This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

gehalten. Auf den Schnitten durch diese Kulturen zeigte sich nach Versilberung, daß ein Teil der Haar-wurzeln gelbes Pigment gebildet hatte, während in der Kontrollkultur, die ohne Glutathion und ohne Embryonalextrakt gefüttert wurde, nur schwarze Haarwurzeln vorkamen. Eine Wiederholung des Ver-suches hatte dasselbe Ergebnis. Es sind stets die schwächeren Haarwurzeln, die gelbes Pigment bil-den, weil sie in bezug auf Bindenbildung am labil-sten sind (s. S. 4). Abb. 8 zeigt eine solche gelbe Haarwurzel neben schwarzen. Der Unterschied ist im Präparat wesentlich deutlicher als in der Schwarz-Weiß-Photographie. Die Bildung von gelbem Pigment kann man auf diese Weise auch erzwingen, wenn man zu einem anderen Zeitpunkt explantiert, d. h. wenn das Haar nicht gerade die Granne bildet.

Erörterung der Ergebnisse

Aus den Arbeiten von C a r r e l 1 7 und vielen ande-ren Autoren ist die mitosefördernde Wirkung des Embryonalextraktes bekannt. In den hier geschilder-ten Versuchen an Gewebekulturen trat als Folge der durch Embryonalextrakt erhöhten Teilungsgeschwin-

17 A. C a r r e l , J . exp. Medicine 17 , 1 4 [ 1 9 1 3 ] .

digkeit eine beschleunigte Bindenbildung auf. Da-mit bestätigt sich der schon früher erhobene Befund, daß die Mitoserate in der Haarwurzel während der Bildung des gelben Pigments erhöht ist. Durch eine Steigerung der Mitosetätigkeit kann man also in wildfarbiger Haut jederzeit eine Bindenbildung aus-lösen, d. h. die Melanoblasten dazu veranlassen, gel-bes an Stelle von schwarzem Pigment zu bilden.

Dasselbe geschieht, wie wir sahen, auch unter der Wirkung von Glutathion, wobei sogar in genetisch einfarbigem a-Gewebe eine Bindenbildung erfolgt. Diese Phänokopie zeigt, daß die Funktion der Pigmentzellen genetisch nicht streng determiniert, sondern experimentell modifikabel ist. Damit ergibt sich vielleicht die Möglichkeit, die Wirkungsweise des Wildfarbigkeit-Faktors weiter zu analysieren. Der Zusammenhang zwischen dem Haarwurzel-Wachstum und der Pigmentbildung in den Melano-blasten ist allerdings einstweilen noch ebensowenig geklärt, wie die Rolle, welche das Glutathion bei der Pigmentbildung spielt.

Für die Förderung meiner Untersudiungen bin ich Herrn Prof. D a n n e e l zu Dank verpflichtet, ebenso Frl. S. G a i 1 e , die die Kulturen versorgte.

Ober die Ausscheidung und Speicherung von radioaktiv indizierten Xylan-Schwefelsäureestern1

IV. Mitt.: Prüfung der Abhängigkeit vom Polymerisationsgrad und Schwefelgehalt. Vergleich mit Heparin-

V o n E . HUSEMANN u n d B . PFANNEMÜLLER,

W . H E R T L E I N u n d E . G . HOFFMANN *

Aus dem Chemischen Laboratorium der Universität Freiburg i. Br., dem Staatlichen Forschungsinstitut für makromolekulare Chemie,

dem Pharmakologischen und dem Physikalischen Institut der Universität Freiburg i. Br. (Z. Naturforschg. 9 b, 704—712 [1954]; eingegangen am 11. August 1954)

Durch Verwendung von mit 35S indizierten Präparaten wurde die Speicherung und Aus-sdieidung von Xylan-sdiwefelsäureestern verschiedenen Polymerisationsgrades und Schwefel-gehaltes sowie von Heparin untersucht und folgende Ergebnisse erhalten:

1. Die Substanzen werden in bestimmten Organen auch über einen längeren Zeitraum hin-weg spezifisch gespeichert. Bei mehrfacher Injektion tritt Kumulierung ein.

2. Das Ausmaß der Speicherung nimmt mit Erhöhung des Polymerisationsgrades sowie des Schwefelgehaltes zu.

3. Heparin und ein in Polymerisationsgrad und Schwefelgehalt ihm ähnlicher Xvlanester verhalten sich in bezug auf Ausscheidung, Ausmaß und Dauer der Speicherung und Kumu-lierung analog.

4. Mit Periston läßt sidi nur bei höhermolekularen Präparaten eine erhöhte Ausscheidung erzielen.

5. Der Gehalt des Blutes an injizierter Substanz fällt zunächst stark ab, erreicht jedodi nach 8—10 Stdn. einen über längere Zeit nahezu konstanten Wert.

Seitdem man weiß, daß Heparin, ein körpereige-ner gerinnungs-hemmender Stoff, ein Polysac-eharid-schwefelsäureester ist, hat es nicht an Ver-suchen gefehlt, synthetische Substanzen mit ähn-lichen Eigenschaften herzustellen 3~11 . Dabei ist es häufig auch gelungen, durch Sulfurierung verschiede-ner Polysaccharide gute gerinnungs-hemmende Wirk-samkeit zii erzielen. In den meisten Fällen scheiterte jedoch die therapeutische Verwendbarkeit an der Toxizität der Präparate. Als Ursache der gegenüber dem Heparin gesteigerten Unverträglichkeit stellte P i p e r bei synthetischen Präparaten eine Thrombo-cyten-Agglutination12 sowie eine Plasma-Trübung durch Fibrinogenfällung13 fest. Diese Beobachtungen wurden durch neuere Untersuchungen von W a l -t o n 1 4 an Dextran-schwefelsäureestern bestätigt. Zur Klärung der Frage, von welchen Faktoren sowohl Wirksamkeit wie Toxizität abhängen, wurde in einer früheren Arbeit 9 der Einfluß von Molekülgröße und Molekülgestalt systematisch geprüft. Es stellte sich heraus, daß die Dosis letalis mit zunehmendem Poly-merisationsgrad erheblich abnimmt, während die Wirksamkeit durch ein Optimum geht.

