novaseq 6000 sequencing system 가이드(1000000019358) - … · 2020. 11. 15. ·...

NovaSeq 6000Sequencing System가이드

문서번호 1000000019358 v11 KOR 자료번호 20023471

2019년 2월

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개정내역문서 날짜 변경사항 설명

자료 번호 20023471문서 번호1000000019358 v11

2019년2월

Xp 워크플로우에 대한 라이브러리 풀 Plexity 표를 업데이트했습니다.

자료 번호 20023471문서 번호1000000019358 v10

2019년1월

SP 플로우 셀 정보를 추가했습니다.표준 및 Xp 워크플로우에 대한 권장 라이브러리 풀 Plexity 표를 업데이트했습니다.

자료 번호 20023471문서 번호1000000019358 v09

2018년11월

NovaSeq 6000 지원 페이지 링크를 수정했습니다.누락된 경고를 수정했습니다.

자료 번호 20020483문서 번호1000000019358 v08

2018년9월

NovaSeq 6000 S4 Kit(200개 사이클) 정보가 추가되었습니다.사용자 계정 정보가 추가되었습니다.단일 셀 로드 농도가 추가되었습니다.시간차 런 시작 지침이 업데이트되었습니다.BaseSpace 로그인 지침이 업데이트되었습니다.프리 런 검사 지침이 업데이트되었습니다.종료 또는 재시작 요건에 대한 참고 사항이 추가되었습니다.불완전한 포스트 런 세척에 대한 참고 사항이 추가되었습니다.관리세척 정보를 명확히 했습니다.소프트웨어 업데이트 정보를 명확히 했습니다.

자료 번호 20020483문서 번호1000000019358 v07

2018년4월

시퀀싱 전에 부스트 단계에서 시약을 혼합하는 라이브러리 튜브 사용을 명확히 했습니다.소모품 또는 소모품 패키지에 표시된 기호에 대한 기호 설명 표가 추가되었습니다.Run Setup(런 설정) 모드 섹션에 Illumina Proactive 모니터링 서비스에 대한 정보가 추가되었습니다.NovaSeq LIMS API에 대한 정보가 추가되었습니다.NovaSeq Control Software v1.4.0에 대한 소프트웨어 설명이 업데이트되었습니다.S2 플로우 셀의 필터를 통과하는 일반적인 리드 수가 업데이트되었습니다.NovaSeq Xp 워크플로우의 권장 로드 농도가 업데이트되었습니다.플로우 셀 패키지를 여는 지침이 업데이트되었습니다.라이브러리를 플로우 셀에 로드하는 절차를 명확히 했습니다.기기를 사용하여 관리세척을 시작할 수 있는지 여부에 대한 참고 사항이추가되었습니다.시간차 시작 카운트다운 타이머에 대한 정보가 추가되었습니다.SRP 규칙의 추가 또는 삭제 방법에 대한 지침이 업데이트되었습니다.

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문서 날짜 변경사항 설명

문서 번호1000000019358 v06

2018년2월

플로우 셀 섹션에 S1 플로우 셀을 사용할 때 소프트웨어 버전 1.3.1이 필요하다는 참고 사항이 추가되었습니다.라이브러리 로드 방법의 표에서 설명 및 표준 용량이 업데이트되었습니다.Reagent Kit 구성요소에 주의가 추가되었습니다.0.5 및 1.5ml 튜브와 20, 200, 1000ul 파이펫의 파이펫 끝이 소모품 표에 추가되었습니다. 장비 표에 눈금 실린더가 추가되었습니다.4장 및 5장에 플로우 셀 준비 섹션이 추가되었고 6장의 단계가 이 섹션으로 이동되었습니다.4장에서 S1 플로우 셀의 총 용량이 업데이트되었습니다.권장 라이브러리 풀 플렉시티 표가 4장의 정규화된 라이브러리 풀 생성에추가되었습니다.4장 및 5장에서 SBS 및 클러스터 카트리지 해동 단계가 업데이트되었습니다.플로우 셀 준비에서 해동 지침을 명확히 했습니다.NovaSeq Xp 권장 로드 농도에서 해동 정보가 업데이트되었습니다.5장의 정규화된 라이브러리 풀 생성에서 권장 라이브러리 풀 플렉시티 표가 업데이트되었습니다.NovaSeq Xp 워크플로우 요약 및 플로우 셀 준비에 플로우 셀을 삭제한 후에 12시간 이내에 사용해야 한다는 것을 명확히 하는 문장이 추가되었습니다.

문서 번호1000000019358 v05

2017년12월

시퀀싱 워크플로우 다이어그램에 Xp용 빈 라이브러리 튜브에 대한 명확한설명이 추가되었습니다.Standard 워크플로우에 대한 라이브러리 및 옵션 PhiX 컨트롤 변성의 5단계에서 표에 나와 있는 Tris-HCI 용량이 업데이트되었습니다.NovaSeq Xp 워크플로우에 대한 ExAmp 마스터 믹스 준비의 4단계 다음에최상의 결과를 얻으려면 흔들어야 한다는 참고 사항이 추가되었습니다.NovaSeq Xp 워크플로우에 대한 플로우 셀에 라이브러리 로드의 3단계 다음에 샘플을 천천히 로드하라는 알림이 추가되었습니다.

자료 번호 20023471문서 번호1000000019358 v04

2017년10월

기기 기능 목록에 개별 레인 로드가 추가되었습니다.소모품 - NovaSeq Xp 2-Lane Kit 및 NovaSeq Xp 4-Lane Kit가 추가되었습니다. NovaSeq Xp 2-Lane Manifold Pack 및 NovaSeq 4-Lane ManifoldPack이 추가되었습니다.장비 - NovaSeq Xp 플로우 셀 도크 및 NovaSeq Xp 워크플로우용 P200 파이펫이 추가되었습니다.NovaSeq Xp 워크플로우에 대한 소모품 준비 챕터가 추가되었습니다.사용된 시약병 비우기가 시퀀싱 장에서 NovaSeq Standard 워크플로우 및NovaSeq Xp 워크플로우 장의 앞부분으로 이동되었습니다.Standard 워크플로우에 대한 풀링된 라이브러리 농도 표 및 권장 로드 농도 표가 업데이트되었습니다.

문서번호 1000000019358 v11 KOR 자료번호 20023471

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문서 날짜 변경사항 설명

자료 번호 20020483문서 번호1000000019358 v03

2017년9월

S1 및 S4 플로우 셀에 대한 지원이 포함되도록 NovaSeq Control Softwarev1.2에 대한 소프트웨어 설명이 업데이트되었습니다.S1 및 S4 플로우 셀의 듀얼 플로우 셀 런을 위한 디스크 공간 요건이 추가되었습니다.특정 *.json 파일의 이름 지정 요건이 명시되었습니다.키트 및 액세서리 장에서 키트 개요 정보가 재구성되었습니다. 이 챕터에서는 시약 및 라이브러리 로드 키트의 구성, 구성요소, 호환성 라벨을 다룹니다.NovaSeq 6000 Reagent Kit가 사용자가 준비해야 하는 소모품에 추가되었습니다.S1 및 S4 플로우 셀의 정보를 포함하도록 라이브러리 풀링 및 변성 지침이업데이트되었습니다.S1 및 S2의 경우 2시간, S4의 경우 4시간 동안 욕조에 담가야 한다는 내용을 포함하도록 시약 카트리지 해동 지침이 업데이트되었습니다.S4 구성요소를 포함하도록 라이브러리 튜브, 시약 카트리지 및 플로우 셀에 대한 설명이 업데이트되었습니다.관리 챕터에 자동 소프트웨어 업데이트에 대한 섹션이 추가되었습니다.Reducing Whole-Genome Data Storage Footprint(게시 번호 970-2012-013)에 대한 참조가 NovaSeq Series and HiSeq X Ten Data QualityComparison(게시 번호 770-2017-010)로 교체되었습니다.6장의 런 매개변수 입력의 3단계에 참고 사항이 추가되었습니다.S1 및 S4 타일 정보를 포함하도록 플로우 셀 타일 섹션이 업데이트되었습니다.

자료 번호 20018871문서 번호1000000019358 v02

2017년4월

다음 정보가 추가되었습니다.• 런에 필요한 Illumina 공급 소모품.• 시약 키트 구성요소에 대한 보관 조건.• 라이브러리 로드 농도에 대한 권장사항.• 2개 플로우 셀의 NaOH 희석.• 로드하기 전에 플로우 셀이 실온에 도달하게 하는 단계.• 사용된 시약병을 비운 후의 장갑 교체 단계.• 타사 LIMS 시스템용 LIMS 출력 구성.• 샘플 시트의 이름 지정 규칙.• 프로세스 관리 아이콘 및 문제 해결.• Windows 보안 기능 및 구성 지침이 나와 있는 부록.• 기술 지원을 받을 수 있는 연락처 정보.시약 카트리지 해동 시간이 4시간으로 증가되었습니다.1% PhiX spike-in 용량을 0.9µl로 변경하고 10mM Tris-HCl, pH 8.5를 사용하여 10nM PhiX를 희석하도록 PhiX spike-in 지침이 업데이트되었습니다.미립자가 보이는 경우에만 플로우 셀 및 플로우 셀 스테이지를 세척하도록지침이 업데이트되었습니다.관리세척 빈도가 14일마다로 업데이트되었습니다.연속성을 높이기 위해 소모품 준비 지침이 재구성 및 통합되었습니다.French 도어의 이름이 액체 부분 도어로 변경되었습니다.

자료 번호 20018406문서 번호1000000019358 v01

2017년3월

Process Management(프로세스 관리) 화면의 열 이름이 Sequencing(시퀀싱)으로 수정되었습니다.

자료 번호 20015871문서 번호1000000019358 v00

2017년2월

최초 릴리스.

