ntc 1232 metodo de analisis de as de ocurrencia natural

8/6/2019 NTC 1232 Metodo de Analisis de as de Ocurrencia Natural

1/11

NORMA TCNICA NTC COLOMBIANA 1232

1996-10-23

MTODO DE ANLISIS DE AFLATOXINAS DEOCURRENCIA NATURAL (B1, B2, G1 Y G2)

E: ANALYSIS METHOD FOR AFLATOXINS OF NATURALOCURRENCE

CORRESPONDENCIA:

DESCRIPTORES: cereal en grano; granos; productovegetal.

I.C.S.: 67.060.00; 65.120.00

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproduccin Primera actualizacinEditada 2001-09-11


2/11

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin,ICONTEC, es el organismo nacionalde normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.

El ICONTECes una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamentalpara brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sectorgubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en losmercados interno y externo.

La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnicaest garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimocaracterizado por la participacin del pblico en general.

La NTC 1232 (Primera actualizacin) fue ratificada por el Consejo Directivo el 96-10-23.

Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda entodo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travsde su participacin en el Comit Tcnico.

AGREVO - SEMILLAS TROPICALESBASF DE COLOMBIABOLSA NACIONAL AGROPECUARIACONCENTRADOS RAZACONTEGRALFINCAINSTITUTO DE MERCADEOAGROPECUARIO

INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIOMEJA Y CANESTLNULABNUTRIANLISISSOLLA S.A.UNIVERSIDAD NACIONAL

Adems de las anteriores, en consulta pblica el proyecto se puso a consideracin de lassiguientes empresas:

ANDI

BAYERFEDERACIN NACIONAL DECULTIVADORES DE PALMAGRASAS S.A.LUCTA GRAN COLOMBIANAASOHUEVO

FEDERACIN NACIONAL DE MOLINEROS

DE TRIGOINDUSTRIAS DEL MAZMINISTERIO DE AGRICULTURABAVARIA S.A.FEDERACIN NACIONAL DECULTIVADORES DE CEREALESLLOREDA GRASAS

El ICONTECcuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesadosnormas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN


3/11

NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 1232 (Primera actualizacin)

1

MTODO DE ANLISIS DE AFLATOXINAS DE OCURRENCIANATURAL (B1, B2 G1 Y G2)

1. OBJETO La presente norma establece un mtodo de anlisis de aflatoxinas de ocurrencia natural (B1,B2, G1 y G2) en granos, cereales y alimentos balanceados de consumo animal utilizando latcnica analtica conocida como cromatografa lquida de alta eficiencia o HPLC (High-performance liquid chromatography). Alternativamente se ofrece un mtodo por cromatografaen capa delgada o TLC (Thin-layer chromatography).

2. PRINCIPIO

Las aflatoxinas (AF) se extraen con una mezcla de acetonitrilo: agua (84 + 16) y se purificancon una columna multifuncional de limpieza. Luego de evaporar el extracto bajo una corrientede nitrgeno, las AFB1 y AFG1 se derivatizan a sus correspondientes hemiacetales (AFB2a yAFBG2a) con cido trifluoroactico. La separacin de las cuatro Aflatoxinas [B1 (B2a), B2, G1(B2a) y G2] se hace en una columna cromatogrfica de fase reversa (RP - 18). Las Aflatoxinasse detectan finalmente y se cuantifican mediante un espectrofotmetro de fluorescenciaacoplado a un integrador-graficador, utilizando un mtodo de cuantificacin por estndarexterno.

3. APLICACIONES DEL MTODO

El mtodo se ha utilizado en los siguientes substratos: maz, sorgo, arroz, torta de algodn,torta de soya, harina de yuca, subproductos de trigo, alimentos concentrados, gluten de maz,man, almendras, pistachos y pasta de breva. Si se requiere analizar un substrato diferente alos anteriores se sugiere hacer una revalidacin del mtodo, con el fin de determinar si seprecisa hacer modificaciones al mtodo.


