Мария Йорданова Андонова ВЪЗМОЖНОСТИ ЗА...

ТРАКИЙСКИ УНИВЕРСИТЕТ – СТАРА ЗАГОРА ВЕТЕРИНАРНОМЕДИЦИНСКИ ФАКУЛТЕТ

Мария Йорданова Андонова

ВЪЗМОЖНОСТИ ЗА КОРИГИРАНЕ НА НАРУШЕНИЯТА В

ЕСТЕСТВЕНИТЕ ЗАЩИТНИ МЕХАНИЗМИ ПРИ ЖИВОТНИ С

РАЗЛИЧНА ЧУВСТВИТЕЛНОСТ КЪМ АНТИГЕНИ НА ГРАМ-

НЕГАТИВНИ БАКТЕРИИ

АВТОРЕФЕРАТ

на дисертация за присъждане на научна степен “ДОКТОР НА НАУКИТЕ”

научна специалност „Патология на животните”

Стара Загора 2017

2

Дисертацията е написана на 303 страници и е онагледена с 16 таблици и 63 фигури. Библиографската справка съдържа 925 автора, от които 905 са на латиница и 20 – на кирилица.

Номерацията на разделите, фигурите и таблиците в автореферата не съответстват на тези в дисертацията.

Основните изследвания в дисертационния труд са извършени във Ветеринарно-медицински факултет на Тракийски университет, Стара Загора (секция „Функционална патология и имунология” на катедра “Обща и клинична патология”; както и в катедра „Ветеринарна хирургия”, катедра „Ветеринарномедицинска микробиология, инфекциозни и паразитни болести” – секции „Ветеринарна микро-биология” и „Епидемиология, инфекциозни болести и превантивна медицина”, катедра „Ветеринарна анатомия, хистология и ембриология” – секция „Цитология, хистология и ембриология”, катедра „Общо животновъдство” – секция ”Генетика”, катедра ”Фармакология, физиология на животните и физиологична химия” – секция „Биохимия с основи на клиничната биохимия”).

Благодаря на моето семейство, на родителите ми за моралната подкрепа при реализиране на избрания професионален път.

Искрени благодарности на всички колеги, специалисти, помощно-технически персонал за оказаното съдействие при реализиране на дисертационния труд. Благо-даря на Даниела Иванова за професионализма, съпричастността към научните ми дирения и безрезервната помощ.

Защитата ще се състои на ..................................... от ........................... часа във Ветеринарномедицински факултет, ТрУ – Стара Загора.

Материалите по защитата на дисертацията са на разположение в Научен отдел на ВМФ и на уебсайта на Тракийския университет (www.uni-sz.bg).

3

СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНИТЕ СЪКРАЩЕНИЯ

АКТХ - аденокортикотропен хормон

АПАК - алтернативен път за активиране на комплемента

ГКТС - главен комплекс за тъканна съвместимост

КПАК - класически път за активиране на комплемента

КАС - киселинно-алкално състояние

ДНК - дезоксирибонуклеинова киселина

АВС - абсолютен брой пръчкоядрени неутрофили (absolute band neutrophils)

АВЕ - алкален излишък (acid base excess)

A/G ratio - съотношение албумин към глобулини (albumin/globulin ratio)

ALAT - аланин аминотрансфераза (alanine aminotransferase)

AMPs - антимикробни пептиди (antimicrobial peptides)

APP - острофазов отговор (acute phase response)

APPs - острофазови протеини (acute phase proteins)

ARE – арилестераза (arylesterase)

ASAT - аспартат аминотрансфераза (aspartate aminotransferase)

ASС - абсолютен брой сегментоядрени неутрофили (absolute segmented neutrophils)

cAMP - цикличен аденозин монофосфат (cyclic adenosine monophosphate)

CAT – каталаза (catalase)

cGMP - цикличен гуанозин монофосфат (cyclic guanosine monophosphate)

CОХ – циклооксигеназа (cyclooxygenase)

CRP - С-реактивен протеин (C-reactive protein)

DAEC - дифузноадхерентни E. coli

DCs - дендритни клетки (dendritic cells)

EAgEC - eнтероагрегативни E. coli

EНEC - eнтерохеморагични E. coli

EIEC - eнтероинвазивни E. coli

e NOS - ендотелна азот-оксид синтетаза (endothelial nitric oxide synthase)

EТEC - eнтеротоксигенни E. coli

EPEC - ентеропатогенни E. coli

ExoА - екзотоксин А (exotoxin A)

FRAP - общ антиоксидантен капацитет на плазмата (ferric reducing antioxidant power)

GC – глюкокортикоиди (glucocorticoids)

G-CSFs - гранулоцит колонии-стимулиращи фактори (granulocyte colony stimulating factors)

4

GR - глюкокортикоиден рецептор (glucocorticoid receptor)

Hb – хемоглобин (hemoglobin)

HCO3- - актуални бикарбонати (actual bicarbonate)

HDL - липопротеини с висока плътност (high-density lipoprotein)

H2O2 - хидроген пероксид (hydrogen peroxide)

Ht – хематокрит (hematocrit)

ICAM-1 - интрацелуларна клетъчно адхезионна молекула (intracellular cell adhesion molecule)

IFN – интерферон (interferon)

Ig – имуноглобулин (immunoglobulin)

i.p. - интраперитонеално приложение (intraperitoneal application)

IL-1β - интерлевкин-1 (interleukin-1beta)

iNOS - индуцируема азот-оксид синтетаза (inducible nitric oxide synthase)

i.v. - интравенозно приложение (intravenous application)

LBP - липополизахарид свързващ протеин (lipopolysaccharide binding protein)

LCs - Лангерхансови клетки (Langerhans cells)

LDL - липопротеини с ниска плътност (low-density lipoprotein)

5 LOX - 5- липооксигеназа (5-lipoxygenase)

LPS – липополизахарид (lipopolysaccharide)

LT – левкотриени (leukotrienes)

МАРК - митоген активиранa протеинкиназa (mitogen-activated protein kinase)

МCH - средно количество на хемоглобин в един еритроцит (mean corpuscular hemoglobin)

MCHC - средна концентрация на хемоглобина в еритроцитите (mean corpuscular hemoglobin concentration)

МСР-1 - моноцит хемотаксичен протеин (monocyte chemoattractant protein-1)

MCV - среден обем на един еритроцит (mean corpuscular volume)

MDA - малондиалдехид (malondialdehyde)

МРО – миелопероксидаза (myeloperoxidase)

NАbs - натурални антитела (natural antibodies)

NADPH-d - никотинамид аденин динуклеотид фосфат диафораза (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase)

NADPH - никотинамид аденин динуклеотид фосфат (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)

NBT - нитроблутетразолов тест (nitroblu tetrazolium chloride test)

NETs - нетоза (neutrophil extracellular traps)

NF-κβ - нуклеарен фактор капа бета (nuclear factor kappa beta)

N/L ratio - съотношение неутрофили/лимфоцити (neutrophil/lymphocyte ratio)

NLRs=NOD - интрацелуларен цитоплазмен рецептор (nucleotide like receptor)

5

nNOS - невранална азот-оксид синтетаза (neuronal nitric oxide synthase)

NO - азотен оксид (nitric oxide)

NSAIDS - нестероидни противовъзпалителни лекарствени продукти (nonsteroidal anti-inflammatory drugs)

OMPs - външно мембранни протеини – порини (outer membrane proteins)

OSI - индекс за оксидативен стрес (oxidative stress index)

PAF - тромбоцит-активиращ фактор (platelet activating factor)

PGN – пептидогликан (peptidoglycane)

PI - фагоцитно число (phagocyte index)

PI3K - фосфоинозитин-3-киназа (phosphoinositide 3-kinase)

РСТ – прокалцитонин (procalcitonin)

РР - фагоцитоза – процент (phagocytosis)

p.o. - орално приложение (per os)

pO2 - парциално налягане на кислорода (partial pressure of oxygen)

pCO2 - парциално налягане на въглеродния диоксид (partial pressure of carbon dioxide)

RANTES - хемокин от СС групата

rGSH - редуциран глутатион (reduced glutathione)

ROS - реактивни кислородни видове (reactive oxide species)

RNI - реактивни азотни междинни съединения (reactive nitrogen intermediates)

SAT – кислородна сатурация (оксихемоглобиново насищане) (oxygen saturation)

SBC - стандартни бикарбонати (standard bicarbonate)

SEPEC - септицемични E. coli

SOD - супероксид дисмутаза (superoxide dismutase)

SBE - стандартен алкален излишък (standard base excess)

TCO2 - тотален въглероден диоксид (total carbon dioxide)

TGF-β - трансформиращ растежен фактор-β (transforming growth factor beta)

TLR - трансмембранни клетъчни рецептори (toll like receptor)

TNF-α - туморнекротизиращ фактор-α (tumor necrosis factor alpha)

Th-2 - Т-хелпери 2 (T helper 2)

VCAM-1 - васкуларно-клетъчно адхезионна молекула (vascular cell adhesion molecule)

6

СЪДЪРЖАНИЕ

I. УВОД 7

II. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ 8

III. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ 10

IV. РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ 18

V. ИЗВОДИ 67

VI. ПРИНОСИ 69

VII. ПРЕПОРЪКИ ЗА ПРАКТИКАТА 71

VIII. ПУБЛИКАЦИИ, СВЪРЗАНИ С ДИСЕРТАЦИЯТА 71

IХ. ENGLISH SUMMARY 74

7

I. УВОД

През последните години се наблюдава нарастване честотата на бактериалните инфекции, във връзка със селектирането на микробни щамове, устойчиви към антибиотици. Опитите на фармацевтичните компании за разработване на синтетични химиотерапевтици и антибиотици от ново поколение не могат да решат проблема с мултирезистентността при Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Нови изследвания разкриват обезпокояващи факти, свързани с това, че анти-стафилококовата терапия може да намали риска от инфекции с тази Грам-позитивна бактерия, но в същото време да доведе до нарастване на псевдомонасасоциираните инфекции. Бързо изгражданата от тези бактерии резистентност към антибиотици, биофилм-формиране, както и устойчивостта им към променящите се условия на средата определят необходимостта от нови антимикробни средства. Усилията в тази област очертават само едно от направленията за борба с бактериалните патогени и определят съществуващото многообразие от терапевтични средства. Ефективният подход изисква двустранни действия – от една страна прилагане на лекарствени продукти, насочени към самия патоген (конвенционална терапия), а от друга подпомагане защитния потенциал на организма и коригиране на възникналите нарушения в естествените защитни механизми (алтернативна терапия). Фокусът при алтернативната терапия са ключови сигнални пътища, за въздействие върху които напоследък се прилагат натурални продукти, чийто странични ефекти за разлика от лекарствата са незначителни.

Сред бактериалните представители на резидентната флора, E. coli и P. aeruginosa будят особен интерес. Последният е провокиран от факта, че геномът на тези бактерии им осигурява значителна изменчивост и гъвкавост, а вирулентните фактори, с които разполагат им обезпечават адхезия, колонизация и инвазия в организма, както и бърза промяна на атакуващите механизми, с което максимално затрудняват терапевтичния контрол. Количеството на патогена, мястото на проникването му, скоростта на размножаването му, както и вирулентността на дадения щам са сред факторите определящи хода на инфекцията.

Гаранция за стопиране на инфекциозния процес през акутната фаза, когато още не е реализиран адаптивния имунитет е пълноценното функциониране на естествените защитни механизми. Имунната протекция, включваща бариерни системи, клетъчни и хуморални елементи, редица неспецифични реакции (възпаление, острофазов отговор и фагоцитоза) е мощна, но нарушаването й позволява на тези бактерии да атакуват организма. Изборът на биомаркери, характеризиращи нарушения на клетъчно ниво, преди появата на клиничните признаци е важен при изясняване на взаимоотношенията между Грам-негативните бактерии и защитните механизми на съответния биологичен вид, както и при отдиференциране на нарушенията в тях и оценяване възможностите на компенсаторните им механизми. Трудностите при борбата с E. coli и P. aeruginosa произтичат не само от хетерогенния характер на нарушенията в организма, но и от колапса в защитните механизми, който предизвикват.

Важен подход за изясняване на ключовите звена и характерните особености на нарушенията в имунната протекция при животни с различна чувствителност към

8

антигените на тези Грам-негативни бактерии, е използването на експериментални модели с P. aeruginosa и E. coli, които са и база за разработване на аргументирани стратегически програми и тактически решения за коригиране на възникналите още на клетъчно ниво промени.

СОБСТВЕНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ

ІІ. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ

Основната цел на настоящия труд е чрез използване на експериментални модели с животни, притежаващи различна чувствителност към антигените на Грам-негативните бактерии E. coli и P. аeruginosa да се отдиференцират настъпилите нарушения в защитния им потенциал, свързан с бариерни системи, неспецифични защитни реакции – възпаление, острофазов отговор и фагоцитоза. На тази база да се разработят нови схеми за коригиране на установените нарушения в защитните механизми, с което да се съдейства за решаване на проблема с важно практическо значение – повишаване ефективността на антибактериалната терапия.

Изследователската хипотеза e да се установи дали при животни с различна чувствителност към антигените на Грам-негативни бактерии, коригирането на нарушенията в едно ключово звено на естествения имунитет се отразява върху ефективността на функциониране на останалите естествени защитни механизми.

За постигане на поставената цел е необходимо да бъдат решени следните задачи:

ЗАДАЧА 1: Да се проучат промените в антиоксидантния статус и липидна пероксидация при мишки, третирани интраперитонеално с липополизахарид от E.coli (O111:B4) и се оценят антиоксидантните възможности на нестероидния противовъзпалителен лекарствен продукт нимезулид (селективен СОХ-2 инхибитор).

1.1. Да се проследи в динамика провокирания от LPS оксидативен стрес, като се анализират взаимоотношенията между оксиданти и антиоксиданти.

1.2. Да се оценят чрез хистологични изследвания, възникналите от действието на LPS тъканни морфологични нарушения.

1.3. Да се проучат антиоксидантните свойства на приложения самостоятелно нимезулид, като се оценят ефектите му върху каталазата, редуцирания глутатион, албумин, глюкоза, общ антиоксидантен капацитет на плазмата, индекса на оксидативен стрес и малондиалдехида и се установят патохис-тологичните промени от действието му.

1.4. Да се анализират антиоксидантните възможности и патохистологични ефекти на нимезулида, приложен на фона на LPS въздействие при мишки.

ЗАДАЧА 2: При плъхове третирани интраперитонеално с липополизахарид от E.coli (O111:B4), да се отдиференцират нарушенията в естествените защитни механизми и се оценят възможностите за коригирането им чрез прилагане на нестероидния

9

противовъзпалителен лекарствен продукт индометацин (неселективен СОХ инхибитор).

2.1. Да се проследят и характеризират промените в концентрациите на PGE2, IL-1β, в клетъчните и хуморални фактори на естествения имунитет, в червената кръвна картина, метаболитните параметри и киселинно-алкално състояние.

2.2. Да се оценят възможностите на индометацина за контролиране на LPS индуцираните нарушения.

ЗАДАЧА 3: При експериментален модел на прасета, третирани интравенозно и интраперитонеално с липополизахарид от E.coli (O111:B4) да се отдиференцират нарушенията в естествените защитни механизми и се оценят възможностите за коригирането им чрез блокиране на простагландиновата синтеза с индометацин и на хистаминовите рецептори чрез циметидин.

3.1. Да се проучат ефектите на интравенозно приложения липополизахарид върху клетъчните и хуморални фактори на естествена резистентност; есенциалните олигоелементи – цинк, желязо; чернодробните трансаминази; глюкозата и небелтъчните азотосъдържащи вещества (урея, креатинин).

3.2. Да се анализират промените в клетъчните и хуморални фактори на естествения имунитет, киселинно-алкално състояние и кръвно-газов профил, провокирани от интраперитонеално приложения липополизахарид и се оценят възмож-ностите за контрол чрез индометацина – блокиращ простагландиновата синтеза и чрез циметидина - инхибиращ хистаминовите Н2 рецептори.

ЗАДАЧА 4. Чрез експериментален модел на P. aeruginosa инфекция на кожата и меките тъкани при кучета, да се характеризира състоянието на организма при развитието на инфекциозния процес, като се проучат възможностите за контрола му чрез използване на конвенционална, алтернативна и комплементарна терапия.

4.1. Да се оценят възможностите на прокалцитонина като ранен маркер за инфек-цията.

4.2. Да се анализира силата на възпалителния отговор при P. aeruginosa инфекция, чрез прилагане на инфламаторни биомаркери (нуклеарен фактор капа-бета, азотен оксид, сиалова киселина, съотношение неутрофили към лимфоцити) и комбинирането им с хематологични показатели (левкоцити, левкограма), с биохимични параметри (глюкоза, ALAT, ASAT, урея, креатинин).

4.3. Да се проследят промените в острофазовия отговор при инфектираните кучета и се анализират ефектите на приложените терапевтични схеми.

4.4. Да се проучи фагоцитозата и свързаните с нея показатели, характеризиращи функционалната активност на неутрофилите, като се приложи корелационен анализ, за да се разкрият регулаторните взаимоотношения между изследваните показатели.

4.5. Върху създадения експериментален модел на кожна инфекция да се тестват ефектите на конвенционалната терапия - чрез енрофлоксацин; на алтернативната терапия – чрез стандартизирания растителен продукт feverfew и на комбинацията feverfew+енрофлоксацин.

10

III. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ

III. А. МАТЕРИАЛ

III. А.1. АНТИГЕНИ НА ГРАМ-НЕГАТИВНИ БАКТЕРИИ

При изследванията са използвани:

Липополизахарид от E. coli, Serotype O111:B4 (Sigma Chemical, USA).

Теренен щам на P. aeruginosa - изолат от куче с урогенитална инфекция, типизиран чрез полуавтоматична идентификационна система BBL Crystal (Becton Dickinson, USA) и кит за Грам-отрицателни неферментативни бактерии.

III. А.2. ЛЕКАРСТВЕНИ ПРОДУКТИ

Nimesulide (Heisinn Birex Phamaceutical Ltd, Damastown, Mulhuddart, Dublin 15, Ireland).

Indomethacin таблетки (Pharmachim AD, Bulgaria).

Cimetidin филмирани таблетки (Балканфарма – Дупница АД, Bulgaria).

Eнрофлоксацин (Syvaquinol 25 injectable – laboratorios syva s.a., Spain).

Feverfew (Tanacetum parthenium) (Feverfew extract – 90 mg, 0.7% parthenolide) (Nature's way, USA).

Alkaine 0.5% eye drops, solution, S.A. ALKON-COUVREUR N.V., Belgium

III. А.3. ОПИТНИ ЖИВОТНИ

В дисертационния труд са използвани лабораторни и домашни животни. Включените биологични видове са подбрани въз основа на различия в чувствителността им към бактериалния антиген - LPS. Мишките, плъховете и кучетата са резистентни на действието му, за разлика от прасетата, които са чувствителни на LPS.

В експериментите са включени:

Мишки - 108 броя

Мишките са с телесна маса 23-32 g, на възраст около 3 месеца, от двата пола. Те са получени от Експериментална развъдна база за опитни животни (ЕРБОЖ) – гр. Сливница. Животните бяха поставени във вивариума на секция „Функционална патология и имунология” към катедра „Обща и клинична патология” при Ветеринарномедицински факултет на Тракийски университет, в клетки по 6 броя, при контролирани условия - температура (21±2 0C), влажност (60±10%), светлинен режим. Беше им осигурен свободен достъп до вода и гранулирана храна, стандартизирана за този биологичен вид. За животните имаше двуседмичен адаптационен период, преди включването им в експеримент.

Плъхове - 135 броя

11

За опитите бяха използвани мъжки инбредни плъхове Wistar с телесна маса 180-200 g, получени от Експериментална развъдна база за опитни животни (ЕРБОЖ) – гр. Сливница. Животните бяха поставени в клетки по 5 броя, при стандартизирани условия - температура (20–22 0C), влажност (50–60%), светлинен режим на вивариума на секция „Функционална патология и имунология” към катедра „Обща и клинична патология” при Ветеринарномедицински факултет на Тракийски университет. Беше им осигурен свободен достъп до вода и гранулирана храна, стандартизирана за този биологичен вид. За животните имаше двуседмичен адаптационен период, преди включването им в експеримент.

Прасета - 42 броя

Бяха използвани женски прасета, на възраст 2-3 месеца, с тегло 25-28 kg. Отглеждани бяха в боксове, във вивариума на ВМФ при стандартизирани условия – температура 210С, влажност 60%. Опитните групи бяха формирани и животните бяха адаптирани 30 дни преди започване на експеримента. На прасетата бе осигурен свободен достъп до храна и вода.

Кучета - 25 броя

Използвахме клинично здрави мъжки, безпородни кучета, на възраст 2–5 години. Адаптационният период преди експеримента продължи един месец. Кучетата бяха обезпаразитени срещу хелминти с комбинацията празиквантел и абамектин (Prazimec D – Биовет, АД, Пещера, България) в доза 1 таблетка /10 kg телесна маса и срещу ектопаразити с комбинацията перметрин и карбарил (Tapilan-B - Dorvert, Israel). Външното обезпаразитяване включваше също изкъпване с антипаразитен шампоан Friskies (Viale G.Richard, Milano, Italia). Приложена бе и противобясна ваксина – Nobivac Rabies (Intervet International B. V.). Животните бяха настанени във вивариума на секция ”Функционална патология и имунология”, като температурата в помещението беше в интервала 15-21 градуса при смесен режим на осветление и влажност на въздуха в границите на 50-60 процента. На кучетата през периода на пребиваването им във вивариума беше осигурена разходка - двукратно на ден. Животните бяха хранени с гранулирана храна “Canil Social Gouomarc H”- Brasilia, като достъпът до вода беше свободен.

Всички експерименти бяха проведени съгласно изискванията на българското законодателство за защита и хуманно отношение към опитните животни и с разрешение на националната ветеринарно-медицинска служба към БAБХ (становище №16/2010).

12

III. А.4. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ МОДЕЛИ

За реализиране на поставените в дисертационния труд задачи са използвани различни експериментални модели целящи:

Проучване на промените в антиоксидантния статус и липидна пероксидация при мишки, третирани интраперитонеално с липополизахарид и ефектите на нимезулида.

Експериментални проучвания при плъхове, третирани интраперитонеално с липополизахарид за отдиференциране на нарушенията в естествените защитни механизми и оценяване възможностите за коригирането им чрез индометацин.

Експериментални проучвания при прасета, третирани интравенозно и интраперитонеално с липополизахарид за отдиференциране на нарушенията в естествените защитни механизми и оценяване на възможностите за коригирането им чрез блокиране на простагландиновата синтеза с индо-метацин и на хистаминовите рецептори с циметидин.

Експериментален модел на кожна P. aeruginosa инфекция при кучета за проучване поведението на естествените защитни механизми и оценяване ефектите на конвенционалната, алтернативната и комплементарна терапии.

III. А.5. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН ДИЗАЙН

Бяха създадени различни схеми на експериментален дизайн, свързани с изпълнението на конкретната задача, като формираните групи, третирането и динамиката на изследване са представени на таблица 1.

III. А.6. БИОЛОГИЧНИ ПРОБИ

Всички проби бяха вземани сутрин преди хранене на животните между 8.00 - 8.30 часа, за да се избегне влиянието на циркадните ритми. Биологичните проби бяха получавани от различни места на тялото – вени, артерии или от пунктиране на орбитални съдове или чрез декапитация. Изборът на метод бе съобразен със законодателните изисквания за защита и хуманно отношение към животните и зависеше от биологичния вид, експерименталния модел, както и от изискванията на методиката за съответния изследван показател.

При мишките на всеки етап от изследването, след седация бе приложена евтаназия, осъществена чрез цервикална дислокация, като бяха вземани кръв, органи и тъкани за морфологични изследвания. При плъховете, биологични проби се получаваха след декапитация.

При прасетата кръв се вземаше от sinus ophthalmicus, след седация с 0.5% алкаин. Не бе използвана анестезия, тъй като тя влияе съществено върху показателите на изследване. При кучетата кръвните проби бяха получавани от v. cephalica antebrachii чрез венфлонови канюли (Vygon GmbH & Co.,Germany - 20G).

13

Таблица 1. Опитни животни и опитна постановка

Групи Третиране

Мишки. Динамика на изследване: 0 час (преди третиране); 6-ти и 24-ти час; 3-ти; 5-ти и 9-ти ден след LPS въздействие.

I (n=36) eднократно i.p. 25 μg/0.5 mL LPS.

II (n=36) 30 минути преди i.p. инжектиране на LPS в посочената доза, прилагане чрез хранопроводна сонда на 100 mg/kg нимезулин. Оралният прием на препарата е с продължителност 4 дни.

III (n=36) р.о.100 mg/kg нимезулид за четири последователни дни, всяка сутрин на гладно.

Плъхове. Динамика на изследване: 0 час (преди третиране); 2-ри, 4-ти, 6-ти и 24-ти час; 3-ти; 6-ти и 10-ти и 15-ти ден след LPS въздействие.

А (n=45) еднократно i.p. 1 mg/kg LPS.

Б (n=45) 30-минути преди i.p. третиране с LPS p.о. индометацин в доза 2.5 mg/kg разтворен в 1 mL 1% карбоксиметилцелулоза.

С (n=45) инжектирани i.p. с 1 mL 0.9% NaCl.

Прасета. Динамика на изследване:

за i.v. въвеждане на LPS: 0-час (преди третирането), 1-ви час, 2-ри час, 4-ти час, 24-ти час, 48-ми час и 72-ри час;

за i.p. въвеждане на LPS: 0 час (преди третирането), 1-ви ден, 3-ти ден, 5-ти ден, 10-ти ден и 15-ти ден.

А (n=6) контроли, нетретирани.

В (n=6) еднократно i.v. 10 μg/kg LPS.

C (n=12) eднократно i.p. LPS в доза 0.3 mg/kg.

D (n=12) 15 минути преди i.p. LPS, p.o. 0.75 g дневно индометацин за четири последователни дни.

E (n=6) веднага след i.p. LPS, p. o. 0.4 g дневно циметидин за 5 последователни дни.

Кучета. Динамика на изследване: 0 час (преди третирането), 4-ти час, 24-ти час, 48-ми час, 72-ри час, 7-ми ден, 10-ти ден и 14-ти ден след експерименталната P. aeruginosa инфекция.

0 (n=5) инжектирани s.c. с P. aeruginosa бактериална суспензия (1x108 CFU/mL).

I (n=5) на 48-я час, s.c. 5 mg/kg енрофлоксацин за десет последователни дни.