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목차

1장 개요 1도입 1추가 리소스 2시퀀싱 개요 2시퀀싱 워크플로우 3기기 구성요소 5

2장 키트 및 액세서리 10키트 개요 10시약 키트 구성요소 11NovaSeq Xp Kit 구성요소 15NovaSeq Xp 플로우 셀 도크 15기호 설명 16

3장 시작하기 18기기 시작 18설정 구성 19사용자가 준비해야 하는 소모품 및 장비 24

4장 Standard 워크플로우: 소모품 준비 27방법 27라이브러리 가이드라인 27SBS 및 클러스터 카트리지 해동 27사용된 시약병 비우기 28플로우 셀 준비 29시퀀싱을 위해 라이브러리 풀링 및 변성 30

5장 NovaSeq Xp 워크플로우: 소모품 준비 34NovaSeq Xp 워크플로우 요약 34방법 35라이브러리 가이드라인 35SBS 및 클러스터 카트리지 해동 35사용된 시약병 비우기 36플로우 셀 준비 37시퀀싱을 위해 라이브러리 풀링, 변성 및 로드 38

6장 시퀀싱 46시퀀싱 런 설정 46런 진행 상황 모니터링 52시간차 런 시작 53런 삭제 53위치 #30 분리 54자동 포스트 런 세척 54

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연구 전용. 진단 절차에는 사용할 수 없습니다.vi

7장 관리 55예방 관리 55관리세척 55소프트웨어 업데이트 58

부록 A 문제 해결 60문제 해결 리소스 60문제 해결 파일 60프리 런 검사 오류 60프로세스 관리 문제 해결 61클러스터링 전 런 실패 61런 종료 62기기 종료 63

부록 B 실시간 분석 64실시간 분석 개요 64실시간 분석 워크플로우 66

부록 C 출력 폴더 및 파일 69출력 폴더 구조 시퀀싱 69출력 파일 시퀀싱 70

부록 D Windows 보안 71보안 구성 71비밀번호 요건 71Windows 방화벽 71Enhanced Mitigation Experience Toolkit 71소프트웨어 제한 정책 72

인덱스 75

기술 지원 79

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1장 개요도입 1추가 리소스 2시퀀싱 개요 2시퀀싱 워크플로우 3기기 구성요소 5

도입Illumina® NovaSeq™ 6000 Sequencing System은 확장 가능한 처리량과 유연한 시퀀싱 기술을 벤치톱 시스템의 효율성과 비용 효율성을 갖춘 프로덕션 규모의 플랫폼에 패키징합니다.

기능u 확장 가능 시퀀싱 - NovaSeq 6000은 광범위한 적용 분야를 위해 고품질 데이터를 사용하여 시퀀싱을 프

로덕션 수준까지 확장합니다.

u 조정 가능 출력 - NovaSeq 6000은 광범위한 출력 범위가 있는 듀얼 플로우 셀 시스템입니다. 1개의 플로우 셀을 시퀀싱하거나 리드 길이가 다른 2개의 플로우 셀을 동시에 시퀀싱합니다. 세 가지 유형의 플로우셀과 다양한 리드 길이를 혼합하여 사용합니다.

u 패턴화된 플로우 셀 - 패턴화된 플로우 셀은 빽빽한 간격의 클러스터를 생성합니다. 나노웰 간 간격이 감소하면 클러스터 밀도 및 데이터 출력이 증가합니다.

u 온보드 ExAmp 혼합 - NovaSeq 6000은 ExAmp 시약을 라이브러리와 혼합하고 라이브러리를 증폭하며 간소화된 시퀀싱 워크플로우를 위해 클러스터를 생성합니다.

u 개별 레인 로드 - NovaSeq Xp 플로우 셀 도크를 사용하면 라이브러리를 플로우 셀의 개별 레인에 미리로드할 수 있으므로 라이브러리 로드 용량이 감소합니다.

u 고처리량 라인 스캔 - NovaSeq 6000은 양방향 스캔 기술이 있는 한 대의 카메라를 사용하여 2개의 컬러채널에서 플로우 셀을 동시에 신속하게 촬영합니다.

u RTA(Real-Time Analysis: 실시간 분석) - NovaSeq 6000은 RTA3이라는 RTA의 구현을 사용합니다. 이 통합소프트웨어는 이미지를 분석하고 베이스를 호출합니다.

u BaseSpace™ Sequence Hub 통합 - 시퀀싱 워크플로우는 데이터 분석, 보관 및 협업을 위한 Illumina 유전체학 컴퓨팅 환경인 BaseSpace Sequence Hub와 통합됩니다. 런이 진행됨에 따라 출력 파일이 실시간으로 환경에 스트리밍됩니다.

u BaseSpace Clarity LIMS 준비 - 샘플 및 시약의 포괄적인 추적, 자동화된 워크플로우 및 통합 기기 작동을통해 작업 효율성이 개선됩니다.

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추가리소스Illumina 웹사이트의 NovaSeq 6000 Sequencing System 지원 페이지에 추가 시스템 리소스가 나와 있습니다.이러한 리소스에는 소프트웨어, 교육, 호환 제품 및 다음 설명서가 포함됩니다. 항상 최신 버전의 지원 페이지를 확인하십시오.

리소스 설명

사용자지정 프로토콜 선택기

시퀀싱 런에 사용된 라이브러리 프렙 방법, 런 매개변수 및 분석 방법에 맞게 맞춤화된 포괄적인사용자지정 설명서를 생성하는 마법사입니다.

NovaSeq 시리즈 현장 프렙 가이드(문서번호1000000019360)

실험실 공간, 전기 요건, 환경 고려사항 및 네트워크 고려사항에 대한 사양을 제공합니다.

NovaSeq 시리즈 안전 및 준수 가이드(문서 번호1000000019357)

작업 안전 고려사항, 준수 설명 및 기기 라벨링에 대한 정보를 제공합니다.

RFID 리더 준수 가이드(문서 번호1000000002699)

준수 인증 및 안전 고려사항을 포함하여 기기의 RFID 리더에 대한 정보를 제공합니다.

NovaSeq 시리즈 사용자지정 프라이머가이드(문서 번호1000000022266)

Illumina 시퀀싱 프라이머를 사용자지정 시퀀싱 프라이머로 교체하는 것과 관련된 정보를 제공합니다.

시퀀싱개요

클러스터생성클러스터 생성 중에 단일 DNA 분자가 플로우 셀 표면에 결합되고 동시에 증폭되어 클러스터를 형성합니다.Standard 워크플로우의 경우 ExAmp 마스터 믹스가 클러스터 생성 전에 기기에 탑재된 라이브러리와 혼합됩니다. NovaSeq Xp 워크플로우의 경우 ExAmp 시약 및 라이브러리가 혼합되어 기기 외부의 플로우 셀에 제공됩니다. 용량은 플로우 셀 유형 및 워크플로우에 따라 다양합니다.

시퀀싱클러스터는 양방향 스캔 및 2채널 시퀀싱 화학검사를 사용하여 이미지로 만들어집니다. 카메라는 빨간색 및녹색 조명을 감지하는 센서를 사용하여 각 스와스(swath)를 이미지로 만들고 동시에 전체 스와스의 빨간색및 녹색 이미지를 생성합니다. 이미지를 만든 후에 패턴화된 플로우 셀에 의해 결정된 위치를 기준으로 각 클러스터에 대한 빨간색 신호 대비 녹색 신호의 비율에 따라 각 타일 내 클러스터에 대한 베이스 콜링이 수행됩니다. 이 프로세스는 각 시퀀싱 사이클에 대해 반복됩니다.

분석런이 진행됨에 따라 NVCS(NovaSeq Control Software)는 데이터 분석을 위해 베이스 콜(*.cbcl) 파일을 지정된 출력 폴더 위치로 자동 전송합니다.

적용 분야에 따라 여러 분석 방법을 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 Illumina 웹사이트의 BaseSpaceSequence Hub 지원 페이지를 참조하십시오.

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https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/novaseq-6000.htmlhttp://support.illumina.com/custom-protocol-selector.htmlhttp://support.illumina.com/custom-protocol-selector.htmlhttps://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/basespace.htmlhttps://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/basespace.html

시퀀싱워크플로우SBS 및 클러스터 시약 카트리지를 해동합니다.

라이브러리를 풀링하고 변성합니다. Standard 워크플로우의 경우 라이브러리를 라이브러리 튜브에 추가합니다. NovaSeq Xp 워크플로우의 경우 ExAmp/라이브러리 믹스를 플로우 셀에 로드합니다.두 워크플로우 모두 라이브러리 튜브를 해동된 클러스터 카트리지에 로드합니다.

소프트웨어 인터페이스에서 Sequence(시퀀스)를 선택하고 듀얼 플로우 셀 런 또는 단일 플로우 셀 런을지정합니다.

이전 런에서 소모품을 언로드하고 현재 런을 위해 새 소모품을 로드합니다.

Run Setup(런 설정) 화면에서 런 매개변수를 지정합니다. BaseSpace Sequence Hub가 구성된 경우 LogIn(로그인) 화면에서 로그인합니다.프리 런 검사가 완료되면 런이 자동으로 시작됩니다.

런 모니터링이 활성화된 경우 BaseSpace Sequence Hub의 Sequence(시퀀스) 화면에서 또는 시퀀싱 분석 뷰어를 사용하여 네트워크 컴퓨터에서 런을 모니터링합니다.데이터가 지정된 출력 폴더로 전송됩니다.

시퀀싱이 완료되면 기기 세척이 자동으로 시작됩니다.

라이브러리로드방법라이브러리는 선택된 워크플로우에 따라 다음 2가지 방법 중 1가지를 사용하여 NovaSeq 6000 플로우 셀에로드됩니다. 시퀀싱 런 설정은 워크플로우에 따라 다릅니다. 항상 방법에 맞는 지침을 따라야 합니다. 27페이지의 Standard 워크플로우: 소모품 준비 및 34페이지의 NovaSeq Xp 워크플로우: 소모품 준비를 참조하십시오.

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워크플로우라이브러리 풀 로드 및 ExAmp 혼합 방법

개별 레인 주소 지정 및 데이터 분석로드 용량*

SP/S1–S2–S4 모드(µ l)

Standard 단일 라이브러리 풀이 라이브러리 튜브에 로드되고 라이브러리 튜브에서 온보드로 ExAmp 시약과 혼합되며 클러스터링 및 시퀀싱을 위해 플로우 셀에 자동으로 전달됩니다. 시퀀싱 전 부스트 단계에서는 클러스터 카트리지 및 라이브러리 튜브의 시약을 사용하여 클러스터링효율성을 높이는 데 도움이 되는 조절믹스를 생성합니다.

단일 라이브러리 풀이 플로우 셀의 모든레인 전체에서 배포되고 시퀀싱됩니다.모든 레인의 리드가 종합적으로 분석됩니다.

150–225–465µl(전체 플로우 셀)

NovaSeq Xp 1개 이상의 라이브러리(플로우 셀 레인수에 해당함)가 기기 외부에서 ExAmp시약과 수동으로 혼합되고 NovaSeq Xp플로우 셀 도크를 사용하여 플로우 셀의개별 레인에 직접 로드됩니다. 그런 다음채워진 플로우 셀이 클러스터링 및 시퀀싱을 위해 기기에 로드됩니다. 시퀀싱 전부스트 단계에서는 빈 라이브러리 튜브를 사용해 클러스터 카트리지의 시약을혼합하여 클러스터링 효율성을 높이는데 도움이 되는 조절 믹스를 생성합니다.

각 라이브러리가 플로우 셀의 개별 레인에 로드된 다음 시퀀싱됩니다. 다양한풀, 동일한 풀의 분주 또는 임의의 조합을 사용할 수 있습니다. 이에 따라 다양한 레인의 리드가 개별적으로 또는 종합적으로 분석됩니다.

