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Implicación de los Metales y Elementos Traza en la enfermedad de Alzheimer y su asociación con los agentes del Estrés Oxidativo sistémico
Natividad López Riquelme
DEPARTAMENTO BIOTECNOLOGÍA Y BIOMEDICINA
TESIS DOCTORAL
Implicación de los Metales y Elementos Traza en la
enfermedad de Alzheimer y su asociación con los
agentes del Estrés Oxidativo sistémico
NATIVIDAD LÓPEZ RIQUELME 2011
Implicación de los Metales y Elementos Traza en la
enfermedad de Alzheimer y su asociación con los
agentes del Estrés Oxidativo sistémico
Memoria presentada por
NATIVIDAD LÓPEZ RIQUELME
Para optar al grado de doctor
Tesis realizada bajo la dirección de la Dra. Consuelo Tormo Díaz
Consuelo Tormo Natividad López Mayo 2011
Agradecimientos
Cuando empecé mi formación como residente en el Servicio de Análisis Clínicos del Hospital
General Universitario de Elche, no sabía que ésta sería muy gratificante tanto a nivel
profesional como personal. Esta formación supuso una oportunidad para introducirme en el
campo de la investigación.
Después de cuatro años trabajando en este proyecto, quiero dar las gracias a todas las
personas que de una u otra forma han intervenido en esta Tesis.
Un papel fundamental ha estado en mi directora de tesis, la Dra. Consuelo Tormo Díaz, a la
que quiero agradecer la confianza depositada en mí desde el principio, su dedicación
absoluta en este trabajo, su paciencia y sobretodo su amistad.
Tampoco puedo olvidarme de todos aquellos que sin su ayuda todo esto habría sido una
misión imposible.
El Dr. Jordi Alom, una ayuda imprescindible ya que sin él no tendría pacientes a los que
estudiar. Quiero expresarle mi agradecimiento por todas sus sugerencias e ideas a la hora de
elaborar este proyecto. También a la Dra. Llinares Ibor por su ayuda y colaboración en la
evaluación de pacientes y revisión de historias clínicas.
A David Apraiz y al equipo de Espectrofotometría del laboratorio LABAQUA por su
colaboración en la determinación de metales.
A Daniel y María por su orientación en el análisis estadístico.
Al equipo de enfermería del laboratorio de Análisis Clínicos del Hospital General de Elche, por
su colaboración en la extracción de muestras, Yolanda, Gema
A los adjuntos y residentes del servicio de análisis clínicos, por los buenos y malos ratos que
hemos pasado juntos, por su apoyo y amistad.
A todo el personal del servicio de análisis clínicos del hospital de Elche por su acogida desde
el primer momento y el apoyo recibido durante los años de mi formación, que también han
contribuido a la realización de este trabajo, por su espíritu de ayudar y facilitar la tarea
estando en todo momento atentos con mis pacientes.
A los familiares de los pacientes con Alzheimer que permitieron que formaran parte del
estudio y a los pacientes que participaron voluntariamente.
A mis padres, por dármelo todo en esta vida y porque siempre han estado animándome y
confiando en que sería la primera.
A mis hermanos, familiares y amigos por su constante ánimo y estímulo.
A mi marido que ha vivido conmigo mis ilusiones, mis desganas, mis agobios y mi alegría,
mostrándome en todo momento una compresión paciente y un apoyo constante, que ha
posibilitado que esta Tesis Doctoral, viera la luz.
Finalmente, deseo hacer constar mi agradecimiento a la Fundación para la investigación
Biomédica del Hospital General Universitario de Elche por el apoyo mostrado al financiar el
proyecto de investigación MARCADORES BIOLOGICOS PARA EL DIAGNOSTICO PRECOZ DEL
DETERIORO COGNITIVO LIGERO POR ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (Fibelx 01/2006). Fruto
del cual ha sido posible la realización de la presente Tesis.
A todos vosotros, muchas gracias
ÍNDICE
1 INTRODUCCION PÁGINA
1.1. EL ENVEJECIMIENTO 4
1.2. DETERIORO COGNITIVO LEVE O LIGERO 5
1.3. DEMENCIAS 7
1.4. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER 11
1.4.1. Etiología y epidemiología de la enfermedad de Alzheimer 17
1.4.2. Hallazgos patológicos 20
1.4.2.1. Formación placas amiloides 21
1.4.2.2. Formación ovillos neurofibrilares 22
1.5. ESTRÉS OXIDATIVO 23
1.5.1. Implicaciones del estrés oxidativo en la enfermedad 27
neurodegenerativa
1.5.2. Agentes implicados en el mantenimiento del estatus 29
oxidativo sistémico
1.5.2.1. Antioxidantes endógenos 31
1.5.2.1.1. Antioxidantes enzimáticos 31
1.5.2.1.1.1. Superóxido Dismutasa 32
1.5.2.1.1.2. Glutatión Peroxidasa 33
1.5.2.1.1.3. Glutatión Reductasa 35
1.5.2.1.2. Antioxidantes no enzimáticos 35
1.5.2.2. Antioxidantes exógenos 36
1.5.2.2.1. Vitamina E 37
1.5.2.2.2. Vitamina A 38
1.5.3. Productos del estrés oxidativo : Malondialdehido 38
1.5.4. Aspectos generales de los Metales y Elementos Traza y su 41
relación con el estrés oxidativo en la enfermedad
neurodegenerativa
1.5.4.1. Aluminio 43
1.5.4.2. Cadmio 44
1.5.4.3. Cobalto 45
1.5.4.4. Cobre 45
1.5.4.5. Cromo 46
1.5.4.6. Hierro 47
1.5.4.7. Manganeso 48
1.5.4.8. Mercurio 49
1.5.4.9. Níquel 50
1.5.4.10. Selenio 50
1.5.4.11. Vanadio 52
1.5.4.12. Zinc 52
2 HIPÓTESIS DE TRABAJO 57
3 OBJETIVOS 61
4 SUJETOS A ESTUDIO
4.1. RECLUTAMIENTO DE PACIENTES Y CONTROLES 65
4.2. SELECCIÓN DE PACIENTES Y CONTROLES 65
4.3. ESTUDIO GENERAL DE LOS PACIENTES Y CONTROLES 67
5 MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN 73
6 METODOLOGÍA
6.1. OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS 81
6.2. DETERMINACIÓN DE LOS PERFILES ANALITICOS BASICOS 82
(BIOQUÍMICO, HEMATOLÓGICO Y HORMONAL)
6.3. MÉTODOS ANALÍTICOS EN EL ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO 83
6.3.1. Determinación de la actividad de enzimas antioxidantes 83
6.3.1.1. Determinación de la actividad Superóxido Dismutasa 83
6.3.1.2. Determinación de la actividad Glutatión Peroxidasa 86
6.3.1.3. Determinación de la actividad Glutatión Reductasa 88
6.3.2. Determinación de Vitaminas antioxidantes 89
6.3.3. Determinación de Malondialdehído 92
6.3.4. Determinación de Metales y Elementos Traza 94
6.4. PRESTACIONES DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS EN EL ESTUDIO 97
DEL ESTRÉS OXIDATIVO
6.4.1. Métodos de determinación de enzimas antioxidantes, 97
Vitaminas A y E y Malondialdehido
6.4.2. Optimización del método de ICP-MS para la determinación 102
de Metales en suero sanguíneo
6.5. MÉTODOS ESTADÍSTICOS 103
7 RESULTADOS
7.1. CARACTERISTICAS GENERALES DE LA POBLACION A ESTUDIO 109
7.2. ESTUDIO ANALÍTICO GENERAL DE LOS SUJETOS A ESTUDIO 111
7.3. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LOS AGENTES IMPLICADOS EN EL 113
METABOLISMO OXIDATIVO EN LA POBLACIÓN A ESTUDIO
7.3.1. Resultados de los Metales y Elementos Traza 113
7.3.2. Resultados de las defensas antioxidantes 116
7.3.2.1. Resultados de los antioxidantes endógenos 116
7.3.2.1.1. Actividades enzimáticas 116
7.3.2.1.2. Antioxidantes no enzimáticos 117
7.3.2.2. Resultados de los antioxidantes exógenos 118
7.3.3. Resultados de los productos del estrés oxidativo: MDA 119
7.4. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS DE LOS AGENTES DEL METABOLISMO 120
OXIDATIVO EN EL DETERIORO COGNITIVO LEVE
7.5. ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN DE LOS DIFERENTES AGENTES 125
IMPLICADOS EN EL ESTRÉS OXIDATIVO
7.5.1. Correlaciones del MDA 125