II (n=5) на 4-я час, 90 mg feverfew (0.7% партенолид) р.о. по една капсула два пъти на ден, за шест последователни дни.

III (n=5) на 4-я час p.o. 90 mg feverfew за 6 последователни дни (по две капсули на ден). На 48-я час включване и на 5 mg/kg enrofloxacin, s.c. за десет последователни дни.

С (n=5) инжектирани s.c. с физиологичен разтвор.

14

Проби за хематологичен анализ

Използваше се периферна хепаринизирана кръв. За фагоцитозата концентрацията на хепарина беше 25-30 U/mL. За хематокрита бяха използвани хепаринизирани капилярки. Скоростта на утаяване на еритроцитите беше определяна с цитратна кръв. Еритроцитен лизат беше използван за определяне на редуцирания глутатион.

Проби за биохимичен анализ

За получаване на серум, кръвта се поставяше в епруветки без антикоагулант. Пробите се държаха на стайна температура, като след съсирването им се центрофугираха 10 минути на 3000 оборота за минута. За получаване на плазма кръвта, взета със съответен антикоагулант, посочен в методиката на изследвания показател, бе центрофугирана при 40С за 15 минути 3000 оборота за минута.

Проби за анализ на киселинно-алкалното състояние и кръвно-газов профил

Беше използвана кръв, взета анаеробно в хепаринизирани капилярки, като пробите бяха веднага отчетени на кръвно-газовия анализатор (ABL-3, Radiometer, Copenhagen, Denmark).

III.Б. ПОКАЗАТЕЛИ И МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕТО ИМ

III.Б.1. Прокалцитонин - биомаркер за бактериална кожна инфекция, предизвикана от P. aeruginosa

Прокалцитонин - серумните концентрации на прокалцитонина при кучета (PCT - pg/mL) бяха определяни чрез ELISA (CA1033, TSZ ELISA, Scientific LLC, BIOTANG, USA), следвайки инструкциите на производителя.

III.Б.2. Биомаркери на възпалението

Нуклеарен фактор капа бета - серумните концентрации на нуклеарния фактор (NF-kB - ng/mL) при кучета бяха определяни чрез ELISA (cat. NO UCL-E1824c Hölzel Diagnostika, Köln, Germany).

Азотен оксид - азотният оксид (NO – μmol/L) беше определен чрез спектрофотометричен метод на Miranda et al. (2001), позволяващ отчитане на нитрат/нитрит (NO3/NO2) концентрацията в биологични флуиди.

Простагландин Е2 - простагландин Е2 (PGE2 - pg/mL) беше определен чрез радиоимунологичен метод с използване на RIA kit (Biomag AM, code Number 6223, DRG). PGE2 беше белязан с 125J.

Интерлевкин-1β - използван бе радиоимунологичен метод - RIA кит (Biomag AM, DRG) за определяне на интерлевкина (IL-1β - pg/mL).

Съотношение неутрофили към лимфоцити - за определяне на съотношението неутрофили към лимфоцити (N/L ratio) беше използвана кръвна натривка, оцветена по May-Grunvald-Gimsa, отчетена микроскопски чрез Меандъров метод на изброяване. Определен бе процентът на съответния вид бели кръвни клетки и съотношението между тях.

Свободна сиалова киселина - бе използван спектрофотометричен метод на Sydow (1985) за определяне серумните концентрации на свободната сиалова киселина (mmol/L).

15

Скорост на утаяване на еритроцитите - Определяше се чрез микрометод на Панченко за 1 час в mm плазмен стълб.

III.Б.3. Ензимни антиоксиданти

Kаталаза - каталазната активност (CAT - кU/L) беше определeна в серум по метода на Goth (1991). Като субстрат беше използван водороден пероксид.

III.Б.4. Неензимни антиоксиданти

Редуциран глутатион - за редуцирания глутатион (rGSH - mmol/L) беше използван метода на Beutler et al. (1963). Концентрацията на редуциран глутатион беше определена по стандартна крива от известни концентрации на L-глутатион.

Албумин - албуминът (g/L) беше определен с готов колориметричен кит с бромкрезол зелено (Giesse diagnostics, Italy)

Глюкоза - кръвната глюкоза (mmol/L) беше отчитана веднага с Glucomer EliteR (Bayer Halth Care) и чрез тест за глюкоза (Human Diagnostica, GmbH Germany).

III.Б.5. Общ антиоксидантен капацитет на плазмата

За определяне на общия антиоксидантен капацитет на плазмата (ferric reducing antioxidant power; FRAP - mmol/L) беше използван методa на Benzie and Strain (1996), измерващ степента на редукция на феритрипиридил-триазиновия (FeIII - TPTZ) комплекс до феро-форма в силно кисела среда. Общият антиоксидантен капацитет се изчисляваше по стандартна крива от разтвори на FeSO47H2O в диапазон 100–1000 mmol/L.

III.Б.6. Индикатори за оксидативен стрес

Малондиалдехид - за определяне на (MDA - μmol/L) – продукт на липидната пероксидация беше използван тиобарбитуров метод. При него беше измерен спектрофотометрично продуктът от свързване на една молекула малондиалдехид и 2 молекули 2-тиобарбитурова киселина (реакция на Кньовенагел) след екстракция с n-бутанол (Uchiyama and Michara, 1978) в модификация на Andreeva et al. (1988). Концентрацията на MDA се изчисляваше по стандартна крива от различни концентрации 1,1,3,3 тетрахидрокиспропан (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany).

Индекс за оксидативен стрес - индексът за оксидативен стрес (oxidative stress index - OSI) беше изчислен по формулата OSI = 100×MDA ÷ 1000×FRAP.

III.Б.7. Червена кръвна картина

Еритроцитите (1012/L) бяха определяни чрез микроскопско изброяване в камерата на Бюркер. За хемоглобина (Hb - g/L) беше изполван цианхемоглобинов колориметричен метод. Хематокритът (Ht - L/L) беше отчитан чрез микрометод, при който се използваха хепаринизирани стъклени капилярки (75 mm) и центрофуга TH-21, VEB MLW Medizintekhnik, Leipzig, Germany).

16

Бяха изчислени следните еритроцитометрични индекси: средно количество на хемоглобин в един еритроцит (MCH – pg) (по формулата Hb/еритроцити); средна концентрация на хемоглобин в еритроцитите (MCHC - %) (по формулата Hb/Ht); среден обем на един еритроцит (MCV – fl) (по формулата Ht/еритроцити).

III.Б.8. Клетъчни показатели на естествения имунитет

Бяла кръвна картина - левкоцитите (109/L) бяха определяни чрез микроскоп-ско изброяване в камерата на Бюркер. Отделните класове бели кръвни клетки (%) бяха отчитани микроскопски на кръвна натривка, боядисана по Романовски-Гимза.

Абсолютен брой пръчкоядрени неутрофили и абсолютен брой сегмен-тоядрени неутрофили - бяха изчислявани въз основа на количеството на левкоцитите, умножено по процента на съответната категория неутрофили, разделено на 100.

Фагоцитоза и фагоцитно число - за определяне на фагоцитозата бе използ-ван имунофлуоресцентен метод (Samnaliev et al., 1995). Изчисляваха се: процент на фагоцитоза (%) = [(фагоцитиращи неутрофили) 150] × 100 и фагоцитно число = (общо количество погълнати частици) 150

Определяне на хидроген пероксид чрез нитроблутетразолов тест (NBT) - хидроген пероксидът – един от продуктите на оксидативния килинг механизъм на фагоцитите бе определян въз основа на цитохимичния метод на Park (1971).

III.Б.9. Хуморални показатели на естествения имунитет

Лизозим - лизозимът (μg/mL) се отчиташе в серум чрез метода на Lie (1985).

Хемолитична активност на комплемента - хемолитичната активност на комплемента (CH50) беше определяна по няколко метода: по метода на Sotirov (1986) - за отчитане алтернативния път за активиране на комплемента; по метода на Stelzner and Stein (1971) – за определяне на класическия път на комплемента. За същата цел бе използван и метода на Кэбот и Мейер (1968).

Естествени имуноглобулини (натурални антитела) - за количествено определяне на имуноглобулините в серума (mg/mL) бе използван цинк-сулфатен тест. Той е турбидиметричен (нефелометричен) метод (McEwan et al., 1970).

III.Б.10. Общ белтък и белтъчни фракции

За определяне на общия белтък (g/L) бе използван колориметричен метод с биуретов реактив (Human GmbH, Germany). За определяне на белтъчните фракции беше използвана микроелектрофореза в агаров гел, а за отчитането - дензитометър (Carl Zeiss, Jena, Germany). Концентрацията на всяка протеинова фракция беше представена в g/L, изчислена въз основа на процента, получен от нейното дензитометриране и количеството на общия белтък в пробата.

17

III.Б.11. Острофазови протеини

Позитивни острофазови протеини - фибриноген - за опредеряне на фибриногена (g/L) беше използван тест (HaemoStat Fibrinogenm Human Diagnostica, Germany). За отчитането се използваше електромеханичен коагулометър КС Amelung KC1A (Germany). Концентрацията на фибри-ногена беше обратно пропорционална на времето за образуване на съсирек в присъствие на високи концентрации тромбин.

Негативни острофазови протеини – арилестераза - серумната арилес-теразна активност (U/L) беше определяна по метода на Lorentz et al. (1979).

III.Б.12. Небелтъчни азотосъдържащи вещества

За определяне на уреята (mmol/L) и креатинина (μmol/L) бяха използвани китове на фирмата Giesse diagnostics (Rome, Italy), а отчитането бе на автоматичен биохимичен анализатор (BA-88 Mindray Biochemistry Analyzer).

III.Б.13. Метаболитни показатели

Лактат - беше определян в кръвна плазма чрез спектрофотометричен метод с тест на Pointe Scientific Inc (Michigan USA).

Ректална температура (0С) - беше определяна с дигитален термометър, модел DT- 11A.

III.Б.14. Есенциални олигоелементи

Серумните концентрации на цинка (μmol/L) и желязото (μmol/L) бяха определяни чрез атомно-абсорбционен спектрофотометър (Buck Scientific 200A).

III.Б.15. Киселинно-алкално състояние и кръвно-газов профил

Анаеробно получените кръвни проби бяха анализирани веднага с кръвно-газов анализатор (ABL-3, Radiometer, Copenhagen, Denmark). Бяха определяни следните показатели: рН; парциално налягане на въглеродния диоксид (рСО2 - mmHg); парциално налягане на кислорода (рО2 - mmHg); актуални бикарбонати (HCO3

- - mmol/L); тотален въглероден диоксид (ТСО2 - mmol/L); актуален алкален излишък (ABE - mmol/L); стандартен алкален излишък (SBE - mmol/L); стандартни бикарбонати (SBC - mmol/L); кислородна сатурация (SAT - %); кислородно съдържание (О2СТ - vol%).

III.Б.16. Чернодробни трансаминази

Чернодробните трансаминази аланин аминотрансфераза (ALAT - U/L) и аспартат аминотрансфераза (ASAT - U/L) бяха определяни чрез биохимичен анализатор (BA-88 Mindray Biochemistry Analyzer) и китове на фирмата Giesse diagnostics (Rome, Italy), а съотношението ASAT/ALAT (DeRitis) беше изчислено въз основа на данните от ASAT и ALAT.

18

III.Б.17. Патохистологични изследвания

Бяха взети проби от вътрешни органи (бял дроб, сърце, слезка, черен дроб, панкреас, тънки черва, бъбреци) на мишки, включени в експерименталните групи, които се фиксираха в 10% разтвор на неутрален формалдехид, бяха обработени чрез класическите методи на хистологичната техника и оцветени с хематоксилин–еозин (Х/Е)

III.В. СТАТИСТИЧЕСКИ АНАЛИЗ

Данните бяха обработени статистически чрез еднофакторен, двуфакторен диспер-сионен анализ (ANOVA), repeated-measure ANOVA. При данни за статистически значима разлика, беше провеждан и допълнителен (post-hoc) тест чрез метода на най-малките значими разлики (LSD-тест). Корелационните коефициенти (r) и нивото на статистическа значимост (p) бяха изчислявани по метода на Пиърсън със софтуер за статистика (StatMost for Windows, Data Most Co, USA). Беше използван също софтуер за статистика Graph Pad InStat 3 (GraphPad Software Ldt, USA). Резултатите бяха представени като средна стойност – mean (m) ± стандартна грешка на средното - standard error of the mean (SEM) или като mean (m) ± стандартно отклонение - (SD). Mетодът на Kolmogorov-Smirnov беше приложен за оценка на нормалното разпределение на данните в извадката.

ІV. РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ

Акцент в дисертационния труд са ефектите на Грам-отрицателните опортюнистични патогени P. аeruginosa и E. coli, представители на резидентната микрофлора при различни биологични видове върху естествените им защитни механизми. Многообразието от вирулентни фактори на тези бактерии (Belkaid and Hand, 2014; Alhazmi, 2015) създава проблем при разкриване на водещия елемент, разтройващ защитната система на организма. Във връзка с това и като се базираме на факта, че главният атакуващ фактор на Грам-негативните бактерии е LPS фокусираме вниманието си върху него, за да проучим, анализираме и оценим ефектите му при биологични видове с ниска чувствителност към него (мишки, плъхове) и при такива с висока чувствителност (прасета), както и да разработим нови стратегии за коригиране на предизвиканите от LPS нарушения в организма.

IV.1. ПРОМЕНИ В АНТИОКСИДАНТНИЯ СТАТУС И ЛИПИДНА ПЕРОКСИДАЦИЯ ПРИ МИШКИ, ТРЕТИРАНИ ИНТРАПЕРИТОНЕАЛНО С ЛИПОПОЛИЗАХАРИД ОТ E. COLI (O111:B4) И ЕФЕКТИТЕ НА НЕСТЕРОИДНИЯ ПРОТИВОВЪЗПАЛИТЕЛЕН ЛЕКАРСТВЕН ПРОДУКТ НИМЕЗУЛИД (СЕЛЕКТИВЕН СОХ-2 ИНХИБИТОР)

Използваният експериментален модел на мишки, третирани интраперитонеално с 25 μg/0.5 mL LPS дава възможност да се изясни динамиката на нарушенията в антиоксидантния статус.

19

IV.1.1. Резултати от изследване на интрацелуларните и екстрацелуларни антиоксидантни системи при LPS действие

Представените на фиг. 1 данни за активността на каталазата показват, че LPS, приложен интраперитонеално на мишките от група I твърде рано – още на 6-я час понижава активността на тази интрацелуларната ензимна антиоксидантна система. Този факт е доказателство, за бърз поразяващ ефект на LPS върху детоксикационния потенциал на клетката. Стойностите на САТ остават по-ниски от изходните до края на изследването – 9-я ден (фиг. 1). Можем да предположим, че промените в антиоксидантната активност на САТ са резултат от натрупване на значителни количества хидроген пероксид при LPS въздействие, тъй като ензимът катализира разграждането на този продукт до вода и кислород (Held, 2015). Най-вероятно регистрираните нарушения в САТ рефлектират върху SOD, защото между тези интрацелуларни ензимни антиоксиданти съществува зависимост, коментирана от Bayliak et al. (2009). Взаимоотношенията се свеждат до това, че САТ предпазва SOD от дезактивация, настъпваща от големи количества Н2О2. Освен това САТ има по-голям афинитет от SOD към Н2О2 и следователно първа реагира на действието на LPS.

**

**

**

***

++v

*** **

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 час 6 час 24 час 3 ден 5 ден 9 ден

kU

/L

LPS LPS+нимезулид нимезулид

Фиг. 1. Динамика на промените в каталазната активност (kU/L) при мишки, инжектирани интраперитонеално с липополизахарид (I група), с комбинацията нимезулид+липополизахарид (II група) и при самостоятелно р.о. прилагане на нимезулид 4 последователни дни в доза 100 mg/kg (III група). Статистическа значимост вътре в групите: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час; ++ p<0.01 спрямо 6 час; v p<0.05 спрямо 24 час.

Антиоксидантният потенциал включва също голям брой малки неензимни молекули с детоксикационна функция. Глутатионът е един от важните интрацелуларни неензимни механизми за защита от ROS (Held, 2015). Директно улавя хидроксилни и пероксилни анионни радикали и косвено участва като ко-фактор на глутатион пероксидазата при отстраняването на Н2О2 (Arthur, 2000). Изслед-ванията на rGSH показват, че концентрациите му при мишките, на които е приложен LPS през целия период на изследване остават по-ниски от изходните (фиг. 2).

20

*

c1*c1

******

++ +++++

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9


mm

ol/L


Фиг. 2. Динамика на промените в концентрациите на редуцирания глутатион (rGSH) (mmol/L) при мишки, инжектирани интраперитонеално с липополизахарид (I група), с комбинацията нимезулид+липополизахарид (II група) и при самостоятелно р.о. прилагане на нимезулид четири последователни дни в доза 100 mg/kg (III група). Статистическа значимост вътре в групите: * p<0.05, *** p<0.001 спрямо 0 час; ++ p<0.01, +++ p<0.001 спрямо 6 час. Статистическа значимост между групите: c1 p<0.05 спрямо III група.

Нарушенията при rGSH могат да рефлектират върху екстрацелуларните антиоксиданти - витамин Е и С, тъй като разглежданият показател регенерира тяхната активна форма (Watson et al., 2003). Представените данни показват, че интрацелуларния антиоксидантен потенциал е с ограничени възможности и бързо бива разрушен от LPS.

На фона на ниските концентрации интрацелуларни антиоксиданти - САТ и rGSH при мишките от група I, се откроява кинетиката на изследваните екстрацелуларни антиоксиданти - албумин, глюкоза. Ние установяваме, че стойностите на албумина на 6-я час от действието на LPS се понижават, но след това нарастват значимо и през целия изследван период - 24-ти час, 3-ти, 5-ти и 9-ти ден остават по-високи от изходните (фиг. 3). Промените в албумина може да са резултат от преразпределение на флуидите между екстрацелуларното и интрацелуларно пространство. Peeples et al. (2005) демонстрират, че албуминът има важна роля при дезактивиране на Н2О2 и предотвратяване на нарушенията от ROS. Промененият от действието на LPS хормонален фон също може да има отношение, тъй като е известно, че активността на глюкокортикоидите кореспондира с увеличаване на албумина (Freise et al., 2001; Lohman and Baron, 2010). Голяма е вероятността токсичният ефект на LPS върху бъбречните нефрони да е отговорен за коментираните промени в албумина.

Експерименталният модел показва, че LPS нарушава глюкозната хомеостаза при мишките от група I като предизвиква трайна хипогликемия, добре изразена, както на 6-я час, така и на 5-я ден (фиг. 4). Данните на Raetzsch et al. (2009) кореспондират с нашите. Най-вероятно, LPS-медиираните промени в глюкозната хомеостаза са комплексни, но фактът че са налице още на 6-я час доказва хормонален контрол, постигнат чрез активиране на инсулиновата секреция. Въпреки, че ние не проследяваме промените в инсулиновата активност, изследванията на Nguyen et al.

21

(2014) и Nohr et al. (2016) осъществени чрез ген-експресионен анализ по безспорен начин доказват, опосредствано чрез цитокини активиране на инсулиновата секреция от LPS.

*c3

++++++

+++ *+++

c1c2

c2

0

10

20

30

40

50

60


g/L


Фиг. 3. Динамика на промените в албумина (g/L) при мишки, инжектирани интраперитонеално с липополизахарид (I група), с комбинацията нимезулид+липополизахарид (II група) и при самостоятелно р.о. прилагане на нимезулид четири последователни дни в доза 100 mg/kg (III група). Статистическа значимост вътре в групите: * p<0.05 спрямо 0 час; +++ p<0.001 спрямо 6 час; v p<0.05 спрямо 24 час. Статистическа значимост между групите: c1 p<0.05, c2 p<0.01, c3 p<0.001 спрямо III група.

***

c2

b2 ++ **

c1

+++

$

++,vv

c1

++,vv

b3

*c3

0

2

4

6

8

10

12


mm

ol/L


Фиг. 4. Динамика на промените в кръвната захар (mmol/L) при мишки, инжектирани интраперитонеално с липополизахарид (I група), с комбинацията нимезулид+липополизахарид (II група) и при самостоятелно р.о. прилагане на нимезулид четири последователни дни в доза 100 mg/kg (III група). Статистическа значимост вътре в групите: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час; + p<0.05, ++ p<0.01, +++ p<0.001 спрямо 6 час; v p<0.05, vv p<0.01, vvv p <0.001 спрямо 24 час; $ спрямо 5 ден. Статистическа значимост между групите: a1 p<0.05, a2 p<0.01, a3 p<0.001 спрямо I група; b1 p<0.05, b2 p<0.01, b3 p<0.001 спрямо II група; c1 p<0.05, c2 p<0.01, c3 p<0.001 спрямо III група.

22

IV.1.2. Оксидативен стрес при LPS действие

Бактериалният антиген LPS на 6-я час от аплицирането си при мишки, увеличава стойностите на MDA (фиг. 5) и на OSI (фиг. 6). След това, индикаторите на оксидативен стрес – MDA и OSI при разглежданата група, понижават нивата си, като

***

b1

++++++

+++

+++

c2

*++

**

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


mm

ol/L


Фиг. 5. Динамика на промените в серумните концентрации на малондиалдехида (MDA) (μmol/L) при мишки, инжектирани интраперитонеално с липополизахарид (I група), с комбинацията нимезулид+липополизахарид (II група) и при самостоятелно р.о. прилагане на нимезулид четири последователни дни в доза 100 mg/kg (III група). Статистическа значимост вътре в групите: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час; ++ p<0.01, +++ p<0.001 спрямо 6 час. Статистическа значимост между групите: b1 p<0.05, спрямо II група; c2 p<0.01спрямо III група.

+++

+++

b1+++

++

**

b3 c3

c1 $

0

1

2

3

4

5

6

7

8



Фиг. 6. Промени в индекса на оксидативен стрес (OSI) при мишки, инжектирани интраперитонеално с липополизахарид (I група), с комбинацията нимезулид+липополизахарид (II група) и при самостоятелно р.о прилагане на нимезулид четири последователни дни в доза 100 mg/kg (III група). Статистическа значимост вътре в групите: ** p<0.01, спрямо 0 час; ++ p<0.01, +++ p<0.001 спрямо 6 час; v p<0.05, vv p<0.01, vvv p <0.001 спрямо 24 час; $ спрямо 5 ден. Статистическа значимост между групите: b1 p<0.05, b 3 p<0.001 спрямо II група; c1 p<0.05, c3 p<0.001 спрямо III група.

23

разликите в концентрациите на MDA на 24-я час, 3-я ден, 5-я ден и 9-я ден са статистически значими (p<0.001 спрямо 6-я час), а OSI е силно понижен, както на 24-я час (p<0.01), така и на 3-я, 5-я и 9-я ден (p<0.001). Тези данни индикират, че провокираният от LPS оксидативен стрес може да бъде туширан чрез по-мощния капацитет на екстрацелуларните антиоксидантни системи, свидетелство за което е увеличеният FRAP, характеризиращ главно плазмените неензимни антиоксиданти (фиг. 7).

c3

**

***+

vvb2 ***v

c2c2

+

c2+++

***

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3


mm

ol/

L


Фиг. 7. Динамика на промените в общия антиоксидантен капацитет на плазмата (FRAP) (mmol/L) при мишки, инжектирани интраперитонеално с липополизахарид (I група), с комбинацията нимезулид+липополизахарид (II група) и при самостоятелно р.о. прилагане на нимезулид четири последователни дни в доза 100 mg/kg (III група). Статистическа значимост вътре в групите: ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час; + p<0.05, +++ p<0.001 спрямо 6 час; v p<0.05, vv p<0.01, vvv p <0.001 спрямо 24 час; Статистическа значимост между групите: b2 p<0.01, спрямо II група; c2 p<0.01, c3 p<0.001 спрямо III група.

IV.1.3. Патохистологични промени при LPS действие

Ronco et al. (2010) посочват, че индуцирания от LPS оксидативен стрес е сред водещите патогенетични механизми на тъканни нарушения при ендотоксемия. Проведените патохистологични проучвания на проби от вътрешни органи (бял дроб, сърце, слезка, черен дроб, панкреас, тънки черва, бъбреци) при мишки, третирани интраперитонеално с LPS показват хиперемия на артериални и венозни кръвонони съдове, дифузни, масивни инфилтрати в интерстициалната съединителна тъкан около всички категории бронхи (фиг. 8), в отделни участъци на миокарда има лимфоцитни огнища, около които напречната набразденост на влакната е нарушена (фиг. 9), черният дроб е хиперемиран (фиг. 10) в съединителната тъкан на бъбречните каналчета на медуларните нефрони има дифузни и локални лимфоцитни струпвания (фиг. 11).

24

Фиг. 8. Бял дроб 9-ти ден от липополиза-харидно въздействие – първа група. Дифузни, масивни лимфоцитни инфилтрати (стрелки) в интерстициалната съединителна тъкан около всички категории бронхи. Х/Е, 125×.

Фиг. 9. Сърце, 9-ти ден от липополи-захаридно въздействие. Лимфоцитни огни-ща (стрелка), около които влакната са с на-рушена напречна набразденост, а кардио-миоцитите съдържат вакуолни включения в саркоплазмата. Х/Е, 250×.

Фиг. 10. Черен дроб, 9-ти ден от липополи-захаридно въздействие. Дилатирани и кръвонапълнени кръвоносни съдове (стрел-ки). Вакуолна и зърнеста дистрофия в хепатоцитите. Х/Е, 250×.

Фиг. 11. Бъбрек, 9-ти ден от липополизаха-ридно въздействие. Медуларните нефрони на бъбречните каналчета са запълнени с еозинофилно оцветено съдържание (бели стрелки), а съединителната тъкан между те-зи каналчета е изпълнена с дифузни и ло-кални лимфоцитни струпвания (черна стрелка). Х/Е, 40×.