4/11


2

4. MTODO POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

4.1 APARATOS Y MATERIALES

4.1.1 Columna de limpieza

El material de empaque de la columna debe tener sitios activos lipoflicos y un intercambiadorinico. El material se coloca en un tubo plstico de 6 ml (1,0 cm x 10 cm) con un reborde decaucho en su extremo inferior y un filtro poroso en el centro del reborde. Sobre el filtro porosodebe ir una vlvula que permite el flujo de lquido en una sola direccin (Columna Mycosep 224MFC o equivalente).

4.1.2 Cromatgrafo de lquidos

a) Inyector con capacidad de introducir 50 l al sistema

b) Bomba cromatogrfica con capacidad de bombear la fase mvil a razn de 1 ml/minc) Columna cromatogrfica de fase reversa (C18) (Supelcosil RP-18 de 25 cm x 4,6 mm

o equivalente)

d) Detector de fluorescencia de longitudes de onda variables. Condiciones deoperacin: excitacin 360 nm, emisin 440 nm. (Perkin Elmer 650-15 oequivalente)

e) Horno cromatogrfico con capacidad para regular una temperatura constante de lacolumna en 50 C

f) Integrador-graficador.

4.1.3 Agitador de vaivn

4.1.4 Bao termostatado con capacidad de regular una temperatura de 65 C.

4.1.5 Evaporador de nitrgeno (ReactiVap Pierce o equivalente).

4.1.6 Papel de filtro cualitativo de 25 cm de dimetro (Whatman No. 4 o equivalente).

4.1.7 Pipetas de 5 ml de capacidad.

4.1.8 Tubos de ensayo de vidrio borosilicato de 15 mm x 85 mm.

4.1.9 Micropipeta de volumen variable con capacidad de medir volmenes de 10l a 100l.

4.1.10 Viales para derivatizacin de 2 ml de capacidad con tapa rosca recubierta de tefln.

4.2 REACTIVOS

4.2.1 Solvente de extraccin

Se mezclan 840 ml de acetonitrilo grado reactivo analtico con 160 ml de agua destilada.


5/11


3

4.2.2 Solucin de derivatizacin

Se mezclan 10 ml de cido trifluoroactico (grado reactivo analtico) con 5 ml de cido acticoglacial (grado reactivo analtico) y 35 ml de agua destilada. Este volumen es suficiente pararealizar 70 derivatizaciones.

4.1.3 Fase mvil

Se mezclan 600 ml de agua grado HPLC con 400 ml de metanol grado HPLC. Se filtran a travsde membrana de 0,45 m de dimetro de poro y se desgasifica antes de usar.

4.1.4 Soluciones estndar de aflatoxinas

Sigma A-1022, la cual contiene las siguientes cantidades de aflatoxinas en forma de pelculadesecada: AFB1:25g; AFG1:25g; AFB2: 7,5g de AFB2; AFG2: 7,5g.

Preparacin de la solucin madre: se disuelve el contenido del vial con 5,0 ml de benceno:CH3CN (98 + 2) para obtener las siguientes concentraciones de aflatoxinas: 5 g/ml de AFB1;1,5 g/ml de AFB2; 5g/ml de AFG1; 1,5g/ml de AFG2.

Preparacin de la solucin de trabajo: se toman 400l de la solucin madre y se llevan a un vialmbar silanizado de 40 ml. Se evaporan a sequedad el solvente en corriente de nitrgeno yredisolver con 40 ml de acetonitrilo grado HPLC. La concentracin final de aflatoxinas: 50 ng/mlde AFB1; 50 ng/ml de AFG1; 15 ng/ml de AFG2 y 15 ng/ml de AFB2.

Preparacin del estndar de calibracin (estndar externo de cuantificacin):

a) Se colocan 200 l de solucin estndar de trabajo en un vial mbar deautomuestrador (preferiblemente silanizado)

b) Se aaden 700 l de reactivo de derivatizacin.

c) Se calienta a 65 C durante 10 min en bao termostatado. Se deja enfriar atemperatura ambiente y se inyectan 50 l en el cromatgrafo de lquidos.

