ntc 4939

NORMA TÉCNICA NTC COLOMBIANA 4939

2001-05-30

CALIDAD DE AGUA. ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichia coli. TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN Y TÉCNICA DE SUSTRATO ENZIMÁTICO E: WATER QUALITY. COLIFORM AND ESCHERICHIA COLI

COUNTING. FERMENTATION TUBE TECHNIQUE AND ENZYMATIC SUBSTRATE TECHNIQUE

CORRESPONDENCIA: DESCRIPTORES: Coliformes, E. coli. I.C.S.: 67.040, 07.100.20 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

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PRÓLOGO El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 4939 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-05-30. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 000031 Microbiología. ACEGRASAS ALPINA S.A. AQUALAB ASINAL LTDA AVESCO BIOQUILAB LTDA. CALIDAD MICROBIOLÓGICA CALIDAD TOTAL CARULLA Y CÍA. CERVECERÍA LEONA EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ FÁBRICA DE ESPECIAS Y PRODUCTOS EL REY S.A. FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A.

FRIGORÍFICOS SUIZO S.A. GASEOSAS COLOMBIANAS S.A. GASEOSAS LUX ICA INGENIO PICHICHI INGENIO RIOPAILA IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. LESNIAK E.U. MEALS S.A. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. NULAB LTDA. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS QUIOS LTDA TECNOCLEAN DE COLOMBIA TRES M DE COLOMBIA

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: ALGARRA ASEBIOL BEATRIZ DEL PILAR MACÍAS CASA LUKER S.A. COLOMBINA S.A. COLSUBSIDIO COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES CONGELAGRO CONSESIONARIO TIBITOC

DISA S.A. EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ HACIENDA SANTA HELENA INVIMA LA CAMPIÑA S.A. LABORATORIO MICROBIOLOGÍA PARA LA CALIDAD DE LOS ALIMENTOS LABORATORIO PROCALIDAD

LABORATORIOS GRAM LLOREDA GRASAS S.A. MERCK MINISTERIO DE SALUD PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL PASSIFLORA COLOMBIANA S.A. PROCESADORA DE LECHE S.A.

PRODUCTORA DE JUGOS S.A. QUALA S.A. RICA RONDO UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD PÚBLICA UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939

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CALIDAD DE AGUA. ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichia coli. TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN Y TÉCNICA DE SUSTRATO ENZIMÁTICO 1. OBJETO La presente norma especifica dos métodos para la enumeración de Coliformes y E. coli. El Método A describe la Técnica de tubos de fermentación y el Método B describe la Técnica de Substrato enzimático empleando tubos múltiples, presencia y ausencia o multiceldas en muestras de agua tratada, cruda o residual, de acuerdo con lo propuesto por el Standard Methods 20 edición 1998.

Método A

Técnica de los tubos de fermentación 2. DEFINICIÓN Para los propósitos de este método se aplica la siguiente definición. Coliformes: bacterias gramn negativas que a la temperatura especificada (35 °C ± 2 °C) causan fermentación de lactosa con producción de gas en las condiciones de ensayo especificadas en este método. 3. PRINCIPIO 3.1 PRUEBA PRESUNTIVA Inoculación de quince tubos con medio selectivo líquido (Véase el numeral 4.2), con serie de cinco tubos con 10 ml, 1,0 ml y 0,1 ml de muestra de ensayo respectivamente ó diez tubos con medio selectivo líquido con 10ml de la muestra de ensayo o inoculación de cinco tubos con medio selectivo líquido con 20 ml de la muestra de ensayo. 3.2 Incubación a 35 °C ± 0,5 °C de los tubos inoculados durante 24 h a 48 h y análisis de estos tubos.


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3.3 PRUEBA CONFIRMATIVA Aislamiento de los cultivos procedentes de la serie de tubos en los cuales se haya observado formación de gas y acidez en medio líquido para confirmación (Véase el numeral 4.3). 3.4 Incubación a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h 3.5 Cálculo del número más probable de coliformes por 100 ml de muestra (es decir el NMP), a partir del número de tubos que muestren formación de gas, usando una tabla para determinación de números más probables. 3.6 Para establecer la presencia de coliformes y establecer una carta de control de calidad, se utiliza el ensayo completo sobre al menos el 10 % de los tubos confirmados. Simultáneamente se inoculan en Caldo bilis verde brillante lactosa para coliformes totales y caldo EC para coliformes fecales o EC+MUG para E. coli a 44,5 ºC. Los resultados positivos de la prueba indican un ensayo completo Paralelamente la presencia de tubos positivos en caldo bilis verde brillante pero negativos en caldo EC o EC+MUG indican la presencia de coliformes no fecales 4. MEDIOS DE CULTIVO 4.1 GENERALIDADES En la NTC 4092 (ISO 7218) se presenta información sobre la práctica actual de laboratorio. 4.2 CALDO LAURYL TRIPTOSA

Composición

Triptosa 20 g

Lactosa 5,0 g

Fosfato dipotásico K2HPO4 2,75 g

Fosfato de potasio KH2PO4 2,75 g

Cloruro de sodio NaCl 5,0 g

Lauril sulfato de sodio 0,1 g

Agua destilada, desionizada 1 000 ml

Preparación El caldo lauryl triptosa debe prepararse teniendo en cuenta que la concentración original del medio debe mantenerse al adicionar la muestra. Por ejemplo: se prepara el medio a doble concentración si el volumen de la muestra es igual al volumen del medio a utilizar. Se añaden los ingredientes deshidratados al agua destilada, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlo. El pH deberá ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo, se agrega caldo a los tubos de fermentación en cantidad suficiente para cubrir los tubos durham invertidos, (al menos parcialmente después de la esterilización). Se cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.