27–33–45µl(개별레인)

표 1 라이브러리로드방법

*NovaSeq Xp 워크플로우는 Standard 워크플로우보다 25~50% 더 낮은 농도의 변성된 라이브러리가 필요합니다.

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기기구성요소NovaSeq 6000 Sequencing System은 터치스크린 모니터, 상태 표시줄, USB 포트가 실행 중인 전원 버튼 및3개의 부분으로 구성됩니다.

그림 1 외부 구성요소

A 터치스크린모니터 - 시스템구성과런설정및모니터링을위한NVCS인터페이스를표시합니다.B 광학부분 - 플로우셀의듀얼표면이미징을활성화하는광학구성요소가포함되어있습니다.C 액체부분 - 시약및버퍼카트리지와사용된시약을담을병이포함되어있습니다.D 플로우셀부분 - 플로우셀을보관합니다.E 상태표시줄 - 시퀀싱준비완료(녹색), 처리중(파란색) 또는주의필요(주황색)로 플로우셀상태를나타

냅니다.F 전원및USB 포트 - 주변구성요소의전원버튼과USB 연결에액세스할수있습니다.

플로우셀부분플로우 셀 부분에는 플로우 셀 스테이지가 포함되어 있어서 왼쪽에는 플로우 셀 A를 보관하고 오른쪽에는 플로우 셀 B를 보관합니다. 각 측면에는 자동으로 포지셔닝하여 플로우 셀을 고정하는 4개의 클램프가 있습니다.

플로우 셀 스테이지에 장착된 광학 배열 타겟이 광학 문제를 진단하고 수정합니다. NVCS에 메시지가 표시되면 광학 배열 타겟이 시퀀싱 결과를 개선하기 위해 시스템을 다시 배열하고 카메라 초점을 조정합니다.

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그림 2 플로우 셀 스테이지

A 측면 A플로우셀홀더B 측면 B 플로우셀홀더C 플로우셀클램프(측면당 4개중 1개)D 광학배열타겟

소프트웨어는 플로우 셀 부분 도어의 개폐를 제어합니다. 도어는 자동으로 열려 런 또는 관리세척을 위해 플로우 셀을 로드합니다. 로드 후 소프트웨어는 부분 도어를 닫고 플로우 셀을 제 위치로 이동하며 클램프 및진공 포장을 체결합니다. 센서는 플로우 셀의 존재 및 호환성을 확인합니다.

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액체부분런을 설정하려면 액체 부분에 액세스하여 시약 및 버퍼를 로드하고 사용된 시약병을 비워야 합니다. 2개의도어가 플로우 셀 A와 플로우 셀 B에 대하여 2개의 일치하는 면으로 나뉜 액체 부분을 둘러싸고 있습니다.

그림 3 액체 부분 구성요소

A 사용된소형시약병 - 캡을손쉽게보관하기위한캡홀더가있으며클러스터카트리지의사용된시약을보관합니다.

B 사용된대형시약병 - 캡을손쉽게보관하기위한캡홀더가있으며 SBS및버퍼카트리지의사용된시약을보관합니다.

C 시약냉각기 - SBS및클러스터카트리지를냉각합니다.D 시약냉각기서랍 - 색상코딩된위치로왼쪽(회색라벨)에는 SBS카트리지를보관하고오른쪽(주황색라

벨)에는클러스터카트리지를보관합니다.E 버퍼서랍 - 왼쪽에는사용된대형시약병을보관하고오른쪽에는버퍼카트리지를보관합니다.

사용된시약유체 시스템은 잠재적으로 유해한 클러스터 카트리지 시약을 사용된 소형 시약병으로 보내도록 설계되어 있습니다. SBS 및 버퍼 카트리지의 시약을 사용된 대형 시약병으로 보냅니다. 그러나 사용된 시약이 흘러가는동안 교차 오염이 발생할 수 있습니다. 안전을 위해 사용된 시약병 모두에 잠재적으로 유해한 화학물질이 포함되어 있다고 가정하십시오. SDS(Safety data sheets: 안전보건자료)에 자세한 화학검사 정보가 나와 있습니다.

참고시스템이사용된시약을외부에서수집하도록구성되어있다면사용된대형시약병으로흘러가도록외부로보냅니다. 클러스터카트리지시약을항상사용된소형시약병으로보냅니다.

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시스템소프트웨어기기 소프트웨어 제품군에는 시퀀싱 런, 기기 분석 및 관련 기능을 수행하는 통합 애플리케이션이 포함됩니다.

u NVCS(NovaSeq Control Software) - 시퀀싱 런을 설정하는 단계를 안내하고 기기 작동을 제어하며 런 진행에 따른 통계를 표시합니다. 소모품의 적합한 언로드 및 로드를 보여주기 위해 NVCS는 런 설정 중에지침 동영상을 재생합니다.

u RTA(Real-Time Analysis: 실시간 분석) - 런 중에 이미지 분석을 분석하고 베이스를 콜링합니다. NovaSeq6000은 아키텍처, 보안 및 기타 향상된 기능을 통합하여 성능을 최적화하는 RTA3을 사용합니다. 자세한내용은64페이지의 실시간 분석을 참조하십시오.

u Universal Copy Service(UCS) - 전체 런 중에 RTA3 및 NVCS에서 출력 폴더로 출력 파일을 복사합니다. 해당되는 경우 이 서비스는 데이터를 BaseSpace Sequence Hub로도 전송합니다. 실행 중에 UniversalCopy Service가 중단되면 다시 연결하여 데이터 전송을 자동으로 다시 시작하도록 여러 번 시도합니다.

상태아이콘NVCS 인터페이스의 상태 아이콘은 런 상태를 나타냅니다. 아이콘에 있는 숫자는 상태에 대한 조건 수를 나타냅니다.

런 상태가 변경되면 이에 대한 경고를 위해 아이콘이 깜박입니다. 상태에 대한 설명을 보려면 아이콘을 선택하십시오. Acknowledge(확인)를 선택하여 메시지를 지운 다음 Close(닫기)를 선택하여 대화상자를 닫습니다.

상태 아이콘

상태 이름 설명

상태 양호 시스템이 정상입니다.

처리 중 시스템이 처리 중입니다.

경고 경고가 발생했고 주의가 필요합니다.경고로 인해 런이 중단되지 않거나 계속하기 전에 조치가 필요합니다.

오류 오류가 발생했습니다.오류로 인해 런을 계속하기 전에 조치가 필요합니다.

표 2 NVCS상태아이콘

프로세스관리Process Management(프로세스 관리) 화면에서 CE(Compute Engine: 컴퓨팅 엔진) 및 하드 드라이브(C:\)에액세스할 수 있습니다. 이 화면에서 런 진행 상황을 모니터링하고 런을 삭제하고 디스크 공간을 관리할 수 있습니다. 파일 및 폴더를 C:\에서 바로 삭제하지 마십시오.

Process Management(프로세스 관리)에는 가용 디스크 공간, CE 및 C:\에 사용된 공간, 디스크 공간을 사용하는 런의 상태가 표시됩니다. Run Date(런 날짜) 및 Name(이름) 열은 각 런을 식별합니다. Run Status(런 상태), BaseSpace 및 Network(네트워크) 열은 런의 각 프로세스 상태를 보여줍니다.

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프로세스 아이콘 설명

런 상태 런이 진행 중입니다.

런이 시퀀싱을 완료했습니다.

네트워크 파일을 네트워크상의 출력 폴더에 복사하고 있습니다.

모든 파일이 네트워크상의 출력 폴더에 복사되었습니다.

런이 네트워크 출력 폴더에 업로드하도록 구성되지 않았거나 업로드 상태가 알려져 있지않으므로 해당되지 않습니다.문제를 해결하려면 61페이지의 프로세스 관리 문제 해결을 참조하십시오.

BaseSpace 파일을 BaseSpace Sequence Hub에 업로드하고 있습니다.

모든 파일이 BaseSpace Sequence Hub에 업로드되었습니다.

런이 BaseSpace Sequence Hub에 업로드하도록 구성되지 않았거나 업로드 상태가 알려져 있지 않으므로 해당되지 않습니다.문제를 해결하려면 61페이지의 프로세스 관리 문제 해결을 참조하십시오.

표 3 프로세스관리상태아이콘

플로우 셀 런이 시작되기 전에 CE 및 C:\의 최소 공간 요건을 충족해야 합니다.

참고단일플로우셀런의경우최소공간요건은다음표에나와있는요건의절반에해당합니다.

플로우 셀 사이클당 CE 공간 플로우 셀 페어당 C:\ 공간

SP .5Gb 5Gb

S1 1.35Gb 20Gb

S2 2.7Gb 20Gb

S4 4.3Gb 40Gb

표 4 듀얼플로우셀런을위한CE및C:\의최소공간요건

런에 필요한 총 CE 공간을 계산하려면 '사이클당 CE 공간' 아래 값을 리드 1, 리드 2, 인덱스 1 및 인덱스 2 길이 값과 곱하십시오( 49페이지의 런 매개변수 입력 참조). 예를 들어 페어드 엔드 150 사이클의 경우 두 인덱스 길이가 8베이스인 듀얼 플로우 셀 S4 런에 필요한 CE 공간은 ( 151 * 2 + 8 * 2 ) * 4.3 = 1.37Tb입니다.

디스크 공간을 확보하는 자세한 방법은 53페이지의 런 삭제를 참조하십시오.

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2장 키트및액세서리키트 개요 10시약 키트 구성요소 11NovaSeq Xp Kit 구성요소 15NovaSeq Xp 플로우 셀 도크 15기호 설명 16

키트개요NovaSeq 6000에서 런을 수행하려면 NovaSeq 6000 Reagent Kit가 필요합니다. NovaSeq Xp 워크플로우는NovaSeq Xp Kit도 필요합니다. 이러한 키트는 다음 구성으로 제공됩니다.

실험 설계에 적합한 키트 크기를 선택하십시오. Illumina는 런 길이가 300 사이클을 초과하는 경우에만 500 사이클 키트를 사용할 것을 권장합니다.

런에 필요한 항목의 전체 목록은 24페이지의 사용자가 준비해야 하는 소모품 및 장비를 참조하십시오.

키트 이름 Illumina 카탈로그 번호

NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit(300개 사이클) 20012866








NovaSeq 6000 SP Reagent Kit(500개 사이클) 20029137



NovaSeq Xp 2-Lane Kit 20021664

NovaSeq Xp 4-Lane Kit 20021665

표 5 키트구성

호환성라벨링호환되는 키트 구성 요소를 식별하기 위해 플로우 셀과 카트리지는 키트 모드를 표시하는 기호로 라벨이 지정됩니다(SP, S1, S2 또는 S4). NovaSeq Xp 매니폴드는 여러 모드를 지원하며 2레인(SP, S1 및 S2 플로우 셀용) 또는 4레인(S4 플로우 셀용)으로 라벨이 지정됩니다.