Weitaus am günstigsten war ein Xylan-schwefel-säureester von etwa gleicher Kettenlänge wie Hepa-rin. Er besaß nahezu die gleiche Wirksamkeit und wurde von Kaninchen bei intravenöser Injektion in Dosen, die dem Vielfachen der therapeutischen Dosis entsprachen, ohne sichtbare Schädigung vertragen. Bei längerer Anwendung im Tierversuch stellten sich jedoch pathologische Veränderungen bestimmter Or-gane (Leber, Niere, Milz, Magen, Darm) heraus. Es schien uns daher notwendig, den Weg der Substan-zen innerhalb des Organismus möglichst einwandfrei zu verfolgen und mit dem von Heparin zu verglei-chen. Wegen der großen Ähnlichkeit zum körper-eigenen Heparin ist es schwierig, eine analytische

1 414. Mitt. über makromolekulare Verbindungen. 2 I. Mitt.: E. H u s e m a n n , E. G. H o f f m a n n ,

R. L o t t e r i e u. M. W i e d e r s h e i m , Experientia [Basel] 8, 153 [1952]. II. Mitt.: E . G . H o f f m a n n , E. H u s e m a n n , R. L o t t e r i e , M. W i e d e r s h e i m u. W. H e r 11 e i n , Makromolekulare Chem. 10, 107 [1953]. III. Mitt.: E. H u s e m a n n , B. P f a n n e m ü l l e r u. W. H e r t i e i n , Experientia [Basel] 9, 379 [1953].

* Jetzt Max-Planck-Institut für Kohlenforsdiung, Mül-heim (Ruhr).

3 S. B e r g s t r ö m , Naturwissenschaften 23, 706 [1935]; Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 238, 163 [1935],

4 E. C h a r g r a f f , F . W . B a n c r o f t u. M. S t a n -l e y - B r o w n , J. biol. Chemistry 115, 149, 155 [1936]; E. C h a r g r a f f u. K. B. 0 1 s o n , J. biol. Chemistry 122, 153 [1937],

5 H. E 1 s n e r , W. B r o s e r u. E . B ü r g e l , Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 246, 244 [1937],

Methode zum spezifischen Nachweis solcher Stoffe zu finden. Wie in der II. Mitteilung berichtet wurde, lassen sich aber Polysaccharid-schwefelsäureester auf einfache Weise mit 35S indizieren. Dies ist eine ein-fache und sichere Möglichkeit, sie vom Heparin analytisch zu unterscheiden. Die erwähnte Arbeit, die in erster Linie der Ausarbeitung der Methode — Aufschluß der Organe, Art der Aufarbeitung, Repro-duzierbarkeit und Dosierungsfragen — diente, führte schon zu dem vorläufigen Ergebnis, daß Speicherung und Ausscheidung erheblich vom Polymerisations-grad abhängen.

Nachdem die methodischen Vorarbeiten geleistet waren, haben wir nun unter genau festgelegten und vergleichbaren Bedingungen Xylan-schwefelsäure-ester verschiedenen Polymerisationsgrades und Schwe-felgehaltes untersucht, um über die Fragen der Ausscheidung und der Speicherung Aufschluß zu erhalten. Insbesondere wurde Heparin selbst indi-ziert, um festzustellen, ob es sich in diese Reihe einordnet oder ob es als körpereigenes Produkt eine Sonderstellung einnimmt.

A u s s c h e i d u n g u n d S p e i c h e r u n g in A b h ä n g i g k e i t v o n d e r K e t t e n l ä n g e

Zur Durchführung dieser Untersuchungen wurden zwei Xylanester verschiedenen Polymerisationsgrades hergestellt. Mit beiden Präparaten wurde die Spei-cherung nach 1-maliger Injektion von 100 mg/kg sowie nach 5-maliger Injektion der gleichen Dosis in 24-stdg. Abstand festgestellt.

Weiter prüften wir die Dauer der Bindung an die Organe nach einer längeren Überlebenszeit der Tiere. Die Versuche wurden an Kaninchen vorgenommen.

Die Tiere wurden 48 Stdn. nach der Injektion ge-tötet und die Organe in der Weise aufgearbeitet, wie es im zweiten Teil beschrieben wird.

e C. R. R e u s e , Soc. Biol. Paris 131, 834 [1939]. 7 P. K a r r e r , H. K ö n i g u. E. U s t e r i , Helv.

chim. Acta 26, 1296 [1943]; P. K a r r e r , E. U s t e r i u. B. K a m e r i n o , Helv. chim. Acta 27, 1422 [1944].

8 T . A s t r u p , I. G a l s m a r u. M . V o l k e r t , Acta phy-siol. scand. 8, 215 [1944].

9 E. H u s e m a n n , K. N. v. K a u i l a u. R. K a p -p e s s e r , Z. Naturforschg. 1, 584 [1946],

10 K. M a u r e r u. F. V i n c k e , Chem. Ber. 80, 179 [1947].

11 M. P a n t s c h l i t s c h k o , J . S c h m i d u. E . K a i s e r , Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 289, 44 [1951].

12 J. P i p e r , Acta physiol. scand. 9, 28 [1945], 13 J. P i p e r , Acta pharmacol. toxicol. 2, 317 [1946];

T . A s t r u p u. J . P i p e r , Acta physiol. scand. 11,211 [1946].