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Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. Como alternativa, se omite el tubo durham invertido y se añade 0,01 g/l de púrpura bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido en lugar de la formación de gas, lo que indicaría un resultado positivo en esta parte de la prueba. 4.3 CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE (MEDIO SELECTIVO)

Composición

Peptona 10 g

Lactosa 10 g

Bilis de buey deshidratada (sales biliares) OXGALL 20 g

Verde brillante 1 0,0133 g


Preparación Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se calienta para disolverlos. El pH debe ser de 7,2 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo, se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente de medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Se cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor. Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. 4.4 CALDO E C

Composición

Triptosa 20 g

Lactosa 3,0 g




Lauryl sulfato de sodio 0,1 g


Preparación Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlos. El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo, se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente de medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Se cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.


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Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos de fermentación no de en contener burbujas de aire después de la esterilización. 4.5 AGAR LES ENDO Composición

Peptona 10 g

Lactosa 10 g


Sulfito sódico anhidro 3,3 g

Pararrosanilina (fuscina) 0,3 g

Agar 12,5


Preparación Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlos. El pH debe ser de 7,4 ± 0,2 después de la esterilización. Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Se vierten en cajas de petri de 100 mm x 15 mm 4.6 AGAR MACCONKEY Composición

Peptona caseinada

Peptona de carne Proteasa

SorbitolLactosa

Sales biliares No.3

Cloruro de sodio

Rojo neutro

Violeta cristal

Agar

Agua

17,0 g

3,0 g

10,0 g

1,5 g

5,0 g

0,03 g

0,001 g

12 g a 15 ga

1 000 ml a Dependiendo de la concentración de gel del agar

Preparación Se añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente hasta ebullición para disolverlos. Se esteriliza en el autoclave por 15 min a 121 °C. Tras la esterilización, se vierte el agar en cajas de petri (100 mm x 15 mm). El pH debe ser de 7,1 ± 0,2 después de la esterilización.


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4.7 AGAR NUTRITIVO Composición

Extracto de carne 3,0 g

Peptona 5,0 g

Cloruro de sodio 5,0 g

Agar 12 g a 18 ga

Agua 1 000 ml a Dependiendo de la concentración de gel del agar.

Preparación Se añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlos. El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizar, se dispensa el medio en tubos con tapón de rosca. Después de la esterilización, inmediatamente coloque en posición inclinada, de forma que el agar solidifique formando pendiente. Ajustar los tapones después de que se hayan enfriado y conserve en una zona fría y protegida. 4.8 REACTIVOS PARA LA TINCIÓN DE GRAM 4.8.1 Oxalato de amonio - cristal violeta (de Hucker) Se disuelven 2 g de cristal violeta (con un contenido de colorante del 90 %) en 20 ml de alcohol etílico al 95 %; se disuelven 0,8 g de (NH4)2C2O4.H2O en 80 ml de agua destilada; se mezclan ambas soluciones y se deja reposar durante 24 h antes de usarlas; se filtra a través de un papel y se conserva en un frasco de tinción. 4.8.2 Solución de Lugol, modificación de Gramn Se tritura en un mortero, 1 g de cristales de yodo y 2 g de KI. Se añade lentamente agua destilada y se tritura con cuidado después de cada adición hasta que se complete la solución. Se almacena en una botella de vidrio ámbar, añadiendo el resto del agua (usando un total de 300 ml). 4.8.3 Contraste Se disuelven 2,5 g de safranina en 100 ml de alcohol etílico al 95 %. Se añaden de 10 ml a 100 ml de agua destilada. 4.8.4 Alcohol acetona Se mezclan partes iguales de alcohol etílico al 95 % y acetona.


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4.9 CALDO E C + MUG

Composición

Triptosa o tripticasa 20 g

Lactosa 5,0 g

Mezcla de sales biliares o sales biliares No. 3 1,5 g




4-methylumberiferil B D glucoronidasa MUG 0,05 g


Preparación Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, mediante calentamiento si es necesario. Se ajusta el pH, si es necesario, de tal modo que después de la esterilización sea 6,9 +/-2 a 25 °C. Se distribuye el medio, en cantidades de 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 180 mm (véase el numeral 5.4) Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos no deben presentar fluorescencia bajo la luz UV a 366nm No es necesario utilizar tubos invertidos. Las tapas pueden ser metálicas o plásticas resistentes al calor 5. APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO Nota 1. Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable. Equipo usual de laboratorio microbiológico y, en particular, lo siguiente. Véase la NTC 4092 (ISO 7218). 5.1 APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN

HÚMEDO (AUTOCLAVE) Véase la NTC 4092 (ISO 7218). 5.2 INCUBADORA Con capacidad de funcionar a 35 °C ± 2 °C. 5.3 ASAS Hechas de platino/iridio o níquel/cromo o asas desechables.


