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DETECCIÓN DE GENES nifH Y phoD EN BACTERIAS ENDÓFITAS Y EPÍFITAS
AISLADAS A PARTIR DE Ricinus communis Y Plukenetia volubilis.
Franck Giovanny Toledo Bustamante
Universidad de Santander UDES, Bucaramanga
Facultad de Ciencias, Naturales y Agropecuarias
Programa de Microbiología Industrial
2019
II
DETECCIÓN DE GENES nifH Y phoD EN BACTERIAS ENDÓFITAS Y EPÍFITAS
AISLADAS A PARTIR DE Ricinus communis Y Plukenetia volubilis.
Franck Giovanny Toledo Bustamante
Trabajo de grado para optar al título de Microbiólogo Industrial
Director
Wilfredo Valdivieso Quintero MSc
Codirector
Carlos Augusto Acevedo MSc
Universidad de Santander UDES, Bucaramanga
Facultad de Ciencias, Naturales y Agropecuarias
Programa de Microbiología Industrial
2019
III
V
DEDICATORIA
Dedicado a mi madre Ruth Bustamante quien ha demostrado su apoyo incondicional en mis
decisiones y metas de vida, creer en mí y siempre estar ahí cuando la he necesitado y cuando
no, por acompañarme en mis mejores y peores momentos durante este recorrido, por enseñarme
como ser persona, por ser el amor de mi vida.
A mi padre Frank Toledo quien también estuvo allí cuando lo necesite, por enseñarme cosas
importantes de la vida, brindarme su apoyo y ser padre a pesar del tiempo y la distancia.
Al resto de mi familia, primos, tíos, mi hermosa abuela Lucila, a quienes espero se sientan
muy orgullosos de mis logros.
X
AGRADECIMIENTOS
Agradezco especialmente al director de mi proyecto de grado, el profesor Wilfredo
Valdivieso, por otorgarme el privilegio de llevar a cabo este proyecto, por tener la paciencia y
guiarme en este largo camino, le agradezco por disponer del tiempo y la paciencia para sacar
adelante este proyecto, principalmente agradezco por el conocimiento que me transmitió, su
optimismo y sus impulsos de ánimo, agradezco sus esfuerzos y su decencia, por ser más que un
excelente tutor, ser una excelente persona.
Agradezco a mis hermanos de otras madres “Diego, Sebastián, Fabián y Edgar” por estar con
migo en los momentos en que los necesite y en los que no, su incondicional apoyo a lo largo de
este recorrido universitario.
Agradezco a todos los profesores que en algún momento me brindaron sus conocimientos en
ciencia y en cómo ser persona.
XI
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 15
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................... 18
3. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................ 21
4. MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 24
4.1 Plukenetia volubilis. .................................................................................................. 24
4.2 Ricinus communis. .................................................................................................... 26
4.3 Ricinus communis y Plukenetia volubilis en Colombia .......................................... 28
4.4 Metabolismo y requerimientos para la producción de aceite. .............................. 31
4.5 Factores medio ambientales. .................................................................................... 35
4.6 Factores microbiológicos. ......................................................................................... 36
4.7 Fijación de nitrógeno. ............................................................................................... 38
4.8 Solubilización de fosfatos ......................................................................................... 39
4.9 Pruebas para la identificación de la capacidad fijadora de nitrógeno ................ 41
4.10 Pruebas para la identificación de la capacidad de solubilizar fosfatos ............ 41
4.11 Identificación molecular de genes de nitrogenasa y fosfatasas. ........................ 42
5. MARCO REFERENCIAL .......................................................................................... 44
6. HIPÓTESIS .................................................................................................................. 46
7. OBJETIVOS ................................................................................................................. 47
XII
7.1 Objetivo general ........................................................................................................ 47
7.2 Objetivos específicos ................................................................................................. 47
8. METODOLOGÍA ........................................................................................................ 48
8.1 Selección de microorganismos de referencia.......................................................... 48
8.2 Recopilación de secuencias ...................................................................................... 49
8.3 Identificación de regiones conservadas................................................................... 50
8.4 Diseño y evaluación de oligonucleótidos ................................................................. 50
8.5 Extracción de ADN microorganismos de referencia ............................................. 52
8.6 Estandarización de PCR .......................................................................................... 53
8.7 Amplificación de microorganismos potenciales a fijar nitrógeno y solubilizar
fosfatos con los oligonucleótidos diseñados ........................................................................... 55
8.8 Secuenciación de amplificados ................................................................................ 55
9 RESULTADOS .................................................................................................................... 57
9.1 Selección de microorganismos de referencia.......................................................... 57
9.2 Recopilación de secuencias ...................................................................................... 59
9.3 Identificación de regiones conservadas................................................................... 59
9.4 Diseño y evaluación de oligonucleótidos ................................................................. 63
9.5 Extracción de ADN microorganismos de referencia ............................................. 66
9.6 Estandarización de PCR .......................................................................................... 66
9.7 Amplificación de genes nifH y phoD microorganismos potenciales a fijar
nitrógeno y solubilizar fosfatos con los oligonucleótidos diseñados ................................... 70
XIII
9.8 Secuenciación de amplificados ................................................................................ 76
10 DISCUSIÓN .................................................................................................................. 77
11 CONCLUSIONES ........................................................................................................ 82
12 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ....................................................................... 83
13 ANEXOS ..................................................................................................................... 100
XIV
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Composición química proximal (en base seca) de R. communis y P.
volubilis……………………………………………………………………..
28
Tabla 2. Algunos microorganismos reportados PGPB, mecanismos de acción y
autores.……………………………………………………………………….
38
Tabla 3. Cepas ATCC usadas como microorganismos de referencia y su respectivo
código………………………………………………………………………..
53
Tabla 4 Oligonucleótidos diseñados con sus respectivas secuencias, GC%, TM y
tamaño del amplificado esperado……………………………………………
65
Tabla 5 Validación de los oligonucleótidos diseñados por medio de BLAST………. 66
Tabla 6 Cuantificación de ADN genómico de microorganismos de referencia
mediante el equipo NanoDrop ………………………………………………
67
Tabla 7 Resultados de secuciación………………………………………………….. 77
XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Plukenetia volubilis planta y semillas……………………………………… 26
Figura 2. Ricinus communis, planta y semillas……………………………………….. 28
Figura 3 Principales departamentos y hectáreas cosechadas de Plukenetia volubilis
en Colombia 2017…………………………………………………………
29
Figura 4 Principales departamentos y hectáreas cosechadas de Ricinus communis en
Colombia 2017……………………………………………………………..
30
Figura 5 Principales departamentos y área sembrada en hectáreas de Plukenetia
volubilis en Colombia 2017……………………………………………......
30
Figura 6 Principales departamentos y hectáreas sembradas de Ricinus communis en
Colombia 2017……………………………………………………………..
31
Figura 7 Producción primaria en toneladas y rendimiento agrícola primario en
tonelada sobre hectárea de Plukenetia volubilis en Colombia
2017………………………………………………………………………
31
Figura 8 Producción primaria en toneladas y rendimiento agrícola primario en
tonelada sobre hectárea de Ricinus communis en Colombia 2017…………
62
Figura 9 Ruta metabólica de las plantas para producir Ácido linolenico y Ácido
ricinoleico ω-9………………………….......................................................
35
Figura 10 Alineamiento de las secuencias del grupo 1.1 con el área conservada
seleccionada ……………………………………………………………….
61
Figura 11 Árbol de distancias con las secuencias del grupo 1.1……………………... 62
XII
Figura 12 Alineamiento de todas las secuencias recopiladas para el grupo 1.2……… 62
Figura 13 Árbol de distancias creado a partir del alineamiento del grupo 1.2………… 63
Figura 14 Alineamiento de las secuencias del género Bacillus sp. O Gram positivas… 63
Figura 15 Alineamiento de las secuencias del grupo Gram negativas………………… 64
Figura 16 Electroforesis de curva melting con oligonucleótidos nifH-F y R con cuatro
temperaturas diferentes…………………………………………………..…
68
Figura 17 Electroforesis de amplificados en el gel de agarosa al 2% con diferentes
temperaturas de anillamiento para oligonucleótidos phoDGP-F y R y
phoDGN-F……………………………………………………………….......
69
Figura 18 Electroforesis de amplificados en el gel de agarosa al 2% con diferentes
temperaturas de anillamiento para oligonucleótidos phoDGP-F y R y
phoDGN-F gel 2……………………………………………………………..
70
Figura 19 Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de
microorganismos aislados a partir de Plukenetia volubilis y Ricinus
communis con oligonucleótidos nifH-F y R.………………………………….
72
Figura 20 Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de
microorganismos aislados a partir de Plukenetia volubilis y Ricinus
communis con oligonucleótidos nifH-F y R gel 2…………………………..
72
Figura 21 Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de
microorganismos aislados a partir de Plukenetia volubilis y Ricinus
communis con los oligonucleótidos phoDGN-F y R………………………..
73
XIII
Figura 22 Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de
microorganismos aislados a partir de Plukenetia volubilis y Ricinus
communis con los oligonucleótidos phoDGN-F y R. gel 2…………………
74
Figura 23 Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de
microorganismos aislados a partir de Plukenetia volubilis y Ricinus
communis con los oligonucleótidos phoDGP-F y R………………………..
75
Figura 24 Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de
microorganismos aislados a partir de Plukenetia volubilis y Ricinus
communis con los oligonucleótidos phoDGP-F y R gel 2………………….
76
XII
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Bacterias endófitas y epífitas aisladas a partir de Ricinnus
communis y Plukenetia volubilis…………………………………...
103
Anexo 2. Lista de microrganismo con presencia de phoD según revisión
bibliográfica y respectivos autores que los reportan………………
104
Anexo 3. Lista de microrganismo con presencia de nifH según revisión
bibliográfica y respectivos autores que los reportan………………
105
Anexo 4 Secuencias utilizadas para el diseño de los oligonucleótidos nifH
1.1 (microorganismos y códigos)………………………………….
108
Anexo 5 Microorganismos y códigos del grupo 1.2 phoD………………….. 109
Anexo 6 Microrganismos y códigos del grupo 2.1 nifH…………………….. 110
Anexo 7 Microorganismos y códigos del grupo 2.2 phoD………………….. 111
Anexo 8 Secuencia consenso obtenida a partir del alineamiento de las
secuencias del grupo 1.1……………………………………………
112
Anexo 9 Secuencia consenso obtenida a partir del alineamiento de las
secuencias del grupo 1.2 Gram positivas…………………………..
112
Anexo 10 Secuencia consenso obtenida a partir del alineamiento de las
secuencias del grupo 1.2 Gram negativas…………………………..
114
Anexo 11 Alineamiento de todas las secuencias del grupo 2.1………………. 115
Anexo 12 Alineamiento de las secuencias del grupo 2.1 Gram negativas……. 116
13
RESUMEN
TÍTULO: DETECCIÓN DE GENES nifH Y phoD EN BACTERIAS ENDÓFITAS Y
EPÍFITAS AISLADAS A PARTIR DE Ricinus communis Y Plukenetia volubilis.
AUTOR: FRANCK GIOVANNY TOLEDO BUSTAMANTE
PALABRAS CLAVE: PCR, nifH, PhoD, Plukenetia volubilis, Ricinus communis, PGPB
La necesidad de la sociedad por buscar nuevas fuentes de farmanutrición y fuentes de
combustibles ha fijado su atención en las plantas Plukenetia volubilis y Ricinus communis; dos
plantas oleaginosas que producen semillas ricas en aceites de interés industrial, estas poseen la
característica de crecer y desarrollarse en diversas condiciones medioambientales, esta peculiar
característica puede verse influenciada por los microorganismos que se asocian a ella, quienes
pueden aportar nitrógeno y/o fósforo a las plantas por medio de los ciclos biológicos “fijación de
nitrógeno y solubilización de fosfatos”, para llevar a cabo estos procesos los microorganismos
utilizan las enzimas fosfatasas y nitrogenasas respectivamente, codificadas en el genoma
bacteriano por los genes phoD y nifH. El presente estudio busca identificar el potencial para fijar
nitrógeno y solubilizar fosfatos en bacterias aisladas a partir de Ricinus communis y Plukenetia
volubilis, por medio de la detección de los genes nifH y phoD. Para la detección de los genes se
diseñaron 3 pares de oligonucleótidos puestos a prueba con 32 cepas aisladas a partir de Ricinus
communis y Plukenetia volubilis de las cuales se encontraron 6 microorganismos con
amplificados sugestivos del mismo tamaño de la banda esperada para los oligonucleótidos de
nifH, 2 sugestivos con gen gln y 8 microorganismos con amplificados del mismo tamaño de la
banda esperada para los oligonucleótidos de phoD.
14
ABSTRACT
TITLE: DETECTION OF nifH AND phoD GENES IN ENDOPHYTAL AND EPÍFITAS
BACTERIA ISOLATED FROM Ricinus communis AND Plukenetia volubilis.
AUTHOR: FRANCK GIOVANNY TOLEDO BUSTAMANTE
KEY WORDS: PCR, nifH, PhoD, Plukenetia volubilis, Ricinus communis, nitrogen fixing,
phosphate solubilitation, PGPB, gene.
The need of the society to find new sources of farmnutrition and sources of fuels has focused
its attention in the plants Plukenetia volubilis and Ricinus communis; two oil plants that produce
seeds rich in oils of industrial interest, these two plants have the characteristic of growing and
developing in diverse environmental conditions, this peculiar characteristic can be influenced by
microorganisms that are associated with it, who can contribute nitrogen and/or phosphorus to the
plants through the biological cycles "nitrogen fixation and solubilization of phosphates", to carry
out these processes the microorganisms use the phosphatases and nitrogenous enzymes
respectively, encoded in the bacterial genome by the nifH and phoD genes. The present study
seeks to identify the potential to fix nitrogen and solubilize phosphates in bacteria isolated from
Ricinus communis and Plukenetia volubilis, by means of the detection of the nifH and phoD
genes. For the detection of genes, 3 pairs of oligonucleotides were designed with 32 strains
isolated from Ricinus communis and Plukenetia volubilis, of which 6 microorganisms with
suggestive amplifications of the same size of the expected band were found for the
oligonucleoetides of nifH, 2 suggestive with gln gene and 8 microorganisms with suggestive
amplifications of the same size as the expected band for phoD oligonucleotides.
15
1. INTRODUCCIÓN
Hace unos años atrás se ha incluido en la alimentación las semillas de diferentes
plantas tales como el maní, las nueces, almendras y otras, produciendo un efecto benéfico en el
perfil lipídico sanguíneo de los consumidores debido al alto contenido de ácidos grasos
poliinsaturados (Garmendia, Pando, & Ronceros, 2011). Las semillas de Plukenetia volubilis
tienen un alto contenido en proteínas, tocoferoles y aceite rico en ácidos grasos omega omega-3
y omega-6 (Ruiz, Diaz, Anaya, & Rojas, 2013), razones por las cuales dan un gran potencial de
aplicación en la industria alimenticia y farmacéutica, esto se ve evidenciado en el incremento de
su siembra y exportación del aceite en países como Perú, México, Brasil, Colombia y Chile
(Rodríguez, Villanueva, Glorio, & Baquerizo, 2015).
Por otro lado, los aceites obtenidos de plantas pueden tener aplicaciones diferentes a la
alimentación humana, un ejemplo de esto, es la planta oleaginosa Ricinus communis, cuyas
semillas son materia prima para la producción de biodiesel, combustible ecológico amigable con
el medio ambiente dado que sería una nueva fuente de energía, renovable (Quiróz, Botero, &
Castaño, 2011). Otras aplicaciones industriales de este aceite es la producción de lubricantes,
plásticos, jabones, líquidos hidráulicos, pinturas, colorantes, entre otros (Mazzani & Rodríguez,
2009).
La producción a escala industrial de los aceites provenientes de estas dos plantas, unido al
sostenimiento rentable del cultivo y a la necesidad de una producción limpia y amigable con el
medio ambiente, exige reducir el uso de insumos químicos para la fertilización que pueden
producir pérdidas financieras y agronómicas además de la contaminación a largo plazo de los
16
suelos de cultivo (Rodriguez , 2013), razones por las cuales se han encontrado a los
biofertilizantes como una solución.
