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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

PROSPECÇÃO DE MOLÉCULAS COM POTENCIAL NUTRACÊUTICO EM

SEMENTES DE Enterolobium contortisiliquum (VELL.) MORONG.: PURIFICAÇÃO

E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE TRÊS INIBIDORES DE QUIMOTRIPSINA

LADY CLARISSA BRITO DA ROCHA BEZERRA

FORTALEZA-CEARÁ

2010

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LADY CLARISSA BRITO DA ROCHA BEZERRA

PROSPECÇÃO DE MOLÉCULAS COM POTENCIAL NUTRACÊUTICO EM

SEMENTES DE Enterolobium contortisiliquum (VELL.) MORONG.: PURIFICAÇÃO

E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE TRÊS INIBIDORES DE QUIMOTRIPSINA

Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação

em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do grau de Mestre em Bioquímica

Área de concentração: Bioquímica

Orientadora: Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho

Co-orientador: Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales

FORTALEZA-CEARÁ

2010

2

B469p Bezerra, Lady Clarissa Brito da Rocha

Prospecção de moléculas com potencial nutracêutico em sementes de

Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong.: purificação e

caracterização parcial de três inibidores de quimotripsina / Lady Clarissa

Brito da Rocha Bezerra, 2010.

97 f. ;il. color. enc.

Orientadora: Profa. PhD. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho

Co-orientador: Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales

Área de concentração: Bioquímica Vegetal

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de

Ciências, Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular, Fortaleza, 2010.

1. Enterolobium contortisiliquum. 2. Proteases. 3. Nutracêutica. I.

Carvalho, Ana de Fátima Fontenele Urano (Orient.). II. Sales, Maurício

Pereira de (Co-orient.). III. Universidade Federal do Ceará – Programa de

Pós-Graduação em Bioquímica. III.Título.

CDD 574.192

3

LADY CLARISSA BRITO DA ROCHA BEZERRA

PROSPECÇÃO DE MOLÉCULAS COM POTENCIAL NUTRACÊUTICO EM

SEMENTES DE Enterolobium contortisiliquum (VELL.) MORONG.: PURIFICAÇÃO E

CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE TRÊS INIBIDORES DE QUIMOTRIPSINA

Esta Dissertação foi submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em

Bioquímica e Biologia Molecular como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre

em Bioquímica, outorgado pela Universidade Federal do Ceará e encontra-se à disposição dos

interessados na Biblioteca do Centro de Ciências e Tecnologia da referida universidade.

A transcrição de qualquer trecho desta tese é permitida, desde que seja feita em

conformidade com as normas da ética científica.

Aprovada em: ____/____/____.

Lady Clarissa Brito da Rocha Bezerra

Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho

Departamento de Biologia

Universidade Federal do Ceará

- Orientadora -

Dra. Adeliana Silva de Oliveira

Departamento de Bioquímica

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

- Examinadora -

Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular

Universidade Federal do Ceará

- Examinadora -

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Dedico esta obra, com amor e gratidão, aos

homens da minha vida: Paulo Lopes, Raul

Júlio e Bezerra Neto.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, pela dádiva da vida. Por me proporcionar saúde e forças a cada amanhecer. E por me

permitir acreditar que o sol sempre volta a surgir após cada tempestade.

À minha orientadora, Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho, inicialmente pela

feliz convivência no laboratório, mesmo nos dias em que todos os problemas vêm à tona de

uma só vez. Pela divertida companhia na hora do café e pelas várias histórias de vida

compartilhadas com alegria e humor. Pelo apoio e confiança incondicionais quando mais

precisei. Pelos valiosos ensinamentos transmitidos, sempre zelando pela ética, caráter e por

uma ciência livre de vaidades e engajada na solução dos problemas sociais. Muitíssimo

obrigada!

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales, por ter me proporcionado

momentos valiosos de aprendizagem e descontração durante minha estadia em seu

laboratório. Pela acolhida calorosa e pela agradável companhia em vários momentos. Pelas

perguntas excitantes, sugestões, críticas e ensinamentos de cientista experiente, pelo incentivo

incessante na busca de resultados claros e coerentes. Pela orientação dedicada e confiança em

mim depositada. Muitíssimo obrigada!

À Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos, pela convivência sempre agradável, por estar sempre

disposta a esclarecer dúvidas e por suas valiosas sugestões. Pela alegria, otimismo e

motivação dispensados em momentos de insegurança e incerteza. Pela paciência e dedicação

durante as disciplinas. Por aceitar a participação na banca examinadora deste trabalho, mesmo

com tantos outros trabalhos a realizar. Muitíssimo obrigada!

À Dra. Adeliana Silva de Oliveira (carinhosamente Ade), minha co-co-orientadora, pelos

valiosos conhecimentos compartilhados, pela gentileza em ajudar e esclarecer dúvidas, pela

paciência em escutar e discutir as minhas idéias mirabolantes e confusas, pelo apoio e

incentivo não apenas no trabalho, mas sobretudo na vida pessoal. Pela disponibilidade em

contribuir mais ainda para a concretização deste trabalho, através de participação na banca

examinadora. Agradeço ainda pela convivência agradável e pela amizade. Muitíssimo

obrigada!

6

Às professoras Vânia Maria Maciel Melo, Suzana Cláudia Silveira Martins e Cláudia Miranda

Martins, pela convivência agradável ao longo de todos estes anos.

A todos os professores que ministraram disciplinas para o Curso de Mestrado em Bioquímica

Vegetal da Universidade Federal do Ceará, pelos conhecimentos cedidos e, em especial, à

Profa. Ilka Vasconcelos e ao Prof. José Tadeu Abreu de Oliveira por me trazerem

experiências de vida e ensinamentos que livros não podem transmitir.

À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, na pessoa da Profa. Dra.

Norma Benevides, Coordenadora, da Profa. Dra. Ilka Vasconcelos, Vice-Coordenadora, e de

Márcio Souza, Secretário, pelo apoio institucional no decorrer de meu curso de Mestrado.

Aos colegas e amigos do Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais (Bioprospec),

Martônio, Terezinha, Rachel, Renata, Gabrielle, Priscila e Cecília, pela amizade,

companheirismo, credibilidade e pelos maravilhosos e impagáveis momentos de trabalho

(recheados de árduas discussões científicas, né Martônio!?) e diversão ao lado de vocês,

sempre com muita alegria e gargalhadas incessantes, capazes de eliminar todos os radicais

livres! Em especial aos grandes, velhos e queridos amigos Davi, Glauber e Nathanna, por

todos os motivos mencionados e ainda por sempre me apoiarem incondicionalmente quando

preciso, por brigarem comigo quando mereço e por acalmarem minhas angústias e aflições.

Vocês são “ispiciais”!

Aos colegas e amigos que já fizeram parte do nosso grupo de pesquisa, Nara, André, Mariana,

Sayonara, e Pedro, pelos felizes e inesquecíveis momentos de convivência no lab. Em

especial aos amigos de velha e jovem guarda, Paulo Michel e Bruno, pelos motivos

mencionados e também pela disponibilidade em ajudar com os experimentos envolvendo

células tumorais.

Às colegas e amigas “agregadas” do laboratório, Eliane e Cecília, por estarem sempre

presentes nos momentos de confraternização, trazendo ainda mais alegrias e sorrisos ao nosso

grupo.

7

À amiga Francisca Berenice Alves, por sua amizade, carinho, alegria e presteza em vários

momentos.

Ao amigo José Valdenor de Oliveira, pelos sorrisos contagiantes que nunca saem do rosto,

pelo otimismo e presteza, pela agradável convivência no dia-a-dia.

Aos colegas e amigos da turma 2008.1, pelo companheirismo durante todo o curso e, em

especial, a Nathanna, Mirella, Mariana e Daniel pela amizade, horas de descontração e de

desespero compartilhadas.

Aos queridos amigos ainda da época de graduação, Liana e Daniel, pela torcida e carinho

sinceros, mesmo à distância. Saudade de vocês!

Aos professores do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Adriana Uchôa, Elizeu Antunes e Hugo Rocha, pelos momentos de estudo durante as

reuniões e seminários, quando tive o prazer de aprender um pouco com o muito que têm a

oferecer.

Aos novos colegas e amigos do Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas

(LQFPB), Cleysyvan, Dayse, Rafaella, Patrícia, Ana Paula, Norberto, Ticiana, Raphael,

Alexandre Serquiz, Kaline, Richele, Luciana e Phellipe, pela agradável e divertida

convivência durante quase um ano, pelo carinho e amizade, pelos vários momentos de auxílio

na bancada e pelos vários almoços até 3 horas da tarde. Em especial ao Jannison, cearense de

verdade e com força, por disponibilizar bastante tempo para me ajudar em uma das etapas

mais importantes deste trabalho, pelo seu otimismo e torcida, pelas idéias de novos trabalhos

e por estar sempre disponível para tirar dúvidas e dar sugestões.

Aos colegas e amigos que já fizeram parte do LQFPB, Paulinha, Fabinho, Alexandre Martins

e Leal, pelos momentos de trabalho e diversão juntos, sempre recheados de gargalhadas e

“cultura inútil”. Em especial à Fabíola, que me recebeu tão bem desde o primeiro dia e que se

dispôs a me ajudar em vários momentos, com paciência e dedicação, e ao Daniel, que também

disponibilizou muito do seu tempo escasso em me ajudar no acúmulo de material para

realização dos ensaios biológicos deste trabalho.

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Às amigas “agregadas”, Virgínia, pelas gargalhadas contagiantes e pelo apoio em momentos

de angústia e solidão; e Jailma, pela calma e otimismo que transmitem a certeza de que tudo

vai dar certo.

Às minhas mais novas melhores amigas, Sheyla e Roberta. Muito obrigada pelo carinho e

pela amizade gratuita e sincera, pelos inesquecíveis e hilários momentos nos “shoppings”,

pela companhia e pelo apoio em vários momentos difíceis, pelos conselhos e orientações.

Desejo “muito bastante” que nossa amizade ultrapasse as barreiras do tempo e da distância, e

cada vez que a gente se encontre seja como se a gente nunca tivesse se separado. “Pela hóstia

consagrada”! Adoro vocês!

Ao meu pai, Paulo Lopes, e irmão, Raul Júlio, por estarem sempre comigo, mesmo à

distância. Por respeitarem e apoiarem as minhas decisões, sejam quais forem. Por terem

compreendido e tolerado a minha ausência por longos períodos. E por sempre acreditarem em

mim e nos meus sonhos.

Ao meu companheiro, Bezerra Neto, pelo imenso esforço em me apoiar quando estive longe.

Por acreditar que seria capaz de realizar meu trabalho com competência e compromisso,

apesar das dificuldades. Por não me deixar desistir quando tudo estava muito difícil de

suportar. Por dividir comigo a angústia de estarmos separados, e ainda assim permanecemos

unidos. Pelo seu amor grande, forte e incondicional. Obrigada amor!

Às minhas mães (in memoriam), Marinalva Brito e Jandira Lopes, pela imensa contribuição à

minha educação e pelos ensinamentos de vida, jamais aprendidos em livro algum.

A todos aqueles que, de alguma maneira, contribuíram para a execução deste trabalho.

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Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes instituições:

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,

Ceará.

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências, Universidade Federal

do Ceará, Fortaleza, Ceará.

Departamento de Biologia, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,

Ceará.

Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas (LQFPB), Centro de Biociências,

Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio

Grande do Norte.

Laboratório de Oncologia Experimental (LOE), Faculdade de Medicina, Departamento de

Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.

Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais (Bioprospec), Centro de Ciências,

Departamento de Biologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.

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“A vida é uma peça de teatro que não permite ensaios. Por

isso, cante, chore, dance, sorria e viva intensamente antes

que a cortina se feche e a peça termine sem aplausos.”

Charles Chaplin

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RESUMO

Sementes de leguminosas constituem uma das principais fontes de proteína na alimentação

humana e animal. Outros interesses têm sido despertados para o potencial nutracêutico

inerente a essas proteínas vegetais, uma vez que muitas proteínas bioativas, até então referidas

apenas como fatores antinutricionais, têm exercido efeitos benéficos no organismo, atuando

na cura e/ou prevenção de várias doenças. Dentre esses, destacam-se os inibidores de

proteases, os quais desempenham importantes funções na defesa de plantas e apresentam

propriedades biológicas de interesse para aplicações biotecnológicas nas áreas farmacológica

e médica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial nutricional e nutracêutico de

sementes de Enterolobium contortisiliquum, enfocando a purificação e caracterização parcial

de inibidores de quimotripsina e avaliar seu efeito antiproliferativo contra células

tumorigênicas humanas. As sementes de E. contortisiliquum são uma excelente fonte de

proteínas, apresentando cerca de 50% desse macronutriente em base seca. A presença de

inibidores de proteases em quantidades elevadas sugere que essas moléculas possam vir a ter

uma aplicação nutracêutica. Dessa forma, foram purificados três inibidores de quimotripsina,

denominados EcCI1, EcCI2 e EcCTI, os quais foram parcialmente caracterizados. As massas

moleculares aparentes determinada para os três inibidores é de 17, 17 e 19 kDa,

respectivamente. EcCI1 e EcCI2 são inibidores do tipo não competitivo e apresentam ki de 4 x

10-8

e 2,5 x 10-8

M, respectivamente. Em contrapartida, EcCTI inibe a quimotripsina de forma

competitiva e apresenta ki de 5 x 10-8

M. Apenas EcCTI foi capaz de inibir a tripsina (98%).

EcCI1 e EcCI2 inibiram satisfatoriamente a elastase neutrofílica (ca. de 70%), mas não EcCTI

(20%). Os três inibidores inibiram sutilmente a elastase pancreática (ca. de 20%) e nenhum

foi capaz de inibir a papaína. Os três inibidores são altamente estáveis às condições extremas

de temperatura (de 37 a 90 °C para EcCI2 e de 37 a 100 °C para EcCI1 e EcCTI ), pH (2 a 12)

e DTT nas concentrações de 1 a 100 mM para EcCI1 e EcCTI e de 1 a 10 mM para EcCI2.

Outros estudos são necessários para melhor caracterizar esses inibidores. Nenhum dos

inibidores promoveu efeito antiproliferativo contra as quatro linhagens de células

tumorigênicas testadas.

Palavras-chave: Enterolobium contortisiliquum, inibidores de proteases, nutracêutica,

potencial nutricional

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ABSTRACT

Leguminous seeds are main sources of food proteins for humans and animals. Other interests

in these plant proteins concerning their nutraceutical properties have been raised, since many

bioactive proteins, previously referred only as anti-nutritional factors, have exerted beneficial

effects on health, acting as chemopreventive agents against several diseases. Among these are

protease inhibitors, which play important roles in plant defense and have biological properties

of interest for biotechnological applications in pharmaceutical and medical areas. This study

aimed to evaluate the nutritional and nutraceutical potential of Enterolobium contortisiliquum

seeds, focusing on the purification and partial characterization of chymotrypsin inhibitors and

assess their antiproliferative effect against human tumor cells. E. contortisiliquum seeds are

an excellent protein source, with about 50% of this macronutrient on a dry basis. The presence

of protease inhibitors in high quantities suggests that these molecules may exert a

nutraceutical application. Three chymotrypsin inhibitors, denominated EcCI1, EcCI2 and

EcCTI were purified and partially characterized. EcCI1, EcCI2 and EcCTI show molecular

weights of 17, 17 and 19 kDa, respectively. EcCI1 and EcCI2 are non-competitive inhibitors

with ki of 4 x 10-8

and 2.5 x 10-8

M, respectively, while EcCTI inhibits chymotrypsin

competitively with ki of 5 x 10-8

M. Only EcCTI was able to inhibit trypsin (98%). EcCI1 and

EcCI2 successfully inhibited leukocyte elastase (about 70%), but EcCTI (20%). The three

inhibitors slightly inhibited pancreatic elastase (about 20%) and none was able to inhibit

papain. The three inhibitors have a high thermal stability (37 to 90 °C for EcCI2 and 37 to

100 °C for EcCI1 and EcCTI), pH (2 to 12) and DTT concentrations ranging from 1 to 100

mM for EcCI1 and EcCTI and from 1 to 10 mM for EcCI2. Further studies are needed to

better characterize these inhibitors. None of the inhibitors promoted antiproliferative effect

against four tumorigenic cell lines tested.

