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Oncogenes Nei virus a DNA

Virus tumorali a DNA

Gli oncogeni virali

Le tre teorie: Virus, radiazioni, prodotti chimici virus

Virus a RNATERT

Microsatellite INSTABILITY MUTSHTP53

RBLOH

APC BRCA1VIRUS a DNA

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Famiglia tumori causati dimensioni del del virus nell’uomo genoma (kb)

Virus tumorali a DNA

Virus dell’epatite B carcinoma epatico 3 dsDNA SV40 e Polyoma nessuno (in animali solo) 5

Papilloma carcinoma cervicale 8 Adenovirus nessuno 35 Epstein Barr Virus EBV Herpes HHV-4 linfoma di Burkitt 100-200

(carcinoma nasofaringeo) sarcoma di kaposi Virus tumorali a RNA

Retrovirus leucemia T dell’adulto 9

Virus oncogeni

•  Virus a DNA (studi sulla trasformazione oncogena delle cellule, scoperta oncosoppressori) •  Retrovirus (hanno permesso la scoperta degli oncogèni)

La attività trasformante di un virus dipende da uno o più geni che appartengono al genoma virale L’oncogene causa dei cambiamenti che convertono la cellula normale in una cellula trasformata

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Come trasforma

un virus oncogeno a DNA?

VIRUS A DNA

genoma virale a DNA

RNA polimerasi codificata dall’ospite

mRNA virale

proteine virali

DNA polimerasi DNA-dipendente

(Codificata dal Virus

o dall’ospite)

Virus oncogeni a DNA

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Ciclo vitale latente

Virus

Cellula

Integrazione (generalmente)

EARLY FUNCTIONS- Virus-specifiche espresse - No virus maturi

Variazioni delle proprietà della cellula ospite - TRASFORMAZIONE

Cell is said to be virally transformed

Tra le diverse proprietà alterate della

CELLULA TRASFORMATA si ha:

•  perdita del controllo proliferativo (perdita dell’inibizione da contatto in cellule in coltura)

•  Invasione della matrice extracellulare

•  Mobilità

•  Ridotta adesione

•  Le cellule trasformate spesso contengono aberrazioni cromosomiche ANEUPLOIDIA

Trasformazione Virale

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Famiglia tumori causati dimensioni del del virus nell’uomo genoma (kb)

Virus tumorali a DNA

Virus dell’epatite B cancro del fegato 3 SV40 e Polyoma nessuno 5 Papilloma v.HPV carcinoma cervicale 8 Adenovirus nessuno 35 Epstein-Barr (herpesvirus) linfoma di Burkitt 100-200

(carcinoma nasofaringeo) sarcoma di Kaposi

Virus tumorali a RNA

Retrovirus leucemia T dell’adulto 9

Virus oncogeni

PAPOVAVIRUS: specie-specifici PA: papillomavirus PO: polyomavirus 2 generi VA: vacuolizzanti

• Virus senza pericapside • 40-50 nm di diametro • 72 capsomeri con 5-7 proteine • struttura icosaedrica • DNA bicatenario circolare di 5-8 Kb • Sede di replicazione: nucleo • Sono citocidi

PAPILLOMAVIRUS DNA 5 Kb Non crescono in coltura Oncogeni nell’ospite naturale 2 generi: POLIOMAVIRUS 6

DNA 3,3 .10 Crescono in vitro Potere oncogeno dubbio

Ribosoma 20nm

HPV può replicare solo nelle cellule in replicazione

Non-enveloped

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Papilloma HPV ���8Kb Closed CircularDNA ���

•  causano tumori naturali nell’animale

•  causano verruche benigne

•  sono ubiquitari

•  epiteliotropici - la maggior parte dei tumori umani derivano da cellule epiteliari (carcinomi)

• Tumori in : orofaringe, cervice uterina, vulva, pene………

• 10% of human cancers (16% in female) are HPV-linked

Papilloma Virus Il loro capside è di 55 nm, possiedono 7.900 paia di basi.