동일한 런에서 모드는 다른 구성요소를 사용할 수 없습니다. 예를 들어 S1 카트리지를 S2 플로우 셀과 페어링하면 안 됩니다.

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키트 모드

라벨 표시

설명

SP 키트구성 요소

SP 플로우 셀은 필터를 통과하는 6억 5천만 개에서 8억 개의 단일 리드를 생성하며 2 x 150bp에서 최대 250Gb 및 2 x 250bp에서 최대 400Gb를 출력합니다.

S1 키트구성요소

S1 플로우 셀은 필터를 통과하는 최대 16억 개의 단일 리드를 생성하며 2 x 150bp에서 최대500Gb를 출력합니다. S1 키트는 처리량이 높은 대부분의 적용 분야에 소량 샘플의 고속 시퀀싱을 제공합니다.


S2 플로우 셀은 필터를 통과하는 최대 41억 개의 단일 리드를 생성하며 2 x 150bp에서 최대1250Gb를 출력합니다. S2 플로우 셀은 처리량이 높은 적용 분야에 대부분 고속 시퀀싱을 제공하며 시퀀싱 출력을 높이기 위해 S1 플로우 셀보다 더 많은 수의 리드를 제공합니다.


S4 플로우 셀은 필터를 통과하는 최대 100억 개의 단일 리드를 생성하며 2 x 150bp에서 최대3000Gb를 출력합니다. 이는 최대 출력을 위해 설계된 4레인 버전의 플로우 셀입니다. 이를 사용하면 다양한 종과 적용 범위 전반에서 비용 효율적으로 전장 유전체를 시퀀싱할 수 있게 됩니다.

Illumina 웹사이트의 NovaSeq Reagent Kits 제품 페이지에는 각 모드에 대한 자세한 사양이 나와 있습니다.

시약키트구성요소각 NovaSeq 6000 Reagent Kit에는 다음 구성요소가 포함되어 있습니다. 각 구성요소는 정확한 소모품 추적및 호환성을 위해 RFID(Radio-Frequency Identification:무선 주파수 식별)를 사용합니다.

적절한 성능을 보장하려면 키트를 받은 즉시 구성요소를 표시된 온도에 보관하십시오.

수량 키트 구성요소 보관 온도

1 라이브러리 튜브 15°C ~ 30°C

1 플로우 셀 2°C ~ 8°C

1 버퍼 카트리지 15°C ~ 30°C

1 클러스터 카트리지 -25°C ~ -15°C

1 SBS 카트리지 -25°C ~ -15°C

표 6 키트구성요소

주의카트리지를떨어뜨리지마십시오. 떨어뜨릴경우상해가발생할수있습니다. 시약이카트리지에서누출되는경우피부자극이발생할수있습니다. 사용전에카트리지에균열이있는지검사하십시오.

라이브러리튜브NovaSeq 6000 라이브러리 튜브는 클러스터 카트리지 위치 #8에 맞는 16mm 튜브입니다. 위치 #8은 손쉽게식별하도록 Library Tube(라이브러리 튜브)라는 라벨이 표시되고 주황색 원이 그려져 있습니다. 튜브에는 필요 시 라이브러리를 보관하도록 나사형 캡이 있습니다. 클러스터 카트리지에 로드하기 전에 캡이 제거되었는지 확인합니다.

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https://www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/cluster-gen-sequencing-reagents/novaseq-reagent-kits.html

그림 4 라이브러리 튜브

라이브러리 튜브는 워크플로우에 따라 다음 2가지 방법 중 1가지로 사용됩니다.

u Standard - 풀링된 라이브러리 및 변성된 라이브러리가 라이브러리 튜브에 추가되고 이는 캡이 없는 상태로 클러스터 카트리지에 로드됩니다. 런이 시작된 후에 기기는 라이브러리 튜브에서 라이브러리를ExAmp 시약과 혼합합니다. 그러면 라이브러리 튜브가 플로우 셀에 자동으로 전달됩니다.

u NovaSeq Xp - 캡이 없는 빈 라이브러리 튜브가 클러스터 카트리지에 로드됩니다. 런 동안 플로우 셀에배포하기 전에 라이브러리 튜브에서 시약이 혼합됩니다.

플로우셀NovaSeq 6000 플로우 셀은 카트리지로 둘러싸인 패턴화된 플로우 셀입니다. 플로우 셀은 수십억 개의 나노웰을 순서가 지정된 배열로 포함하는 유리 기반 물질이므로 출력 리드 및 시퀀싱 데이터의 수를 증가시킵니다. 클러스터가 시퀀싱되는 나노웰에 생성됩니다.

각 플로우 셀에는 풀링된 라이브러리의 시퀀싱을 위한 여러 레인이 있습니다. SP, S1 및 S2 플로우 셀에는 각각 2개의 레인이 있고, S4 플로우 셀에는 4개의 레인이 있습니다. 각 레인은 여러 스와스에 이미지로 만들어지고 소프트웨어는 각 스와스의 이미지를 타일이라고 하는 더 작은 부분으로 나눕니다. 자세한 내용은 65페이지의 플로우 셀 타일을 참조하십시오.

참고S1플로우셀을사용하는경우NVCS v1.3.1이상을사용하는지확인하십시오. SP플로우셀을사용하는경우NVCS v1.6이상을사용하십시오.

그림 5 플로우 셀

A 플로우셀카트리지B 4레인플로우셀(S4)C 2레인플로우셀(SP, S1및 S2)

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각 플로우 셀의 밑면에 4개의 개스킷이 있습니다. 라이브러리 및 시약이 플로우 셀의 주입구 끝에 있는 개스킷을 통해 플로우 셀 레인에 들어갑니다. 사용된 시약은 배출구 끝에 있는 개스킷을 통해 레인에서 배출됩니다.

참고플로우셀을취급할때개스킷에닿지않게하십시오.

그림 6 뒤집어 놓은 플로우 셀

A 배출구끝B 주입구끝C 개스킷(4개중 1개)

버퍼,클러스터및SBS 카트리지NovaSeq 6000 버퍼, 클러스터 및 SBS 카트리지에는 시약, 버퍼, 세척 용액으로 미리 채워져 있는 알루미늄포장지에 싸인 저장장치가 있습니다. 각 카트리지 유형 중 1개가 시약 키트에 포함됩니다.

카트리지는 기기에 직접 로드되고 로드 오류를 줄이기 위해 색상 코딩 및 라벨 표시되어 있습니다. 시약 냉각기 및 버퍼 서랍의 가이드가 적절한 방향을 보장합니다.

카트리지에 대한 라벨에는 S1/S2 또는 SP/S1/S2같이 지원되는 모드가 명시되어 있습니다. 카트리지는 라벨에 나와 있는 모드에만 사용할 수 있습니다.

카트리지 설명

NovaSeq 6000 버퍼 카트리지 시퀀싱 버퍼로 미리 채워져 있으며 무게는 최대 6.8kg(15lbs)입니다. 플라스틱 핸들을 사용하여 운반, 로드 및 언로드가 용이합니다. 상단 플레이트의 들어간 부분에 카트리지를 적재할 수 있습니다.

NovaSeq 6000 클러스터 카트리지

클러스터링, 인덱싱 및 페어드 엔드 시약과 세척 용액으로 미리 채워져 있습니다. 라이브러리 튜브의 지정된 위치가 포함되어 있습니다. 주황색 라벨이 클러스터 카트리지와 SBS 카트리지를 구분합니다.

표 7 시약카트리지

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카트리지 설명

NovaSeq 6000 SBS 카트리지 키트에서 지원하는 사이클 수(500, 300, 200 또는 100)에 특정한 용량의 시퀀싱 시약이 사전 충전되어 있습니다. 3개의 시약 위치 각각에 인접하여 자동 포스트 런 세척에 예약된 위치가 있습니다. 회색 라벨이 SBS 카트리지와 클러스터 카트리지를구분합니다.

클러스터카트리지저장장치

제거가능저장장치위치 #30에 있는 변성 시약에 유기 아미드이며 생식 독소인 포름아미드가 포함되어 있습니다. 시퀀싱 런 후에 사용하지 않은 시약을 안전하게 폐기하도록 이 저장장치를 제거할 수 있습니다.

참고SBS카트리지를클러스터카트리지상단에적재하지마십시오. 위치 #30이분리될수있습니다.

예약된저장장치3개의 저장장치가 사용자지정 프라이머에 예약되어 있고 빈 위치가 라이브러리 튜브에 예약되어 있습니다.샘플 추적을 위해 라이브러리 튜브가 런 설정 중에 클러스터 카트리지에 로드되고 런 종료까지 카트리지에그대로 유지됩니다.

그림 7 번호가 지정된 저장장치

위치 예약 대상

5, 6 및 7 옵션 사용자지정 프라이머

8 라이브러리 튜브

사용자지정 프라이머에 대한 자세한 내용은 NovaSeq 시리즈 사용자지정 프라이머 가이드(문서 번호1000000022266)를 참조하십시오.

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NovaSeq Xp Kit구성요소각 NovaSeq Xp Kit는 일회용이며 다음 구성요소를 포함합니다. 적절한 성능을 보장하려면 키트를 받은 즉시구성요소를 표시된 온도에 보관하십시오.

수량 키트 구성요소 보관 온도

1 DPX1 -25°C ~ -15°C

1 DPX2 -25°C ~ -15°C

1 DPX3 -25°C ~ -15°C

1 NovaSeq Xp Manifold 키트와 함께 보관하거나 실온에 보관하십시오.

표 8 NovaSeq Xp Kit구성요소

DPX1, DPX2및DPX3시약DPX1, DPX2 및 DPX3은 NovaSeq 워크플로우를 위해 개별 튜브에 제공되는 Xp ExAmp 시약입니다. 이러한시약을 통합하면 플로우 셀에 로드하기 전에 라이브러리 풀과 혼합되는 ExAmp 마스터 믹스가 만들어집니다.

NovaSeq Xp ManifoldNovaSeq Xp Manifold는 라이브러리 풀을 개별 플로우 셀 레인에 직접 로드하도록 NovaSeq Xp 플로우 셀 도크에 배치됩니다. NovaSeq Xp Manifold의 측면에 있는 암은 도크에 손쉽게 배치하도록 설계되었습니다.

NovaSeq Xp Manifold는 2레인 및 4레인 플로우 셀과 일치하도록 2웰 및 4웰 구성으로 제공됩니다. 각 웰은 플로우 셀 레인에 해당합니다. 플로우 셀은 NovaSeq Xp 플로우 셀 도크에 거꾸로 로드되므로 뒤집어진 플로우셀에 지정된 레인 번호와 일치하도록 오른쪽에서 왼쪽으로 웰 번호가 지정됩니다.

