optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the...

9
Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers Ashish Tripathi 1 , Waleed M. Maswadeh 1 and A. Peter Snyder 2 * 1 Geo-Centers, Inc., Gunpowder Branch, P.O. Box 68, Aberdeen Proving Ground, MD 21010-0068, USA 2 U.S. Army Edgewood Chemical Biological Center, Aberdeen Proving Ground, MD 21010-5424, USA Received 23 July 2001; Accepted 23 July 2001 SPONSOR REFEREE: Professor Kent J. Voorhees, Department of Chemistry and Geochemistry, Colorado School of Mines, Golden, Co 80401-1887, USA Experimental procedures were investigated to improve the efflux of biomolecule pyrolyzates from quartz tube pyrolysis under atmospheric pressure ionization mass spectrometry conditions. Heating regimes, airflows, and ion focusing parameters were optimized to increase the informative mass spectral signals generated from the pyrolysis of Gram-positive bacterial spores and vegetative cells. Dipicolinic acid DPA) is found in 5±15% by weight in Gram-positive Bacillus spores, and the parameter optimization procedures provided an intense mass spectral signature of the m/z 168 pro- tonated DPA molecule with a minimization of pyrolytic and ionization fragments. Moreover, mass spectral information from the optimization protocols yielded peaks and mass patterns characteristic of DNA and RNA nitrogen bases, protein diketopiperazines, and amino sugars. Copyright # 2001 John Wiley & Sons, Ltd. Pyrolysis Py) is a relatively simple procedure for the examination of very complex solid samples. Pyrolysis transforms a solid sample into a vapor by rapid heating, and interfacing a pyrolysis probe to an atmospheric pressure ionization API) source of a mass spectrometer provides for a convenient solid sample processing introduction system. 1,2 Relatively soft ionization with a minimum of energy transfer to the analyte takes place in API, because a proton transfer is involved in the ionization phenomenon. 3,4 Thus, the concept of Py-API-mass spectrometry is composed of a combination of a relatively destructive, yet convenient, solid sample processing method with a mild ionization technique for mass spectrometry interrogation of the ions. Applying Py-API-mass spectrometry to the characteriza- tion of biological samples such as biopolymers and bacteria has a limited history. 1,5±7 Gram-positive Streptococcus bacteria were investigated for the presence of inherent biological material. 7 Masses characteristic of DNA, protein and relatively low mass peaks m/z 90 and 108) of the cell wall muramic acid amino sugar were observed. Conventional electron ionization EI) and chemical ioniza- tion CI) in low pressure 1±10 Torr) ionization sources of mass spectrometry analytical instrumentation have been used to a greater extent for the characterization and differentiation of pyrolyzates of complex biological species such as biochemical macromolecules and bacteria. 8±13 Gram- positive Bacillus spores have been extensively investigated by Py-mass spectrometry utilizing dipicolinic acid DPA). DPA is found in Gram-positive Bacillus and Clostridia spores at 5±15% levels by weight, 14±16 and this has been targeted as an important mass spectral signature or bio- marker for the presence of these bacteria. In particular, Bacillus anthracis BA) contains DPA, and pyrolysis methods are an attractive technique in the liberation of this compound and its fragments from BA as well as other Bacilli. 17±24 BA is of concern because of its potential for utility in biological warfare aerosols and biological terrorism scenarios. 25±28 Pyrolysis is considered a relatively harsh sample proces- sing method for DPA which is a relatively thermally labile compound. To further complicate matters, EI in general provides a significant amount of energy in the ionization process that results in little to negligible DPA molecular ion intensity m/z 167). 18,21 Thus, controlled pyrolysis conditions and relatively soft ionization methods are required in order to liberate and ionize the DPA Gram-positive spore bio- marker as an ionized, molecular species. Pyrolysis coupled with positive and negative CI 22 and electron capture negative ionization 23 have been used in the investigation of the pure DPA compound and its presence in bacterial spores. When coupled with pyrolysis, the technol- ogy of electron monochromator ionization has been used to produce molecular DPA at m/z 167 as virtually the only peak in a Bacillus cereus preparation containing 1% spores. 23 The current work has improved the Py-quartz tube-API mass spectrometry technique on the mass spectral response of a wide variety of biomolecules in bacterial spores at fewer than 200 Da. In particular, the pyrolysis event, ionization and *Correspondence to : A. P. Snyder, U.S. Army Edgewood Chemical Biological Center, Aberdeen Proving Ground, MD 21010-5424, USA. E-mail: [email protected] DOI:10.1002/rcm.427 Copyright # 2001 John Wiley & Sons, Ltd. RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001; 15: 1672±1680

Upload: ashish-tripathi

Post on 06-Jul-2016

214 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers

����������� � ��� �� ���� �� ������ �������� ��� ���� � �������� ���� ����� ���� � � ��� ��� ����� ����� ��� ����� �� �

Ashish Tripathi1, Waleed M. Maswadeh1 and A. Peter Snyder2*1Geo-Centers, Inc., Gunpowder Branch, P.O. Box 68, Aberdeen Proving Ground, MD 21010-0068, USA2U.S. Army Edgewood Chemical Biological Center, Aberdeen Proving Ground, MD 21010-5424, USA

�������� �� �� � �� �������� �� �� � �

SPONSOR REFEREE: Professor Kent J. Voorhees, Department of Chemistry and Geochemistry, Colorado School of Mines, Golden, Co80401-1887, USA

���� ������ � ����� �� �� � ����������� �� ��� ��� ��� ���� � ����������� �� �������� ��

��� �� ���� �� ������ ��� �������� �� � ���� � �������� ���� ����� ���� � ��������� ������

������� �� ����� �� �� ������ �� ����� � �� � ��������� �� �� ���� ��� �� ������ ����

����� �� ������ ��� ���� �� ��� �� ������ � � �� �������� ����� ��� ��� �� �� ���������� ������

!��������� ���� "!#$% �� ��� � &'(&) �� ������ � � �� �������� *������� ��� ��� �� ���

�� ����� ����������� � ����� �� � ������ � ����� ���� ����� �� ������ � � ��� ��� (+, � �

������ !#$ �������� ���� � ���������� � �� ������ �� �������� ������� -� ���� � ����

����� �� �� ����� �� ��� ����������� � ������� ������� ����� �� ���� ����� � ��� ���� �����

� !.$ �� /.$ �� ��� ������ � ���� ���������� ������ �� ���� ���� �� 0��� ���� � 122(

3�� 4���� 5 6��� 7���

��������� ���� �� � ���������� ������ �������� ��� ���

����������� �� ���� ������� ����� �������� ���������

���������� � ����� ������ ���� � ����� � ����� ������!"

��� ����������! � ��������� ��� � �� �� ����������� �������

����#����� ���$� ����� �� � ���� ������������ �������� ��� �

���������� ����� ������ ���������! ����������� ��������"�

���������� ���� ����#����� %��� � ������ �� ����!� ��������

�� ��� ������� ��&�� ����� �� ��$" ����� � ������ �������� ��

�������� �� ��� ����#����� ������������"' (��" ��� �������

�� ��)��$)���� ������������ �� �������� �� � ��� �������

�� � ���������� ����������" ��� ����������" ����� ������

���������! ������ %��� � ���� ����#����� ������*� ���

���� ������������ �������!����� �� ��� �����

�������! ��)��$)���� ������������ �� ��� ����������#�)

���� �� ����!���� ������� ��� �� ���������� ��� �������

��� � ������� ���������"+,- .���)�������� /�����������

������� %��� �������!���� ��� ��� �������� �� ��������

����!���� ���������- 0����� �������������� �� 12�" �������

��� ���������� ��% ���� ���&� ���� 3 ��� � 4� �� ��� ����

%��� ������ ���� ����� �!�� %��� � �������

5����������� �������� ����#����� �6$� ��� �������� ����#�)

���� �5$� �� ��% ������� ��,� (���� ����#����� ������ ��

���� ������������ ���������� �������������� ���� ���

��� �� � !������ ������ ��� ��� ����������#����� ���

��������������� �� ������#���� �� ������� ����!���� �������

��� �� ���������� ������������� ��� ��������4,�� .���)

�������� 7������ ������ ���� ��� ����������� �������!����

� ��)���� ������������ ����#��! ����������� ���� �1����

1�� �� ���� �� .���)�������� 7������ ��� 5���������

������ �� +,�+8 ������ � %��!��"�',�9 ��� ���� ��� ���

���!���� �� �� ��������� ���� �������� ��!����� �� ��)

���&�� ��� ��� �������� �� ����� �������� $� ���������"

������ ��� ���� �7�� �������� 1��" ��� ��������� �������

��� �� ���������� ������*� �� ��� �� ������� �� ���� �������

��� ��� ���!����� ���� 7� �� %��� �� ����� 7��������-,�' 7� ��

�� ������� ����� �� ��� ��������� ��� ������ �� ����!����

%������ �������� ��� ����!���� ��������� �����������+,�4

��������� �� ���������� � ���������� ����� ������ ������)

���! ������ ��� 1�� %���� �� � ���������� ��������� �� ���

�������� (� ������ ���������� �������" 6$ �� !������

�������� � ��!�������� ����� �� ����!� �� ��� ����#�����

������� ���� ������ �� ������ �� ��!��!� �� 1�� �������� ���

��������� ���� �9-���4"�� (��" ���������� ��������� ����������

��� ���������� ���� ����#����� ������� ��� ��*���� �� �����

�� �� ����� ��� ����#� ��� 1�� .���)�������� ����� ��)

���&�� �� �� ����#��" �������� ��������

��������� ������ %��� �������� ��� ��!����� 5$�� ���

�������� ������ ��!����� ����#������� ���� ��� ��� �� ���

�������!����� �� ��� ��� 1�� ������� ��� ��� �������� ��

�������� ������� :��� ������ %��� ���������" ��� �������)

�!� �� �������� ������������� ����#����� ��� ��� ��� ��

������ �������� 1�� �� ��� �9- �� �������� ��� ���� ���&

�� � ������ ���� ����������� ���������! �8 ���������

(�� ������ %��& ��� �������� ��� ��)*���# � �)��$

���� ������������ ������*� �� ��� ���� �������� ��������

�� � %��� ������� �� ���������� �� �������� ������ �� ��%��

���� � 1�� $� ���������" ��� ��������� �����" ����#����� ���

*������������� ��; �� �� /�����" <�/� ���� 6�!�%��� 5�������7����!���� 5�����" � ������ ������! .����" 01 �� � )+'�'"</��6)����; ��������=� �������!�����������

1>$;� �� �?����'�- 5�����!�� � � � ��� :���� @ /���" A���

���$1 5>00<2$5�($>2/ $2 0�// /�65(�>06(�B

����� ������ �� ��������� � �� (&; �9-�,�94

Page 2: Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers

��� ������! �������� ��������������� ��� �������!���� ���

������� ��!��� ��������� �� 1�� �� ��� ���� ��� �� .���)

�������� 7�������

�8#�/9-�.:$7

6����� � ��� ����1���������� ���� �1���" �� �"9)����� ������������" ��������

5��������" 0��%�&��" :$ +�� �" </�� %�� ��������� ��

������#��" ��������� %���� �� �� �!?�A� C�� ���� ������)