14 K. W. W a 11 o n , Brit. J. Pharmacol. Chemotherapy 9, 1 [1954],

Gesamtaktivität Spezif. Aktivität (Imp./mg) Relat. Aktivität (°/0)

I II I II I II

Harn, 4 Stdn. nach Injekt. . 4,4 • 103 5,18- 10* 3,56 48,4 Harn, 8 Stdn. nach Injekt. . 2,8 • 103 1,02- 103 — — 2,29 3,74 Harn, 24 Stdn. nach Injekt. 1,2 • 103 1,02- 103 — — 0,97 0,95 Harn, 48 Stdn. nach Injekt. 6,2 • 10s 2,62- 102 — — 0,5 0,25 Leber 9,2 • 103 2,91- 103 0,856 0,51 7,43 3,72 Niere 4,0 • 103 4,6 • 103 3,09 2,14 3,25 4,29 Milz 7,1 • 102 0,85- 102 9,43 0,78 0,57 0,08 Lunge 7,4 • 10s 3,9 • 102 0,707 0,26 0,6 0,36 Magen 1,5 • 103 4,76- 10* 0,35 0,13 1,2 0,44 Dünndarm 4,5 • 10* 2,33- 10* 0,516 0,25 . 0,36 0,29 Dickdarm 9,5 • 102 5,15 • 10* 0,688 0,27 0,74 0,48

Tab. 1. Ausscheidung und Speicherung nach 1-maliger Injektion. Präparat I: Zr/ 0,0247, DP 92,0, 16,2% S. Präpa-rat II: Zy] 0,012, DP 44,5, 14,7% S.

Wie aus Tab. 1 und Abb. 1 hervorgeht, ist die Ausscheidung in sehr hohem Maße vom Polymeri-sationsgrad abhängig. Auch bei der Speicherung, besonders in der Milz und in der Leber, bestehen deutliche Unterschiede. Verhältnismäßig wenig be-einflußt wird die Niere; die relativ hohen Werte

Leber Niere Milz

Abb. 1. Spezifische Aktivität von Leber, Niere und Milz nach 1-maliger Injektion. •

XS I X S I I

von Präparat II beruhen vermutlidi nicht auf einer Speidierung, sondern auf einer erhöhten Ausschei-dung und Rückresorption. Im ganzen stimmen die Ergebnisse durchaus mit den früheren überein.

Zur Prüfung der Ausscheidung und Speicherung bei mehrfacher Anwendung wurde das besser ver-trägliche abgebaute Präparat II verwendet, und zwar injizierten wir im Abstand von je 24 Stdn. in dem einen Fall 5-mal, im zweiten Fall 14-mal die gleiche Dosis von 100 mg/kg und untersuchten die Organe in der üblichen Weise 48 Stdn. nach der letzten Injektion (Tab. 2).

Leber Niere Milz

Abb. 2. Spezifisdie Aktivität von Leber, Niere und Milz bei mehrfacher Injektion von Präparat II.

IX100 mg/kg = 5X100 mg/kg 14X100 mg/kg

Den Anstieg der Speicherung erkennt man deut-lich in Abb. 2, in der die spezifische Aktivität der wichtigsten Organe mit der bei einmaliger Injektion verglichen ist.

Man sieht aus diesen Ergebnissen, daß bei länger andauernder Verabreichung eine erhebliche Kumu-lierung auftritt, und zwar hat sich der Gehalt an Xylan-sdiwefelsäureester in Leber und Milz nach 5 Tagen auf das 7-fache, nach 14 Tagen in der Milz

Tab. 2. Speicherung und Ausscheidung bei mehrfacher Verabreichung. I: Injektion von je 100 mg/kg Präparat II, 5 Tage lang. II: Injektion von je 100 mg/kg Präparat II, 14 Tage lang.

Gesamtaktivität Spezif. Aktivität (Imp./mg) Relat. Aktivität (°/0)

I II I II I II

Harn 48 Stdn. n. d. letzt. Injektion 9,1 -IO4 1,56 • 105 — — 12,0 7,4 Leber 6,39 • 104 7,42 • 104 4,95 6,51 8,44 3,51 Niere 1,88 • 104 2,7 -IO4 8,15 11,68 2,48 1,27 Milz 7,34 • 102 2,48 • 103 5,64 20,6 0,09 0,12 Lunge 1,91 • 103 5,37 • 103 1,25 3,86 0,25 0,25 Magen 2,16 - 103 1,08 • 104 0,48 2,42 0,28 0,51 Dünndarm 1,19- 103 4,99 • 103 1,28 3,56 0,16 0,23 Dickdarm 2,75 • 103 6,91 • 103 1,72 3,34 0,36 0,33

Gesamt-aktivität

Spezif. Aktivität

(Imp./mg)

Relat. Aktivität

(°/o)

Leber Niere Milz Magen Dünndarm Dickdarm

8,41 • 103 3,6 • 103 1,1 -IO2 6,17 • 102 1,92 • 10* 3,9 • 102

0,686 (0,51)* 1,78 (2,14) 0,577 (0,775) 0,128 (0,13) 0,113 (0,25) 0,173 (0,274)

6,3 (3,72) 2,7 (4,29) 0,08 (0,08) 0,46 (0,44) 0,14 (0,29) 0,29 (0,48)

Leber Niere Milz

* Die eingeklammerten Werte sind die Aktivitäten nadi 48 Stunden.

Tab. 3. Speicherung von Präparat II nadi 3 Wochen.

sogar auf das 25-fache erhöht. Während für die Leber die Werte auf eine zunehmende Sättigung hindeuten, hat man bei der Milz den Eindruck, daß sie die Substanz unbegrenzt aufnimmt.

Zur Klärung der Frage, wie lange Xylanester in den einzelnen Organen festgehalten werden, wurden Kaninchen mit der üblichen Dosis von 100 mg/kg von Präparat II gespritzt und nach 3 Wochen ge-tötet (vgl. Tab. 3).

Aus Abb. 3 ist zu ersehen, daß der Gehalt an Xylanester in Niere und Milz nach 3 Wochen nur sehr wenig abnimmt, während sich erstaunlidier-weise die Aktivität der Leber in diesem Zeitraum noch erhöht.