IV.1.4. Антиоксидантни възможности на нимезулида

Възможността за контрол на предизвикания от LPS оксидативен стрес чрез прилагане на антиоксиданти е целесъобразен научен подход, използван в настоящия експериментален модел. Изборът на нимезулида, като коригиращ лекарствен продукт е мотивиран от антиоксидантните му свойства, за които има съобщения (Khalil et al., 2012). Проведените изследвания показват, че когато нимезулидът е приложен самостоятелно четири последователни дни в доза 100 mg/kg (група III), концентрациите на FRAP нарастват значимо (p<0.001 спрямо 0 час), като до 3-я ден

25

стойностите на показателя при тази група остават по-високи, както спрямо тези на групи – I и II, така и спрямо изходните (фиг. 7). Освен това при мишките от група III, OSI по време на приема на нимезулид не показва статистически значими отклонения (фиг. 6). Тези данни потвърждават антиоксидантните качества на медикамента. Въпреки благоприятните ефекти на нимезулида върху антиоксидантния статус, изследванията на CAT и rGSH показват, че концентрациите им остават по-ниски от изходните през експерименталния период, което кореспондира с резултатите на Singh et al. (2012). Вероятно механизмите на действие на нимезулида върху антиоксидантните и редокс-ензимните системи са твърде разнообразни, сложни и показват модулиращия потенциал на медикамента. Това се потвърждава от промените в липидната пероксидация (фиг. 5) при животните от III група, които се характеризират с по-високи от изходните концентрации на MDA. Нимезулидът се различава от другите NSAIDS по химичната си структура, фармакологични и фармакокинетични свойства (Bennet, 1999; Rainsford, 2006; Krishnappa, 2010). Сред предимствата му са малкото странични ефекти върху стомашно-чревния тракт, дължащи се на неговата СОХ-2 селективност (Krishnappa, 2010). Според Rainsford (2006) при метаболизирането на нимезулида в черния дроб с участието на цитохром Р450 (CYP-2C9, CYP-2C19 и CYP-1A2) се получава реактивен метаболит.

Нимезулидът приложен на мишки, третирани интраперитонеално с LPS (II група) успява да нормализира концентрациите на rGSH (фиг. 2), но каталазната активност остава по-ниска от изходната (фиг. 1). При тези мишки, OSI до 5-я ден е висок (фиг. 6) и това е резултат, както от ниските стойности на FRAP (фиг. 7), така и от високите серумни концентрации на MDA (фиг. 5) в този период. Стойностите на албумина при разглежданата група животни през целия наблюдаван период остават по-ниски от изходните, за разлика от група I, където те между 5-я – 9-я ден от LPS въздействието са по-високи (фиг. 3). Макар, че нимезулидът, използван самостоятелно (група III) не повлиява разглеждания показател при комбинирането му с LPS, токсичните му ефекти нарастват. При мишките от II група нимезулидът коригира (в периода 3-ти – 9-ти ден) хипогликемията, индуцирана от LPS (фиг. 4). Въз основа на данните на Pelletier et al. (1999) може да се предполага, че този резултат се дължи на увеличена активност на глюкокортикоиди, поради способността на нимезулида да афектира глюкокортикоид-рецепторната система (Rainsford, 2005). Представените данни ясно показват, че нимезулидът в комбинация с LPS упражнява благоприятен ефект, свързан с нормализиране концентрациите на rGSH и регулиране на LPS индуцираната хипогликемия. Необходимо е обаче обективно да се прецени съотношението полза/риск, тъй като при тази комбинация се отдиференцират и неблагоприятни ефекти - ниска каталазна активност и общ антиоксидантен капацитет на плазмата, висок индекс на оксидативен стрес и серумни концентрации на MDA.

Чрез този експеримент е установен оксидативния стрес, който LPS провокира, получена е ценна информация за взаимоотношенията между интрацелуларните и екстрацелуларни ензимни и неензимни антиоксидантни системи и са оценени антиоксидантните възможности на нимезулида.

26

IV.2. ОТДИФЕРЕНЦИРАНЕ НА НАРУШЕНИЯТА В ЕСТЕСТВЕНИТЕ ЗАЩИТНИ МЕХАНИЗМИ ПРИ ПЛЪХОВЕ, ТРЕТИРАНИ ИНТРАПЕРИТО-НЕАЛНО С ЛИПОПОЛИЗАХАРИД ОТ E. COLI (O111:B4) И ОЦЕНЯВАНЕ ВЪЗМОЖНОСТИТЕ ЗА КОРИГИРАНЕТО ИМ ЧРЕЗ НЕСТЕРОИДНИЯ ПРОТИВОВЪЗПАЛИТЕЛЕН ЛЕКАРСТВЕН ПРОДУКТ ИНДОМЕТАЦИН (НЕСЕЛЕКТИВЕН СОХ ИНХИБИТОР)

При този експеримент приложената интраперитонеално при плъхове доза от 1 mg/kg LPS е многократно по-ниска от леталната за този биологичен вид – 25-60 mg/kg (Culbertson and Osburn, 1980), имащ ниска чувствителност към бактериалния антиген.

IV.2.1. Клинични наблюдения

Третираните с LPS експериментални животни (група А) показват неспецифични признаци като намален апетит, ограничена двигателна активност, фебрилитет (фиг. 12). Тези промени в клиничното състояние настъпват твърде рано и кореспондират с изследванията на на Sass et al. (2003), Taser et al. (2014).

**c2

***c3

**c3*c2

a1

a2c3

a2

35,5

36

36,5

37

37,5

38

38,5

39

39,5

40

0 час 2 час 4 час 6 час 1 ден 3 ден 6 ден 10 ден 15 ден

оС

LPS LPS+ind controls

Фиг. 12. Промени в ректалната температура (oC) при плъхове, третирани с липополизахарид (LPS) (група А), с индометацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б) и група С (контроли). Данните са представени като m±SEM. Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час. Cтатистическа значимост между групите: c1 p<0.05, c2 p<0.01, c3 p<0.001 спрямо контролата; а1 p<0.05, а2 p<0.01, а3 p<0.001 спрямо група А (LPS).

IV.2.2. Резултати от изследваните инфламаторни биомаркери

Простагландин Е2

Попаднал в организма LPS нарушава динамичния баланс между активация и потискане, заложен при функционирането на защитните системи (Kong et al., 2007; Mani, 2012; Fang et al., 2015). Ендотоксинът инициира силен възпалителен отговор. Доказателство за него са регистрираните от нас промени в плазмените концентрации на PGE2, които при плъховете от група А са увеличени значимо и достигат стойности, четирикратно по-високи от изходните още на 2-я час, като остават такива на 4-я и на 6-я час (фиг. 13).

27

Драматичното нарастване на PGE2 може да бъде резултат, както от ефектите на LPS върху клетъчните елементи на естествения имунитет – неутрофили, еозинофили, базофили, моноцити и макрофаги (Bozza et al., 1991; Alba-Loureiro et al., 2004), така и върху съдовия ендотел. Nathan and Xie (1994a; 1994b) предполагат, че СОХ продукцията може да влияе върху активацията на iNOS. Posadas et al. (2000) потвърждават съществуването на синергизъм между вазодилататорните ефекти на PGE2 и NO. Получената мощна вазодилатация, както и увеличения пермеабилитет на съдовете нарушават кръвната циркулация. Рязкото нарастване на PGE2 при LPS въздействие показва, че възпалението се развива с прекомерна интензивност, а това кореспондира с надхвърляне на защитните му функции и възникването на нарушения. Caporarello et al. (2016) доказват, че високите нива на PGE2 могат да променят инсулиновата секреция, а Pecchi et al. (2009) коментират ролята на PGE2 при формиране поведенческите реакции.

Интерлевкин-1β

Ние установяваме настъпването на съществени промени в провъзпалителния цитокин - IL-1β (фиг. 14). Неговите плазмени концентрации при третираните само с LPS плъхове (група А) са високи, както на 2-я час, така и на 4-я и 6-я час. В основата на тези промени може да стои фактът, че LPS активира значителен брой клетъчни елементи - макрофаги, неутрофили, епителни и ендотелни клетки, които освобождават този цитокин. Освен това, в отговор на LPS се формират инфламазоми (Martinon et al., 2004; Martinon, 2010). Последните са важен елемент от защитния капацитет на клетъчните елементи, при реализирането на който се усилва секрецията на IL-1 (Martinon and Tschop, 2007).

*****

**

0

10

20

30

40

50

60

70

pg/mL

1 2 3 4

0 час 2 час 4 час 6 час

LPS LPS+ind

*****

**

0

10

20

30

40

50

60

70

pg/mL

1 2 3 4

0 час 2 час 4 час 6 час

LPS LPS+ind

Фиг. 13. Промени в плазмените концент-рации на PGE2 при плъхове, третирани с липополизахарид (LPS) (група А), с индо-метацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б). Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001 спрямо 0 час.

Фиг. 14. Промени в плазмените концентра-ции на IL-1β при плъхове, третирани с липо-полизахарид (LPS) (група А), с индометацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б). Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час; Статистическа значимост между групите: а1 p<0.05, а2 p<0.01, а3 p<0.001 спрямо група А (LPS).

28

IV.2.3. Промени в клетъчните фактори на естествена резистентност

Нашите данни разкриват, че LPS приложен на плъховете от група А понижава статистически значимо количеството на белите кръвни клетки не само на 2-я час, но и по-късно – на 3-ти, 6-ти и 10-ти ден (фиг. 15). Възможно е промените в левкоцитите да са резултат от увеличена трансендотелната левкоцитна миграция, която LPS предизвиква (Shen et al., 1998; Hmama et al., 1999; Bradfield et al., 2007). Bradfield et al. (2007) отчитат висока експресия на ICAM-1, VCAM-1 при LPS действие. Varqovic et al. (2016) обсъждат възможността, предизвиканият от LPS хормонален дисбаланс, да оказва влияние върху левкоцитния трафик.

*

* ****

*

**

*** ****

0

2

4

6

8

10

12

14

16


LPS LPS+ind контроли

Фиг. 15. Промени в количеството на левкоцитите при плъхове, третирани с липополизахарид (група А), с липополизахарид и индометацин (LPS+ind) (група Б) и при нетретирани животни (група С - контроли) (m±SEM). Статистическа значимост вътре в групите: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час.

Приложеният при плъхове LPS, предизвиква рязко увеличаване процента на пръчкоядрените неутрофили в периода 4-ти – 6-ти час при животните от група А (фиг. 16). Олевяването е характерна лабораторна находка при възпаление, с което протича LPS въздействието. В хода на възпалителния процес първоначално се включват пристенните гранулоцити, а по-късно и тези от костномозъчния резерв. Според Kumar and Sharma (2010), Mantovani et al. (2011) увеличаването на младите форми на неутрофилите не гарантира функционална ефективност, поради незавършила експресия на рецепторните им структури.

По отношение на агранулоцитите установяваме, че процентът на лимфоцитите при плъховете от група А е значително увеличен на 2-я, 4-я час, както и на 3-я ден. На 10-я ден тези клетъчни елементи запазват високите си нива при животните от група А. Можем да предположим, че отношение към регистрираните отклонения при лимфоцитите имат, както качествата на LPS като тимуснезависим антиген (Mamchak et al., 2000), така и възможностите му да променя хормоналния фон (Gornikiewicz et al., 2000; Varqovic et al., 2016). Стойностите на моноцитите през целия изследван период остават по-ниски от тези при контролната група (група С).

29

Фиг. 16. Диференциална кръвна картина при плъхове, третирани интраперитонеално с липополизахарид (LPS) (Група А); с липополизахарид и индометацин (LPS+ind) (Група Б) и при контролна група (Група С).

IV.2.4. Промени в хуморални фактори на естествена резистентност

Активността на лизозима, която при контролите варира в рамките на на 0.56 - 0.64 μg/mL, при плъховете от група А още на 4-я час показва нарастване на стойностите спрямо 0-я час (p<0.001) (фиг. 17). Увеличаването е значимо, както на 6-я час (p<0.001), така и на 1-я ден (p<0.001), а достигнатия на 6-я ден максимум е в размер на 1.38±0.06 μg/mL. Въпреки последващото понижение, активността на лизозима остава по-висока от изходната и в края периода – 15-я ден (p<0.001).

***c3

***c3

***c3

***c3

***c3

***c3***c2

****a1c3

***c3

***c3

**c3*a3c2

a3

**c1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6


mg

/mL


Фиг. 17. Промени в активността на лизозима при плъхове, третирани с липополизахарид (LPS) (група А), с индометацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б) и при група С (контроли). Данните са представени като m±SEM. Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час. Статистическа значимост между групите: c1 p<0.05, c2 p<0.01, c3 p<0.001 спрямо група С (контроли); а1 p<0.05, а2 p<0.01, а3 p<0.001 спрямо група А (LPS).

St Sg Eo Ba Lym Mo

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7 7 7 8 8 8 9 9 9 LPS LPS+IND C LPS LPS+IND C LPS LPS+IND C LPS LPS+IND C LPS LPS+IND C LPS LPS+IND C LPS LPS+IND C LPS LPS+IND C LPS LPS+IND C


30

Таб

лиц

а 2

. П

ром

ени

в о

бщи

я б

елтъ

к и

в б

елтъ

чн

ите

фр

акц

ии

при

плъ

хове

тр

ети

ран

и с

ли

по

по

лиза

хар

ид

(гр

упа

А)

и с

ли

по

по

лиза

хар

ид

и и

нд

омет

аци

н (

груп

а Б

), x

±S

EM

.

Пок

азат

ели

Г

руп

и

0 ч

ас

2 ч

ас

4 ч

ас

6 ч

ас

1 д

ен

3 д

ен

6 д

ен

10

ден

1

5 д

ен

Об

щ б

елтъ

к А

5

7±

2.0

***

5

1±

2.2

***

5

5±

3.0

***

5

6±

1.0

***

6

0±

3.1

**

66

±3.

2

66

±3.

1

67

±1.

9

(g/L

) Б

7

2±

3.6

5

6±

1.6

***

5

0±

1.9

***

4

9±

1.9

***

6

2±

2.4

**

61

±2.

8

*

* 6

4±

1.4

*

71

±2.

7

65

±1.

7

* А

лбум

ин

А

1

3.7

±1

.04

**

18

.3±

1.0

9

13

.6±

2.1

6

**

1

6.8

±0

.94

1

7.8

±1

.01

16

.8±

1.2

8

25

.3±

1.2

1

*

1

9.7

±1

.63

(g/L

) Б

2

0.8

±2

.40

1

5.9

±1

.21

* 1

3.2

±2

.05

**

13

.5±

1.3

4

**

1

9.5

±1

.14

2

1.3

±1

.67

20

.2±

2.4

5

26

.2±

1.2

3

*

2

4.3

±0

.47

α1г

лоб

ули

ни

А

1

0.7

±1

.46

9

.6±

0.2

7

12

.0±

0.7

3

9.7

±0

.59

1

0.4

±0

.50

12

.5±

1.0

8

10

.7±

1.9

7

11

.3±

0.9

1

(g

/L)

Б

12.

7±

1.2

0

10

.2±

1.2

3

9.7

±1

.69

9

.6±

0.5

3

10

.8±

1.2

4

11

.7±

0.7

3 1

2.0

±0

.80

1

2.6

±1

.80

1

3.2

±0

.34

α2г

лоб

ули

ни

А

7

.6±

0.5

0

4.3

±0

.40

***

6

.8±

0.3

9

7.7

±0

.36

6

.8±

0.5

6

8.0

±1

.62

5

.6±

0.6

3

**

8.6

±0

.72

(g/L

) Б

9

.0±

1.5

0

8.1

±1

.2

9.0

±2

.94

6

.5±

0.8

6

8.2

±1

.21

6

.3±

1.0

0

9.3

±1

.11

5

.9±

0.7

2

*

6.4

±0

.05

β г

лоб

ули

ни

А

1

0.3

±1

.11

8.6

±0

.42

9

.5±

0.5

1

9.4

6±

0.5

4

10

.5±

0.8

4

11

.1±

2.0

5

10

.9±

0.5

1

11

.4±

0.8

1

(g/L

) Б

1

2.7

±2

.18

1

2.5

±1

.32

9.7

±0

.01

9

.43

±1

.16

1

3.6

±0

.83

9

.8±

1.5

4

10

.1±

0.8

4

10

.4±

0.7

3

1

1.2

±0

.35

γ гл

обул

ин

и

А

13

.8±

0.8

6

1

0.6

±1

.31

*

13

.2±

1.0

9

12

.7±

1.4

8

14

.2±

1.7

4 1

7.4

±1

.24

13

.8±

1.0

1

16

.1±

1.7

1

(g/L

) Б

1

5.3

±1

.55

1

1.6

±1

.23

8.7

±0

.93

**

* 1

0.0

±1

.01

**

9.4

±0

.80

**

* 1

1.8

±1

.49

12

.4±

1.1

0

16

.8±

0.9

2

11

.6±

0.9

5

*

Ст

ати

стич

еска

зна

чим

ост

: *

p<

0.05

, **

p<

0.0

1,*

**p

<0.

001

сп

рям

о 0

-я ч

ас.

31

Промените в общия белтък, в белтъчните фракции са представени на таблица 2. Статистически достоверни отклонения са регистрирани при общия белтък, албумина, α2- и γ-глобулините. Налице е понижаване на общия белтък, значително редуциране на албумина, както и на α2-глобулиновата фракция на 4-я час и на 10-я ден от LPS третирането. Фактът, че количеството на γ-глобулините е понижено може да се разглежда като доказателство за хетерогенния характер на действие на LPS, засягащо не само естествения, но и специфичния имунитет.

IV.2.5. Метаболитен отговор при плъхове

Използваните при нашето изследване плъхове Wistar имат ниски изходни стойности на лактата (между 1.46 mmol/L и 1.62 mmol/L) (фиг. 18), което кореспондира с данните на Sari et al. (2013), използващи същата инбредна линия. Концентрациите на лактата при групи А и Б достигат нива, двойно по-високи от изходните още на 2-я час и остават такива до края на изследването. Отговорен за този резултат най-вероятно е LPS, който разстройва биоенергетиката на клетката (Raetzsch et al., 2009).

******

***

*** ****

*********

****

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4


mm

ol/L

LPS LPS + ind контроли

Фиг. 18. Промени в плазмените концентрации на лактата (mmol/L) при плъхове, третирани с липополизахарид (LPS) (група А), с индометацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б) и при група С (контроли). Данните са представени като m±SEM. Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05,** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час.

Лактатният метаболизъм е ясен индикатор за нарушено съотношение между двете фази на гликолиза – аеробна и анаеробна с доминиране на последната. Това неминуемо се отразява върху енергийната ефективност, тъй като за получаването на необходимата енергия се изразходват значително по-големи количества глюкоза.

Нашите проучвания върху глюкозната хомеостаза при плъховете от група А показват наличието на нарушения (фиг. 19). Те са свързани с регистрираната в периода 1-ви – 10-ти ден хипогликемия при тях. Присъствието й вероятно е резултат от действието на комплекс от фактори. Според Vogel et al. (1991) индуцираните от LPS промени в цитокиновия фон са отговорни за хипогликемията. Анализирайки молекулните механизми на действие на LPS, Moon et al. (2011) коментират, ролята на цАМФ, чрез който може да бъде повлияна инсулиновата секреция.

32

*****

***

******

0

1

2

3

4

5

6

7

8


mm

ol/L


Фиг. 19. Динамика на промените в кръвната захар (mmol/L) при плъхове, третирани с липополизахарид (LPS) (група А), с индометацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б) и при група С (контроли). Данните са представени като m±SEM. Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час.

* **c3

***c3

***c3

***c2

c2

a3c1

a3 a1

c3

c3

7

7.05

7.1

7.15

7.2

7.25

7.3

7.35

7.4


контроли LPS LPS+ind

Фиг. 20. Динамика на промените в рН при плъхове, третирани с липополизахарид (LPS) (група А), с индометацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б) и при група С (контроли). Данните са представени като m±SEM. Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час. Статистическа значимост между групите: c1 p<0.05, c2

p<0.01, c3 p<0.001 спрямо контролите; а1 p<0.05, а2 p<0.01, а3 p<0.001 спрямо група А (LPS).

******

***

***

0

5

10

15

20

25

30

35



Фиг. 21. Динамика на промените в актуалните бикарбонати НСО3 (mmol/L) при плъхове, третирани с липополизахарид (LPS) (група А), с индометацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б) и при група С (контроли). Данните са представени като m±SEM. Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час.

33

IV.2.6. Ефекти на LPS върху киселинно-алкалното състояние

При киселинно-алкалното състояние настъпват промени, свързани със значимо понижаване на рН (фиг. 20), на HCO3

- (фиг. 21), на SBC, и силно изтегляне стойностите на ABE (фиг. 22), SBE към отрицателния знак още на 2-я час. Тези промени продължават през целия период на изследване, и са ясно доказателство за наличието при тези животни на декомпенсирана метаболитна ацидоза. За разлика от това респираторният показател (pCO2), при тази група не показва статистически значими отклонения (фиг. 23).

***

c3

***

c3

***

c3

+++

c1

*+

c3

-*++

c2

***

c1

***

c3

c3-c1

c1

c3

c2

-**

c3

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15


mm

ol/L


Фиг. 22. Динамика на промените в алкалния излишък АВЕ (mmol/L) при плъхове, третирани с липополизахарид (LPS) (група А), с индометацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б) и при група С (контроли). Данните са представени като m±SEM. Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час; + p<0.05, ++ p<0.01, +++ p<0.001 спрямо 2 час. Статистическа значимост между групите: c1 p<0.05, c2 p<0.01, c3 p<0.001 спрямо контролите.

**

******

0

10

20

30

40

50

60

70



Фиг. 23. Динамика на промените в парциалното налягане на въглеродния диоксид (pCO2)

(mmHg) при плъхове, третирани с липополизахарид (LPS) (група А), с индометацин и липополизахарид (LPS+ind) (група Б) и при група С (контроли). Данните са представени като m±SEM. Статистическа значимост вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час.

34

Разстройствата в киселинно-алкалния баланс, които LPS предизвиква са обсъждани от редица изследователи (Fencl et al., 2000; Bruegger et al., 2007; Troskot et al., 2010). Налага се мнението, че поддържането на киселинно-алкалната хомеостаза е важно условие за оптимално протичане на жизнената дейност (Adrogue and Adrogue, 2001).

IV.2.7. Ефекти на LPS върху червената кръвна картина и еритроцитометричните индекси

При плъховете LPS предизвиква твърде ранно – между 2-я и 4-я час, както и продължително (6-ти, 10-ти ден) понижаване на концентрациите на хемоглобина, на хематокрита, на еритроцитните индекси, което индикира настъпването на нарушения в червената кръвна картина (таблица 3). На този фон регистрираното нарастване на количеството на еритроцитите може да бъде разглеждано като проява на включен компенсаторен механизъм от развиваща се в организма хипоксия. За последната свидетелстват високите концентрации на лактата при плъховете от група А (фиг. 18).

IV.2.8. Ефекти на индометацина при LPS третирани плъхове

При нашия експериментален модел, за да осъществим контрол върху силата на възпалението и възстановим качествата му на неспецифичен жизнено протективен механизъм използваме NSAIDS индометацин. При плъховете от група Б, той е приложен рer os, 30-минути преди LPS въздействието в доза 2.5 mg/kg. Тъй като лекарственият продукт е воднонеразтворим, той е аплициран в 1% разтвор на карбоксиметилцелулоза, чрез хранопроводна сонда. В резултат на това въздействие, плазмените концентрации на PGE2 при животните от група Б през целия период на изследване варират около изходните нива, което потвърждава постигането на търсения от нас ефект на индометацина върху PGE2 (фиг. 13). Според Helleberg (1981) този медикамент след орален прием има бърза абсорбция, като плазмените му нива достигат пик след 1-2 часа.

Приложеният индометацин понижава концентрациите на IL-1β, както спрямо изходните, така и спрямо тези на плъховете от група А – третирани само с LPS (p<0.001) (фиг. 14). Това кореспондира с изследванията на Du and Li (1999), които анализирайки in vitro ефектите на индометацина върху IL-1 и NO доказват, че той инхибира продукцията им. Endres et al. (1989) коментират, че този неселективен СОХ инхибитор модулира цитокиновата продукция, вероятно по индиректен път. Crestani et al. (1991), Avitsur et al. (1999) разглеждат връзката PGE2 - IL-1 - индометацин и установяват, че при блокиране на простагландиновата синтеза частично или напълно се променят физиологичните, невроендокринни и поведенчески ефекти на IL-1. Нестероидният противовъзпалителен лекарствен продукт коригира ректалната температура (фиг. 12) и упражнява позитивен ефект върху глюкозната хомеостаза (фиг. 19), но не може да отмени, провокираните от LPS отклонения в левкоцитите (фиг. 15), левкограмата (фиг. 16), червената кръвна картина, еритроцитни индекси (таблица 3), както и нарушенията в общия белтък и белтъчните фракции (таблица 2). Индометацинът не може да тушира предизвиканите от LPS нарушения на КАС (фигури 20, 21, 22 и 23).

35

Таб

лиц

а 3

. Ч

ерве

на

кръ

вна

кар

тин

а и

ер

итр

оц

итн

и и

нд

екси

при

плъ

хов

е, т

рети

ран

и и

нтр

апер

ито

неа

лно

с л

ип

оп

оли

зах

ари

д (L

PS

) (Г

руп

а А

); с

ли

по

пол

иза

хар

ид

и и

нд

ом

етац

ин

(L

PS

+in

d) (

Гру

па

Б)

и п

ри к

онтр

олн

а гр

упа

(Гр

упа

С).

Сто

йн

ост

ите

са

пре

дст

авен

и к

ато

x±S

ЕМ

По

каза

тели

0

час

2

час

4

час

6

час

1

ден

3

ден

6

ден

10

ден

15

ден

Г

руп

а А

(L

PS

)

Er

(x1

012

/L)

8.2±

1.5

7.

7±0.

8

7.3±

0.8

7

.0±

0.6

8.

9±0.

6 c 1

9

.0±

0.4

c 1

7.8±

1.0

8.

5±0.

6

8.4

±0.

6

Hb

(g/

L)

175±

12.

3 14

1±

18.

5**

130

±17

.4 *

**

164

±9.

8

116±

12.

2***

c 2

120

±10

.4**

*c1

132

±11

.8**

* 15

9±1

0.7

163±

11.2

H

t (L

/L)

0.36

±0

.03

0.31

±0.

03c 2

0.

32±

0.0

4c 2

0

.29±

0.0

2c3

0.

36±

0.0

4

0.3

8±0

.03

0.30

±0.

02c 3

0.

34±

0.0

2 0.

39±

0.0

5 M

CH

(pg

) 22

±3.

8

18±

2.8

18

±3.

4

23±

3.0

13

±1.

6**

*c3

13±

1.6

***

c 2

17±

3.4

c 1

19.6

±2.

6

19±

1.9

M

CH

C (

%)

49±

6.0

46

±7.

9

41±

2.8

5

6±5.

4 c

3

32±

2.4

***

3

2±3.

8 *

**

44±

4.2

47

±4.

6

42±

7.2

M

CV

(fl

) 44

±7.

8

41±

8.8

c 1

44±

7.4

4

2±2.

4c 3

41

±3.