7.5.1.1. Correlación de los niveles de lípidos y MDA 125
7.5.1.2. Correlación de los niveles de agentes antioxidantes y MDA 126
7.5.1.3. Correlación de los niveles de Metales y Elementos Traza y MDA 127
7.5.2. Correlaciones de los Metales y Elementos Traza 128
7.5.2.1. Correlación de los niveles de enzimas antioxidantes con los 128
niveles de Metales y Elementos Traza
7.5.2.2. Correlación entre los niveles de vitaminas antioxidantes con 130
los niveles de Metales y Elementos Traza
7.6. ESTUDIO DE LA PRECISIÓN DIAGNÓSTICA DE LOS AGENTES DEL 131
METABOLISMO OXIDATIVO PARA LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
7.7. ANÁLISIS DE REGRESIÓN LOGÍSTICA 135
8 DISCUSIÓN 141
9 CONCLUSIONES 157
10 BIBLIOGRAFÍA 161
11 ANEXOS 179
ANEXO I. Test de Mini Mental State Examination 179
ANEXO II. Hoja de Información al Pacientes y Consentimiento 180
Informado
ANEXO III. Optimization of the trace elements Determination by 184
ICP-MS in human blood serum. Journal of trace
elements in Medicine and Biology. Volumen 21,
supplement 1, 11 December 2007, Pages 14-17
ANEXO IV. Rangos de referencia de las determinaciones de 188
laboratorio en población normal
ABREVIATURAS
- 4-HNE: 4-Hidroxinonenal
- AC: Acetilcolina
- ACE: Acetilcolinesterasa
- ADN: Ácido desoxirribonucleico
- ADP: Adenosin difosfato
- Al: Aluminio
- APA: Asociación Americana de Psiquiatría
- ApoE: Apolipoproteína E
- APP: Proteína Precursora Amiloide
- ARN: Ácido ribonucleico
- ATP: Adenosin trifosfato
- BCE: Butirilcolinesterasa
- Cd: Cadmio
- CIE: Clasificación Internacional de Enfermedades
- Co: Cobalto
- CO2: Dióxido de carbono
- Cr: Cromo
- Cu: Cobre
- DCL: Deterioro Cognitivo Leve
- DHPR: Dihidropterina reductasa
- DPZ: Donepezilo
- DSM: Manual de Diagnóstico Estadístico
- EDTA: Ácido etilendiamino tetracético
- EO: Estrés oxidativo
- EROs: Especies Reactivas de Oxígeno
- Fe: Hierro
- GPx: Glutatión Peroxidasa
- GR: Glutatión Reductasa
- GSH: glutatión reducido
- GSSG: glutatión oxidado
- GTM: Galantamina
- H2O2: Peróxido de hidrógeno
- Hg: Mercurio
- HGU: Hospital General Universitario
- HNE: hidroxinonenal
- IACE: Inhibidores de la Acetilcolinesterasa
- ICP: plasma acoplado inductivamente
- LCR: Líquido Cefalorraquídeo
- MDA: Malondialdehido
- Mg: Magnesio
- MMSE: Mini Mental State Examination
- Mn: Manganeso
- MS: espectroscopia de masas
- NADPH: Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato
- Ni: Níquel
- NMDA: N-Methyl-D-Aspartate
- O2: Oxígeno
- O2-: Anión superóxido
- OES: espectrometría de emisión óptica
- OMS: Organización Mundial de la Salud
- P: Fósforo
- PCR: proteína C reactiva
- PS1: Presenilina 1
- PS2: Presenilina 2
- PUFAs: Ácidos grasos poliinsaturados
- RL: Radicales libres
- RNS: Especies Reactivas de Nitrógeno
- Se: Selenio
- SN: Sistema Nervioso
- SNC: Sistema Nervioso Central
- SOD: Superóxido Dismutasa
- TBARS: Sustancias Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico.
- V: Vanadio
- VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana
- Zn: Zinc
INTRODUCCIÓN
Introducción
3
La enfermedad de Alzheimer es la principal causa de demencia entre los ancianos, salvo en
los japoneses, donde predomina la demencia vascular. Se trata de una enfermedad de
patogenia compleja, en ocasiones aparentemente hereditaria que se caracteriza, desde el
punto de vista anatómico, por la pérdida de neuronas y sinapsis y la presencia de placas
seniles y degeneración neurofibrilar (Boller 1997). Clínicamente se expresa como una
demencia de comienzo insidioso y lentamente progresiva, que habitualmente se inicia con
fallos de la memoria reciente y termina con un paciente postrado en cama, totalmente
dependiente (Donoso 2001).
La enfermedad de Alzheimer recibe este nombre en honor a las contribuciones científicas de
Alois Alzheimer (Munich, 1864-1915) sobre un tipo de desorden neuropsiquiátrico. Esta
enfermedad es una de las demencias más comunes en el anciano y corresponde a un
desorden neurodegenerativo que afecta alrededor del 6.1% de la población mayor de 65
años (Hendrie 1998; Chen 2009; Hesse 2009). Se estima que existen actualmente unos 35
millones de personas que la padecen en el mundo. Se calcula que esta cifra se duplique cada
20 años, hasta los 65,7 millones en 2030 y los 115,4 millones en 2050. Gran parte de este
crecimiento se puede atribuir claramente al incremento en el número de personas con
demencia en países de renta baja y media. En España, el número de afectados supera los
800.000 enfermos, aunque oficialmente sólo hay registrados 650.000 (datos recogidos de la
Fundación Alzheimer España, 2011). El envejecimiento de la población española explica estas
cifras. De hecho, la incidencia de esta patología aumenta rápidamente con la edad,
multiplicándose por dos cada cinco años a partir de los 65, llegando a afectar entre el 20% y
el 30% de las personas de más de 85 años (Chen 2009). Así, este tipo de demencia afecta a
uno de cada cinco españoles mayores de 80 años, pero más del 10% de los 800.000 pacientes
que hay en España tienen menos de 65 años. Algunos datos parecen indicar que las mujeres
tienen mayor riesgo de padecer Alzheimer que los hombres, los cuales tienen mayor riesgo
de sufrir demencias vasculares (Chen 2009; Musicco 2009).
La enfermedad de Alzheimer es la 7ª causa de muerte en el mundo, tiene un coste de 172 mil
millones de dólares anuales y da lugar a 10,9 millones de cuidadores sin sueldo. Por ello, sin
Introducción
4
duda, es uno de los trastornos neuropsiquiátricos que concentra hoy en día más
investigación básica y clínica, mayor preocupación en familiares y autoridades de salud y
creciente curiosidad en los medios de comunicación.
1.1. EL ENVEJECIMIENTO
El envejecimiento es un proceso degenerativo multifactorial cuyo grado y velocidad varía
ampliamente de unos individuos a otros de la misma especie dependiendo de los factores
internos y externos a los que puedan verse expuestos a lo largo de su vida. El grado de
deterioro es distinto de un órgano a otro en cada individuo y afecta a todas las células de los
seres vivos, las cuales, con el paso del tiempo, se ven sometidas a un deterioro que puede
conducirlas a la muerte. Todos los órganos y sistemas del individuo sufren este proceso,
incluido el Sistema Nervioso (SN).
En cuanto al SN, hay que resaltar que las neuronas no tienen la capacidad de dividirse, lo que
impide la recuperación de las células perdidas, pero presentan una elevada capacidad de
adaptación que puede suplir las funciones de otras células que se mueren. La diferencia
fundamental entre el envejecimiento fisiológico y las enfermedades neurodegenerativas,
como el Alzheimer, es la pérdida de esta capacidad de adaptación para hacer frente al
deterioro senil.
Los cambios involutivos del cerebro senil debidos al envejecimiento del Sistema Nervioso
Central (SNC) han sido ampliamente investigados y se ha encontrado que son numerosos,
afectando, en mayor o menor grado, a todas las áreas mentales, comportamentales,
emocionales, sensitivas y motoras del cerebro, pero sin llegar a producir una gran
discapacidad como ocurre en las enfermedades neurodegenerativas (Martínez-Lage 2007). La
enfermedad de Alzheimer ha sido definida como un envejecimiento acelerado del organismo.