Sowohl die extrem hohe Aufnahme durch die Milz als auch die Nachspeicherung in der Leber veranlaß-ten uns, den Blutspiegel durch Messung der Aktivi-tät über längere Zeit zu bestimmen. Für diese Un-tersuchungen wurde einem Hund die Dosis von 100 mg/kg eines indizierten Xylanesters, Präparat III, mit folgenden Daten gespritzt: Zr/ 0,09, DP 32, 14 ,7% S. Es entspricht etwa dem Präparat II, nur daß für diese Zwecke eine besonders hohe Aktivität erforderlich war, um die zu entnehmenden Blut-mengen möglichst gering halten zu können. Durch

Abb. 3. Dauer der Speicherung von Präparat II. J nadi 48 Stdn. nach 3 Wochen

Venenpunktion wurden in bestimmten Zeitabstän-den Blutproben entnommen und in der üblichen Weise aufgeschlossen. Gleichzeitig wurde die Ge-rinnungszeit bestimmt (vgl. Abb. 4).

Nach V2 Stde. ist der Xylanestergehalt des Blutes auf die Hälfte abgesunken, die Proben sind aber noch völlig ungerinnbar. Nadi 2 Stdn., zu einem Zeitpunkt, bei dem die Gerinnungszeit schon fast ihren Normalwert erreicht hat, zirkulieren noch 3 0 % der Substanz in der Blutbahn*. Von da ab nimmt der Gehalt an indiziertem Xylanester nur noch langsam ab und erreicht nach 8—10 Stdn. einen Spiegel von 15%, der im Laufe der nächsten 24 Stdn. nur unwesentlich abfällt. Diese erstaunlidi hohe Konzentration an aktiver Substanz über längere Zeit hinweg läßt das Verhalten von Leber und Milz ver-ständlich erscheinen.

Der Unterschied zwischen beiden Organen liegt in ihrer Speicherungsgeschwindigkeit. Während die Milz sehr rasch reagiert, kann die Leber noch über

* Diese Konzentration (0,6 mg pro cm3) müßte nach den Erfahrungen in vitro ausreichen, um das Blut über mindestens 1 Stde. ungerinnbar zu halten. Es scheint, daß in vivo ein Teil der Substanz inaktiviert wird, mög-licherweise durch Bindung an Plasmaproteine oder Blut-zellen, oder aber durch vermehrte Ausschüttung thrombo-plastischer Substanzen infolge Gegenregulation. Diese Fragen sollen später in einer gesonderten Arbeit be-handelt werden.

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Dosierung Speiche-

rung [%] Aus-

scheidung [%]

100 mg/kg XS, ohne Periston 14,2 7,3

Präparat I 100 mg/kg XS + 10 ccm/kg, Periston gleichzeitig 11,6 25,8 100 mg/kg XS, n. 24 Stdn., 10 ccm/kg Periston 11,6 32,3

100 mg/kg XS, ohne Periston 8,6 53,3

Präparat II 100 mg/kg XS + 10 ccm/kg, Periston gleichzeitig 11,9 65,0 100 mg/kg XS, n. 24 Stdn., 10 ccm/kg Periston 6,8 67,4 100 mg/kg XS, 1 Stde. vorher 10 ccm/kg Periston 9,1 41,0

Tab. 4. Beeinflussung der Speicherung und Ausscheidung durch Periston.

Abb. 4. Aktivität und Gerinnungszeit des Blutes nacb In-jektion von Präparat III am Hund.

längere Zeit aus dem Blut nachspeichern. Zu ähn-lichen Befunden kamen auch H u s e m a n n und S o d e r 15 bei der Injektion von indiziertem Dextran.

Nach den vorliegenden Untersuchungen erschien eine therapeutische Anwendung der Xylan-sehwefel-säureester in der bisher durchgeführten Weise nicht günstig, da Stoffe, die über so lange Zeit gespeichert werden, unter Umständen in den Organen Dauer-sdiäden auslösen können. In der Literatur finden sidi Angaben, daß Periston, ein von W e e s e und R e p p e entwickeltes Blutersatzmittel, zur Aus-schwemmung körperfremder Stoffe geeignet ist. B e n n h o l d und S c h u b e r t 1 0 untersuchten eine Bindungsfähigkeit am Beispiel verschiedener Farb-stoffe mit dem Ziel, Stoffe, die sonst gallengängig sind, auf dem Wege über die Niere zur Ausscheidung zu bringen. Wir untersuchten, ob sich die Speiche-rung auch in unserem Falle durch Periston beein-flussen ließe.

Nachstehende Tab. 4 gibt eine Übersicht über die Ausscheidungs- und Speicherungsverhältnisse bei Ge-genwart von Periston. Verwendet wurde ein nieder-molekulares Präparat vom durchschnittlichen Mole-kulargewicht 12600, das als Periston N im Handel ist. Der Zeitpunkt der Peristongabe wurde variiert.

Die Ausscheidung wird nur bei dem höhermoleku-laren Produkt durch Periston merklich erhöht. Am günstigsten liegen die Verhältnisse, wenn Periston 24 Stdn. nach der Injektion von Xylanestern ge-geben wird. Da jedoch der Gehalt der Hauptspeicher-organe nahezu konstant bleibt, muß man annehmen, daß vorwiegend nur oberflächlich gebundene oder im Blut zirkulierende Anteile herausgewaschen wer-den. Für eine therapeutische Anwendung kommt Periston demnach nicht in Frage, weil die Bindungs-

15 E. H u s e m a n n u. G. S o d e r , Z. Naturforschg. 9 b. 237 [1954],

kräfte in den spezifisch speidiernden Organen so er-heblich sind, daß die Substanz nicht durch Periston abgelöst werden kann.