6

42±

4.4

c2

39±

8.0

c 2

40±

2.8

c 2

47±

8.6

Г

руп

а Б

(L

PS

+in

d)

Er

(x1

012

/L)

6.9±

0.6

7.

0±0.

8

7.2±

0.4

7

.3±

0.6

8.

6±0.

6*c 1

8

.7±

1.4

* 7.

2±0

.8

7.4±

0.6

8.

0±

0.3

Hb

(g/

L)

151±

8.0

14

1±

22.

2

126

±18

.3

c 1

118

±18

.2 a

3 c 2

10

0±1

1.9

** c

3

98±

16.6

**a 1

c3

116

±16

.4 c

2

122±

23.

5a2c

2 14

2±29

.2

Ht

(L/L

) 0.

40±

0.0

2 0.

34±

0.04

c 1

0.29

±0.

04**

c 3

0.2

9±0

.02*

*c3

0.34

±0

.06

0

.35±

0.0

2 0.

32±

0.02

c 3

0.34

±0.

08

0.34

±0

.06

MC

H (

pg)

22±

1.4

20

±5.

0

17±

2.7

1

6±1.

8 a

3 c 2

12

±1.

5**

*c3

12±

2.8

***c

3 16

±2.

7 c 2

16

±2.

6 c 2

17

±4.

2

MC

HC

(%

) 38

±2.

2

42±

9.8

45

±13

.8

41±

6.6

a2

30±

6.8

c1

28±

5.9

c1

36±

6.6

a 1

35±

6.6

a 2

44±

14.5

M

CV

(fl

) 58

±5.

6

50±

11.2

42

±7.

8*

40±

4.6

**c 3

40

±7.

2 *

* 4

0±6.

4*

c 2

46±

7.6

48

±5.

4

42±

7.4

* Г

руп

а С

(kо

нтр

оли

) E

r (x

10

12/L

) 6.

0±0.

6

7.0±

0.6

7.

4±0

.4

6.8

±0.

5

7.3±

0.9

7

.3±

0.6

6.

8±0

.6

7.3±

0.9

7.

4±

0.8

Hb

(g/

L)

144±

10.

6 15

1±

9.2

15

5±

10.4

1

57±

7.0

14

7±6

.2

148

±9.

8

150

±4.

8

158±

2.8

15

6±6.

4

Ht

(L/L

) 0.

43±

0.0

3 0.

41±

0.04

0.

41±

0.03

0

.40±

0.0

2 0.

37±

0.0

4

0.3

9±0

.02

0.

39±

0.01

0.

40±

0.0

4 0.

40±

0.0

2 M

CH

(pg

) 24

±3.

8

22±

2.8

20

±0.

8

22±

1.3

20

±2.

3

20±

2.6

22

±1.

3

22±

2.6

20

±2.

2

MC

HC

(%

) 34

±3.

8

37±

4.0

38

±0.

6

39±

2.3

40

±4.

8

37±

2.5

38

±2.

3

40±

3.2

38

±3.

6

MC

V (

fl)

72±

9.8

59

±10

.4

53±

6.0

5

9±4.

9

52±

10.1

5

4±3.

6

58±

5.8

54

±6.

0

55±

7.2

Ст

ат

ист

ичес

ка з

начи

мос

т в

ът

ре

в гр

упат

а:

*p<

0.0

5,**

p<0

.01,

***p

<0.

001

сп

рям

о 0

час

; С

тат

ист

ичес

ка з

начи

мо

ст м

ежд

у гр

упит

е: c

1 p<

0.05

, c 2

p<

0.01

; c 3

p<

0.0

01 с

пря

мо

гру

па

С (

кон

трол

а);

а 1 p

<0.

05;

а 2 p

<0.

01;

а 3 p

<0.

001

сп

рям

о г

руп

а А

(L

PS

).

36

Проучванията при този експеримент доказват наличието на силен възпалителен отговор при плъхове след интраперитонеално третиране с LPS, нееднозначни промени в клетъчните, в хуморалните фактори на естествена резистентност, метаболитен отговор и разстройства в киселинно-алкалното състояние, като изясняват възможностите на индометацина за коригиране на нарушенията.

Проведените от нас изследвания с животни, проявяващи слаба чувствителност към LPS – мишки, плъхове и направените проучвания за действието му при тях, поставиха за разрешаване друг важен въпрос, касаещ поведението на естествените защитни механизми при биологични видове с повишена чувствителност (прасета), за да се изясни дали и при тези животни, LPS афектира същите защитни системи. Това е важно защото, ако принципите при нарушенията са сходни, те оправдават прилагането на един и същ терапевтичен подход за третиране, независимо от биологичния вид. Във връзка с това са проведени експерименти, при които като антиген е използван също LPS (E. coli 0111:B4).

IV.3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ПРОУЧВАНИЯ ПРИ ПРАСЕТА, ТРЕТИРАНИ ИНТРАВЕНОЗНО И ИНТРАПЕРИТОНЕАЛНО С ЛИПОПОЛИЗАХАРИД ОТ E. COLI (O111:B4) ЗА ОТДЕФЕРЕНЦИРАНЕ НА НАРУШЕНИЯТА В ЕСТЕСТ-ВЕНИТЕ ЗАЩИТНИ МЕХАНИЗМИ И ОЦЕНЯВАНЕ ВЪЗМОЖНОСТИТЕ ЗА КОРИГИРАНЕТО ИМ ЧРЕЗ БЛОКИРАНЕ НА ПРОСТАГЛАНДИНОВАТА СИНТЕЗА С ИНДОМЕТАЦИН И НА ХИСТАМИНОВИТЕ РЕЦЕПТОРИ ЧРЕЗ ЦИМЕТИДИН

IV.3.1. Ефекти на интравенозно приложения липополизахарид при прасета

Експерименталният модел на ендотоксемия при прасета е осъществен чрез интравенозно въвеждане на 10 μg/kg LPS (група В). Тази доза е 5 пъти по-ниска от максималната - 51.2 µg/kg, коментирана от Koopmans et al. (2012).

IV.3.1.1. Клинични наблюдения

Още на 30 минута след интравенозното инжектиране на LPS, при прасетата се наблюдава адинамия, повръщане, адипсия. Ректалната температура се покачва в периода 1-ви – 4-ти час. Описаните нарушения отзвучават след 72-я час. Тези поведенчески реакции определят избора на динамика на изследване - 1-ви, 2-ри, 4-ти, 24-ти, 48-ми и 72-ри час, когато се задействат естествените защитни механизми на организма.

IV.3.1.2. Ефекти на LPS върху клетъчните елементи на естествения имунитет

Интравенозното инжектиране на LPS провокира значими промени в левко-цитите и левкограмата (таблица 4). Те се свеждат до бързо преходна левкопения (2-ри – 4-ти час, p<0.01 спрямо контролата – група А), последвана от левкоцитоза на 72-я час (p<0.05) (Таблица 4). Левкограмата при експерименталните животни от група В, показва статистически достоверно нарастване на пръчкоядре-ните неутрофили в ранните часове от действието на LPS (1-ви – 4-ти час, p<0.001 спрямо контролата). На фона на ядреното изместване наляво се отчита подчертано редуциране на еозинофилите (2-ри– 4-ти час) и достоверно понижение (p<0.05) на моноцитите само на 1-я час, а на лимфоцитите – на 2-я (p<0.01) и на 4-я час (p<0.001).

37

Таб

лиц

а 4

. П

ром

ени

в

левк

оц

ити

те,

левк

огр

амат

а,

съо

тнош

ени

ето

н

еутр

оф

или

/ли

мф

оц

ити

(N

/L)

и

във

фаг

оц

итн

ата

акти

внос

т н

а н

еутр

оф

или

те п

ри п

расе

та о

т гр

упа

А (

кон

тро

ла)

(n=

6),

груп

а В

(n

=6)

(тр

ети

ран

и и

нтр

авен

озн

о с

10

μg/

kg L

PS

. Д

анн

ите

са

пре

дст

авен

и

като

m±

SE

M.

Пок

азат

ели

Гру

пи

0 ч

ас

1 ч

ас

2 ч

ас

4 ч

ас

24

час

4

8 ч

ас

72

час

Лев

к оц

ити

(1.1

09 /L

) А

1

7.2

±0.

4

В

18

.2±

0.4

1

4.2

±2.

0

11

.4±

1.1

а

2 1

2.0

±1.

2

а 2

15

.4±

1.5

1

8.1

±2.

2

22

.9±

2.0

+

vv

a 1

Лев

к огр

ама

Пръ

чко

ядр

ени

н

еутр

оф

или

(%

) А

2

.8±

0.8

В

2

.3±

0.4

1

1.1

±3

.3

a 1

16

.6±

1.7

**

a3

20

.3±

2.3

**

a3

6.5

±1

.6

+ v

v 4

.8±

1.4

+

+ v

vv

6.2

±2

.1

+ v

vv

Сег

ме н

тояд

рен

и

неу

тро

фи

ли (

%)

А

35

.3±

2.8

В

4

3.2

±5

.9

28

.2±

8.2

5

3.3

±6

.5

53

.8±

3.2

3

3.0

±3

.9

33

.2±

5.0

4

0.0

±6

.9

Ео

зин

офи

ли (

%)

А

2.0

±0

.4

В

3.2

±1

.2

3.2

±0

.8

0.8

±0

.4

0.6

±0

.4

7.3

±1

.0

++

vv

a 3

2.2

±0

.5

2.8

±1

.6

Ли

мф

оц

ити

(%

) А

5

7.9

±2

.6

В

49

.2±

6.6

5

6.5

±10

.1

27

.5±

6.6

a 2

2

1.6

±2

.8

a 3

51

.3±

4.8

5

6.8

±5

.2

v 4

7.0

±9

.3

Мо

ноц

ити

(%

)

А

2.0

±0

.6

В

2.2

±1

.2

0.3

±0

.2 a

1

1.5

±0

.6

3.5

±1

.2

1.2

±0

.4

3.0

±1

.0

2.8

±0

.8

N/L

съ

отн

ош

ени

е

А

1.0

3±

0.1

08

В

1.0

9±

0.2

82

1.0

8±

0.2

02

2.6

2±

0.6

36

3.8

0±

0.6

46

** #

#

0.9

2±

0.1

97

vv

0.7

34±

0.1

63

vv

1.6

2±

0.8

16

v

Неу

тро

фи

лна

фаг

оц

ито

за

Фаг

оци

тоза

(%

) А

3

2.3

3±

2.2

0

В

36

.17

±1

.04

25

.33

±0

.67

**

* a 1

2

9.3

3±

1.0

8

***

27

.17

±0

.44

**

* a 1

2

5.8

3±

0.4

4

***

a 1

24

.00

±0

.28

**

* a 2

2

5.3

3±

0.4

6

***a

1 Ф

агоц

итн

о

чи

сло

А

1.1

6±

0.0

8

В

1.1

5±

0.0

8

1.1

3±

0.0

7

2.0

7±

0.0

5

***

a 3

2.0

0±

0.0

6 **

* a 3

1

.47

±0

.05

**

a2

1.3

3±

0.0

3

1.4

9±

0.0

4

** a

2

Ст

ати

стич

еска

до

стов

ерно

ст в

ът

ре в

гру

па

та

: *

p<

0.0

5,*

* p

<0.

01

, **

* p

<0.

001

сп

рям

о 0

час

; #

p<

0.05

, #

# p

<0.

01 с

пр

ямо

1 ч

ас;

+

p<

0.05

, +

+ p

<0

.01

сп

рям

о 2

час

; v

p<

0.05

, vv

p<

0.01

сп

рям

о 4

час

; &

p<

0.05

; &

& p

<0.

01 с

пр

ямо

72

час

; С

тат

ист

ичес

ка д

ост

овер

ност

м

ежд

у гр

упи

те:

а1

p<

0.05

, а 2

p<

0.0

1, а

3 р

<0.

001

спр

ямо

кон

трол

ата

(Гр

упа

А).

38

Трудно е при този in vivo модел да се посочи водещият механизъм за хематологич-ните отклонения, защото макар и да липсва локалната имунна протекция при интравенозното приложение на LPS, той задейства различни кръвни клетки и интрацелуларни сигнални пътища в тях (Szalowska et al., 2011; Vitiello et al., 2012), определящи хетерогенният характер на влиянието му в организма (Morrison and Ryan, 1987; Zuckerman et al., 1989). Според някои автори промените са резултат от действието на ендотоксина върху цитокините (Moya et al., 2007; Venkatesh, 2012). Други изследователи коментират, че нарушения хормонален баланс играе водеща роля (Perlstein et al., 1993; Beishuizen and Thijs, 2003).

Нашите изследвания показват, че промените в левкоцитите кореспондират с мощен възпалителен отговор, за който свидетелства регистрираното значително нарастване на съотношението неутрофили към лимфоцити, чийто стойности достигат до 3.80±0.646 на 4-я час (таблица 4). Това е в унисон с данните на Yang et al. (2013), Celikbilek et al. (2014), Farah and Khamisy-Farah (2014) и определя разглеждания показател като важен и надежден индикатор на възпалението. Наличието на значително количество млади форми на неутрофилите поставя въпроса за функционалната им ефективност, защото данните на Laarman et al. (2012) показват, че при пръчкоядрените неутрофили количеството на експресирани рецептори е по-малко от това при сегментоядрените неутрофили.

IV.3.1.3. Ефекти на LPS върху фагоцитозата

Фагоцитозата, осъществена от неутрофилите е ключов неспецифичен защитен механизъм, който LPS трайно супресира. Още на 1-я час от интравенозното му инжектиране, стойностите на фагоцитозата са ниски (р<0.001), както спрямо изходните, така и спрямо тези при група А (р<0.05) (таблица 4). До края на изследването – 72-я час те остават подчертано ниски. На този фон фагоцитното число при разглежданата група нараства статистически достоверно в периода 2-ри час (р<0.001 спрямо изходното ниво и спрямо контролата) – 24-ти час, както и на 72-я час (р<0.01 спрямо изходното ниво и спрямо контролата) (таблица 4), но този факт не е гаранция за висока ефективност на килинг механизмите на фагоцитите. Дефекти при осъществяване на фагоцитозата регистрират Donnelly and Barnes (2012). Известно е, че тази неспецифична защитна реакция зависи от действието на различни екстрацелуларни и интрацелуларни фактори, влияещи на фагоцитите (Kumar and Sharma, 2010; Mantovani, еt al., 2011). Например за фагоцитозата са необходими хемотаксични фактори, опсонини, клетъчни рецептори (Underhill and Ozynsky, 2002), както и енергиен ресурс (Okpala et al., 2015).

IV.3.1.4. Ефекти на LPS върху хуморалните фактори на естествения имунитет

Резултатите от изследването на хуморалните фактори на естествения имунитет при прасета, третирани интравенозно с LPS са представени в таблица 5. Данните показват, че при този експериментален модел концентрациите на лизозима нарастват достоверно спрямо контролите само на 1-я час, което кореспондира с изследванията на Zyczko and Zyczko (1998). Не са установени статистически значими отклонения в хемолитичната активност на комплемента, което е обяснимо като се изхожда от обстоятелството, че се отчита периода до 72-я час, което е време недостатъчно за активиране на класическия път на комплемента, задействането на който става от комплекса антиген-антитяло.

39

Таб

лиц

а 5

. П

ро

мен

и в

хум

ора

лни

те ф

акто

ри

на

есте

стве

ни

я и

мун

ите

т –

об

щ б

елтъ

к и

сер

умн

и п

роте

ин

и,

лизо

зим

(μ

g/m

L),

хе

мо

лити

чн

а ак

тивн

ост

на

ком

пле

мен

та

(CH

50),

п

ри

пра

сета

о

т гр

упа

А

(кон

тро

ла)

(n=

6),

гр

упа

В

(n=

6)

(тре

тира

ни

и

нтр

авен

озн

о с

10

μg/

kg

LP

S. Д

анн

ите

са

пре

дст

авен

и к

ато

m±

SE

M.

По

каза

тел

и

Гр

упи

0 ч

ас

1 ч

ас

2 ч

ас

4 ч

ас

24

час

4

8 ч

ас

72

час

Об

щ б

елтъ

к

(g/L

) А

73

.8±

3.0

5

В

64

.5±

2.9

9

65

.3±

3.5

0

73

.5±

4.1

6

73

.5±

4.7

8

71

.0±

2.4

6

67

.2±

1.4

0

68

.2±

2.1

4

Пр

оте

ин

огр

ама

Алб

уми

н

(g/L

) А

17

.8±

1.2

5

В

16

.7±

0.7

7

16

.4±

1.2

3

1

8.0

±1

.45

18

.4±

1.0

1

1

8.8

±0

.72

1

7.2

±1

.04

1

7.0

±1

.58

α1г

лоб

ули

ни

(g

/L)

А2

.9±

0.33

В

3

.3±

0.19

&

3

.5±

0.20

&

3

.4±

0.15

&

3

.8±

0.31

&

4

.2±

0.66

3

.2±

0.17

&

&

4.6

±0.

35

a 2

α2г

лоб

ули

ни

(g

/L)

А1

7.5

±0

.29

В

1

2.6

±1

.19

a 2

13

.0±

1.3

0

a 2

15

.4±

1.4

7

15

.0±

1.0

3

a 1

13

.4±

0.5

4

a 3

13

.8±

0.6

2

a 3

12

.6±

1.2

7 a 2

β

гл

обул

ин

и

(g/L

) А

15

.4±

0.9

8 В

1

2.3

±0

.41

a 1

1

2.0

±0

.63

a 1

1

4.3

±1

.00

1

3.4

±1

.61

14

.0±

0.4

1

13

.0±

0.8

9

1

2.8

±0

.97

γ гл

обул

ин

и

(g/L

)

А2

0.2

±1

.24

В

1

9.4

±1

.05

2

0.4

±1

.94

22

.4±

2.2

0

22

.7±

1.5

2

20

.6±

2.0

3

19

.9±

1.2

4

19

.6±

1.7

4

Л

изо

зим

(μ

g/m

L)

А0

.57

±0

.07

В

0

.77

±0

.15

0

.90

±0

.11

a

1 1

.01

±0

.53

0.7

7±

0.5

7

0

.60

±0

.47

0.5

0±

0.0

6

0.5

7±

0.0

7

Ком

пле

мен

т (C

H50

) А

25

.7±

2.1

0

В

25

.4±

2.8

3

23

.8±

2.2

0

22

.0±

3.0

0

2

2.6

±2

.30

21

.0±

1.3

0

2

0.5

±1

.75

2

2.4

±1

.80

Ст

ати

сти

ческ

а д

ост

ове

рно

ст в

ът

ре

в гр

упа

та

: *

p<

0.0

5,*

* p

<0

.01

, **

* p

<0

.00

1 сп

рям

о 0

h; #

p<

0.0

5,

##

p<

0.0

1 с

пря

мо

1ч

ас;

+

p<

0.0

5,

++

p

<0

.01

спря

мо

2

час

; v

p<

0.0

5,

vv

p<

0.0

1

спря

мо

4 ч

ас;

&

p<

0.0

5;

&&

p

<0

.01

сп

рям

о

72

час

; С

тат

ист

иче

ска

до

сто

вер

ност

меж

ду

груп

ит

е: а

1 p

<0

.05

, а 2

p<

0.0

1, а

3 р

<0

.001

сп

рям

о к

онтр

ола

та (

груп

а А

).

40

Промените в серумните протеини, характеризирани чрез протеинограмата показват увеличаване на α1-глобулините на 72-я час (p<0.01) при група В (таблица 5). Този факт индикира развитие на остър възпалителен процес, обусловен от действието на LPS и е доказателство за задействан от него острофазов отговор, защото в състава на тази електрофоретичната фракция влизат острофазови протеини (Petersen et al., 2004). От друга страна е регистрирано намаляване на β–глобулините, което може да е резултат от негативните ефекти на LPS и токсичното му действие върху черния дроб.

IV.3.1.5. Метаболитен отговор при прасета с експериментална ендотоксемия

Динамиката на промените в кръвната захар и чернодробните трансаминази са представени в таблица 6. Налице е бързо увеличаване концентрациите на кръвната захар в периода 1-ви – 4-ти час (p<0.001) спрямо група А, което според Beishuizen and

Thijs (2003), Hirasawa et al. (2009) ) може да е резултат от нарастване концентрациите на АКТХ и на кортизола при тези животни с висока чувствителност към LPS. Биологичният смисъл на тази промяна в кръвната захар е обезпечаване на организма с енергия за справяне с действащия антиген (Garcia et al., 2003; 2008). При нашия експериментален модел хипергликемията е бързо преходна, тъй като още на 24-я час, стойностите на глюкозата се понижават значимо. Това може да е резултат не само от усилено потребление на глюкоза, но и от нарушения в транспорта й или такива, свързани с черния дроб (Garcia et al., 2008), в качеството му на основен глюкостатичен орган (Shao et al., 2011; Nesseler et al., 2012). Това кореспондира с регистрираните от нас при животните от група В, промени в чернодродробните индикатори – ензимите ALAT, ASAT, както и в индекса на DeRitis, чийто стойности са над 1 при тази група. Liu et al. (2011) установяват, че при прасета, LPS увеличава концентрациите на ASAT, на кортизол, на TNF-α. Според Chen et al. (2013) LPS при този биологичен вид, предизвиква тежки нарушения в чернодробния метаболизъм.

Таблица 6. Промени в чернодробните индикатори – аланин аминотрансфераза (ALAT U/L), аспартат аминотрансфераза (ASAT U/L), съотношение ASAT/ ALAT, глюкоза (mmol/L) при прасета от група А (контрола) (n=6), група В (n=6) (третирани интравенозно с 10 μg/kg LPS). Данните са представени като m±SEM.

Показатели Групи 0 час 1 час 2 час 4 час 24 час 48 час 72 час

АLAT (U/L)

А 9.8± 0.60

В 8.4± 1.31

9.4± 2.43

11.9± 2.69

11.4± 2.63

6.50± 0.96a1

7.6± 0.70a1

4.0± 0.47а3

ASAT (U/L)

А 8.3± 1.46

В 5.9± 0.71

6.0± 1.88

11.5± 1.91

14.3± 2.35

7.0± 1.61

6.6± 1.75

3.6± 0.83а1

DeRitis А 0.88± 0.178

В 0.78± 0.198

0.82± 0.262

1.16± 0.276

2.62± 1.327

1.12± 0.180

0.83± 0.130

0.94± 0.117

Глюкоза (mmol/L)

А 4.23± 0.140

В 5.46± 0.540

7.02± 0.580 а3

6.13± 0.440 а2

5.82± 0.450 а2

4.31± 0.900

4.45± 1.120

3.53± 0.320

Статистическа достоверност между групите: а1 p<0.05, а2 p<0.01, а3 р<0.001 спрямо контролата (група А).

41

Ендотоксемията провокира статистически значими отклонения в есенциалните олигоелементи цинк и желязо (фиг. 24). Серумните концентрации на цинка още на 1-я час от ендотоксиновото въздействие нарастват (p<0.001) спрямо първоначалните (0-час), като се запазват високи, както на 2-я час (p<0.001), така и на 4-я час (p<0.001) и на 48-я час (p<0.05) (фиг. 24). При тази група животни, тенденция към нарастване показва и другия, изследван есенциален олигоелемент – желязото, чийто серумни концентрации на 24-я час превишават изходните статистически достоверно (p<0.05). Ефектите на цинка при прасета с акутна ендотоксемия коментират Krones et al. (2004; 2005), а Lichten et al. (2009), Wessels and Cousins (2015) установяват, че проинфламаторни стимули са отговорни за промени в минералния статус на организма.

##

+v

******

*** *##

++v

*

0

5

10

15

20

25

30

0 час 1 час 2 час 4 час 24 час 48 час 72 час

Zn Fe

Фиг. 24. Есенциални олигоелементи – цинк (Zn μmol/L), желязо (Fe μmol/L) при прасета (n=6), третирани интравенозно с 10 μg/kg LPS. Данните са представени като m±SEM. Статисти-ческа достоверност вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час; # p<0.05, ## p<0.01 спрямо 1 час; + p<0.05, ++ p<0.01 спрямо 2 час; v p<0.05, vv p<0.01 спрямо 4 час.

Разкритите нарушения в организма при ендотоксемия са основа не само за търсене на индикативни показатели и прогностични маркери за нея, но и за оценяване терапевтичните ефекти на различни противовъзпалителни медикаменти.

IV.3.2. Ефекти на интраперитонеално приложения липополизахарид и терапевтичното действие на индометацина и на циметидина

Нашият експериментален модел за проучване на нарушенията в естествените защитни механизми при прасета, обхваща продължителен период на наблюдение (1-ви, 3-ти, 5-ти, 10-ти и 15 ден) след интраперитонеално инжектиране на LPS в доза 0.3 mg/kg (група С).

IV.3.2.1. Клинични наблюдения

В първите 30–40 минути при прасетата от група С не се наблюдава промяна в общото им състояние. След този период двигателната активност на животните намалява. Те отказват да приемат храна и вода. Към 3-я час освен анорексията, адипсията и адинамията се появява повръщане, диария. Описаните нарушения, продължават между 3-я – 5-я ден, след което отзвучават. При изследваната група ректалната температура след пик, отбелязан още на 1-я ден (p<0.01 спрямо 0 час)

42

се понижава, но въпреки това на 3-я ден (p<0.001), на 5-я ден (p<0.01), на 10-я ден (p<0.01) стойностите са по-високи от изходните (фиг. 25).

**

**

***

***

***

**

38,4

38,6

38,8

39

39,2

39,4

39,6

39,8

40

40,2

40,4

0 час 1 ден 3 ден 5 ден 10 ден 15 ден

Група С Група D Група Е

Фиг. 25. Динамика на промените в ректалната температура при прасета от група С (n=12), третирани интраперитонеално с LPS, група D (n=12), третирани с LPS и индометацин; група E (n=6), третирани с LPS и циметидин. Данните са представени като m±SEM. Статистическа достоверност вътре в групата: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час.

IV.3.2.2. Промени в клетъчните елементи на естествения имунитет

Представените в таблица 7 данни, показват, че левкоцитите при прасетата от група С се понижават статистически значимо само на 1-я ден (p<0.001) след инжектирането на LPS, като броят им се възстановява, а на 10-я ден стойностите им даже превишават изходните. Промените в левкограмата при тази група се свеждат до увеличаване процента на пръчкоядрените неутрофили в периода 1-ви - 10-ти ден при намалено съдържание на сегментоядрени гранулоцити. Ядреното изместване наляво при прасетата от група С е за продължителен период от време. Възможно е променения цитокинов фон след инжектирането на LPS да има отношение към регистрираните отклонения в кръвните клетки. В подкрепа на това са данните на Bruewer et al. (2003), доказващи увеличена цитокинова продукция. Според други (Berkers et al., 2003) за отклоненията в левкограмата са отговорни медиаторите на възпалението - преформирани и новосинтезирани медиатори, освободени след LPS въздействие, които увеличават пермеабилитета на съдовете. Вероятно ефектите на ендотоксина са опосредствани от включването на различни категории ендогенни регулатори.