4.3 PROCEDIMIENTO GENERAL

4.3.1 Extraccin

1) En un erlenmeyer de 250 ml con tapn esmerilado o tapa rosca, se mezclan 50 gde muestra adecuadamente molida (Molino Romer Serie II o equivalente) con100 ml de solvente de extraccin (CH3CN: agua 84 + 16) durante 1 h en agitadorde vaivn (alternativamente, se homogeneiza la muestra y el solvente durante3 min en una licuadora empleando un vaso de vidrio de 250 ml de capacidad).

Nota. Se recomienda pesar la mitad de la muestra (25 g) cuando se realicen anlisis de harina dearroz, harina de yuca, torta de algodn, torta de soya y subproductos de trigo.


6/11


4

2) Se filtra a travs de papel cualitativo y se recogen cerca de 5 ml de filtrado en untubo de ensayo de 10 ml.

4.3.2 Purificacin del extracto

3) Se inserta lentamente el extremo con el reborde de caucho de la columna delimpieza (Columna Mycosep 224 MFC o equivalente) en el tubo de ensayo y sepresiona hasta obtener cerca de 0,5 ml de extracto purificado en el interior de lacolumna.

4) Se transfieren cuantitativamente 0,5 ml del extracto purificado a un vial de fondocnico de 2 ml de capacidad (preferiblemente silanizado) y se evapora asequedad bajo una corriente suave de nitrgeno (ReactiVap Pierce o equivalente).

5) Se redisuelve el residuo seco con 200l de acetonitrilo.

4.3.3 Derivatizacin

6) Se aaden 700 l de reactivo de derivatizacin.

7) Se calienta a 65 C durante 10 min en bao termostatado. Se deja enfriar atemperatura ambiente.

4.4 HPLC

8) Se filtra a travs de membrana de 0,45m (Millipore HVLP 1300 o equivalente) yse inyectan 50 l en el cromatgrafo de lquidos.

Nota. Las AFB2A y AFBG2a son inestables (especialmente en metanol). Los extractos derivatizados se deben inyectarrpidamente para evitar la degradacin de las aflatoxinas.

Clculos ng/g de aflatoxina en la muestra = C/W

Donde:

C = ng de aflatoxina inyectada en la columna cromatogrfica (en los 50 l =0,5555 ng)

W = equivalente en peso de la muestra inyectada (50l), lo cual se calcula con lasiguiente frmula:

W = 50 g x (0,5 ml/100 ml) x (0,05 ml/0,90 ml) = 0,01385 g

Lmite de deteccin de la tcnica: 1 ng/g de cada aflatoxina


7/11


5

5. TCNICA POR CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA (TLC)

5.1 APARATOS Y MATERIALES

1) Columna de limpieza: el material de empaque de la columna debe tener sitiosactivos lipoflicos y un intercambiador inico. El material se coloca en un tuboplstico de 6 ml (1,0 cm x 10 cm) con un reborde de caucho en su extremo inferiory un filtro poroso en el centro del reborde. Sobre el filtro poroso debe ir una vlvulaque permite el flujo de lquido en una sola direccin (columna Mycosep 224 MFC oequivalente)

2) Bomba de vaco

3) Balanza con sensibilidad 0,1 g

4) Cabina con lmpara de luz ultravioleta (254 y 366 nm)

5) Cabina de extraccin de vapores y gases

6) Cmaras en vidrio para desarrollo de cromatoplacas de 20 x 20 cm

7) Cmaras en vidrio para desarrollo de cromatoplacas de 10 x 10 cm

8) Densitmetro con detector U.V y fluorescencia

9) Estufa de circulacin forzada (graduacin con temperatura hasta 180C).

10) Jeringa cromatogrfica graduada de 50 l.