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5.4 TUBOS DE ENSAYO Con capacidad apropiada para la esterilización y almacenamiento de medios de cultivo y la incubación de medios. 5.5 TUBOS DURHAM Con capacidad de 50 mm x 10 mm 5.6 PIPETAS DE ENTREGA TOTAL Con capacidad nominal de 1ml y 10 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,1 ml y 0,5 ml. 5.7 MEDIDOR DE PH Con capacidad para dar lecturas con aproximación a 0,01 unidades de pH a 25 °C, que permita realizar mediciones con una exactitud de ± 0,1 unidad de pH 5.8 PIPETEADOR 5.9 CAJAS PETRI 6. MUESTREO Para la toma de muestra y muestreo seguir los procedimientos descritos por el Standard Methods Parte 9060 Capítulo 9-17 ó NTC-ISO 5667-3, NTC-ISO 5667-5 y NTC-ISO 5667-14. 7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO Se comienza el examen microbiológico de las aguas máximo 24 h después de su recolección. Si se sabe que el resultado puede ser usado para una acción legal analizar la muestra antes de 6 h, manteniéndola refrigerada y con cadena de custodia 8. PROCEDIMIENTO Véase el diagrama del Anexo A (Normativo). 8.1 MUESTRA DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES

Tabla 1. Preparación del medio líquido de Lauril Triptosa

Inóculo

ml

Cantidad de medio en el

tubo ml

Volumen del medio +

inóculo ml

Medio líquido de lauril triptosa deshidratado

requerido g/l

1 10 10 20 100 100 100

10 o más 10 20 10 50 35 20

11 o más 20 30 30 150 135 120

35,6 71,2 53.4

106,8 106,8 137,1 213,6


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8.2 PRUEBA PRESUNTIVA (Inoculación e incubación) Se agrupan los tubos de fermentación en hileras de cinco o diez en una gradilla para tubos de ensayo. El número y el volumen de los tubos de muestra seleccionados dependen de la cantidad y de las características del agua que se vaya a estudiar. Para agua potable: se utilizan cinco porciones de 20 ml o diez porciones de 10 ml, o una sola botella de 100 ml. Si se trata de agua no potable: se utiliza cinco tubos por dilución (de 10 ml, 1 ml, 0,1 ml, etc.). Se agita vigorosamente la muestra y las diluciones unas 25 veces. Se inocula cada tubo en un grupo de cinco con volúmenes duplicados de muestra (en diluciones decimales crecientes, si se utilizan cantidades decimales de la muestra). Se mezclan las porciones a estudiar mediante agitación suave. Se verifica que en los tubos durham invertidos no halla quedado aire. Se incuban los tubos inoculados o las botellas a 35 °C ± 0,5 °C. Después de 24 h ± 2 h, se agita cada tubo o botella suavemente y se observa si se produce crecimiento, gas o una reacción ácida (color amarillo) y, en caso contrario, se reincuba y se vuelve a examinar al final de 48 h ± 3 h. Se registra la presencia o ausencia de crecimiento, gas y reacción ácida. Si no se ha utilizado el tubo de durham, un crecimiento con acidez significa una presunta reacción positiva. Interpretación. La aparición de gas o ácido en los tubos o botellas dentro de las 48 h ± 3 h constituye una presunta reacción positiva. Los tubos con este tipo de reacción deben ser estudiados en la fase confirmatoria. La ausencia de reacción ácida o de formación de gas al finalizar las 48 h ± 3 h de incubación indica una reacción negativa. Se someten las muestras de agua potable que demuestren crecimiento sin una reacción ácida o formación de gas a la fase confirmatoria. El límite arbitrario de 48 h para la observación excluye sin ninguna duda a los miembros ocasionales del grupo coliforme que crecen de manera muy lenta 8.3 PRUEBA CONFIRMATIVA Se someten todos los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestren crecimiento, cualquier cantidad de gas o reacción ácida dentro de las 24 h ± 2 h de incubación a la fase confirmatoria. Si se observa una fermentación activa o un crecimiento ácido antes de las 24 h ± 2 h, transfiera al medio de confirmación; preferiblemente examine los tubos a las 18 h ± 1 h. Si hay otros tubos o botellas de la fase presuntiva con crecimiento ácido después de las 48 h ± 3 h de incubación, también se llevarán a la fase confirmatoria. Se agitan suavemente o se hacen rotar los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestren gas o crecimiento ácido para que se produzca una resuspensión de los microorganismos. Con una asa estéril de 3,0 mm a 3,5 mm de diámetro, se transfiere un asa completa de cultivo al tubo de fermentación que contiene el medio verde brillante de lactosa bilis o introduzca un aplicador de madera estéril en el cultivo, de al menos 2,5 cm, se retira rápidamente y se introduce hasta el fondo en la botella o el tubo de fermentación con el medio mencionado.