Los biofertilizantes son preparados de microorganismos benéficos y pueden estar divididos en
dos grupos: el primer grupo está constituido por aquellos microorganismos capaces de sintetizar
o proveer substancias que promueven el crecimiento vegetal por medio de la fijación de
nitrógeno (como sustancias indólicas) o el fósforo por medio de la solubilización de fosfatos. El
segundo grupo está compuesto por microorganismos capaces de inhibir a organismos patógenos
para la planta por medio del control biológico (Armenta et al., 2010).
Para la fertilización de las plantas los dos macro elementos más críticos son el nitrógeno y
el fósforo, debido a que el nitrógeno es utilizado para la producción de proteínas, ácidos
nucleicos, moléculas de transporte y energéticas entra otras (Mayz, 2004) y el fósforo es
utilizado por las plantas para el almacenamiento y transferencia de energía, además se encuentra
en macromoléculas como fosfolípidos, ácidos nucleicos y otros (Teresa , 2007). El fósforo y el
nitrógeno son dos elementos que pueden ser aportados a la planta por microorganismos capaces
de llevar a cabo la fijación de nitrógeno y solubilización de fosfatos por medio de fosfatasas y
nitrogenasas codificadas en el genoma bacteriano por uno o más genes tales como los genes nifD
y nifK que codifican para una subunidad de la dinitrogenasa y los genes phoA y phoX que
codifican para otras fosfatasas alcalinas.
La detección de estos genes puede indicar el potencial de los microorganismos para producir
estas enzimas y llevar a cabo estos procesos, las enzimas fosfatasa y nitrogenasa son inducibles
por su entorno, debido a esto, y a que solo una pequeña proporción <10% de microorganismos
son cultivables, el potencial de fijar nitrógeno y solubilizar fosfatos en microorganismos no
puede ser evidenciado solo por pruebas bioquímicas, la amplificación de los genes que codifican
17
para las enzimas nitrogenasa (nifH) y fosfatasa (phoD) pueden ser una alternativa para detectar
el potencial.
La detección de microorganismos capaces de fijar nitrógeno y solubilizar fosfatos puede
ser utilizada como una alternativa de biofertilizante para promover el crecimiento de plantas
como Ricinus communis y Plukenetia volubilis, generando una producción de interés industrial
ecológica, amigable con el medio ambiente y rentable.
18
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Ricinus communis y Plukenetia volubilis son plantas objetivo de estudio debido a que las dos
producen semillas ricas en aceites de interés industrial ya que los aceites de (Ricinus communis)
pueden ser utilizados para la producción de biocombustibles, lubricantes, nylon, prótesis entre
otros (Sujatha, Reddy, & Mahasi, 2008). (Plukenetia volubilis) produce semillas ricas en aceites
de uso alimentario y nutraceutico (Maurer, Hatta, Pascual, & Rodriguez, 2012). Estas plantas se
ven poco beneficiadas por la fertilización, poseen la habilidad de adaptarse a diferentes tipos de
ambientes y suelos en donde se debe tener en cuenta el riego ya que la cantidad de aceites
producidos se ve influenciada por el agua (Jiao, Xiang, Li, & Cai, 2012) (Goytia, Gallegos, &
Nuñez, 2011), estas habilidades de adaptación pueden verse influenciadas por microorganismos
que interactúan con las plantas de manera directa o indirecta. (Loredo, Lopez, & Espinosa, 2004)
(Camelo, Vera, y Bonilla, 2011).
Las bacterias presentes en la rizosfera pueden cumplir funciones benéficas, perjudiciales o
neutrales desde el punto de vista del desarrollo y crecimiento de la planta (Schoebitz, 2006), las
bacterias que en algún momento de su ciclo de vida se localizan dentro de la planta se les
conocen como endófitas y epífitas a las que se localizan fuera de la planta, aquellas rizosfericas
capaces de provocar un impacto positivo en el crecimiento y desarrollo de la planta se les conoce
como PGPR (plant growth-promotion rhizobacteria) (Bhattacharyya, 2012) bacterias promotoras
de crecimiento vegetal; las PGPR promueven el crecimiento vegetal a través de; la asistencia en
la adquisición de recursos como el nitrógeno y fósforo, la modulación de los niveles de
hormonas vegetales o la inhibición de organismos patógenos para las plantas en forma de agentes
de biocontrol (Ahemad & Kibret, 2014). Cabe la posibilidad de la utilización de estas PGPR
19
como biofertilizantes para proveer nutrientes a la planta en suelos carentes de estos, además
puede reducir costos en cultivos al disminuir el uso de fertilizantes de origen químico que
pueden ser contaminantes a largo plazo por una alternativa de origen biológico amigable con el
medio ambiente.
El nitrógeno (N) y el fósforo (P), estos dos elementos pueden ser provistos por bacterias a las
plantas, quienes son incapaces de tomarlos de la manera en la que se encuentran naturalmente en
el ambiente o en los suelos.
El nitrógeno es el elemento más crítico en la producción agrícola debido a que ocupa entre el
1 y el 5% del peso seco de las plantas y se encuentra en moléculas como el ADN y proteínas
entre otras (Perdomo , Barbazan, & Duran, 1992 ), además de que estas son incapaces de
obtenerlo de la forma en que se encuentra naturalmente, un grupo de microorganismos conocidos
como diazotrofos son capaces de utilizar este nitrógeno para producir amonios y óxidos por
medio de un proceso conocido como fijación del nitrógeno (Camelo, Vera y Bonilla, 2011). Este
proceso de la fijación de nitrógeno utiliza una enzima llamada nitrogenasa, que pueden incluir en
su estructura un complejo que contiene hierro o molibdeno-hierro. Las nitrogenasas están
codificadas en el genoma bacteriano por una familia de genes denominada nif, de los cuales el
gen nifH ha sido ampliamente reportado (David, Levy, Prescott. Susan J y Grayston, 2014).
El fósforo es el segundo elemento más crítico en las producción agropecuaria debido a que
constituye el 0,2% del peso seco de las plantas y se encuentra en moléculas de gran importancia
como el ADN, moléculas de transporte de electrones y energéticas entre otras, la agroindustria
recurre al uso de fertilizantes fosforados ya que la planta no es capaz de obtener el fósforo desde
fuentes naturales, además del costo de estos fertilizantes, también pueden generar contaminación
a largo plazo ya que algunas de las formas inorgánicas del fósforo adicionados por medio de los
20
fertilizantes tampoco son asimilables por las plantas. Los microorganismos con la capacidad de
solubilizar fosfatos producen enzimas que catalizan la hidrólisis de estéres y anhídridos de ácido
fosfórico brindando fuentes de fósforo asimilables para las plantas. Las fosfatasas pueden ser
codificadas por el gen phoD (Apel, Sola, Rodriguez, y Martin, 2007).
La implementación de técnicas moleculares como la PCR, reduce los tiempos de
identificación del potencial de los microorganismos y permite ampliar los resultados ya que las
técnicas microbiológicas por medio de pruebas bioquímicas requieren aislamiento y selección de
los microorganismos impidiendo tener en cuenta los microorganismos no cultivables que ocupa
entre el 10 y 30% de los reportados como fijadores de nitrógeno o solubilizadores de fosfatos,
adicionando que las pruebas bioquímicas pueden no promover los procesos de fijación de
nitrógeno o solubilización de fosfatos (Cerón & Aristizábal, 2012).
La detección de los genes nifH y phoD en bacterias endófitas y epífitas, hace posible estimar
su potencial para la fijación del nitrógeno y solubilización de fosfatos; lo que aporta información
valiosa para favorecer la producción de las plantas Ricinus communis y Plukenetia volubilis, ya
que por medio de estas bacterias es posible afectar positivamente su crecimiento y desarrollo,
facilitando la disposición de los nutrientes “N y P” adicionados en los fertilizantes para el uso de
las plantas, reduciendo costos al reducir la cantidad de agro insumos necesarios para la
producción de las plantas.
Pregunta de investigación: ¿Los microorganismos endófitos y epífitos aislados a partir de
Ricinus communis y Plukenetia volubilis portan los genes nifH o PhoD??
21
3. JUSTIFICACIÓN
La importancia de las bacterias promotoras de crecimiento vegetal PGPB yace en los
beneficios que pueda brindarle a la planta, los mecanismos de acción de las PGPB pueden
resumirse en tres: i) agentes antagónicos, inhibiendo otros organismos que pueden ser patógenos
para la planta; ii) la producción de sustancias homóogas a hormonas de crecimiento y iii)
facilitándole a la planta la adquisición de macronutrientes (N y P) (Ahemad., 2013). El
implemento de PGPB como agroinsumo biofertilizante proporciona una alternativa de cultivo
reduciendo el uso de agroinsumos de origen químico como pesticidas, hormonas y fuentes
químicas de fósforo (P) y nitrógeno (N), evitando así, residuos contaminantes derivados de estos,
evitando la bioacumulación y disminuyendo los altos costos que representa el uso de
fertilizantes.
El nitrógeno y el fósforo son macronutrientes críticos en los cultivos debido a que las plantas
son incapaces de obtenerlos por su propia cuenta desde las fuentes naturales debido a que no
tienen la capacidad de producir enzimas que catalicen la reacción para separar el Nitrógeno y
fósforo de los otros elementos a los que se encuentra ligado, ante esta problemática se presenta la
solución del uso de PGPB para aportarle N y P a la planta (Camelo, Vera y Bonilla, 2011) las
PGPB aportan estos nutrientes a la planta por medio de los procesos de fijación de nitrógeno y
solubilización de fosfatos, la fijación de nitrógeno es un proceso biológico llevado a cabo por
diazotrofos, quienes reducen el nitrógeno atmosférico (N2) a amonio (NH4), una fuente de
nitrógeno asimilable por las plantas utilizando una enzima especial llamada nitrogenasa.
(Mantilla, Anaya y Oviedo, 2007).
22
La enzima nitrogenasa utilizada por los microorganismos para la fijación de nitrógeno está
compuesta por dos unidades (dinitrogenasa y reductasa de dinitrogenasa) codificadas en el
genoma bacteriano por los genes nif; nifH para Fe- proteína y nifD y nifK para MoFe- proteína
(Robson, Woodly y Jones, 1986), siendo el gen nifH el más estudiado y usado como marcador
hasta el momento (Levy-Booth, Prescott y Grayston, 2014).
La solubilización de fosfatos es un proceso biológico que puede ser llevado a cabo por
bacterias por medio de dos principales mecanismos de acción; la liberación de compuestos de
bajo peso molecular como ácidos orgánicos que actúan sobre compuestos quelando iones
metálicos que se encuentran asociados con fósforo insoluble, haciendo soluble el fósforo de una
manera asimilable para la planta, el segundo mecanismo de acción es la producción de enzimas
fosfatasas y fitasas que por medio de hidrólisis aumentan la disponibilidad de fósforo inorgánico
soluble asimilable por las plantas a partir de materia orgánica (Corrales, Arevalo y Moreno,
2014).
El gen PhoD codifica en el genoma bacteriano para una enzima fosfatasa monomérica, que
hidroliza tanto los fosfomonoestéres como los fosfodiestéres y es activada por el ion Ca2+, es
utilizada por las bacterias para la solubilización de fosfatos. Esta enzima intracelular también es
exportada al medio exterior por la vía de translocación de doble arginina, siendo el gen más
común en fosfatasas (Ragot, Kertesz, & Bunemann, 2015).
La producción de enzimas como nitrogenasas y fosfatasas se estimula por condiciones
específicas como la disponibilidad de materia orgánica y los bajos niveles fósforo y nitrógeno
(Corrales, Arevalo, & Moreno, 2014) (Camelo & Bonilla, 2011) (Cerón & Aristizábal, 2012).
23
El conocimiento de las bacterias con capacidad para fijar nitrógeno o solubilizar fosfatos se
basaba en pruebas y métodos tradicionales que dependían del cultivo de estas y evidenciar estos
procesos por reacciones bioquímicas; El avance y desarrollo tecnológico en técnicas
independientes de los cultivos han proporcionado nuevas herramientas para el estudio de
comunidades microbianas en su hábitat natural; La biología molecular aporta métodos viables
para el estudio del potencial de fijar nitrógeno y solubilizar fosfatos en bacterias como la
reacción en cadena de la polimerasa PCR, una técnica rentable y relativamente fácil que permite
evidenciar la presencia de los genes nifH y phoD en bacterias no cultivables (Ragot, Kertesz y
Bünemann, 2015).
24
4. MARCO TEÓRICO
4.1 Plukenetia volubilis.
La planta Plukeneteia volubilis también conocida como sacha inchi pertenece a la familia de
Euphorbiaceae. Dentro de la familia de las Euphorbiaceas se encuentran alrededor de 7500
especies, entre el género Plukenetia hay 19 especies aceptadas, hallándose 12 especies en
Sudamérica y centro américa y 7 especies en otros continentes pudiendo existir otras especies
aun no conocidas (Ayala, 2016).
Plukeneteia volubilis se encuentra distribuida principalmente desde centro américa hasta
Bolivia, en Perú se ha registrado en la zona amazónica, departamentos de San Martin, Ucayali y
Loreto; En Colombia se encuentra distribuida en diversos lugares de la Orino-Amazonia y en el
pacifico en su estado silvestre, se reporta como cultivo establecido en los departamentos del
Amazonas, Antioquia, Caquetá, Casanare, Cauca, Meta, Putumayo, Valle del Cauca y Vichada
(Ayala, 2016) (Ministerio de agricultura y desarrollo rural 2017).
Plukeneteia volubilis produce semillas con grandes cantidades de aceite (entre 35 y 60%) y
alrededor del 27% de proteínas (en base seca) ricas en cisteína, tirosina, treonina y triptófano
(Ruiz, Diaz, Anaya, & Rojas, 2013) con propiedades Alimentarias y nutraceuticas por el
contenido de ácidos grasos como el omega-3 que protegen de enfermedades cardiovasculares.
Las hojas contienen terpenoides, saponinas, compuestos fenólicos (flavonoides) y otros
componentes responsables de las actividades antioxidantes y antiproliferativas (Lima, et al.,
2013).
25
Descripción: Es una planta trepadora, monoica, decidua, con hojas opuestas y simples, la
lámina foliar es oavado-triangular entre 6 - 13cm de largo, 4 y 10cm de ancho, con base truncada
o cordada; el margen es crenado o finamente aserrado; en la cara adaxial se presenta una
protuberancia glandular en el ápice del pecíolo. La inflorescencia es racemosa, alargada,
monoica (bisexual), y de 5 -18 cm de largo; las flores pistiladas se encuentran solitarias en los
nudos basales, la columna estilar es parcial o totalmente connada, 15 - 30 mm de largo, flores
masculinas subglobosas, numerosas, agrupadas en los nudos distales; estambres 16 - 30, con
filamentos conspicuos, cónicos, 0,5 mm de largo. Las cápsulas son tetra- o pentámeras, glabras,
2,5 - 6 cm de diámetro. Las semillas son lenticulares, comprimidas lateralmente y de color
marrón con manchas irregulares más oscuras, 1,5 - 2 x 0,7 - 0,8 cm (Dostert, 2009).
Apariencia de Plukenetia volubilis y sus semillas: (figura 1)
Figura 1: Plukenetia Boluvilis; a) Planta Fuente: NusHub, b) semilla Fuente: Michael Herman
A B
26
4.2 Ricinus communis.
Comúnmente llamada ricino, tártago o higuerilla, pertenece a la familia de Euphorbiaceae,
Ricinus communis es una especie monotipia que contiene unas 22 especies (Machado, Suárez, &
Alfonso, 2012).
Ricinus communis es de origen tropical y procede del norte de África, donde se conoce hace
más de 6000 años (Cardoso y Severino 2005), aunque es un cultivo exigente, su resistencia a la
sequía y su adaptación a zonas áridas es una de sus principales características (Pereira de
Oliveira et al., 2005).