IV.3.2.3. Промени в хуморалните фактори на естествения имунитет

От хуморалните фактори на естествена резистентност (лизозим и комплемент) само комплементът реагира със статистически значими промени. Още на 1-я ден след аплициране на LPS, хемолитичната му активност при прасетата от група С се понижава, като на 3-я ден е регистриран минимум в размер на 19.78±2.57 хемолитични единици (p<0.01) при изходни 27.91 ± 2.20 хемолитични единици

43

Таб

лиц

а 7

. П

ром

ени

в к

летъ

чн

ите

фак

тор

и н

а ес

тест

вен

ия

им

уни

тет

при

пра

сета

от

груп

а А

(ко

нтр

ола

) (n

=6)

; гр

упа

С (

n=

12),

тре

тир

ани

и

нтр

апер

ито

неа

лно

с L

PS

; гр

упа

D (

n=

12),

тр

ети

ран

и с

LP

S и

ин

дом

етац

ин

, гр

упа

E (

n=

6),

трет

ир

ани

с L

PS

и ц

им

ети

ди

н (

m±

SE

M).

Пок

азат

ели

Гру

пи

0 ч

ас

1 д

ен

3 д

ен

5 д

ен

10

ден

1

5 д

ен

А

17

.2±

0.4

С

17

.1±

0.6

12

.2±

0.8

***

a 3

15

.1±

0.8

1

7.2

±0.

5

18

.2±

0.5

1

7.4

±0.

6

D

1

7.2

±0.

5 1

7.6

±0.

4c3

18

.7±

0.4c

3 1

8.2

±0.

3

18

.2±

0.2

1

9.0

±0.

4*

Лев

коц

ити

(1

.10

9 /L)

E

1

7.4

±0.

4 1

9.0

±0.

2**

c3

20

.2±

0.8

***c

3 1

6.6

±0.

6+vv

v 1

7.0

±0.

4vv

18

.4±

0.6

А

2.8

±0

.8

С

10

.6±

1.8

20

.0±

4.0

* 1

8.4

±1.

3**

1

7.8

±1.

8**

1

6.9

±1.

5*

15

.3±

1.8

D

9.8

±2

.9

19

.0±

1.8

* 1

9.8

±2.

2*

18

.3±

2.4

*

16

.0±

3.0

1

4.3

±2.

2

Пръ

чко

ядр

ени

н

еутр

оф

или

(%

)

E

4.3

±1

.0

10

.8±

2.0

* 1

0.8

±1.

6

* 3

.6±

0.6

+

v c

3 d

3 8

.6±

1.4

7

.6±

1.4

А

35

.3±

2.8

С

24

.5±

2.1

18

.1±

0.8

**a 3

1

8.2

±1.

0*

a 2

16

.3±

1.2

**a 3

2

0.2

±1.

4a2

21

.2±

1.3

D

25

.0±

5.0

24

.2±

2.1a

2 2

0.8

±2.

1a2

18

.4±

0.7a

3 2

4.0

±3.

0

26

.2±

1.9

Сег

мен

тояд

рен

и

неу

тро

фи

ли

(%)

Е

3

6.8

±5.

5 1

9.8

±3.

6 *

a 2

24

.2±

6.8

2

6.3

±2.

4

a 2 c

3 d

2 2

2.6

±4.

9

26

.8±

3.8

А

2.0

±0

.4

С

3.1

±0

.5

4.6

±0

.9

4.3

±0

.6

3.3

±0

.6

2.6

±0

.5

2.3

±0

.3

D

3.5

±1

.0

8.6

±2

.5

5.5

±1

.1

8.3

±2

.2

5.0

±1

.3

6.0

±1

.0

Ео

зин

офи

ли

(%)

Е

3.2

±1

.2

3.0

±1

.0

3.5

±1

.0

4.8

±1

.3

2.2

±0

.6

2.8

±0

.8

А

57

.9±

2.6

С

59

.3±

2.2

55

.3±

3.0

56

.0±

3.0

6

0.0

±1.

4

58

.0±

1.7

5

9.4

±1.

7

D

6

0.0

±5.

0 4

6.6

±1.

7*

51

.2±

2.3

5

2.0

±2.

0c1

53

.7±

2.8

5

1.2

±2.

7 Л

им

фоц

ити

(%

)

Е

54

.0±

5.4

65

.5±

5.6d

2 5

8.3

±7.

8

63

.2±

3.4d

2 6

5.6

±5.

2

60

.6±

3.6

А

2.0

±0

.6

С

2.5

±0

.5

2.0

±0

.6

3.1

±0

.6

2.6

±0

.4

2.3

±0

.5

1.8

±0

.4

D

1.7

±0

.4

1.5

±0

.6

2.7

±0

.5

3.0

±0

.4

1.3

±0

.6

2.3

±0

.8

Мо

ноц

ити

(%

)

Е

2.5

±1

.0

1.0

±0

.4

3.2

±0

.8

2.1

±0

.4

1.0

±0

.6

2.2

±0

.6

А

1.0

4±0

.108

С

0

.61±

0.0

58

0.7

2±0

.092

0

.58±

0.0

34

0.5

6±0

.044

0

.59±

0.0

46

0.5

6±0

.032

D

0

.64±

0.0

66

0.6

5±0

.034

0

.58±

0.0

34

0.5

6±0

.044

0

.59±

0.0

46

0.5

6±0

.032

N

/L

Е

0.8

4±0

.170

0

.52±

0.1

12

0.7

8±0

.288

0

.49±

0.0

72

0.5

2±0

.130

0

.60±

0.0

86

Ст

ати

стич

еска

до

стов

ерно

ст в

ът

ре в

гр

упа

та

: *

p<

0.05

, **

p<

0.0

1,

***

p<

0.0

01 с

пря

мо

0 ч

ас;

+ p

<0.

05,

++

p<

0.01

сп

рям

о 1

ден

; v

p<

0.05

, vv

p<

0.0

1, v

vv p

<0.

001

спря

мо

3 д

ен.

Ст

ати

стич

еска

до

стов

ерно

ст м

ежд

у гр

упит

е: а

1 p

<0.

05,

а 2 p

<0

.01,

а3

р<

0.0

01 с

пря

мо

кон

тро

лата

(A

), c

1 p

<0.

05,

c 2 p

<0

.01,

c3 р

<0.

001

сп

рям

о L

PS

ip

(C

); d

1 p

<0.

05

, d2

p<

0.0

1, d

3 р

<0.

001

сп

рям

о L

PS

+in

d (

D).

44

(таблица 8). Стойностите на показателя при разглежданата група до края на изследването са по-ниски от изходните.

Таблица 9. Клинично-лабораторни данни за киселинно-алкалното състояние и кръвно-газов профил при прасета от група С (n=12), третирани интраперитонеално с LPS. Данните са представени като m±SEM.

LPS 0 час 1 ден 3 ден 5 ден 10 ден 15 ден

pH 7.275±0.013

7.225±0.018 *

7.203±0.016 **

7.248±0.016

7.217±0.006 ***

7.202±0.008 ***

pCO2

(mmHg) 59.3±2.0

60.4±2.0

67.8±2.5 **

65.1±1.6

66.9±2.2

68.8±3.0 ***

PO2 (mmHg)

43.6±5.8 42.4±1.5

40.3±2.5

39.0±1.2 *

39.9±1.4

40.2±1.3

HCO3

(mmol/L) 27.0±0.4

23.7±0.7 ***

25.1±1.4 25.6±1.1 25.7±1.1

25.3±1.3

TCO2

(mmol/L) 43.6±5.8

42.4±1.5 40.3±2.5

39.0±1.2 *

39.8±1.4 40.2±1.3

ABE (mmol/L)

0.8±0.6

-2.9±0.8 **

-2.2±1.1 **

-0.1±1.0 -1.6±1.0 *

-2.2±1.2 **

SBE (mmol/L)

0.6±0.4

-3.2±1.1 **

-1.6±1.2 *

-0.2±0.9

-1.1±1.0

-1.4±1.0 *

SBC (mmol/L)

24.6±0.5

21.3±0.7 **

21.8±0.9 *

23.5±0.7 22.5±0.5 **

21.7±1.0 *

SAT (%)

62±2 54±3 42±3 ***

45±5 ***

47±2 ***

46±5 ***

Статистическа достоверност вътре в групата: * p<0.05,** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0 час.

Таблица 8. Промени в хуморалните фактори на естествения имунитет при прасета от група А (контрола) (n=6); група С (n=12), третирани интраперитонеално с LPS; група D (n=12), третирани с LPS и индометацин, група E (n=6), третирани с LPS и циметидин (m±SEM).

Групи 0 час 1 ден 3 ден 5 ден 10 ден 15 ден

А 0.57± 0.07

С 0.58± 0.11

1.06± 0.49

0.90± 0.12

2.11± 1.53

1.01± 0.53

0.60± 0.11

D 0.57±0.40 0.65±0.19 0.77±0.57 1.52±1.13 0.75±0.03 0.49± 0.04

Ли

зози

м

(μg/

mL

)

Е 0.54± 0.15

0.58± 0.14

0.95± 0.09

1.27± 0.92

0.60± 0.06

0.53± 0.07

А 25.3± 1.5

С 27.91± 2.20

23.48± 6.94

19.78± 2.57**

25.12± 6.18

23.97± 6.66

24.87± 0.42

D 25.98± 7.82

23.60± 2.30

26.30± 1.90

23.80± 2.20

26.20± 0.80

27.20± 1.00

Ко

мп

лем

ент

(CH

50)

Е 26.37± 2.67

27.29± 1.48

29.10± 1.82

25.96± 0.62

26.23± 0.60

25.08± 0.94

Статистическа достоверност вътре в групата: ** p<0.01, спрямо 0 час.

45

IV.3.2.4. Промени в киселинно-алкалното състояние и кръвно-газов профил

Резултатите от изследването на киселинно-алкалния метаболизъм по време на интраперитонеално въвеждане на LPS при прасета (група С) са изложени в таблица 9. Анализът на данните показва, че на 1-я ден от аплицирането на LPS, когато са налице неспецифични клинични признаци, са регистрирани промени в рН, изразяващи се в намаляване на стойностите му (p<0.05). Понижаването продължава на 3-я ден (p<0.01), на 10-я ден (p<0.001) и на 15-я ден (таблица 9). При тази група животни pCO2 се повишава статистически достоверно на 3-я ден (p<0.01), а най-високи са неговите стойности в края на изследването - 15-я ден (p<0.001). При HCO3

-, и SBC са налице статистически значими понижения, които за HCO3

- са отбелязани на 1-я ден (p<0.001), а за SBC освен на 1-я ден (p<0.01), те са проявени и на 3-я ден (p<0.05), 10-я ден (p<0.01) и 15-я ден (p<0.05). В газовия състав на кръвта също са регистрирани значими промени, свързани с намаляване pO2 на 5-я ден (p<0.05) и значително редуциране на SAT в периода 3-ти – 15-ти ден (p<0.001).

Изложените данни показват, че интраперитонеално приложения на прасета LPS (група С) задейства системен възпалителен отговор, характеризиращ се с промени в ректалната температура (фиг. 25), в кръвната картина (таблица 7), в метаболизма (таблица 9). Необходимостта от коригиране на интензитета на възпалението определи включването на експериментална група D, при която бе приложен индометацин и група Е, при която терапевтичният контрол бе осъществен чрез циметидин.

IV.3.2.5. Ефекти на индометацина при прасета, третирани интраперитонеално с LPS

Ефектите на индометацина по отношение индуцираните от LPS промени в клиничното състояние и хематологични отклонения показват, че прилагането му per os в дневна доза 0.75 g, четири последователни дни при прасетата премахва анорексията, адинамията, контролира ректалната температура (фиг. 25) и коригира нарушенията на количеството на левкоцитите (таблица 7). Този NSAIDS с доказани антипиретични и аналгетични свойства, реализира действието си главно чрез инхибиране на циклооксигеназата – ключов ензим за простагландиновата синтеза, макар че може да упражни супресиращото действие и върху фосфолипаза А, С (Basivireddy et al., 2002; Kim and Know-Wook, 2007). Индометацинът не може да промени очертаните от LPS тенденции при неутрофилите. Еозинофилите при животните от група D, през целия период на изследване имат стойности, превишаващи тези на групи А, С, Е (таблица 7). Данните на Kim et al. (2009) показват, че медикаментът редуцира синтеза на еозинофил-хемотаксичен фактор, което се отразява върху миграционните свойства на тези клетки и обяснява наблюдавания от нас ефект на индометацина при прасетата от група D. За разлика от това процентът на лимфоцитите е редуциран на 1-я ден спрямо изходното ниво (p<0.05) и на 5-я ден спрямо група С (p<0.05). Възможно е този СОХ инхибитор на простагландиновата синтеза чрез ефектите си върху продукцията на ROS да влияе върху тези клетъчни елементи. Известно е, че във високи дози, както и след продължителен орален прием индометацинът има токсично действие (Adedapo and Aiyelotain, 2001). Неселективният СОХ инхибитор не може да тушира напълно нарушенията в киселинно-алкалния статус, защото при неговото действие стойностите на

46

метаболитния показател (HCO3-) остават по-ниски от изходните, както на 1-я ден,

така и на 5-я ден (таблица 10).

IV.3.2.6. Ефекти на циметидина при прасета, третирани интраперитонеално с LPS

Интересът към циметидина е провокиран от възможностите му да контролира клетъчните медиатори на възпалението, имунния и метаболитен отговор, както и да бъде ефективен срещу ROS продукцията (Ching et al., 1993; Lapenna et al., 1994; Zangeneh et al., 2014).

При нашия експериментален модел, прасетата от група Е веднага след интраперитонеалното инжектиране на LPS получават per os циметидин в дневна доза 0.4 g. Третирането с Н2 рецепторния антагонист продължава пет последователни дни, като дозата кореспондира с посочената от Mozdarani et al. (2008) оптимална протективна доза на лекарствения продукт.

Анализирайки ефектите на циметидина устанавяваме, че той проявява терморегулаторни свойства, тъй като стойностите на ректалната температура при животните от група Е са по-ниски от тези на група С, а след 1-я ден наблюдаваната тенденция към понижаване на показателя е трайна (фиг. 25). Вероятно циметидинът влияе върху хематоенцефалитната бариера, както и върху ЦНС, чийто важен невротрансмитер е хистаминът. Изследванията на Patnaik et al. (2000) потвърждават, че блокирането на хистаминовите Н2 рецептори променя пермеабилитета на хематоенцефалитната бариера.

Таблица 10. Клинично-лабораторни данни за киселинно-алкалното състояние и кръвно-газов профил при прасета от група D (n=12), третирани интраперитонеално с LPS и индометацин. Данните са представени като m±SEM.

LPS+ind 0 час 1 ден 3 ден 5 ден 10 ден 15 ден

pH 7.287±0.012 7.269±0.028 7.274±0.024 7.273±0.023 7.274±0.021 7.278±0.025

pCO2

(mmHg) 58.3±4.0 54.4±4.0 58.8±1.9 55.1±3.0 64.0±1.4 59.0±3.0

PO2 (mmHg)

43.3±3.0 44.3±1.9 50.3±5.0 42.8±2.3 46.0±3.0 48.2±8.0

HCO3

(mmol/L) 26.8±0.4 23.6±1.1* 26.1±1.0 24.3±0.7** 28.4±1.4 26.2±1.0

TCO2

(mmol/L) 23.9±2.5 25.2±1.1 27.8±1.0 25.9±0.7 30.2±1.4 27.8±1.0

ABE (mmol/L)

0.7±0.9 -2.6±1.2 0.0±1.3 -2.1±0.8 1.3±1.6 0.0±1.0

SBE (mmol/L)

-0.1±0.8 -2.3±1.2 0.0±1.2 -1.6±0.8 2.0±1.5 0.1±1.0

SBC (mmol/L)

24.2±0.8 21.6±0.9* 23.3±1.1 22.0±0.6* 25.0±1.3 23.4±0.8

SAT 65±2 59±3 65±6 65±7 61±4 68±7

Статистическа достоверност вътре в групата: * p<0.05,** p<0.01 спрямо 0 час.

47

Използваната от нас схема на третиране (група Е) довежда до значими промени в количеството на левкоцитите, свързани с преодоляване ефектите на LPS (таблица 7). При този показател е налице статистически достоверно нарастване на 1-я ден (p< 0.01 спрямо 0 час; p<0.001 спрямо група С), на 3-я ден (p< 0.001 спрямо 0 час; p<0.001 спрямо група С). Промените в левкограмата при животните от група Е, демонстрират значително увеличаване процента на лимфоцитите, особено спрямо този на група D (p<0.01). Ефектите на циметидина върху лимфоцитите и техните субпопулации са обстойно коментирани в литературата (Kumar, 1990; Lin et al., 2004; Biswas et al., 2012). Циметидинът повишава хемолитичната активност на комплемента (таблица 8). Той коригира нарушенията на киселинно-алкалния статус, породени от LPS, защото при показателите му през целия период на изследване не са регистрирани достоверни отклонения, с изключение на pCO2, стойностите на който на 10-я ден (p<0.05) и на 15-я ден (p<0.01) са по-високи от изходните (таблица 11).

Чрез този експеримент е установено влиянието на начина на аплициране на LPS при биологичен вид, чувствителен на действието му, върху неспецифичния имунен и метаболитен отговор, както и е изяснена ефикасността на различни противо-възпалителни лекарствени продукти (индометацин и циметидин), приложени за контролиране негативното влияние на антигена при интраперитонеалното му инжектиране на прасета.

В клиничната практика Грам-отрицателните бактерии E. сoli и P. aeruginosa са елемент от резидентната микрофлора (Петров, 2009; Трошева, 2011), но те при нарушаване на физичните бариери и локалната имунна протекция могат да придобият

Таблица 11. Клинично-лабораторни данни за киселинно-алкалното състояние и кръвно-газов профил при прасета от група Е (n=6), третирани интраперитонеално с LPS и циметидин. Данните са представени като m±SEM.

LPS+cim 0 час 1 ден 3 ден 5 ден 10 ден 15 ден

pH 7.279±0.023

7.270±0.040

7.303±0.025

7.327±0.025

7.316±0.013

7.307±0.021

pCO2

(mmHg) 58.6±2.9 62.0±5.0 63.3±4.0 56.2±1.5 60.1±0.6* 64.2±1.7**

PO2 (mmHg)

50.6±2.5

41.2±3.0

54.2±8.0

44.2±3.0 40.5±1.5

41.7±0.8

HCO3

(mmol/L) 25.9±0.9

25.6±1.2

29.6±1.6 28.3±1.5 29.3±1.1

30.5±0.9

TCO2

(mmol/L) 27.6±0.9

26.5±1.2 31.3±1.6

29.9±1.5 30.9±1.1 32.3±0.9

ABE (mmol/L)

0.0±1.1

-1.7±1.5

2.9±1.6 2.3±1.8 3.0±1.1

3.7±1.1

SBE (mmol/L)

0.0±1.0

-1.1±1.4 3.6±1.6 2.8±1.7

3.5±1.1

4.5±1.1

SBC (mmol/L)

23.2±1.0

22.2±1.3 26.5±1.3

26.0±1.7 26.3±1.0 27.0±1.0

SAT (%) 65±2 56±5 69±8 68±8 55±3 58±2

Статистическа достоверност вътре в групата: * p<0.05,** p<0.01 спрямо 0 час.

48

патогенни свойства и да атакуват организма чрез богат набор от вирулентни фактори, осигуряващи им адхезия, колонизация и инвазия. Разкриването на сложните взаимоотношения между опортюнистичните патогени и защитните механизми на гостоприемника би позволило да се отдиференцират ключовите нарушения в имун-ната хомеостаза, което е необходимата база за разработване на аргументирани стратегически програми и тактически решения за контрол на инфекциозния процес.

IV.4. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН МОДЕЛ НА P. AERUGINOSA ИНФЕКЦИЯ НА КОЖАТА И МЕКИТЕ ТЪКАНИ ПРИ КУЧЕТА ЗА ПРОУЧВАНЕ НА ИНФЕК-ЦИОЗНИЯ ПРОЦЕС, ПОВЕДЕНИЕТО НА ЕСТЕСТВЕНИТЕ ЗАЩИТНИ МЕХАНИЗМИ И ОЦЕНЯВАНЕ ЕФЕКТИТЕ НА КОНВЕНЦИОНАЛНАТА, АЛТЕРНАТИВНАТА И КОМПЛЕМЕНТАРНА ТЕРАПИИ

За изясняване закономерностите на възникването, развитието и изхода от инфекциозния процес, предизвикан от Грам-отрицателни опортюнистични патогени е необходим in vivo експериментален модел, защото данните при in vitro моделите не винаги корелират с тези от клиничните случаи (Giamarellos-Bourboulis et al., 2003; 2004; 2005; Toufekoula et al., 2013). Затова в дисертационния труд е разработен in vivo модел на кожна P. aeruginosa инфекция при кучета, чрез който може да се получи точна информация за динамиката на развиващия се инфекциозен процес, както в най-ранните му етапи - 4-ти час – 72-ри час, така и в по-късните – 7-ми ден – 14-ти ден. Моделът, стандартизирайки част от условията, влияещи на инфекциозния процес - количество на бактериите (1х108CFU/mL), място на инокулирането им (субкутанно - в областта на врата), пол на животните (всички кучета са мъжки), хранителен (стандартизирана гранулирана храна), температурен и светлинен режим (постигнати чрез отглеждането на животните във вивариум), циркадни ритми (кръвните проби се получават винаги сутрин 800–830 часа) дава възможност да се отдиференцират водещите патогенетични звена.

IV.4.1. Клинични наблюдения

При кучетата, на които субкутанно е инжектирана бактериална суспензия от P. aeruginosa още на 4-я час в мястото на инокулиране, кожата е с инфилтративен едем, като проявите на възпаление са добре изразени и на 24-я час. В началото локалните промени са придружени с неспецифични признаци - намален апетит и двигателна активност, както и фебрилитет. Ректалната температура при инфектираните кучета (0 група) достига максимални стойности на 24-я час, след което тя остава висока и в периода 48-ми час – 72-ри час (фиг. 26).

Фебрилитетът, с който протича кожната P. aeruginosa инфекция е резултат от активиране на клетъчните елементи на кожата, в резултат на което се освобождават ендогенни пирогени. Кератиноцитите, съставляващи 95% от клетъчния състав на епидермиса при активирането си синтезират голям брой проинфламаторни цитокини – TNF-α, IL-1, IL-6, участващи в механизма на треската (McGrath et al., 2004; Iozzo, 2005).

49

*

**

a2

***a3

**

a3

**

**

a1

**

b1

***

a2

a1

***

a3c1***a3**

a3

a1

*

a2

c1

*

a1

37

37.5

38

38.5

39

39.5

40

40.5

41

0 час 4 час 24 час 48 час 72 час 7 ден 10 ден 14 ден

контроли 0 група I група II група III група

Фиг. 26. Промени в ректалната температура (0C) при здрави кучета (контроли, група С), кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група). Статистическа достоверност вътре в групите: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0-я час. Статистическа достоверност между групите: а1 (p<0.05), а2 (p<0.01), а3 (p<0.001) спрямо контролата; b1 (p<0.05) спрямо 0 група; с1 (p<0.05) спрямо I група.

IV.4.2. Резултати от изследване на прокалцитонина като маркер за P. aeruginosa инфекция

Нашите изследвания показват, че серумните концентрации на PCT при инфектираните, но нетретирани животни (0 група) се увеличават прогресивно от 24-я час до 7-я ден (фиг. 27), което налага извода, че PCT може да бъде използван като биомаркер на кожна P. aeruginosa инфекция при кучета. На този фон стойностите на разглеждания показател при инфектираните, но третирани животни от групи I, II и III са ниски, което показва, че PCT е чувствителен на приложеното въздействие – при I група антибиотик; при II група фитопродукт и при III група комплементарна терапия и следователно може да бъде използван като индикатор за ефективността на терапевтичните подходи за контрол на инфекциозния процес. Gilbert (2010) счита, че концентрациите на PCT могат да подпомогнат тълкуването на резултатите преди да са получени данните от микробиологичното изследване. Prkno et al. (2013) разглеждат PCT като биомаркер, индикиращ развитието на бактериална инфекция, тъй като при нея стойностите му са високи, докато при пациенти без инфекция или при такива с вирусна инфекция те са ниски. Koivula et al. (2011), Brodska et al. (2014), Leli et al. (2015) коментират факта, че концентрациите на PCT са достоверно по-високи при кръвни инфекции с Грам-отрицателни бактерии от тези с Грам-положителни бактерии и гъби.

50

a3

a3

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

4h 24h 48h 72h 7d

pg/mLконтролна група 0 група I група II група III група

b1b1

a2

a3a3

a2 a2

a2

Фиг. 27. Промени в серумните концентрации на прокалцитонина (РСТ) при здрави кучета (Група С, контроли), при кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и при инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група). Статистическа достоверност между групите: а1 (p<0.05), а2 (p<0.01), а3 (p<0.001) спрямо контролната група; b1 (p<0.05) спрямо 0 група.

Тестването на PCT като маркер за инфекция, провокирана от P. aeruginosa инфекция е важно за клиничната практика, която се нуждае от бързи, достъпни и евтини тестове, данните от които да корелират с резултатите от стандартните микробиологични методи за детекция на бактериите. Научно-приложният аспект на този показател произтича от факта, че в практиката инфекциите обикновено са от смесен тип, тъй като Грам-отрицателните бактерии са асоциирани с други бактерии, вируси и гъби. Изясняването на инфекциозната етиология обаче и по-точно отдиференцирането на бактериалните от вирусните и гъбични инфекции е ключов момент при избора на адекватна терапия.

IV.4.3 Ефекти на инфекцията и на приложените терапевтични схеми върху инфламаторните биомаркери

Осъществените клинични наблюдения показват, че в мястото на инжектиране на P. aeruginosa се развива възпаление. Оценяването силата на възпалителния отговор, иницииран от опортюнистичния патоген е важно, защото развиващото се с прекомерна интензивност възпаление нарушава основни контролни механизми, губи характера си на жизненопротективен неспецифичен защитен механизъм и провокира тежки разстройства в организма. Оценката трябва да бъде базирана на точна информация, която може да бъде получена от важни инфламаторни биомаркери.