Keywords: Enterolobium contortisiliquum, chymotrypsin inhibitor, nutraceutical properties,

nutritional potential

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. A área em destaque no mapa representa a abrangência do Bioma Caatinga no

Nordeste do Brasil .................................................................................................................... 21

Figura 2. A área em destaque no mapa representa o domínio do clima semi-árido no Nordeste

Brasil, por sua vez delineando a abrangência do Bioma Caatinga na mesma região ............... 22

Figura 3. Imagens de Enterolobium contortisiliquum. A: planta adulta; B: folhas e flores; C:

frutos; D: sementes; E: tronco; F: madeira (Lorenzi, 1998) ..................................................... 26

Figura 4. Possíveis mecanismos e sítios de interação nos quais inibidores de proteases podem

atuar a fim de inibir o processo de carcinogênese (Adaptado de JOHNSON et al., 1994). ..... 31

Figura 5. Procedimento para determinação de Fibra Alimentar Total da farinha delipidada das

sementes de Enterolobium contortisiliquum segundo a metodologia descrita pela AOAC

(1997) ....................................................................................................................................... 39

Figura 6. Perfil cromatográfico da fração F5,0 aplicada em Resource Q em sistema FPLC

Äkta Purifier ............................................................................................................................. 58

Figura 7. Perfil eletroforético de amostras de Enterolobium contortisiliquum sob condições

desnaturantes e não redutoras ................................................................................................... 61

Figura 8. Curvas de calibração de EcCI1 e EcCI2 (A) - 17,3 kDa e EcCTI (B) - 19,3 kDa,

construídas em relação a marcadores de massa molecular ....................................................... 62

Figura 9. Curvas de titulação dos inibidores de quimotripsina EcCI1 (A) e EcCI2 (B) e

inibidor de quimotripsina e tripsina EcCTI (C) ........................................................................ 64

Figura 10. Mecanismos de inibição de EcCI1, EcCI2 e EcCTI determinados através de

gráfico duplo-recíproco de Lineweaver-Burk .......................................................................... 65

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Figura 11. Constantes de inibição (ki) de EcCI1 (A), EcCI2 (B) e EcCTI (C) através de

representação de Dixon ............................................................................................................ 66

Figura 12. Estabilidade térmica dos inibidores EcCI1 (A), EcCI2 (B) e EcCTI (C) .............. 69

Figura 13. Estabilidade de EcCI1 (A), EcCI2 (B) e EcCTI (C) a variação de pH .................. 70

Figura 14. Estabilidade dos inibidores EcCI1 (A), EcCI2 (B) e EcCTI (C) ao agente redutor

ditiotreitol (DTT). ..................................................................................................................... 71

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição química elementar (g/100g) e energia (kcal/100g) da farinha de

sementes de Enterolobium contortisiliquum em base seca ...................................................... 53

Tabela 2. Composição de aminoácidos (g/kg de proteína) da farinha delipidada de sementes

de Enterolobium contortisiliquum comparada à clara do ovo, soja e aos requerimentos

estabelecidos pela FAO/WHO/UNU para crianças em diferentes faixas etárias ..................... 54

Tabela 3. Análise quantitativa da presença de fatores tóxicos e/ou antinutricionais nas

sementes de Enterolobium contortisiliquum ............................................................................ 55

Tabela 4. Atividade inibitória de quimotrisina das frações proteicas de Enterolobium

contortisiliquum: Percentual de Inibição e Atividade Específica ............................................. 57

Tabela 5. Tabela de Purificação dos inibidores de quimotripsina de sementes de

Enterolobium contortisiliquum ................................................................................................. 59

Tabela 6. Especificidade de inibição apresentada pelos inibidores EcCI1, EcCI2 e EcCTI

frente a enzimas serínicas e cisteínica ...................................................................................... 67

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ABREVIATURAS

BANA Nα-Benzoil-DL-Arginina-p-Naftilamida

BApNA Nα-Benzoil-DL-Arginina-p-Nitroalinida

BSA Albumina Sérica Bovina

DL50 Dose Letal capaz de matar 50% dos animais testados

DMACA 4-Dimetilaminocinamaldeído

DMSO Dimetilsolfóxido

DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético

FAT Fibra Alimentar Total

IC50 Concentração de inibidor capaz de reduzir em 50% a atividade

enzimática

MTT Brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazólio

PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

SAAVpNA N-Succinil-L-Alanil-L-Alanil-L-Valina-p-Nitroanilida

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

TCA Ácido Tricloroacético

TEMED N’, N’, N’, N’, tetrametiletilenodiamina

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

UI Unidades de Inibição

UH Unidades de Hemaglutinação

ki Constante de inibição

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 20

1.1. O Bioma Caatinga ................................................................................................................. 20

1.2. Valorização da Biodiversidade da Caatinga .......................................................................... 23

1.3. Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong.; Fabaceae .................................................. 24

1.4. Leguminosas como Fonte de Proteínas Alimentares e Bioativas .......................................... 27

1.5. Inibidores de Proteases .......................................................................................................... 27

1.6. Atividade Anticarcinogênica de Inibidores de Proteases ...................................................... 29

2. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 33

2.1. Objetivo Geral ....................................................................................................................... 33

2.2. Objetivos Específicos ............................................................................................................ 33

3. MATERIAL ............................................................................................................................. 34

3.1. Material Biológico ................................................................................................................. 34

3.1.1. Sementes de E. contortisiliquum ........................................................................................ 34

3.1.2. Células Tumorais ................................................................................................................ 34

3.2. Reagentes Químicos .............................................................................................................. 34

3.2.1. Proteínas ............................................................................................................................. 34

3.2.2. Substratos Enzimáticos ....................................................................................................... 34

3.2.3. Outros Reagentes ................................................................................................................ 35

3.3. Equipamentos ........................................................................................................................ 35

4. METODOLOGIA ..................................................................................................................... 37

4.1. Processamento das Sementes de E. contortisiliquum ............................................................ 37

4.2. Composição Proximal de Sementes de E. contortisiliquum .................................................. 37

4.2.1. Umidade ............................................................................................................................. 37

4.2.2. Proteínas Totais .................................................................................................................. 37

4.2.3. Lipídios Totais .................................................................................................................... 38

4.2.4. Matéria Mineral .................................................................................................................. 38

4.2.5. Fibra Alimentar Total ......................................................................................................... 38

4.2.6. Carboidratos Digeríveis ...................................................................................................... 41

4.3. Composição Aminoacídica de Sementes de E. contortisiliquum .......................................... 41

4.4. Preparação do Extrato Proteico Bruto (EB) de E. contortisiliquum ...................................... 42

4.5. Determinação de Fatores Tóxicos e/ou Antinutricionais ...................................................... 42

4.5.1. Lectinas ............................................................................................................................... 42

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4.5.2. Inibidores de Quimotripsina ............................................................................................... 43

4.5.3. Inibidores de Tripsina ......................................................................................................... 43

4.5.4. Toxinas ............................................................................................................................... 43

4.6. Seleção do Melhor Fracionamento Proteico com TCA ......................................................... 44

4.7. Obtenção da Fração Proteica (F5,0) de E. contortisiliquum ................................................. 44

4.8. Dosagem de Proteínas Solúveis ............................................................................................. 44

4.9. Isolamento e Purificação de Inibidor (es) de Quimotripsina ................................................. 45

4.10. Caracterização Bioquímica .................................................................................................. 45

4.10.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) ...................................................... 45

4.10.2. Determinação de IC50 ......................................................................................................................................................... 46

4.10.3. Determinação da Constante de Inibição e do Mecanismo de Inibição ............................. 46

4.10.4. Avaliação da Especificidade dos Inibidores Para Proteases Serínicas e Cisteínica ......... 47

4.10.4.1. Inibição de Tripsina (protease serínica)......................................................................... 47

4.10.4.2. Inibição de Elastase Pancreática (protease serínica) ..................................................... 48

4.10.4.3. Inibição de Elastase Neutrofílica (protease serínica) .................................................... 48

4.10.4.4. Inibição de Papaína (protease cisteínica)....................................................................... 48

4.10.5. Estabilidade dos Inibidores a Agentes Desnaturantes Físicos e Químicos ...................... 49

4.10.5.1. Estabilidade em Diferentes Temperaturas ..................................................................... 49

4.10.5.2. Estabilidade em Diferentes Valores de pH .................................................................... 49

4.10.5.3. Estabilidade Frente ao Agente Redutor DTT ................................................................ 49

4.11. Avaliação da Atividade Antiproliferativa de Inibidores de Quimotripsina de E.

contortisiliquum ............................................................................................................................ 50

4.11.1. Citotoxicidade contra Células Tumorais in vitro .............................................................. 50

5. RESULTADOS ........................................................................................................................ 52

5.1. Potencial Nutricional de Sementes de E. contortisiliquum ................................................... 52

5.2. Atividade Inibitória de Quimotripsina nas Frações Proteicas de E. contortisiliquum .......... 56

5.3. Isolamento e Purificação dos Inibidores de Quimotripsina ................................................... 56

5.4. Caracterização Bioquímica .................................................................................................... 60

5.4.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) ........................................................ 60

5.4.2. Determinação de IC50 ........................................................................................................ 60

5.4.3. Determinação do Mecanismo de Inibição e da Constante de Inibição ............................... 63

5.4.4. Especificidade dos Inibidores para Proteases Serínicas e Cisteínica ................................. 63

5.4.5. Estabilidade dos Inibidores a Agentes Desnaturantes Físicos e Químicos ........................ 63

5.5. Atividade Antiproliferativa in vitro contra Células Tumorais Humanas .............................. 68

19

6. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 72

7. CONCLUSÕES ........................................................................................................................ 81

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 83

20

1. INTRODUÇÃO

1.1. O Bioma Caatinga

A Caatinga é um mosaico de arbustos espinhosos e florestas sazonalmente secas

que cobre a maior parte dos estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba,

Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia e a parte nordeste de Minas Gerais (Figura 1). Ocupa

uma área de 734.478 km2, correspondendo a quase 10% do território brasileiro (LEAL et al.,

2005).

Apesar de ser a única grande região natural brasileira cujos limites estão

inteiramente restritos ao território nacional, pouca atenção tem sido dada à conservação da

variada e marcante paisagem da Caatinga, e a contribuição da sua biota à biodiversidade

extremamente alta do Brasil tem sido subestimada (GIULIETTI et al., 2004).

A Caatinga estende-se por todo o domínio do clima semi-árido (Figura 2), sob um

solo raso e pedregoso e com um índice pluviométrico que varia entre 240 e 1.500 mm anuais,

mas metade da região recebe menos de 750 mm e algumas áreas centrais menos de 500 mm

(SAMPAIO, 1995; PRADO, 2003). A maioria das chuvas na Caatinga (50-70%) é

concentrada em três meses consecutivos, apesar da alta variação anual e dos longos períodos

de seca freqüentes (NIMER, 1972). Tal escassez de água aliada a outros fatores abióticos

criam, durante a maior parte do ano, uma feição desoladora da Caatinga, o que contribuiu para

a criação de mitos a respeito da biodiversidade desse bioma. Ele tem sido descrito como um

ecossistema pobre em espécies e endemismos (VANZOLINI et al., 1980; ANDRADE-LIMA,

1982; PRANCE, 1987). Entretanto, estudos recentes têm desafiado esse ponto de vista e

demonstrado a importância da Caatinga para a conservação da biodiversidade brasileira

(LEAL et al., 2003).

Apesar de estar, realmente, bastante alterada, a Caatinga possui uma grande

variedade de tipos vegetacionais, com elevado número de espécies e, também, remanescentes

de vegetação ainda bem preservada, que incluem um número expressivo de táxons raros e

endêmicos (GIULIETTI et al., 2004).

A lista de espécies existentes na Caatinga é incompleta devido à falta de estudos

na região. Segundo Tabarelli et al. (2000), mais de 40% deste bioma ainda não foi amostrado,

cerca de 80% das áreas estudadas foram sub-amostradas e as áreas protegidas, como reservas

e unidades de conservação, totalizam menos de 2% de todo ecossistema. Portanto, a crescente

21

Figura 1. A área em destaque no mapa representa a abrangência do Bioma Caatinga no

Nordeste do Brasil.

22

Figura 2. A área em destaque no mapa representa o domínio do clima semi-árido no Nordeste

Brasil, por sua vez delineando a abrangência do Bioma Caatinga na mesma região.

Fonte: www.integracao.gov.br/programas/programasregi...

23

preocupação com a conservação do bioma Caatinga vem aumentando à medida que estudos

são realizados na região e novas espécies endêmicas de plantas e animais são constantemente

descritas (ANDRADE-LIMA, 1982; RODAL, 1992; SAMPAIO, 1995; GARDA, 1996,

SILVA e OREN, 1997).

Apesar da alta biodiversidade, a Caatinga ainda é pouco explorada cientificamente

(MARACAJÁ et al., 2003; AMBIENTE BRASIL CAATINGA, 2007). Dentre os biomas

brasileiros, a Caatinga é, provavelmente, o mais desvalorizado e mal conhecido

botanicamente (GIULIETTI et al., 2004).

Contrapondo-se à falta de pesquisas voltadas ao seu conhecimento, há uma

exploração crescente dessa vegetação, com fins meramente lucrativos, necessitando, dessa

forma, de elementos básicos de sustentabilidade (ARAÚJO FILHO e BARBOSA, 2000), que

venham a evitar a extinção de espécies nativas desse bioma, antes mesmo do conhecimento de

várias de suas propriedades e aplicabilidades.

1.2. Valorização da Biodiversidade da Caatinga

A descoberta de espécies florestais de valor econômico e o crescente risco de

extinção decorrente da ação predatória e da exploração indiscriminada em áreas nativas têm

motivado o estudo de espécies que empiricamente possuem algum potencial ou propriedades

que venham a ser reveladas através de pesquisas científicas antes que sejam extintas. O

potencial de muitas espécies silvestres cearenses está sendo subestimado pela comunidade em

suas áreas de ocorrência e pelo setor governamental competente devido à falta de

conhecimento do seu real valor de utilização (RIZZINI, 1978).

Em 2003, foram produzidas no semi-árido nordestino 80 toneladas de mel de

abelha, 30 toneladas de doces, sucos e geléias a partir de umbu, além de 3 mil artigos de couro

comercializados mensalmente, dentre outros. Esses são apenas alguns exemplos do imenso

potencial que a região semi-árida nordestina oferece com a exploração racional, pura ou

associada, dos recursos do bioma caatinga (GUIMARÃES FILHO, 2006).

Outro grande filão do bioma caatinga, contudo, ainda está por ser conhecido e

explorado. Trata-se de sua extraordinária biodiversidade, na qual se inserem espécies vegetais

de uso medicinal, produtoras de óleos essenciais, agentes praguicidas e outras provedoras de

matérias primas para indústria química, alimentar e farmacêutica; espécies animais,

especialmente insetos, inimigas naturais de pragas, provedoras de substâncias de uso

medicinal (soros, enzimas, hormônios); bactérias, fungos e líquens com propriedades de

24

antagonismo a agentes de pragas e doenças, bioinseticidas, biolixiviadoras, antibióticas e

genes indutores de tolerância ao estresse hídrico e salino, à acidez do solo e a doenças. Na

identificação e expressão prática desse potencial, cabe à pesquisa um papel decisivo, ainda

não assumido efetivamente. A valorização dos produtos locais é, no contexto da globalização,

o grande instrumento estratégico para alcançar os objetivos principais de conservar os

recursos da caatinga e assegurar, ao mesmo tempo, o bem estar das populações que nela

vivem e dela dependem (GUIMARÃES FILHO, 2006).

Desta forma, um estudo sistemático poderia revelar o potencial de utilização de

muitas espécies, considerando a riqueza da biodiversidade brasileira. O extrativismo fomenta

cada vez mais os riscos de extinção das espécies e medidas que venham inviabilizar as ações

degradantes, favorecendo ao mesmo tempo o domínio do conhecimento sobre os recursos

naturais, representam, neste momento, o caminho para a elaboração de diagnósticos e

estabelecimentos de estratégias adequadas ao manejo racional desses recursos, bem como

uma alternativa para a melhoria da qualidade de vida das populações envolvidas, no momento

em que a conservação ambiental é fator de vital importância para a humanidade.

1.3. Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong.; Fabaceae

A espécie Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong., conhecida

popularmente como orelha-de-negro, orelha-de-macaco, tamboril, timbaúba, timboúva, dentre

outros, apresenta duas sinonímias botânicas: Mimosa contortisiliqua Vell. e Enterolobium

timbouva Mart. (LORENZI, 1998). Segundo a obra de Carl Friedrich Philipp von Martius,

Flora Brasiliensis (CRIA, 2005), a orelha-de-negro é classificada taxonomicamente da

seguinte forma:

Família Leguminosae (Fabaceae)

Subfamília Mimosoideae

Tribo Ingeae

Gênero Enterolobium Mart.

Enterolobium timbouva Mart.

A distribuição geográfica de E. contortisiliquum é ampla: ocorre desde o Pará ao

Rio Grande do Sul, nas florestas pluvial e semidecídua. É particularmente frequente na

floresta latifoliada da bacia do Paraná. Estende-se ainda até Uruguai e Argentina (BRAGA,

1982; LORENZI, 1998).

25

Esta espécie é uma árvore cuja altura varia de 20 a 35 m, com tronco medindo de

80 a 160 cm de diâmetro. As folhas são compostas, bipinadas, com 2 a 7 jugas de pinas. A

madeira é leve, macia ao corte, pouco resistente, própria para o fabrico de barcos e de canoas

de tronco inteiro, brinquedos, compensados, armações de móveis, miolo de portas e caixotaria

em geral. A copa é ampla e frondosa, proporcionando ótima sombra. As flores apresentam-se

em capítulos globosos esbranquiçados de cerca de 4 mm e reúnem-se em cachos terminais ou

axilares. A vagem é coriácea, dura e lenhosa, indeiscente, preta, incurvo-reniforme,

lembrando uma orelha, daí a denominação popular “orelha-de-negro” (Figura 3) (BRAGA,

1982; LORENZI, 1998).