11) Agitador de vaivn

12) Bao termostatado con capacidad para regular una temperatura de 65 C

13) Evaporador de nitrgeno (reactiVap Pierce o equivalente)

14) Papel de filtro cualitativo de 25 cm de dimetro (Whatman No. 4 o equivalente)

15) Pipetas de 5 ml de capacidad

16) Tubos de ensayo de vidrio borosilicato de 15 mm x 85 mm

17) Micropipeta de volumen variable con capacidad para medir de 10 l a 100 l

18) Viales para derivatizacin de 2 ml de capacidad con tapa rosca recubierta detefln.

5.2 REACTIVOS

- Solvente de extraccin: se mezclan 840 ml de acetonitrilo grado reactivo analticocon 160 ml de agua destilada.


8/11


9/11


7

5.3.5 Interpretacin de los resultados

Semicuantitativos

Se colocan las placas en la cmara de luz UV. Se compara los valores Rf del estndar y la muestra.

Se busca el estndar aplicado de fluorescencia similar a la fluorescencia de muestra. Se reportanlos resultados como4 g/kg.

muestra peso.aplic.ext lextracto finalvolumeninconcentracmuestraeequivalent estndar del

g / ng

=

Cuantitativo

Utilizando un densitmetro se realiza la curva de calibracin aplicando cuatro estndares 2 l, 5 l,10 l, 15 l de la muestra y se reportan losg/kg de la muestra.

Calibracin de los estndares

Clculo de absortividad molar y factor de correccin (CF)

En espectrofotmetro se determina la absorbancia de tres soluciones de K2Cr2O7 en H2SO4

Solucin 1: 0,25 mM

Solucin 2: 0,125 mM

solucin 3: 0,0625 nM

Se determina la absorbancia (A) a 350 nm utilizando como blanco una solucin de 0,0018 N deH2SO4 en agua.

Se calcula ? mediante la ecuacin:

= (A X 1 000)/concentracin en mM

Para determinar el factor de correccin CF, se reemplaza en la ecuacin CF = 3160/

Clculo de la concentracin de estndares de aflatoxinas en benceno:acetonitrilo (98:2)(aplicable a estndares independientes a AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2).

Se realiza para el espectro para establecer la mxima absorbancia entre 330 nm - 370 nm secalcula:

= )CF x MW A(mL

aflatoxinag0001


10/11


8

Donde:

A = lectura del espectrofotmetro

MW y = tomados segn la siguiente tabla

Aflatoxina MW B1 312 19,800B2 314 20,900G1 328 17,100G2 330 18,200

Tambin se pueden adquirir estndares preparados.


11/11


9

Anexo A (Informativo)

Bibliografa

DAZ, G.J. 1995. Anlisis de aflatoxinas por cromatografa lquida de alta eficiencia. Mtodos deanlisis del Laboratorio de Toxicologa de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia.Universidad Nacional de Colombia.

HOLCOLB, M., WILSON, D.M., TRUCKSESS, M.W. 6 THOMPSON, H.C. 1992 Determination ofAflatoxins in Food Products by Chromatography. Journal of Chromatography, 624:341-352.

PARK, D.L., S. NESHEIM, S., TRUCKSESS, M.W., STACK & R.F. NEWELL. 1990. LiquidChromatographic Method for Determination of Aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in corn and PeanutProducts: Collaborative Study. J Assoc. Off. Anal. Chem., 73:260-266.

TRUCKSESS, M.W., STACK, M.E., M.E., NESHEIM, S., ALBERT, R.H. & ROMER, T.R. 1994.Multifunctional Column Coupled with Liquid Chromatography for Determination of Aflatoxins B1,B2, G1, and G2 in corn Almonds, Brazil nuts, Peanuts, and Pistachic Nuts: Collaborative Study J.of AOAC Int., 77: 1512-1521

WILSON, T.J. & ROMER, T.R. 1991. Use of Mycosep Multifunctional Cleanup Column for LiquidChromatographic Determination of Aflatoxins in Agricultural Produts. J. Assoc. Off. Anal. Chem.74:951-956.

ntc 1232 metodo de analisis de as de ocurrencia natural

Documents