•  >100 tipi identificati - i più comuni sono i tipi 6 e 11 (basso rischio)

•  per lo più tumori cervicali (cervice uterina), vulvari e penieni, ASSOCIATI ai tipi 16 e 18 (70% dei tumori penieni),31,33,45

Infetta cheratinociti indifferenziati e proliferanti, entrando attraverso INTEGRINE ALFA6

La progressione attraverso la fase M è critica per l’infezione di HPV (early prophase, that includes nuclear envelope (NE) breakdown and changes in chromatin structure)

STUDI EPIDEMIOLOGICI : HPV 16 e HPV 18 trasformano i cheratinociti umani

https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1000318

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Tipo:31, 33, 45

Caratteristiche del capside 72 capsomeri 60 esavalenti - 12 pentavalenti

2 proteine strutturali: -  L1 proteina capsidica

maggiore peso molecolare di 55 kd rappresenta l’80% delle proteine capsidiche

-  L2 proteina capsidica minore

peso molecolare di 70 kd rappresenta il restante 20% delle proteine capsidiche

50 nm

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CIN: Cervical-Intraepithelial Neoplasia

Vaccino Gardasil:RICOMBINANTE, ADSORBITO

Virus Like Particles

Anni 12

PAP (da Dr. George Papanicolaou, 1943) esame diagnostico di primo livello, COLPOSCOPIA secondo livello Cellule anomale?

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-  è il secondo cancro prevalente -  è la quinta causa di morte nelle donne (breast, colon, lung, endometrial) -  colpisce ogni anno circa 3.500 donne e causa 1.000 decessi in Italia I fattori di rischio per lo sviluppo del tumore sono: •  Infezioni persistenti con Papilloma Virus (HPV) ad alto rischio •  Un largo contatto con partners infetti •  Co-infezioni con virus dell’immunodeficienza umana (HIV-1) •  Immunosoppressione •  Fumo • L'esposizione, durante la gestazione, a un farmaco chiamato dietilstilbestrolo (DES), prescritto a molte donne tra il 1938 e il 1971 per prevenire gli aborti spontanei. • L'infezione da clamidia o da virus herpes simplex di tipo 2 (tipi diversi di malattie sessualmente trasmissibili).

CANCRO DELLA CERVICE

Organizzazione del genoma e proteine virus indotte

7906

E7 E6

E1 E2

E5 L2

E4

LCR

0

L1

Long Control region

• L1 Proteina capsidica maggiore (attacco alle cellule) • L2 Proteina capsidica minore • E1 Replicazione DNA virale, stato episomico del DNA • E2 Replicazione DNA virale, controllo trascrizione • E4 Legame citocheratine, assemblaggio, coilocitosi • E5 Trasformazione cellulare (lega recettori EGF, PDGF) • E6 Trasformazione cellulare (lega p53) • E7 Trasformazione cellulare (lega pRb)

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CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia

Undifferentiated Basal cells with 100 episomes(Infected cells)

Suprabasal DIFFERENTIATED cells that have re-entered S-phase

E6E7

Low-grade Squamous Intraepithelial lesion

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L’aspetto morfologico specifico e patognomonico della presenza di HPV, in uno striscio cervico vaginale, si basa sulla presenza di coilociti (Cellula con buco), nucleo acentrico e ipercromatico, dislocalizzato da vacuoli perinucleari, che rappresentano l’effetto citopatico più eclatante di una infezione virale produttiva. Basilio Ubaldo PassamontiAz. USL Umbria 1Dipartimento dei Servizi – A.O. Patologia Clinica

Cheratinocita di controllo

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Alto Rischio: Persistenti, Integrati

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5383336/

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Integrazione DNA virale

Il virus si linearizza, Può perdere E1, E2, E5 o L2 Si integra stabilmente nel genoma della cellula ospite con 1 o più copie in tandemSintetizza le proteine trasformanti E6 ed E7, ciò comporta l’ immortalizzazione

The viral integration sites are distributed across almost all the chromosomes, except chromosome 22

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26735580

Un aspetto importante del ciclo vitale degli HPV è la capacità di stabilire infezioni persistenti negli epiteli cervicali squamosi. Gli HPV ad “alto rischio” utilizzano questa strategia per contrastare efficientemente il differenziamento cellulare e favorire la trasformazione neoplastica. Un evento chiave della tumorigenesi indotta da HPV è l’integrazione del DNA virale nel genoma della cellula ospite