Orelha-de-negro é uma planta decídua, heliófita, seletiva higrófita, dispersa em

várias formações florestais. É ótima para reflorestamento de áreas degradadas, principalmente

por seu rápido crescimento inicial e para arborização urbana (LORENZI, 1998). Quanto à sua

classificação no estádio sucessional, é considerada, de acordo com Oliveira Filho et al.

(1995), uma espécie pertencente ao grupo ecológico clímax exigente de luz. A árvore floresce

em meados de setembro, prolongando-se até novembro. A maturação dos frutos ocorre

durante os meses de junho e julho, entretanto permanecem na árvore mais alguns meses.

Assim como ocorre com inúmeras outras espécies de plantas da caatinga, pouco

se conhece a respeito do potencial nutricional e bioativo de E. contortisiliquum, a fim de

utilizá-los para fins farmacêuticos e/ou biotecnológicos e de alimentação. Alguns trabalhos,

no entanto, descrevem algumas das potencialidades dessa planta. Hashimoto e Nishimoto

(1996) relatam que E. contortisiliquum é uma planta rica em saponinas triterpenóides e, por

isso, é usada popularmente no tratamento de doenças parasitárias e gonorréia no Brasil.

Mimaki et al. (2003; 2004) descrevem o isolamento e a atividade citotóxica contra

macrófagos de 9 novas saponinas triterpenóides, denominadas Enterolosaponinas A e B e

Contortisiliosídios A-G. Também é relatada na literatura a atividade antibacteriana do óleo

essencial de sementes de E. contortisiliquum contra bactérias Gram-positivas e Gram-

negativas (SHAHAT et al., 2008). Quanto às proteínas bioativas de E. contortisiliquum,

Castro-Faria-Neto et al. (1991) descrevem a atividade pro-inflamatória da enterolobina, uma

proteína hemolítica obtida a partir das sementes de E. contortisiliquum. Já é relatada também

a purificação e caracterização de um inibidor de protease do tipo Kunitz (BATISTA et al.,

1996) e de uma vicilina ligante à quitina, dotada de bioatividade contra fungos filamentosos e

insetos (MOURA et al., 2007).

26

Figura 3. Imagens de Enterolobium contortisiliquum. A: planta adulta; B: folhas e flores; C:

frutos; D: sementes; E: tronco; F: madeira (Lorenzi, 1998).

27

1.4. Leguminosas como Fonte de Proteínas Alimentares e Bioativas

As leguminosas constituem um dos grupos de plantas mais importantes da

humanidade, uma vez que provêem proteínas para a alimentação humana e animal

(DURANTI, 2006). Em várias regiões do mundo, especialmente em países em

desenvolvimento, sementes de leguminosas constituem a única fonte de proteínas da dieta

(CRUZ et al., 2004), apesar de serem deficientes em aminoácidos sulfurados, principalmente

metionina e cisteína, além do triptofano (PROLL et al., 1998).

A maior restrição ao uso de sementes de leguminosas na dieta é a presença de

fatores tóxicos e/ou antinutricionais, os quais podem ocasionar efeitos deletérios agudos nos

organismos que os consomem, como também efeitos crônicos resultantes da interferência

negativa sobre os processos relativos ao aproveitamento de nutrientes (VASCONCELOS e

OLIVEIRA, 2004).

Nos últimos anos, tem sido reconhecido que proteínas vegetais não são

meramente fonte de aminoácidos necessários para desempenhar funções energética e

construtora, mas também se constituem em fonte de componentes bioativos e/ou precursores

de peptídios biologicamente ativos que exercem efeitos metabólicos sobre os organismos que

os consomem (CHAMP, 2002; DURANTI, 2006).

Nessa perspectiva, foi desenvolvida uma nova área da pesquisa científica,

denominada nutracêutica, resultante da fusão de “nutrientes” e “farmacêutica”. A nutracêutica

abrange “qualquer alimento, ou parte dele, considerado promotor de efeitos benéficos à saúde,

incluindo a prevenção e o tratamento de doenças”, tais como doenças cardiovasculares,

inflamatórias e degenerativas, diabetes, obesidade, e câncer (SCARAFONI et al., 2007).

Muitas propriedades nutracêuticas são atribuídas aos fatores antinutricionais clássicos, como

lectinas, inibidores de proteases e substâncias não-proteicas oriundas do metabolismo

secundário de plantas. Dessa forma, a importância da ingestão moderada de fatores

antinutricionais presentes na dieta, em especial em sementes de leguminosas, tem sido

amplamente discutida (DURANTI, 2006).

1.5. Inibidores de Proteases

Inibidores de proteases compreendem um grupo específico de proteínas que

possuem a habilidade de produzir complexos estequiométricos com enzimas alvo e, desta

28

maneira, inibem a atividade catalítica das mesmas (VALUEVA e MOSOLOV, 1999;

OLIVEIRA et al., 2007).

Inibidores de proteases estão presentes em todas as formas de vida, mas são

especialmente comuns em sementes de plantas (BATISTA et al., 2001; ZHANG et al., 2007).

São encontrados em várias famílias, sendo particularmente abundantes (1-10% de proteína

total) em órgãos de armazenamento, como sementes e tubérculos (RICHARDSON, 1991;

USSUF et al., 2001).

São várias as funções biológicas dos inibidores de proteases vegetais. Podem atuar

como proteínas de armazenamento (XAVIER-FILHO, 1992), como reguladores endógenos de

atividade proteolítica (RYAN, 1990) e, também, como participantes dos mecanismos de

morte celular programada (SOLOMON et al., 1999; LIN e NG, 2008). Ademais, esses

inibidores participam de mecanismos de defesa de plantas em resposta a estresses abióticos

(FRANCO e MELO, 2000) e contra o ataque de insetos (CARLINI e GROSSI-DE-SÁ, 2002),

fungos (KIM et al., 2005) e outros microrganismos patogênicos (BREITENEDER e

RADAUER, 2004).

Geralmente, os inibidores de proteases são específicos para uma das classes de

enzimas proteolíticas, e, baseado na classe mecanística de enzimas que são capazes de inibir,

são classificados em inibidores serínicos, cisteínicos, aspárticos ou de metalo-proteases

(RYAN, 1990; RICHARDSON, 1991). Dentre esses, os inibidores de proteases serínicos são

provavelmente os mais intensamente estudados. A maioria deles tem sido isolada e

caracterizada a partir de sementes de plantas das famílias Leguminosae, Cucurbitaceae,

Solanaceae e Poaceae (RICHARDSON, 1991).

Os inibidores de proteases serínicos são divididos, de acordo com suas

propriedades estruturais (estrutura primária, posição e número de pontes dissulfeto, posição

do sítio reativo), nas subfamílias Kunitz, Bowman-Birk, Batata I, Batata II, Abóbora e Cereal

(RICHARDSON, 1991; OLIVA et al., 2000).

Dentre as famílias de inibidores de proteases serínicos, as famílias Kunitz e

Bowman-Birk são as mais bem caracterizadas (OLIVEIRA et al., 2007), tendo sido

inicialmente isolados e caracterizados a partir de sementes de soja, da família Leguminosae

(BOWMAN, 1946; KUNITZ, 1947a,b; BIRK et al., 1963). Essas famílias diferem entre si em

relação à massa molecular, conteúdo de cisteína e número de sítios reativos. Geralmente,

inibidores do tipo Kunitz são proteínas de massa molecular entre 18 e 25 kDa, compostas de

aproximadamente 180 resíduos de aminoácidos, incluindo 4 resíduos de cisteína, capazes de

formar até duas pontes dissulfeto e um único sítio reativo (um resíduo de arginina)

29

(RICHARDSON, 1991). Estudos recentes têm mostrado, no entanto, que outros sítios reativos

podem estar presentes em inibidores dessa família (FRANCO et al., 2002; OLIVEIRA et al.,

2002; GOMES et al., 2005). Por outro lado, inibidores do tipo Bowman-Birk são,

geralmente, proteínas de massa molecular entre 8 e 10 kDa, de cadeia única, com dois sítios

reativos e apresentam um padrão característico de 14 resíduos de cisteína, todos formando

pontes dissulfeto intracadeia (RICHARDSON, 1991; PRAKASH et al., 1996). Esse arranjo

conservado de sete pontes dissulfeto desempenha um papel importante na estabilização da

estrutura tridimensional (QI et al., 2005).

Sob um ponto de vista histórico, inibidores das famílias Kunitz e Bowman-Birk

são considerados “fatores antinutricionais” devido a sua habilidade em inibir enzimas

envolvidas nos processos digestivos em animais e humanos, interferindo na digestibilidade

das proteínas da dieta (LIENER, 1995; DOMONEY, 1999; DURANTI et al., 2003). No

entanto, recentemente tem sido demonstrado que eles podem desempenhar importantes papéis

na cura e/ou prevenção de diversas doenças (CHAMP, 2002; DURANTI, 2006;

SCARAFONI et al., 2007). Assim, tem sido reconsiderada sua utilização sob o ponto de vista

de exploração de suas atividades biológicas nas áreas farmacológica, médica e cosmética

(DURANTI et al., 2003).

O controle desses inibidores sobre síntese e reciclagem de proteínas os possibilita

regular vários processos fisiológicos, tais como digestão, crescimento, diferenciação e

sinalização/migração celular, defesa imunológica e apoptose. Proteases são cruciais para o

estabelecimento e a propagação de doenças, e inibidores dessas proteases emergem como

agentes terapêuticos promissores (LEUNG et al., 2000). Evidências terapêuticas incluem

efeitos positivos no tratamento de hemorragia, atrofia do músculo esquelético, desordens

respiratórias e cardiovasculares, controle de obesidade, doenças degenerativas e autoimunes,

esclerose múltipla e doença de Alzheimer (OLIVA et al., 2000; LICHTENSTEIN et al., 2002;

ROSTAMI e KENNEDY, 2004; MORRIS et al., 2005). Além disso, possuem importantes

propriedades antivirais (LIN e NG, 2008), anti-inflamatórias e anticarcinogênicas

(KENNEDY, 1998; ZHANG et al., 2007).

1.6. Atividade Anticarcinogênica de Inibidores de Proteases

O câncer é uma das maiores causas de mortalidade no mundo, geralmente

excedida apenas por doenças cardiovasculares em países desenvolvidos. É esperado que o

número de pessoas diagnosticadas com câncer dentro das próximas décadas chegue ao dobro.

30

Haverá, portanto, aumento na demanda por novos diagnósticos e terapias médicas que

utilizem fontes alternativas (CHAMP, 2002).

Estudos epidemiológicos sugerem que componentes de vegetais, particularmente

legumes, podem desempenhar um papel benéfico na diminuição da incidência e mortalidade

por diferentes tipos de câncer (CORREA, 1981). Uma vez que legumes são conhecidos por

conter elevadas quantidades de inibidores de proteases, especialmente das famílias Kunitz e

Bowman-Birk (CLEMENTE et al., 2004), acredita-se que há uma estreita relação entre baixa

incidência e mortalidade por câncer e ingestão desses inibidores presentes em leguminosas da

dieta, como a soja (MESSINA e BARNES, 1991; MESSINA et al., 1994). De fato, proteases

são consideradas fatores chave na progressão do câncer (CLEMENTE et al., 2005). Assim, o

controle de sua atividade por inibidores de proteases parece ser relacionado com a capacidade

de prevenir ou suprimir patologias tumorais (DURANTI, 2006; SCARAFONI et al., 2007).

Vários estudos apontam para o potencial dos inibidores de proteases Kunitz e

Bowman-Birk na supressão e prevenção da carcinogênese, tanto em modelos in vitro quanto

in vivo (TROLL, 1989; JOHNSON et al., 1994; WARE et al., 1997; KENNEDY, 1998;

WITSCHI e ESPIRITU, 2002; CATALANO et al, 2003; CLEMENTE e DOMONEY, 2006;

SAITO et al., 2007; ZHANG et al., 2007; LIN e NG, 2008).

Embora sejam bastante relatadas as propriedades anticarcinogênica,

antiproliferativa, e radio- e quimioprotetora de inibidores de proteases das famílias Kunitz e

Bowman-Birk, ainda permanece desconhecido se essas atividades estão correlacionadas com

a inibição de tripsina e quimotripsina ou de outras enzimas capazes de interagir com outras

macromoléculas. Tem sido proposto que a atividade antiquimotríptica é mais eficaz do que a

atividade antitríptica no processo de supressão e prevenção de carcinogênese (DURANTI,

2006; SCARAFONI et al., 2007). No entanto, a atividade antiquimotríptica não é

requerimento essencial (CATALANO et al., 2003). As pesquisas realizadas no sentido de

elucidar essa questão têm focalizado em três linhas principais (Figura 4): i) o efeito de

inibidores sobre proteases celulares envolvidas no processo de carcinogênese (transformação,

proliferação, liberação de espécies reativas de oxigênio capazes de causar danos ao DNA); ii)

o efeito de inibidores de proteases no sistema de reparo de DNA nuclear ou na regulação da

expressão de alguns proto-oncogenes, como c-myc e c-fos, superexpressos em várias

linhagens de células tumorais, e iii) inibição de tripsina extracelular, secretada por muitas

linhagens de células tumorais e envolvida, junto com metaloproteases, na proteólise da matriz

extracelular, favorecendo a ocorrência de metástase (CATALANO et al., 2003).

31

Figura 4. Possíveis mecanismos e sítios de interação nos quais inibidores de proteases podem

atuar a fim de inibir o processo de carcinogênese (Adaptado de JOHNSON et al., 1994).

32

Mesmo de posse do conhecimento do imenso potencial terapêutico e preventivo

dos inibidores de proteases Kunitz e Bowman-Birk contra doenças como o câncer, muitas

pesquisas ainda são necessárias para torná-los ferramentas biológicas efetivas para uso com

essas finalidades. Por exemplo, inibidores de proteases como drogas potentes devem se

mostrar altamente específicos, além de apresentar propriedades farmacocinéticas e

farmacodinâmicas apropriadas (LEUNG et al., 2000). Ademais, é necessário também elucidar

com detalhes os mecanismos pelos quais os inibidores exercem a sua bioatividade, além de

buscar novas fontes (SCARAFONI et al., 2007), a fim de ampliar as possibilidades de

utilização dessas proteínas como ferramentas biológicas e biotecnológicas nas áreas

farmacológica e médica.

33

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Este trabalho objetivou avaliar o potencial nutracêutico de sementes de

Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong., destacando: a avaliação da composição

proximal e aminoacídica, a detecção de fatores tóxicos e/ou antinutricionais, a purificação e

caracterização parcial de inibidores de quimotripsina, e a avaliação de sua atividade

antiproliferativa contra linhagens de células tumorigênicas humanas.

2.2. Objetivos específicos

Determinar a composição proximal e aminoacídica, como também os teores de fatores

tóxicos e/ou antinutricionais em sementes de E. contortisiliquum;

Purificar o (s) inibidor (es) de quimotripsina e caracterizá-lo (s) quanto a:

- Massa molecular aparente;

- Cinética da inibição;

- Estabilidade frente a agentes desnaturantes físicos e químicos;

- Especificidade do (s) inibidor (es) para enzimas serínicas e cisteínica.

Verificar a proliferação e a viabilidade de células tumorigênicas das linhagens HL-60,

MDA-MB-435, SF-295 e HCT-8 em presença do (s) inibidor (es) purificado (s) de sementes

de E. contortisiliquum;

Avaliar o (s) mecanismo (s) envolvido (s) na possível atividade citotóxica do (s)

inibidor (es) de quimotripsina de sementes de E. contortisiliquum.

34

3. MATERIAL

3.1. Material Biológico

3.1.1. Sementes de E. contortisiliquum

As sementes de E. contortisiliquum foram obtidas de vagens maduras, coletadas

em uma área de caatinga arbórea na fazenda “Não me Deixes”, no município de Quixadá –

CE. Um ramo terminal com folhas e frutos foi coletado, prensado e desidratado para posterior

identificação e incorporação ao acervo do Herbário Prisco Bezerra (EAC), Universidade

Federal do Ceará (UFC), sob a identificação EAC 38.115.

3.1.2. Células Tumorais

Células tumorais das linhagens HL-60 (leucemia), MDA-MB-435 (melanoma),

SF-295 (cérebro) e HCT-8 (cólon), cultivadas e mantidas no Laboratório de Oncologia

Experimental do Departamento de Farmacologia e Fisiologia da Universidade Federal do

Ceará, foram obtidas do National Cancer Institute, Bethesda, MD, EEUU.

3.2. Reagentes Químicos

3.2.1. Proteínas

Albumina sérica bovina (BSA), tripsina, quimotripsina, elastase pancreática,

papaína e proteases de Bacillus licheniformis foram adquiridas da Sigma-Aldrich Co. (St.

Louis, EEUU). Elastase neutrofílica foi obtida a partir de suspensão de neutrófilos humanos

cedida pelo Hemonorte – Hemocentro do Rio Grande do Norte. Marcadores de massa

molecular foram adquiridos da Fermentas International Inc. (Ontário, Canadá).