Aus Tab. 4 geht hervor, daß eine Erhöhung der Ausscheidung auch ohne gleichzeitige Abnahme der Organspeicherung möglich ist. Diese Erscheinung veranlaßt uns, die Frage der Bilanz kurz zu erörtern. Sowohl aus dieser als auch aus den vorangehenden Tabellen ist ersichtlich, daß es bisher in keinem Fall gelungen ist, 100% der injizierten Aktivität der Prä-parate wiederzufinden. Aus den Ergebnissen der Blutverweilzeit können wir schließen, daß ein wesentlicher Anteil des „Verlustes" durch die noch im Blut vorhandene Substanzmenge, die bei abge-bauten Produkten etwa 15%, bei höhermolekularen aber zweifellos mehr ausmachen wird, gedeckt wird. Ein weiterer Teil dürfte diffus im Gewebe verteilt sein; dabei könnte man sich besonders ein Anhaften an den Gefäßwänden denken. Diese geringen Men-gen lassen sich bei protrahierter Ausscheidung nur noch schwer analytisch erfassen, da sie im Harn durch viel inaktives anorganisches Sulfat verdünnt werden.

iß H. B e n n h o l d u. R. S c h u b e r t , Klin. Wschr. 26, 19 [1944]; Z. ges. exp. Med. 5/6, 722 [1944].

Aktivität (Imp/Min.)

Tier I Tier II

Harn 568 800 571 400 Leber 12 100 8 300 Niere 1 100 790 Lunge 630 760 Milz 660 1 100 Magen — 1380 Dünndarm 8 360 5 760 Dickdarm 4 340 3 900

Gesamt 595 990 593 390

Tab. 5. Ausscheidung und Speidierung von Na.,35S04. Aktivität der injizierten Na.y35S04-Lösung:

750 000 Imp/Min.

A u s s c h e i d u n g u n d S p e i c h e r u n g v o n N a 2 35 S O 4

Um eine Vorstellung zu erhalten, mit welchem Verlust bei unserer Art der Aufarbeitung und Akti-vitätsbestimmung zu rechnen ist, wurden 2 Kanin-chen mit indiziertem Na 2 3 5 S0 4 gespritzt und nadi 48 Stdn. Organe und Harn in der üblichen Weise auf ihre Aktivität geprüft.

Die in Tab. 5 zusammengestellten Versuche er-gaben, daß sich in beiden Fällen 80% der ver-abreichten Aktivität wiederfinden läßt. Es muß also nach dieser Methode mit einem Verlust von 2 0 % gerechnet werden. Von der wiedergefundenen Akti-vität entfallen 9 7 % auf die Ausscheidung, während nur 3 % nach 48 Stdn. noch in den Organen haften.

Nach Untersuchungen von D z i e w i a t k o w s k i 1 7

und B o s t r ö m und Mitarbb. 1 8 ' 1 9 wird intravenös verabreichtes Natriumsulfat z. T. in schwefelhaltige Mucopolysaccharide, besonders Chondroitinschwefel-säure, eingebaut. Da bei unseren Versuchen lediglich der Gehalt an 35S bestimmt wird, erhebt sich die Frage, ob die Aktivität noch an die injizierte Sub-stanz gebunden ist oder teilweise durch Umesterung in körpereigene Schwefelsäureester übergegangen ist. Wegen des außerordentlich ähnlichen chemischen Verhaltens von Heparin, Chondroitinschwefelsäure und Xylan-schwefelsäureester ist uns bisher ein sicherer Nachweis nicht gelungen. Auf indirektem Wege läßt sich aber aus den Ergebnissen mit reiner

17 D. D. D z i e w i a t k o w s k i , R. E. B e n e s c h u. R. B e n e s c h , J. biol. Chemistry 178, 931 [1949].

is H. B o s t r ö m , J. biol. Chemistry 196, 477 [1952]; H. B o s t r ö m u. S. G a r d e l l , Acta ehem. scand. 7, 216 [1953],

E. J o r p e s , E. O d e b l a d u. H. B o s t r ö m , Acta Haematol. 9, 237 [1953],

Natriumsulfatlösung schließen, daß eine Umesterung nur in sehr geringem Maße möglich ist. Falls näm-lich im Gewebe eine Abspaltung der Sulfatgruppen erfolgen sollte, wird der größte Teil davon gleich ausgeschieden werden (97%), so daß dieser Fehler kaum ins Gewicht fallen kann.

A u s s c h e i d u n g u n d S p e i c h e r u n g i n A b h ä n g i g k e i t v o m S c h w e f e l g e h a l t

Die bisher geprüften Substanzen lagen in ihrem Schwefelgehalt von 14—17% alle höher als das Heparin (13,2%). Es war nun die Frage, ob sich

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Abb. 5. Abhängigkeit der Kumulation vom Schwefelgehalt.

n X S I I FEI XSIV m Heparin L I (14,7% S) g (12,2% S) m (12,8% S)

Heparin unter den gleichen Versuchsbedingungen grundsätzlich von einem Xylanester gleichen Schwe-felgehaltes und Polymerisationsgrades unterscheidet. Zu diesem Zweck stellten wir uns ein in Schwefel-gehalt und Polymerisationsgrad dem Heparin mög-lichst analoges indiziertes Präparat her und vergli-chen es mit einem schonend mit 35S nachsulfurierten Heparin, um auch hier Speicherung, Kumulierung und Ausscheidung zu untersuchen*. Tab. 6 zeigt die Ergebnisse.

Schon bei 1-maliger Injektion liegt die Speiche-rung deutlich unter der von Präparat II.

In Abb. 5 ist der Verlauf der spezifischen Aktivität von Leber, Niere und Milz bei 1-maliger und 5-mali-

* Der Deutschen Hoffmann-La Roche A.G. möchten wir auch an dieser Stelle für die Überlassung von 2 g Heparin danken.