En muchos aspectos esto es así, ya que muchas de las características del envejecimiento
fisiológico se observan en los pacientes con Alzheimer, aunque en un grado mayor de
afectación.
Introducción
5
El envejecimiento sin ningún tipo de enfermedad y sin alteraciones funcionales menores
importantes es excepcional; por tanto, se considera normal un cierto grado de afectación
funcional que no impida la realización de actividades físicas o intelectivas (Martínez-Lage
2007). Establecer las diferencias entre el envejecimiento fisiológico y un cierto grado de
deterioro cognitivo constituye uno de los aspectos a estudio más importantes para evitar la
progresión a la demencia senil.
1.2. DETERIORO COGNITIVO LEVE O LIGERO
Hoy en día debe considerarse un objetivo prioritario en los pacientes con deterioro de
funciones cognitivas la precocidad en su detección. Por este motivo presenta gran interés el
estudio de los pacientes con deterioro cognitivo ligero (DCL) (Petersen 1999, 2009; Robles
2002). Este grupo de pacientes se caracteriza por presentar una alteración adquirida de una o
más funciones cognitivas, pero que todavía no son suficientemente intensas como para
reunir criterios clínicos de demencia, ya que estos sujetos son capaces de mantener una vida
social o laboral normal (Luis 2003).
Deterioro cognitivo ligero es el término usado para describir un nivel de función cognitiva
que refleja un estado intermedio entre envejecimiento normal y demencia y puede implicar
un estado de pre-enfermedad de Alzheimer o, en general, un estado de pre-demencia (Luis
2003). El desenlace en cada caso de DCL es incierto, sin embargo, muchos sujetos con DCL
permanecen estables o, a veces, revierte a un estado cognitivo normal y aproximadamente
un 15% de ellos evolucionan a Alzheimer (DeCArli 2003).
El diagnóstico del DCL se basa en la objetivación del deterioro cognitivo, a través de pruebas
neuropsicológicas estandarizadas, con puntos de corte apropiados para la edad y el nivel
académico del sujeto, teniendo en cuenta su actividad profesional presente o pasada. Es
necesario constatar que las alteraciones son adquiridas mediante la declaración de un
informador fiable o bien por su objetivación en exploraciones diferentes. Las pruebas de
neuroimagen también pueden ayudar tanto en el diagnóstico diferencial del DCL como a la
Introducción
6
monitorización de los cambios que pueden tener lugar en el paciente. En general, las pruebas
de neuroimagen demuestran que el DCL comparte características con la enfermedad de
Alzheimer.
Existen varios criterios para el diagnóstico del DCL, pero los más aceptados y utilizados son
los de Petersen et al (1999):
- Pérdida de memoria, referida por el paciente o por un informador fiable.
- Facultad de memoria inferior en 1.5 SD (desviaciones estándar) o más por debajo de
la media para su edad.
- Cognición general normal.
- Normalidad en las actividades de la vida diaria.
- Ausencia de criterios diagnósticos de demencia.
La duración del DCL es imprecisa, aunque al menos se suele prolongar varios meses. Puede
ser transitorio y reversible, o estacionario y con pocas variaciones en largos períodos de
tiempo, o progresivo y convertirse en demencia sin un momento de transición claramente
definido.
Las etiologías del deterioro cognitivo ligero que va a evolucionar a demencia serían
obviamente las mismas que las de la demencia y, por tanto, es muy importante evaluar y
constatar precozmente el perfil de los defectos cognitivos presentes, con el fin de poder
realizar un estudio adecuado en cada caso que permita su identificación para la rápida
instauración del tratamiento farmacológico correspondiente.
Actualmente no existe ningún método clínico para determinar si un paciente con DCL tiene
un Alzheimer incipiente o tiene una forma “benigna” de DCL sin ninguna progresión. La
conversión de DCL a enfermedad de Alzheimer está cerca del 15% por año (DeCArli 2003).
Debido a que la pérdida de la función cognitiva es irreversible por cada mes que un DCL
Introducción
7
moderado evoluciona a Alzheimer sin tratamiento y porque el tratamiento con inhibidores
de la Acetilcolinesterasa (IACE) reduce el deterioro cognitivo en pacientes con Alzheimer
tratados durante 5 años en un 50% aproximadamente (Farlow 2002) es importante detectar,
diagnosticar y tratar la enfermedad de Alzheimer tan pronto como sea posible. Esto lleva a la
necesidad de encontrar unos biomarcadores diagnósticos para identificar pacientes con
Alzheimer incipiente en los casos de DCL (Blennow 2004; Henley 2005; Marksteiner 2007).
1.3. DEMENCIAS
La demencia es una patología asociada al envejecimiento y según la Organización Mundial
de la Salud (OMS) se define como “un síndrome debido a una enfermedad del cerebro,
generalmente de naturaleza crónica o progresiva, en la que hay déficit de múltiples funciones
que repercuten en la actividad cotidiana del enfermo”. Entre las funciones que el enfermo va
perdiendo figuran la memoria, el entendimiento, el juicio, el habla, el cálculo, el
pensamiento, la orientación, etc… No todas las funciones se alteran simultáneamente, sino
que es un proceso continuo en el que cada vez se percibe mayor número de funciones
afectadas y con mayor deterioro, siendo generalmente la memoria la primera observación
de alteración que percibe el enfermo o sus parientes más próximos. La pérdida única de la
memoria sería una amnesia y el deterioro único de la misma, dismnesia. En ningún caso, si
no existe otra alteración cognoscitiva se puede hablar de demencia.
Es importante en la evaluación de personas con problemas de memoria considerar que no
todo el que presenta fallos de memoria tiene demencia. Hay varias condiciones que imitan la
clínica de la demencia y que pueden ser ignoradas si el clínico no se preocupa de buscarlas
activamente. Los principales diagnósticos alternativos a la demencia son el delirio, la
depresión y las alteraciones cognitivas por fármacos (Martínez-Lage 2007).
El diagnóstico de demencia, se hace siguiendo las recomendaciones propuestas por la OMS,
en la Décima Clasificación Internacional de Enfermedades (CIE-10) (WHO 1988) y por la
Introducción
8
Asociación Americana de Psiquiatría (APA) recogido en el Manual de Diagnóstico Estadístico
(DSM-IV) (American 1991), y son las siguientes:
Según la CIE-10 en la demencia se encuentran estos síntomas (que pueden evaluarse
objetivamente con pruebas específicas):
- Deterioro de la memoria: alteración para registrar, almacenar y recuperar información
nueva. Pérdida de contenidos amnésicos, o memorizados, relativos a la familia o al
pasado.
- Deterioro del pensamiento y del razonamiento: la demencia es más, y más profunda y
anómala, que una dismnesia o alteración patológica de la memoria. Existe reducción en el
flujo de ideas, deterioro en el proceso de almacenar información y dificultad para prestar
atención a más de un estímulo a la vez y para cambiar el foco de atención.
- Interferencia en la actividad cotidiana.
- Existe conciencia, clara inicialmente, pero hay la posibilidad de superposición entre
delirio y demencia.
Según la DSM-IV para diagnosticar demencia tienen que existir:
a) Pruebas evidentes de deterioro de la memoria a corto y largo plazo.
b) Al menos uno de los siguientes síntomas:
-Deterioro del pensamiento abstracto.
-Deterioro de la capacidad del juicio.
-Otros trastornos de las funciones corticales posteriores, como afasia, apraxia, agnosia y
"dificultades constructivas".
-Modificaciones en la personalidad.
c) La alteración en a) y b) debe interferir de forma significativa en las actividades laborales o
sociales habituales, o en las relaciones con los demás.
d) Debe estar presente de manera continuada y no aparecer exclusivamente durante el curso
de un "delirium".
Introducción
9
e) Tiene que existir una de estas dos razones para la demencia:
-Una causa demostrable específica que se estima bien relacionada con esta alteración clínica.
-Puede presuponerse que existe demencia cuando no exista ningún tipo de trastorno mental
al que pueda achacarse la patología que se observa (diagnóstico de exclusión) (este es el caso
típico de las demencias neurodegenerativas como el Alzheimer).
