Int J Pharm Compd.

2014;18(3):213-21.

3. Sutton S. What is an objectionable organism. Am

Pharmaceut Rev. 2012;15(6):36-48

4. Clontz L. Microbial Limit and Bioburden Tests:

Validation approaches and global requirements. 2nd ed.

Lucia Clontz: CRC press publisher; 2009.

[DOI:10.1201/NOE1420053487] [PMID] [PMCID]

5. Bennett SN, McNeil MM, Bland LA, Arduino MJ,

Villarino ME, Perrotta DM, et al. Postoperative

infections traced to contamination of an intravenous

anesthetic, propofol, N Engl J Med. 1995; 333(3):147-

154. [DOI:10.1056/NEJM199507203330303] [PMID]

6. Archibald LK, Ramos M, Arduino MJ, Aguero SM,

Deseda C, Banerjee S, et al. Enterobacter cloacae and

Pseudomonas aeruginosa polymicrobial bloodstream

infections traced to extrinsic contamination of a dextrose

multidose vial. J Pediatr. 1998;133(5):640-4.

[DOI:10.1016/S0022-3476(98)70104-0]

7. Mohiuddin A. Extemporaneous Compounding: Cautions

Vs Convenience. Research & Reviews: A Journal of

Toxicology. 2019;9(1):26-43.

[DOI:10.15520/ijmhs.v9i1.2420]

8. Hosseyni R, Raefi A, Hashemi M. Identification of

Microbial Agents Indifferent Parts of the Gastric Juice

Company. Iran J Med Microbiol. 2015;8(4):44-9.

9. Mohammadi Sarab Badyeh F, Saeedi M, Enayatifard R,

Morteza-Semnani K, Akbari J. Microbial Contamination

in some Moisturizing Creams in Iran Market. J of

Mazandaran Univ of Med Sci. 2015;24(121):400-405.

10. Ratajczak M, Kubicka M, Kamińska D, Sawicka P,

Długaszewska J. Microbiological quality of non-sterile

pharmaceutical products. Saudi Pharm J.

8139 آذر و دی▐ 5 شمارۀ 13 سال▐شناسی پزشکی ایران مجلۀ میکروب

345

2015;23(3):303-7. [DOI:10.1016/j.jsps.2014.11.015]

[PMID] [PMCID]

11. Vu N, Lou J, Kupiec T. Quality Control: microbial limit

tests for nonsterile pharmaceuticals, part 2. Int J Pharm

Compd. 2014;18(4):305-10.

12. United States Pharmacopeial Convention. The United

States pharmacopeia: the national formulary. United

States Pharmacopeial Convention.; p. 5965-78 & 7297-

98.

13. GUIDE TO INSPECTIONS OF MICROBIOLOGICAL

PHARMACEUTICAL QUALITY CONTROL

LABORATORIES 2014. Available at: URL:

http://www.fda.gov/ora/inspect_ref/igs/micro.html.

Accessed February 18, 2014.

14. Apendix 16B. British pharmacopoeia. Vol. 5. London;

2016; p. 486-501.

15. 15 2.6.12 and 2.6.13 Chapters. Council of Europe.

European Pharmacopoeia. 8th ed. Strasbourg: Council of

Europe; 2014; p.185-194.

16. 16 Pharmacopoeia J. The Japanese Pharmacopoeia. In:

Nippo TY, editor. The Japanese Pharmacopoeia. 16 ed.

Tokyo: Hirokawa Publishing; 2016. p. 138-47 & 21-0.

17. Dilip Maheshwari PV. Harmonization in Microbial

Limit Test of USP and EP. AJPTI. 2106;04(19):61-70.

18. Behravan J, Bazzaz F, Malaekeh P. Survey of

bacteriological contamination of cosmetic creams in Iran

(2000). Int. J. Dermatol. 2005;44(6):482-5.

[DOI:10.1111/j.1365-4632.2005.01963.x] [PMID]

19. Enayatifard R, Asgarirad H, Kazemi-Sani B. Microbial

quality of some herbal solid dosage forms. Afr. J.

Biotechnol. 2010;9(11): 1701-05.

[DOI:10.5897/AJB10.1673]

20. Haftbaradaran B, Abedi D, Jalali M, Bagherinejad MR.

Microbial quality survey of sunscreen products in

Iranian market. Adv Biomed Res 2014;3:180. 227-234.

[DOI:10.4103/2277-9175.139534] [PMID] [PMCID]

21. Modabberi S, Namayandeh A, López-Galindo A,

Viseras C, Setti M, Ranjbaran M. Characterization of

Iranian bentonites to be used as pharmaceutical

materials. Applied Clay Science. 2015 Nov 1;116:193-

201. [DOI:10.1016/j.clay.2015.03.013]

22. Sedghi Sharif-Abad N, Saeedi M, Enayatifard R,

Morteza-Semnani K, Akbari J. Evaluation of microbial

content of some sunscreen creams in Iran's market.

Pharm Biomed Res. 2015;1(2):30-4.

[DOI:10.18869/acadpub.pbr.1.2.30]

23. Norouz-zadeh S, Saeedi M, Enayatifard R, Morteza-

Semnani K, Akbari J. Microbial Content in some

Foundation Creams in Iran's Market. J of Mazandaran

Univ of Med Sci. 2014;24(118):214-9.

24. Hewitt W. Microbiological assay for pharmaceutical

analysis: a rational approach: CRC press publisher;

2003.

25. Baird RM, Hodges NA, Denyer SP. Handbook of

microbiological quality control in pharmaceuticals and

medical devices: CRC press publisher; 2000.

[DOI:10.4324/9780203305195]