����" ��+ �A%��� ���� .���)�������� ������ ��� ��!�������

����� �� ������ ��� ���� �7��" �� ����� ���� �������� �7.� ���

�� � �������� �7(� %��� �������� �� ���������� ��

������#��" ��������� %���� �� �� �!?�A" ��� ��� ��� 7������

%��� ����)&������ � ��)�!?�A ��������� �� ��� .���)

��!����� ������� �������� �6D� ������� %�� ���� ��������

��� ����)&�����" ��� +)�A ���*��� %��� ��� ��� ����

����������� 7. %�� ������ ����� �� ������� �����)

���������! 1�� ��� �� � ����!��� ��� 7� �� ������ �������

����������� ���������� 7( %�� ������ ����� �� ����

������� ������ ���������! 1��� 7( �� ���� �� � �� �� ��

���������� ����������� ���� ��� ������� ���� ���������� 7(

�������� � ������� ���� �� �� ����������� ��� �������� ������

�������� �� �!�������� ������ ��� ����� �� %����� 6D %��

������ ����� �� ���� ��� ������� 1�� �� �������� ��������"

��� �� �� ��� ���� .���)��!����� ��!����� �������� � ���

6������������ ���������� �!���� ��� ������" ��������

��������� ������������� ������� C���������" 6D �� �

����!��� ��� �����!���� .���)��!����� ��!�������

7�������� !��%�� ��� ����� ��������� ��� ������ �� �� ���

�����%��! ���������� � 7������ ����� %�� �����&�� ���

��������� ���� �� �!�� ����� ���������! ���������� ��� �!��

�(/�� ��� +8 �����E� ���� ��� ��� ���� ������!�� ��

�-°5� � ���!�� ������ %�� �����&�� ���� �� �!�� ����� ���

��� ���� �� �-°5 ��� � �� ',9 � �� ���� ����� %�� ���� ��

!��%�� �� ��� ������ (�� �������� !��%�� %�� ������� ����

��� �!�� ����� ��� %�� �������� �� ������� ���� �� �������

+ �A �� ��� �������� ��������� %��� �������� ���� ���

������ �� ������� ���������� ����� �2/0� �� �� �!�� �����

��� ������ ������ %��� � ���� ��������� (���� ������ %���

��� ���� �� �-°5 ��� � ���� ���� ����� ��������� �������

������ ������� ��%��� ��������� /���� ��������� %��

��������� ���! ����� �������� ����������� F�!������� �����

�������� �� ���&" � ���! ����� �� ����� �� ���! ������ �������

�� ������� /����� ������ �� �������" ��!��� ���������� �����

������ %����� ��!������� ����� �� ����)�������!� .��%�� %��

������� ���� ������ ��� %����� �%��� %��� � �A �������

%����" ���������� �� ������� %����" ����)&����� ��� ������)

��#��� F�!������� ����� %��� �������� � ��������! ��������

�������� ���� (/� ��� �����E� ���� �!�� ������ �� �������

%���� �� � ������� ������������! �� � � 0�C������

����������3 (��� %�� ������ �;� " ��� � �A �� ��� �;�

��������� %��� ����� �� � �A �� ������� ����� (��

������� ���� %�� ��� ���� ������!�� �� �� ���� �������)

���" �������!��" %����� �%��� %��� � �A ������� %����"

���������� �� ������� %����" ����)&�����" ��� ��������#���

��� ������ %��� ��������� ��� � ��� �� &��� ��� ��!�)

������ ����� ��� ������� ������ ��� ���� ������������ %���

������ ��� &����� ���� 7�������� ����� � �7A)�� ����������"

%���� ��� ����� ��!������ %��� ������� ��� ���������

���� ������� ������ ����� 7A)� �����������

#� ������ � �������� 5������� 1��� /������ �5������� 1��� /������" >�����"

�� �3�9�" </�� *���# � � ������� � ������ ���� %��

���� (�� ������� � %�� �������� ���� � !���� � � �������

�� ��� ���� �C�!� ��" ��� ��� ��� � %�� ������ ��� ����

���������� !��)��!�� � F����� ������� ����� �� ��� *���# � �

����� �� ��� �� ��� ���� �� ��� !���� ��� �� (�� *���# � �

��� � � �� ���� ��� �� ��+' �� ���!� � ����� ����� �� *���#

%��� %�� ������ ���� ��� *���# � � ���%�� �������������

�9�+ �� � ��+ ������� ���� ��� ���� �� ��� *���# � ��

Figure 1. Schematic of the pyrolysis probe in the glass tube guide and details of theairflow region.

5�����!�� � � � ��� :���� @ /���" A��� ����� ������ �� ��������� � �� (&; �9-�,�94

���������)��$)0/ �� ������� �9-�

Page 3: Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers

0��������� ������ �� ����!���� ������ %��� ������ �� ���

*���# %��� � � �����!�" ��� ��� ������ %�� ����� �� � °5��� � �� � ���% �� ��� ��� ���� � !�� �������� %�� ��������

���� ��� ��������� ��!��� � ��������! ��� ��� ����!� ���

*���# � � ���������! ��� *���# %��� ��� ������� (��

������%� ��� ��� ��� �G��� ��� *���# %���)������ ����)

%���� (�� ������� � ��%�� ����� %�� ��� �� �����������

�� ' " + " 9 ��� - °5 ��� ��� ������ ������������

0���������� �� ��� ����� ����������� ���! � (��� H

�>��!� 6�!�������!" $���" /�������" 5( 93 -" </��

����������� �������� ���� ��� *���# %��� ������ ��� *���#

� � �C�!� �� %��� � " ��+" �+ ��� ' °5" ������������� ������������ ����������� %��� �������� �� ��� ������

������! ���� �� ��� ������� ���� �� � °5?�� (�� �����

������! ���� %�� � ��

-��� ����� ����� (�� !���� � � ������� � ����� �� %�� �������� ���� ���

������! �� ��� ��-3 A ����)!������ �����" �����������

������� ����#����� ���$� ��!��� �� �� ��$ $$$� ������

*������� ���� ������������ �/����" 5������" >������"