51

NF-kB

*

a2

d2

e2

a2

d2

e1

a3

d2

e1

a2

d2

e2a3

d2

e3

a2

d1

a3

d2

e2

*

a1

d1

e1

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

4h 24h 48h 72h 7d 10d

ng/m

L

контролна група група 0 група I група II група III

Фиг. 28. Промени в серумните концентрации на нуклеарния фактор капа-бета (NF-kB) при здрави кучета (Група С, контроли), при кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и при инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група). Статистическа достоверност вътре в групите:* p<0.05 спрямо 4-я час. Статистическа достоверност между групите: а1 (p<0.05), а2 (p<0.01), а3

(p<0.001) спрямо контролната група; d1 (p<0.05), d2 (p<0.01) спрямо II група; e1 (p<0.05), e2

(p<0.01) спрямо III група.

Получените данни демонстрират, че ключовият регулатор на възпалението – NF-kβ, при инфектираните кучета (0 група) (фиг. 28) още на 24-я час рязко увеличава серумните си концентрации, които при тези животни нарастват 2-3 пъти над контролите. Можем да приемем, че регистрираното увеличение на NF-κB го прави индикативен показател при in vivo изследвания на бактериални P. aeruginosa кожни инфекции при кучета. Още повече, че стойностите на NF-κB при животните от 0 група остават високи до 10-я ден. Tak and Firestein (2001), Barton (2008), Cinel and Opal (2009), Tilstra et al. (2011) подчертават ключовата позиция на NF-kB в механизма на възпалението. Koprowska and Czyz (2010) разглеждат възможността за блокиране на NF-κB чрез партенолид – активен компонент от растителния препарат feverfew. Анализирайки представените данни и като изхождаме от обстоятелството, че ранния период на инфекцията е ключов за коригиране на предизвиканите от патогена нарушения ние прилагаме стандартизирания растителен продукт feverfew още на 4-я час от заразяването, за да упражним ефикасен контрол върху силата на възпалителния отговор. Доказателство за постигнатия успех при контролиране NF-κB чрез партенолид (0.7%) – активен компонент на feverfew, приеман 6 последователни дни при инфектираните кучета от група II и III е липсата на статистически достоверни отклонения на този показател при тях (фиг. 28). При експерименталните животни от III група за управление на инфекциозния процес е приложена комплементарна терапия. Чрез нея едновременно се влияе на самия патоген (с антибиотик) и се отстраняват предизвиканите от него нарушения в защитния потенциал на организма (с фитопродукта).

52

Таблица 12. Промени в серумните концентрации на азотния оксид (NО) при здрави кучета (Група С, контроли), при кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и при инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група). Данните са представени като mean±SD, като броят на животните във всяка група е 5.

Контроли 0 група I група II група III група

0 час 66.6±2.7 64.4±10.9 56.9±7.8 64.8±4.8 64.4±5.0 4 час 65.4±2.3 71.2±14.8 92.2±0.5 95.8±8.8 110.8±41.0 *** * a1b1 24 час 65.4±4.8 69.8±9.7 58.4±20.4 70.2±20.1 88.4±21.4 +++

48 час 64.8±4.7 70.6±8.1 62.5±9.0 68.0±5.2 72.5±21.4 ++

72 час 66.3±3.9 70.5±15.0 59.8±10.6 81.8±9.2 84.7±41.9 +++

7 ден 64.9±5.0 101.4±46.2 76.9±10.4 55.0±5.5 77.4±13.6 ++b1 10 ден 62.8±4.0 81.9±6.9 66.5±15.7 85.4±7.8 85.6±21.1 +++ 14 ден 63.9±4.6 73.6±14.5 87.9±4.8 109.9±29.8 85.3±20.2 ***§§vv ***§§vv••• a2b1 a2b1

Статистическа достоверност вътре в групите:* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0-я час; ++ р<0.01, +++ р<0.001 спрямо 4-я час; §§ р <0.01 спрямо 24-я час; vv р<0.01 спрямо 48-я час; ••• р<0.001 спрямо 7-я ден. Статистическа достоверност между групите: а1 (p<0.05), а2

(p<0.01), а3 (p<0.001) спрямо контролната група; b1 (p<0.05) спрямо 0 група.

При нашия експериментален модел установяваме, че серумните концентрации на NO нарастват твърде рано – още на 4-я час от инфектирането на животните с Р. aeruginosa (таблица 12). Това кореспондира с регистрираните в този период прояви на кожно възпаление. Логично е да се предположи, че NO участва в механизма на артериалната хиперемия с вазодилататорния си ефект (Cirino et al., 2006; Dudzinski et al., 2006; Tripathi et al., 2007) и така променяйки хемодинамиката, подобрява снабдяването на тъканите с кислород и хранителни вещества. Той е разглеждан като биомаркер на възпалението (Pereira et al., 2006; Ghasemi et al., 2011), не само защото може да контролира съдовия тонус, но и поради факта, че регулира освобождаването на медиатори от мастоцитите. Доказано е, че всички клетъчни елементи на кожата могат да синтезират NO. Представените в таблица 12 данни показват двуфазово увеличаване на серумните концентрации на NO, както в ранния етап – 4-я час от изследването, така и в по-късния (7-ми ден – 14-ти ден). При инфектираните но нетретирани кучета (0 група), стойностите на NO на 7-я ден от инфекцията достигат до 101.4±46.2 μmol/L при изходни – 64.4±10.9 μmol/L, докато при кучетата от I и II групи вторият пик в размер на 87.9±4.8 μmol/L (за I група) и 109.9±29.8 μmol/L (за II група) е регистриран на 14-я ден. Тези данни могат да се разглеждат като доказателство за участието на NO не само в неспецифичните, но и в специфичните защитни механизми. Bogdan (2000), Tripathi et al. (2007), анализирайки ролята на NO в адаптивния имунитет обсъждат възможността той да повлиява съотношението Th1/Th2.

53

Ghasemi and Zahediasl (2011) привеждат доказателства за действието на NO като регулатор на енергийния метаболизъм, откъдето произтича ключовата му позиция, свързана със защитните механизми на организма.

Таблица 13. Промени в съотношението неутрофили/лимфоцити (N/L ratio) при здрави кучета (контроли), при кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и при инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група). Данните са представени като Mean±SD, като броят на животните във всяка група е 5. Контроли 0 група I група II група III група

0 час 2.04±0.34 2.53±1.32 2.63±0.43 2.67±1.65 1.72±0.91 4 час 2.59±0.18 3.38±1.35 5.19±1.80 5.26±1.04 5.03±2.52 24 час 2.53±0.72 3.88±2.81 7.90±1.98 11.44±5.66 5.28±2.63 ** ** a2b1

48 час 1.92±0.21 5.21±3.84 6.30±2.72 7.17±2.68 4.72±2.56

72 час 2.36±0.30 5.08±2.64 6.23±2.88 5.76±4.09 3.51±1.35

7 ден 2.66±0.94 3.46±1.70 4.05±1.70 4.34±2.77 2.14 ± 1.34 § 10 ден 2.33±0.17 2.85±1.23 2.88±0.90 2.64±0.58 2.70±1.53 §§ 14 ден 2.58±0.46 1.88±0.76 1.78±0.62 3.10±1.11 2.78± 2.49 §§§v §§

Статистическа достоверност вътре в групите:* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0-я час; § p<0.05, §§ р<0.01, §§§ p<0.001 спрямо 24 час; v р<0.05 спрямо 48-я час. Статистическа достоверност между групите: а2 (p<0.01) спрямо контролната група; b1 (p<0.05) спрямо 0 група.

В настоящото проучване проследяваме промените и в друг индикативен показател на възпалението – съотношението неутрофили към лимфоцити (таблица 13). Установяваме значително нарастване на съотношението N/L при І и ІI група в периода 24-ти час – 7-ми ден, когато то е по-високо не само спрямо контролите, но и спрямо базисните нива (таблица 13). При инфектираните, но нетретирани животни - 0 група увеличаването на показателя е по-слабо изразено. Вероятно продуцираните от P. aeruginosa вирулентни фактори компрометират неутрофилната хомеостаза като нарушават трансмиграцията, метаболизма на тези клетъчни елементи и им пречат да реализират ефекторните си функции (Jesaitis et al., 2003; Somprasong et al., 2012). По принцип увеличеният пермеабилитет на съдовете при възпаление позволява излизането на плазмени белтъци, улеснява емиграцията на кръвни клетки (неутрофили, лимфоцити). Затова Farah and Khamisy-Farah (2014) разглеждат N/L ratio като маркер на възпалението.

54

При експерименталния модел на кожна P. aeruginosa инфекция серумните концентрации на свободната сиалова киселина при всички опитни групи на 72-я час достигат най-високите си нива, които са статистически значими, както спрямо изходните, така и спрямо контролите (фиг. 29). Трудно е да се прецизира точният механизъм, обуславящ регистрираното нарастване на серумните концентрации на свободната сиалова киселина. Може да се предположи, че е резултат от интензивен клетъчен метаболизъм, от тъканна пролиферация или пък от увреждане на клетъчните мембрани, тъканна деструкция, при което сиаловата киселина преминава в кръвната циркулация. Основание за това ни дава фактът, че сиаловата киселина е регулаторен трансмембранен протеин, експресиран върху различни левкоцитни субпопулации, участващи в механизма на възпалението.

***

a1

*

a2

**

a3

d1

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5



Фиг. 29. Динамика на промените в серумните концентрации на свободната сиалова киселина (mmol/L) при здрави кучета (Група С, контроли), при кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и при инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група). Статистическа достоверност вътре в групите:* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0-я час; Статистическа достоверност между групите: а1 (p<0.05), а2 (p<0.01), а3 (p<0.001) спрямо контролната група; d1 (p<0.05) спрямо II група.

Фактът, че сиаловата киселина е локализирана в края на веригата на много от острофазовите протеини дава основание на редица изследователи (Mohebbi et al., 2010; Khoshvaghti et al., 2012; Nazifi et al., 2012) да я разглеждат като маркер на острофазовия отговор.

IV.4.4. Ефекти на инфекцията и на приложените терапевтични схеми върху острофазов отговор

Представените в таблици 14 и 15 данни за острофазовите протеини при експерименталните животни индикират настъпването на значими промени, засягащи количествата, както на позитивните (таблица 14), така и на негативните острофазови протеини (таблица 15).

55

Таб

лиц

а 1

4.

Поз

ити

вни

ост

роф

азо

ви п

роте

ин

и п

ри з

др

ави

куч

ета

(Гр

упа

С -

кон

тро

ли),

при

куч

ета

ин

фек

тир

ани

с P

. a

erug

ino

sa

(0 г

руп

а) и

при

ин

фек

тира

ни

и т

рет

ира

ни

с:

енро

фло

ксац

ин

(І

груп

а),

feve

rfew

(ІІ

гр

упа)

и f

ever

few

+ен

роф

локс

аци

н (

ІІІ

груп

а).

Дан

ни

те с

а п

ред

став

ени

кат

о M

ean

±S

D,

като

бр

оят

на

жи

вотн

ите

въ

в вс

яка

груп

а е

5.

0

час

4

час

2

4 ч

ас

48

час

7

2 ч

ас

7 д

ен

10

ден

1

4 д

ен

Фиб

ри

ноге

н (g

/L)

Ко

нтр

. 1

.5±

0.2

0

1.6

±0

.47

1

.6±

0.3

7

1.7

±0

.50

1

.7±

0.4

4

1.6

±0

.28

1

.6±

0.4

0

1.6

±0

.35

0 г

руп

а 2

.0±

0.5

5

4.4

±0

.66

а3

5.6

±1

.57

** а

3

6.2

±1

.32

***а

3

5.7

±1

.98

***а

3

4.0

±1

.68

а2

3.6

.0±

1.56

а2

3

.1±

1.2

2

а

2

I гр

упа

1.4

±0

.08

1

.9±

0.8

6

b3

3.3

±1

.16

**b

1

4.9

±1

.36

***a

1

4.2

±0

.44

***a

1b1

1.7

±0

.07

b2

1.3

±0

.07

b3

1.3

±0

.07

b3

II

гр

упа

1

.3±

0.1

9

1.7

±0

.82

b

3

3.3

±0

.76

b

1

4.6

±2

.26

**

*a1

4

.4±

0.8

4

***a

2b1

2

.8±

0.5

4

2

.5±

0.17

1

.4±

0.4

4

b2

IIII

I г р

упа

1.7

±0

.58

2

.4±

0.6

8

b2

3.7

±1

.04

**a1

4.2

±1

.36

**

*

3.5

±0

.84

b

2

1.5

±0

.10

b3

1

.3±

0.18

b3

1

.4±

0.18

b

2

Гло

бул

ини

(g

/L)

Ко

нтр

. 3

4.7

±1

.0

35

.5±

1.0

3

5.6

±1

.0

35.

4±

0.9

3

4.6

±1

.0

35

.0±

0.9

3

4.0

±0

.8

33

.4±

1.6

0 г

руп

а 3

4.0

±0

.4

34

.0±

1.4

4

3.6

±2

.3

***

45.

0±

0.6

***

43

.4±

1.2

***

36

.9±

3.4

3

5.2

±1.

8

35

.1±

1.7

I гр

упа

36.

1±

2.3

3

8.6

±3.

0

37

.8±

2.4

42.

9±

5.6

*

44

.0±

2.5

**

45

.7±

2.8

***

35.

2±

2.2

35

.8±

1.6

II г

руп

а 2

7.5

±4

.1

40

.4±

12

* 3

0.0

±5

.3

3

1.6

±4

.2

30

.7±

4.0

27

.2±

5.3

1

8.0

±5

.9

14

.2±

1.2

III

груп

а 3

4.6

±0

.6

35

.4±

2.6

3

5.4

±1

.4

35.

4±

1.2

3

6.5

±1

.8

36

.0±

1.2

3

6.6

±2

.2

35

.8±

0.6

С

тат

ист

ичес

ка д

ост

овер

ност

въ

тре

в г

руп

ит

е:*

p<

0.05

, **

p<

0.0

1,

***

p<

0.0

01

сп

рям

о 0

-я ч

ас.

Ст

атис

ти

ческ

а д

ост

овер

ност

м

ежд

у гр

упи

те:

а1

(p<

0.0

5),

а2

(p<

0.01

), а

3 (p

<0.

00

1) с

пря

мо

кон

тро

лата

; b

1 (p

<0.

05

), b

2 (p

<0

.01)

, b

3 (p

<0

.001

) сп

рям

о 0

гр

упа;

с1

(p<

0.05

),

с 2 (

p<

0.0

1),

с3

(p<

0.0

01)

спря

мо

I гр

упа;

d1

(p<

0.0

5),

d2 (p

<0

.01)

, d3 (p

<0.

001

) сп

рям

о II

гру

па.

56

Резултатите показват, че количествата на фибриногена при инфектираните животни, нарастват 2-3 пъти в периода 24-ти – 72-ри час спрямо неинфектираните (таблица 14), което кореспондира с данните на автори, използвали не Грам-отрицателни бактерии, а Грам-положителни бактерии (S. aureus) (Georgieva et al., 2013; Zapryanova et al., 2013). Данните показват, че фибриногенът е индикативен показател за кожна P. аeruginosa инфекция при кучета, а фактът, че методът за определянето му е лесен за изпълнение и евтин му дават безспорни предимства за клинично приложение при този биологичен вид. Hanington and Zhang (2011) коментират ролята на фибриногена като свързващ протеин при защитата на гръбначните животни, човека и разглеждат участието му в естествената защита чрез активиране на TLR. Опитите ни чрез feverfew да коригираме, предизвиканите от P. аeruginosa нарушения в защитните механизми показват, че приложеният растителен препарат не променя динамиката, но повлиява стойностите на този умерено-позитивен острофазов протеин (ІI група) (таблица 14). Отношение към регистрирания факт може да има инхибиторният ефект на feverfew върху тромбоцитната агрегация (George et al., 2012). Промени в този показател настъпват и при кучетата с антибиотична терапия (І група), както и при тези, на които антибиотичната терапия е съчетана с прием на фитопродукта (ІII група), тъй като и при тях концентрациите на фибриногена също са увеличени в периода 24-ти - 72-ри час (таблица 14). Това показва, че този умерено позитивен острофазов протеин може да бъде използван при кучетата и като неспецифичен маркер за инфекция, както и да служи за оценяване на терапевтичния ефект от приложено лечение с кожна P. aeruginosa инфекция.

Глобулините, чийто фракции включват значителна част от острофазовите протеини реагират с нарастване, което при животните от 0 група е добре подчертано в периода 24-ти – 72-ри час, когато отклоненията са статистически достоверни спрямо изходните (p<0.001) (таблица 14). Прилагането при инфектираните кучета от І група на енрофлоксацин, довежда до нарастване на глобулиновото съдържание при стартиране на антибиотичната терапия – 48-я час (p<0.05 спрямо 0-я час), задържането му високо на 72-я час (p<0.01 спрямо 0-я час), на 7-я ден (p<0.001), след което в резултат на последвалато понижение в края на изследвания период нивата са близки до изходните. За разлика от това, при комбиниране на антибиотика с фитопрепарата (ІІІ група) няма статистически значими отклонения, а самостоятелно приложения feverfew при ІІ група предизвиква бързо, ранно – още на 4-я час и краткотрайно, но достоверно нарастване на стойностите на показателя (p<0.05).

На фона на увеличената продукция на позитивни APPs серумните концентрации на албумина при инфектираните кучета (0 група) се понижават (таблица 15). Понижаването на този негативен APPs е ясно проявено в първите дни от антибиотичната терапия – 48-ми час – 7-ми ден (І група). Резултатът доказва, че серумните концентрации на албумина се повлияват не само от P. aeruginosa, но и от самия антибиотик (Taceetti et al. 2008). Данните на Tras et al. (2001) показват, че енрофлоксацинът при кучета променя концентрациите на общия белтък и албумина. Отношение към това, вероятно има факта, че in vivo антибиотикът метаболизира в черния дроб чрез фамилията на цитохром P450 (Taceetti et al., 2008). Ефектът на енрофлоксацина спрямо албумина е коригиран при комбинирането на антибиотика с партенолид (ІII група). Най-вероятно този резултат се дължи на доказаните хепато-протективни свойства на фитопрепарата (George et al. 2012), но може да се предполага

57

Таб

лиц

а 1

5.

Нег

ати

вни

ост

ро

фаз

ови

про

теи

ни

и A

/G с

ъо

тно

шен

ие

при

зд

рав

и к

учет

а (Г

руп

а С

- к

онтр

оли

), п

ри к

учет

а и

нф

екти

ран

и с

P.

aer

ugin

osa

(0

гр

упа)

и п

ри и

нф

екти

ран

и и

тр

ети

ран

и с

: ен

роф

локс

аци

н (

І гр

упа)

, fe

verf

ew (

ІІ г

руп

а) и

fev

erfe

w+

енро

фло

ксац

ин

(ІІ

І гр

упа)

. Д

анн

ите

са

пр

едст

авен

и к

ато

Mea

n±

SD

, ка

то б

роя

т н

а ж

иво

тни

те в

ъв

всяк

а гр

упа

е 5.

0

час

4

час

2

4 ч

ас

48

час

7

2 ч

ас

7 д

ен

10

ден

1

4 д

ен

Алб

уми

н (g

/L)

Ко

нтр

. 3

6.2

±0

.6

35

.6±

0.6

3

6.1

±0

.4

36

.6±

0.6

3

6.6

±0

.9

35

.4±

0.8

3

6.7

±0

.6

36

.9±

0.6

0 г

руп

а 3

7.0

±0

.8

36

.4±

3.2

2

7.4

±1.

9

***a

2

26

.2±

1.8

***

28

.2±

1.8

***a

2

34

.5±

4.0

3

6.5

±0

.9

36

.2±

0.8

I гр

упа

34

.9±

1.8

3

1.8

±3

.4

31

.5±

2.8

b2

26

.4±

7.2

*

26

.5±

3.6

*a3

24

.1±

4.5

***a

3b2

35

.8±

1.7

34

.8±

3.1

II г

руп

а 4

1.6

±0

.9

46

.0±

24

a3b

3c3

4

2.2

±6

.4

b3

c3

51

.2±

14

a1b

3c3

4

2.6

±3

.8

a1b3

c3

46

.0±

5.2

a2

b3

c3

35

.4±

7.9

2

9.0

±1

.5

a3b3

c3

III

груп

а 3

5.4

±1

.0

35

.3±

2.6

3

6.0

±1

.4

35

.6±

1.2

3

4.1

±2

.6b1

c2

34

.8±

1.1

c2

34

.4±

4.1

3

5.2

±1

.8

Ар

иле

стер

аза

(U

/L)

Ко

нтр

. 6

2.2

±6.

5

62

.3±

7.2

6

1.8

±10

5

8.6

±20

5

5.7

±6.

2

61

.0±

16

61

.6.6

±5

.9

60

.3±

4.9

0

гр

упа

61

.6±

2.7

5

3.9

±6.

2

64

.1±

8.4

6

4.4

±9.

5

55

.7±

17.

65

.4±

3.2

6

8.6

±4.

8

60

.4±

1.5

I гр

упа

55

.4±

11

53

.9±

21

74

.2±

22

75

.6±

22

51

.9±

12

65

.8±

30

58

.1±

19

52

.4±

22.2

II г

руп

а 6

1.2

±1.

6

52

.3±

7.1

6

8.2

±10

5

6.7

±8.

9

73

.2±

10

53

.8±

16

49

.7±

19

36

.2±

8.2

* II

I гр

упа

62

.6±

4.2

5

8.2

±30

7

6.8

±19

5

9.2

±18

4

7.9

±20

6

6.2

±37

4

8.8

±23

5

2.6

±36

.0

Алб

уми

н гл

об

ули

ново

съ

от

нош

ение

(А

/G)

Ко

нтр

. 0

.86±

0.4

1

.00±

0.1

1

.02±

0.0

1

.02±

0.0

1

.05±

0.0

1

.01±

0.0

1

.10±

0.1

1

.06±

0.0

0 г

руп

а 1

.08±

0.0

1

.07±

0.1

0

.63±

0.1

***

a3

0.5

8±

0.0

***

a3

0.6

5±

0.1

***

a3

0.9

4±

0.2

1.0

4±

0.1

1

.04

±0

.1

I гр

упа

0.9

7±

0.1

0

.83

±0

.2

0.8

4±

0.1

0

.64

±0

.2

**

0.6

0±

0.1

1

***

0.5

3±

0.1

***a

3

1.0

2±

0.1

0.9

7±

0.1

II г

руп

а

1.5

4±

0.2

1

.76

±0

.2

1.4

2±

0.1

1.6

1±

0.3

a3

b3

1

.40

±0

.22

1.8

0±

0.7

a2

b3

c3

2.0

1±

0.3

2

*a3b

3c3

d3

2

.06

±0

.24

**

a3b

3c3

d3

III

груп

а 1

.02

±0

.1

1.0

0±

0.1

1

.02

±0

.0

1.0

0±

0.1

d3

0.9

4±

0.1

0

.96

±0

.0c2

d3

0

.94

±0

.14

0

.98

±0.

6

Ст

ати

стич

еска

до

стов

ерно

ст в

ът

ре в

гру

пит

е:*

p<

0.0

5, *

* p

<0.

01,

***

p<

0.0

01

сп

рям

о 0-

я ч

ас.

Ст

ати

стич

еска

до

стов

ерно

ст м

ежд

у гр

упи

те:

а1

(p<

0.05

), а

2 (p

<0.

01),

а3

(p<

0.0

01)

спр

ямо

кон

трол

ата;

b1

(p<

0.05

), b

2 (p

<0.

01),

b3

(p<

0.0

01)

спря

мо

0 г

руп

а; с

1 (p

<0.

05),

с2

(p<

0.01

), с

3 (p

<0.

001

) сп

рям

о I

груп

а; d

1 (p

<0.

05),

d2

(p<

0.01

), d

3 (p

<0.

001

) сп

рям

о II

гру

па.

58

също, че е постигнат чрез осигуряване на по-добра реология на кръвта и съответно поддържане на адекватен кръвен ток (ІI група). Промените в албумина, който според Infusino and Panteghini (2013) е показател, широко използван в клиничната практика дават своето отражение върху съотношението A/G. При кучетата от 0 група стойностите са достоверно понижени в периода 24-ти час – 72-ри час, докато при І група понижаването е в периода 48-ми час – 7-ми ден (таблица 15). Извън референтния интервал, който за кучетата е 0.8 – 2.0 (Willard et al., 2004), A/G съотношението при животните от ІI група се променя. Въпреки преустановения прием на фитопрепарата след 6-я ден, A/G съотношението нараства до 2.01±0.32 на 10-я и до 2.06±0.24 - на 14-я ден.

В условията на нашия експериментален дизайн активността на арилестеразата, в качеството й на негативен острофазов протеин не показва статистически значими отклонения, с изключение на група ІI, където в края на изследвания период – 14-ти ден отчитаме достоверно понижаване на ARE спрямо изходните й стойности (p<0.05) (таблица 15). Това противоречи на редица литературни данни показващи, че при възпаление и/или инфекция с Грам-негативни бактерии ARE редуцира активността си (Rossi et al. 2013). Toker et al. (2009) съобщават, че при пациенти с псориазис ARE увеличава концентрациите си. Тези противоречиви резултати могат да се дължат на действието на различни фактори – биологичен вид, пол, възраст, хранителен режим (Tvarijonaviciute et al., 2012). Oran et al. (2014) коментират ролята на генетични фактори, а Tvarijonaviciute et al. (2012) – на методите на изследването й. Salman et al. (2011) посочват, че антибиотиците упражняват инхибиторен ефект върху ARE.

При нас енрофлоксацинът, приложен при инфектираните с P. aeruginosa кучета (І група) довежда до слабо проявено, без статистическа значимост, понижаване на разглеждания показател едва към края на изследването (10-я - 14-тия ден) (таблица 15). Комбинираното прилагане на антибиотик и партенолид оказва позитивно влияние върху ARE (ІII група). Необходими са обаче допълнителни изследвания за оценяване на механизмите, обуславящи промените в активността на ARE при кучета с кожна инфекция, индуцирана от P. aeruginosa, както и за изясняване на ефектите от приложената терапия.