El aceite producido a partir de sus semillas, presenta gran viscosidad a diferentes
temperaturas y solo se congela a -10°C se ha utilizado para la fabricación de pintura y del barniz,
no obstante se ha encontrado útil para la fabricación de una amplia gama de productos
sofisticados como fibras de nylon, lubricantes para motores a reacción, fluidos hidráulicos,
plásticos, cuero artificial, fabricación de fibra óptica, prótesis de vidrio y chalecos a prueba de
balas, como anticongelante para combustibles y lubricantes utilizados en aviones y cohetes
espaciales (Sujatha, Reddy, & Mahasi, 2008).
Descripción: Planta herbácea alta, a veces algo arbustiva, de color verde claro a azul-grisáceo,
en ocasiones rojiza con un tamaño de hasta 6 metros de alto, tallo engrosado ramificado con
hojas de lámina casi orbicular de 10 a 60cm de diámetro, profundamente palmatilobada, las
divisiones ovado-oblongas a lanceoladas, agudas o acuminadas, borde irregularmente dentado-
glanduloso; pecíolo tan largo o más largo que la lámina: glándulas entre la lámina y el pecíolo,
Las flores masculinas con un perianto de 6 a 12 mm de largo, el de las flores femeninas de 4 a
8 mm de largo, ovario densamente cubierto por largos tubérculos blandos.
27
El fruto es una cápsula subglobosa, de 1.5 a 2.5 cm de largo, con espinas cortas y gruesas
(equinado); semillas elipsoides, algo aplanadas, de 10 a 17 mm de largo, lisas, brillantes,
frecuentemente jaspeadas de café y gris, conspicuamente carunculadas (Rzedowski y Rzedowski,
2001).
Apariencia de Ricinus communis y sus semillas:
Figura 2: Ricinus communis a) planta Fuente: Alvesgaspar b) semillas Fuente: Schnobby
La comparación en composición química proximal de las semillas de Ricinus communis y
Plukenetia volubilis:
Tabla 1: Composición química proximal (en base seca) de R. communis y P. volubilis. (Ruiz, Diaz, Anaya, &
Rojas, 2013) (Vasco-Leal, et al., 2017).
Plukenetia volubilis Ricinus communis
Aceite (%) 50 – 55 40 - 50
Proteína (%) 23 – 28 12 - 16
Fibra (%) 5 – 8 12 - 21
A B
28
Ceniza (%) 2 – 4 2 – 4
Carbohidrato (%) 9 – 11 12 – 30
4.3 Ricinus communis y Plukenetia volubilis en Colombia
El cultivo de estas especies es potencialmente nuevo, con un valor económico prometedor en
el cual no se ha dado el enfoque necesario (Krivankova, 2007), las hectáreas cosechadas y
sembradas (Figura 3, 4, 5, 6,7 y 8) para el año 2017:
Figura 3. Principales departamentos y hectáreas cosechadas de Plukenetia volubilis en Colombia 2017 Fuente:
MADR, Evaluaciones Agropecuarias Municipales - EVA. Fecha de actualización: Diciembre, 2017. Ministerio de
agricultura y desarrollo rural
29
Figura 4: Principales departamentos y hectáreas cosechadas de Ricinus communis en Colombia 2017 Fuente:
MADR, Evaluaciones Agropecuarias Municipales - EVA. Fecha de actualización: Diciembre, 2017. Ministerio de
agricultura y desarrollo rural
Figura 5: Principales departamentos y área sembrada en hectáreas de Plukenetia volubilis en Colombia 2017
Fuente: MADR, Evaluaciones Agropecuarias Municipales - EVA. Fecha de actualización: Diciembre, 2017.
Ministerio de agricultura y desarrollo rural
30
Figura 6: Principales departamentos y hectáreas sembradas de Ricinus communis en Colombia 2017 Fuente:
MADR, Evaluaciones Agropecuarias Municipales - EVA. Fecha de actualización: Diciembre, 2017. Ministerio de
agricultura y desarrollo rural
Figura 7. Producción primaria en toneladas y rendimiento agrícola primario en tonelada sobre hectárea de
Plukenetia volubilis en Colombia 2017 Fuente: MADR, Evaluaciones Agropecuarias Municipales - EVA. Fecha de
actualización: Diciembre, 2017. Ministerio de agricultura y desarrollo rural
31
Figura 8: Producción primaria en toneladas y rendimiento agrícola primario en tonelada sobre hectárea de
Ricinus communis en Colombia 2017 Fuente: MADR, Evaluaciones Agropecuarias Municipales - EVA. Fecha de
actualización: Diciembre, 2017. Ministerio de agricultura y desarrollo rural
El costo de las semillas de sacha inchi según su nivel de transformación para el 2012:
Almendra negra 1,29$/Kg. Almendra blanca 2,59$/kg. Aceite de granel 25,89$/L. Torta de sacha
inchi 0,49$/Kg. (Agrolincolsa S.A 2012).
El sacha inchi se comercializa como aceite (42,34%), polvo (12,73%), snacks (5,37%),
tostado (2,85%), cápsulas (1,79%), cosmético (0,10%). Los principales mercados de destino son:
Canadá (31,78%), Estados Unidos (23,33 %), Japón (14,73%), España (6,97%), Francia (6,23%),
México (4,59%), Bélgica (3.44%) y Australia (2,66%). (Flores y lock 2013).
4.4 Metabolismo y requerimientos para la producción de aceite.
En los procesos metabólicos y para la producción de semillas el nitrógeno y fósforo son
primordiales ya que hacen parte de los macronutrientes, conforman el 1 – 5% del peso seco de
las plantas y estas son incapaces de producir las enzimas necesarias para tomar estos nutrientes a
partir de sus fuentes naturales.
32
El nitrógeno forma parte de los aminoácidos, enzimas, coenzimas, vitaminas, ácidos
nucleicos, clorofila, reguladores de crecimiento, nucleótidos y alcaloides, por lo tanto se
encuentra presente en la mayoría de las reacciones fisiológicas, de las células vegetales,
incluyendo las rutas metabólicas para la producción de aceite y cumple funciones osmóticas en
la reducción del potencial hídrico de la vacuola en el proceso de osmoregulacion gracias al
efecto del ion nitrato y otras formas reducidas del N (Navarro, 2004) (Jarma, Combatt, & Cleves,
2010).
El fósforo se encuentra en moléculas de gran importancia como ácidos nucleicos, enzimas,
moléculas de transporte de electrones, moléculas energéticas, glucofosfatos y otros compuestos
que cumplen funciones esenciales en procesos metabólicos como la fotosíntesis, transferencia de
energía y síntesis y degradación de otros compuestos (Cerón & Aristizábal, 2012) (Jarma,
Combatt, & Cleves, 2010).
Aunque estas plantas se ven poco beneficiadas por la fertilización, poseen la habilidad de
adaptarse a diferentes tipos de ambientes y suelos en donde se debe tener en cuenta el riego ya
que la cantidad de aceites producidos se ve influenciada por el agua (Jiao, 2012), Goytia en,
(2011) describe que estas habilidades de adaptación se puede ver influenciadas por
microorganismos que interactúan con estas de manera directa o indirecta. (Loredo, López y
Espinosa, 2004) (Camelo, Vera, y Bonilla, 2011).
En el contenido de las semillas de Plukenetia volubilis se encuentra 45 – 55% de aceite, 24 –
29% de proteínas, 10 – 12% en carbohidratos 6 – 7% en fibra y 2 – 4% en cenizas (Ruiz 2013).
La composición química próxima (en base seca) del aceite de Plukenetia volubilis es de un
47 – 54% de ácidos grasos, valores elevados en comparación con las semillas de otras plantas
33
oleaginosas de consumo humano como el girasol (48%) maní (45%) y soya (19%). (Rangel,
2012) (Flores y Lock 2013) (Ruiz, 2013).
Para la producción de aceites en estas plantas, el ácido palmitoleico es el precursor de otros
ácidos grasos, se forma a partir del mevalonato; el mevalonato está formado por la unión del
acetil – CoA + Malonil – CoA; Por medio de una elongación posterior del ácido palmitico se
obtiene ácido esteárico, que por medio de desaturaciones llega a formar el ácido linoleico y una
desaturación posterior para formar el ácido linolenico (Figura 9).
El ácido linoleico conforma un 33 - 36% de los aceites de las semillas de Plukenetia volubilis
y el ácido linolenico un 45 - 50%, (Ruiz, Diaz, Anaya, & Rojas, 2013) (Rangel, 2012). Estos
ácidos grasos pertenecen a los ácidos grasos esenciales para el ser humano ya que son necesarios
pero el cuerpo es incapaz de sintetizarlos.
Las semillas de Ricinus communis están compuestas de un 45 – 55% de aceite (Pita &
Martínez, 2004), el aceite de las semillas está conformado por un 90 – 95% por ácido ricinoleico
el cual se encuentra formando parte del triglicerido trirricinoleina, el ácido ricinoleico posee un
grupo hidroxilo en su carbono 12 que lo diferencia del ácido oleico y le confiere su alta
viscosidad (Benavides, Benjumea, & Pashova, 2007). Debido a su naturaleza química el aceite
de las semillas de Ricinus communis es altamente viscoso, miscible en alcohol y ácido acético y
posee un bajo punto de solidificación.
34
Figura 9. Ruta metabólica de las plantas para producir Ácido linolenico y Ácido ricinoleico ω-9, Fuente:
autor.
35
4.5 Factores medio ambientales.
Plukenetia volubilis es una planta capaz de adaptarse en un gran intervalo de altitud, desde los
100 hasta 2000 msnm, aunque su rendimiento en producción de semillas es óptimo entre 100 y
1500 msnm y las mejores semillas con respecto a su tamaño (>12mm) fueron registrados a una
altitud de 600msnm (Ayala, 2016).
También es capaz de adaptarse a un amplio rango de temperaturas, presentando buen
crecimiento, desarrollo y producción desde 10 hasta 35°C, si se superan los 36°C la planta se ve
afectada perdiendo sus flores y frutos (Calram, 2007).
Con respecto a las características del suelo, la planta presenta su mejor desarrollo y
producción en suelos franco-arcillosos a franco, con un rango de pH de 5,5 a 7,5. La planta
presenta tolerancia a suelos ácidos pero presenta susceptibilidad a suelos muy alcalinos (>8).
También requiere pedregosidad de media a baja, fertilidad y contenido de materia orgánica de
media a alta. (Andrade y Calderón 2009).
Ricinus communis presenta un desarrollo y crecimiento óptimo en un rango de altura entre
los 300 y 1500 msnm pero es capaz de adaptarse a alturas de hasta 2300 msnm (Córdoba 2012).
El rango de temperatura para un óptimo crecimiento, desarrollo y producción de semillas esta
entre los 26 y 41°C, temperaturas inferiores a 14°C reducen la capacidad de la planta para
producir frutos y temperaturas superiores a los 41°C provocan en la planta aborto de flores,
reversión sexual y disminuyen el contenido de aceite y la cantidad de semillas producidas
(Córdoba, 2012).
Su nivel de adaptación a diversos suelos es bastante alto exceptuando suelos con alto
contenido de arcilla y aluminio, la limitación del drenaje afecta directamente el crecimiento y
36
desarrollo de la planta ya que en su fase de inicio de etapa vegetativa tiene un alto requerimiento
de agua pero presenta susceptibilidad a excesos de humedad, presenta adaptación a fotoperiodos
no mínimos de 9 horas de luz y presenta óptima producción de aceite con fotoperiodos de 12
horas de luz o más. (Falasca et al., 2012).
4.6 Factores microbiológicos.
Las plantas pueden proveer excelentes hábitats para los microorganismos; La rizosfera es la
zona en donde interactúan las raíces de la planta y los microorganismos, interactuando con las
raíces de las plantas conviven distintos géneros bacterianos, esta interacción puede ser benéfica,
neutra o perjudicial desde el punto de vista del crecimiento y desarrollo de la planta, aquellas
bacterias que tienen un impacto benéfico en el crecimiento y desarrollo de la planta son
conocidas como bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPB) (Schoebitz, 2006).
Las PGPB pueden promover el crecimiento vegetal por medio de tres mecanismos; pudiendo
aumentar la disponibilidad de nutrientes, transformándolos en formas asimilables por las plantas,
produciendo sustancias homóogas a las fitohormonas (SHP) o funcionando como una barrera
inhibitoria de agentes patógenos (Rives, Acebo, & Hernández, 2007).
Las PGPB también pueden ingresar al interior de las raíces y establecerse allí como
población, estas bacterias son denominadas como endófitas y las PGPB que permanecen todo el
ciclo de vida de la planta en la rizosfera son denominadas como epífitas.
Guzman et al. (2012) por medio de su estudio en selección de PGPB en cultivos de algodón,
encontró 5 cepas con gran eficiencia en la promoción del crecimiento de la planta in vitro para
ser evaluadas como futuro principio activo en inoculantes para el algodón.
37
Por medio de su estudio, Sanchez et al. (Sanchez, Gomez, Garrido, & Bonilla, 2012)
describen el incremento significativo en biomasa, desarrollo de la planta y producción de frutos
en tomate gracias a cepas de Pseudomonas putida y Enterobacter sp. demostrando capacidad en
solubilizar fosfatos.
El estudio realizado por Criollo et al. (2012) describe el efecto benéfico de las PGPB en
Pennisetum clandestinum, resaltando el efecto de Stenotrophomona ssp. y Pseudomona ssp.
Como fijadoras de nitrógeno y productoras de sustancias indolicas con efectos relevantes en la
producción de biomasa.
Algunas bacterias obtenidas a partir de rizosfera de suelo volcánico demostraron ser capaces
de fijar nitrógeno y promover el crecimiento de la zona aérea y radical de Lolium perenne,
además demostraron capacidad de producir compuestos indolicos y efecto antagonista hacia el
hongo fitopatógeno Monilia sp. (Schoebitz, 2006).
Algunos microorganismos reportados como promotores de crecimiento vegetal se muestran
en la siguiente tabla:
Tabla 2. Algunos microorganismos reportados como promotores de crecimiento vegetal. Nombre del
microorganismo, Mecanismo de acción (Fijación de nitrógeno, solubilización de fosfato y producción de sustancias
homóogas a fitohormonas SHP).
Microorganismo Mecanismo PGPB Referencia
Azotobacter sp. Fijación de nitrógeno, SHP Guzmán 2012
Azospirillum sp. Fijación de nitrógeno, SHP Guzmán 2012, Schoebitz
2006
Enterobacter sp. Solubilización de fosfatos Sánchez 2012
Enterobacter sp. Fijación de nitrógeno y
SHP
Schoebitz 2006
38
Pseudomonas sp. Solubilización de fosfatos,
SHP, fijación de nitrógeno
Sánchez 2012, Criollo 2012
Bacillus sp. Solubilización de fosfatos,
SHP
Sánchez 2012, Criollo 2012
Gluconacetobacter sp. SHP Sánchez 2012
Stenotrophomona sp. Solubilización de fosfatos,
SHP, fijación de nitrógeno
Criollo 2012
Mycobacterium sp. Solubilización de fosfatos,
fijación de nitrógeno
Criollo 2012
Klebsiella sp. Fijación de nitrógeno Schoebitz 2006
4.7 Fijación de nitrógeno.
La fijación de nitrógeno es un proceso realizado por microorganismos diazotrofos, quienes
utilizan el nitrógeno atmosférico para producir amonios y óxidos (Camelo, Vera y Bonilla,
2011).
El nitrógeno ocupa un porcentaje entre el 1 y el 5% en peso seco de la planta, el requerimiento
de nitrógeno en la planta varía según el desarrollo de la planta, en el inicio del desarrollo de la
planta el requerimiento es escaso, cuando la planta llega al periodo de activo crecimiento ocurre
una etapa de máxima absorción de nitrógeno y por último la adsorción del nitrógeno se reduce
(Perdomo , Barbazan, & Duran, 1992 ).
En la atmosfera el Nitrógeno ocupa aproximadamente el 80% en forma N≡N siendo
imposible de ser usado por la mayoría de organismos debido al triple enlace entre estas dos
moléculas, un grupo de microorganismos es capaz de utilizar este N2 por un proceso de
reducción (Kneip, 2007).
Las bacterias intervienen en el ciclo del nitrógeno por medio de fijación: Proceso en el que se
reduce el N2 al NH3; Nitrificación: es la oxidación del NH3 a NO2 y posteriormente a NO3.