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Se retira y desecha el aplicador. Se repite esta operación para todos los tubos posiblemente positivos. Se incuba el medio de verde brillante lactosa bilis a 35 °C ± 0,5 °C. La formación de cualquier cantidad de gas en el tubo durham invertido en el medio de fermentación verde brillante de lactosa bilis a cualquier tiempo (por ejemplo, 6,0 h ± 1 h, 24 h ± 2 h) dentro de las 48 h ± 3 h constituye un resultado positivo en la fase confirmatoria. Se calcula el NMP a partir del número de tubos positivos en el medio de fermentación verde brillante de lactosa bilis. Procedimiento alternativo. Se usa esta alternativa sólo para aguas contaminadas o residuales que se sepa presenten sistemáticamente resultados positivos. En caso de que todos los tubos sean positivos en dos o más diluciones consecutivas durante 24 h, lleve sólo a la fase confirmatoria los tubos de la dilución más alta (menor muestra de inóculo) en la cual todos los tubos son positivos y algunos tubos positivos en diluciones aún más altas. Se somete a la fase confirmatoria todos los tubos que presenten gas o crecimiento ácido sólo después de las 48 h. 8.4 PRUEBA COMPLETA Para establecer la presencia de bacterias coliformes y obtener datos sobre el control de calidad, se usa la prueba completa sobre por lo menos el 10 % de los tubos positivos confirmados. Simultáneamente, se inocula en medio líquido verde brillante de lactosa bilis para coliformes totales y medio líquido EC para coliformes fecales o puede ser usado medio líquido EC-MUG para Escherichia coli. Se consideran como respuesta positiva de la prueba completa los resultados positivos en caldo medio líquido EC y medio líquido EC-MUG a temperatura elevada (44,5 °C). Los cultivos que sean positivos en medio de verde brillante lactosa bilis y negativos en medio EC y EC-MUG indican la presencia de coliformes no fecales. Se siembra asépticamente una placa de agar LES Endo o agar MacConkey por cada tubo de medio verde brillante lactosa bilis que ha producido gas; se realiza la operación lo antes posible tras la detección del gas. Se siembran las cajas de forma que asegure la existencia de algunas colonias aisladas, separadas por al menos 0,5 cm. Si existen coliformes y se quiere obtener una elevada proporción de aislamientos satisfactorios, se deben tener las siguientes precauciones: (a) Se utiliza un asa estéril de 3 mm de diámetro o una aguja de inoculación ligeramente curvada en la punta; (b) se abre e inclina el tubo de fermentación evitando la toma con la aguja de cualquier membrana o espuma; (c) se introduce el extremo del asa o la aguja en el líquido del tubo a una profundidad de alrededor de 0,5 cm, y (d) se siembra la caja con la parte curvada de la aguja en contacto con el agar para no arañar la superficie. Se flamea el asa entre los cuadrantes segundo y tercero para mejorar el aislamiento de las colonias.


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Se incuban las cajas invertidas a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h. Las colonias que se desarrollan en el agar LES Endo pueden definirse como típicas (rosas a rojo oscuras con un brillo verde metálico superficial) o atípicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) a las 24 h de incubación. Las colonias típicas de la fermentación de la lactosa desarrolladas sobre el agar MacConkey son rojas y pueden estar rodeadas por una zona opaca de precipitado biliar. Se toma de cada caja una o más colonias típicas bien definidas o, si no existen, dos o más entre las que se consideren como probablemente formadas por microorganismos del grupo coliforme y se las pasa a un tubo de fermentación con medio de lauril triptosa y a uno con agar en inclinado (este último no es necesario si se trata de muestras de agua potable). Si es necesario, utilice una lupa para colonias a fin de conseguir un aumento óptimo a la hora de tomarlas de las cajas de agar LES Endo o agar MacConkey. Cuando se transfiera las colonias, se eligen las que estén bien aisladas y se toca apenas su superficie con una aguja esterilizada a la llama, enfriada al aire para evitar en lo posible el peligro de transferir un cultivo mixto. Se incuban los tubos con el medio secundario (medio líquido de lauril triptosa con tubos durham de fermentación invertidos) a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h; si no se produce gas en este período se prolonga la incubación hasta 48 h ± 3 h. Se estudian microscópicamente las preparaciones teñidas con Gram y obtenidas en los cultivos de pendiente de agar a las 24 h, correspondientes a los tubos secundarios que muestren gas. Tinción de Gram. Si se trata de muestras de agua potable, se puede prescindir de la tinción de Gramn en la prueba completa, ya que es raro que existan bacterias gramnpositivas y microorganismos esporulados sobrevivientes en este método de detección selectiva. Existen varias modificaciones de la técnica de Gramn. Se utiliza la modificación de Hucker para teñir las extensiones de cultivos puros; se incluye un control para organismos grampositivos y otro para gramnegativos. Se preparan emulsiones ligeras distintas de los crecimientos bacterianos en estudio y de los cultivos de control positivos y negativos sobre el mismo porta, utilizando para ello gotas de agua destilada colocadas en el cristal. Se dejan secar al aire y se fijan pasando el porta sobre una llama, se tiñen por 1 min con la solución de oxalato de amonio cristal violeta. Se enjuaga con agua corriente y se aplica la solución de Lugol durante 1 min. Se lava de nuevo el porta teñido con agua corriente. Se decolora durante aproximadamente 15 s - 30 s con alcohol acetona, manteniendo el porta entre los dedos y deje que el alcohol acetona fluya por la extensión teñida hasta obtener un líquido incoloro. No decolore en exceso. Contraste con safranina durante 15 s, lave con agua corriente, seque con papel absorbente o al aire y examine microscópicamente. Los microorganismos grampositivos son azules y los gramnegativos rojos. Los resultados sólo son aceptables cuando los controles dan la reacción adecuada.