IV.4.5. Ефекти на инфекцията и на приложените терапевтични схеми върху клетъчните елементи на естествения имунитет

P. aeruginosa инфекцията при кучетата от 0 група протича с твърде ранно - още на 24-я час нарастване на левкоцитите, които на 72-я час достигат пик, а стойностите им на 7-я и на 10-я ден остават достоверно по-високи от контролите и от 0-я час (p<0.05) (фиг. 30). При кучетата от I група левкоцитите също нарастват значимо на 48-я час (p<0.05 спрямо контролите и 0 час), когато стартира антибиотичната терапия. Двадесет и четири часа след нея те показат пик, съпоставим с този при 0 група (p<0.01 спрямо 0 час). След него регистрираните отклонения в стойностите на разглеждания показател са без статистическа значимост. Фитопрепаратът feverfew, приложен още на 4-я час при инфектираните кучета от ІІ група предизвиква значимо нарастване на левкоцитите на 24-я час, когато те са достоверно по-високи от контролите (p<0.001) и от 0-я час (p<0.01). По време приема на фитопродукта, броят на левкоцитите остава висок, а на 7-я ден, когато per os третирането е преустановено те вече са около нивата, характерни за контролите.

59

*

a

*

a

**

a

*

a

**

a1

*

a1

**

a3

**

a3

*

b2

0

5

10

15

20

25

30

35


Контроли 0 група I група II група III група

Фиг. 30. Промени в количеството на белите кръвни клетки (1.109/L) при здрави кучета (Група С - контроли), при кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и при инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група); Статистическа достоверност вътре в групите:* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0-я час; Статистическа достоверност между групите: а1 (p<0.05), а2 (p<0.01), а3 (p<0.001) спрямо контролната група; b1 (p<0.05), b2 (p<0.01) спрямо 0 група.

Белите кръвни клетки при кучетата, подложени на комбинирано въздействие –feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група) не показват статистически достоверни отклонения (фиг. 30).

Левкограмата при кучетата с експериментална P. aeruginosa инфекция (В - 0 група) (фиг. 31) доказва статистически достоверно нарастване процента на пръчкоядрените неутрофили, започващо от 48-я час на инфекцията и продължаващо до 10-я ден (p<0.01 спрямо 0-я час и p<0.05 спрямо контролите - А). За разлика от това, еозинофилите при тази група реагират със статистически достоверно понижаване на 24-я час (p<0.01 спрямо 0-я час) и на 72-я час (p<0.05 спрямо 0-я час), докато при агранулоцитите – лимфоцити и моноцити не са отбелязани статистически значими отклонения (фиг. 31). Високият процент пръчкоядрени неутрофили в кръвта на кучетата с P. aeruginosa инфекция (фиг. 31) може да бъде резултат от една страна на усилена гранулопоеза. Това се потвърждава от данните на Gregory et al. (2007), показващи, че при P. aeruginosa инфекция главен активатор на гранулопоезата е гранулоцит-колоний стимулиращ фактор (G-CSF), контролиращ преживяемостта, функционалната активност и диференциация на неутрофилите. Bardoel et al. (2014) също коментират ключовата роля на G-CSF. От друга страна Leidal et al. (2003) доказват, че Р. aeruginosa влияе върху хемокините - RANTES, MCP-1, като нарушава възможността за трансмиграция на неутрофили от кръвта. Този процес е анализиран от Voisin and Nourshargh (2013), Strydom and Rankin (2013).

60

пръчкоядрени сегментоядрени еозинофили моноцити лимфоцити неутрофили неутрофили

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 A B C D E A B C D E A B C D E A B C D EI A B C D E A B C D E A B C D E A B C D E

0 час 4 час 24 час 48 час 72 час 7 ден 10 ден 14 ден Фиг. 31. Левкограма (%) при здрави кучета (контроли - A), при кучета инфектирани с P. ae-ruginosa (0 група - B) и при инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група - C), feverfew (ІІ група - D) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група - E).

Съпоставими с посочените данни са резултатите от абсолютния брой пръчкоядрени и сегментоядрени неутрофили, представени в таблица 16.

Те показват, че кучетата от 0 група реагират със статистически достоверно увеличаване на абсолютния брой пръчкоядрени неутрофили в кръвта още на 48-я час от инфектирането (p<0.05). На 72-я час те вече надвишават референтния интервал (по Williard et al., 2004) повече от 6 пъти, а до 10-я ден остават по-високи от контролите (таблица 16). Промените са отражение на силен възпалителен отговор спрямо P. aeruginosa. Mizgerd (2002) посочва, че NF-kB e сред молекулните механизми, контролиращи формирането му. Логично е да се предположи, че при блокиране на NF-kB този ефект отпада. Това потвърждават и нашите данни, защото чрез feverfew ние блокираме NF-kB. При тези условия процентът на пръчкоядрените и сегментоядрени неутрофили е висок и се понижава след преустановяване приема на фитопрепарата (ІІ група) (фиг. 31). Антибиотичната терапия (І група) също се съпътства с увеличен абсолютен брой пръчкоядрени и сегментоядрени неутрофили (таблица 16). При комбиниране на антибиотик c feverfew (ІІІ група) се постига контрол, за което свидетелства фактът, че абсолютният брой неутрофили при кучетата от ІІІ група варира в рамките на референтния интервал, характерен за този биологичен вид (Williard et al., 2004). Коментираната от Granick et al. (2013) възможност в кръвната циркулация да има хемопоетични стволови прогениторни клетки, които чрез TLR2/MyD88/PGE2 сигнални пътища, могат бързо да се диференцират в неутрофили е интересна. Така организмът във всеки един момент

61

разполага със значителен клетъчен резерв за бърза диференциация. Това до голяма степен обяснява регистрираното ранно нарастване на абсолютния брой неутрофили в кръвта на инфектираните животни (таблица 16), когато все още не е реализирана гранулопоезата. За последната са необходими 4-6 дни.

Taблица 16. Промени в абсолютния брой на пръчкоядрените и сегментоядрени неутрофили при здрави кучета (Група С, контроли), при кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и при инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+ енрофлоксацин (ІІІ група). Данните са представени като Mean±SD, като броят на животните във всяка група е 5.

Динамика на изследване


Абсолютен брой пръчкоядрени неутрофили (ABC) х109/L

Група C 0.00±0.0 0.00±0.0 0.00±0.4 0.02±0.1 0.02±0.1 0.12±0.2 0.04±0.0 0.04±0.1

0 група 0.10±0.1 0.45±0.5 0.39±0.4 1.51±0.8

*

2.04±1.1

*** а1

0.82±0.4

а1

0.59±0.3

а2

0.18±0.1

I група 0.00±0.0 0.44±0.2 1.41±0.8 1.29±1.1 1.76±1.5

*

0.64±0.2 0.23±0.0

b1

0.13±0.1

II група 0.09±0.2 0.58±0.4 2.10±1.1 ** а2b1

1.80±1.2 ** а1

1.53±1.0 *

0.35±0.2 0.16±0.2 b1

0.24±0.2

II група 0.03±0.1 0.68±0.7 0.81±1.1 0.50±0.4

а3b3c3

0.58±0.6 0.24±0.4 0.04±0.1

b2

0.18±0.2

Aбсолютен брой сегментоядрени неутрофили (ASC) х109/L

Група C 5.12±1.4 5.52±1.1 5.72±1.5 4.74±1.8 5.63±2.2 6.00±2.8 5.56±1.6 5.64±1.4

0 група 6.06±1.5 8.72±1.7 10.56±1.9 10.92±3.02

а1

16.34±4.2

*** а1

9.56±2.6

9.11±2.1

а1

5.51±1.6

I група 3.10±0.9 8.66±1.7 13.26±4

*** а1

12.90±4.2

*** а2

16.82±6.3

*** а2

9.98±1.6

*

8.62±1.6 5.99±0.8

II група 5.54±2.2 9.76±2.6 17.71±6

*** а3

13.94±3.4

* а3

13.83±5.3

*

6.64±2.2 6.58±1.7 6.58±2.0

III група 4.98±2.9 9.52±4.6 11.02±4 11.37±2.1

a1

9.58±3.6

6.72±5.1 5.66±1.8

b1

6.32±3.3

Статистическа достоверност вътре в групите:* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0-я час.; Статистическа достоверност между групите: а1 (p<0.05), а2 (p<0.01), а3 (p<0.001) спрямо контролната група C; b1 (p<0.05), b2 (p<0.01) спрямо 0 група; c1 (p<0.05), c2 (p<0.01), c3 (p<0.001) спрямо I група.

IV.4.6. Ефекти на инфекцията и на приложените терапевтични схеми върху фагоцитозата

Осъществяваната от неутрофилите фагоцитоза е ключов неспецифичен защитен механизъм за елиминиране на патогена (Underhill and Ozinsky, 2002), макар че тези клетъчни елементи могат също да формират инфламазоми, да освобождават в екстрацелуларното пространство антимикробни пептиди и протеази (нетоза - NETs) (Kumar and Sharma, 2010). Данните от нашите изследвания показват, че фагоцитозата при всички експериментални групи остава по-ниска от контролите (таблица 17).

62

Понижението е най-добре изразено на 24-я час при кучетата от 0 група, както и при тези получавали feverfew (ІІ група).

Това не кореспондира с големия брой неутрофили в кръвта на тези животни (таблица 17). Най-вероятно регистрираният факт е резултат от действието на P.

Tаблица 17. Фагоцитоза, фагоцитно число и количество на естествените имуноглобулини при здрави кучета (Група С, контроли), при кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и при инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група).

Динамика на изследване


Фагоцитоза (PP) (%)

Група C 30.0±2.2 28.8±5.5 29.2±6.0 29.0±7.4 30.2±2.6 28.8±6.5 28.6±7.8 31.4±5.8

0 група 29.6±1.6 28.0±3.6 21.2±3.4

*** а1

22.6±3.4

**

25.0±2.2 27.0±2.0 28.0±0.7 24.2±1.9

*

I група 29.0±2.9 24.2±3.1 22.2±4.4

*

23.2±4.2 28.8±3.3 22.8±1.3 23.8±3.2 24.2±2.6

II група 28.4±4.6 23.8±4.2 19.2±1.3 ** а2

26.4±3.2 22.2±1.4 а3с2

22.6±3.8 25.0±1.2 21.0±4.7 * а2

III група 29.6±2.4 21.6±4.6 21.6±3.2 24.2±9.5 26.6±2.7 21.0±3.5

а1

28.6±1.9 22.2±4.8

а1

Фагоцитно число (PI)

Група C 0.82±0.1 0.78±0.2 0.82±0.2 0.80±0.2 0.71±0.1 0.74±0.3 0.85±0.3 0.86±0.3

0 група 0.96±0.2 0.88±0.8 0.75±0.1 0.80±0.1 0.82±0.1 1.15±0.2

а1

0.95±0.1 0.85±0.1

I група 0.88±0.1 0.89±0.8 0.75±0.1 0.84±0.1 0.97±0.1

а3 b1

0.80±0.1

b1

0.84±0.1 0.82±0.1

II група 0.91±0.1 0.89±0.2 0.72±0.1 0.98±0.1 0.84±0.1

а1с1

0.87±0.1

0.94±0.1 0.78±0.1

III група 0.96±0.1 0.82±0.1 0.86±0.1 0.97±0.4 0.96±0.1

а3 b1

0.82±0.1 1.06±0.0 0.88±0.2

Естествени (натурални) имуноглобулини (NAbs) (mg/mL)

Група C 25.2±3.8 26.2±2.6 23.7±2.4 24.6±1.1 25.0±5.9 26.1±3.2 21.7±2.4 24.9±2.8

0 група 25.9±2.9 31.5±6.2 29.4±6.0

35.9±5.5

**

35.2±4.2

*

37.3±3.2

**

32.6±1.7 а1

39.7±4.0

а2

I група 27.2±2.9 22.4±5.4 25.8±9.6

28.0±12 33.9±16 35.4±6.2 26.9±7.4 25.9±7.4

b1 II група 27.0±3.2 33.6±9.7 26.0±10

30.4±13 31.2±7.2

31.6±12 30.7±4.9

а1 27.8±8.3

b1

III група 26.5±3.0 26.2±7.7 25.7±9.2 25.2±5.9 29.2±5.6 30.7±4.6 28.4±4.5 23.0±5.6

b2 Статистическа достоверност:* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0-я час; а1 p<0.05, а2 p<0.01, а3 p<0.001 – спрямо контролите; b1 p<0.05, b2 p<0.01– спрямо 0 група; c1 (p<0.05), c2 (p<0.01) спрямо I гр.

63

aeruginosa. Екстрацелуларните продукти на тази бактерия – пиоцианин, еластаза, протеаза, екзотоксин А влияят върху фагоцитозата (Ramos et al., 2015). Laarman et al. (2012) посочват, че алкалната протеаза на P. aeruginosa блокира класическия и лектинов път на комплемента, което навежда на мисълта, че вероятно бактерията упражнява негативен ефект върху опсонините. Използваният от нас флуоресцентен метод позволява да се отчете влиянието на серумните опсонини върху фагоцитозата. Различни са подходите, чрез които P. aeruginosa стопира този важен неспецифичен защитен механизъм. Чрез екзотоксин А, пиоцианина тя нарушава клетъчните рецептори, затруднява комуникацията и нормалното протичане на интрацелуларните сигнални пътища. Фактът, че броят на рецепторите за комплемента, експресирани върху пръчкоядрените неутрофили е по-малък в сравнение със сегментоядрените показва, че функционалният капацитет на младите форми не е пълен (Fortin et al., 2008). В подкрепа на това твърдение са данните, получени при кучетата от ІІ група, показващи най-висок абсолютен брой пръчкоядрени неутрофили в периода 24-ти – 72-ри (таблица 16), кореспондиращ с най-нисък процент на фагоцитозата (таблица 17). Ниските стойности на фагоцитозата при животните от тази група са доказателство, че ефектите на P. aeroginosa са комплицирани, с тези на партенолида, инхибиращ NF-kB. Въздействието върху този сигнален път блокира не само проинфламатoрните цитокини, простагландиновата синтеза, но също упражнява такъв ефект върху синтеза на хемокини, адхезионни молекули (Karin and Ben-Neriah, 2000).

IV.4.7. Ефекти на инфекцията и на приложените терапевтични схеми върху хидроген пероксидната продукция на неутрофилите

Функционалната активност на неутрофилите, свързана с оксидативния килинг механизъм, оценен чрез продукцията на хидроген пероксида (NBT тест) показва, че в отговор на действието на P. aeruginosa (0 група) е налице усилена продукция на H2O2 още на 24-я час, която е статистически достоверно подчертана спрямо контролите и на 48-я час (p<0.05), на 72-я час (p<0.001), на 7-я ден (p<0.001), 10-я (p<0.001) и 14-я ден (p<0.001) (фиг. 32).

Хидроген пероксидът е получен в резултат на бързо протичаща реакция между супероксидния анион и хидрогенен катион (Marcinkiewicz et al., 2000a). Той може да бъде декомпозиран до H2O с участието на каталазата (Zhang et al., 2010). Jesaitis et al. (2003), Somprasong et al. (2012) коментират, че бактериалната каталаза също конвертира H2O2 и така бързо се справя с нарастване на неговите концентрации. Използваният от нас теренен изолат на P. aeruginosa e каталаза-позитивен, което показва, че тази Грам-отрицателна бактерия може да се справи лесно с резки промени в продукцията на H2O2. Изолатът е чувствителен на енрофлоксацин. При инфектираните и третирани с този антибиотик кучета (І група), H2O2 продукция на 48-я час, когато стартира антибиотичната терапия е висока (фиг. 32). Това кореспондира с данните на Tall and Veerareddy (2011), показващи, че флуорохинолоните индуцират оксидативен стрес (Zhang et al., 2011). Интересно е, че само в началото на прилагане на eнрофлоксацин се регистрира тази промяна на H2O2, след което антибиотикът постига коригиращ ефект, за което свидетелства фактът, че H2O2 продукция при І група до края на изследването е статистически достоверно по-ниска от тази на 0 група (фиг. 32). В подкрепа на нашите данни са изследванията на Barski et al. (2011) доказващи, че само в началото, антибиотика индуцира ROS продукция. George et al.

64

(2012), анализирайки терапевтичния потенциал на партенолида отбелязват неговия противовъзпалителен капацитет и антиоксидантна активност. Прилагането му при кучетата от ІІ група потвърждава способността му да повлиява H2O2 продукция, тъй като докато трае приема му, тя е ниска и нараства след преустановяване прилагането на партенолида. Най-добър коригиращ ефект по отношение на H2O2 продукция се постига при комбиниране на енрофлоксацин с партенолид (ІІІ група).

*a1

***a3

***a3

***a3

***a3

***a2

*a2

*b2

b1b2

a1

b1

b1

*a2

b2 b1b1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45


%контролна група 0 група I група II група III група

Фиг. 32. Промени в хидроген пероксидната продукция на неутрофили от здрави кучета (Група С, контроли), кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група). Статистическа достоверност вътре в групите:* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0-я час. Статистическа достоверност между групите: а1 (p<0.05), а2 (p<0.01), а3 (p<0.001) спрямо контролната група; b1 (p<0.05), b2 (p<0.01) спрямо 0 група.

IV.4.8. Ефекти на инфекцията и на приложените терапевтични схеми върху концентрациите на малондиалдехида

Нашите изследвания показват, че експерименталната P. aeruginosa инфекция при кучетата (0 група) протича основно с понижаване на серумните концентрации на MDA спрямо контролната група на 4-я час, 24-я, 72-я час, на 10-я и 14-я ден (фиг. 33). Нарастване е регистрирано само на 48-я час и на 7-я ден от инфекцията.

При групите, на които е прилаган feverfew самостоятелно (ІІ група) или в комбинация с антибиотик (ІІІ група) установяваме още по-ниски нива на MDA от тези на контролите, което е доказателство за антиоксидантната активност на фитопродукта. Литературните данни показват твърде противоречиви промени при MDA. Giamarellos-Bourboulis et al. (2004) установяват значителни разлики при in vivo and in vitro стимулация с чувствителни и резистентни изолати P. aeruginosa, а Koussoulas et al. (2005) регистрират разлики в концентрациите на MDA в кръвта и в тъканни култури. Ware et al. (2011) коментират увеличаване на MDA при пациенти с чернодробни и ренални нарушения и отсъствие на такива при пациенти белодробни

65

заболявания. Следователно промените в липидната пероксидация не са еднозначни и зависят от характера на заболяването, методите за определяне на MDA.

а3 *

a1

a2 a1

a3a3

b2

b2

*

a3

b1

*

a2

c3

***

a3

b3

***

c2

**

a3

b3

c3

**

a3

b3

c3

***

a3

b2

***

a2

c3 ***

a3

b3

***

c1

***

a3

b3

c3

***

a3

b3

c3

0

5

10

15

20

25

30

35

40



Фиг. 33. Промени в серумните концентрации на малондиалдехида (μmol/L) при здрави кучета (контроли), кучета инфектирани с P. aeruginosa (0 група) и инфектирани и третирани с: енрофлоксацин (І група), feverfew (ІІ група) и feverfew+енрофлоксацин (ІІІ група); Статистическа достоверност вътре в групите:* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 спрямо 0-я час; Статистическа достоверност между групите: а1 (p<0.05), а2 (p<0.01), а3 (p<0.001) спрямо контролата; b1 (p<0.05), b2 (p<0.01), b3 (p<0.001) спрямо 0 група; с1 (p<0.05), с2 (p<0.01), с3 (p<0.001) спрямо I група.

IV.4.9. Ефекти на инфекцията и на приложените терапевтични схеми върху метаболитния отговор

Функционирането на естествените защитни механизми на организма изисква енергийна обезпеченост. Затова при нашите изследвания ние включваме глюкозата, като главен източник на енергия. Данните показват, че при кучетата от 0, II и III групи стойностите на този показател през целия период на изследване варират в рамките на референтния интервал (3.0 mmol/L – 6.1 mmol/L) (таблица 18). Следователно при нашият експериментален модел на инфекция, многокомпонентната система от фини регулаторни механизми успява да поддържа кръвната захар във физиологичните й граници. В тази система се пресичат от една страна хормоналната регулация, ензимната активност, транспортните механизми в клетките, а от друга алостеричната регулация на ензимите (инхибиране или активиране) посредством метаболити – АТФ, АМФ. Въпросът за критичните граници е тясно и непосредствено свързан с въпроса за селекцията на приоритетите при избора на показатели или на групи от тях. Изследванията на серумните концентрации на ALAT и ASAT не са показателни за функционалните резерви на черния дроб, а само за моментното състояние на неговия паренхим. Нашите данни показват, че активността на черно-

66

Таб

лиц

а 1

8.

Би

охи

ми

чн

и п

оказ

ател

и –

глю

коза

, A

LA

T,

AS

AT

, п

ри з

др

ави

куч

ета

(гр

упа

С -

кон

трол

и),

при

куч

ета

ин

фек

тир

ани

с

P.

aeru

gino

sa (

0 г

руп

а) и

при

ин

фек

тира

ни

и т

рет

ира

ни

с:

енро

фло

ксац

ин

(І

груп

а),

feve

rfew

(ІІ

гр

упа)

и f

ever

few

+ен

роф

локс

аци

н (

ІІІ

груп

а). Д

анн

ите

са

пр

едст

авен

и к

ато

mea

n±S

D, к

ато

бро

ят н

а ж

иво

тни

те в

ъв

всяк

а гр

упа

е 5

.

0

час

4

час

24

час

48

час

72

час

7

ден

10

ден

14

ден

Гл ю

коза

(m

mol

/L)

Кон

т р.

5.1±

1.14

4.

6±1.

38

4.4±

0.72

5.

4±0.

64

4.4±

1.27

4.

4±0.

80

4.7±

1.06

4.

4±0.

52

0 гр

упа

4.2±

0.44

4.

6±0.

34

4.2±

0.33

4.

4±0.

54

4.7±

0.44

4.

6±0.

26

4.4±

0.52

4.

2±0.

23

I гр

упа

4.8±

1.53

8.

6±3.

11*a

1b1

4.

5±1.

14

7.5±

0.86

a3

4.7±

1.40

5.

6±0.

90a1

7.

0±0.

46a3

b3

7.

8±2.

64a2

b2

II г

руп

а 4.

1±1.

18

4.7

±0

.31

4.3

±1.

24

3.7

±0.

46a2

c3

3.1±

0.42

3.

6±0.

29c3

5.6

±0.

72c1

6.

4±

1.0

8

III

груп

а 4.

4±

0.59

4.

6±

1.35

4

.0±

1.35

4

.2±

0.36

a1c

3

4.7

±0.

27

4.9

±0.

34 d

1

4.

6±

0.48

c3

4.9

±0.

61 c

1

AL

AT

(U

/L)

Кон

т р.

23.6

±3.

6

27.6

±8

.3

22.6

±5.

4

32.0

±3.

1

25.6

±5.

0

25.4

±4.

2

27.4

±5.

8

27.0

±6.

3

0 г

руп

а 29

.8±

1.7

32

.4±

4.0

32.6

±2.

8

68.0

±3

.2 a

3

62.8

±14

a3

57

.6±

13 a

2

50.2

±11

a1

32

.0±

14

I гр

упа

22.1

±3

.1

41.

4±4

.2 a

1 53

.8±

14 a

3b1

67

.4±

18 *

*a3

7

0.9±

16 *

**a3

78.

1±15

***

a3

32.5

±14

32

.4±

16

II г

руп

а 22

.0±

3.2

24

.4±

4.0

24.2

±15

c2

23

.9±

9.6

b3

c3

31.1

±3.

6 b

3c3

28.5

±3.

0 b

2c3

35

.8±

9.5

44

.8±

13

III

груп

а 21

.6±

5.2

28

.7±

7.4

26.3

±7.

4 c

2

34.8

±9.

8 b

3c3

24

.4±

4.3

b3

c3

32.0

±13

b1c

3

28.6

±5.

8 b

1

31.5

±10

AS

AT

(U

/L)

Кон

т р.

18.6

±0.

6

13.2

±9.

9 13

.6±

8.2

21

.4±

2.7

18

.2±

7.6

16

.2±

9.6

16

.0±

8.6

2

0.0

±7

.6

0 г

руп

а 18

.4±

2.0

31

.7±

6.2

a2

59.2

±7.

4 a

3

33

.8±

8.0

a1

22

.2±

5.2

21

.4±

4.0

1

5.6

±2

.7

18.5

±2.

4

I гр

упа

15.8

±2.

5

23.3

±9.

6 1

8.1

±6.

4 b

3

19.0

±6.

5 b

2

20.

2±

6.8

22.2

±9.

9

25

.0±

6.8

19

.6±

3.0

II г

руп

а 14

.9±

1.4

17

.0±

2.2

20.0

±3.

9 b

3

26.0

±5.

2 *

**

22.3

±4.

5 *

22

.8±

5.2

*

23.2

±3.

7 *

20

.6±

3.3

III

груп

а 13

.5±

1.2

13

.6±

1.0

b2

15.6

±3.

6 b

3

17.0

±2.

8 b

3

15.5

±2.

3

20.4

±5.

1**

16

.8±

3.2

14

.3±

2.3

Ст

ати

стич

еска

до

стов

ерно

ст в

ът

ре в

гру

пит

е:*

p<

0.05

, **

p<

0.01

, **

* p

<0.

001

сп

рям

о 0

-я ч

ас.

Ст

ати

стич

еска

до

стов

ерно

ст м

ежд

у гр

упи

те:

а1

(p<

0 .05

), а

2 (p

<0 .

01),

а3

(p<

0 .00

1)

спря

мо

кон

трол

ата;

b1

(p<

0.05

), b

2 (p

<0.

01),

b3

(p<

0 .00

1)

спря

мо

0 гр

упа;

с1

(p<

0.05

), с

2

(p<

0.01

), с

3 (p

<0.

001

) сп

рям

о I

груп

а.

67

дробните трансаминази при кучетата с експериментална P. aeruginosa инфекция (0 група) се повишават сравнително рано – за ASAT (4-ти час – 48-ми час) и по-късно (48-ми час – 10-ти ден) за ALAT. В същото време стойностите на ALAT са значително по-високи от тези на ASAT (таблица 18). Отношение към това има факта, че ASAT се елиминира от серума почти три пъти по-бързо в сравнение с ALAT. Трансаминазите при инфектираните животни с антибиотична терапия (I група) показват леки до умерени отклонения (таблица 18). За разлика от това при групите, на които е приложен feverfew самостоятелно (II група) или в комбинация с антибиотик (III група) стойностите на изследваните показатели са без съществени отклонения. Това може да се разглежда като безспорно доказателство за хепатопротективния ефект на фитопрепарата (таблица 18).