3.2.2. Substratos Enzimáticos

Os substratos sintéticos BApNA (Nα-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida) e

BANA (Nα-benzoil-DL-arginina-p-naftilamida), SAAVpNA (N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-

35

valina-p-nitroanilida) e o substrato proteico Azocaseína foram adquiridos da Sigma-Aldrich

Co. (St. Louis, EEUU).

3.2.3. Outros Reagentes

O kit para ensaio de fibra alimentar TDF-100A e L-triptofano foram obtidos da

Sigma-Aldrich Co. (St Louis, EEUU). Acrilamida, Coomassie Brilliant Blue R-250, Dodecil

Sulfato de Sódio (SDS), TEMED (N’, N’, N’, N’- tetrametiletilenodiamina), trizma-base,

metilenobisacrilamida, β-mercaptoetanol e demais reagentes foram adquiridos das empresas

Amersham Biosciences (Piscataway, EEUU), Sigma-Aldrich Co. (St Louis, EEUU), Acros

Organics (Geel, Bélgica) e Amresco Inc. (Ohio, EEUU). Meio de cultura de células RPMI

1640, soro fetal bovino, penicilina e estreptomicina foram adquiridos da Cultilab (Campinas,

Brasil). MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] foi adquirido da

Sigma-Aldrich Co. (St Louis, EEUU).

Todos os demais reagentes utilizados eram de grau analítico, fabricados por

empresas reconhecidas e foram obtidos comercialmente.

3.3. Equipamentos

Foram utilizados os seguintes equipamentos:

Moinho industrial Tecnal (São Paulo, Brasil);

Estufa de secagem Fanem, Modelo 002 CB (São Paulo, Brasil);

Forno mufla Quimis, Modelo Q-318m24 (Diadema, Brasil);

Aparelho Digestor Marconi, Modelo MA 448 (Piracicaba, Brasil);

Espectrofotômetro Femto 700 Plus (São Paulo, Brasil);

Espectrofotômetro de placa Beckman Coulter DTX 880 (Brea, CA, EEUU);

Banho-Maria Tecnal TE-056 (Piracicaba, Brasil);

Balança analítica Tecnal Classe II (Piracicaba, Brasil);

Centrífuga Hitachi CR 21 Hitachi High Technologies Corp. (Tóquio, Japão);

Sistema de purificação de água Milli-Q Millipore Corporation (Billerica, MA, EEUU);

Sistema FPLC Äkta Purifier GE Healthcare Bio-Sciences (Uppsala, Suécia);

Coletor de frações Radifrac Pharmacia Biotech (Uppsala, Suécia);

Concentrador Eppendorf 5301 (Hamburg, Alemanha);

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Microcentrífuga Eppendorf 5410 (Hamburg, Alemanha);

Centrífuga de placa Eppendorf 5403 (Hamburg, Alemanha);

Agitador magnético Tecnal TE-081 (Piracicaba, Brasil);

Sistema de eletroforese unidimensional Amersham Biosciences Corp. (Piscataway,

NJ, EEUU);

Incubadora de CO2 Nuaire US Autoflow (Plymouth, MN, EEUU);

Centrífuga de placa Eppendorf 5403 (Hamburg, Alemanha);

Leitor de placa Beckman Coulter DTX 880 Esalab (São Paulo, Brasil).

37

4. METODOLOGIA

4.1. Processamento das Sementes de E. contortisiliquum

As sementes de E. contortisiliquum foram retiradas de suas vagens e moídas em

moinho industrial. Em seguida, a farinha foi peneirada em malha de 1,0 mm2 e colocada em

estufa a 45 °C por 72 h para obtenção de um material mais homogêneo e livre de umidade. Os

procedimentos descritos em tópicos a seguir foram realizados com a farinha delipidada,

exceto a determinação de lipídios totais. A delipidação foi realizada com n-hexano, na

proporção de 1:3 (p/v), num total de quatro trocas de solvente. O solvente foi desprendido da

farinha em capela de exaustão à temperatura ambiente. A farinha obtida foi acondicionada em

recipiente plástico até a realização das análises.

4.2. Composição Proximal de Sementes de E. contortisiliquum

4.2.1. Umidade

A umidade da farinha das sementes de E. contortisiliquum foi determinada

seguindo a metodologia descrita pela AOAC (1998). Em triplicata, 10 g de amostra não-

desidratada foram colocados em recipientes limpos e tarados e deixados a 105 °C por 24 h. O

percentual de umidade foi determinado pela diferença entre os pesos inicial e final das

amostras após o processamento.

4.2.2. Proteínas Totais

As proteínas totais da farinha das sementes de E. contortisiliquum foram

determinadas em triplicata segundo o método Macrokjeldahl, utilizando o fator 6,25 para

conversão do teor de N em teor de proteína. Balões de Kjeldahl contendo 0,5 g de amostra, 25

mL de ácido sulfúrico concentrado e 5,0 g de mistura catalítica (sulfato de potássio, sulfato de

cobre e selênio metálico, 100:10:1, respectivamente) foram levados para um digestor e

deixados por 1 h a 400 °C. Em seguida, o material digerido foi transferido para balões

volumétricos de 100 mL, que tiveram seus volumes aferidos com água deionizada. A medida

de nitrogênio foi obtida por ensaio fotocolorimétrico como descrito por Baethgen e Alley

(1989), utilizando uma curva padrão com diferentes concentrações de sulfato de amônio.

38

4.2.3. Lipídios Totais

O teor de lipídios totais da farinha das sementes de E. contortisiliquum foi

determinado em triplicata segundo o método descrito pela AOAC (1998). Amostras de 5 g

foram pesadas em balança analítica e depositadas em cartuchos de papel de filtro, sendo,

então, transferidas para um sistema Soxhlet 303 mm. A extração de lipídios foi contínua

durante 8 h, sendo o n-hexano utilizado como solvente, na proporção de 1:5 (p/v). Em

seguida, o solvente foi evaporado em estufa durante 48 h e os balões contendo os resíduos de

óleo foram resfriados em dessecador e pesados em balança analítica. O percentual de lipídios

totais foi calculado pela diferença entre os pesos inicial e final dos balões.

4.2.4. Matéria Mineral

A matéria mineral foi determinada em triplicata a partir da farinha das sementes

de E. contortisiliquum segundo metodologia descrita pela AOAC (1998). Amostras pesando 1

g foram levadas em cadinhos de porcelana a um forno mufla e calcinizadas à temperatura de

550 °C por 4 h. O percentual de matéria mineral foi determinado pela diferença entre os pesos

inicial e final.

4.2.5. Fibra Alimentar Total

A determinação do teor de fibra alimentar da farinha das sementes de E.

contortisiliquum foi realizada em quadruplicata, seguindo a metodologia descrita pela AOAC

(1997), utilizando o kit para ensaio de fibra alimentar TDF-100A. Os procedimentos de

digestão e filtração estão representados na Figura 5.

39

DIGESTÃO

1,0000 g da amostra livre de umidade em 50 mL de tampão fosfato de sódio 0,08 M, pH 6,0, contendo 0,1 mL de

α-amilase (kit TDF-100A)

Banho-maria a 95 °C por 15 min, agitação a cada 5 min

Resfriar à temperatura ambiente

Ajustar o pH 7,3 a 7,7 com 10 mL de NaOH 0,275 M

Adicionar 0,1 mL de protease 50 mg/mL (kit TDF-100A)

Banho-maria a 60 °C com agitação por 30 min, após a temperatura interna atingir 60 °C

Resfriar à temperatura ambiente

Ajustar o pH 4,0 a 4,6 com 10 mL de HCl 0,325M

Adicionar 100 mL de amiloglucosidase (kit TDF-100A) e misturar

Banho-maria a 60 °C com agitação por 30 min, após a temperatura interna atingir 60 °C

Resfriar à temperatura ambiente

Acrescentar um volume de etanol 95% correspondente a 4 x o volume já existente nos recipientes

40

Registrar o peso do cadinho livre de umidade e da celite (kit TDF-100A), (referido como R1 = cadinho + celite)

Deixar as soluções sedimentarem overnight à temperatura ambiente

Umedecer e redistribuir a camada de celite em cada cadinho, usando etanol 78%

FILTRAÇÃO

Aplicar sucção branda para sentar a celite e transferir o precipitado e a suspensão para o cadinho

Acrescentar 20 mL de etanol 78%, 2 porções de 10 mL de etanol 95% e 2 porções de 10 mL de acetona

Secar os cadinhos contendo os resíduos overnight em uma estufa ventilada a 105 °C ou a vácuo a 70 °C

Pesar os cadinhos livres de umidade (referido como R2 = cadinho + celite + resíduo)

PROTEÍNAS E CINZAS

Das 4 repetições de cada amostra, duas tiveram suas proteínas totais quantificadas segundo Baethgen e Alley

(1989) e as outras duas a matéria mineral (registrado o peso do cadinho + amostra calcinizada = R3) segundo a

AOAC (1998)

Figura 5. Procedimento para determinação de Fibra Alimentar Total da farinha delipidada das

sementes de Enterolobium contortisiliquum segundo a metodologia descrita pela AOAC

(1997).

41

A quantificação do teor de fibra alimentar total foi obtida a partir da equação:

% FAT = Ramostra - Pamostra - Aamostra - B x 100

PA

Onde:

FAT: Fibra Alimentar Total;

R: Peso médio do resíduo da amostra, em mg (R2 - R1);

P: Peso médio da proteína, em mg;

A: Peso médio da matéria mineral, em mg, (R3 – R1);

PA: Peso médio da amostra, em mg;

B = Rbranco - Pbranco - Abranco

4.2.6. Carboidratos Digeríveis

O teor de carboidratos digeríveis foi determinado pela diferença dos demais

constituintes (proteínas totais, lipídios totais, matéria mineral e fibra alimentar total).

4.3. Composição Aminoacídica de Sementes de E. contortisiliquum

A composição em aminoácidos da farinha das sementes de E. contortisiliquum foi

realizada através de cromatografia de troca iônica em sistema HPLC, adaptada a partir do

método descrito por Spackman et al. (1958). Em triplicata, 4 mg de farinha delipidada foi

hidrolisada com 1 mL de HCl 6,0 M contendo 1% de fenol (p/v), por 22 h, a 110 ºC.

Concluída a hidrólise, as ampolas foram abertas e o HCl/fenol foi removido por evaporação

em dessecador com pressão reduzida na presença de NaOH. Em seguida, as amostras foram

dissolvidas em tampão citrato de sódio 0,05 M, pH 2,2, filtradas em membrana de 40 µm

(Millipore®) e submetidas a análise de aminoácidos.

O aminoácido aromático triptofano, sensível a hidrólise ácida, foi determinado

pelo método descrito por Pintér-Szakács e Molnár-Perl (1990). Amostras contendo 12,5 mg

de farinha foram colocadas em contato com 2,5 mL de reagente contendo ninhidrina a 1%

dissolvida em HCl 37% + ácido fórmico 96% (2:3, v/v), por 2 h, a 35 ºC. O branco foi

realizado paralelamente em condições semelhantes, mas sem ninhidrina. A seguir, às amostras

42

em solução foram adicionados 2,5 mL de uma mistura feita com as soluções HCl/ácido

fórmico descritas e etanol absoluto (1:4, v/v). O teor de triptofano foi medido através de

leitura espectrofotométrica a 380 nm, tendo como referência uma curva padrão feita com L-

triptofano.

4.4. Preparação do Extrato Proteico Bruto (EB) de E. contortisiliquum

A farinha delipidada das sementes de E. contortisiliquum foi submetida a extração

em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, na proporção 1:10 (p/v) e mantida sob agitação

constante por 3 h, à temperatura ambiente. O material foi filtrado em tecido de nylon e em

seguida submetido à centrifugação a 8.000 x g, por 30 min, a 4 °C. O material precipitado foi

descartado e o sobrenadante, denominado Extrato Bruto (EB), utilizado para a realização dos

procedimentos descritos adiante. Alíquotas do EB foram separadas para dosagem de proteínas

solúveis.

4.5. Determinação de Fatores Tóxicos e/ou Antinutricionais

4.5.1. Lectinas

A presença de lectinas nas sementes de E. contortisiliquum foi avaliada através de

ensaio de atividade hemaglutinante do EB, seguindo a metodologia descrita por Moreira e

Perrone (1977), adaptada para o uso de tubos de ensaio. O EB foi diluído seriadamente com

NaCl 0,9% (1:2; 1:4; 1:8; 1:16 etc) e cada diluição foi misturada (1:2, v/v) com uma

suspensão a 2% de eritrócitos de coelho, nativos e tratados previamente com um pool de

proteases de Bacillus licheniformis. Esse tratamento consistiu em uma mistura da solução de

proteases (1 mg/mL) com a suspensão de eritrócitos a 2%, na proporção 1:100 (v/v), por 1 h,

a 4 ºC. As soluções diluídas do EB foram incubadas a 37 °C, durante 30 min, com o sangue

nativo e tratado de coelho e, depois, por mais 30 min à temperatura ambiente. Após esse

tempo, os tubos foram centrifugados a 2000 x g, por 1 min, e a aglutinação visualizada a olho

nu. Os resultados foram expressos como título de hemaglutinação, o qual foi definido como o

recíproco da maior diluição que é capaz de provocar aglutinação visível, ou como a

quantidade mínima de proteína (µg/mL) capaz de induzir aglutinação visível. Essa

concentração foi denotada como uma unidade de atividade hemaglutinante (UH).

43

4.5.2. Inibidores de Quimotripsina

A atividade inibitória sobre a quimotripsina foi determinada de acordo com

Erlanger et al. (1961). Vinte microlitros de solução de quimotripsina bovina (0,1 mg/mL em

tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 contendo CaCl 0,02 M) foram pré-incubados, por 15 min a

37 °C, com o mesmo tampão e 0,1 mL da solução teste. Após esse período, a reação foi

iniciada adicionando-se 0,2 mL de azocaseína 1% em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5.

Decorridos 30 min, a reação foi interrompida adicionando-se 0,3 mL de solução de TCA 20%.

A mistura de reação foi centrifugada a 10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante alcalinizado

com NaOH 2 N na proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor do produto da clivagem da

azocaseína pela enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm. Provas em branco

foram realizadas em duplicata e os testes em triplicata. Os resultados foram expressos em

Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição (UI), definida como o decréscimo em 0,01

da absorbância a 440 nm.

4.5.3. Inibidores de Tripsina

A atividade inibitória sobre a tripsina foi determinada de acordo com Erlanger et

al. (1961). Vinte microlitros de solução de tripsina bovina (0,3 mg/mL em HCl 0,0025 M)

foram pré-incubados, por 15 min a 37 °C, com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 e 0,1 mL da

solução teste. Após esse período, a reação foi iniciada adicionando-se 0,2 mL de azocaseína

1% em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5. Decorridos 30 min, a reação foi interrompida

adicionando-se 0,3 mL de solução de TCA 20%. A mistura de reação foi centrifugada a

10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporção 1:2 (v/v),

a fim de intensificar a cor do produto da clivagem da azocaseína pela enzima. A leitura das

absorbâncias foi realizada a 440 nm. Provas em branco foram realizadas em duplicata e os

testes em triplicata. Os resultados foram expressos em Percentual de Inibição (%) e Unidade

de Inibição (UI), definida como o decréscimo em 0,01 da absorbância a 440 nm.

4.5.4. Toxinas

A avaliação da toxicidade aguda do EB de E. contortisiliquum, em diferentes

concentrações, foi realizada através de injeção intraperitonial (0,3 mL/10 g de peso corpóreo)

em camundongos machos, seguindo metodologia descrita por Carvalho et al. (1987).

44

Após 48 h da inoculação do extrato, foram contados os indivíduos mortos, caso

tenha ocorrido, para calcular medidas de dispersão como média, desvio padrão e coeficiente

de variação. A DL50 foi calculada conforme descrita por Litchfield e Wilcoxon (1949). Foi

utilizado como controle negativo o grupo de animais que recebeu apenas NaCl 0,9%.

4.6. Seleção do Melhor Fracionamento Proteico com TCA

Inicialmente, foi realizado um screening a fim de verificar, baseado na atividade

inibitória de quimotripsina específica e no percentual de inibição, qual fração proteica

encerrava maior concentração de inibidores após tratamento com ácido tricloroacético (TCA).

Dessa forma, alíquotas do EB foram submetidas ao fracionamento com TCA 20% a fim de

obter frações de concentração final de ácido variando de 0,5 a 10,0%. Ao EB, mantido neste

procedimento sob agitação constante e a frio, foram adicionados paulatinamente os volumes

de TCA 20% correspondentes a cada fração. O material foi então deixado em repouso por 30

min, a 4 °C e em seguida centrifugado a 8.000 x g, por 30 min, a 4 °C. O precipitado foi

descartado e o sobrenadante submetido à diálise overnight contra água destilada em

membranas de 6-8 kDa. Em seguida foi realizada nova diálise, desta vez contra tampão Tris-

HCl 0,05 M, pH 7,5 por 4 h, a fim de ajustar o pH das amostras. As frações proteicas obtidas

foram finalmente submetidas à dosagem de proteínas solúveis e quantificação de atividade

inibitória de quimotripsina.