Gesamtaktivität Spezif. Aktivität (Imp./mg) Relat. Aktivität (°/o)

XS IV Heparin XS IV Heparin XS IV Heparin

Harn, 24 Stdn. n. Injektion 4,5 • 104 4,13 • 104 3,46 • 102 2,06 • 102 49,8 56,8 Harn, 48 Stdn. n. Injektion 4,5 • 103 3,8 • 103 0,45 • 10* 0,23 • 10» 4,98 5,21 Leber 2,8 • 103 2,12 • 103 0,107 0,093 3,46 2,92 Niere 6,21 • 10- 1,84 • 102 0,332 0,777 — 2,53 Milz 0,53 • 102 1,52 • 102 0,35 0,563 0,058 0,209 Dünndarm 1,73 • 102 2,34 • 10- 0,086 0,168 0,192 0,322

Tab. 6. Ausscheidung und Speicherung von Präparat IV und Heparin. Präparat XS IV: Z»; = 0,0047; 12,2% S. Heparin: Zrj = 0,0057; 12,8% S.

ger Injektion von XS II einerseits und XS IV und Heparin andererseits dargestellt.

Während bei 5-maliger Verabreichung von höher sulfuriertem Xylanester der Gehalt in der Leber auf das 10-fache, in der Milz auf das 7-fache ansteigt, haben wir hier nur eine Erhöhung auf den etwa 3-fachen Wert (Leber bei Heparin 2,9; bei XS IV 3,2; Milz bei Heparin 2,0; bei XS IV 3,7) gegenüber einer

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70

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Abb. 6. Abhängigkeit der Dauer der Speicherung vom Schwefelgehalt.

| XS II |Hj XS IV J Heparin

1-maligen Injektion von 100 mg/kg. Heparin und der heparin-ähnlich gebaute Xylanester stimmen da-bei in ihrem Verhalten weitgehend überein. Die Niere verhält sich anders als die übrigen Organe, bei denen die Speicherung erheblich geringer ist als bei XS II. Die Aktivität steigt bei Substanzen mit höherem Schwefelgehalt im Dauerversuch nur relativ wenig an und ist bei schwefel-ärmeren Substanzen mit großer Ausscheidung erhöht. Da eine spezifische Speicherung für abgebaute oder niedersulfurierte Xylanester nicht anzunehmen ist, kann dieser Befund am ehesten durch Rückresorption in den Tubuli er-klärt werden.

Auch in der Dauer der Ablagerung verhalten sich Heparin und XS IV wesentlich günstiger als XS II.

Nach 3 Wochen sind rund 5 0 % der nach 48 Stdn. gespeicherten Menge aus den Organen verschwun-den. Dabei ist für Heparin der Gehalt in der Milz besonders stark reduziert, während sich in bezug auf die anderen Organe beide Produkte analog ver-halten. (Vgl. Abb. 6.)

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß für die Höhe von Speicherung und Ausscheidung nicht nur der Polymerisationsgrad der Präparate, sondern auch der Schwefelgehalt maßgeblich verantwortlich ist. Ein Vergleich von Heparin und XS IV zeigt ferner, daß Heparin keine Sonderstellung einnimmt, sondern sich in bezug auf die Speicherung wie ein Xylanester gleichen Schwefelgehaltes verhält. Dieser Befund scheint bemerkenswert, weil immer wieder in der Literatur die Vermutung geäußert wird, daß für Heparin in der Leber ein spezifisch abbauendes Fer-mentsystem vorliege. Von J a q u e s wurde eine Heparinase beschrieben 20. M a r b e t und W i n t e r -s t e i n beobachteten, daß Heparin beim Durchgang durch den Organismus i/2 bis 1/3 seiner Wirksam-keit verliert21. Nach ihren Angaben besitzt das aus-geschiedene Heparin eine erniedrigte Viskositätszahl, ohne daß eine Schwefelabspaltung festzustellen war. Die Verfasser neigen gleichfalls zu der Annahme, daß Heparin in der Leber von einem spezifischen Fermentsystem angegriffen und abgebaut wird, und erklären die erheblich größere Toxizität synthetischer Präparate damit, daß sie fermentativ nicht angegrif-fen werden können. Daß sieb jedoch nach 3 Wochen Überlebenszeit Heparin und der heparin-ähnliche Xylanester in nahezu gleicher Menge in der Leber finden, spricht gegen eine spezifische Spaltung des Heparins, da für die ß-glukosidischen Bindungen des Xylans sicher kein entsprechendes Ferment zur

20 L. B. J a q u e s , J. biol. Chemistry 133, 445 [1940]; L. B. J a q u e s u. E. K e e r i - S z a n t o , Canad. J. med. Sei. 30, 353 [1952].

21 R. M a r b e t u. A. W i n t e r s t e i n , Helv. phv-siol. pharmacol. Acta 9, 24 [1951],

n m

7«7OL nach

1 18

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1* 100 mg/kg nach 3 Wochen

m n — Leber Niere MHz

Verfügung steht. Es wäre eher zu vermuten, daß eine unspezifische langsame Spaltung auf oxydati-vem oder auch hydrolytischem Wege möglich ist, da die Einführung von Sulfogruppen die Spaltbarkeit der glucosidischen Bindung erhöht2 2 .

Bisher wurden synthetische Polysaccharidester nach ihrer Wirksamkeit und Toxizität (Dosis letalis, Thrombocytenagglutination und fibrinogenfällende Wirkung) beurteilt. Nach unseren Ergebnissen scheint aber auch die Speicherung und Kumulierung für die therapeutische Anwendbarkeit ein nicht zu vernach-lässigender Faktor zu sein. Für die hier untersuchten Xylan-schwefelsäureester kommen wir zu dem Schluß, daß Wirksamkeit und Speicherung gleichsinnig ver-laufen. Es scheint uns daher unmöglich, ein Präpa-rat optimaler Wirksamkeit und zugleich optimaler Verträglichkeit (auch bei längerer Anwendung), wie es im Heparin vorliegt, auf Xylanbasis herzustellen. Die Speicherung läßt sich entweder durch starken Abbau (Thrombocid) oder durch Verminderung des Schwefelgehaltes in Grenzen halten. In beiden Fäl-len muß aber dafür eine wesentlich geringere Wirk-samkeit und damit erhöhte therapeutische Dosis in Kauf genommen werden. Es läßt sich bisher nicht mit Sicherheit angeben, welchen speziellen Faktoren Heparin seine günstigen Eigenschaften verdankt, sei es der Art der Bindung der Grundbausteine, sei es einer bestimmten Verteilung und sterischen An-ordnung der Sulfogruppen oder deren Bindung an die Aminogruppe des Glucosaminrestes.