Чрез експерименталния модел на кожна P. aeruginosa инфекция при кучета е разкрита картината на развиващия се инфекциозен процес, резултат от сложни комплексни взаимодействия между опортюнистичния патоген и естествените защитни механизми, компенсаторния потенциал на организма и факторите на средата, като са тествани иновативни подходи за контрола му.

V. ИЗВОДИ

1. Липополизахаридът, приложен интраперитонеално на мишки понижава активността на каталазата и редуцирания глутатион, увеличава стойностите на малондиалдехида и индекса на оксидативния стрес. При неговото действие общият антиоксидантен капацитет на плазмата, както и антиоксидантните възможности на албумина са запазени, но глюкозната хомеостаза е трайно нарушена. В хепатоцитите е установена зърнеста вакуолна дистрофия.

2. Третирането на мишките с нимезулид довежда до увеличаване общия антиоксидантен капацитет на плазмата. В комбинация с липополизахарида той нормализира концентрациите на редуцирания глутатион и регулира хипоглике-мията, но понижава каталазната активност, увеличава малондиалдехида и индекса на оксидативен стрес.

3. Липополизахаридът при плъхове, рязко увеличава плазмените концентрации на PGE2 и IL-1. Той активира лизозима, но при клетъчните елементи на естествена резистентност ефектите му са разнопосочни и се изразяват в ранно и трайно понижаване на левкоцитите, пръчкоядрена неутрофилия и сегментоядрена неутропения, както и редуциране на моноцитите и увеличаване процента на лимфоцитите.

4. Липополизахаридът повишава концентрациите на лактата в кръвта на плъхове, предизвиква хипогликемия и понижава общия белтък, албумина, α2-глобулините и γ- глобулините. Той предизвиква хипоксия и декомпенсирана метаболитна ацидоза. Концентрациите на хемоглобина, на хематокрита, на еритроцитните индекси – МСV, MCH, MCHC са трайно понижени при действието му.

5. Нестероидният противовъзпалителен продукт индометацин коригира плазмените концентрации на PGЕ2, на IL-1 при липополизахарид третираните плъхове, но не може да предотврати отклоненията в левкоцитите, левкограмата, червената кръвна картина, еритроцитни индекси и киселинно-алкално състояние.

68

6. Основните клинични признаци при липополизахаридно действие – фебрилитет, адинамия, анорексия не са специфични и не зависят от чувствителността на биологичния вид към този антиген. Периодът на проява и отзвучаване на тези неспецифични поведенчески реакции зависи от начина на аплициране на липополизахарида. При интраперитонеалното му въвеждане на плъхове и прасета те са изразени най-добре на 1-я ден и отзвучават към 5-я ден, докато интравенозното му инжектиране при прасетата води до твърде ранни прояви – още на 30 минута и отзвучаване към 72-я час.

7. При прасета, инжектирани интравенозно с липополизахарид ендотоксемията протича с бързо преходна левкопения, последвана от левкоцитоза, ядрено изместване наляво, както и редуциране на еозинофилите, на моноцитите и лимфоцитите. Неутрофилната фагоцитоза е супресирана. Метаболитните промени са свързани с бързо преходна хипергликемия, заменяща се с хипогликемия, с промени в чернодробните трансаминази и превишаване стойностите на DeRitis над 1. Акутната ендотоксемия променя минералния статус като предизвиква ранно увеличаване на серумните концентрации на цинка и желязото.

8. Действието на липополизахарида, въведен интраперитонеално при прасета, предизвиква краткотрайно понижаване на левкоцитите, ядрено изместване наляво. Хуморалните фактори на естествена резистентност реагират с редуциране хемолитичната активност на комплемента. Провокираните нарушения в киселинно-алкалното състояние се свеждат до развитие на декомпенсирана метаболитна ацидоза.

9. При прасетата третирани интраперитонеално с липополизахарид, нестероидният противовъзпалителен препарат индометацин коригира нарушенията в количеството на левкоцитите, без да повлиява индуцираните от този антиген пръчкоядрена неутрофилия и сегментоядрена неутропения. Неселективният СОХ инхибитор обаче не може да отстрани нарушенията в киселинно-алкалното състояние при тези животни.

10. Н2 рецепторният антагонист циметидин притежава протективен ефект срещу липополизахарида, аплициран интраперитонеално на прасета. Този ефект е свързан с терморегулаторните свойства на продукта, благоприятното му въздействие върху клетъчните и хуморални фактори на естествения имунитет и възможностите за възстановяване на киселинно-алкалното състояние.

11. Кучетата с артифициална кожна P. aeruginosa инфекция реагират със силен възпалителен отговор, проявяващ се с фебрилитет, два до три пъти увеличаване на нуклеарния фактор капа-бета, твърде ранно нарастване на серумните концентрации на азотния оксид, и на съотношението неутрофили към лимфоцити.

12. P. aeruginosa инфекцията модулира неутрофилната активност като увеличава абсолютния брой на пръчкоядрените и сегментоядрени неутрофили и понижава фагоцитозата. Инфекцията протича с нарастване на хидроген пероксидната продукция на неутрофилите и на серумните концентрации на малондиалдехида.

13. Острофазовият отговор при инфектираните с P. aeruginosa кучета протича с увеличаване на фибриногена, повишаване на серумните концентрации на свободната сиалова киселина, нарастване на съотношението албумин/глобулини и понижаване на албумина, без значими колебания на арилестеразата.

69

14. Метаболитният отговор на кучетата с експериментална P. aeruginosa кожна инфекция се характеризира с нарастване активността на чернодробните трансаминази и на уреята.

15. Периодът от началото на експерименталната P. aeruginosa инфекция до 72-я час е определящ за по-нататъшния й ход и представлява терапевтичен прозорец за предприемане на ефективни действия.

16. Установено е, че прокалцитонинът при кучетата е достоверен индикативен показател за инфекция, предизвикана от P. aeruginosa, тъй като стойностите на показателя рязко нарастват.

17. Фитопродуктът feverfew приложен на 4-я час след P. aeruginosa инфекция при кучета ефективно блокира нуклеарния фактор капа-бета и има антиоксидантна активност, доказана чрез незначителните флуктуации на хидроген пероксидната продукция и ниските концентрации на малондиалдехида. Растителният продукт не променя активността на трансаминазите и може да се комбинира с антибиотик.

18. Комплементарната терапия, приложена на кучета с експериментална P. aeruginosa инфекция коригира отклоненията в нуклеарния фактор капа-бета, в левкоцитите, левкограмата, в абсолютния брой на неутрофилите и тяхната хидроген пероксидна продукция, в съотношението неутрофили към лимфоцити, но не влияе върху супресираната фагоцитоза.

VII. ПРИНОСИ

VII. 1. ОРИГИНАЛНИ ПРИНОСИ

1. Проведено е комплексно проучване при биологични видове с ниска чувстви-телност към бактериалния антиген липополизахарид (мишки, плъхове) и при такива, с висока чувствителност към него (прасета), като са отдиференцирани нарушенията в естествените защитни механизми и са проучени някои възможности за коригирането им.

2. Представена е схема за контролиране на оксидативния стрес при мишки, предизвикан от липополизахарида на E.coli (серотип O111:B4) чрез селективния СОХ-2 инхибитор нимезулид, като са доказани антиоксидантните свойства на този лекарствен продукт.

3. Разработена е оригинална схема за контролиране силата на възпалителния отговор, предизвикан от липополизахарида чрез блокиране на простаглан-диновата синтеза с индометацин при биологични видове, проявяващи ниска чувствителност към LPS (плъхове) и при такива с висока чувствителност към него (прасета).

4. При прасета е създаден експериментален модел, чрез който са доказани позитивните ефекти на Н2 рецепторния антагонист циметидин и възможностите той да бъде използван като коректив на нарушенията, предизвикани от интраперитонеално инжектирания липополизахарид на E.coli (серотип O111:B4).

70

5. Разработен е експериментален модел на кожна P. aeruginosa инфекция при кучета, върху който е апробиран иновативен подход за контрол на инфекциозния процес, включващ съчетаване на конвенционална с алтернативна терапия.

6. При кучета за първи път е проучен противовъзпалителния и антиоксидантен потенциал на фитопродукта feverfew и са разкрити възможностите му за комбиниране с антибиотика енрофлоксацин.

7. Доказано е, че при подбора на терапевтични средства за контрол на инфекциозния процес, предизвикан от опортюнистичния патоген P. aeruginosa е важно да се отчитат ефектите им върху защитния потенциал на организма.

8. Проучено е как контролираната сила на възпалителния отговор при Грам-негативна инфекция се отразява върху функционалната активност на другите неспецифични защитни механизми – острофазов отговор, фагоцитоза, продукция на оксидни радикали.

9. Установено е, че прокалцитонинът при кучетата може да бъде индикативен маркер за инфекция с Грам-негативни бактерии, доказано на експериментален модел с P. аeruginosa при тези животни.

10. Проучена е възможността за оценяване силата на възпалителния отговор, провокиран от опортюнистичния патоген P. аeruginosa чрез комбинирано използване на нови и надеждни инфламаторни маркери - нуклеарен фактор капа-бета, азотен оксид, съотношение неутрофили към лимфоцити, свободна сиалова киселина.

11. Доказано е, че свободната сиалова киселина е маркер на острофазовия отговор, а фибриногенът – умерено позитивен острофазов протеин при кучето е индикативен показател за протичаща при този биологичен вид кожна P. aeruginosa инфекция.

12. Чрез използване на експериментални модели с чист липополизахарид и Грам-негативна бактерия P. aeruginosa е доказано, че независимо от биологичния вид, фагоцитозата е трайно супресирания неспецифичен защитен механизъм.

VII. 2. ПОТВЪРДИТЕЛНИ ПРИНОСИ

13. Потвърдени са хематологичните, хистологични и биохимични промени, които липополизахаридът предизвиква при мишки, плъхове и прасета.

14. Установено е, че липополизахаридът нарушава киселинно-алкалното състояние като предизвиква декомпенсирана метаболитна ацидоза при плъхове и прасета.

15. Доказано е, че липополизахаридното действие, независимо от биологичния вид протича с неспецифични признаци – фебрилитет, адинамия, анорексия.

71

VIII. ПРЕПОРЪКИ ЗА ПРАКТИКАТА

1. За бързо диагностициране на P. aeruginosa кожна инфекция при кучета да се използва прокалцитонин, паралелно с конвенционалните микробиологични методи за детекция на бактериите.

2. За оценяване силата на възпалителния отговор при инфекции, провокирани от Грам-негативни бактерии биха могли да се включат и няколко инфламаторни биомаркери като нуклеарен фактор капа-бета, азотен оксид, съотношението неутрофили/ лимфоцити.

3. При Грам-негативните бактериални инфекции е препоръчително прилагането на противовъзпалителни лекарствени продукти и антиоксиданти.

4. Н2 рецепторният антагонист циметидин може да бъде използван като коректив на предизвиканите от липополизахаридното действие нарушения в организма.

5. При кучета като противовъзпалително средство може да се използва растителният продукт feverfew. Този фитопрепарат може да бъде комбиниран при необходимост с енрофлоксацин.

6. Препоръчва се за контрол на инфекциозния процес да се прилага комплементарна терапия, включваща средства за въздействие върху патогена и такива за корекция на предизвиканите от него нарушения в естествените защитни механизми на организма.

VIII. ПУБЛИКАЦИИ, СВЪРЗАНИ С ДИСЕРТАЦИЯТА

1. Andonova, M., I. Borissov, L. Sotirov, 2001. Changes in some factors of the innate immunity and serum zinc and iron concentrations in pigs following intravenous administration of Escherichia coli lipopolysaccharide. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 68, 91-99. (Импакт фактор - 0.410)

2. Andonova, M., 2002. Role of innate defence mechanisms in acute phase response against Gram - negative agents. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 5, 2, 77-92.

3. Borissov, I., M. Andonova, V. Urumova, L. Sotirov, 2004. Microbiological and laboratory studies on porcine arthritis. Zbornik Radova, Clinica Veterinaria, The sixth international symposium in Animal Clinical Pathology and Therapy, Zbornic, Budva, 14-18 June, 246-249.

4. Dinev, D., M. Andonova, 2004. The effect of general anaesthesia and abdominal surgery upon plasma thromboxane B2 concentrations in horses. Veterinary Anaesthesia and Analgesia, 31,146-149. (Импакт фактор - 1.151)

5. Андонова, М., И. Борисов, М. Паскалев, 2008. Експериментални проучвания върху някои аспекти на биологичния отговор при кучета с титанови зъбни имплантати и направлявана костна регенерация. Международна научна конференция”Българската наука и Европейското изследователско пространство” 5-6 юни, Стара Загора ISBN 978-954-93-2944-5

72

6. Georgieva, T. M., D. S. Zapryanova, E. V. Dishlyanova, S. Tanev, I. P. Georgiev, M. I. Andonova, I. N. Kanelov, I. V. Lazarov, P. Koleva, 2009. Comparison of the results of serum total protein concentration measured by 3 methods: preliminary results. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 33, 1, 67-70. (Импакт фактор - 0.342)

7. Андонова, М., И. Борисов, М. Паскалев, Н. Узунов, 2010. Клетъчни и хуморални фактори на естествена резистентност при възстановяване на костни дефекти на мандибулата при кучета чрез направлявана костна регенерация и титанови зъбни импланти. Животновъдни науки, 1, v. 47, 56-63.

8. Dimitrov, N., D. Sivrev, M. Andonova, I. Borissov, 2011. Dynamics of changes in central and peripheral lymphoid organs in rats treated intraperitoneally with lipopolysaccharide of E. coli. Acta morphologica et antropologica, 17, 133-137.

9. Andonova, M., V. Urumova, 2013. Immune surveillance mechanisms of the skin against the stealth infection strategy of Pseudomonas aeruginosa – Review. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 36, 433-448. DOI: 10.1016/j.cimid.2013.03.003. (Импакт фактор - 2.107)

10. Andonova M., V. Urumova, B. Petkova, E. Slavov, P. Dzhelebov, T. Chaprazov, R. Roidev, I. Borissov, 2014. Haematological and biochemical parameters characterizing the progression of experimental Pseudomonas aeruginosa skin infection in dogs. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 17 (1), 32-41. (Импакт ранг - SJR=0.143)

11. Simeonova, G., D. Dinev, M. Andonova, 2014. Effects of general and local anaesthesia on innate and cell-mediated immunity in dogs. Advances in Animal and Veterinary Sciences 2 (6): 354 – 358. http://dx.doi.org/10.14737/journal.aavs/2014/2.6.354.358

12. Andonova, M., V. Urumova, D. Dimitrova, E. Slavov, P. Dzhelebov, T. Chaprazov, I. Borissov, 2015. Evaluation of nuclear factor kappa beta, nitric oxide and blood neutrophil/lymphocyte ratio as biomarkers of inflammatory response and complementary therapy in dogs with experimental skin Pseudomonas aeruginosa infection. Advances in Animal and Veterinary Sciences 3(3): 174-182. http://dx.doi.org/10.14737/journal. aavs/2015/3.3.174.182

13. Andonova, M., V. Urumova, D. Dimitrova, E. Slavov, P. Dzhelebov, T. Chaprazov, T. Georgieva, 2016. Acute-phase response and the effect of the phytopreparation Feverfew (Tanacetum parthenium) in dogs with experimental Pseudomonas aeruginosa skin infection. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 19 (1), 72-77. DOI: 10.15547/bjvm.873. (Импакт ранг - SJR=0.134)

14. Andonova, M., Dimitrova, D., Urumova, V., Slavov, E., Dzhelebov, P., Nikiforov, I., Borissov, I. 2016. Haematological and acute-phase response of dogs with experimental skin Pseudomonas aeruginosa infection to treatment with antibiotic and parthenolide. Comparative Clinical Pathology. DOI 10.1007/s00580-016-2234-0. (Импакт ранг - SJR=0.281)

15. Andonova M., E. Slavov, P. Dzhelebov, V. Urumova, D. Dimitrova, M. Lyutskanov. 2017. Effects of Feverfew (Tanacetum parthenium) and antibiotic co-administration on blood neutrophil function and serum procalcitonin in dogs with experimental subcutaneous Pseudomonas aeruginosa infection. Journal of Animal and Plant Sciences, 27(2), 430-438. (Импакт фактор – 0.381)

73

* Научни публикации в списания с импакт фактор и импакт ранг - 8 Импакт фактор на публикациите, свързани с дисертационния труд – 4.391 Импакт ранг на публикациите, свързани с дисертационния труд – 0.558 Общо – 4.391+0.558=4.949 ** Научни публикации в списания без импакт фактор - 7 *** Водещ автор – 10

УЧАСТИЯ В НАУЧНИ ФОРУМИ

1. Dinev, D., M. Andonova. Influence of halothane anaesthesia on thromboxane B2, activated partial prothrombin time, prothrombin time and several parameters of the non-specific immunity in horses undergoing abdominal surgery. 7th World Congress of Veterinary Anaesthesia, Sep. 20-23, 2000, Швейцария

2. Андонова, М., И. Борисов, М. Паскалев, Н. Узунов. Оценка на имунния статус при кучета с експериментални дефекти на мандибулата и възстановяването им чрез направлявана костна регенерация и титанови зъбни имплантати. Юбилейна научна сесия “80 години Ветеринарномедицински факултет и висше ветери-нарномедицинско образование в България, Стара Загора, 13 май, 2003, България

3. Borissov, I., M. Andonova, V. Urumova, L. Sotirov. Microbiological and laboratory studies on porcine arthritis. The sixth international symposium in Animal Clinical Pathology and Therapy, Budva, 14-18 June, 2004, Черна гора

4.Georgieva, T. M., D. S. Zapryanova, E. V. Dishlyanova, S. Tanev, I. P. Georgiev, M. I. Andonova, I. N. Kanelov, I. V. Lazarov, P. Ivanova. Comparison of the results of serum total protein concentration measured by three methods: preliminary results. XIIth Congress of the International society of animal clinical Biochemistry, 22-25 May, 2006, Istambul

5. Димитров, Н., Сиврев Д., Андонова, M., И. Борисов. Динамика на промените в централни и периферни лимфоидни органи при плъхове, третирани интраперитонеално с липополизахарид от E. Coli. VІІІ Национална конференция по антропология – ІV Копривщенски морфологични дни, 4-6 юни 2010, 15-16, България.

6. Andonova M., V. Urumova, B. Petkova, E. Slavov, P. Dzhelebov, T. Chaprazov, R. Roidev, I. Borissov. Haematological and biochemical parameters characterizing the progression of experimental Pseudomonas aeruginosa skin infection in dogs. Научна конференция, 30-31 май 2013, Стара Загора, България.

7. Simeonova, G., D. Dinev, M. Andonova. Effects of general and local anaesthesia on innate and cell-mediated immunity in dogs. International VETistambul Group congress, 28-30 April, 2014, P – 31, Istambul, Turkey.

8. Andonova, M., V. Urumova, D. Dimitrova, E. Slavov, P. Dzhelebov, T. Chaprazov, T. Georgieva. Evaluation of acute phase response and the effect of the phytopreparation Feverfew (Tanacetum parthenium) in dogs with experimental Pseudomonas aeruginosa skin infection. International Scientific Conference Veterinary Medicine –Science, Practice, Business, 9 October 2014, Stara Zagora, България.

9. Андонова, М., Д. Димитрова, Е. Славов, П. Джелебов, В. Урумова, И. Никифоров, И. Борисов. Проучвания на ефекта от конвенционалната и комплементарна терапия

74

чрез промените в острофазовите протеини при кучета с експериментален пиодерматит, предизвикан от Pseudomonas aeruginosa. Научна конференция с международно участие „20 години факултет по ветеринарна медицина в Лесотехнически Университет”, 20-30.11. 2014, Юндола. Сборник доклади от научната конференция, стр. 279-285, 2014, София, България.

• Национални научни форуми – 5

• Международни научни форуми - 4

IX. ENGLISH SUMMARY

Infections induced by Gram-negative bacterial pathogens E. coli and P. aeruginosa are a challenge for therapeutic control due to the selection of microbial strains resistance to antibiotics, the numerous available virulence factors that are rapidly switched during the course of infection, as well as the broad pH, temperature and nutritional range of development. Therefore, new strategies for solving the important practical problem with improving the efficacy of antibacterial therapy should be sought.

The main purpose of this thesis was to use experimental models with animal species with different sensitivity to antigens of Gram-negative bacteria E. coli and P. аeruginosa in order to differentiate occurring disturbances in antioxidant and defense systems. On this basis, the aim to develop strategic programmes and solutions to support the correction of impaired mechanisms of defense associated to barrier systems and innate immunity – inflammation, acute-phase response, phagocytosis.

Relying on the circumstance that the primary attacking factor of Gram-negative bacteria is lipopolysaccharide (LPS), our attention was focused on this antigen to investigate, analyse and evaluate its effects in animals with low sensitivity to it (mice, rats) and animals with high sensitivity (pigs) and to develop new algorithms for correction of LPS-induced systemic disturbances. In used experimental animal models, LPS from E.coli, serotype O111:B4 was always used.

The experiments with mice have shown that intraperitoneally applied LPS induced oxidative stress and rapidly decreased the activity of intracellular antioxidants – catalase and reduced glutathione. Under its influence, the ferric-reducing ability of plasma and antioxidant potential of albumin were preserved, but malondialdehyde concentrations were increased and glucose homeostasis was permanently impaired. Nimesulide, applied for oxidative stress control, normalised reduced glutathione levels, succeeded to regulate hypoglycaemia but blood catalase activity remained low, and oxidative stress markers (malondialdehyde and oxidative stress index) – high.

In rats, LPS induced a strong inflammation associated with increased concentrations of inflammatory biomarkers PGЕ2 and IL-1β. It reduced leukocyte counts, caused a left shift, reduced monocyte and increased lymphocyte percentages. Blood lysozyme levels were statistically significantly increased, whereas haemoglobin content, haematocrit and erythrocytic indices were permanently decreased. The endotoxin impaired acid-base

75

balance causing decompensated metabolic acidosis, accompanied with increased blood lactate levels at the background of hypoglycaemia. The non-steroidal anti-inflammatory product indomethacin altered plasma PGЕ2 and IL-1β concentrations in rats treated intraperitoneally with LPS although it could not prevent the deviations in total and differential white blood cell counts, red blood cells, erythrocytic indices and acid-base status.

Our results proved that the main clinical signs after LPS challenge – fever, adynamia, anorexia, were non-specific and did not depend on the sensitivity of the biological species to the antigen. Non-specific behavioural reactions were observed in both rats and pigs. It was demonstrated that intraperitoneally applied LPS in pigs, a species highly sensitive to it, affected the same defense systems as in rats but the observed tendencies in cellular and humoral factors if innate immunity in both species did not follow the same trend. The action of this antigen in pits caused a transient decrease in leukocyte counts, a left shit. Humoral factors responded with reduced complement haemolytic activity, and lysozyme concentrations remained within the reference range. The disturbances in the acid-base balance corresponded to decompensated metabolic acidosis. In the used experimental model, two drugs were evaluated – indomethacin and cimetidine. The non-selective COX-inhibitor indomethacin corrected the impaired leukocyte counts without influencing the LPS effects on neutrophils, reducing lymphocyte percentage. The non-steroidal anti-inflammatory drug could not prevent LPS-induced changes in acid-base balance because after its application, blood НСО3

– remained lower than baseline values both on post treatment days 1 and 5. Our studies showed the protective effect of the Н2 receptor antagonist cimetidine against intraperitoneal LPS challenge in pigs. This effect was associated with thermoregulatory properties of the drug, its beneficial effect on cellular and humoral factors of innate immunity and the possibilities for restoration of the acid-base equilibrium.

An in vivo animal model of skin P. aeruginosa infection in dogs was developed, allowing for obtaining accurate information for the time course of the developing infection both in its earliest stages (post treatment hour 4–72) and in later stages(post treatment days 7–14). The model standardised some conditions influencing the infection as bacterial counts, inoculation site, animal gender, nutritional, temperature and light regimen, circadian rhythms, so it allowed for differentiation of the primary pathogenetic elements. Using this model, the potential of serum procalcitonin as a marker of P. aeruginosa infection was tested: a step of clinical relevance arising from the need from rapid readily available and non-expensive tests correlating with results from conventional microbiological methods for detection of bacteria. The research and applied aspect of this parameter came from the fact that in a clinical setting, infections were usually mixed-type, as Gram-negative bacteria were associated with other bacteria, viruses or fungi. The elucidation of the infectious etiology and more precisely the differentiation of bacterial from viral and fungal infections is a key point in the selection of adequate therapy. Our data evidenced that serum procalcitonin concentrations in infected but untreated animals increased progressively from the 24th hour to the 7th day, demonstrating that it could be used as a biomarker of canine skin P. aeruginosa infection.

The response of dogs with experimental skin infection comprised a strong inflammatory response with fever, sharp elevation of blood nuclear factor kappa beta, nitric oxide, neutrophil/lymphocyte ratio, and free sialic acid levels. These modern biomarkers of

76

inflammation and their complex interpretation together with haematological and blood biochemical parameters permitted the integral evaluation of the inflammatory response, which is important as the excessively strong inflammation impaired primary mechanisms of control and thus, it lost its role as a vital non-specific mechanism of protection provoking systemic disturbances. The skin infection was characterised with increased leukocyte counts between post infection hours 48–72, increased absolute counts of band and segmented neutrophils, low phagocytosis percentage but increased blood concentrations of malondialdehyde and hydrogen peroxide production by neutrophils. The acute-phase response in P. aeruginosa-infected dogs was accompanied with increased fibrinogen, serum free sialic acid concentrations, increased albumin/globulin ratio and no considerable changes in blood arylesterase.

In this thesis, an innovative approach combining drugs aimed at control of the pathogen (antibiotic therapy) and others, aimed at supporting the systemic defense through correction of disturbances in innate mechanisms of defense was used. To this end, the standardised phytopreparation feverfew was applied starting from the 4th hour of P. аeruginosa infection. Its active component parthenolide blocked effectively nuclear factor kappa beta and had antioxidant activity as could be seen from the insignificant fluctuations of hydrogen peroxide production of neutrophils and low malondialdehyde concentrations in blood. The phytopreparation did not alter blood activity of transaminases and could be combined with the antibiotic enrofloxacin. The results established that complementary therapy applied to the dogs with experimental P. aeruginosa infection managed to correct the deviations in nuclear factor kappa beta, total and differential leukocyte counts, absolute neutrophil counts and their hydrogen peroxide production, neutrophil to lymphocyte ratio but had no effect on suppressed phagocytosis.

Мария Йорданова Андонова ВЪЗМОЖНОСТИ ЗА...

Documents