그림 8 번호가 지정된 웰이 있는 NovaSeq Xp Manifold

NovaSeq Xp플로우셀도크NovaSeq Xp 플로우 셀 도크는 라이브러리를 플로우 셀에 직접 로드하는 재사용 가능한 액세서리입니다. 플로우 셀은 뒤집어서 도크에 로드되고 NovaSeq Xp Manifold는 플로우 셀 위에 장착됩니다.

2개의 돌출부(브래킷 아래)와 2개의 스프링이 플로우 셀 삽입을 유도하여 적절한 방향을 보장합니다. 컷아웃이 NovaSeq Xp Manifold 암을 적절한 방향으로 유지하고 균일하게 장착합니다. 자석 클램프가 180° 회전하여NovaSeq Xp Manifold를 플로우 셀 위에 고정합니다.

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그림 9 NovaSeq Xp 플로우 셀 도크

A 로드를유도할돌출부(브래킷아래)B 플로우셀을배열할스프링C NovaSeq Xp Manifold 암을유지할컷아웃D 플로우셀및NovaSeq Xp Manifold를고정할클램프

기호설명다음 표에서는 소모품 또는 소모품 패키지에 표시되는 기호를 설명합니다.

기호 설명

소모품이 만료되는 날짜입니다. 최상의 결과를 얻으려면 이 날짜 전에 소모품을 사용하십시오.

제조업체(Illumina)를 나타냅니다.

용도가 연구 전용(RUO: Research Use Only)임을 나타냅니다.

소모품을 식별할 부품 번호를 나타냅니다.¹

소모품이 제조된 배치 또는 로트를 식별할 배치 코드를 나타냅니다.¹

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기호 설명

일련 번호를 나타냅니다.

빛이나 열로부터 보호해야 함을 나타냅니다. 직사광선을 피해서 보관하십시오.

건강에 유해함을 나타냅니다.

유해물 경고를 나타냅니다.

섭씨로 표시되는 보관 온도 범위입니다. 소모품을 표시된 범위 내에 보관하십시오.²

¹ REF는 개별 구성요소를 식별하고 LOT는 구성요소가 속해 있는 로트 또는 배치를 식별합니다.

² 보관 온도는 배송 온도와 다를 수 있습니다.

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3장 시작하기기기 시작 18설정 구성 19사용자가 준비해야 하는 소모품 및 장비 24

기기시작1 기기 뒷면의 토클 전원 스위치를 |(켜짐) 위치로 전환합니다.

그림 10 전원 스위치 위치

2 기기의 오른쪽에 있는 전원 버튼이 파란색으로 켜질 때까지 기다렸다가 누릅니다.

그림 11 전원 버튼 위치

사용자계정NVCS v1.5 이상 버전에는 관리자와 사용자라는 2가지 유형의 계정이 있습니다. 각 유형에 대한 권한이 다음표에 나와 있습니다.

권한 관리자 사용자

시퀀싱 런 설정, 시작 및 모니터링 X X

소프트웨어 다운로드 및 업데이트 X

다른 사용자가 시작한 활성 런의 상태 확인 X

응답하지 않는 UCS 프로세스 종료 X

애플리케이션 데이터 파일은 C:/ProgramData에 저장됩니다. 애플리케이션은 C:/Program Files에 설치됩니다. NVCS는 계정 유형 모두에서 전체 화면 앱으로 실행됩니다.

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시스템로그온1 운영체제가 로드될 때 사이트의 사용자 이름 및 비밀번호를 사용하여 Windows에 로그온합니다.

2 NVCS를 엽니다.소프트웨어가 실행되고 시스템을 초기화합니다. 초기화가 완료되면 Home(홈) 화면이 표시됩니다.

NVCS가 사용자 앱으로 실행됩니다. 소프트웨어 업데이트와 같이 관리자 권한이 필요한 기능을 사용하려고할 때 관리자로 로그인되지 않은 경우 관리자로 로그인하라는 메시지가 표시됩니다.

시퀀싱 런의 진행 상황에 관한 최신 정보를 받으려면 NVCS가 실행 중일 때와 시퀀싱 런이 진행 중일 때 로그인 상태를 유지합니다.

설정구성NVCS에는 다음에 대한 설정이 포함됩니다.

u 런 모드(수동 또는 파일 기반)

u NovaSeq Xp 워크플로우

u BaseSpace Sequence Hub

u 소프트웨어 업데이트

참고소프트웨어업데이트에대한Workflow Selection(워크플로우선택) 또는 Automatic Checks(자동 검사)를구성하기전에Mode Selection(모드 선택)이 구성되어있어야합니다.

런설정모드u Manual(수동) - 나중에 분석할 수 있도록 데이터를 지정된 출력 폴더로 보내는 기본 모드입니다.

u File-Based(파일 기반) - BaseSpace Clarity LIMS 또는 다른 LIMS 시스템의 파일을 사용하여 런 매개변수를 정의하는 대체 모드입니다. 자세한 내용은 20페이지의 LIMS 출력 구성을 참조하십시오.

런 설정 모드를 구성할 때 런 설정 폴더의 기존 위치를 지정해야 합니다. 이 폴더는 필수이며 유효하지 않은위치 메시지는 지정된 위치가 존재하지 않는다는 것을 나타냅니다.

두 런 설정 모드 모두 분석을 위해 데이터를 BaseSpace Sequence Hub로 보내는 옵션이 있습니다.

수동모드구성1 Main Menu(주 메뉴)에서 Settings(설정)를 선택합니다.

Settings(설정) 화면이 열리고 Mode Selection(모드 선택) 탭이 표시됩니다.

2 Manual(수동)을 선택합니다.

3 [옵션] 출력 폴더의 기본 설정 네트워크 위치를 입력하거나 해당 위치로 이동합니다.C:\, D:\ 또는 Z:\ 드라이브에서 위치를 지정하지 마십시오. 그러면 유효하지 않은 드라이브 오류가 발생합니다.이 설정은 기본 위치입니다. 출력 폴더 위치는 런 단위로 변경할 수 있습니다.

4 [옵션] Illumina로 기기 성능 데이터 전송을 선택하여 Illumina Proactive 모니터링 서비스를 활성화합니다.소프트웨어 인터페이스에서의 설정 이름은 사용 중인 NVCS 버전에 따라 이 가이드 상의 이름과 다를 수있습니다.

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이 설정을 켜면 기기 성능 데이터가 Illumina에 전송됩니다. 이 데이터는 Illumina가 문제를 더 쉽게 해결하고 잠재적 장애를 감지하여 사전 예방적 관리를 활성화하고 기기 가동 시간을 극대화하는 데 도움을 줍니다. 이 서비스의 이점에 대한 자세한 내용은 Illumina Proactive 기술 노트(문서 번호 1000000052503)를 참조하십시오.이 서비스는 다음과 같습니다.u 시퀀싱 데이터를 전송하지 않습니다.u 기기가 인터넷 액세스를 통해 네트워크에 연결되어 있어야 합니다.u 기본적으로 사용 설정되어 있습니다. 이 서비스를 사용하지 않으려면 Illumina로 기기 성능 데이터 전

송 설정을 비활성화합니다.

5 Save(저장)를 선택합니다.

파일기반모드구성1 Main Menu(주 메뉴)에서 Settings(설정)를 선택합니다.


2 File-Based(파일 기반)를 선택합니다.

3 LIMS 파일이 있는 런 설정 폴더의 기본 설정 네트워크 위치를 입력하거나 해당 위치로 이동합니다.런을 설정하기 전에 적절한 LIMS 파일이 런 설정 폴더에 추가됩니다. 런 설정 중에 소프트웨어가 라이브러리 튜브 ID 또는 플로우 셀 ID를 사용하여 현재 런에 대한 파일을 찾습니다.

4 [옵션] 출력 폴더의 기본 설정 네트워크 위치를 입력하거나 해당 위치로 이동합니다.C:\, D:\ 또는 Z:\ 드라이브에서 위치를 지정하지 마십시오. 그러면 유효하지 않은 드라이브 오류가 발생합니다.출력 폴더 위치는 런 단위로 변경할 수 있습니다.

5 [옵션] Illumina로 기기 성능 데이터 전송을 선택하여 Illumina Proactive 모니터링 서비스를 활성화합니다.소프트웨어 인터페이스에서의 설정 이름은 사용 중인 NVCS 버전에 따라 이 가이드 상의 이름과 다를 수있습니다.이 설정을 켜면 기기 성능 데이터가 Illumina에 전송됩니다. 이 데이터는 Illumina가 문제를 더 쉽게 해결하고 잠재적 장애를 감지하여 사전 예방적 관리를 활성화하고 기기 가동 시간을 극대화하는 데 도움을 줍니다. 이 서비스의 이점에 대한 자세한 내용은 Illumina Proactive 기술 노트(문서 번호 1000000052503)를 참조하십시오.이 서비스는 다음과 같습니다.u 시퀀싱 데이터를 전송하지 않습니다.u 기기가 인터넷 액세스를 통해 네트워크에 연결되어 있어야 합니다.u 기본적으로 사용 설정되어 있습니다. 이 서비스를 사용하지 않으려면 Illumina로 기기 성능 데이터 전

송 설정을 비활성화합니다.이 옵션을 사용하려면 외부 인터넷에 연결해야 합니다.


LIMS 출력구성시스템이 파일 기반 모드로 구성되어 있고 BaseSpace Clarity LIMS 이외의 LIMS 소프트웨어를 사용하는 경우*.json 형식의 런 설정 파일을 생성하도록 LIMS를 구성합니다. Standard 워크플로우의 경우 파일 이름이 라이브러리 튜브 ID와 일치해야 합니다. 파일의 플로우 셀 ID 필드를 비워둘 수 있습니다. NovaSeq Xp 워크플로우의 경우 파일 이름이 플로우 셀 ID와 일치해야 하고 플로우 셀 ID 및 라이브러리 ID가 파일에 지정되어야 합니다. 파일 이름 및 값은 대소문자를 구분하지 않습니다.

외부 LIMS 소프트웨어는 NovaSeq LIMS API를 사용하여 NovaSeq 6000과 상호작용할 수 있습니다. API 엔드포인트에 대한 자세한 내용은 Illumina 기술 지원에 문의하십시오.