5����� A'H ' 4�� (�� ����#����� �� ������ ������ ����� �

� ������ �� �����)��)����� ������ �������!�� ������� ���)

����� ��� ����#�� � ������! ������ %��� � ����������

%���� ������� � ����� ��!��� ������ �� �� ��������� ��%���

����������� ������� ��� ����� 2����!�� !�� �� �����

���� ���� ��!��� �� ����� �� ��� ��� �������� ��� ����������"

�������� ������� �� ����� �� ���� ��� I0�DJ� ������� ���

�� ��� �������� ��� ����� F����!�� ��� � �������� �� ����

��!��� � ��� >� ��� �> �������� �� �� �� ������ ����!�

���� ��� �������� ����" ��� ���� ������� �� &��%� �� �)�����

���������)������ ������������ �� ������ 5$1�� ,�' >� �� ���

�����!� ������� �� ��� ����������)��)���� ������� �����"

��� �> ������ �� ��� �����!� ������ �� ��� ��� ������!

*������� ����� �� �K �� C�!�� � �������� ������� �� ���

������� � ����� ��)��$)����� ��!��� �� ��� ����������

�������������

C�� ������ ���� ������������" ��!�� !�� %�� ��������

���� ��� ������� ��������� ���� ����!� � � � �� ��� ��� �� ���

*�������" ��� ���� ��� ��!�� ����� ������ � %��� �� !��

������������ �� ��� ��� ���� (�� ��!�� �� � ��*�����

���#�� ���� ��� �-,� ° H ����� ������� �� ��� ����� �� ���

���� �� ���! � ����� �������� � ��������� ��� �� �

���!������ ������ ����!� ��� L������E �� ��!�� !��" ���

��� ����&���� �� ��� ��!�� ��������� !�� L������E %��

������������� 9 � � �� ��������?���� 6���������� %���

�������� %��� � ��������� ��� ���������� �� + °5" ��������% ����!� ��� ��������� *���# � � �� �9 �A?���"

>� M � F" ��� �> M 9 F" ����� �����%��� ����������

6����������� ����������� %��� ��������� %��� ��� �����

�������� � ��� /���� ����������� /������� �� ��� �������

%��� ������ �������� ���� ��� ���� �������������

/�6;7:6 $.! !960;669�.

(�� ��G�� � G������� �� ��� ������� %��& %��� �� �������� ���

����������� ��������� �� ��� ������#��� �� ����!����

� ������� ��� �� ����������� �������� ��� ������#��� �� ���

���� ������������ �������� ���� ��$ ����������� 5�����)

������ *���# � � ��)���� ������������ ��������� ���

����� �������� ���� ��% �������� ��,� (���� %���

�������� ����#����� �6$� �� �������� ����#����� �5$�� (��

�������� �������� ��������������� �� ��� ������#��� ������)

��� ��������� ��� ���������� �� �������� �� ��� ������#��� ����

��� *���# � �" ����!� � ������ �������� ����" ��� ���� ���

6$ �� 5$ ������ ������� ������#��� ������� ��� ���������

������ � ��������� ��������� ��������� %��� ��� ������

������� ������)����� �������� ������������� &�������� �� �

��� ���������! �� ������ �������� ����!� %����� ��� ������)

#��� �������� �#���)����� ������������� &��������� (����

Figure 2. Schematic of the Pyroprobe assembly in Fig. 1 interfaced to the API source.The ion focusing and up-front CID OR-RO voltage elements are also shown.

5�����!�� � � � ��� :���� @ /���" A��� ����� ������ �� ��������� � �� (&; �9-�,�94

�9-' �� (�������" :� 0� 0��%���� ��� �� �� /�����

Page 4: Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers

������������� ����%���" ������! ��!����" ������%� ��� ���

������! ���������� %��� �������!���� �� ��)��$)����

������������ ����������� %��� ������� �� ��� ������� �����)

����" �������� ��� ��������� �� ��� ��������� ��� ����!���)

����� �� ��� 1�� ������� ���� �� .���)�������� 7������

�������

#� $#9 ���� ����� � � !#$1�� ��� � ���!����" ��������� ���� ����" ��� ���������

�����&�� �������� ��� ��� ���������� �� ��� �������� ��

7������ �������� �������� C�!�� � �������� ��� ���������

������ ������ ���� �� 1�� �� ��������� ������% �����

����!� ��� ������� � �� � ��� ���������� �� + °5� $� ��� ������ ���� ��� ���� �� ������% �������� ����!� ���

��������� ��!��� ����� �� ��������� ���� �� ��� ���������� ��

�������� �� ��� ������#��� ������� �� ��� ��$ ������ (��

!������ ��� ���������� �� �������! ��� �������� ����!� �� ���

������#��� ������� �� ��� ����������� �������� ��� ���

������ ��� ������� �� ��� ������#��� ���� ��� ������ *���#

� �" ��� !������ ��� ��� � ����� ��� ��� I0�DJ� ��� ��!���

���� ���!����� �� 1�� �� ����� ��� ����#����� ������ ��

�� �A?��� ������%�" � ������ ����� �� 1�� �� ���

���� �� I0�DJ� �� �������" ��� � ��!�������� ����� ��

��� ����������� ������ ����� �+ �� ���� ������� A�%����

�������� ����������� �� ���������� �� �98� �� ��� ��' ���

���������� �������� ��8� �� ��� 4 ��� ����� (�� ����� ��

C�!� � �� �9 �A?��� ���%� ��� ��)��$ ���� ������� ���

1��� (���� �� � ���� ����� ����� ����� ��� %���� ���� �

������ � ������ �� %���� ��� 5> ���� ��� ���������� 1��

�������� :��� ��� ������% ����!� ��� ��������� ��!��� ��

������" ��� ��!��� ���� ������� �������� ��� ��� ��%��

���� ������� ����������� ���� ���� ���������� �������� ��

��� 4 ������� %���� �� ������% �� ������� �� ��� *���# � �

�C�!� ��� (���� ����������� ���% ��� ���������� ��!� ����)