Para realizar el diagnóstico de demencia tanto para la CIE-10 o la DSM-IV, además es
necesario:
-Que los síntomas estén presentes y/o progresen al menos durante seis meses y que estos
sean demostrados por exploración psicopatológica y testimoniadas por un informador fiable.
-Que se afecte más de una función cognoscitiva.
-Que haya una causa de demencia.
La historia clínica y la evaluación neuropsicológica también son dos componentes esenciales
para el diagnóstico de la demencia.
A través de la historia clínica se recoge información sobre la vida sanitaria, cultural y social
del paciente, los antecedentes familiares sobre enfermedades relacionadas con la demencia,
las funciones cognoscitivas que se han visto afectadas, en qué orden y cómo es la forma y el
tiempo de evolución, los trastornos conductuales y los cambios de personalidad, la capacidad
del individuo para realizar sus actividades de la vida diaria y mantener las relaciones sociales
y laborales, la confirmación, por parte del informador próximo a su entorno cotidiano, de los
problemas que describe el paciente y, es interesante incluir también, la valoración que el
propio sujeto hace de su enfermedad y de su repercusión en la vida diaria.
La evaluación neuropsicológica aporta un estudio cualitativo y funcional del deterioro
intelectual. Estos estudios neuropsicológicos son específicos de la persona y sirve para
valorar la orientación, la memoria, el cálculo, el lenguaje, las praxias, la abstracción y la
conceptualización, las funciones ejecutivas y sobre todo la influencia de sus posibles
Introducción
10
alteraciones en las actividades de la vida diaria. Para evaluar las demencias se pueden utilizar
un gran número de test de detección entre los que destaca el Mini Mental State Examination
(MMSE) de Folstein (1975), muy utilizado por su sencillez y rapidez (Anexo I). El MMSE es una
de las pruebas más utilizadas a escala mundial para detectar y seguir la evolución del
deterioro cognitivo. Es cierto que la interpretación de sus resultados depende de factores
como la edad y el nivel educativo pero, en general, los pacientes que presentan déficit
cognitivo en dos ó más áreas suelen obtener una puntuación inferior a 24.
El examen cognoscitivo del paciente, el registro de las manifestaciones mostradas por el
sujeto durante la entrevistas, la exploración neurológica, los datos de los fármacos que toma,
la evaluación neuropsicológica y una entrevista psiquiátrica estructurada a un familiar o
cuidador, nos lleva a detectar de forma global el deterioro cognoscitivo y el grado de
evolución del trastorno.
Además de ello se realizan exámenes neurológicos, para detectar alteraciones focales
(tumoraciones, hematomas, etc…) y pruebas de laboratorio como: hemograma, bioquímica,
análisis de orina, hormonas tiroideas, vitaminas B12 y ácido fólico, serología luética, análisis
del líquido cefalorraquídeo (LCR), VIH, radiografía de tórax, electrocardiograma,
electroencefalograma, electromiografía, arteriografía, resonancia magnética, etc… para
poner de manifiesto todas las posibles causas de demencias o descartar algún tipo de
patología subyacente.
Las demencias se pueden clasificar en función a la edad de inicio, la causa o etiología, los
signos neurológicos acompañantes y si son o no tratables. En España los casos de demencia
no han dejado de aumentar debido al envejecimiento de la población. Entre el año 1990 y el
1995 se incrementaron en un 13%, entre el 1995 y el 2000 en un 10,5%, y entre el año 2000 y
2005 en un 3%.
De todos los tipos de demencias, el Alzheimer y la demencia de tipo vascular suponen
conjuntamente más del 90% de los casos (Chen 2009). La incidencia de demencias por
enfermedades neurodegenerativas es infinitamente superior en los ancianos, mientras que
Introducción
11
las demencias por consumo de substancias neurotóxicas es patrimonio de los jóvenes, salvo
los casos de adicción a ciertos medicamentos en personas de mayor edad.
1.4. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
La enfermedad de Alzheimer, según la CIE-10 se define como una demencia. La enfermedad
se caracteriza por un deterioro progresivo e irreversible de las funciones cerebrales
superiores o cognoscitivas, con pérdida de memoria, juicio y lenguaje, es decir clínicamente
se manifiesta como una demencia siendo además la forma más frecuente de demencia.
La pérdida de memoria y los cambios de humor y de comportamiento pueden ser los
primeros síntomas. El avance progresivo de la enfermedad agrava el estado del paciente,
provocándole dificultad para comunicarse, desorientación en el tiempo y en el espacio,
imposibilidad para reconocer a familiares y amigos y pérdida de la identidad personal, entre
otros síntomas. El paciente ve mermada su autonomía y necesitará ayuda para llevar a cabo
necesidades básicas, como las relativas a la higiene personal o la alimentación.
El periodo evolutivo puede ser corto, 2 o 3 años en algunos casos extremos, o bastante largo
de 10 a 12 años. El conocimiento que se tiene actualmente de ella es muy extenso, aunque
aún se desconoce la causa y patología, lo que impide que se disponga de un tratamiento
curativo o preventivo. La opinión más general es que la enfermedad de Alzheimer tiene un
origen multifactorial con predisposición genética e influencia de factores ambientales
desconocidos (Munoz 2000).
El factor edad se ha identificado como un desencadenante del Alzheimer, por lo que,
mayoritariamente afecta a personas mayores de 65 años y su incidencia aumenta con la edad
(Chen 2009). Sin embargo, excepcionalmente, puede afectar a personas con edades
comprendidas entre los 30 y los 50 años.
Introducción
12
La enfermedad de Alzheimer se puede clasificar en distintos tipos, según hagamos referencia
a distintos aspectos, así:
I. Según la edad de inicio, la enfermedad de Alzheimer puede ser:
-Presenil o temprana, de inicio precoz, generalmente con clara relación familiar. Comienza
antes de los 60 años y constituye entre el 0,5-2,5% de los casos de Alzheimer (Chen 2009). En
ella el deterioro cognitivo es más rápido y las alteraciones del lenguaje son más importantes,
las alteraciones neuroquímicas mayores, la afectación de los sistemas de neurotransmisión y
neuromodulación más amplia, las lesiones elementales más intensas, la degeneración de la
sustancia gris más notable y la pérdida neuronal más grave.
-Senil o tardía, de inicio tardío, aparece después de los 65 años, es muy heterogénea y su
etiopatogenia es probablemente multifactorial. Este tipo representa más del 95 % de los
casos de Alzheimer (Chen 2009) y parece estar más relacionada que la presenil con el
proceso de envejecimiento normal y con las alteraciones que aparecen en los ancianos
mayores de 80 años. En esta forma el componente de confusión mental es más intenso y las
alteraciones de la marcha más frecuentes.
II. Según la etiología probable, la enfermedad de Alzheimer puede ser:
-Familiar: cuya causa es genética, coincidiendo en la mayoría de los casos con la enfermedad
de Alzheimer presenil. Ocurre entre el 1% y el 5% de los casos de forma autosómica
dominante por alteraciones (mutaciones) en tres genes principalmente: el gen de la Proteína
Precursora Amiloide (APP) situado en el cromosoma 21; el gen de la Presenilina 1 (PS1), en el
cromosoma 14; y el gen de la Presenilina 2 (PS2), en el cromosoma 1 (Zekanowski 2004;
Hoenicka 2006).
-Esporádica: coincide generalmente con los casos de enfermedad de Alzheimer senil,
comienza en personas mayores de 65 años y es el tipo más común. Su causa es aún
desconocida, aunque se han descrito distintos factores genéticos que aumentan el riesgo de
padecer la enfermedad, como es la presencia del alelo 4 de la apolipoproteína E (ApoE),
localizado en el cromosoma 19 (Mayeux 1993; Hoenicka 2006).
Introducción
13
Una de las definiciones más comunes del diagnóstico de Alzheimer es la que aporta el
Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Comunicativos e Ictus - Asociación de
enfermedad de Alzheimer y Trastornos Afines (National Institute of Neurological and
Communicative Disorders and Stroke/ Alzheimer´s Disease and Related Disorders
Association) (NINCDS-ADRDA). El NINCDS-ADRDA deja claro que sólo se puede dar un
diagnóstico definitivo de Alzheimer mediante el análisis anatomopatológico del cerebro y
que el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer anterior a la muerte es muy improbable.