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Interpretación. El resultado positivo de la prueba completa requiere la formación de gas en los tubos secundarios con medio de lauril triptosa en 48 h ± 3 h y la demostración de bacterias alargadas gramnegativas no esporuladas procedentes de los cultivos con agar, lo que demuestra la presencia de un miembro del grupo coliforme. 9. EXPRESIÓN DE RESULTADOS 9.1 PRECISIÓN DE LA PRUEBA DE TUBOS DE FERMENTACIÓN A menos que se estudien numerosas porciones de la muestra, la precisión de la prueba de tubos de fermentación es muy baja. Por ejemplo, si sólo 1 ml es examinado en una muestra que contiene 1 coliforme/ml, casi un 37 % de los tubos de 1 ml pueden producir resultados negativos, debido a la distribución aleatoria de las bacterias en la muestra. Cuando en estas condiciones se utilizan cinco tubos, cada uno con 1 ml de la muestra, se puede esperar un resultado completamente negativo en alrededor de 1 % de las veces. Aunque se utilicen cinco tubos de fermentación, la precisión de los resultados no es muy elevada. Por tanto, hay que tener cuidado a la hora de interpretar el significado sanitario de los resultados de coliformes obtenidos cuando se utilizan pocos tubos con dilución de muestra, sobre todo cuando el número de muestras de una toma es limitado. 9.2 CÁLCULO Y REGISTRO DEL NMP Para calcular la densidad de coliformes, se calcula en términos del Número Más Probable (NMP). Las Tablas 2, 3 y 4 indican los valores del NMP para distintas series de siembras y resultados. En estas tablas se contemplan límites de confianza del 95 % para cada valor del NMP. Si los volúmenes de la muestra utilizados son los contenidos en las tablas, se reporta el valor correspondiente al número de resultados positivos y negativos en las series en forma de NMP/100 ml o se reporta como presencia o ausencia de coliformes totales o fecales. Los volúmenes de muestra indicados en las Tablas 2 y 3 están relacionados de forma más específica con las aguas terminales. La Tabla 4 ilustra los valores de NMP para combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se estudian volúmenes de cinco muestras de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml. En caso de que las series de diluciones decimales sean distintas de las de la tabla, se seleccionan los valores de NMP de la Tabla 4 por la combinación de tubos positivos, calculando de acuerdo con la siguiente fórmula:

ml100/NMPestudiado volumen Mayor

10tabla) la(de NMP del Valor =x

Cuando se utilice más de tres diluciones en series de diluciones decimales, sólo se tomarán los resultados de tres de ellas para calcular el NMP.


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Para seleccionar las tres diluciones por utilizar en la determinación del índice del NMP, se escoje la dilución más alta con resultado positivo entre las cinco estudiadas (no hay ninguna dilución menor que haya dado un resultado negativo) y las dos siguientes diluciones más altas. Se usan los resultados de estos tres volúmenes para calcular el índice del NMP. En el ejemplo siguiente, los resultados de la dilución significativa se dan en negritas. El numerador representa los tubos positivos y el denominador, el total de tubos estudiados; la combinación de positivos indica únicamente el número total de tubos positivos por dilución:

Ejemplo 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml Combinación de positivos

Índice NMP / 100 ml

a 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 5 000

b 5/5 4/5 2/5 0/5 5-4-2 2 200

c 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20

En c, se selecciona las tres primeras diluciones, de manera que se incluya el resultado positivo en la dilución media. Cuando se presenta un caso como el que se muestra a continuación en la línea d, en el que una dilución muestra un positivo mayor que las tres elegidas según la regla general, el resultado se incorpora a la mayor de las diluciones elegidas, como sucede en e:

Ejemplo 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml Combinación de positivos

Índice NMP / 100 ml

d 5/5 3/5 1/5 1/5 5-3-2 1 400

e 5/5 3/5 2/5 0/5 5-3-2 1 400

Si desea resumir en un solo valor de NMP los resultados de una serie de muestras, se recurrirá a la media geométrica o la mediana. En la Tabla 4 se muestran las combinaciones de tubos positivos más probables. Si aparecen combinaciones poco probables con una frecuencia superior al 1 %, hay que pensar que la técnica es inadecuada o que no se ha cumplido por completo el supuesto estadístico en que se basa el cálculo del NMP. El NMP para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras combinaciones de tubos o diluciones, puede calcularse mediante la sencilla fórmula de Thomas:

100tuboslostodosenmuestrademlnegativostuboslosenmuestrademl

positivostubosde.No ml NMP/100 x

x=

Aunque los cálculos del NMP se facilitan para su uso en la prueba de coliformes, también son aplicables para determinar el NMP de cualquier otro microorganismo, siempre que se disponga de los medios de estudio adecuados.