������ �� ��� ������� ��������� ������ (��� ��" ��� ���������

����� ������� ������ 1��� ��%����" ��� ���� �� ������� ��

��� 1�� ������#��� �� ��� ������� ��������� ���� �����)

����� ��� ����� �� ��� ���� �������� ��������� �� 1�� �� ���

�������� �� ��� ����������� �� 1�� ��� ��� ���������

���!������ :��� ��� ����� ������� �� ��� ��������� �������

�����%�� � ��������� �� ��� ��$ �����" � ������� ������ ��

��� ������� ������#��� ����� ��� ��������� �������������

������� �� ��� ������� ��������� ������� ��� � � �������

�� ���������� ��% ������%�" ��� 1�� ������#��� ��� �

!������ ��� � ����� �� ����������! %��� ���� ��� ��� ���)

����� ��� ��� � � %���� ���� �� ���������� ��!��� ������%��

(�� ������������� �� ��� ��������� �� ��� 1�� ���� ��������

�� �����!�� ��������� � ��� ��% ������% ����� �C�!� �� ��

����������� ������� �� � ������ ������� ��!��� �� ����

�9�+ �� ��� ��� ���� ��� � ��� �� �� �� ����������

��%��� ��� ��� ��� �������� ��� ��� ������ *���# � �

%����� (��������" ��� ������������� �� 1�� ���� �������� ��

��������� �� ���� ��������� � �����)����� &������� �����

�� ��� ���������� ��%��� ��� ��������� �� ��� 1�� ��� ���

��� ��� �������� ��� ������ %���� �� ��� *���# � �� $�

��������" ���������� ��!��� ������% ����� ����% ��� ���������

������� �� ��� 1�� ������� ��������� ������� (��� ����%�

��� � ��%�� ����� �� ���������� ��%��� ��� 1�� ������#���

��� ��� ��� ��� �������� ��� ��� � � %����

� ���� �������� �������� �� C�!� � %��� ������� �� ���

!��������� �� ��� !����� 1�� ������� ��� ��� ��������

������������� ������ ��� � ���� �� C�!� '� C�!�� '

Figure 3. Graph of the airflow rate through the quartz tube pyrolysis source and theintensity distribution of m/z 168, 150, 124 and 80 from the pyrolysis of DPA. OR, 30 V; RO,60 V; 500°C pyrolysis. Inset shows Py-API mass spectrum at 36 mL/min of bottled airthrough the quartz tube.

5�����!�� � � � ��� :���� @ /���" A��� ����� ������ �� ��������� � �� (&; �9-�,�94

���������)��$)0/ �� ������� �9-+

Page 5: Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers

�������� ��� �������� ��������� ����� �94 ������� � ��� ��

�� ��� 4 ���������� ��� �94 �� ���� �� ��� ���������� �� ���

������#��� ��������� ���� �� ��� ������ *���# � �� �� ���

��������� ���� ���������" ��� ����� �� !��)����� 1�� ����

������� ��� �����!� ����!� ��� ������ *���# � �

���������� (���� �� � �����% %����% �� ��������� ���� ����

�������� � ���������� ���!� ���������� �� ��� �������

��� � ����� �� !����� 1��� (�� ���������� �� ��� ���������

���� �� �*�� �� ��� ���% ���� ������� � ��� ����� �� ���

��������� *���# � �� ���" ��� ���������� ��������� ���� ��

������������ �� ��� ���% �����

C�!�� + ���%� ��� ������ �� ��������� ��������� ���

����������� �� ��� ��$ ���� �������� ������ ������ ����

�� 1��� �� �������� �� ��������� ���������� �������� ��

�������� �� 1�� �������������� �� �������� �� ���������

�� ��� �+ ����������� 1���" ��' ����" ��� �1��)D�>)5>�

��� 4 ���������� �� � ������� ����" ��� ����������� �� ��� � 9

��� -4 ������ �� � ��������� �� ������� (�� ���& �� ��� � 9

��� ����� ���� � ���� �� 5>� ��� %���� ���� 1��" ��� ���

-4 ���� � �� �� � �������� �� ��� �������� ���! %��� � ����

�� �������� �����!���

(�� ��!���� ��� � ���� ���� ��� � ��������� ����� �+ "

��' ��� ��� �� C�!� � ��� + �+ °5 ���������� ���� � �� ��

��� >�)�> ��������� ���������� �� ��� ����������)��)

���� ��������� �C�!� ��� C�!�� 9 ���%� ���� �� � ���"

����� ��� ��������� �� ��� �94 ��������� ��� ����

������� �� >� M � F ��� �> M �� F� >� %�� ��� �� � F

%���� �> %�� ������ ���� �� �� 3 F� 6����������" ���� ���

�94 �� � ������ %��� ��� ��������� ���������� ��%��� >�

��� �> �� �,�' F� (�� ��$ ���� ������� �� ��� ��������� ��

1�� �� �> ����� �� �� ��� 9 F ��� ���%� �� ������ �� C�!�

9� C�� �����G����� �� �����������" �> M 9 F%�� ������ �� �

���������� �� ������#� ��� ��!��� �� ��� ��� �94 �������

��� �� ������#� ��� ��%�� ���� 1�� ���!�����" ����

�������� �����" ��� ��� ��������! ���������� ��� �������

������#��� �������� C�� �> ����� !������ ���� - F" �)�����

5$1 ��&�� ����� �� �� ��� � ��������� �� ��� 3'" %���� ��

Figure 4. Plot of the reciprocal of the residence time of the pyrolyzate molecules in thequartz tube pyrolysis region versus the intensity of m/z 168 divided by the sum of theintensities of m/z 80 and 168.