Introducción
14
Criterios Diagnósticos del NINCDS-ADRDA para la enfermedad de Alzheimer
(McKhann y col., 1984)
I. Criterios para el diagnóstico clínico de enfermedad de Alzheimer probable
Demencia diagnosticada mediante examen clínico y documentada con el MMSE de
Folstein, la escala de demencia de Blessed u otras similar y confirmada con tests
neuropsicológicos.
Deficiencias en dos o más áreas cognitivas.
Empeoramiento progresivo de la memoria y de otras funciones cognitivas.
No alteración del nivel de conciencia.
Comienzo entre los 40 y los 90 años, con mayor frecuencia después de los 65.
Ausencia de alteraciones sistémicas u otras enfermedades cerebrales que pudieran
producir el deterioro progresivo observado de la memoria y de las otras funciones
cognitivas.
II. Apoyan el diagnóstico de "enfermedad de Alzheimer probable"
Deterioro progresivo de alguna función cognitiva específica como lenguaje (afasia),
habilidades motoras (apraxia) y trastornos de la percepción (agnosia).
Alteraciones conductuales y en la realización de las actividades diarias habituales.
Antecedentes familiares de trastorno similar, especialmente si obtuvo confirmación
anatomopatológica.
Pruebas complementarias:
o líquido cefalorraquídeo normal, en las determinaciones estándar
o EEG normal, o con alteraciones inespecíficas como incremento de la actividad
de ondas lentas.
o Atrofia cerebral en TAC, objetivándose progresión de la misma en observación
seriada.
Introducción
15
III. Aspectos clínicos compatibles con el diagnóstico de "enfermedad de Alzheimer
probable", tras excluir otras causas de demencia
Mesetas en la progresión de la enfermedad.
Síntomas asociados de depresión, insomnio, incontinencia, ideas delirantes, ilusiones,
alucinaciones, accesos emocionales, físicos o verbales, alteraciones de la conducta
sexual, pérdida de peso.
Otras alteraciones neurológicas en algunos pacientes, especialmente en los que se
hallan en fase avanzada, como hipertonía, mioclonías o alteración de la marcha.
Convulsiones, en fase avanzada de la enfermedad.
TAC cerebral normal para la edad del paciente.
IV. Aspectos que convierten el diagnóstico de "enfermedad de Alzheimer probable" en
incierto o improbable
Instauración brusca o muy rápida.
Manifestaciones neurológicas focales como hemiparesia, alteración de la sensibilidad
o de los campos visuales, o incoordinación en fases tempranas de la evolución.
Convulsiones o alteraciones de la marcha al inicio o en fases muy iniciales de la
enfermedad.
V. Diagnóstico clínico de enfermedad de Alzheimer posible
Demencia, con ausencia de otras alteraciones sistémicas, psiquiátricas y neurológicas
que puedan causar esa demencia, pero con una instauración, manifestaciones o
patrón evolutivo que difieren de lo expuesto para el diagnóstico de "enfermedad de
Alzheimer probable".
Presencia de una segunda alteración, cerebral o sistémica, que podría producir
demencia pero que no es considerada por el clínico como la causa de esta demencia.
En investigación, cuando se produce deterioro gradual e intenso de una única función
cognitiva, en ausencia de otra causa identificable.
Introducción
16
VI. Criterios para el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer definitiva
Criterios clínicos de "enfermedad de Alzheimer probable", y
Comprobación histopatológica, obtenida a través de biopsia o autopsia.
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad que es responsable del 5 % de las muertes
en la población anciana. La supervivencia de esta enfermedad tiene una media de 5,9 años,
siendo mayor cuando la edad de inicio de la enfermedad es más temprana (Ganguli 2005).
La enfermedad de Alzheimer no se puede curar ni es posible restaurar las funciones
deterioradas. Actualmente, es posible retardar su progresión pero no detenerla. El
tratamiento del Alzheimer va destinado a retardar la evolución de la enfermedad, a manejar
los problemas de conducta, la confusión y la agitación, a modificar el ambiente del hogar. En
la actualidad existen como tratamiento dos fármacos aprobados por la organización FDA de
Estados Unidos (Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos): los inhibidores
de la Acetilcolinesterasa (IACE) y la Memantina.
En los enfermos de Alzheimer se ha encontrado una disminución importante en los niveles de
ciertos neurotransmisores, concretamente una reducción de acetilcolina (AC), lo que se ha
relacionado con la pérdida de neuronas colinérgicas en regiones del cerebro que están
implicados en los procesos de memoria y aprendizaje. En el cerebro, la AC es inactivada por
la enzima acetilcolinesterasa (ACE), que se encuentra en las neuronas colinérgicas y, en
menor medida, por la butirilcolinesterasa (BCE). Los IACE retardan el progreso de la
enfermedad y mejoran la función cognitiva, ya que actúan afectando el nivel de AC en el
cerebro. Estos medicamentos tienen eficacia en los estadios leves y moderados de la
enfermedad y en la práctica diaria se emplean tres tipos: el donepezilo (DPZ), un inhibidor
específico y reversible de la ACE que causa un bloqueo fundamentalmente no competitivo; la
rivastigmina, como inhibidor dual (de la ACE y de la BCE) y la galantamina (GTM), una amina
terciaria que inhibe de forma selectiva, competitiva y reversible la actividad de la ACE (su
acción sobre la BCE es mucho más débil).
Introducción
17
Otro fármaco que se indica en fases moderadas y avanzadas de la enfermedad es la
memantina, cuyo mecanismo de acción se basa en antagonizar los receptores N-Methyl-D-
Aspartate (NMDA) glutaminérgicos. La disfunción de los receptores a NMDA afecta
directamente a la entrada intracelular de calcio y activa un mecanismo de neurotoxicidad. El
bloqueo no competitivo de los receptores NMDA, mediante este fármaco, regularía la
entrada de calcio y la consiguiente acción neuroprotectora.
Todos los fármacos anteriormente descritos tienen efectos colaterales potenciales como
náuseas y vómitos. El uso de estos fármacos en los trastornos cognitivos leves no ha
mostrado ser capaz de retardar la aparición de la enfermedad de Alzheimer.
Actualmente se encuentran en fase de ensayos clínicos otros fármacos que tienen como
objetivo el reducir la intensa acumulación de material proteico anormal (placas amiloides,
degeneración neurofibrilar) que caracteriza la enfermedad. Gran número de estudios
también sugieren ensayos con drogas inhibitorias de Serino-proteasas o inhibidores de los
radicales libres o estimulantes neurotróficos. No sabemos aún si el reducir la producción es
clínicamente significativo para el tratamiento de la enfermedad, pero es éste uno de los
campos más prometedores.
1.4.1. Etiología y epidemiología de la enfermedad de Alzheimer
Como ya hemos comentado anteriormente, los principales factores de riesgo de la
enfermedad de Alzheimer son la ancianidad y la presencia de antecedentes familiares para
esta patología.
La asociación entre la aparición de la enfermedad de Alzheimer y la presencia de
antecedentes familiares de demencia sugiere una causa genética como origen de la
enfermedad. Hemos visto que la enfermedad de Alzheimer es hereditaria entre el 1% y el 5%
de los casos (Enfermedad de Alzheimer familiar) por transmisión autosómica dominante de
alteraciones en los cromosomas 1 (PS2), 14 (PS1) o 21 (APP), con una edad de presentación
Introducción
18
generalmente anterior a los 60 años. En el resto de los casos (Enfermedad de Alzheimer
esporádica) también parece intervenir un factor genético del que no se ha podido determinar
un patrón hereditario concreto, probablemente, porque la causa es multifactorial. Sin
embargo, sí se han investigado diferentes factores genéticos que condicionan una cierta
susceptibilidad para padecer la enfermedad. Hasta el momento el factor genético de riesgo
en la enfermedad de Alzheimer esporádica es la presencia del alelo ε4 de la ApoE
(cromosoma 19), especialmente en los casos homocigóticos (ε4/ ε4) para dicho alelo (Chen
2009). Por el contrario, se ha postulado un efecto opuesto para el alelo ε2 de la misma ApoE,
que tendría por tanto un papel protector.
