nuove strategie di prevenzione e terapia del danno renale ......z preliminary efficacy data appear...

Nuove strategie di prevenzione e terapia del danno renale acuto

Luigi BianconeSCU Nefrologia‐Dialisi‐Trapianto, ASO San Giovanni

Battista di TorinoDir. G.P. Segoloni

Krause D et al, J Clin Invest, 2005

Paracrine effects of EPCs-Growth factors (VEGF, etc.)

-Microvesicles (MVs)…….

MSC and kidney

http://www.jci.org/content/vol115/issue7/images/large/JCI0525540.f1.jpeg

Repair

Cell Injury

DedifferentiationMigration

Proliferation

RedifferentiationRepolariztion

BBM lossExfoliation

Tubular Obstruction

GFR

(%

)

100 -

1 20 3 4 5 6 7 8 9 10

Ischemia/Sepsis

Initiation

Extension

MaintenanceRecovery

Days

Phases of AKIPhases of AKI

Microvascular injurywith obstruction,coagulopathy &

inflammation

CMJ Hypoxia

0 -

In flam m atory cell

In jured tissue

B asem ent m em brane

Endothelial ce lls

Vessel lum en

C h em otaxis Tether

Trigger

Strong adhesio n

Tran send othelial m igration

selectin s

ch em okines (IC A M -1)

In jured tubu le

chem

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C YT O K IN ES R A N TES M C P-1 ...

T N F- IL -6

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N O O -2 O H- O C l-

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Vasoconstriction

P lugg ing

LeukocyteS ig nal

R B Cp latele ts

RUOLO DELLE STAMINALI DI ORIGINE MIDOLLARE NEL RIPARARE IL DANNO RENALE ACUTO

Staminali di origine midollare sono state identificate durante la rigenerazione tubulare

-Poulsom et al J Pathol 2001-Fang et al JASN 2005 -Gupta et al Kidney Int 2002-Lin et al J Am Soc Nephrol 2003

- La capacità delle Staminali di origine midollare di transdifferenziare è stata messa in discussione

-Duffield et al. J Clin Invest 2005 -Togel et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005

Dopo danno tubulare indotto da cisplatino e gicerolo, le MSC colonizzano il tessuto renale leso ma solo poche si differenziano in cellule epiteliali tubulari.

-Morigi et al. J Am Soc Nephrol 2004-Herrera et al. In J Mol Med 2004

MSC proteggono dal danno renale acuto da ischemia con meccanismi indipendenti dalla differenziazione.

-Lange et al. Kidney Int 2005-Tögel et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005

L’INFUSIONE DI MSC CONTRIBUISCE ALLA RIPARAZIONE DEL DANNO TUBULARE

Coinvolgimento delle MSC nella riparazione del danno tubulare

Kidney International Supplements (2011) 1, 90–93;

Potential of mesenchymal stem cells in the repair of tubular injuryBarbara Imberti, Marina Morigi and Ariela Benigni

Westenfelder C, Togel FE. Protective actions of administered mesenchymal stem cells in acute kidney injury: relevance to clinical

trials. Kidney inter., Suppl. 2011; 1: 103–106.

PHASE I CLINICAL TRIAL: PREVENTION AND TREATMENT OF AKI WITH ALLOGENEIC MSCS

In this safety and feasibility trial, adult subjects who have undergone coronary artery bypass graft and/or cardiac valve surgery were infused via the suprarenal aorta with allogeneic MSCs. All studied subjects presented with the following risk factors for post-cardiac surgery-associated AKI: underlying chronic kidney disease, congestive heart failure, diabetes mellitus, hypertension, chronic obstructive pulmonary disease, and age >65 years.Preliminary analysis of the outcomes in this cohort of study subjects showed that:

the suprarenal, postoperative administration of allogeneic MSCs is feasible and safe, as it has not resulted in adverse or serious adverse eventspreliminary efficacy data appear promising, showing, that MSC therapy prevented postoperative

deterioration in renal function (~20% AKI incidence in case controls), reduced length of stay (by ~40%), need for readmission (by ~40%), and prevented late deterioration in renal function

Westenfelder C, Togel FE. Kidney inter., Suppl. 2011; 1: 103–106.