4.7. Obtenção da Fração Proteica (F5,0) de E. contortisiliquum

De acordo com os procedimentos descritos no item 4.6., foi verificado que a

fração proteica correspondente a 5% de TCA apresentou os melhores valores de atividade

inibitória de quimotripsina específica e percentual de inibição. Por isso, essa fração foi

escolhida para dar continuidade aos procedimentos de purificação do (s) inibidor (es) de

quimotripsina e nomeada de F5,0. O procedimento para obtenção de F5,0 segue os mesmos

passos já descritos no item 4.6., com exceção de que a diálise foi realizada apenas contra água

destilada, realizando um total de 4 trocas a cada 12 h. O material dialisado foi então

liofilizado e acondicionado em recipiente plástico à temperatura ambiente até sua utilização.

4.8. Dosagem de Proteínas Solúveis

45

A dosagem de proteínas solúveis foi realizada de acordo com o método de

Bradford (1976). A uma alíquota de 50 µL das amostras foram adicionados 2,5 mL do

reagente de Bradford. A mistura foi agitada e após 10 min foram feitas as leituras das

absorbâncias a 595 nm. A concentração foi estimada em relação a uma curva padrão obtida

com diferentes concentrações de albumina sérica bovina (BSA) em NaCl 0,9%.

4.9. Isolamento e Purificação de Inibidor (es) de Quimotripsina

A purificação do (s) inibidor (es) de quimotripsina de sementes de E.

contortisiliquum foi realizada aplicando-se a fração protéica (F5,0) em coluna de troca iônica

Resource Q em sistema FPLC Äkta Purifier, com loop de 1 mL. A F5,0 liofilizada foi

ressuspendida em tampão Tris-HCl 0,02 M, pH 8,0 na concentração de 1 mg P/mL e, em

seguida, centrifugada a 10.000 x g, por 10 min, a 4 °C para remoção de partículas em

suspensão. A F5,0 foi então aplicada na coluna, previamente equilibrada com o mesmo

tampão. Foi aplicado 1 mg de proteína na coluna para evitar saturação. A cromatografia foi

realizada a um fluxo constante de 1,5 mL/min. O material não retido foi eluído com tampão

Tris-HCl 0,02 M, pH 8,0. Em seguida, foi aplicado um gradiente salino que variou de 0 a 0,5

M NaCl para eluição do material retido na coluna. Foram coletadas frações cromatográficas

de 0,5 mL, as quais foram acompanhadas por espectrofotometria a 280 nm e submetidas a

ensaio de inibição de quimotripsina conforme descrito no item 4.5.2. Nesse procedimento,

foram identificados três picos cromatográficos com atividade inibitória de quimotripsina

superior a 40%, os quais foram nomeados P1, P2 e P3. Os mesmos foram eluídos quando o

gradiente de NaCl atingiu as concentrações 0,12; 0,14 e 0,19 M, respectivamente. Material

correspondente a esses três picos foi, então, obtido em quantidade para os procedimentos

descritos a seguir.

4.10. Caracterização Bioquímica

4.10.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Com o intuito de avaliar o grau de pureza das amostras proteicas, as mesmas

foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS, de acordo

com a metodologia descrita por Laemmli (1970). O gel de separação (12% de acrilamida) foi

preparado com 1,25 mL de acrilamida-bisacrilamida 30%; 1,25 mL de tampão Tris-HCl 1,5

46

M, pH 8,8; 2,425 mL de água destilada; 0,05 mL de SDS 10%; 0,005 mL de TEMED e 0,025

mL de persulfato de amônio 30%. O gel de concentração (5% de acrilamida) continha 0,33

mL de acrilamida-bisacrilamida 30%; 0,625 mL de tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8; 1,5 mL

de água destilada; 0,025 mL de SDS 10%; 0,005 mL de TEMED e 0,0125 mL de persulfato

de amônio 30%. O tampão de corrida consistia de Tris-HCl 0,025 M; glicina 0,192 M e SDS

10%. Uma vez diluídas em tampão de amostra (Tris-HCl 0,0625 M; SDS 2%; glicerol 10%

(v/v) e 0,01% de azul de bromofenol), em um volume de 0,02 mL, amostras que encerravam

12 µg de EB, F5,0, P1, P2 e P3 foram aplicadas no gel (10 x 14 cm, com espaçadores de 0,75

mm), o qual foi submetido a uma corrente constante de 20 mA por, aproximadamente, 2 h.

Após o término da corrida, o gel foi corado segundo procedimento descrito por Weber e

Osborne (1969). A solução corante foi preparada usando-se Comassie Brilliant Blue R-250

1%, metanol 40%, ácido acético 10% e água destilada. O descoloramento foi feito com uma

solução contendo ácido acético 10% e etanol 30%. Para determinar a massa molecular

aparente da (s) proteína (s) de interesse, foram utilizados os marcadores padrão de massa

molecular β-galactosidase (116 kDa), BSA (66,2 kDa), ovalbumina (45 kDa), lactato

desidrogenase (35 kDa), endonuclease de restrição Bsp 981 (25 kDa), β-lactoglobulina (18,4

kDa) e lisozima (14,4 kDa).

4.10.2. Determinação de IC50

A concentração de P1, P2 e P3 que reduz em 50% a atividade da quimotripsina

(IC50) foi determinada através da construção de uma curva de titulação que relaciona

percentual de atividade de quimotripsina e concentração de inibidor. Na construção dessa

curva, alíquotas com concentrações crescentes de inibidor (0,041; 0,083; 0,165; 0,330 e 0,661

μM, para P1; 0,062; 0,124; 0,248; 0,495 e 0,991 μM para P2; e 0,130; 0,259; 0,518; 1,036 e

2,073 μM para P3) foram incubadas com alíquotas de 10 μL de quimotripsina 8,0 μM,

encerrando uma concentração final de 0,114 μM, e o ensaio procedeu como descrito no item

4.5.2. Foi determinado o percentual de atividade residual de quimotripsina na presença de

cada concentração de inibidor utilizada e construída a curva de titulação.

4.10.3. Determinação da Constante de Inibição e do Mecanismo de Inibição

47

Para a determinação do mecanismo de inibição foi construído o gráfico de

Lineweaver-Burk, no qual é representado o inverso da velocidade da reação enzimática em

presença de inibidor em função do inverso da concentração de substrato.

Para a construção do gráfico, foi realizado um ensaio de inibição de quimotripsina

no qual se combinaram várias concentrações de substrato com várias concentrações de

inibidor, mantendo-se a concentração de enzima constante. Foram utilizadas quantidades

crescentes de inibidores de quimotripsina de E. contortisiliquum nas concentrações 17,34

(P1), 18,49 (P2) e 7,25 (P3) µM, encerrando concentrações finais a saber:

P1: 0,165; 0,248; 0,330 µM;

P2: 0,124; 0,186; 0,248 µM;

P3: 0,130; 0,259; 0,518 µM.

Os inibidores foram pré-incubados com 10 µL de solução de quimotripsina na

concentração de 8,0 µM em tampão Tris-HCl 0,05 M com CaCl2 0,02 M, pH 7,5, cuja

concentração final foi de 0,114 µM. A reação foi iniciada com a adição de 200 µL de

azocaseína em diferentes concentrações: 0,1; 0,15; 0,3; 0,4; 0,6 e 0,8 mM. O controle positivo

procedeu-se da mesma maneira, porém sem a adição da fração inibidora. O ensaio foi

realizado como descrito no item 4.5.2.

O valor da constante de inibição (ki) foi determinado de acordo com Dixon et al.

(1979). O ensaio enzimático com quimotripsina para a determinação de ki foi realizado na

presença de concentrações crescentes de P1, P2 e P3 (as mesmas já referenciadas para a

construção do gráfico de Lineweaver-Burk) e duas diferentes concentrações de azocaseína

(0,1 e 0,15 mM para P1; 0,6 e 0,8 mM para P2 e 0,15 e 0,3 mM para P3). O valor de ki foi

obtido através da intercessão de duas linhas correspondentes às concentrações de substrato.

4.10.4. Avaliação da Especificidade dos Inibidores para Proteases Serínicas e Cisteínica

4.10.4.1. Inibição de Tripsina (protease serínica)

A atividade anti-tríptica foi determinada utilizando BApNA como substrato

(ERLANGER et al., 1961). Alíquotas de 20 L de solução de tripsina bovina (0,3 mg/mL em

HCl 0,0025 M) foram pré-incubadas, por 10 min a 37 °C, com HCl 0,0025 M, tampão Tris-

HCl 0,05 M, pH 7,5 e volumes de P1, P2 e P3 que encerravam 8, 5 e 20 g de proteína,

respectivamente. Após esse período, a reação foi iniciada adicionando-se 0,5 mL de BApNA

48

0,00125 M. A reação prosseguiu por mais 15 min nas mesmas condições de incubação, sendo

interrompida pela adição de 0,12 mL de ácido acético 30%. A formação de p-nitroanilina foi

monitorada em espectrofotômetro a 410 nm. Provas em branco foram realizadas em duplicata

e os ensaios em triplicata.

4.10.4.2. Inibição de Elastase Pancreática (protease serínica)

A atividade inibitória sobre elastase pancreática foi avaliada utilizando-se

azocaseína como substrato (ERLANGER et al., 1961). A enzima (60 µL; 2,9 mg/mL) foi pré-

incubada, por 15 min a 37 °C, com tampão Tris-HCl 0,05 M com CaCl2 0,02 M, pH 7,5 e

volumes de P1, P2 e P3 que encerravam 8, 5 e 20 g de proteína, respectivamente. A reação

foi então iniciada adicionando-se 0,2 mL de azocaseína 1% em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH

7,5. A reação enzimática prosseguiu durante 30 min e foi finalizada com a adição de 0,3 mL

de TCA 20%. O material foi então centrifugado por 10 min a 10.000 x g e depois o

sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor

do produto da clivagem da azocaseína pela enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a

440 nm.

4.10.4.3. Inibição de Elastase Neutrofílica (protease serínica)

A atividade inibitória de elastase neutrofílica foi avaliada utilizando SAAVpNA

como substrato (JOHANSSON et al., 2002). Para o ensaio, a solução de enzima foi

previamente centrifugada a 10.000 x g por 10 min, a 4 °C. Uma alíquota de 0,1 mL do

sobrenadante (0,5 mg/mL) foi incubada, por 15 min a 37 °C, com tampão fosfato de sódio 0,1

M, pH 7,4, e volumes de P1, P2 e P3 que encerravam 8, 5 e 20 g de proteína,

respectivamente. A reação foi iniciada com a adição de 5 µL de SAAVpNA 0,125 M. Após 2

h, a reação foi interrompida com a adição de 0,25 mL de ácido acético 2%. Os tubos foram

centrifugados a 10.000 x g por 10 min a 4°C e, então, foi realizada a leitura das absorbâncias

a 405 nm.

4.10.4.4. Inibição de Papaína (protease cisteínica)

A atividade inibitória sobre a papaína foi realizada utilizando BANA como

substrato (ZHAO et al., 1996). A enzima (0,1 mg/mL) foi pré-incubada por 10 min a 37°C

49

com tampão fosfato de sódio 0,25 M, pH 6,0, solução ativadora para papaína [tampão fosfato

de sódio 0,25 M, pH 6,0 contendo ditiotreitol (DTT) 0,003 M e ácido

etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,002 M] e volumes de P1, P2 e P3 que encerravam 8, 5 e

20 g de proteína, respectivamente. A reação foi iniciada com a adição de 0,2 mL de BANA

0,001 M, e a mistura mantida nas mesmas condições por 20 min. Para interromper a reação

foram utilizados 0,5 mL de HCl 2% em etanol e, em seguida, adicionados 0,5 mL de reagente

de cor 4-dimetilaminocinamaldeído (DMACA) 0,06% em etanol. As absorbâncias foram

monitoradas a 540 nm.

4.10.5. Estabilidade dos Inibidores a Agentes Desnaturantes Físicos e Químicos

4.10.5.1. Estabilidade em Diferentes Temperaturas

A estabilidade térmica de P1, P2 e P3 foi avaliada segundo a metodologia descrita

por Gomes et al. (2005). Alíquotas de 0,5 mL de cada inibidor foram incubadas em banho-

maria por 30 min nas seguintes temperaturas: 37 (controle), 40, 60, 70, 90 e 100 °C. Após

resfriamento das amostras à temperatura ambiente, procedeu-se o ensaio de inibição de

quimotripsina conforme descrito no item 4.5.2. Foram utilizados volumes de inibidor que

encerravam 8, 5 e 20 μg de P1, P2 e P3, respectivamente. Provas em branco foram realizadas

em duplicata e os ensaios em triplicata.

4.10.5.2. Estabilidade em Diferentes Valores de pH

A estabilidade de P1, P2 e P3 em diferentes valores de pH foi avaliada segundo a

metodologia descrita por Gomes et al. (2005). Alíquotas de 0,5 mL de cada inibidor foram

submetidas à diálise overnight contra as seguintes soluções tampão: glicina-HCl 0,1 M, pH

2,0; glicina-HCl 0,1 M, pH 3,0; fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,0; fosfato de sódio 0,1 M, pH

8,0; glicina-NaOH 0,1 M, pH 11,0; glicina-NaOH 0,1 M, pH 12,0. Os inibidores foram em

seguida submetidos à nova diálise, desta vez contra tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, durante

4 h. Procedeu-se, então, o ensaio de inibição de quimotripsina conforme descrito no item

4.5.2., usando volumes de P1, P2 e P3 que encerravam 8, 5 e 20 μg de proteína,

respectivamente. Provas em branco foram realizadas em duplicata e os ensaios em triplicata.

4.10.5.3. Estabilidade Frente ao Agente Redutor DTT

50

Para avaliar a estabilidade dos inibidores de quimotripsina de sementes de E.

contortisiliquum na presença de agente redutor seguiu-se a metodologia descrita por Cruz

(2008), onde alíquotas de inibidor, encerrando 8, 5 e 20 μg de P1, P2 e P3, respectivamente,

foram incubadas a 37 °C com soluções de DTT de concentrações finais de 1, 10 e 100 mM

por 15, 30, 60 e 120 min. Ao final do tempo de incubação, foi adicionada iodoacetamida na

quantidade de duas vezes a concentração final de DTT, a fim de prevenir a reoxidação dos

grupos sulfidril. Após o período de incubação, a mistura de reação foi submetida ao ensaio de

atividade inibitória de quimotripsina como descrito no item 4.5.2. O ensaio foi acompanhado

por controle sem DTT. Provas em branco foram realizadas em duplicata e os ensaios em

triplicata.

4.11. Avaliação da Atividade Antiproliferativa de Inibidores de Quimotripsina de E.

contortisiliquum

4.11.1. Citotoxicidade contra Células Tumorais in vitro

A citotoxicidade de inibidores de quimotripsina de E. contortisiliquum contra

células tumorais humanas foi inicialmente avaliada de acordo com a metodologia descrita por

Mosmann (1983). O ensaio consiste em uma análise colorimétrica baseada na conversão do 3-

(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazólio (MTT) em formazan, devido a

atividade da enzima succinil-desidrogenase presente nas mitocôndrias de células viáveis.

Desta maneira, é possível quantificar a porcentagem de células vivas. Nessa investigação,

foram utilizadas as linhagens HL-60 (leucemia), MDA-MB-435 (melanoma), SF-295

(cérebro) e HCT-8 (cólon), obtidas através de doação do National Cancer Institute (Bethesda,

MD, USA).

As linhagens celulares foram cultivadas em frascos plásticos para cultura

(Corning, 25 cm2, volume de 50 mL para células aderidas e 75 cm

2, volume de 250 mL para

células em suspensão) em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal

bovino e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina). As células foram incubadas em

estufa a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2, seguido da observação do crescimento celular

com ajuda de microscópio de inversão a cada 24 h. Quando necessário, as células foram

repicadas em meio de cultura novo, em uma concentração de 5,0-10,0 x 105 céls/mL

(BUTLER e DAWSON, 1992).

51

As células em suspensão ou monocamadas foram distribuídas em placas de 96

poços numa densidade de 3,0 x 105 céls/mL para HL-60, 7,0 x 10

4 céls/mL para HCT-8 e 1,0

x 105 céls/mL para MDA-MB-435 e SF-295. Os inibidores foram incubados durante 72 h

juntamente com as suspensões de células em concentrações que variaram de 0,39 a 200

g/mL, obtidas através de diluição seriada. Doxorrubicina foi utilizada como controle

positivo com concentrações variando de 0,003 a 0,25 g/mL. Após o período de incubação, as

placas foram centrifugadas a 15 x g por 15 min e o sobrenadante foi descartado. Cada poço

recebeu 0,2 mL de MTT 10% em meio RPMI 1640 e foram reincubadas durante 3 h em estufa

a 37 °C e CO2 5%. Em seguida, as placas foram novamente centrifugadas a 30 x g por 10 min,

o sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspendido em 0,15 mL de dimetilsulfóxido

(DMSO). Para a quantificação do sal reduzido nas células vivas, as absorbâncias foram lidas

em espectrofotômetro de placa a 550 nm. Os testes foram realizados em duplicata.

Para análise dos resultados, foi registrada a porcentagem de inibição versus

logaritmo da concentração de inibidor e foram determinados suas CI50 (concentração capaz de

diminuir em 50% o efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança, através de

regressão não-linear utilizando o programa Prism versão 3.0 (Graph Pad Software).