Il 98% dei tumori della cervice uterina contengono un frammento del genoma di HPV human papilloma virus nel genoma cellulare. I geni per la replicazione e per nuove particelle virali sono persi. E’ perso anche E2 che reprime la trascrizione di E6, E7

L’integrazione del genoma di HPV è un processo ordinato e ormai ben caratterizzato. Alcune regioni del DNA virale sono delete, come E2, altre vengono integrate ma trascrizionalmente silenziate mentre le sequenze E6 ed E7 sono integrate e trascrizionalmente attive. In particolare, la perdita della sequenza genica E2, che normalmente controlla l’espressione regolata di E6 ed E7, comporta la trascrizione incontrollata delle oncoproteine virali. Ne consegue che la cellula ospite che contiene le sequenze E6 ed E7 integrate acquisisce un vantaggio di crescita selettivo rispetto a quella che contiene il DNA virale in forma episomiale 

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PROTEINE E1

-  Proteina di 65 kDa

-  Attività ATPasica ed elicasica 3’-5’ reclutata da E2 all’origine virale dove riconosce sequenze ricche in AT

- Forma complessi con E2 sull’origine di replicazione inducendo una distorsione nel DNA virale che facilita il reclutamento di altre molecole E1 e il distacco di E2

-  Si assembla in un doppio anello esamerico, aiutato dall’associazione con proteine heat shock (es. Hsp40 e Hsp70)

-  Lega proteine importanti per la replicazione come RPA (Replication Protein A) e la DNA polimerasi alfa-primasi cellulare

Abrogation of E1 replication activities that can induce DNA damage and growth arrest and promote focal genomic instability at the integration locus

E2 -  Proteina di 50 kDa -  E’ una DNA binding protein che riconosce, attraverso il dominio C-ter e sottoforma di dimero, un motivo palindromico (AACCg(N4)cGGTT) nella regione LCR -  Lega E1 attraverso il dominio N-ter -  Ancora gli episomi virali ai cromosomi mitotici per la corretta segregazione -  Può formare un complesso con i fattori trascrizionali C/EBP che regolano diversi promotori associati al differenziamento cellulare -  Agisce anche come fattore trascrizionale e regola il promotore precoce: •  A bassi livelli E2 agisce come attivatore trascrizionale •  Ad alti livelli E2 reprime il promotore bloccando il legame dei fattori trascrizionali (es. TFIID e SP-1)e regola/reprime la trascrizione e i livelli di espressione di E6 e E7

-  Over-produzione di E2 porta ad apoptosi p53 indipendente

-  Abrogation of E2-mediated transcriptional repression of the E6/E7 promoter

E2

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E4

-  Proteina di fusione

-  L’ORF è priva del codone di inizio AUG e quindi usa la sequenza d’inizio di E1 formando proteine E1-E4

-  La sua rimozione blocca gli eventi tardivi, quindi si pensa sia coinvolta nell’uscita del virus

E5

-  Proteina transmembrana che risiede soprattutto nel Reticolo Endoplasmatico

-  Può associarsi alla pompa vacuolare ATPasi ed ostacola il processo di acidificazione dell’endosoma à aumenta riciclo dei recettori per EGF (epidermal growth factor)

In presenza della proteina E5, il numero degli EGFR aumenta

Interazione tra E5 e l’ATPasi vacuolare tipo V Oncogene (2001) 20

E5

The vacuolar ATPase maintains the low pH required for receptor degradation

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T654 phosphorylationE5 papilloma inibisce Vacuolar ATPasi

dell’endosoma

Viral-Cbl (senza RING domain) lega il recettore ma non lo ubiquitina. Lo protegge da Cbl w.t.

Ligandi EGF-like di poxvirus

E6 151aa

- Ruolo di proteina anti-apoptotica in quanto lega p53 e ne media la degradazione in sinergia con E6-Associated Protein E6AP/UBE3A Ubiquitin-Ligase

- Compromette la risposta cellulare al danno al DNA permettendo l’accumulo di mutazioni secondarie

- Media la proliferazione cellulare e contribuisce allo sviluppo di metastasi tumorali, provocando la distruzione della normale adesione cellulare

-  Attiva l’espressione della subunità catalitica della telomerasi, associandosi a Myc e al suo cofattore Max, attiva il promotore di hTERT (Veldman et al., 2001).