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Tabla 2. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados

positivos y negativos cuando se emplean cinco porciones de 20 ml

Límites de confianza del 95 % (aproximados) No. de tubos que dan reacción positiva de

un total de cinco de 20 ml c/u

Índice NMP/

100 ml Superior Inferior

0 <2,2 0,0 6,0

1 2,2 0,1 12,6

2 5,1 0,5 19,2

3 9,2 1,6 29,4

4 16,0 3,3 52,9

5 >16,0 8,0 Infinito

Tabla 3. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean diez porciones de 10 ml

Límites de confianza del 95 % (aproximados) No. de tubos que dan reacción positiva de

un total de diez de 10 ml c/u

Índice NMP/


0 <1,1 0,0 3,0 1 1,1 0,03 5,9 2 2,2 0,26 8,1 3 3,6 0,69 10,6 4 5,1 1,3 13,4 5 6,9 2,1 16,8 6 9,2 3,1 21,1 7 12,0 4,3 27,1 8 16,1 5,9 36,8 9 23,0 8,1 59,5

10 >23,0 13,5 Infinito


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Tabla 4. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan cinco tubos por dilución (10 ml, 1,0 ml, 0,1 ml)

Límites de confianza del 95 % (aproximados) Combinación de positivos

Índice NMP/


0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0

1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0

2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-3-0

3-0-0 3-0-1 3-1-0 3-1-1 3-2-0 3-2-1

4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1 4-3-0 4-3-1 4-4-0

<2 2 2 4

2 4 4 6 6

4 7 7 9 9

12

8 11 11 14 14 17

13 17 17 21 26 22 26 27 33 34

- 1,0 1,0 1,0

1,0 1,0 1,0 2,0 2,0

1,0 2,0 2,0 3,0 3,0 5,0

3,0 4,0 4,0 6,0 6,0 7,0

5,0 7,0 7,0 9,0 12 9

12 12 15 16

- 10 10 13

11 15 15 18 18

17 20 21 24 25 29

24 29 29 35 35 40

38 45 46 55 63 56 65 67 77 80

Continúa . . .


15

Tabla 4. (Final)

Límites de confianza del 95 % (aproximados Combinación de positivos

Índice NMP/


5-0-0- 5-0-1 5-0-2 5-1-0 5-1-1 5-1-2 5-2-0 5-2-1 5-2-2 5-3-0 5-3-1 5-3-2 5-3-3 5-4-0 5-4-1 5-4-2 5-4-3 5-4-4 5-5-0 5-5-1 5-5-2 5-5-3 5-5-4 5-5-5

23 30 40 30 50 60 50 70 90 80

110 140 170 130 170 220 280 350 240 300 500 900

1600 >1600

9 10 20 10 20 30 20 30 40 30 40 60 80 50 70

100 120 160 100 100 200 300 600

-

86 110 140 120 150 180 170 210 250 250 300 360 410 390 480 580 690 820 940

1300 2000 2900 5300

-

10. INFORME DE ENSAYO En el informe de ensayo se debe especificar el método usado, la temperatura seleccionada, y los resultados obtenidos. También se deben mencionar todos los detalles de las operaciones no especificados en esta norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualesquier incidente que puedan haber influido en los resultados. En el informe de ensayo se debe incluir toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra.

Método B

Técnicas con sutrato enzimático 11. DEFINICION Para los propósitos de este método se aplican las siguientes definiciones: Bacterias Coliformes Totales Cuando se utiliza la técnica enzimática, el grupo Coliforme Total se define como toda bacteria que posea la Enzima β-D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de abrir el substrato cromogénico, resultando en la liberación del cromógeno.


16

Escherichia coli Cuando se utiliza la técnica enzimática, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que da respuesta positiva al grupo Coliforme Total y además posee la enzima β-glucoronidasa, la cual tiene la propiedad de abrir el substrato fluorogénico, resultando en la liberación del fluorógeno. 12. PRINCIPIO Bacterias Coliformes Totales Substratos cromogénicos tales como Orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosido (ONPG) o clorofenol rojo β-D-galactopiranósido (CPRG) son utilizados para detectar la enzima β-D- galactosidasa la cual es producida por las Bacterias Coliformes Totales. La enzima β-D-galactosidasa hidroliza el substrato y produce un cambio de color, lo cual indica una prueba positiva para Coliformes totales en 24 h (ONPG) o 28 h (CPRG) sin procedimientos adicionales. Escherichia coli Un substrato fluorogénico tal como 4-metil-umbeliferil-β-D-glucoronido (MUG) es utilizado para detectar la enzima β-glucoronidasa la cual es producida por E.coli. La enzima β-glucoronidasa hidroliza el substrato y da un producto fluorescente cuando es revelado bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm). La presencia de fluorescencia indica una prueba positiva para E.coli. El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnología del substrato definido, el cual emplea nutrientes - indicadores que producen color y/o fluorescencia al ser metabolizados por los microorganismos Coliformes Totales y E coli; los cuales son detectados simultáneamente. El reactivo proporciona dos nutrientes indicadores específicos: ONPG (O- nitrofenil -β-d- galactopiranósido) y MUG ( 4-metil-umbeliferil-β- D- glucorónido). Durante la metabolización de éstos nutrientes por la enzima Coliforme β-D galactosidasa y β- glucoronidasa de E. coli, se produce un color amarillo (del ONPG) y fluorescencia (del MUG). Con lo cual queda confirmada la presencia de Coliformes totales y de E coli respectivamente. Interferencias La técnica del substrato enzimático ONPG-MUG tiene limitaciones, particularmente en aguas con alta turbiedad; para tales aguas es conveniente hacer diluciones con agua destilada estéril. Además, si la muestra tiene un color de fondo, se debe comparar bolsas o tubos según el formato utilizado, que contienen muestra con medio de cultivo inoculado, contra un blanco de control de la misma muestra de agua y para este caso se recomienda usar CPRG-MUG. Bacterias no Coliformes tales como Aeromonas y especies de Pseudomonas, pueden producir pequeñas cantidades de la enzima β- D-galactosidasa, pero son suprimidas y generalmente no producen una respuesta positiva dentro del tiempo de inoculación a menos que estén presentes mas de 104 UFC/ml. Algunas cepas de Shigella spp también pueden producir una respuesta positiva a la fluorescencia, pero debido a que este microorganismo es un conocido patógeno humano, se considera que no va en detrimento para la prueba de calidad sanitaria de agua.