En la enfermedad de Alzheimer esporádica, la etiología es multifactorial con diversos factores
de riesgo entre los que destaca la predisposición genética, evidenciada porque los
antecedentes familiares de demencia en primer grado suponen un aumento del riesgo en un
3,5% para el desarrollo de una demencia y más aún si son varios. El sexo también influye en
la presentación de la enfermedad y el hecho de ser mujer confiere un riesgo 1,6 veces mayor
frente a ser hombre. Factores de riesgo vascular (diabetes, hipertensión arterial, dislipemias,
dietas ricas en grasas, tabaquismo...) y otros ambientales como: la intoxicación crónica leve
por metales como el mercurio y aluminio o la infección por algunos virus pueden favorecer
también el desarrollo de la enfermedad, pero no se ha demostrado que intervengan de
manera determinante (Munoz 2000).
Todos estos factores de riesgo han llevado al planteamiento de varias teorías o hipótesis
sobre las causas de la enfermedad de Alzheimer:
Hipótesis colinérgica Esta hipótesis sugiere que la enfermedad de Alzheimer se debe a
una reducción en la síntesis del neurotransmisor acetilcolina. Esta hipótesis no ha mantenido
apoyo global ya que los medicamentos que tratan una deficiencia colinérgica tienen una
efectividad reducida en la prevención o cura del Alzheimer, aunque se ha propuesto que los
efectos de la acetilcolina dan inicio a una acumulación a tan grandes escalas que conlleva a la
neuroinflamación generalizada que deja de ser tratable simplemente promoviendo la síntesis
del neurotransmisor (Terry 2003; Hardy 2009).
Introducción
19
Hipótesis vírica Esta teoría se ha postulado por la similitud de la enfermedad de
Creutzfeld-Jakob, donde la demencia tiene una evolución muy rápida y fatal, como en el caso
del Alzheimer. Dicha enfermedad es de carácter infeccioso y se ha podido demostrar el
agente precursor de la misma: una proteína infecciosa que tiene cierta similitud con la
sustancia amiloide que se forma en la enfermedad de Alzheimer, pero la secuencia de
aminoácidos es distinta (Honko 2009).
Hipótesis tóxica A causa de la facilidad para formar enlaces covalentes con la membrana
fosfolipídica, el aluminio (Al) provoca ciertas lesiones neuronales similares a la degeneración
neurofibrilar del Alzheimer. Dicha intoxicación crónica mediante sales de Al todavía no se ha
podido detectar en las autopsias de los fallecidos por Alzheimer (Exley 2005).
Hipótesis vascular y metabólica Se ha observado en algunos estudios que en pacientes
dementes hay un hipometabolismo en la corteza temporoparietal, una dificultad para extraer
la glucosa y el oxígeno, acompañada de una disminución del flujo de perfusión. Aunque
puede que dicha dificultad hipometabólica sea a causa de la disminución de las neuronas
(Erol 2008; Milionis 2008).
Hipótesis autoinmune Se ha observado en pacientes con Alzheimer la presencia de
autoanticuerpos dirigidos contra las células de prolactina. También se ha detectado la
presencia de amiloide en las placas seniles y en la pared de los vasos, que se relaciona con los
procesos de alteración inmunitaria (Bouras 2005; Hawkes 2007).
Hipótesis genética La hipótesis hereditaria se explicaría por la del gen dominante. Se ha
descubierto una relación de las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Alzheimer con
el síndrome de Down, donde el cromosoma 21 se ve alterado. La relación de ambas
enfermedades es que en el cromosoma 21 se encuentra el precursor de la proteína amiloide.
También se ha descubierto que la enfermedad que se manifiesta de forma precoz tiene cierta
relación con el cromosoma 14, y por el contrario, a los pacientes donde se les manifiesta la
enfermedad de forma tardía se produce cierta alteración en el cromosoma 19 (Lambert
2007).
Introducción
20
Hipótesis del estrés oxidativo Se ha investigado también sobre los radicales oxigenados
libres. Se ha estimado que la esperanza de vida podría prolongarse de 5 a 10 años si se
controlasen dichos radicales. En la enfermedad de Alzheimer se ha observado que los
radicales libres (RL) atacan la membrana celular, liberan los ácidos grasos y las proteínas,
perturban la permeabilidad de la membrana, alteran la posición, formación y función de
proteínas y en consecuencia generan cambios en la actividad enzimática (Practico 2008).
En la enfermedad de Alzheimer esporádica, ni los factores genéticos ni los ambientales por
separado provocan la enfermedad, pero asociados entre sí son necesarios, pero no
suficientes, precisando además del concurso del factor envejecimiento.
1.4.2. Hallazgos patológicos
Desde el punto de vista neuropatológico, la enfermedad de Alzheimer tiene dos
características histológicas típicas que hace que se diferencie del proceso de envejecimiento
normal, estas son la presencia de: a) alteraciones neurofibrilares extraneuronales (placas
seniles o amiloides) y b) acumulaciones fibrilares intraneuronales (ovillos neurofibrilares o
"tangles", en inglés). Ambas lesiones, placas amiloides y ovillos neurofibrilares (Figura 1), no
se encuentran o están presentes en reducido número en el cerebro de ancianos sanos y lo
que en realidad marca el diagnóstico histopatológico es su cantidad y topografía,
correlacionándose su número y densidad con la intensidad de la demencia en estos
pacientes, encontrándose en cantidades elevadas en la enfermedad de Alzheimer.
Introducción
21
Figura 1
www.ahaf.org/assets/images/plaques_and_tangles_border.jpg
Estas lesiones se acompañan de una pérdida neuronal que afecta fundamentalmente al
córtex frontal y a la región hipocámpica y, en mayor medida, a los sistemas con
neurotransmisión colinérgica.
1.4.2.1. Formación placas amiloides
Los exámenes autópsicos o postmortem del cerebro de pacientes con Alzheimer, muestran
una extensa formación de placas amiloides, las cuales se depositan y acumulan alrededor de
los nervios celulares. El principal elemento de los depósitos extracelulares es la proteína
β-amiloide, que forma fibrillas y se agrega formando las placas. El péptido β-amiloide se
produce por una escisión anómala de la proteína precursora amiloide (APP). Cuando la APP
es escindida por una α-secretasa, que es la vía normal, el producto resultante es un péptido
soluble, eliminado después por el organismo con facilidad. Pero en la enfermedad de
Alzheimer predomina la escisión consecutiva de la APP por parte de una β-secretasa primero
y de una γ-secretasa después, formándose entonces el péptido β-amiloide insoluble que es
Introducción
22
excretado al exterior de las neuronas. Fuera de la células, estos péptidos amiloides se
agregan formando oligómeros, los cuales se acumulan y forman depósitos llamados placas
amiloides sobre la membrana de las neuronas (Figura 2).
Figura 2
http://www.jci.org/articles/view/25100/files/JCI0525100.f2/medium
1.4.2.2. Formación ovillos neurofibrilares
En condiciones normales de la neurona, la proteína Tau se encuentra en el interior de los
microtúbulos, teniendo una función interna de soporte estructural que actúa estabilizando
los microtúbulos. En la enfermedad de Alzheimer se produce una hiperfosforilación de la
proteína Tau, que es catalizada por varias proteinquinasas, lo que hace que esta deje de
cumplir su papel en la estabilización del citoesqueleto y se transforma en una proteína con
una capacidad aberrante de asociarse consigo misma para formar polímeros intracelulares
(Figura 3). Estos ovillos se localizan en el interior de las neuronas y se ha demostrado que
estas estructuras no se encuentran en los cerebros post-mortem de sujetos controles de
edad avanzada que no presentan esta enfermedad (Gomez-Isla 1997).
Introducción
23
Figura 3
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/51/TANGLES_HIGH.jpg
El proceso de degeneración neurofibrilar genera una disfunción de las células nerviosas,
ocasionando en una etapa más avanzada la muerte selectiva de ciertas poblaciones
neuronales, especialmente en regiones del hipocampo, corteza entorina y núcleos de
Meynert. Además, se produce una disminución en los niveles de ciertos neurotransmisores
como la AC. Sin embargo, los mecanismos involucrados en la neurodegeneración y pérdida
neuronal no han sido aún dilucidados.