H e r s t e l l u n g d e r r a d i o a k t i v e n P r ä p a r a t e

Der aktive Schwefel wurde als Natriumsulfatlösung durch die Medizinische Forsdiungsanstalt der Max-Planck-Gesellschaft, Göttingen, bezogen. Die Lösung wurde im Vakuum eingedampft und zur Entfernung der restlichen Feuchtigkeit einige Tage über Phosphor-pentoxyd aufbewahrt. Der Rückstand wurde mit der zur Sulfurierung notwendigen Menge frisch dest. Chlorsulfon-säure übergössen. Stichproben ergaben, daß nach einigen Tagen nahezu vollständiger Austausch der Aktivität statt-gefunden hat, so daß man nach 3—4 Tagen die Säure abdestillieren kann.

Zu 60 cm3 Formamid ließ man unter Kühlung mit Eis-Kochsalz 20 cm3 dieser Chlorsulfonsäure langsam zu-tropfen. Es bildete sich ein farbloses Additionsprodukt, das im Überschuß von Formamid löslich ist. 10 g Xylan wurden in 100 cm3 Formamid bei 90—100° gelöst, rasch abgekühlt und bei 20° dem Sulfurierungsgemisch zu-gegeben. Die Mischung blieb gut verschlossen 15 Stdn. bei 20° stehen. Die klare, hellgelbe Lösung wurde zur Ausfällung in Aceton eingegossen, von dem zähen Nie-

22 E. L o e s , Dissertation, Freiburg i. Br. 1951.

dersdilag dekantiert und dieser in 2-n. NaOH gelöst. Die Lösung wurde unter Rühren in Methanol ausgefällt, ab-gesaugt, mit Methanol und Äther gewaschen und im Mörser zur Trockene verrieben. Zur vollständigen Über-führung des Ammoniumsalzes in das Natriumsalz wurde der Niederschlag in 150 cm3 Wasser gelöst und mit 230 cm3 2-n. Natronlauge 50 Min. gekocht. Nach dem Neutralisieren mit Salzsäure dialysierte man bis zum Ver-schwinden der Chlorionenreaktion, bleichte durch Zusatz von etwa 0,25-proz. Chlordioxydlösung und zentrifugierte. Die Lösung wurde im Vakuum bei 35° eingedampft bis auf etwa 20—30 cm3, in Methanol ausgefällt und mit Methanol und Äther getrocknet. Ausbeute 13 g (Präparat XS I Zr) = 0,0247, DP = 92, 16,2% S).

Der Abbau von XS I wurde mit Wasserstoffperoxyd durchgeführt. 11,5 g XS I wurden in 37,4 cm3 Wasser ge-löst, auf eine Innentemperatur von 80° gebracht und nach Zusatz von 2,87 cm3 Perhydrol 70 Min. auf dieser Temperatur gehalten. Dann kühlte man die Lösung rasdi ab, neutralisierte mit Natronlauge und dialysierte bis zum Verschwinden der Sulfatreaktion. Die zentrifugierte Lösung wurde im Vakuum eingedampft, in Methanol-Äther ausgefällt, abgesaugt und getrocknet (Präparat XS II Zrj = 0,012, DP = 44,5, 14,7% S).

XS III und XS IV wurden durch Umesterung mit akti-ver Chlorsulfonsäure erhalten. 1,5 g Xylan-schwefelsäure-ester [Zt] = 0,0122, DP = 45,3, 16,6% S) wurden in 15 cm3 Formamid gelöst und zu einem Gemisch von 7,2 cm3 Formamid und 2,4 cm3 aktiver Chlorsulfonsäure gegeben. Nadi 10-stdg. Stehen bei 20° wurde in Aceton ausgefällt und wie bei der Herstellung von XS I be-schrieben weiter aufgearbeitet (Präparat XS III Zrj — 0.009, DP = 32, 14,7% S). Präparat IV wurde durdi Behandeln von 1,8 g eines Xylan-schwefelsäureesters (Zr] 0,0084, DP = 29,5, 13,0% S), der in 18 cm3 Formamid gelöst war, mit einem Gemisch von 5,4 cm3 Formamid und 1,8 cm3 aktiver Chlorsulfonsäure erhalten. Die Reaktions-dauer betmg 10 Stdn. bei 20° C (Präparat XS IV Zr) = 0,0047, DP = 16,7, 12,2% S).

Zur Herstellung von indiziertem Heparin wurden 10 Fläsdichen Liquemin-Roche (je 25000 I.E.) 24 Stdn. gegen Wasser dialysiert, im Vakuum eingedampft und der Rüdestand über Phosphorpentoxyd getrocknet. 2 g Heparin wurden in 20 cm3 Formamid gelöst, rasch auf 20° abgekühlt und die Lösung einem Gemisch von 5,4 cm3 Formamid und 1,8 cm3 aktiver Chlorsulfonsäure zugesetzt. Nach 10-stdg. Stehen bei 20° C wurde das Re-aktionsprodukt in Aceton ausgefällt, 3-mal in der Kälte mit 2-n. Natronlauge umgefällt, sodann in Wasser gelöst, dialysiert, mit etwas Chlordioxyd gebleicht und zentri-fugiert. Die im Vakuum eingeengte Lösung wurde in Methanol-Äther gefällt und das Produkt in der üblichen Weise getrocknet.

(Indiziertes Heparin Z»; = 0,0057, 12,8% S.)