39
Desnitrificación: es el proceso invertido de la nitrificación, es decir de NO3 a NH3 La fijación del
nitrógeno es de gran interés ya que provee un nitrógeno que las plantas y otros organismos
puedan utilizar partiendo de un nitrógeno inerte (N2) (Halbleib & Ludden, 2000).
Reacción química de fijación del nitrógeno llevada a cabo por la nitrogenasa: N2 + 10H+
8e- + nMgATP →2NH4+ H2 + nMgADP + nPi (n ≥16).
La dinitrogenasa es un complejo enzimático que está compuesto por la subunidad
nitrogenasa reductasa o nitrogenasa 1 la cual es una proteína que contiene hierro por esto
llamada proteína Fe que se asocia a la dinitrogenasa o nitrogenasa 2 la cual contiene molibdeno y
hierro por esto llamada proteína MoFe con la intervención también de una proteína llamada
ferredoxina (Gómez, 2013).
La dinitrogenasa está codificada en el genoma bacteriano por una familia de genes llamada nif
en los cuales el gen nifH ha sido altamente conservado a través de la evolución y ha
proporcionado una extensa base de datos de secuencias en diversos entornos terrestres y marinos
(Zehr, Jenkins, Short, & Steward, 2003).
Hoy en día se pueden encontrar diversos productos tales como el Custombio N2 que
contiene bacterias de Paenibacillus polymyxa el cual es capaz de producir enzimas nitrogenasa,
por lo tanto fija nitrógeno y es capaz de inhibir microorganismos fitopatógenos.
4.8 Solubilización de fosfatos
El fósforo es el segundo elemento más crítico en la producción agrícola ya que constituye
entre un 0,2 y 0,5% de la planta, según la planta y su ciclo de vida (Fernández & Rodriguez,
2005).
40
Este elemento se encuentra naturalmente en apatitas y otros depósitos de donde es liberado
por medio de meteorización, lixiviación, erosión y extracción industrial, parte de este fósforo es
absorbido por plantas y microorganismos que hacen parte del ciclo finalizando su incorporación
en suelos en forma de fosfatos insolubles de Ca2+, Fe2+, Mg2+ y Al3+ dependiendo del pH del
suelo (Ceron, 2012). Las plantas son incapaces de tomar el P en estas formas inorgánicas ya que
absorben el P casi exclusivamente en sus formas HPO4 y H2PO4.
La disponibilidad del P para las plantas en sus formas orgánicas solubles es brindada
principalmente por microorganismos solubilizadores de fosfatos y por la adición de fertilizantes
en la agricultura; Los microorganismos solubilizadores de fosfato constituyen hasta un 40% de la
población microbiana en la rizosfera.
La solubilización de fosfatos está relacionada con la producción y liberación de ácidos
orgánicos, estos ácidos orgánicos de bajo peso molecular como el ácido butírico, oxálico,
succínico, málico, acético, láctico, cítrico entre otros actúan quelando los iones metálicos de los
fosfatos inorgánicos insolubles transformándolo en fosfatos solubles asimilables para las plantas;
Muchos de estos ácidos son producidos principalmente por la ruta metabólica de la glucosa.
Reacción química de solubilización de fosfatos por medio de ácidos orgánicos: Ca3 (PO4) +
C2O4H2 + 2CaHPO4 + Ca2O4 (Ahemad & Kibret, 2014).
Algunas bacterias producen fosfatasas que son utilizadas para la mineralización por medio de
hidrólisis de estéres orgánicos de fósforo que forman parte de componentes de alto peso
molecular como el ADN o ARN (Fernández y Rodriguez, 2005).
Reacción química de las fosfatasas: R (PO4) + H2O + R-OH + (HPO4) (Henao, 2008).
41
En las bacterias se puede encontrar una de las fosfatasas alcalinas codificada por el gen phoD
expresado por el regulón pho (Corrales, Arévalo , & Moreno, 2014). La importancia de las
enzimas fosfatasas alcalinas radica en brindar la disponibilidad del fósforo a partir de moléculas
orgánicas, permitiendo el uso de materia orgánica en la agricultura para sustituir los agros
insumos de origen químico.
4.9 Pruebas para la identificación de la capacidad fijadora de nitrógeno
Para determinar la capacidad fijadora de nitrógeno en microorganismos se recurre
habitualmente a pruebas bioquímicas basadas en medios de cultivo (Ashby, RMR, BURK, LGI)
que le proveen al microorganismo los sustratos necesarios para su desarrollo exceptuando la
fuente de nitrógeno, por lo tanto solo los microorganismos capaces de fijar el nitrógeno
atmosférico tendrán un normal desarrollo en el medio (Guzmán, Obando, Rivera, & Bonilla ,
2012). También se puede utilizar un método cuantitativo indirecto de valoración de los iones
amonio como la técnica colorimétrica de Berthelot (Fenol-hipoclorito) (Lara, Villalba , &
Oviedo, 2007).
4.10 Pruebas para la identificación de la capacidad de solubilizar fosfatos
Las determinaciones cualitativas para observar la capacidad de solubilizar fosfatos en un
microorganismo se suelen basar en pruebas bioquímicas, donde se inocula el microorganismo en
un medio solido con una fuente de fósforo de origen orgánico o inorgánico tales como; los
medios de cultivo agar PVK diseñado por Pykovskaya en 1948, agar Sperber y el NBRIP
(National Botanical Research Institute´s Phosphate growth médium) desarrollado por Nautiyal en
1999, los cuales evidencian la capacidad solubilizadora de fosfatos por la presencia de un halo
claro alrededor de la biomasa microbiana (Scattareggia, 2016) (Alejo, Marquez, Gonzáles, & De
la Rivadela, 2016) (Tejera, Heydrich, & Rojas, 2013). Sin embargo, autores como (Corrales,
42
Arévalo , & Moreno, 2014) (Hernández, Garrión , & Heredia, 2011) mencionan que la ausencia
de un halo en el medio de cultivo no necesariamente indica que el microorganismo sea incapaz
de solubilizar fosfatos sino que el medio es insensible para detectar la forma en la que el
microorganismo solubiliza el fosfato por lo que es necesario recurrir a medios líquidos o pruebas
cuantitativas como el Mo-Blue.
Los microorganismos solubilizan fosfatos por medio de producción de ácidos extracelulares,
producción de enzimas fitasas y producción de enzimas fosfatasas; Las enzimas fitasas y
fosfatasas suelen ser inducibles por el entorno del microorganismo; la ausencia de fósforo
soluble y condiciones específicas como disponibilidad de materia orgánica en su entorno
(Corrales, Arévalo , & Moreno, 2014), por esta razón y porque solo un pequeño porcentaje de
bacterias que se encuentran en el suelo son cultivables in vitro se puede concluir que para
determinar el potencial de solubilizar fosfatos en bacterias asociadas a plantas es necesario
recurrir a pruebas moleculares.
4.11 Identificación molecular de genes de nitrogenasa y fosfatasas.
La identificación molecular del potencial en microorganismos para fijar nitrógeno y
solubilizar fosfatos consiste en la detección de los genes que estos microorganismos utilizan
estos procesos, el gen nifH codifica en el genoma bacteriano para la enzima nitrogenasa, la cual
es encargada de llevar a cabo el proceso de fijación de nitrógeno en diazotrofos. El gen phoD
codifica en el genoma bacteriano para una enzima fosfatasa alcalina, esta enzima es utilizada por
diversos microorganismos para solubilizar el fósforo a partir de fuentes orgánicas.
43
A partir de bases de datos de libre acceso como NCBI (National center of biotechnology
information) o DDBJ (Data bank of Japan) se pueden recopilar secuencias de los genes de interés
con el fin de diseñar oligonucleótidos o cebadores.
La principal técnica utilizada para la identificación molecular es la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), técnica que determinara la presencia o ausencia de los genes de interés en el
genoma bacteriano al producir grandes cantidades del fragmento de ADN delimitado por los
oligonucleótidos o cebadores diseñados previamente, los oligonucleótidos o cebadores definen el
inicio y el final de la secuencia de ADN que se desea replicar, por lo tanto, se podrá evidenciar
cualitativamente la presencia o ausencia de la amplificación del fragmento de ADN de interés
por medio de la técnica electroforesis.
44
5. MARCO REFERENCIAL
La implementación de microorganismos promotores de crecimiento vegetal PGPB en
cultivos de interés agronómico pueden aumentar la disponibilidad de nutrientes como el
nitrógeno, fósforo y otros minerales aumentando la biomasa y producción vegetal (Criollo,
Obando, Sanchez, & Bonilla , 2012). Los autores Sánchez, Pérez y David en (2016), encontraron
aumentos de 64 y 68% en peso seco de la parte aérea de Pennisetum clandestinum al usar
bacterias promotoras de crecimiento vegetal (B. subtilis y B. amyloliquefaciens) solubilizadoras
de fosfatos y con capacidad de producir sustancias indolicas, cabe resaltar que las bacterias
evaluadas en este experimento soportan concentraciones de NaCl de 200mM, lo que
posiblemente permitió una actividad de promoción de crecimiento reflejada en el peso seco de la
parte aérea y radicular de la planta aún en condiciones adversas para la planta.
Los microorganismos promotores de crecimiento vegetal pueden potenciar el crecimiento
vegetal en condiciones adversas para la planta, Ezaka et al. (2018) encontraron que las bacterias
PGPB P. aeruginosa y B. cereus, tienen gran habilidad para degradar glyfosato en diferentes
concentraciones utilizándolo como fuente de carbono y fósforo. Pazos et al. (2018) encontro
bacterias altamente tolerantes a la escacez de agua capaces de mantener su capacidad de
adherencia, capacidad de colonizar la planta y promover el crecimiento de estas aun en
condiciones adversas de sequía en semillas de maíz.
Algunas enzimas especializadas para procesos biológicos relacionados con la promocion del
crecimiento vegetal como nitrogenasas y fosfatasas producidas por microorganismos son
inducibles, esto quiere decir que dependiendo de las características del ambiente, como la
45
carencia o presencia de un substrato, el microorganismo produce o no la enzima (Corrales,
Arévalo , & Moreno, 2014), autores como Emmyrafedziawati & Stella (2018) concluyen que la
determinacion del gen nifH en ciertas especies no se relaciona con los rendimientos de la
actividad nitrogenasa, a través de sus resultados encontraron dos cepas con potencial para para
ser utilizadas como inoculantes en biofertilizantes por su capacidad de fijar nitrogeno al
identificar molecularmente el gen nifH.
El gen de la fosfatasa alcalina phoD que se encuentra en algunos microorganismos puede
proporcionar informacion importante acerca de la produccion de fosfatasas alcalinas en el suelo
(Fraser, Lynch, Entz, & Dunfield, 2015), 16 filos fueron evidenciados con la presencia del gen
phoD en los cuales Actinobacteria, Cyanobacteria, Deinococcus-Thermus, Firmicutes,
Gemmatimonadetes, Planctomycetes y Proteobacteria se presentaron como dominantes a través
del trabajo de Ragot Kertesz & Bunemann (2015) (Ragot, Kertesz, & Bunemann, 2015);
entender la abundancia de la diversidad de los organismos que albergan genes de fosfatasa y la
importancia que tiene en el ciclo de fósforo es esencial para entender el potencial que este puede
representar.
46
6. HIPÓTESIS
Hipótesis de investigación: La hipótesis planteada, en esta investigación postula "bacterias
endófitas y epífitas aisladas a partir de Ricinus communis y Plukenetia volubilis poseen el
potencial de promover el crecimiento vegetal por medio de la fijación del nitrógeno y
solubilización de fosfatos.
Hipótesis nula: bacterias endófitas y epífitas aisladas a partir de Ricinus communis y
Plukenetia volubilis no poseen el potencial de promover el crecimiento vegetal al no presentar la
presencia de los genes nifH y/o phoD.
.
47
7. OBJETIVOS
7.1 Objetivo general
Identificar la presencia de los genes nifH y phoD en bacterias endófitas y epífitas
asociadas a las plantas Ricinus communis y Plukenetia volubilis.
7.2 Objetivos específicos
Adquirir secuencias de ADN para los genes nifH y phoD reportadas en las bases de
datos de libre acceso e identificar en ellos la presencia de regiones conservadas
Diseñar y evaluar ““in silico”” oligonucleótidos potenciales para la amplificación
de los genes nifH y phoD en bacterias asociadas a Ricinus communis y Plukenetia
volubilis.
Identificar la presencia de los genes nifH y phoD en aislados endófitos y epífitos de
Ricinus communis y Plukenetia volubilis.
48
8. METODOLOGÍA
8.1 Selección de microorganismos de referencia
Teniendo en cuenta la amplia distribución taxonómica de los genes nifH y phoD, se
seleccionaron dos grupos de microorganismos para el diseño de los primers. El primer grupo (1)
se conformó por los microorganismos endófitos y epífitos con mayor capacidad de promover el
crecimiento vegetal asociados a las plantas Plukenetia volubilis y Ricinus communis obtenidos
del proyecto: (AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS Y
EPÍFITOS CON POTENCIAL BIOFERTILIZANTE ASOCIADOS A Higuerilla (Ricinus
communis Linneo) y Sacha inchi (Plukenetia volúbilis Linneo) correspondientes a los géneros
(Bacillus sp., Serratia sp., Enterobacter sp., Klebsiella sp. Y Pseudomonas sp.)
El segundo (2) grupo está compuesto por una variedad de microorganismos seleccionados a
partir de una revisión bibliográfica en donde se tuvieron en cuenta artículos científicos
experimentales y de revisión utilizando como criterios de búsqueda las palabras: nifH, PhoD,
bacterias, suelos, plantas, bacterias promover de crecimiento vegetal PGPB, se tuvieron en
cuenta artículos entre los años 1989 y 2019 que reportaran por nombres bacterias con la
presencia de alguno de los genes de interés. Los datos obtenidos fueron organizados teniendo en
cuenta las bacterias con mayor número de citaciones de artículos (NC). Se complementó la
revisión con la búsqueda de secuencias de genes anotadas como phoD y / o asociadas con
COG3540 (Cluster de grupos ortólogos; http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/COG/), que corresponde a la
fosfatasa alcalina (Ragota, Kertesz y Bünemann, 2015).
49
8.2 Recopilación de secuencias
Para las secuencias de nifH se utilizó un margen de tiempo entre los meses de septiembre y
octubre del año 2017 y para los genes phoD febrero y marzo del 2019. Se llevó a cabo una
búsqueda de secuencias en la base de datos de “nucleótidos” de la biblioteca de libre acceso
NCBI National Center for biotecnology information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando
como criterio de búsqueda el nombre (especie y/o género) de cada microorganismo seleccionado
previamente (Anexo 2 y 3) y el nombre del gen; Posteriormente, se descargó en formato FASTA
la secuencia del gen (nifH o phoD) a partir de genomas completos, secuencias shotgun del
genoma completo, secuencias genómicas, clonaciones en plásmidos y/o cds parciales excluyendo
las secuencias negativas (3’ – 5’) y secuencias con un tamaño menor a 250 pb; Dependiendo de
la oportunidad, se recolecto al menos una secuencia del gen de cada microorganismo y máximo
4, Las secuencias recopiladas fueron separadas en 4 grupos:
Grupo Subgrupo Descripción
1
1.1 Secuencias del gen nifH obtenidas a partir de los
géneros Enterobacter sp., Klebsiella sp., Bacillus sp.,
Pseudomonas sp., y Serratia sp.
1.2 Secuencias del gen phoD obtenidas a partir de los
géneros Enterobacter sp., Klebsiella sp., Bacillus sp.,
Pseudomonas sp., y Serratia sp.
2
2.1 Secuencias del gen nifH recopiladas a partir de
microorganismos seleccionados por medio de una
revisión bibliográfica.
2.2 Secuencias del gen phoD recopiladas a partir de
microorganismos seleccionados por medio de una
revisión bibliográfica.