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필드 이름 값

run_name 기본 설정 런 이름(영숫자 문자, 하이픈 및 밑줄을 포함할 수 있음)

run_mode 다음 모드 중 1가지입니다:• SP• S1• S2• S4

workflow_type NoIndex, SingleIndex 또는 DualIndex

librarytube_ ID 라이브러리 튜브의 RFID

rehyb* True 또는 False

sample_ loading_type NovaSeqStandard 또는 NovaSeqXp

Flowcell_ ID 플로우 셀의 ID

paired_end True 또는 False

read1 최대 251까지의 값

read2 최대 251까지의 값

index_read1 모든 값

index_read2 모든 값

output_folder 이스케이프(escape) 시퀀스에 대해 2개의 백슬래시가 있는 출력 폴더의 경로

samplesheet 이스케이프(escape) 시퀀스에 대해 2개의 백슬래시가 있는 샘플 시트 또는 다른*.csv 형식 파일의 경로

use_basespace True 또는 False

basespace_mode RunMonitoringOnly 또는 RunMonitoringAndStorage

use_custom_read1_primer True 또는 False

use_custom_read2_primer True 또는 False

use_custom_ index_read1_primer True 또는 False

* NVCS v1.4.0 이전 버전에서는 재혼성화를 이용할 수 없습니다.

H6655DMXX.json이라는 *.json 파일 예:

{"run_name": "2x151_PhiX","run_mode": "S2","workflow_type": "NoIndex","sample_loading_type": "NovaSeqXp","librarytube_ID": "NV1236655-LIB","flowcell_ID": "H6655DMXX","rehyb": false,"paired_end": true,"read1": 151,"read2": 151,"index_read1": 0,"index_read2": 0,"output_folder": "\\\\sgnt-prd-isi01\\NovaSEQ\\SeqRuns","attachment": "\\\\sgnt-prd-isi01\\NVSQ\\SampleSheet.csv","use_basespace": false,"basespace_mode": null,"use_custom_read1_primer": false,

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"use_custom_read2_primer": false,"use_custom_index_read1_primer": false

}

기본인덱스사이클구성표준 워크플로우에 대한 기본 인덱스 사이클 수를 다음과 같이 구성할 수 있습니다.

1 Main Menu(주 메뉴)에서 Settings(설정)를 선택합니다.Settings(설정) 화면이 열리고 Mode Selection(모드 선택) 탭이 표시됩니다.

2 Workflow Selection(워크플로우 선택) 탭을 선택합니다.

3 Index Cycles(인덱스 사이클) 텍스트 상자에 기본 인덱스 사이클 수를 입력합니다.


NovaSeq Standard및NovaSeq Xp워크플로우NovaSeq Standard 워크플로우와 NovaSeq Xp 워크플로우 모두 Illumina 소유의 ExAmp 화학검사를 사용합니다.

u Standard 워크플로우

NovaSeq Standard 워크플로우는 기기에서 온보드로 Illumina 소유의 ExAmp 클러스터 화학검사를 수행하는 중요한 다음 2가지 단계를 자동화합니다.

u ExAmp 마스터 믹스 준비

u 플로우 셀에 마스터 믹스 제공

마스터 믹스의 온보드 준비 및 제공은 사용자 개입을 최소화하고 준비된 믹스의 가변성을 줄여줍니다.

Standard 워크플로우에 대한 런 설정의 일환으로 권장 농도로 변성되고 중화된 라이브러리 풀이 포함된라이브러리 튜브가 클러스터 카트리지의 위치 #8에 삽입됩니다. 런 시작의 후속 단계는 기기에서 온보드로 진행되고 이때 사용자 개입은 필요하지 않습니다. 여기에는 ExAmp 시약을 클러스터 카트리지에서 라이브러리 튜브로 옮기거나 시약 및 라이브러리 풀 믹스를 준비하거나 준비된 믹스를 플로우 셀의 모든 레인으로 보내는 단계가 포함됩니다.

온보드 클러스터링 후 워크플로우 모두에 공통된 일련의 단계가 수행됩니다. 여기에는 조절 믹스를 클러스터링된 플로우 셀에 적용하는 단계와 합성을 통해 시퀀싱용 클러스터를 준비하는 추가 화학검사 단계가 포함됩니다. 조절 믹스는 클러스터링 프로세스 동안 클러스터 카트리지의 시약과 런 설정 중에 삽입된라이브러리 튜브를 사용하여 준비됩니다. 조절 믹스는 NovaSeq 기기에서 클러스터링의 효율성을 높이는데 도움을 줍니다.

u NovaSeq Xp 워크플로우

NovaSeq Xp 워크플로우에서는 NovaSeq Xp 플로우 셀 도크와 플로우 셀별 소모품 키트(NovaSeq Xp 2-Lane Kit 또는 NovaSeq Xp 4-Lane Kit)를 사용하여 다양한 라이브러리 또는 라이브러리 풀을 NovaSeq 플로우 셀의 개별 레인에 로드할 수 있습니다. NovaSeq Xp Kit에는 클러스터링에 필요한 ExAmp 시약과 레인 로드에 필요한 NovaSeq Xp Manifold가 포함되어 있습니다.

ExAmp/라이브러리 믹스를 준비하여 NovaSeq Xp 플로우 셀 도크와 NovaSeq Xp Manifold를 사용해 플로우 셀의 개별 레인에 로드합니다. 자동 액체 핸들러를 사용해 ExAmp/라이브러리 믹스를 준비하고 매니폴드에 제공하여 플로우 셀을 자가 충전할 수 있습니다. 플로우 셀 샘플 로드가 완료되면 빈 라이브러리튜브가 클러스터 카트리지의 위치 #8에 삽입되고, 플로우 셀이 기기에 배치되고, 시퀀싱 런이 시작됩니다.

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런이 시작되면 워크플로우 모두에 공통된 일련의 단계가 수행됩니다. 여기에는 조절 믹스를 클러스터링된 플로우 셀에 적용하는 단계와 합성을 통해 시퀀싱용 클러스터를 준비하는 추가 화학검사 단계가 포함됩니다. 조절 믹스는 클러스터링 프로세스 동안 클러스터 카트리지의 시약을 사용하여 준비되고 런 설정중에 삽입된 빈 라이브러리 튜브에서 혼합됩니다. 조절 믹스는 NovaSeq 기기에서 클러스터링의 효율성을 높이는 데 도움을 줍니다.

NovaSeq Xp워크플로우구성1 Main Menu(주 메뉴)에서 Settings(설정)를 선택합니다.


2 Workflow Selection(워크플로우 선택) 탭을 선택합니다.

3 NovaSeq Xp 워크플로우를 활성화하려면 Enable Workflow Selection(워크플로우 선택 활성화)을 선택합니다.

4 [옵션] NovaSeq Xp를 기본 워크플로우로 만들려면 NovaSeq Xp를 선택합니다.


BaseSpace Sequence Hub구성다음 지침에 따라 BaseSpace Sequence Hub에 대한 기본 설정을 구성하십시오. 런 설정 중에 현재 런에 대해 BaseSpace Sequence Hub를 비활성화하거나 런 모니터링 및 보관에 대한 설정을 변경할 수 있습니다.BaseSpace Sequence Hub에 연결하려면 인터넷 접속이 필요합니다.

1 Main Menu(주 메뉴)에서 Settings(설정)를 선택합니다.Settings(설정) 화면이 열리고 Mode Selection(모드 선택) 탭이 표시됩니다.

2 BaseSpace Sequence Hub 확인란을 선택합니다.

3 다음과 같이 구성 옵션을 선택합니다.u Run Monitoring and Storage(런 모니터링 및 보관) - 원격 모니터링 및 데이터 분석을 위해 런 데이터

를 BaseSpace Sequence Hub에 보냅니다. 이 옵션을 사용하려면 런과 함께 샘플 시트를 업로드해야합니다.

u Run Monitoring Only(런 모니터링만) - 런을 원격으로 모니터링할 수 있도록 InterOp, 로그 및 기타non-CBCL 런 파일을 BaseSpace Sequence Hub에 보냅니다.

4 Hosting Location(호스팅 위치) 드롭다운 메뉴에서 EU(Frankfurt) 또는 USA(N. Virginia)를 선택합니다.이 옵션은 데이터가 업로드되는 위치를 결정합니다.

5 BaseSpace Enterprise 가입자인 경우 다음을 따릅니다.

a Private Domain(비공개 도메인) 확인란을 선택합니다.b BaseSpace Sequence Hub에 대한 Single Sign-On(싱글 사인온)에 사용된 도메인 이름을 입력합니

다.


샘플시트이름NVCS v1.3.1 혹은 이전 버전을 실행할 때 NovaSeq 6000 런과 BaseSpace Sequence Hub에 업로드된 샘플시트의 이름을 SampleSheet.csv(대소문자 구분)로 지정해야 합니다. 샘플 시트의 이름이 잘못 지정되고 RunMonitoring and Storage(런 모니터링 및 보관)가 활성화되면 BaseSpace Sequence Hub는 사용자가 주의하도록 런을 플래그 지정합니다. 플래그가 지정된 런은 More(더보기) | Fix Sample Sheet and Requeue(샘플 시트수정 및 다시 대기열에 추가)를 선택한 다음 해당 샘플 시트를 입력하여 FASTQ 생성을 위해 대기열에 추가할수 있습니다. 샘플 시트가 제공될 때까지는 시퀀싱 데이터를 FASTQ 파일로 변환할 수 없습니다.

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NVCS v1.4 이상 실행 시에는 샘플 시트 이름에 대한 제한이 없습니다.

bcl2fastq2 변환 소프트웨어 v2.19 이상을 사용하여 데이터를 로컬에서 FASTQ 파일로 변환하는 경우에는 명령줄 옵션 --sample-sheet를 사용하여 모든 위치에서 모든 CSV 파일을 지정할 수 있습니다. 명령줄을 사용하면 모든 파일 이름을 사용할 수 있습니다.

소프트웨어업데이트구성소프트웨어 업데이트에 대한 자동 검사는 기본적으로 활성화되어 있습니다. 업데이트 자동 검사를 Settings(설정)에서 비활성화 또는 활성화할 수 있습니다.

1 Main Menu(주 메뉴)에서 Settings(설정)를 선택합니다.

2 Software Update(소프트웨어 업데이트)를 선택합니다.

3 If enabled, the instrument will display a notification when a Software Update is available(활성화된 경우 소프트웨어 업데이트를 이용할 수 있을 때 기기에 알림이 표시됩니다) 확인란을 선택합니다.


사용자가준비해야하는소모품및장비다음의 사용자가 준비해야 하는 소모품 및 장비가 소모품 준비, 시퀀싱 및 시스템 관리에 사용됩니다.

소모품

소모품 공급자 목적

1N NaOH 일반 실험실 공급자 라이브러리 변성을 위해 0.2N으로 희석.

10mM Tris-HCl, pH 8.5 일반 실험실 공급자 변성 전에 라이브러리 및 옵션 PhiX 컨트롤 희석.