B e s t i m m u n g v o n A u s s c h e i d u n g u n d S p e i c h e r u n g

Die Untersuchungen wurden an Kaninchen mit Gewich-ten zwischen 1,5 und 2,5 kg durdigefiihrt. Die Substan-zen waren 1-proz. in physiologischer Kodisalzlösung ge-

löst und wurden in die Ohrvene injiziert. Die Dosis be-trug in allen Fällen 100 mg/kg. Die Tiere wurden je-weils 48 Stdn. nach der letzten Injektion, zur Bestimmung der Verweildauer jedoch nach 3 Wochen getötet. Der Harn wurde im Stoffwechselkäfig aufgefangen oder bei Entnahmen in kürzeren Zeitabständen durch Katheteri-sieren gewonnen. Die zur Untersuchung bestimmten Organe wurden zerkleinert und mit Aceton getrocknet. Der Aufschluß der Organe und des Harns erfolgte, wie in der II. Mitteilung angegeben, nach einem von B e n e -d i c t 2 3 vorgeschlagenen und von W o l f und 0 s t e r -b e r g 2 4 modifizierten Verfahren. Mit Ausnahme der Leber, von der nur 2 g Trockensubstanz zur Verarbeitung kamen, wurde jeweils die Gesamttrockensubstanz eines Organs in einen Kjeldahlkolben übergeführt und lang-sam 20 cm3 rauchende Salpetersäure zugefügt. Wenn die erste, sehr heftige Reaktion vorbei war, erhitzte man mit kleiner Flamme bis zur vollständigen Lösung. Die Lösung wurde mit heißem Wasser in einen Porzellan-tiegel gespült und 20 cm3 der Benedictsehen Lösung zu-gegeben (200 g sulfatfreies Kupfernitrat • 6 H 0 0 und 50 g reines Kaliumchlorat in 1 / Wasser gelöst). Man ver-dampfte auf dem Sandbad bis zur Trockne und erhitzte den Rückstand auf offener Flamme, bis keine Stickoxyde mehr entweichen. Dann ließ man erkalten und löste in einem Gemisch von 5 cm3 konz. Salzsäure und 20 cm3 Wasser unter leichtem Erwärmen. Die Lösung wurde in einen 500-cm3-Erlenmeyer gebracht, mit etwa 150 cm3 Wasser verdünnt und 15 Min. gekocht. Nach Stehen über Nacht wurde filtriert, auf 400 cm3 verdünnt und mit 5—8 cm3 einer 1-proz. Bariumehloridlösung das Sulfat gefällt. Je nach der zu erwartenden Aktivität der Organe mußte manchen Proben vor der Fällung mit Barium-ehlorid inaktive Schwefelsäure als Träger zugesetzt werden.

Bei der Verarbeitung größerer Harnmengen war es notwendig, durch Zusatz von Nitrit den Harnstoff zu zer-stören. Die Harnproben wurden auf dem Sandbad ein-gedampft und in gleicher Weise wie die Organe aufge-schlossen. Der Harn enthielt meistens genügend Sulfat-ionen, so daß keine inaktive Schwefelsäure zugesetzt wer-den mußte. Zur Ermittlung der relativen Aktivität kann man die verabfolgte Substanz analog aufschließen. Es genügte aber auch, in salzsaurer Lösung mit Perhvdrol zu kochen, um alles Sulfat abzuspalten. Die Aktivität

23 St. R. B e n e d i c t , J. biol. Chemistry 6, 363 [1909]. 24 C. G L. W o 1 f u. E. Ö s t e r b e r g , Biochem. Z.

35, 329 [1910],

wurde mit dem Geiger-Zählrohr bestimmt. Verwandt wurde zunächst ein Fensterzählrohr mit sehr dünner Glimmerfolie, das als Füllgas ein Gemisch von 90 Torr Argon und 10 Torr Methylal enthielt sowie später ein Glockenzählrohr der Zentral Werkstätten Göttingen *. Als Unterlage dienten Sehälchen aus Plexiglas, in denen eine kreisrunde Vertiefung mit einer Fläche von 1 cm2 angebracht war. Es wurde immer mit einer Schicht-dicke von 20 mg/cm2 gearbeitet, so daß eine Korrektur durch den Selbstabsorptionsfaktor unterbleiben konnte. 20 mg des in einem Achatmörser fein verriebenen Bariumsulfat-Niederschlags wurden in ein Sehälchen ein-gewogen, mit einem Tropfen einer 1-proz. Lösung von Methylcellulose (als Bindemittel) zu einem dicken Brei angerührt, gleichmäßig auf der Fläche verteilt und kurze Zeit unter der Infrarotlampe getrocknet. Jedes Präparat wurde 6-mal gemessen und gleichzeitig die Aktivität eines Standardpräparates und der Nulleffekt bestimmt.

B e r e c h n u n g der A k t i v i t ä t

Aus den 6 Messungen wurde der Mittelwert der Akti-vität in Impulsen pro Minute berechnet, der Nulleffekt abgezogen und mit dem Faktor für den Standard multi-pliziert. Die Gesamtaktivität eines Organs errechnet sich aus dem Verhältnis der Gesamtbariumsulfat-Auswaage zu der Aktivität der 20 mg:

BaS04-Auswaage • Aktivität (Imp/Min.) 20 mg BaSO^

Dividiert man die Gesamtaktivität durch das Trocken-gewicht des Organs in mg, so erhält man die spezifische Aktivität in Imp/mg oder Imp/cm3.

Zur Bestimmung der relativen Aktivität mißt man die Aktivität der verwendeten radioaktiven Substanz und errechnet aus dem Verhältnis der Substanzeinwaage und der BaS04-Äuswaage die Aktivität der injizierten Menge. Diese setzt man zu der Gesamtaktivität in Beziehung.

Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t , dem F o n d s der C h e m i e sowie der Dr. W a n d e r -A.G. Bern und Säckingen danken wir auch an dieser Stelle sehr herzlich für die Unterstützung dieser Arbeit.

* Zählrohr sowie Verstärkerapparatur mit 7-stufigem Untersetzer, also 128-fache Untersetzung, sind von E. G. H o f f m a n n , z. Z. Mülheim (Ruhr), hergestellt. Nähere Angaben II. Mitt.