50
8.3 Identificación de regiones conservadas
Se llevó a cabo un alineamiento local con las secuencias de cada subgrupo seleccionado (1.1,
1.2, 2.1 y 2.2) utilizando el software de libre acceso CLC sequence viewer 8
(www.qiagenbioinformatics.com) usando un algoritmo de alineación progresivo, utilizando los
valores por defecto ofrecidos por el programa; una vez alineadas las secuencias, se llevó a cabo
la búsqueda de regiones conservadas teniendo en cuenta el mayor porcentaje de conservación y
la ausencia de gaps. Las regiones seleccionadas para cada gen fueron extraídas para obtener una
secuencia consenso que representa los nucleótidos que se encuentran con mayor frecuencia en
cada posición de la secuencia. Dependiendo de la homogeneidad de las secuencias conservadas,
se utilizó la opción automatizada del software para obtener una secuencia consenso, en caso de
encontrar una alta heterogeneidad, se recurrió a crear árboles de distancia creados con el
software CLC sequence viewer, el cual utiliza el método “neighbor joining” y el modelo medida
de distancia de nucleótidos “jukes-cantor”; Los árboles de distancia fueron creados con análisis
de 100 réplicas.
8.4 Diseño y evaluación de oligonucleótidos
Los primers del grupo 1, subgrupos 1.1 y 1.2 fueron diseñados a partir de las secuencias
consenso obtenidas anteriormente. Luego de la obtención de las secuencias consenso, se
revisaron manualmente las letras del código degenerado que se encontraban presentes en las
secuencias consenso para obtener primers más específicos; Para el diseño de estos, se utilizó el
software de libre acceso Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-
bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Los parámetros utilizados fueron los estándares y
51
recomendados por el software; tamaño entre 18 y 20 pares de bases, rango de temperatura de
melting entre 57 y 63°C y porcentaje de guaninas y citosinas entre 20 y 80%. El diseño de los
primers del grupo 2, subgrupos 2.1 y 2.2 fue llevado a cabo manualmente, identificando
secuencias conservadas teniendo en cuenta que no había una secuencia consenso de un tamaño
suficiente para utilizar el software de diseño de primers; Una vez seleccionadas las secuencias
de los primers, fueron sintetizadas por la empresa Macrogen (Empresa pública biotecnológica de
Corea del sur).
La capacidad de reconocimiento de los oligonucleótidos fue evaluada “in silico” a través de
la herramienta de libre acceso Basic Local Alignment Search Tool
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) que utiliza alineamientos de secuencias de tipo local
para encontrar regiones de similitud con las secuencias biológicas pertenecientes a la base de
datos National Center for Biotecnology Information NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), El
algoritmo heurístico de BLAST encuentra las secuencias que tienen mayor similitud a la
secuencia de los oligonucleótidos; Se seleccionó en el conjunto de búsqueda “otros”, la base de
datos “nucleótidos” y como organismo “bacteria”; Como resultados se tuvieron en cuenta el
porcentaje de cubrimiento y el porcentaje de identidad; la formación de dímeros a partir de los
oligonucleótidos fue evaluada por medio del software de libre acceso Thermo oligo analyzer
(https://www.thermofisher.com/co/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-
biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-
web-tools/multiple-primer-analyzer.html).
52
8.5 Extracción de ADN microorganismos de referencia
Para establecer las condiciones adecuadas de la amplificación en cadena por la polimerasa se
utilizaron los siguientes microorganismos (tabla 3) de referencia proporcionados por cepario de
bacteriología de la Universidad de Santander UDES en caldo nutritivo con 24 horas de
crecimiento:
Tabla 3
Cepas ATCC usadas como microorganismos de referencia y su respectivo código.
Cepa ATCC Código
Klebsiella oxytoca 13182
Enterobacter cloacae 35030
Serratia marcescens 14041
Pseudomonas aeruginosa 27853
Bacillus cereus 10876
Klebsiella pneumoniae 700603
La extracción de ADN de los microorganismos de referencia se realizó mediante el método de
salting-out descrito por Casañas et al. (2001) con modificaciones. Se tomaron 3 mL de un cultivo
de 24 horas en caldo nutritivo fue centrifugado durante 4 minutos (8.000 rpm), el sedimento se
lavó con PBS pH=7.2 y se centrifugó nuevamente. Posteriormente se adicionó 600 µl de buffer
de lisis (EDTA 0.5M, Tris-HCl 1M, NaCl 1M) suplementado con 10 µl de proteinasa K (20
mg/mL) y 10 µl de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS), se dio vórtex por 30 segundos y se
incubó a 56°C por 1 hora. Pasado este tiempo de incubación se agregó 150 µl de acetato de
sodio 5M para precipitar las proteínas, se mezcló en vórtex y se incubó a 4°C por 5 minutos;
posteriormente, se centrifugó la mezcla por 10 minutos (13.000 rpm). El sobrenadante se
53
transfirió a un nuevo vial de 1.5 ml y se añadió 600 µl de isopropanol frío a -20°C, la mezcla se
homogenizó por inversión para permitir la precipitación de ADN y posteriormente se centrifugó
durante 4 minutos (4000 rpm) para permitir la precipitación del ADN. Se descartó el
sobrenadante y se agregó 500 µl de etanol al 70%, para lavar y se volvió a centrifugar en las
condiciones descritas anteriormente. El sobrenadante fue descartado por inversión y el tubo se
dejó a temperatura ambiente por 1 hora para permitir la evaporación del etanol residual. El ADN
se resuspendió en 50 µl de buffer TE 1X (Tris-HCl 1 M, 10M NaOH, EDTA 0.5M. La calidad
del ADN fue medido por espectrofotometría utilizando un equipo nanodrop y electroforesis en
gel de agarosa 1% en buffer TAE 1X para identificar la integridad del mismo.
El ADN de los microorganismos aislados a partir de Ricinus communis y Plukenetia
volubilis fue otorgado en cantidades necesarias para trabajar por el autor del proyecto
(AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS Y EPÍFITOS
CON POTENCIAL BIOFERTILIZANTE ASOCIADOS A Higuerilla (Ricinus communis
Linneo) y Sacha inchi (Plukenetia volúbilis Linneo) (Anexo 1).
8.6 Estandarización de PCR
Para optimizar los resultados de la amplificación de los cebadores se llevó a cabo una PCR
con diferentes temperaturas para cada par de oligonucleótidos diseñados; Estas constaron de 35
ciclos con 4 temperaturas de hibridación diferentes para los oligonucleótidos de nifH, las
temperaturas evaluadas fueron: 50°C, 57,4°C, 60,4°C y 63°C, para evaluar las temperaturas se
utilizaron las muestras Klebsiella sp. (30), Serratia marcescens (14041) y Enterobacter cloacae
(35030); Las temperaturas usadas para los oligonucleótidos diseñados para phoD fueron: 50°C,
59,1°C y 65°C con las muestras Klebsiella sp. (30), Serratia marcescens (14041) y Enterobacter
54
cloacae (35030); las reacciones se realizaron en el termociclador Thermo Cycler Biorad®
model T100.
Los productos de PCR (amplicones) se analizaron en geles de agarosa al 2% teñidos con el
colorante SYBR safe DNA gel strain (invitrogen) usando buffer TAE 1X. Se cargaron 10 µL de
cada amplicón; las electroforesis se desarrollaron en cámaras horizontales (Sub-Cell® GT Cell) a
80V durante 80 min para su posterior visualización bajo luz UV en un fotodocumentador E-Gel
Imager - The Compact Gel Imaging System (ThermoFisher).
55
8.7 Amplificación de microorganismos potenciales a fijar nitrógeno y solubilizar
fosfatos con los oligonucleótidos diseñados
La amplificación para los genes se llevó a cabo tomando como base las siguientes
condiciones, las cuales se realizaron en tubos de 0.2 ml. Para la amplificación de los genes
blanco se usó una polimerasa con un sistema convencional 5X (5 µl) que contenía MgCl2 y
dNTPS, 10 µM (0.4, 0.2 y 0.125 µl) de oligonucleótidos y agua libre de nucleasas. Las
condiciones de amplificación fueron las estandarizadas previamente. Por último, luego de haber
servido la mezcla en tubos de 0.2 µl se agregó 1 µl de ADN de cepas a evaluar para un volumen
final en todas las reacciones de 10 µl. Las mezclas se homogenizaron por vórtex y finalmente las
reacciones de RCP se colocaron en un termociclador Thermo Cycler Biorad® model T100
usando un programa de amplificación con una temperatura inicial de 95°C (5 min.), segundo
paso a una temperatura de 95° (20 seg.), tercer paso a una temperatura de 60°C (30 seg.), cuarto
paso a una temperatura de 68°C (20 seg.) y el paso 5 a una temperatura de 68°C (5 min.), con
una repetición de 35 veces para los pasos 2, 3 y 4.
8.8 Secuenciación de amplificados
Se realizó amplificación de las cepas de referencia a un volumen final de 30uL. Los
amplificados fueron remitidos a la empresa Macrogen en Corea y se solicitó el servicio de
purificación y secuenciación por extensión de primer en un sentido utilizando los
oligonucleótidos nifH, phoDGP y phoDGN (tabla 5). Las secuencias obtenidas fueron
56
analizadas utilizando el programa Bioedit versión 7.2.6 con el fin de recortar la sección de la
secuencia entregada donde se observa la mejor resolución de cada una de las bases. Las
secuencias obtenidas fueron analizadas utilizando el algoritmo BLAST (descrito anteriormente)
para obtener la secuencia con mayor identidad.
57
9 RESULTADOS
9.1 Selección de microorganismos de referencia.
Para el grupo 1 Se tuvieron en cuenta los datos provistos por el estudio (AISLAMIENTO Y
EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS Y EPÍFITOS CON POTENCIAL
BIOFERTILIZANTE ASOCIADOS A HIGUERILLA (Ricinus communis Linneo) Y SACHA
INCHI (Plukenetia volúbilis Linneo) (datos no publicados) se seleccionaron 32
microorganismos, los cuales presentaron capacidad de promover el crecimiento vegetal de las
plantas Plukenetia volubilis y/o Ricinus communis, estos comprenden 4 familias
Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Moraxellaceae con los siguiente géneros;
Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Serratia sp., Microbacterium sp., Pantonea sp., Rhizobium
sp., Klebsiella., Cronobacter sp., Acinetobacter sp., Raoultella sp., Kluyvera sp., Bacillus sp.,
Ralstonia sp. y Citrobacter sp. Presentes en el anexo 1. De los cuales se seleccionaron 5
(Bacillus sp., Enterobater sp., Klebsiella sp., Pseudomonas sp. y Serratia sp.) para la
recopilación de secuencias debido a su sobresaliente capacidad de promover el crecimiento
vegetal con respecto al resto.
Para el grupo 2.1 se tuvieron en cuenta 25 artículos, en los cuales se encontraron 35 familias
(Acetobacteraceae, Acidithiobacillaceae, Alcaligenaceae, Nostocaceae, Rhodocyclaceae,
Comamonadaceae, Xanthobacteraceae, Rhodospirillaceae, Azotobacteraceae,
Bradyrhizobiaceae, Beijerinckiaceae, Burkholderiaceae, Chlamydomonadaceae, Chlorobiaceae,
Clostridiaceae, Enterobacteriaceae, Hapalosiphonaceae, Frankiaceae, Oxalobacteraceae,
58
Phyllobacteriaceae, Methanobacteriaceae, Methanococcaceae, Methylococcaceae,
Methylocystaceae, Nostocaceae, Paenibacillaceae, Oscillatoriaceae, Pseudomonadaceae,
Rhizobiaceae, Rhodobacteraceae, Synechococcaceae, Thiobacillaceae, Phormidiaceae,
Vibrionaceae, Rhodospirillaceae.) con 68 géneros que se especifica en el anexo 3 Asociadas
con el gen nifH. Para el grupo 2.2 se tuvieron en cuenta 9 artículos, en los cuales se encontraron
15 familias (Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Moraxellaceae,
Caulobacteraceae, Xanthobacteraceae, Geobacteraceae, Phyllobacteriaceae,
Methylobacteriaceae, Micrococcaceae, Nostocaceae, Rhodospirillaceae, Rhizobiaceae,
Streptomycetaceae, Sphingomonadaceae con los siguientes géneros; Bacillus sp., Azorhizobium
sp., Caulobacter sp., Enterobacter sp., Escherichia sp., Geobacter sp., Mezorizobium sp.,
Methylobacterium sp., Micrococcus sp., Nostoc sp., Pseudomonas sp., Rhodospirillum sp.,
Sinorhizobium sp., Streptomyces sp. y Zymomosas sp.) Revisar anexo 2. Que se encuentran
asociados con el gen phoD. Debido a los reducidos resultados de artículos científicos reportando
microorganismos con la presencia del gen phoD se apoyó la búsqueda con el código COG3540
(Cluster de grupos ortólogos; http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/COG/), que corresponde a la fosfatasa
alcalina (Ragota, Kertesz y Bünemann, 2015).
59
9.2 Recopilación de secuencias
Las secuencias para los grupos 1.1 y 2.1 fueron recolectadas en los meses de septiembre y
octubre del año 2017 y las de los grupos 1.2 y 2.2 fueron recolectadas en los meses de febrero y
marzo del 2019; Para los genes nifH se obtuvieron 12 secuencias en el grupo 1.1 (Anexo 4) y
50 secuencias para el grupo 2.1 (Anexo 6.), Para el gen phoD se obtuvieron 32 secuencias para
el grupo 1.2 (Anexo 5.), y 22 secuencias para el grupo 2.2 (Anexo 7.) Todas las secuencias
fueron recopiladas en formato FASTA.
Debido a que no fueron encontradas secuencias de los genes phoD o nifH de algunos de los
microorganismos seleccionados previamente (Anexos 1,2 y 3) se procedió a ampliar el número
de secuencias con microorganismos con un número de citaciones NC inferior (Anexo 2 y 3).
9.3 Identificación de regiones conservadas
Las secuencias recopiladas para los oligonucleótidos nifH del grupo 1 fueron secuencias cds
parciales del gen, el tamaño de estas secuencias fue <400 pb, las secuencias presentaron una
zona conservada de 180 pb, se seleccionó esta zona para obtener la secuencia consenso a partir
de allí (Figura 10).
60
Figura 10. Alineamiento de las secuencias (Anexo 4) con el área conservada seleccionada.
El software CLC sequence viewer no utiliza un código degenerado, ubica una letra “N”
cuando no se encuentre un nucleótido sobre el 50% en proporción en una posición de las
secuencias alienadas; Debido a que los oligonucleótidos del grupo 1 (1.1 y 1.2) se deseaban
específicos para un selecto grupo de bacterias (Anexo 1) y que el software para diseñar
oligonucleótidos no reconoce las letras “N” en una secuencia, las letras “N” fueron reemplazadas
manualmente por la letra presente en esa posición que empareje con mayor número de letras de
la posición anterior.
Una vez reemplazadas las “N” fue obtenida la secuencia consenso (Anexo 8.)
El árbol de distancias obtenido a partir del alineamiento del grupo 1.1
61
Figura 11. Árbol de distancias con las secuencias del grupo 1.1
A pesar de que el árbol de distancias (Figura 11) mostró la secuencia AB052653.1
lejos (Figura 2) de las demás secuencias, no presento gran interferencia en el
alineamiento cono se puede observar en la Figura 10. Razón por la cual no fue eliminada
del alineamiento.
Figara 12. Alineamiento de todas las secuencias recopiladas para el grupo 1.2.
El alineamiento del grupo 2.1 (Figura 12) mostró gran heterogeneidad, razón por la cual se
creó un árbol de distancias (Figura 13) en el cual se encontró la división de dos grupos; Uno de
los grupos encontrados fue denominado “Gram positivas” donde se encuentran las secuencias
AP012495.1, AP012496.1, CP000002.3, CP002627.1, FN597644.1, HG328254.1, CP003017.1,
UFSS01000001.1, CP005965.1, CP006890.1, CP007165.1, CP007640.1, CP011802.1,
CP021507.1, CP021921.1 y UFTC01000001.1, pertenecientes a bacterias del género Bacillus sp.