400mM Tris-HCl, pH 8.0 일반 실험실 공급자 변성 전에 라이브러리 및 옵션 PhiX 컨트롤 중화.

원심분리 병, 500ml 일반 실험실 공급자 관리세척을 위해 Tween 20 희석.

원심분리 튜브, 30ml 일반 실험실 공급자 관리세척을 위해 NaOCl 희석.

가루가 묻지 않는 일회용 장갑 일반 실험실 공급자 일반 목적.

이소프로필 알코올 수건, 70%또는에탄올 알코올 수건, 70%

VWR, 카탈로그 번호 95041-714또는 이와 동등일반 실험실 공급자

런 전에 구성요소 세척 및 일반 목적.

보풀이 적은 실험실용 티슈 VWR, 카탈로그 번호 21905-026또는 이와 동등

플로우 셀 스테이지 건조 및 일반 목적.

마이크로 원심분리 튜브, 1.5ml VWR, 카탈로그 번호 20170-038또는 이와 동등

NaOH 및 라이브러리 희석 시 용량 혼합.

NaOCl, 5% Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호239305

관리세척.

NovaSeq 6000 Reagent Kit Illumina(카탈로그 번호는 10페이지의 키트 개요 참조)

시퀀싱 런 수행.

파이펫 끝, 20μl 일반 실험실 공급자 라이브러리 희석 및 로드를 위한 파이펫팅.



시약 또는 분광 측량용 이소프로필 알코올(99%), 100ml 병

일반 실험실 공급자 정기적으로 광학 구성요소 세척 및 세척 카트리지 지원.

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소모품 공급자 목적

Tween 20 Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호P7949

관리세척.

일반 실험실용 순수 일반 실험실 공급자 라이브러리 변성을 위해 NaOH 희석.관리세척을 위해 Tween 20 및 하이포아염소산나트륨 희석.

[NovaSeq Xp 워크플로우] 다음키트 중 1개:• NovaSeq Xp 2-Lane Kit• NovaSeq Xp 4-Lane Kit

Illumina:

• 카탈로그 번호 20021664• 카탈로그 번호 20021665

라이브러리를 플로우 셀에 수동으로 로드.

• SP, S1 및 S2 플로우 셀용 2레인 키트• S4 플로우 셀용 4레인 키트

[NovaSeq Xp 워크플로우] 0.5ml및 1.7ml 튜브

일반 실험실 공급자 ExAmp 혼합을 위해 필요.

[NovaSeq Xp 워크플로우] [옵션] 다음 매니폴드 팩 중 1가지:• NovaSeq Xp 2-Lane Manifold

Pack• NovaSeq Xp 4-Lane Manifold

Pack

Illumina:

• 카탈로그 번호 20021666• 카탈로그 번호 20021667

라이브러리를 플로우 셀에 수동으로 로드하기 위한 예비 Spare NovaSeq Xp Manifold.

[옵션] PhiX Control v3 Illumina, 카탈로그 번호 FC-110-3001

PhiX 컨트롤 spike-in.

Illumina키트의소모품1개의 플로우 셀을 시퀀싱하려면 하나의 NovaSeq 6000 Reagent Kit가 필요합니다. 각 키트는 다음 표에 나와 있는 여러 소모품으로 구성됩니다. 듀얼 플로우 셀 런의 경우 2개의 키트를 사용하십시오.

소모품(각각 1개) 목적

버퍼 카트리지 런을 위한 시퀀싱 버퍼를 제공합니다.

클러스터 카트리지 런을 위한 클러스터링, 인덱싱 및 페어드 엔드 시약을 제공합니다.

플로우 셀 플로우 셀에서 클러스터링 및 시퀀싱 반응이 발생합니다.

SBS 카트리지 런을 위한 시퀀싱 시약을 제공합니다.

라이브러리 튜브 풀링된 라이브러리 및 변성된 라이브러리(고객 제공)를 보관하거나시퀀싱의 클러스터링 효율성을 높이는 조절 믹스를 준비하는 데 사용된 튜브를 비웁니다.

표 9 NovaSeq 6000 Reagent Kit의소모품

NovaSeq Xp 워크플로우에 따라 라이브러리를 플로우 셀에 직접 로드하는 경우 각 시약 키트를 1개의NovaSeq Xp Kit로 보충하십시오. 각 NovaSeq Xp Kit는 다음 소모품으로 구성됩니다.

소모품(각각 1개) 목적

DPX1 ExAmp 마스터 믹스를 준비합니다.

DPX2

DPX3

NovaSeq Xp Manifold 라이브러리를 플로우 셀에 로드합니다.

표 10 NovaSeq Xp Kit의소모품

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일반실험실용순수에대한가이드라인항상 일반 실험실용 순수 또는 탈이온수를 사용하여 기기 절차를 수행하십시오. 수돗물은 사용하지 말고 다음 그레이드의 순수 또는 그와 동등한 순수를 사용하십시오.

u 탈이온수

u Illumina PW1

u 18MΩ 순수

u Milli-Q 순수

u Super-Q 순수

u 분자 생물 실험용 순수

장비

항목 출처

냉동고, -25°C ~ -15°C 일반 실험실 공급자

눈금 실린더, 500ml, 멸균 일반 실험실 공급자

얼음통 일반 실험실 공급자

파이펫, 20µl 일반 실험실 공급자



냉장고, 2°C ~ 8°C 일반 실험실 공급자

튜브, 욕조* 일반 실험실 공급자

[NovaSeq Xp 워크플로우] NovaSeq Xp 플로우 셀 도크 Illumina, 카탈로그 번호 20021663

* 2개의 시약 카트리지와 적절한 수위를 수용할 수 있는 욕조를 사용하십시오(예: 61cm × 91.4cm × 25.4cm).

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4장 Standard워크플로우:소모품준비방법 27라이브러리 가이드라인 27SBS 및 클러스터 카트리지 해동 27사용된 시약병 비우기 28플로우 셀 준비 29시퀀싱을 위해 라이브러리 풀링 및 변성 30

방법샘플 또는 소모품을 준비하기 전에 NVCS 버전이 다음 표에 나와 있는 최소 소프트웨어 요건을 충족하는지확인해야 합니다.

플로우 셀 최소 소프트웨어 버전

SP 1.6

S1 1.3.1

S2 모두

S4 1.2.0

표 11 최소소프트웨어요건

u 필수 소모품 및 장비가 있는지 확인하십시오 24페이지의 사용자가 준비해야 하는 소모품 및 장비를 참조하십시오.

u 소모품을 준비할 때 항상 라벨에서 구성요소 간에 호환이 되는지 확인하십시오. SP, S1, S2 및 S4 구성 요소를 혼합 및 일치시키지 마십시오.

u 지정된 용량, 농도, 온도 및 지속기간을 사용하여 표시된 순서대로 지침을 따르십시오.

u 지침에 중단점이 지정되어 있지 않은 경우 즉시 다음 단계를 진행하십시오.

라이브러리가이드라인모든 지침은 지원되는 라이브러리 프렙 방법에 적용되고 지원되는 NovaSeq 6000 적용 분야에 일반적인 삽입크기를 가정합니다.

u 최상의 결과를 얻으려면 즉각적인 시퀀싱을 위해 라이브러리를 풀링 및 변성합니다.

u 라이브러리를 적용 분야에 적합한 로딩 농도로 희석합니다. 로딩 농도가 너무 낮거나 너무 높으면 필터통과 클러스터의 비율(%PF)에 부정적인 영향을 미칩니다. 낮은 라이브러리 농도는 시퀀싱 중복을 증가시킵니다. 지나치게 높은 라이브러리 농도는 %PF를 압박합니다.

u 최적의 %PF를 달성하려면 정확한 라이브러리 정량화 및 적절한 품질 관리가 필요합니다. 권장사항은 라이브러리 프렙 키트 설명서를 참조하십시오.

SBS 및클러스터카트리지해동1 시퀀싱 런이 진행 중인 경우 해동이 완료되면 기기의 양 측면 모두를 이용할 수 있는지 확인합니다.

2 SBS 및 클러스터 카트리지를 -25°C ~ -15°C 보관장치에서 꺼냅니다.

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3 각 카트리지를 와이어 해동 랙에 놓습니다.랙은 기기와 함께 제공되며 이를 사용하면 욕조에서 뒤집어지는 것을 방지할 수 있습니다.

그림 12 와이어 해동 랙의 카트리지

4 실온 욕조(19°C ~ 25°C)에서 해동합니다.대략 절반 정도 잠기게 합니다.

5 다음 표에 따라 해동 시간을 결정합니다.

주의시약을해동할때뜨거운물을사용하면데이터품질이저하되거나런이실패할수있습니다.

카트리지 해동 시간

SP, S1 및 S2 SBS 카트리지 4시간

SP, S1 및 S2 클러스터 카트리지 최대 2시간

S4 SBS 카트리지 4시간

S4 클러스터 카트리지 최대 4시간

6 종이 타월을 사용하여 카트리지 베이스를 완전히 건조합니다. 모든 물이 제거되도록 웰 사이를 건조합니다.

7 알루미늄 포장지에 물이 있는지 검사합니다. 물이 남아 있는 경우 보풀 없는 티슈로 닦아서 건조합니다.

8 각 카트리지의 아래쪽을 검사하여 저장장치에 얼음이 없는지 확인합니다. 이는 시약이 해동되었음을 나타냅니다.

9 각 카트리지를 10회 뒤집어서 시약을 혼합합니다.

10 벤치에서 각 카트리지의 바닥을 가볍게 두드려서 공기 버블을 줄입니다.

11 4시간 이내에 시약을 기기에 로드할 수 없는 경우 최대 24시간 동안 2°C ~ 8°C에 보관합니다.

사용된시약병비우기다음 지침에 따라 매 시퀀싱 런마다 사용된 시약병을 비우십시오. 시스템이 사용된 시약을 외부로 보내도록구성된 경우 소형 병으로 사용된 시약을 수집하여 각 시퀀싱 런마다 비워야 합니다. 대형 병은 제자리에 있어야 합니다.

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경고이시약에는잠재적으로유해한화학물질이포함되어있습니다. 흡입, 섭취, 피부접촉및눈접촉으로인해신체적상해가발생할수있습니다. 보호안경, 장갑, 실험가운등노출된위험에적합한보호장비를착용하십시오. 사용된시약은화학물질폐기물로취급하고해당지역, 국가, 현지법률및규정에따라폐기하십시오. 환경, 건강, 안전에대한추가정보는 support.illumina.com/sds.html에서 SDS를참조하시기바랍니다.