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13. EQUIPOS Y MATERIALES 13.1 Autoclave 13.2 Cabina de flujo laminar 13.3 Incubadora a 35,5 °C ± 0,5 °C 13.4 Pipetas Bacteriológicas estériles de 0,1 ml, 1 ml y 10 ml 13.5 Frascos o bolsas estériles de 100 ml 13.6 Tubos tapa rosca ó Bolsas multiceldas 13.7 Sellador para bolsas multiceldas 13.8 Pipeteador 13.9 Lámpara UV de 366 nm y 6 watios de intensidad 14. MEDIOS DE CULTIVO Medio substrato Comercialmente se encuentran formulaciones predispensadas para el procedimiento de tubos múltiples o de botellas por 100 ml para el ensayo presencia ausencia. 15. PROCEDIMIENTO 15.1 PROCEDIMIENTO DE TUBOS MÚLTIPLES Se selecciona el número apropiado de tubos por muestra con medio predispensado para prueba de tubos múltiples. Se siguen las instrucciones del fabricante para preparar seriales de diluciones para varias formulaciones. Asépticamente, se agregan 10 ml de muestra a cada tubo, se tapa ajustadamente y se mezcla vigorosamente para disolver. La mezcla permanece sin color con la prueba con base en ONPG y se torna amarilla en el formato CPRG. Algunas partículas pueden permanecer indisolubles durante la prueba; esto no afecta el comportamiento del ensayo. Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por el periodo especificado por el fabricante del substrato. El procedimiento también puede desarrollarse agregando la cantidad apropiada de substrato a la muestra, mezclando completamente y dispensando en 5 o 10 tubos estériles. Se incuba como se establece para el procedimiento de tubos múltiples, utilizando las series establecidas en el Método A.


18

15.2 PROCEDIMIENTO MULTICELDA El procedimiento multicelda es desarrollado con paquetes desechables estériles de medio. Se agrega la muestra a un recipiente de 100 ml, luego se agrega el substrato, se agita vigorosamente y se vierte dentro de la bolsa. El sellador de bolsa dispensa la muestra dentro de los pozos y la sella. Se incube a 35 °C ± 0,5 °C por el período especificado por 24 h. El valor del NMP es obtenido de la tabla suministrada por el fabricante. 15.3 PROCEDIMIENTO PARA PRESENCIA/AUSENCIA (P/A) Asépticamente, se agrega el medio enzimático previamente pesado a 100 ml de muestra ,en un recipiente de vidrio borosilicato no fluorescente y estéril o en una botella equivalente. Opcionalmente, se agrega 100 ml de muestra al substrato enzimático, en un recipiente estéril suministrado por el fabricante. Asépticamente, se tapa y se mezcla completamente para disolver el substrato. Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por 24 h. 16. INTERPRETACIÓN Bacteria Coliforme Total Después del período de incubación mínima apropiada se examinan los tubos o los recipientes para el cambio de color apropiado (véase la Tabla 5). El ONPG es hidrolizado por la enzima de la bacteria para producir un color amarillo. El CPRG es hidrolizado por la enzima de la bacteria para producir un color rojo o magenta. Si la respuesta de color no es uniforme a través del tubo ó la bandeja multicelda, se mezcla invirtiéndolo antes de leer. Se leen las instrucciones del fabricante como guía para la interpretación. Algunos fabricantes sugieren comparar los tubos ó bandeja multiceldas de muestra contra un comparador de color disponible suministrado por el fabricante. Las muestras son negativas para Coliformes totales si no se observa color en el ensayo con ONPG o si el tubo es amarillo cuando se utiliza CPRG. Si hay una respuesta cromogénica cuestionable después de 18 h o de 24 h para ONPG, se incuba por un tiempo adicional de 4 h. Si la respuesta es negativa después de 28 h para el CPRG se incuba hasta por un tiempo adicional de 20 h. Si el cromógeno se intensifica la muestra es positiva para Coliformes Totales. Si no la muestra es negativa. Escherichia coli Se examinan los tubos positivos de Coliformes totales o los recipientes para fluorescencia usando una lámpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios, de onda larga (366 nm). Se compara cada tubo ó bandeja multicelda contra el comparador de referencia disponible. La presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli. Si la fluorescencia es cuestionable se incuba por un periodo adicional de 4 h para la prueba con ONPG y hasta por un periodo adicional de 20 h para las pruebas con CPRG; la fluorescencia intensificada es una prueba de resultado positivo. 17. INFORME DEL ENSAYO Si se desarrolla un procedimiento tubos múltiples, calcule el NMP para Coliformes totales y E. coli del numero de tubos positivos como se describe en el numeral 9. Si se desarrolla el procedimiento de bandeja multiceldas, calcule el NMP para Coliformes y E. coli tomando como referencia la tabla suministrada por el fabricante. Si se sigue un procedimiento de presencia ausencia, se reportan los resultados como presencia/ausencia de Coliformes totales y E. coli en 100 ml de muestra.