(Anexo 5)
62
El siguiente grupo es “Gram negativas” donde se encuentran las secuencias FKIY01000004.1,
UFDM01000012.1, UFDQ01000024.1, UKAL01000001.1, AHPN01000001.1, CP010896.1,
AHPP01000002.1, AP014522.1, AP014623.1, UGUQ01000001.1, AP014627.1, AP014628.1,
CP006256.1, LT855380.1, LT963395.1 y MKZO01000017.1. (Anexo 5)
Figura 13. Árbol de distancias creado a partir del alineamiento del grupo 1.2
Una vez separado el grupo 2.1 en Gram positivas y Gram negativas, se llevó a cabo un
alineamiento para cada grupo (Figura14 y 15).
Figura 14. Alineamiento de las secuencias del género Bacillus sp. o Gram positivas.
63
Por medio del alineamiento de Gram positivas se pudo observar que las secuencias entre
diferentes especies del género Bacillus sp. se encuentran conservadas. A partir de este
alineamiento se pudo obtener una secuencia consenso de 2275 pares de bases (Anexo 9).
Figura 15. Alineamiento de las secuencias del grupo Gram negativas.
A partir del alineamiento de las secuencias del grupo 1.2 Gram negativas se obtuvo una
secuencia consenso de 380 pares de bases (Anexo 10).
Debido a la heterogeneidad que se presentó en el grupo 2 (grupos 2.1 y 2.2), las secuencias
presentaron pocas zonas conservadas y de tamaños muy cortos <100pb, la búsqueda de estas
regiones conservadas se llevó a cabo manualmente (Anexo 11 y 12).
9.4 Diseño y evaluación de oligonucleótidos
A partir de las zonas conservadas identificadas previamente se pudo obtener un par de
oligonucleótidos (forward y reverse) para cada grupo donde los oligonucleótidos nifH-F y nifH-
R fueron obtenidos a partir del grupo 1.1; Los oligonucleótidos FT-nifHF y FT-nifHR fueron
obtenidos a partir del grupo 2.1; Los oligonucleótidos phoDGP-F y phoDGP-R fueron
obtenidos a partir del grupo 1.2 Gram positivas; los oligonucleótidos phoDGN-F y phoDGN-R
64
fueron obtenidos a partir del grupo 1.2 Gram negativas y los oligonucleótidos FT-phoDF y FT-
phoDR fueron obtenidos a partir del grupo 2.2 (Tabla 4).
Tabla 4.
Oligonucleótidos diseñados, nombre, secuencia, longitud de los oligonucleótidos, temperatura de anillamiento
(TM), porcentaje guaninas y citosinas (%GC) y tamaño esperado de amplificación.
Nombre Secuencia Longitud TM
(°C)
GC% Tamaño
amplificado
nifH-F CACGCCAAAGCACAGAACAC 20 pb 62,8 55 100 pb
nifH-R CATCGCCGTAGCCGATTT 18 pb 62,1 55,6
FT-nifHF GAACACCGTCCTGGATATGG 20 pb 60,2 55 201
FT-nifHR CGTAGTCCATCGTCGTCGTA 20 pb 59,7 55
phoDGP-F GACCAATGGAGAGCGGATTA 20 pb 60 50 192 pb
phoDGP-R GGCTTTGTTATGGGCAAAGA 20 pb 60,1 45
phoDGN-F AATGCGTATTTACCGCCATC 20 pb 59,8 45 207 pb
phoDGN-R TCGAGTGGTTCAAGTTGTGG 20 pb 59,7 50
FT-phoDF ATCTGGACATGGGACGACCA 20 pb 59,3 55 342 pb
FT-phoDR ACATTCCACTGCGCTTGCGA 20 pb 59,3 55
La evaluación “in silico” de los oligonucleótidos fue llevada a cabo por medio de la
herramienta BLAST y se muestra en la siguiente tabla (Tabla 5):
65
Tabla 5.
Resultado BLAST de los oligonucleótidos; código de GenBank de las secuencias con las que
alinean los oligonucleótidos, porcentaje de cubrimiento y porcentaje de identidad.
nombre Secuencia Código de
accesión
Porcentaje
de
cubrimiento
Porcentaje
de identidad
nifH-F CACGCCAAAGCACAGAACAC CP029770.1 20/20 100%
nifH-R V00631.1 20/20 100%
FT-nifHF GAACACCGTCCTGGATATGG MG754385.1 13/20 100%
FT-nifHR KC445672.1 15/20 100%
phoDGP-F GACCAATGGAGAGCGGATTA CP029473.2 18/20 100%
phoDGP-R CP027061.1 18/20 100%
phoDGN-F AATGCGTATTTACCGCCATC CP034078.1 16/20 100%
phoDGN-R CP027742.1 14/20 100%
FT-phoDF ATCTGGACATGGGACGACCA CP029551.1 11/20 100%
FT-phoDR
La formación de dímeros a partir de los oligonucleótidos diseñados encontró que los
oligonucleótidos FT-nifHR pueden formar dímeros con los oligonucleótidos FT-phoDF
5’-CGTAGTCCATCGTCGTCGTA-> FT-nifHR
| | | | | | | | |
<- ACCAGCAGGGTACAGGTCTA-5’ FT-phoDF
La formación de dímeros se presentó en el oligonucleótido reverse del grupo 2.1 con el
oligonucleótido forward del grupo 2.2, no obstante el interés se enfocó en la formación de
homodimeros o heterodimeros con las secuencias de los oligonucleótidos R y F de un mismo
grupo, razón por la cual el heterodimero formado por el oligonucleótido FT-nifHR con FT-
phoDF no es relevante.
66
9.5 Extracción de ADN microorganismos de referencia
Se logró extraer el ADN genómico bacteriano de las cepas de referencia mediante el
protocolo de extracción del salting out; las concentraciones de ADN (ng/µL) obtenidas fueron
relativamente altas <2000ng/ µL, exceptuando a Bacillus cereus que obtuvo una concentración
de ADN de 187 ng/µL (Tabla 6).
Tabla 6. Cuantificación de ADN genómico de microorganismos de referencia.
Microorganismo Código
ATCC
Concentración ADN
ng/µL
260/230 260/280
Klebsiella oxytoca 13182 2843,3 1,97 1,96
Enterobacter cloacae 35030 3547,6 1,95 2,09
Serratia marcescens 14041 2088 1,72 2,02
Pseudomonas aeruginosa 27853 5996,6 1,98 2,04
Bacillus cereus 10876 187 2,03 1,83
Klebsiella pneumoniae 700603 5973,3 1,87 1,92
9.6 Estandarización de PCR
Se llevó a cabo una curva melting PCR para establecer la temperatura adecuada de
amplificación de los oligonucleótidos nifH-F y R, phoDGP-F y R y phoDGN-F y R: Las
temperaturas utilizadas para los oligonucleótidos nifH-F y R fueron de 50, 57.4, 60.4 y 63°C, las
temperaturas fueron evaluadas con el ADN de los microorganismos de referencia; 35030, 14041
y 13182 (Figura 16).
67
Figura 16. Electroforesis de curva melting con oligonucleótidos nifH-F y R con cuatro temperaturas, los
pozos 1, 2, 3, 4 corresponden al control negativo, pozo 5 (35030 a 50°C), pozo 6 (35030 a 57,4°C), pozo 7 (35030
a 60,4°C), pozo MW (Marcador de peso molecular), pozo 1 (35030 a 63°C), pozo 2 (13182 a 50°C), pozo 3 (13182
a 57,9°C), pozo 4 (13182 a 60,4°C), pozo 5 (13182 a 63°C), pozo 6 (14041 a 50°C), pozo 7 (14041 a 57,4°C), pozo
8 (14041 a 60,4°C) pozo (14041 a 63°C), pozo MW (marcador de peso molecular).
La curva Melting para los oligonucleótidos phoDGP-F y R y phoDGN-F y R fue llevada
a cabo con las temperaturas 50, 59.1 y 65°C con el ADN de las cepas de referencia Baci10876,
Entero35030, kleb13182.
1 2 3 4 5 6 7 MW 8 9 10 11 12 13 1 4 15 16 17 MW 18
68
Figura 17. Electroforesis de amplificados en el gel de agarosa al 2% con diferentes temperaturas de
anillamiento para oligonucleótidos phoDGP-F y R y phoDGN-F
El contenido de cada pozo (1-19) se encuentra en la siguiente tabla:
Pozo Muestra Oligonucleótidos Temperatura
1 35030 X
65°C
2 phoDGN
3 phoDGP
4 10876 X
5 phoDGN
6 phoDGP
7 13182 X
8 phoDGN
9 phoDGP
MW Marcador de peso molecular
10 35030 phoDGP
59,1°C
11 X
12 phoDGN
13 10876 phoDGP
14 X
15 phoDGN
16 10876 phoDGP
17 X
18 phoDGN
19 Control negativo
69
Figura 18. Electroforesis de amplificados en el gel de agarosa al 2% con diferentes temperaturas de
anillamiento para oligonucleótidos phoDGP-F y R y phoDGN-F gel 2.
El contenido de cada pozo (1-10) se encuentra en la siguiente tabla:
Pozo Muestra Oligonucleótidos Temperatura
1 35030 X
50°C
2 phoDGN
3 phoDGP
4 10876 X
5 phoDGN
6 phoDGP
7 13182 X
8 phoDGN
9 phoDGP
MW Marcador de peso molecular
Control negativo
La temperatura de anillamiento seleccionada fue de 59°C debido a que en una
temperatura de 50°C se evidenció la presencia de bandas interferentes y amplificación
inespecífica y a 65°C no hubo amplificación de ningún tipo (Figura 17 y 18).
70
9.7 Amplificación de genes nifH y phoD microorganismos potenciales a fijar nitrógeno y
solubilizar fosfatos con los oligonucleótidos diseñados
Se llevó a cabo 3 PCR (1 con oligonucleótidos nifH-F y R, 2 con oligonucleótidos
phoDGN-F y R y la última con los oligonucleótidos phoDGP-F y R) con el ADN de las 32
cepas extraídas a partir de Ricinus communis y Plukenetia volubilis con cada uno de los 3 pares
de oligonucleótidos, los resultados fueron evidenciados por electroforesis en gel de agarosa al
2% (Fugura 19).
.
Figura 19. Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de microorganismos aislados a
partir de Plukenetia volubilis y Ricinus communis (anexo 1) con los oligonucleótidos nifH-F y R. donde los pozos
(1-19): Pozo 1 ( muestra 1), pozo 2 (muestra 2), pozo 3 (muestra 4), pozo 4 (muestra 5), pozo 5 (muestra 6), pozo 6
(muestra 7,) pozo 7 (muestra 8), pozo 8 (muestra 9), pozo 9 (muestra 11), pozo MW (marcador de peso molecular),
pozo 10 (muestra 12), pozo 11 (muestra 13), pozo 12 (muestra 14), pozo 13 (muestra 15), pozo 14 (muestra 16),
pozo 15 (muestra 18), pozo 16 (muestra 19), pozo 17 (muestra 22), pozo 18 (muestra 23) y pozo 19 (muestra 24) Gel
1.
71
Figura 20. Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de microorganismos aislados a
partir de Plukenetia volubilis y Ricinus communis (anexo 1) con los oligonucleótidos nifH-F y R. parte 2; donde los
pozos (1-15): Pozo 1 (muestra25), pozo 2 (muestra 27), pozo 3 (muestra 28), pozo 4 (muestra 29), pozo5 (muestra
32), pozo 6 (muestra 33), pozo 7 (muestra 34), pozo 8 (muestra 35), pozo MW (Marcador de peso molecular), pozo
9 (muestra 36), pozo 10 (muestra 37), pozo 11 (muestra 38), pozo 12 (muestra 39), pozo 13 (muestra 40), pozo 14
(Control negativo) y pozo 15 (Control positivo). Gel 2
De los 32 microorganismos incluidos en este estudio (Anexo 1), 6 microorganismos
presentaron la amplificación de una banda sugestiva cercana a 100 pares de bases como la banda
que muestra el control positivo en el carril 14 (13182, Klebsiella oxytoca) del gel 2; muestra 6 en
el pozo 5 (Pantoea sp.), muestra 9 en el pozo 8 (Enterobacter cloacae) y 15 en el pozo 13
(Cronobacter sakazakii) en el gel 1 (Figura 19)y 25 en el pozo 1 (Enterobacter sp.), muestra 29
en el pozo 4 (Citrobacter freundii) y muestra 32 en el pozo 5 (Serratia sp.) en el gel 2 (Figura
20).
72
Figura 21. Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de microorganismos aislados
a partir de Plukenetia volubilis y Ricinus communis (anexo 1) con los oligonucleótidos phoDGN-F y R, donde los
pozos (1-19): Pozo 1 ( muestra 1), pozo 2 (muestra 2), pozo 3 (muestra 4), pozo 4 (muestra 5), pozo 5 (muestra 6),
pozo 6 (muestra 7,) pozo 7 (muestra 8), pozo 8 (muestra 9), pozo 9 (muestra 11), pozo MW (marcador de peso
molecular), pozo 10 (muestra 12), pozo 11 (muestra 13), pozo 12 (muestra 14), pozo 13 (muestra 15), pozo 14
(muestra 16), pozo 15 (muestra 18), pozo 16 (muestra 19), pozo 17 (muestra 22), pozo 18 (muestra 23) y pozo 19
(muestra 24).
73
Figura 22. Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de microorganismos aislados a
partir de Plukenetia volubilis y Ricinus communis (anexo 1) con los oligonucleótidos phoDGN-F y R. gel 2; donde
los pozos (1-15): Pozo 1 (muestra25), pozo 2 (muestra 27), pozo 3 (muestra 28), pozo 4 (muestra 29), pozo5
(muestra 32), pozo 6 (muestra 33), pozo MW (Marcador de peso molecular), pozo 7 (muestra 33), pozo 8 (muestra
34), pozo 9 (muestra 35), pozo 10 (muestra 36), pozo 11 (muestra 37), pozo 12 (muestra 38), pozo 13 (muestra 39),
pozo 14 (muestra 40) y pozo 15 (Control negativo).
Los oligonucleótidos phoDGN-F y R fueron diseñados para amplificar una secuencia de
207 pares de bases, 3 muestras de las 32 procesadas presentaron una amplificación de una banda
sugestiva de un tamaño cercano a los 200 pares de bases en los pozos 7, 9 y 11 pertenecientes a
las muestras 33 del pozo 7 (uncultured bacteria), 35 del pozo 9 (Serratia marcescens) y 37 del
pozo 11 (Ralstonia sp.) del gel 2 (Figura 22).
74
Figura 23. Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de microorganismos aislados a
partir de Plukenetia volubilis y Ricinus communis (anexo 1) con los oligonucleótidos phoDGP-F y R, donde los
pozos (1-19): Pozo 1 ( muestra 1), pozo 2 (muestra 2), pozo 3 (muestra 4), pozo 4 (muestra 5), pozo 5 (muestra 6),
pozo 6 (muestra 7,) pozo 7 (muestra 8), pozo 8 (muestra 9), pozo 9 (muestra 11), pozo MW (marcador de peso
molecular), pozo 10 (muestra 12), pozo 11 (muestra 13), pozo 12 (muestra 14), pozo 13 (muestra 15), pozo 14
(muestra 16), pozo 15 (muestra 18), pozo 16 (muestra 19), pozo 17 (muestra 22), pozo 18 (muestra 23) y pozo 19
(muestra 24).
75
Figura 24. Electroforesis en gel de agarosa al 2% para amplificados de ADN de microorganismos aislados a
partir de Plukenetia volubilis y Ricinus communis (anexo 1) con los oligonucleótidos phoDGP-F y R gel 2; donde
los pozos (1-15): Pozo 1 (muestra25), pozo 2 (muestra 27), pozo 3 (muestra 28), pozo 4 (muestra 29), pozo5
(muestra 32), pozo 6 (muestra 33), pozo 7 (muestra 34), pozo 8 (muestra 35), pozo MW (Marcador de peso
molecular), pozo 9 (muestra 36), pozo 10 (muestra 37), pozo 11 (muestra 38), pozo 12 (muestra 39), pozo 13
(muestra 40), pozo 14 (Control negativo) y pozo 15.