Kunter U, Rong S, Moeller MJ et al. Mesenchymal stem cells as a therapeutic approach to glomerular diseases: benefits and risks.Kidney inter., Suppl. 2011; 1: 68–73.

MDPs self-assemble into nanofibrous hydrogels.

Wang Y et al. JASN 2011;22:704-717

©2011 by American Society of Nephrology

Preconditioned nanofibers reverse endothelial cell hyperpermeability.

Wang Y et al. JASN 2011;22:704-717


Secreted protein expression profiling of preconditioned nanofibers.

Wang Y et al. JASN 2011;22:704-717


Preconditioned nanofibers are renoprotective in experimental models of AKI. (A) Renal histology was assessed by H&E staining 24 hours after LPS administration.

Wang Y et al. JASN 2011;22:704-717


La comunicazione tra cellule danneggiate sopravvissute al danno e cellule staminali residenti o reclutate dal midollo osseo deve essere essenziale.

le microvescicole (MV) rappresentano un meccanismo di comunicazione tra cellule coinvolto nel trasferimento di informazione genetica dalle cellule staminali alle cellule mature.

Deregibus MC et al. Blood. 2007;110:2440-8.

Quali segnali sono coinvolti nell’interazione tra cellule staminali e tessuto con danno?

MECCANISMI DI PRODUZIONE DI MV

Gli esosomi originano dal compartimento endosomiale e hanno dimensioni di 30 ‐ 120nm.

Sono liberati per esocitosi con meccanismo dipendente dall’attivazione del citoscheletro. Camussi et al Kidney Int 78:838, 2010

MECCANISMI DI PRODUZIONE DI MV

Le “Shedding vesicles” hanno dimensioni di 100nm - 1mm.

Sono prodotte con meccanismo dipendente dall’influsso di calcio, l’attivazione della calpaina e la riorganizzazione del citoscheletro.

Ca++ modifica la simmetria dei fosfolipidi di membrana con attivazione di specifici enzimi (flippase, floppase e scramblase)

Camussi et al Kidney Int 78:838, 2010

ATTIVITA’ BIOLOGICHE DELLE MVATTIVITAATTIVITA’’ BIOLOGICHE DELLE MVBIOLOGICHE DELLE MV

Trasferimento di informazione genetica

• MVs derivate da cellule staminali embrionali murine riprogrammano le cellule staminali/progenitori emopoietici.- Ratajczak J et al. Leukemia 2006; 20: 847-856.

• MVs derivate da progenitori endoteliali umani attivano un programma angiogenetico nell’endotelio per trasferimento orizzontale di mRNA.

- Deregibus MC et al. Blood. 2007;110:2440-8.

Genetic information shuttled by Stem cell‐derived MVsGenetic information shuttled by Stem cellGenetic information shuttled by Stem cell‐‐derived MVsderived MVs

Embryonic Stem CellsEmbryonic Stem Cells‐mouse mRNA: Ratajczak J et al. Leukemia 2006

‐mouse microRNA: Yuan A et al. PLoS One 2009

Adult Stem CellsAdult Stem Cells‐human EPC‐derived MV mRNA: Deregibus et al. Blood 2007

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/ GEO database: GSE 7019

‐human EPC‐derived MV microRNA: Cantaluppi et al 2010

‐ human MSC‐derived MV mRNA: Bruno et al JASN 2009 GEO database: GSE 12243

‐ human MSC‐derived MV microRNA: Collino et al PloS One 2010

‐ human Liver SC‐derived MV mRNA: Herrera et al J Cell Mol Med. 2010GEO database: GSE 15569

Ruolo potenziale delle MV derivate da cellule danneggiate nella riparazione tessutale

Trasferimento MV-mediato di mRNA polmonare specifico alle cellule

staminali (Dooner et al 2008; Aliotta et al 2010).