52

5. RESULTADOS

5.1. Potencial Nutricional de Sementes de E. contortisiliquum

A composição proximal da farinha das sementes de E. contortisiliquum está

apresentada na Tabela 1. Essas sementes são excelentes fontes de proteína, uma vez que são

compostas majoritariamente por esse macronutriente (cerca de 50% do conteúdo total, em

base seca). A semente também apresenta um alto conteúdo de fibra alimentar (24,61%),

característica desejável para uma leguminosa, e de umidade (10,29%). As sementes de E.

contortisiliquum apresentam teor de lipídio correspondente a 3,42% do conteúdo total, em

base seca. Percentual semelhante a esse é representado pelo teor de matéria mineral (3,46%).

O alto percentual de proteínas e moderado teor de carboidratos digeríveis (18,48%) resultam

em uma semente com um altíssimo valor calórico, correspondente a 304,82 kcal em uma

porção de 100 gramas.

As sementes de E. contortisiliquum apresentam um bom perfil de aminoácidos

essenciais, uma vez que o teor de leucina, lisina e histidina (81,4; 148,9 e 60,7 g/kg P,

respectivamente) são superiores aos descritos para a soja e clara do ovo e também aos

requerimentos nutricionais para crianças em diferentes faixas etárias (FAO/WHO/UNU,

1985). As sementes de E. contortisiliquum também apresentam um bom teor de treonina,

uma vez que este é equivalente ao descrito para a soja e superior aos requerimentos para

crianças em diferentes faixas etárias (FAO/WHO/UNU, 1985). No entanto, é notória a

deficiência nos aminoácidos metionina e triptofano, como também em fenilalanina, quando

comparados aos valores de referência (Tabela 2). Quanto aos aminoácidos não essenciais,

destacam-se os teores de serina (57,0 g/kg P) e glicina (50,2 g/kg P). Estes valores são

superiores aos descritos para a soja e clara do ovo.

Os resultados da análise da presença quantitativa de fatores tóxicos e/ou

antinutricionais estão apresentados na Tabela 3. Foi verificada a presença de toxinas no

extrato bruto (EB) de E. contortisiliquum, apresentando uma DL50 de 1,12 ± 0,04 g/kg de peso

corpóreo. Não foi detectada a presença de lectinas. Por outro lado, foram detectados altos

níveis de inibidores de tripsina e quimotripsina. A atividade inibitória de quimotripsina e

tripsina de sementes de E. contortisiliquum, considerando o teor de proteínas solúveis no EB

(atividade inibitória específica), foi avaliada em 39,84 e 38,87 UI/mg P, respectivamente. O

percentual de inibição de quimotripsina e tripsina foram de 97 e 100%, respectivamente. Com

base no alto conteúdo de inibidores de proteases nessas sementes e no fato de que a atividade

53

Tabela 1. Composição química elementar (g/100 g) e energia (kcal/100 g) da farinha de

sementes de Enterolobium contortisiliquum em base secaa

Constituintes

Sementes de

E. contortisiliquum

Umidadeb 10,29 ± 0,46

Proteínas totaisa,b

50,03 3,44

Lipídios totaisa,b

3,42 0,0

Material minerala,b

3,46 0,37

Fibra alimentara,b

24,61 0,28

Carboidratos digeríveisa 18,48

Energiac

304,82

bOs valores são média desvio padrão de uma triplicata;

cg de carboidrato x 4,0 kcal + g de proteína x 4,0 kcal + g de lipídio x 9,0 kcal (MAHAN e

SCOTT-STUMP, 1996).

54

Tabela 2. Composição de aminoácidos (g/kg P) da farinha delipidada de sementes de

Enterolobium contortisiliquum comparada à clara do ovo, soja e aos requerimentos

estabelecidos pela FAO/WHO/UNU (1985) para crianças em diferentes faixas etárias

Aminoácidos Sementes de E.

contortisiliquum

Clara do

ovo Soja

Crianças

2

0-5

anos

1

10-12

anos

Essenciais

Thr 38,2 49,2 38,1 34,0 28,0

Val 34,1 55,4 46,6 35,0 25,0

Ile 30,1 57,8 37,9 28,0 28,0

Leu 81,4 77,1 76,8 66,0 44,0

Lys 148,9 110,2 65,5 58,0 44,0

Phe 52,2 89,5 60,5 63,0 22,0

Tyr 37,5 44,0 50,2 - -

Met 10,2 52,3 13,8 25,0 22,0

Cys 8,36 23,8 16,3 - -

Trp 1,93 14,5 5,4 11,0 0,9

His 60,7 23,4 30,4 19,0 19,0

Não-essenciais

Asx 92,3 61,2 111,3

Glx 141,4 86,0 183,0

Ser 57,0 54,3 42,3

Gly 50,2 32,6 38,8

Ala 49,8 58,1 42,5

Arg 81,5 104,0 85,2

Pro 26,3 29,2 53,3

55

Tabela 3. Análise quantitativa da presença de fatores tóxicos e/ou antinutricionais nas

sementes de Enterolobium contortisiliquum

Fator tóxico e/ou antinutricional

Sementes de

E. contortisiliquum

Toxinas 1,12 ± 0,04*

Lectinas

ND**

Inibidores de Quimotripsina

39,84 ± 0,95***

Inibidores de Tripsina

38,87 ± 0,15***

* DL50, definido como a quantidade de proteína, em g/kg de peso corpóreo, capaz de causar

50% de morte em 24 h.

** Não detectado quando usado sangue de coelho nativo e tratado com proteases de Bacillus

licheniformis;

*** Expresso em Unidades de Inibição por miligrama de proteína (UI/mg P). Uma unidade de

inibição é definida como o decréscimo em 0,01 na absorbância a 440 nm no ensaio de

atividade inibitória de quimotripsina segundo Erlanger et al. (1961).

56

antiquimotríptica é mais eficaz do que a atividade antitríptica no processo de supressão e

prevenção da carcinogênese (DURANTI, 2006; SCARAFONI et al., 2007), o estudo foi

direcionado para o potencial nutracêutico dos inibidores de quimotripsina de sementes de E.

contortisiliquum, inicialmente através da sua purificação e caracterização parcial e finalizando

com a avaliação do seu efeito antiproliferativo contra linhagens de células tumorigênicas

humanas.

5.2. Atividade Inibitória de Quimotripsina nas Frações Proteicas de E. contortisiliquum

A Tabela 4 mostra o percentual de inibição e a atividade inibitória de

quimotripsina específica das frações proteicas de E. contortortisiliquum. As frações proteicas

correspondentes a concentração final de 0,5-6,0% de TCA apresentaram alto percentual de

inibição (≥ 95%), semelhante ao mostrado pelo EB (97%). Em contrapartida, as atividades

específicas das referidas frações mostraram-se superiores (de 13 a 45 vezes maior) do que a

observada no EB. As frações proteicas que correspondem a 6,5-10,0% de TCA praticamente

não apresentaram atividade inibitória de quimotripsina, por isso foram desconsideradas para

fins de seleção da fração de trabalho. A fração proteica que corresponde à concentração final

de 5,0% de TCA (F5,0) foi escolhida para dar prosseguimento aos procedimentos de

isolamento e purificação de inibidores de quimotripsina, já que ela apresentou o maior valor

de atividade inibitória específica (1.806 UI/mg P) e um alto percentual de inibição (97%).

5.3. Isolamento e Purificação dos Inibidores de Quimotripsina

O perfil cromatográfico de F5,0 aplicado em Resource Q em sistema FPLC Äkta

Purifier está apresentado na Figura 6. O ensaio de inibição de quimotripsina das frações

cromatográficas revelou que todos os picos do material retido na coluna mostraram algum

efeito inibitório sobre a quimotripsina, variando de 10 a 86%. No entanto, foram selecionados,

para fins de purificação e caracterização, somente aqueles que apresentaram inibição igual ou

superior a 40%. Os picos selecionados, P1, P2 e P3, apresentaram 69, 86 e 40% de inibição,

respectivamente.

As etapas utilizadas no processo de purificação dos inibidores de quimotripsina de

sementes de E. contortisiliquum estão sumarizadas na Tabela 5.

57

Tabela 4. Atividade inibitória de quimotrisina das frações proteicas de E. contortisiliquum:

Percentual de Inibição e Atividade Específica expressa em Unidades de Inibição* por

miligrama de proteína (UI/mg P)

Amostra % Inibição UI/mg P

EB 97 39,84

F0,5 95 503,6

F1,0 96 530,8

F1,5 96 568,2

F2,0 98 664,3

F2,5 98 720,0

F3,0 98 813,9

F3,5 97 1039,3

F4,0 98 1711,8

F4,5 97 1729,4

F5,0 97 1806,3

F5,5 97 1694,1

F6,0 96 1594,4

F6,5 7 146,7

F7,0 3 53,3

F7,5 0 0

F8,0 0 0

F8,5 0 0

F9,0 0 0

F9,5 0 0

F10,0 0 0

*Uma unidade de inibição é definida como o decréscimo em 0,01 na absorbância a 440 nm no

ensaio de atividade inibitória de quimotripsina segundo Erlanger et al. (1961).

58

Figura 6. Perfil cromatográfico da fração F5,0 aplicada em Resource Q em sistema FPLC

Äkta Purifier, com loop de 1 mL. A F5,0 liofilizada foi ressuspendida em tampão Tris-HCl

0,02 M, pH 8,0 e aplicada na coluna (1mgP/mL), previamente equilibrada com o mesmo

tampão. A cromatografia foi realizada a um fluxo constante de 1,5 mL/min. O material não

retido foi eluído com tampão Tris-HCl 0,02 M, pH 8,0 e, em seguida, aplicado um gradiente

salino que variou de 0 a 0,5 M NaCl para eluição do material retido na coluna. Foram

coletadas frações cromatográficas de 0,5 mL, as quais foram acompanhadas por

espectrofotometria a 280 nm e submetidas a ensaio de inibição de quimotripsina. Os picos P1,

P2 e P3 foram eluídos quando o gradiente de NaCl atingiu as concentrações 0,12; 0,14 e 0,19

M, respectivamente, e selecionados para fins de purificação e caracterização por terem

apresentado atividade inibitória de quimotripsina igual ou superior a 40%.

59

Tabela 5. Tabela de purificação dos inibidores de quimotripsina de sementes de E. contortisiliquum

Amostra Proteína

Total (mg)

Atividade Específica

(UI/mg P)

Atividade

Total (UI)

Índice de

Purificação**

Rendimento***

(%)

em termo de

proteína

Rendimento****

(%)

em termo de

atividade

EB* 748,3 54 40.470 1 100,0 100,0

F5,0 105,6 715 75.451 13,2 14,1 186,4

P1 1,8 6.741 11.864 124,8 0,24 29,3

P2 4,2 7.567 31.629 140,1 0,56 78,2

P3 4,2 1.208 5.123 22,4 0,56 12,6

* O extrato bruto (EB) obtido na primeira etapa de purificação serviu como referência para as demais amostras.

** Índice de purificação 1 e rendimento de 100% foram atribuídos ao EB. O índice de purificação nos passos subsequentes foi calculado

como sendo a razão entre a sua atividade específica e aquela do EB.

*** O rendimento foi calculado como sendo a razão entre a quantidade de proteína total em cada etapa e aquela do EB, multiplicada por 100.

**** O rendimento foi calculado como sendo a razão entre a atividade total em cada etapa e aquela do EB, multiplicada por 100.

60

O EB obtido na primeira etapa serviu como referência para as demais amostras.

Índice de purificação 1 e rendimento de 100% foram atribuídos ao EB. O índice de

purificação nos passos subsequentes foi calculado como sendo a razão entre a sua atividade

específica e aquela do EB. O rendimento em termo de proteína foi calculado como sendo a

razão entre a quantidade de proteína total em cada etapa e aquela do EB, multiplicado por

100. O rendimento em termo de atividade foi calculado como sendo a razão entre a atividade

total em cada etapa e aquela do EB, multiplicado por 100. A análise da Tabela 5 revela que as

atividades específicas de P1, P2 e P3 são bastante mais elevadas do que a observada no EB.

Tomando-se em consideração este parâmetro, o índice de purificação desses inibidores foi de,

aproximadamente, 125, 140 e 22 vezes, respectivamente. O rendimento proteico da

purificação, no entanto, foi inferior a 1,0% para os três inibidores.

5.4. Caracterização Bioquímica

5.4.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Os perfis eletroforéticos de EB; F5,0; P1; P2 e P3 estão mostrados na Figura 7.

No EB, está presente uma grande variedade de proteínas que se encontram em uma ampla

faixa de massa molecular. Já em F5,0, a variedade de bandas proteicas é muito menor, sendo

majoritárias aquelas correspondentes aos inibidores. Esse fato mostra que o fracionamento do

EB com TCA foi um procedimento bastante eficaz na remoção de proteínas de alta massa

molecular, contribuindo para uma maior eficiência no processo de purificação. Os inibidores

de quimotripsina de sementes de E. contortisiliquum P1, P2 e P3 migraram como proteínas de

massas moleculares aparentes de 17,3; 17,3 e 19,3 kDa, respectivamente, determinadas

através de mobilidade eletroforética com base em curva de calibração utilizando marcadores

moleculares (Figura 8). Considerando a visualização de apenas uma banda protéica no gel em

cada um dos picos P1, P2 e P3, deste momento em diante os mesmos passaram a ser

denominados EcCI1, EcCI2 e EcCTI, como referência ao nome da planta (Ec) e atividade

inibitória de quimotripsina e/ou tripsina (CI e/ou CTI).

5.4.2. Determinação de IC50

61

Figura 7. Perfis eletroforéticos de amostras de E. contortisiliquum sob condições

desnaturantes e não redutoras. Foram aplicados 12 g de proteína em cada poço. 1:

Marcadores de massa molecular (β-galactosidase - 116 kDa; BSA - 66,2 kDa; ovalbumina -

45 kDa; lactato desidrogenase - 35 kDa; endonuclease de restrição Bsp 981 - 25 kDa; β-

lactoglobulina - 18,4 kDa; lisozima - 14,4 kDa); 2: EB; 3: F5,0; 4: EcCI1 - 17,3 kDa; 5:

EcCI2 - 17,3 kDa; 6: EcCTI - 19,3 kDa.

62

Figura 8. Curvas de calibração de EcCI1 e EcCI2 (A) - 17,3 kDa e EcCTI (B) - 19,3 kDa,

construídas de acordo com a mobilidade eletroforética em gel de poliacrilamida sob condições

desnaturantes e não redutoras – SDS-PAGE (Laemmli, 1970), utilizando marcadores de

massa molecular como referência. 1: β-galactosidase (116 kDa); 2: BSA (66,2 kDa); 3:

ovalbumina (45 kDa); 4: lactato desidrogenase (35 kDa); 5: endonuclease de restrição Bsp

981 (25 kDa); 6: β-lactoglobulina (18,4 kDa); 7: lisozima (14,4 kDa).

63

A Figura 9 mostra as curvas de titulação de EcCI1, EcCI2 e EcCTI. As massas de

EcCI1, EcCI2 e EcCTI que reduzem em 50% a atividade da quimotripsina (IC50) são 2; 1,5 e

4 µg, respectivamente.

5.4.3. Determinação do Mecanismo de Inibição e da Constante de Inibição

Os gráficos duplo-recíproco (Lineweaver–Burk) para determinação do mecanismo

de inibição de EcCI1, EcCI2 e EcCTI estão mostrados na Figura 10. EcCI1 e EcCI2

apresentaram inibição do tipo não-competitiva, caracterizada pela alteração da velocidade

máxima, dada pela interseção das retas em diferentes pontos da ordenada, e inalteração do

valor de km (constante de Michaellis-Menten), dada pela interseção das retas no mesmo ponto

da abscissa. EcCTI inibiu a quimotripsina de forma competitiva, caracterizada pela

inalteração da velocidade máxima e alteração do valor de km.

As determinações das constantes de inibição (ki) de EcCI1, EcCI2 e EcCTI

através dos gráficos de Dixon (1/v versus I) estão mostradas na Figura 11. Os valores de ki de

EcCI1, EcCI2 e EcCTI são, respectivamente, 4 x 10-8

; 2,5 x 10-8

e 5 x 10-8

M.

5.4.4. Especificidade dos Inibidores para Proteases Serínicas e Cisteínica

Os inibidores de quimotripsina de E. contortortisiliquum não apresentaram

atividade inibitória contra papaína (Tabela 6). Apenas EcCTI foi capaz de inibir a tripsina,

apresentando 98% de inibição. Esse inibidor também foi capaz de inibir a elastase

neutrofílica, porém não com a mesma intensidade (apenas 20%). Em contrapartida, EcCI1 e

EcCI2 a inibiram consideravelmente (77 e 76%, respectivamente). Os três inibidores também

foram capazes de inibir a elastase pancreática, porém de forma mais fraca (ca. de 20%).