Figure 5. Py-API mass spectra of DPA at different pyrolysis settemperatures. OR = 30 V; RO = 60 V; 36 mL/min airflow.

5�����!�� � � � ��� :���� @ /���" A��� ����� ������ �� ��������� � �� (&; �9-�,�94

�9-9 �� (�������" :� 0� 0��%���� ��� �� �� /�����

Page 6: Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers

��������� �� � � �����!��) ���� ���! ���!���� �� 1���

C�!�� + ���%� ����" �� ��� ��!��� ��������� �����������"

�����!��) ���� ���! ���!����� ��� ����� -4 ���� �����������

��� � ���� ����� ����� �� ��� 3' ��� � �������

(�� ��)��$ ���� ������� �� 1�� ���!�" ����� �� C�!� �"

+ °5 ���� ������� �� C�!� +" ��� ��� �> M 9 ����

������� ����� �� C�!� 9� ��� � �������� %��� ����

!�������� � ������������ 6$ ��� �������� 5$ ���� ��%

������� ��,� (���� ���������� %��� ������ 5���)����� %���

��������� �� ������ ������ ��� � ������!� 6$ ���� �������)

������-"�4"�� ���������� --" -3" � + ��� ��� %������� -3 ��

��� ��� � ��� ��� ���&� 6������� ������ ��!����� ��� ����

��������� ������� �� ��� �9- �������� ��� ��� ���& ���

1�� %��� ���������� ����� ������ �� ����� ������� (��� ��

� ������ �� � ������� �� ��� ��)��$ �������� ��� ����

������� �� C�!� 9 �>� M �� F" ������� �������� 5$ %���

��� ���� ������� �� I0�DJ� 1�� ��� ���& �� ���

�94" ��� 4 ��� �������� �� 8 ���������� ��� ��� ��' ��� ��

�� 8 ������������+ 5������� �� ��� ������� %��&" ��� ����)

������� ������� ��� �+ ��� ��� ����� �� %���� ��� 5>�

%��� ��� � ������ �� ��� 6$ ��� 5$ ���� ���������-"�4"��

� ���������� �� ��� ������ �� 1�� ��������� ���� ��$

���������� ��� ������������ ����#����� �6/$� �� ���%� �� C�!�

-� �� �� >�" �> �� � F" 9 F" ��� ������ �� ���� ��������

����������� ��� �����&� �� ������� ��� ��� �94 ��� �+ � (��

���� �� %���� ��� 5> �� ���� ��� ��� �� ��!���������� !������

�� 6/$ �������� �� ��)��$" ��� ���������� ��" ��� ��'" ��

��� ������ ���� 6/$ ����������� A�% ������ �� ��� ��� ���

��' %��� � ������ ���� ��)��$ �����������

#� $#9 ���� ����� � � ����� ��C�!�� 4 �������� ��)��$ ���� ������� ��� ��� ������ �� �����

��������� 7������� 7� ��� 7. ���% � ��� ���& �� ��� �94 ���

1�� %���� ���� ���� �� ��� ������ ���� ������� ���& �� ���

7( ���� �������� � ���& �� ��� ��' �� �����������

��������� �� ��� ����� ���� ������� ��� ���� �� ���� ��&���

Figure 6. Plot of RO voltage versus each m/z 168, 150, 122 and 94 intensity divided by the sum ofthe intensities of the four ions. Insets show the Py-API mass spectra at select RO voltages. OR,30 V; 36 mL/min airflow.

Figure 7. Comparison of the Py-API and ESI mass spectra ofDPA. OR, 30 V; RO, 60 V. 36 mL/min airflow was used in thepyrolysis-API experiments.

5�����!�� � � � ��� :���� @ /���" A��� ����� ������ �� ��������� � �� (&; �9-�,�94

���������)��$)0/ �� ������� �9--

Page 7: Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers

��������� ����� (�� ��� 4 ���&" ���������� ��������" �� ��

��!��!� �� ��������� %��� ������� �� ��� ��� ���& ��� ��� �����

������� 0����� ���� ��� � ������ ��� ����� ����� �� ����������

�� ��� ���������� ���� ��� ��� ���" ��������� ���" ������

��-" �������� ��9" �������� �'� ��� �''" ���������� �!��

���!����� ��� �+�" !������ 6��� ��!����� ��������

������� �� ������ �������� � �� ��� 3-" � �" ���,��9"

���,��9 ��� �'9� (���� ���� ������� ���� ��&��� ����� ����

��� ��&���������#��� ��������� ������� ���� ��� ��������

����������"+"- ���&� �� ��� 4' ��� 49 ������ �� � �����!��)

���������! ����)!��� ��������� ���!����� ���� ��� �����

���� ������� �� ��� �������� ������� �����������"+"- 6$ ����

������� �� 7� �������-"�4"��"�� ������� �������� ��� ������)

����� �� ���� �� ��� I0�DJ� ������ � ������ �� ��� ��)