Role of MVs derived from injured tissue in inducing change in the phenotype of bone marrow stem cellsRole of MVs Role of MVs derived from injured tissue in inducing change in the derived from injured tissue in inducing change in the phenotype of bone marrow stem cellsphenotype of bone marrow stem cells

-Aliotta JM et al. Exp Hematology 2010

MV-mediated transfer of lung specific mRNA to bone marrow (BM) stem cells In co-culture experiments of bone marrow cells separated from injured lung cells, the bone marrow cells express genes for lung-specific proteins such as Clara cell-specific protein, surfactant B, and surfactant C.

(Dooner et al 2008; Aliotta et al 2010).

BM cells

Lung injured cellsMVs

BM cells acquireLung phenotype

mRNA, miRNA and protein transfer

Ruolo potenziale delle MV derivate da cellule staminali nella riparazione del danno tissutale

Le MV trasferiscono patterns selezionati di mRNA e microRNA (GEO d.b. accession GSE12243)

Sono stati individuati 239 mRNA, 132 dei quali associati a Entrez Gene identifiers con l’analisi IPA 6.0, compresi:

-mRNA caratteristici delle linee cellulari mesenchimali, quali quelli nervosi, osteogenici, epiteliali ed emopoietici;

-mRNA coinvolti nel controllo della trascrizione, proliferazione cellulare e della regolazione immune.

Caratterizzazione delle MV derivate da MSC

EVIDENZE DI TRASFERIMENTO DI INFORMAZIONI GENETICHE DA PARTE DI MVEVIDENZE DI TRASFERIMENTO DI INFORMAZIONI EVIDENZE DI TRASFERIMENTO DI INFORMAZIONI GENETICHE DA PARTE DI MVGENETICHE DA PARTE DI MV

‐ Esperimenti dimostrano il trasferimento di geni reporter in cellule target sia in vitro sia in vivo.

‐ Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009‐ Herrera et al. J Cell Mol Med 14:1605, 2010

‐ Esperimenti dimostrano la traslazione in proteine di un RNA reporter quale il green fluorescence protein mRNA (GFP).

‐ Deregibus et al. Blood 110: 2440, 2007‐ Aliotta et al. Exp Hematol. 38:233, 2010

Dimostrezione del trasferimento di mRNA:

Caratterizzazione dei miRNAs

• small not coding region (20-24 ases) that function as importnant

players in gene regulation

Collino et al. PloSOne 2010, 5 (7):e11803

Caratterizzazione dei miRNAs


EVIDENCE FOR MVEVIDENCE FOR MV‐‐MEDIATED TRANSFER OF GENETIC MEDIATED TRANSFER OF GENETIC INFORMATIONINFORMATION

MV‐mediated transfer of specific miRNAs to target cells


Effetti proliferativi e anti-apoptotici delle MV derivate da MSC sulle cellule tubulari renali

Proliferative effect

-Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009

Anti-apoptotic effect

MV derivate da MSC proteggono dal danno tubulare acuto

Murine model of Acute Kidney Injury (AKI)

*

*: 75,000 MSC or 15 μg of MV -Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009


MSC or MV injection MSC or MV injection

Functional Recovery


MV derivate da MSC si localizzano nel tessuto renale danneggiato



AKI AKI+MV

AKI+RNaseMV AKI+MSC-Bruno et al JASN 2009

Trasferimento orizzontale di mRNA ed espressione di proteine umane nelle cellule tubulari epiteliali trattate con MV

derivate da MSC


CONCLUSIONI

-La terapia cellulare con MSC è una prospettiva di prevenzione e trattamento dell’ AKI allo stadio attuale di sperimentazione clinica.

-Alternative sperimentali come le MV o i nanopolimeri condizionati possono superare alcune problematiche delle terapie cellulari mantenendo i vantaggi terapeutici delle staminali

Laboratory of Renal and Vascular PathophysiologyUniversità di Torino

Luigi BianconeBenedetta BussolatiStefania BrunoVincenzo CantaluppiFederica CollinoM. Chiara DeregibusAndrea Ranghino

Giovanni Camussi

nuove strategie di prevenzione e terapia del danno renale ......z preliminary efficacy data appear...

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