E6 oncogene

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Le oncoproteine di Papilloma:E6 150aa nuclear (3NLS) and cytoplasmic

The expression of this protein alone immortalizes several human cell types E6 in high risk is nuclear, in low risk is cytosolic

P53

BAK Bcl Antagonist Killer

UBE3A: E6 Associated Protein, E6APHECT Ubiquitin ligase 850aa

Minichromosome maintanance protein

HECT= Homolog to E6-Associate Protein Carbossi Terminal

https://www.medscape.org/viewarticle/558452

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Proteasomal Degradation of p53 by Human Papillomavirus E6 Oncoprotein Relies on the Structural Integrity of p53 Core DomainPLoS ONE 6(10): e25981. doi:10.1371/journal.pone.0025981 (2011)

HPV E6+p53+E6-AP Ubiquitin-protein ligase E3A (UBE3A)UBE3A chr15q, only maternal allele is active in brain (paternallyimprinted). Both alleles active in most body’s tissues

MDM2 Mouse Double Minute, protooncogene, E3 Ubiquitin LigaseWith RING domain

Adeno E1b-55K

  Per superare l’attività pro-apoptotica di p53, E6 lega p53 in un complesso ternario con la Hect ubiquitin ligasi E6-AP (Homologous E6-Associated Protein C-terminal)

  Questo porta all’ubiquitinazione di p53 e alla sua degradazione da parte del proteasoma 26S

  La vita media di p53 risulta ridotta da molte ore a meno di 20’ nei cheratinociti

Degradazione di p53: E6 +E6 ubiquitin protein ligase E3A (human papilloma virus E6-associated protein, Angelman syndrome protein)

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Prader-Willi: mental retardation, insaziable appetite. PWS is caused by the absence of segment 11-13 on the long arm of the paternally derived chromosome 15. small ribonucleoprotein N (SNRPN) involved in mRNA processing

Angelmann syndrome: IMPRINTING PATERNO neurogenetic disorder characterized by mental retardation, abnormal gait, speech impairment, seizures, and an inappropriate happy demeanor that includes frequent laughing, smiling, and excitability “happy puppet syndrome”. Absence of the same segment as PWS on the maternal chromosome 15. UBE3A codes for an E6-AP Ubiquitine ligase UBE3A chr15q, only maternal allele is active in brain (paternallyimprinted). Both alleles active in most body’s tissues

EPIGENETIC DESEASES : uniparental disomy; deletionIMPRINTED LOCI

Il 15 paterno deve funzionare in questo locusImprinting materno

Il 15 materno deve funzionare nel cervello, in questo locus

Adenovirus E1B-55K: another foe of p53, with another weapon

NO APOPTOSIS

The stabilization of p53 by E1B-55K (in the absence of E4orf6) (Levine, 1990) causes a dramatic increase in p53 concentration. Also, p53 bound to E1B-55K has a 10-fold higher affinity for its binding site than free p53 (Martin and Berk, 1998). This increased concentration and binding affinity presumably turn the p53–E1B-55K complex in the nuclei of transformed cells into a potent repressor of genes with p53-binding sites.

https://www.nature.com/articles/1209040

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hADA3 is a TRANSCRIPTIONAL COACTIVATOR of p53A new strategy of HPV E6 induced loss of p53 , independent of direct p53 degradation

In vitro binding of immortalizing (left panel) and nonimmortalizing (right panel) HPV16 E6 mutants to hADA3.

. Notably, three immortalizing E6 mutants that do not induce direct p53 degradation but do interact with hADA3, induced the abrogation of p53-mediated transactivation and G(1) cell cycle arrest after DNA damage, comparable to wild-type E6

P53 destructionP53-ADA3 inactivationBak inactivationSintesi di telomerasiStabilizzazione beta-catenina

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TELOMERASE è espressa in tumori HPV positiviL’espressione di hTERT è proporzionale alla severità ed è associata a HPV High RISK E6

Fig. 1. hTERT promoter model. The hTERT core promoter contains several cis elements. These include two E boxes, five GC-rich sites, and one X box. These cis elements areregulated by HR E6 with E6AP through recruitment of transcriptional activators and histone acetyltransferases (HAT)(shown above the promoter) and removal or degradationof transcriptional repressors and histone deacetylases (shown below the promoter) (HDAC) to the promoter.