1.5. ESTRÉS OXIDATIVO
En el metabolismo aerobio entre el 1 y el 5% del oxígeno que consumimos se reduce de
forma incompleta, dando lugar a intermediarios o especies reactivas llamadas radicales libres
(RL). Los RL son átomos o grupos de átomos que tienen un electrón desapareado por lo que
son muy reactivos ya que tienden a capturar un electrón de moléculas estables con el fin de
alcanzar su estabilidad electroquímica. Una vez que el RL ha conseguido sustraer el electrón
Introducción
24
que necesita para aparear su electrón libre, la molécula estable que se lo cede se convierte a
su vez en un RL por quedar con un electrón desapareado, iniciándose así una verdadera
reacción en cadena que destruye nuestras células.
La vida media biológica del RL es de microsegundos, pero tiene la capacidad de reaccionar
con todo lo que esté a su alrededor provocando un gran daño a moléculas y a membranas
celulares. Los RL no son intrínsecamente deletéreos. De hecho, nuestro propio cuerpo los
fabrica en cantidades moderadas para luchar contra bacterias y virus. Los RL producidos por
el cuerpo para llevar a cabo determinadas funciones son neutralizados fácilmente por
nuestro propio sistema. Con este fin, nuestro cuerpo produce unas enzimas antioxidantes
que son las encargadas de neutralizarlos. Estas enzimas tienen la capacidad de desarmar a los
RL sin desestabilizarse.
Dentro de este concepto genérico se incluyen, moléculas radicales que son agentes oxidantes
como el anión superóxido (O2• -) y moléculas no radicales, que son fácilmente convertibles a
radicales como el peróxido de hidrógeno (H2O2), que constituyen las especies reactivas del
oxígeno (EROs). Además de las EROs, también son importantes en este contexto las especies
reactivas del nitrógeno (RNS). Bajo condiciones fisiológicas normales se estima que entre el
2-4% del oxígeno consumido durante el transporte de electrones en la mitocondria no se
reduce a agua por la citocromo C oxidasa, sino que se forma el O2• - , el principal radical libre
de oxígeno producido por la mitocondria, y este, a su vez, puede generar otras EROs. En la
célula el O2• - es convertido a rápidamente a H2O2 espontáneamente o por vía enzimática
(Reacción 1).
2 O2• - + 2H+ H2O2 + O2 REACCIÓN 1
Sin embargo, el H2O2 puede reaccionar con metales de transición reducidos, a través de la
reacción de Fenton (Reacción 2,3), para producir el radical hidroxilo (OH•-) altamente
reactivo, una molécula mucho más perjudicial para la célula.
Introducción
25
Me(n+1)+ + O2• - Men+ + O2 REACCIÓN 2
Men+ + H2O2 Me(n+1)+ + •OH + OH- (reacción de Fenton) REACCIÓN 3
Además de la formación de H2O2, los radicales O2- pueden rápidamente reaccionar con el
óxido nítrico (NO) para generar aniones peroxinitrito citotóxicos (ONOO-), que pueden
reaccionar con el dióxido de carbono, produciendo daño a las proteínas con la formación de
nitrotirosina y oxidación de ADN y lípidos (Figura 4).
Figura 4
http://institutobiologico.com/seminarios/imagenes/stop1.jpg
La generación de EROs en las células normales, incluyendo las neuronas, está bajo un estricto
control homeostático. Para ayudar a desintoxicar las EROs, los antioxidantes biológicos
reaccionan con la mayoría de los oxidantes. Sin embargo, cuando los niveles de EROs
superan la capacidad antioxidante presente en la célula se produce una situación conocida
como estrés oxidativo (EO) (Figura 5).
Introducción
26
Figura 5
Una excesiva producción de EROs puede llevar a la destrucción de componentes celulares
incluyendo lípidos, proteínas y ADN (Figura 6), y, en última instancia, producir la muerte
celular a través de la apoptosis o necrosis (Kannan 2000).
Figura 6
Introducción
27
El EO puede producirse como consecuencia de un incremento de la exposición a oxidantes o
del descenso de la protección contra estos oxidantes; ambos problemas pueden ocurrir
simultáneamente. De hecho, se define el EO como un desequilibrio entre la producción de
EROs y la protección antioxidante. Algunos de los factores que pueden llevar a esta situación
son un aumento de metales pesados, componentes del tabaco, radiaciones ultravioleta,
hiperoxia, algunas drogas, dieta hipercalórica, dieta insuficiente en antioxidantes, diabetes,
procesos inflamatorios y traumatismos, fenómenos de isquemia y ejercicios extenuantes.
El EO intrínseco, y presumiblemente el daño celular, aumenta con la edad, ya sea debido a la
disminución de defensas antioxidantes o el aumento de la disfunción mitocondrial
(Cassarino 1999). Estos efectos relacionados con la edad, compuestos por factores de riesgo
genéticos y ambientales y la alta dependencia energética, pero relativamente con un bajo
nivel de antioxidantes específicamente en el cerebro, puede proporcionar una acumulación
de mecanismos para la alta incidencia de desordenes neurodegenerativas que se produce en
la población anciana.
1.5.1. Implicación del estrés oxidativo en la enfermedad neurodegenerativa.
Una serie de evidencias apuntan que el estrés oxidativo es uno de los factores determinantes
en las enfermedades neurodegenerativas (Sayre 2001; Mecocci 2004). Sin embargo, está en
debate si el EO está implicado en el origen y/o en la progresión de estos trastornos o
solamente se encuentra en la fase terminal de la enfermedad.
La investigación en el campo de las enfermedades neurodegenerativas ha ayudado a
proporcionar una mejor comprensión en la cascada de eventos bioquímicos que se producen
en la enfermedad de Alzheimer y la naturaleza heterogénea de la misma. Las hipótesis del EO
apoya esta heterogeneidad así como el hecho de que el envejecimiento sea uno de los
factores de riesgo más evidentes (Smith 2000; Christen 2000; Perry 2002; Zhu 2004; Gella
2009). La probable implicación del estrés oxidativo se ve apoyada por el hecho de que las
neuronas son altamente susceptibles a EROs o RL por las siguientes razones: 1) su contenido
Introducción
28
en antioxidantes es baja, 2) sus membranas contienen una alta proporción de ácidos grasos
poliinsaturados (Hazel 1990), y 3) el metabolismo cerebral requiere grandes cantidades de
oxígeno. Todo ello puede inducir tanto a la necrosis neuronal como a la apoptosis.
Además, en el examen de cerebros postmortem de pacientes con Alzheimer se han
encontrado marcadores de estrés oxidativo (Sayre 2001; Praticò 2008; Butterfield 2010)
como son productos de oxidación de ADN, proteínas y lípidos, metales con actividad redox
que pueden dar lugar a la formación de RL y una disminución de las defensas antioxidantes
(Navarro 2004; Rodrigues Sigueira 2005).
Las reacciones mediadas con EROs, particularmente con los lípidos de membrana de las
neuronas, son frecuentes en el cerebro de enfermos con Alzheimer y están directamente
implicadas en el proceso de la enfermedad. El cerebro está compuesto por una gran cantidad
de lípidos, los cuales resultan unos excelentes sustratos para reaccionar con RL. Además,
dispone de metales de transición que pueden intervenir en el proceso de formación de RL
catalizando las reacciones que los producen. Por otra parte, el cerebro tiene una alta
demanda de energía que es satisfecha por un alto movimiento metabólico y reacciones
oxidativas en la mitocondria de las células cerebrales y tiene unas pobres defensas
antioxidantes. Además en el cerebro sustratos, RLs y catalizadores llegan a estar muy
próximos y pueden interaccionar más fácilmente. Todo ello favorece el proceso del EO que
promueve cambios, a veces irreversibles, en los mecanismos normales de señalización, lo que
generarían una disfunción de las neuronas y llevarían a la muerte neuronal en etapas
avanzadas de la enfermedad. En muchos casos, el daño oxidativo es más una consecuencia
del daño tisular que produce la enfermedad que una causa del mismo y este daño oxidativo
puede entonces contribuir a empeorar el daño tisular generado.
Varios estudios han revelado que la formación del β-amiloide y otros derivados de la APP son
factores clave en los cambios celulares en el cerebro de pacientes con Alzheimer, incluida la
generación de RL, daño oxidativo e inflamación (Reddy 2006).