��$ ���� ������� �� 7� �� C�!� 4���� 0��� �� ��� ��)��$

������ ���� 7. ������ �C�!� 4� �� ������� ������ �� �� ����

�� ��� ���� �������� ��� 5$�� ���� �������� (��� �������

��� ��� ��% ��� ��!� ���� ������

7������ �� ����� ���� ���%� ���� ��� ��)��� ���� ��������

��� 5$ ���� ������� �� �)������������)A)������)A)���)

!�������" �� ����� �!��" ��� ���&� ���� ������ ��� � �"

�� " �''" �94" �49 ��� � '� ��&��� �� ��� ���� ��� ��)

������� �������� ��� 5$ �� ����� ������ �� ��� � �" ��9" �94

�� 8 ����������" �49 ��� � ' ��� �)������!���������"�9 %���

��� ������ ����� ���� �������! ���� ����������� ����������

����� �!��� ���� �� ��������� ���� �� ��� ���� %���

������� �� .���)�������� 7��������-,' (���� ������ �� ������

��� ���� � ���� �� ��� ��)��� ���� 5$ ���� ������� ��

7. �������� ��� ��� ��)��$ ���� ������� �� C�!� 4���,��� ���

Figure 8. Py-API mass spectra of the spores of (a) Bacillusanthracis, (b) Bacillus subtilis var. niger and (c) Bacillusthuringiensis. OR, 30 V; RO, 60 V; 500°C pyrolysis; 36 mL/minairflow.

Figure 9. Py-API tandem mass spectra of m/z 168 from (a) B. anthracis and (b) DPA. (c)ESI tandem mass spectrum of m/z 168 from DPA. OR, 30 V; RO, 60 V.

5�����!�� � � � ��� :���� @ /���" A��� ����� ������ �� ��������� � �� (&; �9-�,�94

�9-4 �� (�������" :� 0� 0��%���� ��� �� �� /�����

Page 8: Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers

7������ ������� (��" ��� ��)��$ ���� ������� ���% � �����!

����������� ��� ��� �������� �� �����!��) ���� �!���� $� ���

��� ���� 5$ %��& �� 7." ��� �94 %�� ��������� ���!�� ��

���!����� ������������� ���� 1��� ��%����" ������ ����

������������ �������� ���� ��� ���� ������ ��������� ��

����� �!�� ��!������ ���� �� ��� ������ ����� ���)

������� C�!��� 3��� ��� 3� � ���% ���� ��� ��)��$ ��� �94

���� �������� ������ ���� 7������ �� C�!� 4 ������� �� ���)

������� %��� ��� I0�DJ� �� 1��� (�� 6/$ ���� ������� ��

1�� �C�!� 3���� ���� �������� ��� ���� ������ ����

������� ��� 1�� �������� �� ��� ��)��$ ���������� ����

���� �� 1�� ��� 7��

C�!�� � �������� ��)��$ ���� ������� �� ��!������� ����

������������ �� 7� ��� 7( �� %��� �� ��� 6D .���)��!�����

��!������ (�� 7������ ��� 6D ���% ���������� ��% ������ ��

��� �94� ��� ����� ��!������ ������� ��� ���" ���" ��-" ��9

��� �+� �� ������! ��!���� %���� �!!��� ��� �������� ��

��������" �����" �������" ������� ��� !����� �����!����

����" ������������" ���� �� 12�" �2� ��� �(� ��������

����������� �� %�� ��� ���� ��� ��� 7������ ������ �C�!� 4�"

������ � �" �� " �''" �94" �49 ��� � ' ������ �� ������ ������

�� ���!����� ���� ��� ����� �!�� ������� ���������

���!�������"�9 �� C�!� � ��� ��� � � �� (���� ������ %���

���� � ������ �� ��� ��)������� �������� ��� 5$ ���� �������

���� �������� ���� %��� �������!����� ��� ��!������� ����

������������ �� 7�" 7( ��� 7.��9 (���� ������ ��� ����������

��% �� ��������� ��� 6D �� C�!� � ���� (��� � ��������� ��

���������� %��� ��� ���� ���� .���)��!����� 6D ��� ����������

������ �������!����� ��� ����� �!��� �� ��� ���� %���

������������ F����� ������� �� ������ �������! ��� 39"

3-" � �" ���,��9" ���" ��3" �� ��� �'9 �!!��� �������

��&���������#��� ��������� ���!����� ���� �������� �������

�����������

0�.07;69�.6

>�����#����� �� ��� ������#��� ����� ���� ��� *���# � �

�������� ���� ��!�������� ���� �������� ���&� ������� ���

��������� �������! �� ����������� �������� (�� ����������

����� �������� ��%��� ��� ������ �� ��� *���# � � ��� ���

��$ ��!��� ����%� ��� �� ��������� �������� �� �������� ���

������������ ������#��� �������� /����� �����������" ����)

���! ��� ��������� ���� ��� ��$ ����� ��� �����!�����%���"

��� ��� ������ ��*���� �� ���� ��������� �� �������� ��

6$ ��� 5$� (�� � ��������� �� ������ ������������! ��

���������� �����!���� ����� ����" ������� ���&�" �����

Figure 10. Py-API mass spectra of (a) vegetative BA cells, (b) vegetative BTcells and (c) Erwinia herbicola cells. OR, 30 V; RO, 60 V; 500°C pyrolysis; 36 mL/min airflow.