E6 blocca Dishevelled

E6-induced p53 degradation inhibits Siah-1 expression, which reduces β-catenin degradation

Seven In Absentia Homoogue1Is aE3 ubiquitin ligase

E7 binds to PP2A in the structural and catalytic domain, which may avoid the GSK3β activation

Regulation of the Wnt/β-Catenin Signaling Pathway by Human Papillomavirus E6 and E7 OncoproteinsViruses. 2015 Aug; 7(8): 4734–4755. doi: 10.3390/v7082842

The E6/E6AP complex stabilizes β-catenin

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p53

Telomerase

Retinoblastoma

P21, p27

Most of HPV infections are transient and the body’s immune system can quickly remove the virus, so as to avoid the development of infection into canceration. In women, about 50% of the infection disappears within 8 months. In 5- 10% women, HPV infection can become persistent, and the persistent infection is likely to lead to precancerous lesions and the development of invasive cancerViral genome can be replicated separately and eventually produce progeny virus. It can also be integrated into host cell genome. After the integration of viral genome into the genome of cells, progeny viruses are usually not produced because the genome is not complete. In particular, due to E2 protein expression disorders, it cannot inhibitthe transcription of E6 and E7 genes to produce excessive E6 and E7 proteins, resulting in continuous high expression of E6 and E7 oncoproteins in infected cells.

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E7 98aa

- La presenza di E7 porta ad una caratteristica ritenzione dei nuclei in tutti gli strati epiteliali infettati

-  Si associa alla pRb (retinoblastoma) impedendone l’associazione repressiva col fattore trascrizionale E2F, il quale va a transattivare proteine cellulari richieste per la replicazione virale

-  E7 Si associa anche ad altre proteine come:

• Deacetilasi istoniche ( causando spegnimento soppressori)

• Inibitori ternari della chinasi ciclina dipendente: p21CIP1 e p27 ( guidando le cellule alla mitosi)

• Insieme con E6 aumenta CATENINE Nucleari (blocca Siah proteasomale)

• E7 dei ceppi ad alto rischio hanno 10X affinita di legame per pRB 105

E7 Oncogene

E7 Subverts G1-S arrest

•  E7 interacts with many tumor suppressors

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https://www.medscape.org/viewarticle/558452

NFkB Anoikis

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E7 stimulates abnormal centrosome synthesis through increased CDK2 activity and by interacting with γ-tubulin

Extra centrosomes promote chromosomal instability (CIN: high rates of chromosome gain or loss during mitosis)Leading to ANEUPLOID Cells

Centriole duplicationA lesson in self-control PMID: 20647763

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E7 è una fosfoproteina acida di 98 aminoacidi che si trova prevalentemente nel nucleo.

Conserved Region1 e CR2 si trovano nella regione N-terminale e CR3, che contiene uno “zinc finger”

Il dominio CR2 contiene una sequenza LXCXE omologa alla proteina E1A degli Adenovirus e all’Antigene T grande dei Poliomavirus. Lega Rb(Phelps et al., 1988; Vousden and Jat, 1989).

- E7 transattiva CDC25 (progressione ciclo cellulare) (Jinno et al., 1994)- P16 INKa è sovraespresso quando pRb è inattivato a causa della presenza di E7 di HPV (Biomarcatore della progressione)- E7 Interagisce con HDAC (Histone DeACetylase)- Spegne “interferon regulatory factor 1”, (IRF1) (Park et al., 2000).

Il Retinoblastoma legato al peptide virale che lo blocca

E7 di papilloma

E7

C-terminal of Retinoblastoma

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Human Papillomavirus Type 16 E7 Oncoprotein Associates with the Cullin 2 Ubiquitin Ligase Complex, Which Contributes to Degradation of the Retinoblastoma Tumor Suppressor▿

Ring Finger Protein RBx1 binds E2 ubiquitin ligaseE7 is a specific substrate adaptor