La PCR llevada a cabo con los oligonucleótidos phoDGP-F y R, los cuales se diseñaron
para un amplificado de 192 pares de bases, se encontró en la electroforesis que los pozos 11 con
la muestra 13 (Enterobacter cloacae), pozo 15 con la muestra 18 (Raoultella planticola), pozo
18 con la muestra 23 (Pantoea agglomerans) del gel 1 (Figura 23) y pozos 9 con la muestra 36
(Bacillus sp.), y pozo 13 con muestra 40 (Ralstonia sp.) en el gel 2 (Figura 24) , presentan una
banda sugestiva muy cercana al tamaño de amplificación de los oligonucleótidos.
76
9.8 Secuenciación de amplificados
Tabla 7
Resultados de la secuenciación de las muestras 151 (Cronobacter sakazakii amplificado con
oligonucleótidos nifH), 133 (Enterobacter cloacae amplificado con oligonucleótidos
phoDGP) y 233 (Pantoea agglomerans con primers phoDGP), tamaño de la banda
amplificada, porcentaje de identidad con el gen CDS y gen con el cual se identificó.
CODIGO Tamaño
de banda
Primer Secuencia Identidad CDS Identificación
151 300 pb nifH F LR134196.1 184/186(99%) VEB70977.1 nitrogen
regulatory
protein P-II
133 190 pb phoDGP
F
CP032872.1 140/142
(99%)
AYK99853.1 Fosfatasa
alcalina
233 600 pb phoDGP
F
CP031574.1 523/527
(99%)
AXO49882.1 DgaE family
pyridoxal
phosphate-
dependent
ammonia lyase
77
10 DISCUSIÓN
Los microorganismos definidos para el grupo 1, han sido también reportados por otras
investigaciones como la de Hurek et al. (2002), Apel et al. (2007) y Lara, Villalba & Oviedo
(2007). Aquí se muestra el potencial de microorganismos para fijar nitrógeno de
microorganismos como Rhizobium sp., Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Klebsiella
sp. entre los más destacados y de Bacillus sp., Enterobacter sp. y otros para la solubilización de
fosfatos.
Con respecto a la selección de microorganismos del grupo 1.2 y 2.2, aunque existe una amplia
variedad que se han estudiado para la fijación de nitrógeno, se conoce poco sobre la asociación
entre los genes y la solubilización de fosfatos, esto se debe a que muchos de los autores reportan
el proceso de solubilización como un factor secundario al metabolismo microbiano no específico
que en su proceso de producción de energía, producen ácidos orgánicos que acidifican el pH y
aumentan la biodisponibilidad del fósforo para las plantas.
El análisis de secuencias de los genes nifH y phoD muestran una gran heterogeneidad para
los genes phoD, esto se observó cuando se realizó el árbol de distancias el cual permitió
identificar dos grupos para el desarrollo de los oligonucleótidos. Poly et al. (2001) muestran la
filogenia del gen nifH en donde puede apreciarse que se enumeran en mayor cantidad las
bacterias Gram negativas.
El alineamiento de las secuencias del grupo 1.1 permitió identificar una región conservada y
una secuencia consenso de 180pb (Anexo 8), a partir del cual se obtuvieron los oligonucleótidos
nifH.
78
A pesar de la heterogeneidad presentada en las secuencias del grupo 1.2 Gram negativas se
pudo extraer una secuencia consenso de 380pb (Anexo 9) a partir de una región un poco
conservada.
Con respecto a los oligonucleótidos diseñado por medio de este proyecto tienen un contenido
de guaninas y citosinas recomendado por Dieffenbach, Lowe, & Dveksler (2019), entre 50 y
56% para obtener temperaturas de anillamiento entre 56 – 62°C, lo cual proporciona un rango
térmico para un anillado eficiente evitando amplificaciones inespecíficas.
La evaluación “in silico” de los oligonucleótidos diseñados encontró un cubrimiento del
100% y un porcentaje de identidad del 100% para los oligonucleótidos nifH-F y R con los
accesos CP029770.1 klebsiella michiganensis y V00631.1 klebsiella pneumoniae como
resultados positivos, para los otros oligonucleótidos diseñados se encontró cubrimientos 55 -
90% con identidades del 100%, los bajos porcentaje de cubrimiento probablemente se deban a la
cantidad de secuencias que se utilizan para el diseño de oligonucleótidos ya que la
heterogeneidad en los alineamientos es proporcional a la cantidad de secuencias (Gaby &
Buckley, 2012).
En la amplificación del gen nifH de los 32 microorganismos aislados a partir de Ricinus
communis y Plukenetia volubilis (Anexo 1) se encontraron 6 microorganismos que en su ADN
se amplificó una banda sugestiva de un tamaño similar a los 100 pares, tamaño esperado de
amplificación para los oligonucleótidos diseñados nifH-F y R, los 6 microorganismos
corresponden a: Pantoea sp., Enterobacter cloacae, Cronobacter sakazakii, Enterobacter sp.,
Citrobacter freundii y Serratia sp.; Se esperaba un total de 11 microorganismos con
amplificación del gen nifH por medio de los oligonucleótidos nifH-F y R debido a que hay 11
microorganismos aislados a partir de Ricinus communis y Plukenetia volubilis pertenecientes a
79
los géneros Bacillus sp., Enterobacter sp. y Serratia sp. (Anexo 1), géneros de los cuales se
obtuvieron secuencias del gen nifH para diseñar los oligonucleótidos nifH-F y R, no obstante, de
las 6 muestras con amplificados cercanos a los 100 pb, 3 de ellas pertenecen a 2 de los géneros
utilizados para diseñar los oligonucleótidos, muestras 9,5 del género Enterobacter sp. y 32 del
género Serratia sp.; De los 3 géneros restantes Pantoea sp., fue reportada como fijadora de
nitrógeno y portadora del gen nifH (Muangthong, Youpensuk, & Rerkasem, 2015), Enterobacter
sakazakii descrita como Cronobacter sakazakii (Iversen et al., 2008), especie no reportada como
fijadora de nitrógeno, sin embargo, especies del género Enterobacter sp., se han reportado como
fijadoras de nitrógeno tales como; Enterobacter cloacae (Defez, Andreozzi, & Bianco, 2017),
Citrobacter freundii al igual que Enterobacter sakazakii no ha sido una especie descrita como
fijadora de nitrógeno, no obstante los autores Hongrittipun, Youpensuk, & Rerkasem (2014)
encontraron aislados de Citrobacter sp. como fijadoras de nitrógeno.
Para detectar el gen phoD, los oligonucleótidos phoDGP-F y R fueron diseñados a partir de
secuencias del gen phoD de 9 especies diferentes del género Bacillus sp. (Anexo 5) para obtener
un amplificado de 192 pares de bases, entre los microorganismos aislados a estudiar (Anexo 1)
se encuentran 4 microorganismos del género Bacillus sp. (B. cereus, B. toyonesis, B.
thuringiensis), muestras 19, 24, 34 y 36 de las cuales se esperaba obtener una amplificación
cercana a los 200 pb, no obstante, la muestra 36 (Bacillus sp.) de las esperadas, fue la única en
presentar un amplificado sugestivo cercano a los 200 pb; Los oligonucleótidos phoDGN-F y R,
fueron diseñados a partir de secuencias del gen phoD de microorganismos de los géneros
Enterobacter sp., Klebsiella sp. y Pseudomonas sp.; Entre los aislados a estudiar se encuentran
12 microorganismos pertenecientes a los géneros Enterobacter sp. (muestras 1, 9, 12, 13, 14 y
25), Klebsiella sp. (muestras 11 y 30) y Pseudomonas sp. (muestras 2, 28, 38 y 39), sin embargo,
80
ninguna de las muestras anteriores presento un amplificado cercano a los 207 pares de bases
(tamaño en pb que amplifican los oligonucleótidos phoDGN-F y R); Los otros amplificados
sugestivos cercanos a 192 pb con los primes phoDGP-F y R pertenecen a las muestras; 13
(Enterobacter cloacae), la muestra 18 (Raoultella planticola), muestra 23 (Pantoea
agglomerans) y muestra 40 (Ralstonia sp.), de los cuales Enterobacter cloacae presenta el gen
phoD tal y como se encuentra en FKIY01000004.1[130723..132753] y aunque no hay reportes
de fosfatasa alcalina con el gen phoD, según Mihara et al. (2001) Raoultella planticola es
solubilizadora de fosfatos ya que produce una enzima fosfatasa ácida.
Las muestras 33 (uncultured bacteria), 35 (Serratia marcescens) y 37 (Ralstonia sp.)
presentaron amplificados sugestivos cercanos a los 207 pb, tamaño que amplifican los
oligonucleótidos phoDGN-F y R, de las cuales Serratia marscescens es reportado como
solubilizador de fosfatos al producir una enzima fosfatasa ácida (Behera et al., 2017).
A pesar de que las temperaturas de anillamiento de los oligonucleotidos diseñados se
encuentran entre el rango recomendado por Dieffenbach, Lowe, & Dveksler en (2019), se
encontro que los oligonucleotidos nifH-F y R, phoDGP y phoDGN tuvieron amplificaciones
inespecificas no deseadas,las bandas de 300 pb de la muestra 15 con los oligonucleotidos nifH-F
(figura 19), la banda de 200pb de la muestra 12 y la banda de 600pb de la muestra 13 con los
oligonucleotidos phoDGP (Figura 23) se seleccionaron para secuenciar debido que estas bandas
se repiten en otros pozos.
La secuenciación 155 de la banda 300pb de la muestra 15 (Cronobacter sakazakii), demostró
un 99% de identidad con nitrogen regulatory protein P-II (VEB70977.1), esta proteina pertenece a
una familia de señales de traducción que desempeña un papel fundamental en el control del
metabolismo del nitrógeno, esta proteína se encuentra relacionada con el gen nifH debido a que
81
regula la expresión de la enzima nitrogenasa (Noindorf et al., 2011), también los autores
Arcondeguy, Jack & Merrick. (2001) indican que la proteína reguladora de nitrógeno PII se
encuentra codificada en el genoma bacteriano (gen gln) después del gen nifH, esta puede ser la
razón por la cual los primers nifH-F diseñados para amplificar el gen nifH amplificaron el gen
gln.
La secuenciación de la banda presente en la muestra 12 (Enterobacter ludwigii), de la cual se
secuenció un amplificado de 190 pares de bases, presentó un 99% de identidad con la accesión
AYK99853.1, la cual corresponde a una fosfatasa alcalina, demostrando la efectividad de los
oligonucleótidos phoDGP diseñados.
Por otra parte la secuenciación de la banda de 600 pb con los oligonucleótidos phoDGP de la
muestra 23 (Pantoea agglomerans) no corresponde a ningún resultado asociado con la enzima
fosfatasa alcalina o el phoD ya que demostró un 99% de identidad con la accesión AXO49882.1
que corresponde a DgaE family pyridoxal phosphate-dependent ammonia lyase.
82
11 CONCLUSIONES
Se encontró una alta distribución taxonómica para el gen nifH reportándose
aproximadamente 71 especies, caso contrario para el gen phoD, donde la mayoría de reportes
incluía no más de 10 géneros.
Los oligonucleotidos diseñados por medio de este trabajo permitieron la amplificación de
secuencias con pesos moleculares sugestivos muy cercanos o del mismo tamaño a los esperados,
también permitieron la amplificación de genes asociados a la actividad de fijación del nitrógeno
con el gen gln a pesar de ser un resultado inespecífico.
La reacción en cadena de la polimerasa permite la detección del potencial para fijar nitrógeno
y solubilizar fosfatos en bacterias aisladas a partir de Ricinus communis y Plukenetia volubilis.
83
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100
13 ANEXOS
Anexo 1.
Bacterias endófitas y epífitas aisladas a partir de Ricinnus communis y Plukenetia volubilis
Planta Códig
o
Bacteria Procedenci
a
Plukeneti
a volubilis
1 Enterobacter cloacae Endófitas
2 Pseudomonas resinovorans cepa IGS-131
4 Serratia marcescens strain NL2106
5 Microbacterium paraoxidans.
6 Pantoea sp
7 Rhizobium pusense
8 Pantoea agglomerans
9 Enterobacter cloacae
11 Klebsiella sp
12 Enterobacter ludwigii
13 Enterobacter cloacae
14 Enterobacter tabaci Epífitas
15 Cronobacter sakazakii
16 Acinetobacter calcoaceticus
18 Raoultella planticola
19 Bacillus cereus
22 Kluyvera sp
23 Pantoea agglomerans
24 Bacillus toyonensis
25 Enterobacter sp
Ricinus
communis
27 Bacillus sp Endofitas
28 Pseudomonas aeruginosa
29 Citrobacter freundii
30 Klebsiella sp.
32 Serratia sp
33 Uncultured bacteria
34 Bacillus thuringiensis Epífitas
35 Serratia marcescens
36 Bacillus sp.
37 Ralstonia sp
38 Pseudomonas sp
101
39 Pseudomonas aeruginosa
40 Ralstonia sp
Anexo 2.
Lista de microrganismos con presencia de phoD según revisión bibliográfica y respectivos autores que los
reportan
Autores Código
Art.
Numero
de hits
Microorganismo Códigos
artículos
Apel et al., 2007 1 1 Bacillus
amyloliquefaciens
4
1 Azorhizobium sp. 5
Ceron y Aristizabal, 2012 2 6 Bacillus subtilis 2,3,6,5,7,9
2 Caulobacter sp. 5,6
Eder, Liu y Hulett,1999 3 1 Enterobacter sp. 6
3 Escherichia coli 2,3,4
Gómez e Ingram, 1955 4 1 Geobacter sp. 5
1 Mesorhizobium loti 6
Muller y Wagner, 1999 5 1 Methylobacterium sp. 5
1 Micrococcus sp. 5
Pop et al., 2002 6 1 Nostoc sp. 6
1 Pseudomonas
aeruginosa
6
Ragota, Kertesz b y
Bünemann, 2015
7 1 Rhodospirillum sp. 5
1 Sinorhizobium
meliloti
6
Rodriguez et al., 2014 8 2 Streptomyces
coelicolor
1,3
wu et al., 2014 9 2 zymomonas mobilis 4,8
102
Anexo 3.
Lista de microrganismo con presencia de nifH según revisión bibliográfica y respectivos autores que los
reportan
Autores códig
o Art.