5�����!�� � � � ��� :���� @ /���" A��� ����� ������ �� ��������� � �� (&; �9-�,�94

���������)��$)0/ �� ������� �9-3

Page 9: Optimization of quartz tube pyrolysis atmospheric pressure ionization mass spectrometry for the generation of bacterial biomarkers

�!�� ������� ��� 1�� �� ��)��$ ���� ������� ���

��������� ���� %��� %���� �� ������� ��� ����������#� ���

�������� �� �������� ������� �� � ������� (���� ��������

%��� ���� �� ������� ��!��� � �� ������������� � 1� ��

��� ������� %��&� C����� ������ �� ��� ������������ �� ���

�����?����� ���� ������� ��� �� ���!����� (��� �� �� ���������

����� �� ��������� ���� �������� � ��!�������� ������ ��

�������� ����������������

$�������������(�� ������ %��� ��&� �� ��&��%���!� 0�� A���� .� �����

��� ��� ����������� ��� ������! �� ��� ��������� ��� 0��

H���� /� D���� ��� ��� !��%�� ��� ���������! �� ���

������� ��������

/�<�/�.0�6

�� /����� ��" H����� D" 0�#����� DA5" :����! :"(�!��#���� H� ����� � ��� �34-� &=; �3'+�

�� /����� ��� ����� ����� � ��� �33�� (1; �39��� /���� " 2���� ." H� ���� �� ����� � ��� �344� +2; �� �'� /���� " $&����� 0." H� ���� �� ����� � ��� �344� +2;�� 4�

+� /����� ��" 6������ .�" :����! :� �� ����� ����� !���!��344� (>; �'��

9� /����� ��" H����� D" 0�#����� DA5" :����! :� �� ���������� !���!� �344� (>; --�

-� :����! :" A�� ��� /�" :�������� 07" /����� ��� ������ ��� �344� +2; �+ ��

4� $�%�� :� ����!����� !���!�" � ���������� �� �������; 2�%B��&" �34�� ���� 11" ����� ��

3� 0�#����� DA5" D����&��� " D������ C1� !���!� �������������! �# ������ ��� $��� �����������" ��������� �������� 6�������; ���������" �34��

� � F������� H� ����!����� !���!�" ��� ��%� ��� ������������7����%�����; A�����" �34'�

��� (�� �5" ��� �� .���� " 1�:���� " 7�%��� " (�� 2������� 7��% 05� �� ����� ����� !���!� �34+� ?; �'3�

��� ��� �� .���� " (�� �5" (�� 2����� �� 7��% 05� ��������� ��������� �344� (+; '+�

��� (�� �5" ��� ��� .���� � �� ��������� ��&� �33'� (>; �++��'� .��� .:" D��� � ������ � � ��������� ������ ��������

�����; 2�% B��&" �393�

�+� (����� 0:" 0��.�� " D������ :� ����� ��&����� �����������3-9� >(; �+�

�9� /������ (�" 2��������:A������ ��&����� ���������� � �� +?;��-'�

�-� F������� H" 1�A�� /" 2�!����� �� �� ����� ����� !���!��33�� 1@; ��

�4� 7������ 07" 7����� C" F������� H" D��N��� (A� ����������� �� ��������� �339� (2; ''+�

�3� A� /" 0��� " /��&�� ��!�� 1" D�����%��� �� $���� ������ ��� ��� ���� �333� >; �+-�

� � /����� ��" 0��%���� :0" ������� �" (������� �"0�#����� DA5" 1%��#���&� �" H�� 0).� $���� ����� � ������ ���� �333� >; ��+�

��� .������� �" /���� 7" .�� ��� �" (������ 60" 0�.������5" ��� ��! 7H" H��� 17" A�!�� 2�� ����� � ��� � � ?1;��3�

��� 7������ 07" F������� H" D��N��� (A� ����� ������ ����������� �333� (>; ��� �

��� 7������07" F������� H" D��N��� (A" 5��� �7������ � ���� � ?1; �'�4�

�'� /����� ��" (������� /2" 1%��#���&� �" 0�#����� DA5�$���� ����� � ��� ��� ���� �339� (; '3�

�+� O$��* N����� ������ �����! ����!���� %����� �������P�����' (�#���� )��*�!" �� �+" �33+� �9�

�9� Q�����&�� ��� �� ��� ���� ���� �33-� ?,; '�4��-� 5��� :/� ����� ��&� ���������� �334� 1@; �'3��4� 5���������� .:" 5�����& (" ������ �" 6��#�� 60 �� �� ���

���� ���� �33-� 1?,; '����3� A������� 6D" 7���%� �" D����� : �" (���� �� ����� �#

�������� �����������! ���� ����� �������� /������ ��� 0����) ����!�" �34 � ����� 34�

� � :�����! 0:" /����� ��" D����� 5/� ����� ������ ����������� �339� (2; ��+3�

��� D�������� 0" 7��� 0C" 5��� /�� ����� � ��� �33�� +&; 4--���� 1��! " 7�&���� :" H����� 17� ����� ������ ��

��������� �33'� ,; 3'���� 7�&��� �" C����� 7" ���� 20� ���� �������� ����� �� �3-'�

12; �����'� /���� �1" A�� �" 7�����!� 5" 6������ 5." <����� D�� ��

��� ���� �� ��������� �33 � (; +���+� 7������ 07" �������� ������������" �333��9� ��&��� �" ��� � (D" /����� " B�� �� �6" 6##��� :� �� �����

���� !���!� �34'� ?; �+��-� 0��# AA" 7����� (5" .������� �� �� ���������� �3- � (2(; �39��4� /�������� HD" H������ >� ��������������� ��&� �3-�� >+; ' -��3� ���� �D" 0����� .� ��&���� �� ��������� !�����!�

�������� ������ A�����" <H" �3-4�' � C������ 7�" ����� ��+����* �# �����������! ����� ����� :�

7� /������ 5��� ������������" ��" �3-3�

5�����!�� � � � ��� :���� @ /���" A��� ����� ������ �� ��������� � �� (&; �9-�,�94

�94 �� (�������" :� 0� 0��%���� ��� �� �� /�����