5.4.5. Estabilidade dos Inibidores a Agentes Desnaturantes Físicos e Químicos

A estabilidade térmica dos inibidores de quimotripsina de E. contortortisiliquum

está apresentada na Figura 12. Apenas EcCI2 não manteve sua atividade inibitória estável a

100 °C, tendo sido reduzida para 10%. No intervalo de 37 a 90 °C, a inibição de EcCI2 variou

entre 88 e 93%. A variação térmica não exerceu influência sobre a capacidade inibitória de

64

Figura 9. Curvas de titulação dos inibidores de quimotripsina EcCI1 (A) e EcCI2 (B) e do

inibidor de quimotripsina e tripsina EcCTI (C), construídas com concentrações crescentes de

inibidor (0,041; 0,083; 0,165; 0,330 e 0,661 μM, para EcCI1; 0,062; 0,124; 0,248; 0,495 e

0,991 μM para EcCI2; e 0,130; 0,259; 0,518; 1,036 e 2,073 μM para EcCTI). As quantidades

de EcCI1, EcCI2 e EcCTI que reduzem em 50% a atividade da quimotripsina (IC50) são 2; 1,5

e 4 g, respectivamente.

65

Figura 10. Mecanismos de inibição de EcCI1, EcCI2 e EcCTI determinados através de

gráfico duplo-recíproco de Lineweaver-Burk. EcCI1 (A) e EcCI2 (B) apresentam mecanismo

de inibição do tipo não-competitivo. EcCTI (C) apresenta mecanismo de inibição do tipo

competitivo.

66

Figura 11. Constantes de inibição (ki) de EcCI1 (A), EcCI2 (B) e EcCTI (C) através de

representação de Dixon.

67

Tabela 6. Especificidade de inibição apresentada pelos inibidores EcCI1, EcCI2 e EcCTI

frente a enzimas serínicas e cisteínica, determinada utilizando 8, 5 e 20 g de EcCI1, EcCI2 e

EcCTI, respectivamente

Inibição Enzimática (%)

Tripsina Elastase

Pancreática

Elastase

Neutrofílica Papaína

EcCI1 ND* 17 77 ND

*

EcCI2 ND* 18 76 ND

*

EcCTI 98 18 20 ND*

*ND: Não detectada.

68

EcCI1 e EcCTI. No intervalo de 37 a 100 °C, a inibição de EcCI1 variou entre 89 e 97%. Já a

inibição de EcCTI variou entre 86 e 92%.

Os três inibidores mantiveram suas atividades inibitórias de quimotripsina

estáveis frente a variações extremas de pH (Figura 13). A variação de pH entre 2 e 12

praticamente não alterou a atividade inibitória de EcCI1 (inibição de 92 a 100%), EcCI2

(inibição de 92 a 94%) e EcCTI (inibição de 80 a 91%).

A presença do agente redutor ditiotreitol (DTT), mesmo em alta concentração

(100 mM), não exerceu influência sobre a atividade inibitória de quimotripsina de EcCI1 e

EcCTI, como mostrado na Figura 14. A variação da inibição exercida por EcCI1 e EcCTI nos

vários tempos de incubação e nas várias concentrações de DTT foi de 86-94% e de 81-84%,

respectivamente. EcCI2, em contrapartida, reduziu a sua atividade inibitória em cerca de 50%

quando incubado com DTT 100 mM, em todos os tempos testados. A variação da atividade

inibitória de EcCI2 quando incubado com DTT 1 e 10 mM foi entre 84 e 92%.

5.5. Atividade Antiproliferativa in vitro contra Células Tumorais Humanas

Os inibidores de quimotripsina de sementes de E. contortisiliquum não exerceram

efeito antiproliferativo contra as linhagens de células tumorais HL-60 (leucemia), MDA-MB-

435 (melanoma), SF-295 (cérebro) e HCT-8 (cólon), testadas na concentração máxima de 200

µg/mL em 72 h de exposição.

69

Figura 12. Estabilidade térmica dos inibidores EcCI1 (A), EcCI2 (B) e EcCTI (C),

determinada utilizando 8, 5 e 20 g de EcCI1, EcCI2 e EcCTI, respectivamente. A variação

de inibição de EcCI1 e EcCTI, quando incubados entre 37 e 100 °C, por 30 min, foi de 89-

97% e 86-92%, respectivamente. Entre 37 e 90 °C, a inibição de EcCI2 variou entre 88 e

93%. A 100 °C, a inibição de EcCI2 caiu para 10%.

70

Figura 13. Estabilidade de EcCI1 (A), EcCI2 (B) e EcCTI (C) a variação de pH entre 2 e 12,

determinada utilizando 8, 5 e 20 g de EcCI1, EcCI2 e EcCTI, respectivamente. Os três

inibidores mantiveram-se funcionalmente estáveis nas condições de pH testadas.

71

Figura 14. Estabilidade dos inibidores EcCI1 (A), EcCI2 (B) e EcCTI (C) ao agente redutor

ditiotreitol (DTT) em concentrações que variaram entre 1 e 100 mM, determinada utilizando

8, 5 e 20 g de EcCI1, EcCI2 e EcCTI, respectivamente. EcCI1 e EcCTI mantiveram suas

atividades inibitórias estáveis nas concentrações de DTT e tempos de incubação testados,

enquanto EcCI2 reduziu sua atividade em torno de 50% quando incubado com DTT 100 mM.

72

6. DISCUSSÃO

Neste trabalho, foi avaliado o potencial nutricional de sementes de E.

contortisiliquum, considerando a possibilidade de estas virem a ser uma fonte promissora de

alimento com propriedades funcionais (nutracêuticos). Considerando que várias espécies de

plantas da Caatinga são subexploradas ou o seu real valor de utilização é desconhecido da

população e também da comunidade científica, pesquisas que objetivam oportunizar o uso

racional dos recursos naturais podem fornecer subsídios para a conservação da biodiversidade

dos biomas brasileiros, neste caso, a Caatinga.

Inicialmente, o estudo foi direcionado para a avaliação do potencial nutricional

das sementes de E. contortisiliquum através da análise da composição proximal e

aminoacídica e determinação da presença de fatores tóxicos e/ou antinutricionais. O teor de

umidade determinado para as sementes de E. contortisiliquum (10,29 ± 0,46%) é superior ao

descrito para Vigna unguiculata (6,14 a 8,92%) (ONWULIRI e OBU, 2002) e para legumes

selvagens da Índia (Cassia floribunda, C. obtusifolia e Mucuna monosperma), os quais

variam entre 5,7 e 8,5% (VADIVEL e JANARDHANAN, 2005). De acordo com Puzzi

(2000), grãos de soja devem ser armazenados com teor de umidade variando entre 11 e 14% a

fim de prevenir a proliferação de microrganismos e a ocorrência de reações de hidrólise que

podem levar a perda do valor nutricional das sementes. Portanto, o alto valor de umidade

determinado para as sementes de E. contortisiliquum não compromete a sua qualidade

nutricional.

Na composição proximal em base seca da farinha das sementes de E.

contortisiliquum destaca-se o teor de proteínas. Essa leguminosa possui um altíssimo teor

proteico, de 50,03 ± 3,44%, muito mais elevado do que os valores já descritos para 6

variedades de Vigna unguiculata (19,5 a 26,1%), 9 variedades de Glycine max (39,4 a 44,5%)

e legumes selvagens da Índia (37,2 a 45,41%) (MAIA et al., 2000; VADIVEL e

JANARDHANAN, 2005; VASCONCELOS et al., 2006). Portanto, E. contortisiliquum pode

ser considerada uma excelente fonte de proteínas. É de fundamental importância o estudo de

fontes não convencionais de proteína vegetal a fim de que possam ser incorporadas à dieta, na

tentativa de combater os quadros de desnutrição que atingem, principalmente, as populações

mais pobres dos países em desenvolvimento (METRI et al., 2003). Por outro lado, o teor

lipídico, de apenas 3,42%, é bastante inferior ao descrito para a soja (20,1 a 23,2%) por

Vasconcelos et al. (2006), porém superior ao dos feijões (UNICAMP, 2006). O percentual de

material mineral encontrado para as sementes de E. contortisiliquum (3,46 ± 0,37%) é

73

comparável aos valores descritos por Trugo et al. (2000) para Lupinus spp. (3,2%), Phaseolus

vulgaris (4,6%), Glycine max (5,3%) e para as demais leguminosas comumente utilizadas na

alimentação humana (UNICAMP, 2006). O percentual de fibra alimentar nas sementes de E.

contortisiliquum é moderado, equivalendo a 24,61 ± 0,28%, em base seca. Esse valor é apenas

um pouco inferior ao descrito para Phaseolus vulgaris (36%) por Mechi et al. (2005). A

presença de uma quantidade razoável de fibra alimentar nas sementes de E. contortisiliquum

as tornam ainda mais promissoras do ponto de vista nutricional, dado que o consumo desses

componentes da dieta em quantidades moderadas promove uma série de efeitos benéficos à

saúde, como prevenção de doenças cardiovasculares e do trato digestório, diabetes, sobrepeso

e obesidade (DURANTI, 2006), caracterizando-a, nessa condição, como alimento funcional.

Devido ao moderado teor de carboidratos digeríveis (18,48%) e ao altíssimo percentual de

proteínas, as sementes de E. contortisiliquum apresentam um elevado conteúdo calórico, de

304,82 kcal em uma porção de 100 g, enquanto a mesma quantidade de Phaseolus vulgaris

fornece apenas 228,16 kcal (MECHI et al., 2005). As sementes de E. contortisiliquum,

portanto, são dotadas de um alto valor nutricional, na medida em que são excelentes fontes de

proteínas, apresentam moderado teor de fibras em sua composição e ainda, fornecem um

elevado aporte energético.

Quanto à composição aminoacídica, parâmetro importante quando se busca uma

nova fonte de proteína para a alimentação humana e/ou animal, as sementes de E.

contortisiliquum apresentam, dentre os aminoácidos essenciais, quantidades adequadas de

leucina (81,4 g/kg P), lisina (148,9 g/kg P) e histidina (60,7 g/kg P) quando em comparação

com os valores descritos para Glycine max, clara do ovo e com os requerimentos

estabelecidos pela FAO/WHO/UNU (1985) para crianças em diferentes faixas etárias. O teor

de treonina (38,2 g/kg P) também pode ser considerado adequado quando comparado com os

valores de referência (exceto clara do ovo). Por outro lado, é notória a deficiência nos

aminoácidos metionina e triptofano (10,2 e 1,93 g/kg P, respectivamente), característica

inerente às proteínas das leguminosas (MAIA et al., 2000; VASCONCELOS et al., 2001).

Dentre os aminoácidos não-essenciais ou semi-essenciais, destacaram-se os elevados teores de

serina e glicina (57,0 e 50,2 g/kg P), superiores aos encontrados na soja e clara do ovo.

Quando os teores de aminoácidos essenciais detectados em E. contortisiliquum são

comparados à composição da clara do ovo, proteína de referência nos estudos de avaliação da

qualidade de proteínas, apenas três aminoácidos aparecem em quantidades superiores:

leucina, lisina e histidina. Esses mesmos aminoácidos, acrescido de treonina, isoleucina,

fenilalanina e metionina aparecem também em quantidades equivalentes ou superiores nas

74

sementes de E. contortisiliquum quando comparado à soja (G. max) analisada por

Vasconcelos et al. (2001). Portanto, o perfil aminoacídico das sementes de E. contortisiliquum

é comparável àquele descrito para G. max, leguminosa amplamente difundida na alimentação

humana. Quando a composição de aminoácidos essenciais de E. contortisiliquum é comparada

aos requerimentos estabelecidos pela FAO/WHO/UNU (1985) para crianças de 2 a 5 anos,

três aminoácidos (fenilalanina, metionina e triptofano) apresentam deficiência de 17,14; 59,20

e 82,45%, respectivamente. No geral, as sementes de E. contortisiliquum são boas fontes de

aminoácidos, apresentando triptofano e metionina como os mais limitantes.

Quanto aos fatores antinutricionais, foi detectada a presença de toxinas e

inibidores de proteases (tripsina e quimotripsina). Não foi detectada a presença de lectinas

através de ensaio de atividade hemaglutinate utilizando eritrócitos de coelho nativo e tratado

com proteases de Bacillus licheniformis. As lectinas são encontradas em uma ampla variedade

de espécies de plantas e animais. Entretanto, estão presentes em maior quantidade em grãos

de leguminosas e gramíneas (MANCINI-FILHO et al., 1979; PUSZTAI, 1989). Vasconcelos

et al. (2006) detectaram atividade hemaglutinante em nove cultivares de soja brasileira,

variando de 1.152 a 147.456 UH/kg farinha. Embora muitas lectinas reconheçam e se liguem

a açúcares simples, a afinidade é muito maior para com os constituintes de glicoproteínas

encontrados em animais e seres humanos (NICOLSON, 1974; PEUMANS e VAN DAMME,

1996). Assim, faz-se necessária a investigação de atividade hemaglutinante utilizando tipos

sanguíneos de outras origens (rato, camundongo, homem) a fim de ratificar a ausência de

lectinas nas sementes de E. contortisiliquum. Foi verificada a presença de toxinas nas

sementes de E. contortisiliquum. A DL50 calculada para a atividade tóxica foi de 1,12 ± 0,04

g/kg de peso corpóreo. Esse valor é cerca de 180 vezes maior do que aqueles descritos para

duas proteínas tóxicas de Glycine max, a “soyatoxina” – SYTX e a toxina da soja – SBTX, as

quais apresentam DL50 de 6-8 mg/kg de peso corpóreo e 6 mg/kg de peso corpóreo,

respectivamente (VASCONCELOS et al., 1994; 2008). Outra toxina, a canatoxina – CNTX,

purificada de Canavalia ensiformis, apresenta DL50 de 2 mg/kg de peso corpóreo, isto é, 560

vezes mais potente do que as toxinas de E. contortisiliquum. Dessa forma, a presença de

toxinas em sementes de E. contortisiliquum não deve representar um elevado potencial para a

manifestação de efeitos deletérios à saúde devido à sua baixa toxicidade. Ademais, embora a

presença de proteínas com propriedades tóxicas em sementes de E. contortisiliquum seja

desfavorável à sua sugestão como nova fonte de proteína para uso na alimentação animal e

humana, elas podem ser facilmente inativadas através de tratamento térmico como o

cozimento, uma vez que são termolábeis. Também foi verificada a presença de inibidores de

75

proteases (tripsina e quimotripsina) nas sementes de E. contortisiliquum, cujas atividades

corresponderam a cerca de 40 UI/mg P para ambos os tipos de inibidores. A essa classe de

biomoléculas é atribuída uma série de efeitos deletérios à saúde, como alterações metabólicas

do pâncreas (aumento da secreção enzimática, hipertrofia e hiperplasia) e redução da taxa de

crescimento (AL-WESALI et al., 1995). No entanto, o outro lado a se considerar, quando se

propõe a caracterizar os componentes antinutricionais/bioativos de uma planta, é aquele

referente aos efeitos benéficos que esses compostos podem também exercer (CHAMP, 2002;

DURANTI, 2006), questão de que trata a nutracêutica. Neste sentido, há relatos de várias

propriedades farmacológicas interessantes apresentadas por inibidores de proteases de soja e

outras leguminosas, o que tem levado a comunidade científica a repensar a necessidade de se

remover todas as substâncias antinutricionais e/ou tóxicas por meios tecnológicos e,

especialmente, por melhoramento genético (THOMPSON, 1993; WARE et al., 1997;

CLEMENTE e DOMONEY, 2001). Dessa forma, o estudo foi direcionado para a

investigação do potencial nutracêutico dos inibidores de quimotripsina de sementes de E.

contortisiliquum, inicialmente através da sua purificação e caracterização parcial e finalizando

com a avaliação do seu efeito antiproliferativo contra linhagens de células tumorigênicas

humanas.

Três inibidores de quimotripsina foram purificados e parcialmente caracterizados

a partir de sementes de E. contortisiliquum através de precipitação com TCA e cromatografia

de troca iônica em sistema FPLC. Para a mesma espécie, já é descrito na literatura a

purificação e caracterização de um inibidor de tripsina pertencente à família Kunitz

(BATISTA et al., 1996), onde foram realizadas etapas de precipitação com acetona e

cromatografias de troca iônica, exclusão molecular e de fase reversa.

O fracionamento proteico do EB de E. contortisiliquum com TCA foi capaz de

desnaturar e precipitar proteínas de alta massa molecular, fato verificado através da

visualização dos perfis eletroforéticos de EB e F5,0 (Figura 6). O EB apresenta uma grande

diversidade de bandas proteicas de alta e média massa molecular, ao passo que a fração

proteica obtida através de fracionamento com TCA encerrando uma concentração final de

5,0% de ácido (F5,0) reúne, em termos práticos, apenas os inibidores de quimotripsina.

Assim, o fracionamento com TCA como etapa inicial do processo de purificação desses

inibidores revelou-se uma estratégia extremamente eficiente na remoção de grande parte de

proteínas contaminantes.