1 다음과 같이 사용된 소형 시약병을 꺼내서 비웁니다.

a 레버를 올려서 사용된 소형 시약병을 알코브에서 꺼냅니다. 병의 측면을 잡습니다.b 병 앞면에 있는 캡 홀더에서 나사형 캡을 제거합니다.c 쏟아지지 않도록 병 입구를 캡으로 밀봉합니다.d 내용물을 다른 병의 내용물과 분리하여 보관하고 해당 표준에 따라 폐기합니다.e 캡이 없는 병을 알코브에 다시 넣은 다음 레버를 내립니다. 캡을 캡 홀더에 보관합니다.

2 다음과 같이 사용된 대형 시약병을 꺼내서 비웁니다.

a 상단 핸들을 사용하여 사용된 대형 시약병을 버퍼 서랍의 왼쪽에서 꺼냅니다.b 병 앞면에 있는 캡 홀더에서 나사형 캡을 제거합니다.c 쏟아지지 않도록 병 입구를 나사형 캡으로 밀봉합니다.d 해당 표준에 따라 내용물을 폐기합니다. 비울 때 두 핸들을 잡습니다.e 캡이 없는 병을 버퍼 서랍에 다시 넣습니다. 캡을 캡 홀더에 보관합니다.

그림 13 빈 병 반환

3 가루가 묻지 않는 새 장갑을 착용하여 기기 표면의 오염을 방지합니다.

4 버퍼 서랍을 닫은 다음 액체 부분 도어를 닫습니다.

경고사용된시약병을비우지않으면런이종료되고오버플로우가발생하여기기가손상되고안전상의위험이발생할수있습니다.

플로우셀준비1 2°C ~ 8°C 보관장치에서 새로운 플로우 셀 패키지를 꺼냅니다.

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http://support.illumina.com/sds.html

2 플로우 셀이 실온에 도달하도록 포장지에 싸인 플로우 셀 패키지를 10~15분 동안 그대로 둡니다.플로우 셀을 패키지에서 꺼낸 후 12시간 이내에 사용합니다.

시퀀싱을위해라이브러리풀링및변성

정규화된라이브러리풀생성다음 지침에 따라 라이브러리를 적절한 농도로 정규화한 다음 풀링하십시오. 동일한 플로우 셀에 시퀀싱된라이브러리는 정규화된 단일 풀에 통합해야 합니다.

1 적용 분야 및 플로우 셀 유형별 일반적인 리드 수와 권장 플렉시티는 다음 표를 참조하십시오.

적용 분야 플로우 셀 유형플로우 셀당 필터 통과 페어드 엔

드 리드 수(B)레인당 라이브러리 수

인간 유전체 SP 1.3~1.6 ~2

S1 2.6~3.2 ~4

S2 6.6~8.2 ~10

S4 16~20 ~24

엑솜 SP 1.3~1.6 ~20

S1 2.6~3.2 ~40

S2 6.6~8.2 ~100

S4 16~20 ~250

전사체 SP 1.3~1.6 ~16

S1 2.6~3.2 ~32

S2 6.6~8.2 ~82

S4 16~20 ~200

표 12 권장라이브러리풀플렉시티

풀링을위한라이브러리정규화1 원하는 최종 로드 농도를 기준으로 필요한 풀링된 라이브러리 농도를 결정합니다.

31페이지의 권장 로드 농도를 참조하십시오.

최종 로드 농도(pM) 풀링된 라이브러리 농도(nM)

100 0.50

150 0.75

200 1

250 1.25

300 1.50

350 1.75

400 2

450 2.25

500 2.50

2 10mM Tris-HCl, pH 8.5를 사용하여 라이브러리를 원하는 풀링된 라이브러리 농도로 정규화합니다.라이브러리를 적절한 농도로 희석하려면 Illumina 웹사이트의 Pooling Calculator(풀링 계산기)를 참조하십시오.

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http://support.illumina.com/help/pooling-calculator/pooling-calculator.html

권장로드농도최적의 DNA 로드 농도는 라이브러리 유형과 삽입 크기에 따라 달라집니다. 다음 표에 삽입 크기가 ≤ 450bp이고 Illumina 라이브러리를 기준으로 권장되는 DNA 로드 농도가 나와 있습니다. 삽입 크기가 더 작은 라이브러리는 권장 범위의 하단에 로드하십시오. 삽입 크기가 > 450bp인 라이브러리의 경우 더 높은 로드 농도가필요할 수 있습니다.

참고Illumina 라이브러리프렙이아닌방법을통해생성된라이브러리의경우최적의 %PF를얻기위해처음에특정라이브러리유형의적정을수행하여최적의시딩농도를확보해야할수도있습니다. 최적의로드농도가결정되면앞으로동일한라이브러리유형에적용해야합니다.

라이브러리 유형 최종 로드 농도(pM) 풀링된 로드 농도(nM)

PhiX¹ 250 1.25

DNA PCR-free 라이브러리 풀 175~350 0.875~1.75

DNA PCR로 증폭된 라이브러리 풀 300~600 1.5~3.0

단일 셀² 250~500 1.25~2.5

표 13 Standard워크플로우(소프트웨어버전1.1이상)의권장로드농도

¹ PhiX 전용 런에 해당합니다.

² 단일 셀은 Xp 워크플로우에 대해서만 검증되었습니다.

HiSeq™ X, HiSeq™ 4000 또는 HiSeq™ 3000의 최종 로드 농도를 최적화한 경우 해당 농도의 1.5배를NovaSeq 6000에 사용하십시오. 예를 들어 HiSeq X의 최종 로드 농도가 200pM인 경우 300pM를 NovaSeq6000에 사용합니다.

정규화된라이브러리풀링및옵션PhiX컨트롤추가1 적절한 용량의 정규화된 각 라이브러리를 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 혼합하여 다음과 같은 최종

용량 중 1개를 생성합니다.

모드 최종 용량(µ l)

SP/S1 100

S2 150

S4 310

예를 들어 6플렉스 라이브러리 풀 및 S2 모드의 경우 동일한 농도로 정규화된 각 라이브러리의 25µ l를 혼합합니다. 4플렉스 라이브러리 풀 및 S1 모드의 경우 정규화된 각 변성되지 않은 라이브러리의 25µ l를 혼합합니다.

2 [옵션] 풀링되지 않은 나머지 라이브러리를 -25°C ~ -15°C의 온도로 보관합니다.

3 [옵션] 다음과 같이 변성되지 않은 1% PhiX를 spike-in합니다.

a 10mM Tris-HCl, pH 8.5를 사용하여 10nM PhiX를 2.5nM로 희석합니다.b 적절한 용량의 변성되지 않은 2.5nM PhiX를 변성되지 않은 라이브러리 풀의 튜브에 추가합니다.

모드 변성되지 않은 2.5nM PhiX(µ l) 변성되지 않은 라이브러리 풀(µ l)

SP/S1 0.6 100

S2 0.9 150

S4 1.9 310

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PhiX를 spike-in할 때 1%가 균형 잡힌 라이브러리의 권장 용량입니다. 다양성이 낮은 라이브러리가 더 필요할 수 있습니다. PhiX 컨트롤을 다양성이 낮은 라이브러리와 함께 사용하기 위한 지침은 Illumina 기술지원에 문의하십시오.

Fresh NaOH희석액준비시퀀싱을 위해 라이브러리를 변성하려면 Fresh 0.2N NaOH 희석액을 준비하십시오. 작은 파이펫팅 오류가 최종 NaOH 농도에 영향을 미치지 않도록 추가 용량을 준비합니다.

주의새로희석한 0.2N NaOH는 변성프로세스에반드시필요합니다. 변성이적절하지않으면수율이감소할수있습니다.

1 다음 용량을 마이크로 원심분리 튜브에 혼합하여 1N NaOH를 0.2N으로 희석합니다.

시약 1개 플로우 셀의 용량(µ l) 2개 플로우 셀의 용량(µ l)

일반 실험실용 순수 40 80

Stock 1N NaOH 10 20

표 14 SP/S1/S2모드

이러한 용량을 사용하면 1개 플로우 셀의 경우 50µ l 0.2N NaOH, 2개 플로우 셀의 경우 100µ l 0.2N NaOH가 생성됩니다.

시약 1개 플로우 셀의 용량(µ l) 2개 플로우 셀의 용량(µ l)

일반 실험실용 순수 80 160

Stock 1N NaOH 20 40

표 15 S4모드

이러한 용량을 사용하면 1개 플로우 셀의 경우 100µ l 0.2N NaOH, 2개 플로우 셀의 경우 200µ l0.2N NaOH가 생성됩니다.

2 여러 번 뒤집어서 혼합하거나 완전히 흔듭니다. 튜브의 캡을 닫은 상태로 보관하고 12시간 이내에 사용합니다.

라이브러리풀및옵션PhiX컨트롤변성1 다음과 같이 0.2N NaOH를 변성되지 않은 라이브러리 풀 및 옵션 PhiX가 들어있는 튜브에 추가합니다.

플로우 셀0.2NNaOH

변성되지 않은 라이브러리 풀(µ l) 결과 용량

SP/S1 25 100 125µl 또는 125.6µl(PhiX 포함 시)

S2 37 150 187µl 또는 187.9µl(PhiX 포함 시)

S4 77 310 387µl 또는 388.9µl(PhiX 포함 시)

2 캡으로 닫은 다음 가볍게 흔듭니다.

3 280 × g에서 최대 1분 동안 원심분리합니다.

4 실온에서 8분 동안 배양하여 변성합니다.

5 다음과 같이 400mM Tris-HCl, pH 8.0을 추가하여 중화합니다.

모드 400mM Tris-HCl, pH 8.0 (µ l) 결과 용량

SP/S1 25 150µl 또는 150.6µl(PhiX 포함 시)

S2 38 225µl 또는 225.9µl(PhiX 포함 시)

S4 78 465µl 또는 466.9µl(PhiX 포함 시)

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6 캡으로 닫은 다음 가볍게 흔듭니다.

7 280 × g에서 최대 1분 동안 원심분리합니다.

8 변성된 라이브러리의 용량 또는 변성된 라이브러리 및 PhiX의 전체 용량을 NovaSeq 6000 Reagent Kit와함께 제공된 라이브러리 튜브로 옮깁니다.

9 즉시 라이브러리 튜브를 클러스터 카트리지에 로드하고 런을 설정합니다.라이브러리 튜브를 포함한 시약 카트리지는 30분 이내에 기기에 로드해야 합니다.

10 [옵션] 즉시 진행할 수 없다면 라이브러리 튜브를 캡으로 닫고 -25°C ~ -15°C에서 최대 3주 동안 보관합니다. 해동 후에 다시 냉동하지 마십시오.

주의필요한경우에만라이브러리튜브를보관하십시오. -25°C ~ -15°C에서장기간보관하면중복이증가하여수율이감소할수있습니다.

SBS및클러스터카트리지준비1 각 카트리지의 아래쪽을 검사하여 저장장치에 얼음이 없는지 확인

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