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Tabla 5 Cambios de Color para varios medios

Substrato Coliforme Positivo E. Coli Positivo Resultado Negativo

ONPG- MUG Amarillo Azul fluorescente Color demasiado pálido/ No fluoresce

CPRG- MUG Rojo o Magenta Azul fluorescente Amarillo/ No fluoresce

18. CONTROL DE CALIDAD Se prueba el comportamiento de cada lote de medio adquirido, inoculando con tres baterías de control: Escherichia coli, una Coliforme total diferente a E. coli (por ejemplo Enterobacter cloacae) y una no Coliforme. También, se agrega un control de agua estéril. Si el control de agua estéril presenta tinte fluorescente o tinte de resultado positivo Coliforme se descarta y se utiliza un nuevo lote de substrato. Se debe evitar utilizar un inóculo pesado. Si se utiliza Pseudomonas como el no Coliforme se selecciona una especie no fluorescente. Se incuba estos controles a 35 °C ± 0,5 °C como se indicó antes. Se lee y se registra los resultados. 19. APÉNDICE 19.1 NORMAS QUE SE DEBEN CONSULTAR Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante la referencia dentro de este texto, constituyen la integridad del mismo. En el momento de su publicación eran válidas las ediciones indicadas. Todas las normas están sujetas a actualización; los participantes, mediante acuerdos basados en esta norma, deben investigar la posibilidad de aplicar la última versión de las normas mencionadas a continuación. NTC 4092:1997, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para los análisis microbiológicos. (ISO 7218:1997). NTC-ISO 5667-3:1995 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Muestreo. Directrices para la Conservación y manejo de las muestras. NTC-ISO 5667-5:1996 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Guía para el muestreo de agua potable y agua utilizada para alimentos y procesamiento de bebidas. NTC-ISO 5667-14:1999 Calidad de agua muestreo. Parte 14: Guía para el control de la calidad en el muestreo y en el manejo ambiental del agua. 19.2 DOCUMENTO DE REFERENCIA AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION; WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods For The Examination of Water and Wastewater, 20 TH EDITION.1998.Washington Multiple Tube Fermentation Technique for Members of the Coliform Group (SM 9921) and Enzyme Sustrate Coliform Test (SM 9223).


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Anexo A (Normativo )

Esquema de las pruebas presuntiva, confirmativa y completa para la detección de coliformes totales

Inocular caldo lauril triptosa o caldo presencia asencia en tubos defermentación o botellas e incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C

(1) Producción de gas y/o crecimiento ácido.Transferir a fase confirmatoria a caldo bilis lactosaverde brillante. Incubar 48 +/- horas a 35 +/- 0,5°C

(2) Ausencia de gas o ácido.Incubación adicional 24 horas

(total 48 +/- 3 horas)

(a) Gas producido. Transferir a agarLES Endo o agar MacConkey.

Incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C

(b) No gas producido.Prueba negativa. Grupo

coliforme ausente.(a) Gas o ácido producido.

continue en (1a)

(b) Crecimiento ácidoConfirmar como en (1)

(c) no producción de ácido y gas. Prueba negativa

Grupo coliforme ausente

(1,2) Colonias negativas.Grupo coliforme ausente

(1,1) Colonias de coliformes típicas o atípicas. Transferir a agar blando y tubos de

fermentación con caldo lauril triptosa. Incubar agar blando 18 a 24 h y caldo lauril triptosa

de 24 +/- 2h a 48 +/- 3h a 35 +/- 0,5°C

(b') Ausencia de gas.Prueba negativa

Ausencia de grupo coliforme.

(a') Producción de gas.teñir con gran parte

del crecimiento en agar blando

(1,11) Presencia de bacilos gramnegativos. Ausencia de esporas. Prueba completa:

presencia de grupo coliforme.Presencia de bacilos gramnegativos y

grampositivos. Repetir el procedimiento comenzando en 1,1

(1,12) Presencia de esporas o esporas y bacilos grampositivos. Prueba completa:

Ausencia de grupo coliforme

ntc 4939

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coliformes y escherichiacoli

coliformes y escherichia

los tubos confirmados

h y anlisis deestos

bogotpurificacin y anlisis

regionales y nacionales

carulla y ca

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