Num. De
hits
Bacterias Código
s artículos
Ueda et al., 1995 1 1 Acetobacter
diazotrophicus
7
3 Acidithiobacillus
ferroxidans
6,7,22
Poly, Monrozier y Bally,
2001
2 6 Alcaligenes faecalis 2,5,6,7,
14,23
10 Anabaena sp. 1,2,4,5,
6,7,9,12,1
5,18
Dedysh, Ricke y Liesack,
2004
3 2 Azoarcus communis 7,14
6 Azoarcus sp 2,14,15
,18,23,25
Zehr y Mcreynolds, 1989 4 3 Azohydromonas
australica
8,16,22
9 Azorhizobium
caulinodans
3,9,10,
12,14,15,1
7,22,25
Zani et al., 2000 5 10 Azospirillum
brasilense
2,6,7,8,
9,11,13,20
,22,23
7 Azospirillum
lipoferum
2,8,9,1
1,15,20,22
Boulygina et al., 2002 6 9 Azotobacter
Chroococcum
1,2,5,6,
7,13,14,15
,23
11 Azotobacter
vinelandii
1,4,5,6,
7,13,14,15
,22,23,25
Poly, Monrozier y Bally,
2000
7 9 Bradyrhizobium
japonicum
1,2,3,7,
10,13,17,2
2,23
1 Beijerenckia indica 3
Rodrigues et al., 2007 8 1 Beijerenckia mobilis 3
2 Beijerenckia derxii 3,12
Rösch, Mergel y Bothe, 2002 9 6 Bradyrhizobium sp. 1,5,8,1
2,14,25
103
1 Burkholderia
fungorum
4
Laguerre et al., 2001 10 1 Chlamydomonas
reinhardtu
1
1 Chlorobium tepidum 6
Xie y Yokota., 2005 11 8 Clostridium
pasteurianum
1,4,9,1
3,14,19,23
,24
1 Gluconacetobacter
diazotrophicus
6
Terakado-Tonooka et al.,
2008
12 1 Dermocarpa sp. 5
1 Erwinia
chrysanthemi
6
Reiter et al., 2003 13 3 Fischerella sp 2,5,6
9 Frankia sp. 1,2,5,7,
9,13,14,15
,19
Hurek et al., 2002 14 9 Herbaspirillum
seropedicae
6,7,12,
14,19,20,2
2,23,25
13 Klebsiella
pneumoniae
1,2,4,5,
6,7,8,13,1
4,17,19,20
,25
Deslippe y Egger, 2006 15 1 Marchantia
polymorpha
1
3 Mesorhizobium
mediterraneum
3,1,23
Coehlo et al., 2009 16 1 Metanobacterium
thermolithotripicus
3,1
1 Methanobacterium
ivanovii
1
Andam, Mondo y Parker,
2007
17 3 Methanococcus
voltae
1,18,24
2 Methylocella
palustris
3,22
Wartiainen, Ericksson y
Rasmussen, 2007
18 1 Methylocella
silvestris
3
1 Methylocella
tundrae
3
4 Methylococcus
capsulatus
6,18,22
,25
Ando et al., 2005
19 3 Methylocystis
echinoides
3,6,25
104
5 Methylosinus
trichosporium
3,6,11,
12,22
Ding et al., 2005 20 3 Nostoc muscorum 5,6,18
3 Paenibacillus
azotofixans
5,6,13
Jha, Gontia y Harmann, 2012 21 2 Paenibacillus
polymyxa
6,2
1 Parasponia
rhizobium
7
Chowdhury et al, 2007 22 2 Plectonema
boryanum
1,5,19
8 Pseudomonas
stutzeri
3,6,9,1
5,20,21,22
,25
Flores-Mireles, Winans y
Holguin, 2007
23 5 Rhizobium etli 8,11,17
,22,23
1 Rhizobium fredii 7
7 Rhizobium
leguminosarum
1,2,6,1
0,12,17,22
Ma y Lu, 2008 24 5 Rhizobium meliloti 1,2,4,5,
15
2 Rhizobium phaseoli 5,6
Diallo, Reinhold-Hurek y
Hurek, 2008
25 8 Rhizobium sp. 1,5,7,9,
10,13,17,2
2
11 Rhodobacter
capsulatus
1,3,4,5,
6,7,13,14,
15,19,22
3 Rhodobacter
sphaeroides
2,15,23
10 Sinorhizobium
meliloti
3,6,9,1
0,11,13,17
,18,22,23
2 Synechococcus sp. 1,5
3 Thiobacillus
ferrooxidans
1,2,14
2 Trichodesmium
thiebautii
2,5
3 Vibrio
diazotrophicus
5,6,15
2 Rhodospirillum
rubrum
9,14
1 Enterobacter
cloacae
9
105
3 Mesorhizobium loti 16,17,2
2
2 Azospirillum oryzae 18,25
1 Serratia marcescens 19
1 Pseudomonas putida 21
1 Agrobacterium
tumefaciens
21
1 Pseudomonas sp. 22
2 Pseudomonas
azotifigens
23,25
1 Stenotrophomonas
maltophila
24
Anexo 4.
Secuencias utilizadas para el diseño de los oligonucleótidos nifH 1.1 (microorganismos y códigos).
Bacteria Código NCBI
Bacillus cereus strain AY373369.1
Bacillus megaterium AY373365.1
Bacillus megaterium AY373367.1
Bacillus pumilus GU201866.1
Bacillus sp. AY373366.1
Bacillus sp. AY373371.1
Enterobacter oryzendophyticus JN698219.1
Enterobacter oryziphilus JN698220.1
Serratia liquefaciens strain KR150372.1
Serratia liquefaciens strain KR150371.1
Serratia liquefaciens strain KR150370.1
Serratia marcescens AB052653.1
106
Anexo 5.
Microorganismos y códigos del grupo 1.2 phoD
Bacteria Código secuencia (NCBI)
Bacillus subtilis AP012495.1[283743..286019]
AP012496.1[283745..286021]
Bacillus licheniformis CP000002.3[255216..257492]
Bacillus amyloliquefaciens CP002627.1[239049..241325]
FN597644.1[260973..263249]
HG328254.1[261053..263329]
Bacillus megaterium CP003017.1[192218..194506]
UFSS01000001.1[2804372..2806660]
Bacillus paralicheniformis CP005965.1[272237..274513]
Bacillus velezensis CP006890.1[248373..250649]
CP007165.1[286923..289199]
Bacillus atrophaeus CP007640.1[3845655..3847931]
CP011802.1[2272087..2274363]
Bacillus subtilis CP021507.1[300227..302503]
CP021921.1[294263..296539]
Bacillus firmus UFTC01000001.1[483489..485769]
Enterobacter cloacae FKIY01000004.1[130723..132753]
Klebsiella pneumoniae UFDM01000012.1[24318..26610]
UFDQ01000024.1[16703..18995]
Klebsiella variicola UKAL01000001.1[1645312..1646886]
Pseudomonas fluorescens AHPN01000001.1[3674005..3676047]
CP010896.1[2009418..2011464]
Pseudomonas synxantha AHPP01000002.1[1940955..1943001]
Pseudomonas protegens AP014522.1[5560695..5563096]
Pseudomonas chlororaphis AP014623.1[5485592..5488126]
UGUQ01000001.1[511689..513692]
Pseudomonas sp. AP014627.1[5567632..5570173]
AP014628.1[5508673..5511214]
Pseudomonas syringae CP006256.1[4970840..4972882]
Pseudomonas viridiflava LT855380.1[5089717..5091759]
Pseudomonas cerasi LT963395.1[477678..479720]
Pseudomonas putida MKZO01000017.1[259..1236]
Nota. En el anexo 5, los microorganismos subyarados pertenecen al grupo “Gram positivas” y los no
subrayados al grupo “Gram negativas”.
107
Anexo 6.
Microoganismos y códigos del grupo 2.1 nifH
Bacteria Código de secuencia (NCBI)
Acetobacter diazotrophicus AF030414.3[10610..11775]
AM889285.1[433396..434561]
Acidithiobacillus ferroxidans CP001219.1[1319786..1320943]
Anabaena cylindrica NC_019771.1[3935882..3937051]
Azospirillum brasilense X51500.1
CP007793.1[2052839..2053984]
Azospirillum lipoferum AP010946.1[872724..873889]
FQ311868.1[639267..640432]
NC_016622.1[639267..640432]
Azotobacter Chroococcum CP010415.1[142361..143498]
M73020.1[1..1307]
X03916.1
Azotobacter vinelandii CP001157.1[136628..137761]
CP005094.1[136628..137761]
Bradyrhizobium japonicum AH010242.2[49949..51098]
CP010313.1[8356772..8357921]
CP017637.1[9305297..9306446]
Bradyrhizobium sp. CP011360.1[1247823..1248972]
Clostridium pasteurianum CP013019.1[1208057..1209124]
CP013019.1[1514194..1515261]
CP013019.1[1524864..1525927]
CP013019.1[1526091..1527158]
Herbaspirillum seropedicae CP002039.1[3246176..3247317]
CP011930.1[3246702..3247843]
DQ073946.1
Klebsiella pneumoniae FLEC01000001.1[1611944..16130
89]
JRTV01000011.1[2755556..27567
01]
JX570695.1
Mesorhizobium
mediterraneum
GQ167280.1[1..927]
EU267716.1
Methylococcus capsulatus AE017282.2[226109..227254]
Paenibacillus azotofixans CP009288.1[1360163..1361304]
CP009288.1[2665371..2666446]
CP011114.1[491967..493108]
108
CP011114.1[1584557..1585632]
Pseudomonas stutzeri CP000304.1[1432131..1433276]
CP002622.1[1438181..1439326]
NC_017532.1[1438181..1439326]
Rhizobium etli NC_004041.2[323419..324580]
NC_010996.1[288826..289987]
NC_010996.1[383945..385106]
NC_011368.1[698929..700082]
NC_012848.1[308328..309481]
Rhizobium leguminosarum NZ_JH719381.1[5337873..533902
6]
CP009145.1[1065275..1066436]
JN624730.1
NZ_CP021801.1[969851..971012]
NZ_CP021827.1[641897..643058]
Sinorhizobium meliloti AF111110.2
Anexo 7.
Microorganismos y códigos del grupo 2.2 phoD
Bacteria Código NCBI
Bacillus
amyloliquefaciens
CP000560.1[263441..265717]
CP002627.1[239049..241325] (1)
CP021505.1[255093..257369]
FN597644.1[260973..263249] (1)
Bacillus subtilis CP011802.1[2272087..2274363]
CP021507.1[300227..302503]
Enterobacter sp. FKIY01000004.1[130723..132753] (1)
Methylobacterium sp. LQAN01000173.1[4898..6940]
Micrococcus sp. LS483396.1[679137..681320]
Nostoc sp. BA000019.2[2678379..2680448]
RSCN01000004.1[174828..176897]
Pseudomonas
aeruginosa
CP014948.1[1121832..1123862]
CP029605.1[1149028..1151058]
UWWR01000001.1[2335689..2337719]
UWXL01000001.1[3248381..3250411]
Rhodospirillum sp. CP000613.2[4261720..4264394]
Sinorhizobium meliloti CP001832.1[799914..801067]
109
HE995408.1[797643..798819]
zymomomas mobilis AY171597.1[1..1279]
CP023682.1[957468..959717]
CP023715.1[957468..959717]
L36230.1[1..2460]
Anexo 8
Secuencia consenso obtenida a partir del alineamiento de las secuencias del grupo 1.1.
CACGCCAAAGCACAGAACACCATTATGGAGATGGCGGCGGAAGTCGGCTCGGTCGAGGACCTGGA
ACTCGAAGACGTGCTGCAAATCGGCTACGGCGATGTSCGCTGCGCGGAATCCGGCGGCCCGGAGCCAG
GCGTCGGCTGCGCSGGACGCGGSGTGATCACCGCGATCAACTTCCTT
Anexo 9
Secuencia consenso obtenida a partir del alineamiento de las secuencias del grupo 1.2 Gram
positivas.
GGAGGCATTCTTGTNAAATTGNTCGGTGTTTTTTTANTTTTTAAGATTGTGAAGAAAAATAGGCAAAA
AGNGCGGTTGGCAAANGACAAGTTATACAGAAAACGGGGGATTTNGCCGGGTTGCGCCAAGTTTNGT
CGAAAGNNATGTGAANAATGTCTCTGTNNTTCATTTTCNGGGCTTACAATCCCTTCACACTTCTTCANA
GTCGTTTAACAATNATTTCNTATAATGAAGGCGATCAATGAGAAGANAGGGGANCTGAAATGACACA
TGACNGTCGTTTAGATGAATGGATNAAGAAATTGAAGGAGGAAAGCTTTCAGAACAATACGTTTGACC
GCCGCCGATTTATNCAAGGAGCGGGGAAAATCGCCGGTCTTTCTCTCGGNTTANCGATTGCGCAGTCG
ATCGGNGCNTTTGAAGTNAATGCCGCGCCTAAATTCTCAANCTATCCGTTNACACTCGGCGTAGCTTC
110
AGGAGANCCGCTNTCTGACAGCGTCGTTCTTTGGACACGTCTTGCACCAGATCCGCTGAATGGCGGCG
GAATGCCGAAGCAAGCTGTGCCNGTAAAATGGGAGCTCGCCNANGATGAACATTTCCGCCAAATCGT
CAAACGCGGAACGGAAATGGCCAANCCGAATCTTGCACACTCCGTCCATGTCGAAGCGGACGGGCTT
AAGCCAAATAAAGTGTACTATTACCGTTTTAAAAGCGGCCATGAGCTAAGCCCTGTCGGNAAAACAAA
AACNCTGCCTGCCCCCGGTGCAGATGTNTCGNAAATGACGTTTGCATTTGCTTCATGCCAGCANTATG
AACACGGCTATTATACGGCCTATAAGCATATGGCGAAGGAAAAGCTTGATCTTGTCTTCCATCTCGGC
GATTACATTTATGAATACGGACCGAATGAATATGTGTCAAAAACAGGAAATGTCCGCACGCACAGCA
GCGCGGAAATCATTACGCTGCAAGATTACCGAAACCGTCATGCCCAATACCGTTCTGATGCCAATCTG
AAAGCTGCCCANGCCGCATTTCCGTGGGTTGTGACNTGGGATGACCATGAAGTGGAAAACAACTATGC
CAATNTAATCCCTGAAAAAGGCCAGTCGGTTGAAGCATTTGTGCTCCGCCGNGCCGCAGCTTATCAGG
CTTATTATGAACATATGCCGCTCCGCCGCACCTCTTTGCCGAACGGTCCTGATATGCAGCTGTACCGGC
ACTTTTCTTATGGNAANTTNGCGTCNTTCAATGTGCTTGATACNCGACAGTACAGAGANGACCAAGCC
AANGGCGACGGGAATAAGCCGCCTTCTGATGAATCGCGTGATCCGAAGCGGACANTGCTGGGGAAAG
AACAGGAGCAATGGCTNTTCAACAATTTGGGCAGCTCAACAGCGCACTGGAATGTGCTGGCGCAGCA
NATTTTCTTTGCNCAATGGAATTTCGGGACAAGCGCAAATCCGATATACAGCATGGATTCATGGGACG
GCTACCCGGCTCAGCGCGAGCGGGTCATCAATTTTATTAAAAGCAAAAATCTGAACAATGTCNTCGTA
CTGACGGGTGATGTTCACGCAAGCTGGGCATCGAATCTGCATACCGATTTTGATAAAACNAATTCAAA
AATTTTCGGAGCCGAATTCGTCGGNACCTCCATTACATCNGGAGGGAACGGAGCGGATAAACGAGCG
GATACGGATCANATTTTAAAACAAAATCCGCACATNAAGTTTTTNAACGATTATCGCGGCTATGTCCG
CTGTACGGTGACGCCTGACCAATGGAGAGCGGATTATCGGGTGGTGCCGTTTGTGACNGAGCCGGGGG
CAGNGATTTCCACGCGGGCTTCATTCGTTTATCAGAAAGACCAAACNGGGNTGAGNAAGGTCTCTTCA
ACCNCNGTTCCAGGCGGCTTGAAGCAGTCAAACGAGGTNGAAGAGGATCGTTTCTTTGCCCATAACAA
AGCCCANGAAAANCAAATGATAAAGAAGCGGGCAAAAATCACACAATAAGGAGTGAAACATCATGTT
TTCAAATATCGGNATTCCCGGTTTGATCCTGATTTTCGTCATCGCTCTCATCATTTTTGGACCTTCAAAG
CTTCCGGAAATCGGCCGTGCCGCCGGACGGACNCTGCTTGAATTTAAAAGCGCCNCAAAATCACTGGT
GTCAGATGATGAAAAAGAAAAGGAATCAGCTACGGCGGCTNAGCAAGACAAAACGGCGGGCTGAAT
GCTGATAGGAGGCAGACGACCGGGTCTGCCTCTTTTTT
111
Anexo 10.
Secuencia consenso obtenida a partir del alineamiento de las secuencias del grupo 1.2 Gram
negativas.
CCCCAACGTCCCGGTGGCGCACTTTCTGTGCCAGGGGGCCGCCGCCTACCAGGCCTTTTTCGAACA
CATGCCGTTGCGCTCCAGCAGCTTGCCCAAAGGCCCGGAATGCGTATTTACCGCCATCTGGACTACGG
CCGTCTGGTCCACTTCACGTGCTGGACGTTCGGCAGTACCGTTACGAGCAGCCCTGCATCCCGGCCAAT
GGCAGCCAGCAGGAGCATGTGGCGACTGGCGCGACCTGCGCAACCCGGGCCGCACTTTGCTCGGCTG
GAAACAGAAGGCCTGGCTGGACCACAACTTGAACCACTCGACCGCGCAATGGAATATCATCGCCCAG
GATGTGCTGATCGCCCGGCTCAAGCTGAGCGATCCGGTGAACC
112
Anexo 11.
Alineamiento de todas las secuencias del grupo 2.1
113
Anexo 12.
Alineamiento de todas las secuencias del grupo 2.1