Os inibidores de quimotripsina EcCI1, EcCI2 e EcCTI foram purificados

utilizando apenas um passo cromatográfico em coluna de troca aniônica Resource Q, em

76

sistema FPLC Äkta Purifier. O índice de purificação de EcCI1 e EcCI2 foi de 125 e 140

vezes, respectivamente. Esses valores são comparáveis aos encontrados para os inibidores de

tripsina de Dimorphandra mollis (116,2 vezes), Archidendron ellipticum (123,9 vezes) e

Tamarindus indica (127 vezes) (MACEDO et al., 2000; ARAÚJO et al., 2005;

BHATTACHARYYA et al., 2006). EcCTI apresentou índice de purificação de 22 vezes,

superior a outros inibidores de tripsina de Cratylia mollis (18 vezes), Dimorphandra mollis

(12,15 vezes), Caesalpinia bonduc (11,4 vezes) e Entada scandens (2,3 vezes) (MELLO et

al., 2001; PAIVA et al., 2006; BHATTACHARYYA et al., 2007; LINGARAJU e GOWDA,

2008).

A análise dos perfis eletroforéticos dos inibidores de quimotripsina purificados de

E. contortisiliquum revelou a presença de bandas proteicas de massas moleculares aparentes

de 17,3 (EcCI1 e EcCI2) e 19,3 kDa (EcCTI), semelhantes às encontradas para inibidores de

Lens culinaris, de 16 kDa (RAGG et al, 2006), Archidendron ellipticum

(BHATTACHARYYA et al., 2006), Entada scandens (LINGARAJU e GOWDA, 2008),

Caesalpinia bonduc (BHATTACHARYYA et al., 2007), Dimorphandra mollis (MACEDO et

al., 2000) e também para o inibidor de tripsina de E. contortisiliquum descrito por Batista et

al. (1996), todos apresentando massa molecular aparente de 20 kDa. Lam e Ng (2009) relatam

que a maioria dos inibidores de quimotripsina apresenta massa molecular inferior a 10 kDa.

No entanto, muitos deles encontram-se entre 10 e 25 kDa, como é o caso dos inibidores

descritos neste trabalho. As massas moleculares aparentes de EcCI1, EcCI2 e EcCTI sugerem

que esses inibidores são pertencentes à família Kunitz, da qual fazem parte inibidores de

proteases de massas moleculares que variam, geralmente, entre 18 e 25 kDa (RICHARDSON,

1991). Outros parâmetros como o conteúdo de cisteína e o número de sítios reativos devem

ser avaliados para reforçar essa hipótese. No entanto, resultado conclusivo sobre este aspecto

será obtido com sequenciamento e comparação de identidade com outros inibidores dessa

família em bancos de dados.

Os valores de ki determinados para os inibidores purificados de sementes de E.

contortisiliquum encontram-se na mesma ordem de grandeza, 10-8

M. Dentre esses, EcCI2 é o

mais potente inibidor de quimotripsina, com ki de 2,5 x 10-8

M, seguido de EcCI1 e EcCTI,

que apresentam constantes de inibição de 4 x 10-8

e 5 x 10-8

M, respectivamente. Esses

inibidores são menos potentes do que aqueles descritos por Bhattacharyya et al (2006; 2007) e

Bhattacharyya e Babu (2009) para A. ellipticum, C. bonduc e Derris trifoliata Lour, todos

exibindo ki da ordem de 10-10

M. Outros inibidores de quimotripsina, no entanto, exibem

constantes de inibição comparáveis aos encontrados neste trabalho, como é o caso dos

77

inibidores de Schizolobium parahyba e Bombyx mori, que apresentam ki de 5,8 x 10-8

e 1,3 x

10-8

M, respectivamente (SASAKI, 1984; SOUZA et al., 1995). Ademais, EcCI1, EcCI2 e

EcCTI são inibidores de quimotripsina mais potentes do que os descritos para Plathymenia

foliosa, Calliandra selloi, Peltophorum dubium e para a própria E. contortisiliquum, os quais

apresentam ki de 1,4 x 10-6

; 4,95 x 10-7

; 2,6 x 10-7

e 1,2 x 10-7

M, respectivamente (BATISTA

et al., 1996; MACEDO et al., 2003; YOSHIZAKI et al., 2007; RAMOS et al., 2008).

Os estudos referentes à cinética de inibição também revelaram que EcCI1 e EcCI2

inibem a quimotripsina de forma não-competitiva, assim como os inibidores de C. bonduc

(BHATTACHARYYA et al., 2007), Acacia confusa (LAM e NG, 2009) e Adenanthera

pavonina (MACEDO et al., 2004). EcCTI, no entanto, inibe a quimotripsina de forma

competitiva, assim como os inibidores de A. ellipticum (BHATTACHARYYA et al., 2006) e

D. trifoliata Lour (BHATTACHARYYA e BABU 2009).

Dentre os inibidores de quimotripsina purificados neste trabalho, apenas EcCTI

foi capaz de também inibir a tripsina (98% de inibição), assim como EcTI, outro inibidor já

descrito para E. contortisiliquum (BATISTA et al., 1996). Apesar de EcCTI e EcTI serem

ambos inibidores de tripsina e quimotripsina e ainda apresentarem massas moleculares

aparentes semelhantes, o estudo cinético dos dois inibidores sugere a possibilidade de que

sejam moléculas distintas, dada a afinidade para quimotripsina ser diferente nos dois casos. A

constante de inibição de EcTI para quimotripsina é da ordem de 10-7

M, enquanto que o

mesmo parâmetro encontra-se na ordem de 10-8

M no caso de EcCTI. No entanto, a

comparação das sequências de aminoácidos dos dois inibidores, ainda não realizada, poderá

esclarecer essa questão a respeito da identidade de ambos os inibidores.

Vários inibidores de tripsina/quimotripsina já foram purificados e caracterizados

(LIN et al., 1991; SAMPAIO et al., 1996; OLIVA et al., 2000; BHATTACHARYYA et al.,

2006, 2007; BHATTACHARYYA e BABU, 2009). Por outro lado, poucos inibidores de

quimotripsina não exercem atividade inibitória sobre a tripsina, como é o caso de EcCI1,

EcCI2 e outros inibidores já descritos na literatura (KORTT, 1980; SOUZA et al., 1995;

TELES et al., 2004; IWANAGA et al., 2005; LAM e NG, 2009). EcCI1 e EcCI2 também

apresentaram elevada atividade inibitória de elastase neutrofílica (ca. de 80%), enquanto

EcCTI inibiu fracamente essa enzima (20%). Elastase neutrofílica é uma proteinase serínica

envolvida em processos inflamatórios agudos e crônicos devido a sua habilidade em degradar

elastina, fibronectina, proteoglicanos e proteínas plasmáticas, além de atuar como moduladora

de funções celulares inflamatórias, como ativação de linfócitos e agregação plaquetária

(OWEN et al., 1997). Compostos capazes de inibir a ação da elastase neutrofílica ou sua

78

liberação a partir de neutrófilos são candidatos a novas drogas anti-inflamatórias, e portanto,

de grande interesse para a indústria farmacêutica (FOOK et al., 2005). Os três inibidores

purificados neste trabalho foram capazes de inibir a ação da elastase pancreática, porém de

forma pouco intensa (ca. de 20%). Esse resultado é semelhante ao encontrado por Teles et al.

(2004), no qual relatam a inibição dessa enzima em 18% pelo inibidor de S. parahyba.

Nenhum dos três inibidores relatados neste trabalho foi capaz de inibir a enzima cisteínica

papaína. Portanto, eles não exibem a característica bifuncional já descrita para outros

inibidores de proteases serínicas, como aqueles purificados de Pithecelobium dumosum

(OLIVEIRA et al., 2007) e Crotalaria pallida (GOMES et al., 2005).

Quanto à permanência da atividade inibitória de quimotripsina frente a agentes

desnaturantes físicos (temperatura e pH) e químicos (DTT), EcCI1, EcCI2 e EcCTI

mostraram-se bastante estáveis. EcCI1 e EcCTI não tiveram suas propriedades inibitórias

alteradas em temperaturas extremas, mantendo a inibição de quimotripsina em torno de 90%,

mesmo a 100 °C. Resultado semelhante foi apresentado por inibidor de Poecilanthe

parviflora (GARCIA et al., 2004). Esses autores discutem que as pontes dissulfeto

intramoleculares são presumivelmente as responsáveis pela alta estabilidade funcional de

inibidores em condições extremas de temperatura, pH e presença de agentes redutores. A

maior termoestabilidade apresentada por EcCTI em relação a EcTI descrito por Batista et al.

(1996) fornece mais subsídios à hipótese de que se tratam de dois inibidores distintos. Este

último mantém sua atividade inibitória após incubação a 60 °C por 10 min, mas não quando

incubado pelo mesmo tempo a 100 °C. Por outro lado, EcCI2 se manteve funcionalmente

estável até 90 °C, apresentando percentual de inibição em torno de 90%. A 100 °C, entretanto,

sua atividade inibitória de quimotripsina decaiu para 10%. Ainda assim, esse inibidor é mais

termoestável do que aquele de A. confusa, o qual inicia a decrescer sua atividade a partir de 60

°C, chegando a perdê-la completamente a 100 °C (LAM e NG, 2009) e de S. parahyba, o qual

inicia a diminuição de sua atividade inibitória a partir de 75 °C e chega a 95 °C sem atividade

(SOUZA et al., 1995). A atividade inibitória de quimotripsina de EcCI1, EcCI2 e EcCTI não

foi influenciada pela variação de pH entre 2 e 12, mantendo o percentual de inibição em torno

de 90%. Resultados semelhantes foram obtidos para E. contortisiliquum (BATISTA et al.,

1996), P. parviflora (GARCIA et al., 2004) e Inga laurina (MACEDO et al., 2007). Além da

possível presença de pontes dissulfeto, a alta estabilidade dos inibidores de E.

contortisiliquum à variação de pH pode estar relacionada à baixa massa molecular desses

inibidores. Lam e Ng (2009) discutem que a susceptibilidade do inibidor de quimotripsina de

A. confusa em extremos de pH (0-2 e 11-14) pode dever-se a sua massa molecular elevada, de

79

70 kDa. Os três inibidores também se mostraram altamente resistentes ao agente redutor DTT.

EcCI1 e EcCTI não tiveram suas atividades inibitórias comprometidas mesmo na

concentração de 100 mM de DTT por 2 h, mantendo percentuais de inibição em torno de 90 e

80%, respectivamente. EcCI2, entretanto, apresentou-se mais susceptível ao DTT do que os

outros dois inibidores, reduzindo sua atividade inibitória para 50% da original quando

incubado com DTT 100 mM. Resultado semelhante a esse foi descrito para o inibidor de Inga

laurina, o qual perdeu 56% de sua atividade quando incubado com DTT 100 mM (MACEDO

et al., 2007). Ainda assim, os três inibidores purificados neste trabalho demonstram-se mais

resistentes ao DTT do que os inibidores de P. parviflora (GARCIA et al., 2004) e P. dubium

(MACEDO et al., 2003), os quais reduzem drasticamente suas atividades inibitórias quando

incubados com DTT 10 mM. Alguns autores discutem que a estabilidade funcional do

inibidor não está relacionada à presença de pontes dissulfeto intramoleculares (MACEDO et

al., 2007), uma vez que é raro a susceptibilidade ao DTT. No entanto, as pontes dissulfeto que

conferem estabilidade estrutural à proteína não necessariamente também conferem sua

estabilidade funcional. Esta pode ser adquirida também através de inúmeras pontes de

hidrogênio no sítio reativo, como é o caso do inibidor de tripsina de Erythrina caffra (LEHLE

et al., 1994).

Já é bastante relatada na literatura a ocorrência de inibidores de proteases oriundos

de sementes de leguminosas capazes de inibir a ação catalítica de tripsina e/ou quimotripsina

com ação antiproliferativa contra células tumorais. Esses inibidores possuem características

bastante variadas, apresentando massas moleculares tão distintas quanto 8 e 70 kDa, além de

pertencerem a ambas as famílias Kunitz e Bowman-Birk (KENNEDY, 1998; CATALANO et

al., 2003; SAITO et al., 2007; LIN e NG, 2008; LAM e NG, 2009). Não há, pois, até o

momento, uma regra que defina quais características um inibidor de proteases deve possuir

para que seja capaz de apresentar essa atividade biológica. Sabe-se, no entanto, que a

atividade antiquimotríptica é mais eficaz do que a atividade antitríptica no processo de

supressão e prevenção de carcinogênese (KENNEDY, 1998; DURANTI, 2006; SCARAFONI

et al., 2007). No entanto, a atividade antiquimotríptica não é requerimento essencial

(CATALANO et al., 2003). No presente trabalho, não foi observado efeito antiproliferativo

dos inibidores de quimotripsina EcC1 e EcCI2 e de tripsina/quimotripsina EcCTI contra as

linhagens de células tumorigênicas HL-60 (leucemia), MDA-MB-435 (melanoma), SF-295

(cérebro) e HCT-8 (cólon). No entanto, este resultado não descarta a possibilidade de dar

continuidade à avaliação dessa atividade biológica desempenhada pelos inibidores de

quimotripsina purificados neste trabalho. Uma nova perspectiva de trabalho é avaliação da

80

atividade antiproliferativa in vitro utilizando outras linhagens de células tumorais, dada a

especificidade de inibidores de proteases sobre células-alvo (LAM e NG, 2009). Outra

possibilidade é o estudo dessa atividade em sistemas in vivo. Há relatos de que certas

substâncias podem exercer efeitos antiproliferativos in vivo, mas não in vitro (LINS et al.,

2008).

Vários mecanismos de quimioprevenção contra o câncer desempenhados por

inibidores de proteases são descritos na literatura. Um deles abrange a prevenção primária, na

qual o agente quimiopreventivo atua de forma a evitar a indução da transformação e/ou a

inibir a progressão de um estágio preliminar para outro mais avançado da carcinogênese. Isso

pode ocorrer de várias maneiras, dentre elas, atuando sobre a inibição da síntese e/ou captação

de agentes mutagênicos, degradação e/ou remoção de carcinógenos, favorecimento da

absorção de outros agentes protetores, controle da inibição da ativação de pró-

mutagênicos/carcinogênicos por enzimas etc (DE FLORA e FERGUSON, 2005). Desse

modo, é válido ainda avaliar se os inibidores de quimotripsina de E. contortisiliquum

relatados neste trabalho desempenham ou não alguma função quimiopreventiva em células

sadias.

81

7. CONCLUSÕES

1- As sementes de Enterolobium contortisiliquum são dotadas de um alto

potencial nutricional, merecendo destaque:

o excelente teor de proteínas (ca. de 50% do conteúdo da semente, em base

seca) e um bom perfil de aminoácidos essenciais, sendo triptofano e metionina os mais

limitantes;

o bom teor de fibra alimentar (ca. de 20%) e o alto aporte energético (ca. de

300 kcal) fornecido em uma porção de 100 g;

a baixa toxicidade;

a presença de inibidores de proteases (tripsina e quimotripsina), cujas

atividades específicas foram avaliadas em cerca de 40 UI/mg P para ambos.

2- Três inibidores de quimotripsina denominados EcCI1, EcCI2 e EcCTI foram

purificados e assim caracterizados:

EcCI1, EcCI2 e EcCTI possuem massas moleculares aparentes de 17, 17 e 19

kDa, respectivamente;

EcCI1 e EcCI2 apresentam mecanismos de inibição do tipo não-competitivo e

constantes de inibição (ki) de 4 x 10-8

e 2,5 x 10-8

M, respectivamente. EcCTI apresenta

inibição de quimotripsina do tipo competitivo e ki de 5 x 10-8

M;

EcCI1, EcCI2 e EcCTI mantêm suas atividades inibitórias de quimotripsina

estáveis em uma faixa de pH entre 2 e 12, apresentando percentuais de inibição de até 100, 94

e 91%, respectivamente;

EcCI1 e EcCTI mantêm suas atividades inibitórias de quimotripsina estáveis

em uma faixa de temperatura entre 37 e 100 °C, apresentando percentuais de inibição de até

97 e 92%, respectivamente. EcCI2 mantém sua atividade inibitória de quimotripsina estável

até 90 °C, apresentando percentual de inibição de até 93%. A 100 ºC, no entanto, EcCI2

apresenta percentual de inibição de 10%;

EcCI1 e EcCTI apresentam elevada estabilidade ao agente redutor DTT.

Mesmo na concentração de 100 mM de DTT, esses inibidores mantêm suas atividades

inibitórias de quimotripsina em torno de 90 e 80%, respectivamente, enquanto EcCI2 reduz

sua inibição para 50%;

82

Apenas EcCTI apresenta atividade inibitória de tripsina (98% de inibição).

EcCI1 e EcCI2 apresentam elevada atividade inibitória de elastase neutrofílica (77 e 72% de

inibição, respectivamente), mas não EcCTI (20% de inibição). Os três inibidores também

exercem efeito inibitório sobre a elastase pancreática, porém de forma pouco intensa (ca. de

20% de inibição para os três inibidores). Nenhum inibidor de quimotripsina purificado neste

trabalho apresenta atividade inibitória de papaína;

EcCI1, EcCI2 e EcCTI não apresentam atividade antiproliferativa contra as

linhagens de células tumorais HL-60 (leucemia), MDA-MB-435 (melanoma), SF-295

(cérebro) e HCT-8 (cólon), quando testadas in vitro na concentração máxima de 200 µg/mL

em 72 h de exposição.

83

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