Introducción
29
La hipótesis del estrés oxidativo (EO) puede justificar la gran heterogeneidad de la
enfermedad de Alzheimer y el hecho de que tanto las causas genéticas y no genéticas estén
implicadas. Tan generales consideraciones sugieren que el EO está implicado en muchas
patologías relacionadas con la edad, específicamente en la enfermedad de Alzheimer y en
todas las enfermedades neurodegenerativas (Klein 2003; Marlatt 2008).
A pesar de los avances conseguidos por las investigaciones realizadas hasta ahora, la
degeneración de las neuronas, que es evidente incluso en el inicio del Alzheimer, ha hecho
difícil determinar si el daño oxidativo observado en esta enfermedad es responsable de la
muerte neuronal o se produce como un acontecimiento secundario de la misma. Sabemos
que un 15% de los sujetos con DCL en última instancia progresan a Alzheimer (Luis 2003). Los
cambios neuropatológicos y la degeneración de las neuronas en los DCL muestran cierta
superposición con los resultados de la autopsia en las personas mayores cognitivamente
intactos (Schmitt 2000), lo que sugiere que los pacientes con DCL nos pueden proporcionar
una oportunidad para aclarar si el aumento del daño oxidativo es un factor importante en la
patogénesis de la muerte neuronal en la enfermedad de Alzheimer o un fenómeno
secundario (Keller 2005).
1.5.2. Agentes implicados en el mantenimiento del estatus oxidativo sistémico
La vida en presencia del oxígeno molecular exige contar con una batería múltiple de defensa
contra las diversas EROs o RL que por un lado tiendan a impedir su formación y por otro los
neutralicen una vez formados. Los seres vivos poseen un conjunto de sistemas fisiológicos
que se encargan de eliminar estas EROs ocupándose de mantener el estado de equilibrio que
existe entre sustancias oxidantes y antioxidantes. Estos sistemas comienzan por reducir el
oxígeno y son los llamados antioxidantes.
Un antioxidante es una estructura molecular capaz de neutralizar la acción oxidante de las
EROs liberando electrones en nuestra sangre que son captados por otros RL manteniendo su
estabilidad y evitando así la oxidación de otra molécula. En condiciones fisiológicas, la
Introducción
30
concentración de antioxidantes es varios órdenes de magnitud superior a la concentración de
EROs. A pesar de esto, la formación de EROs tiene lugar de forma continua pero controlada.
El problema para nuestra salud se produce cuando nuestro organismo tiene que soportar un
exceso de RL durante años, producidos principalmente por contaminantes externos que
penetran en nuestro organismo.
Se ha desarrollado un importante sistema defensivo antioxidante, de prevención en la
generación de EROs, intercepción de estas sustancias una vez formados y reparación del
daño oxidativo o eliminación de las moléculas dañadas. Los EROs se pueden producir tanto
en medios acuosos como lipídicos y también producirse dentro o fuera de las células, por ello
para minimizar sus efectos dañinos existen antioxidantes hidrosolubles y liposolubles e intra
y extracelulares. Esto refleja la enorme importancia de estar a salvo de la oxidación.
Las EROs pueden ser eliminados mediante sistemas de pequeñas moléculas enzimáticos y no
enzimáticos. Es lo que se denomina defensa primaria contra el daño oxidativo. Como regla
general, la mayor concentración de antioxidantes enzimáticos es intracelular (aunque
también poseen localización extracelular algunas enzimas como la SOD y algunas
peroxidasas), mientras que la mayor concentración de la mayoría de los antioxidantes no
enzimáticos se encuentra en el líquido extracelular. En la tabla 1 podemos ver una
clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejercen su acción. A su vez, los niveles
tanto de un tipo de antioxidante como del otro, varían de un tejido a otro.
Introducción
31
Tabla 1: Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejercen su acción.
Intracelular Membrana Extracelular
Superóxido Dismutasa Vitamina E Ceruloplasmina
Glutatión Peroxidasa Vitamina A Transferrina
Glutatión Reductasa Glutatión Peroxidasa Ácido Úrico
Glutatión Reductasa Vitamina E
Albúmina
Superóxido Dismutasa
Glutatión Peroxidasa
Glutatión Reductasa
Los antioxidantes pueden ser exógenos o endógenos según su procedencia. Los primeros son
aportados principalmente por los alimentos, mientras que los endógenos son producidos por
el mismo organismo como un mecanismo de defensa intrínseco.
1.5.2.1. Antioxidantes endógenos
1.5.2.1.1. Antioxidantes enzimáticos
La función de los antioxidantes enzimáticos es prevenir la iniciación de las oxidaciones en
cadena, reduciendo a las especies O2- y H2O2 a moléculas más estables, agua y oxígeno, al
mismo tiempo que se evita la interacción entre las anteriores con metales de transición y, así,
evitar la formación de la especie oxigenada más reactiva, el radical OH- (Figura 7). A grandes
rasgos se caracterizan por utilizar iones metálicos (Fe, Zn, Cu, Mn y Se) como cofactores o
coenzimas esenciales.
Introducción
32
Figura 7 http://institutobiologico.com/seminarios/imagenes/stop6.jpg
1.5.2.1.1.1. Superóxido Dismutasa (SOD)
La SOD es una enzima que convierte los radicales O2.- en H2O2. Para ello cataliza una reacción
de dismutación que consiste en la oxidación de un radical O2.- a oxígeno molecular y la
reducción de otro radical O2.- a H2O2 (Reacción 4), que aunque es una molécula más estable,
sigue poseyendo una reactividad alta.
2 O2.- + 2H+
SOD H2O2 + O2 REACCIÓN 4
Existen varias variantes moleculares de la enzima: Cu/Zn-SOD (citosólica y mitocondrial), Mn-
SOD (citosólica y mitocondrial) y EC-SOD (extracelular).
La Cu/Zn-SOD se distribuye principalmente en los tejidos con gran actividad metabólica
(hígado, riñón) y la Mn-SOD en aquellos que el proceso respiratorio es alto (miocardio).
Introducción
33
La EC-SOD también posee Cu y Zn, pero es muy diferente a la forma intracelular (Marklund
2002). Se secreta al plasma y líquido intersticial, donde es el isoenzima predominante, sin
embargo, de manera general a nivel tisular su presencia es menor.
Por tanto, el ámbito de actuación de la SOD es muy amplio, puede hacerlo a nivel
extracelular, pero fundamentalmente lo hace en el intracelular, en la mitocondria y
compartimentos citosólicos. La regulación de su producción es sensible tanto a la cantidad de
oxígeno tisular, como a la producción de radical O2.- intracelular (Turrens 2003).
Se ha constatado que esta enzima es clave en el proceso de EO que se produce en la
enfermedad de Alzheimer (Maier 2002). Se han encontrado resultados contradictorios en los
niveles de actividad de esta enzima en sangre de pacientes con Alzheimer. Algunos estudios
han encontrado aumentada la actividad de SOD (Ozcankaya 2002; Rossi 2002; Kharrazi 2008)
en sangre de pacientes con Alzheimer. Esto también se ha demostrado que ocurre en
cerebro de ratones transgénicos con Alzheimer (Resende 2008) en los momentos iniciales de
la enfermedad. Otros estudios han encontrado una disminución de la actividad de esta
enzima (Rinaldi 2003; Casado 2008; Padurariu 2010; Vural 2010) en pacientes con Alzheimer,
mientras que Bourdel-Marchasson (2001) no encontró diferencias de actividad en sangre
entre pacientes con Alzheimer y controles.
1.5.2.1.1.2. Glutatión peroxidasa (GPx)
Se trata de una selenoenzima cuya función primordial es proteger al organismo de la acción
citotóxica de los hidroperóxidos y los RL ya que previene la formación de peróxidos lipídicos
en la membrana celular. Esta enzima clave del ciclo del glutatión, actúa además sobre
grandes moléculas de peróxidos lipídicos y sobre productos derivados de las reacciones
catalizadas por la lipooxigenasa.
La GPx es la enzima más importante para eliminar el H2O2 en el ser humano ya que actúan a
niveles bajos de éste. Para ello cataliza la reducción del H2O2 y la de los hidroperóxidos
Introducción
34
lipídicos a agua (Reacción 5) y alcoholes estables y agua (Reacción 6), mediante la oxidación
del glutatión reducido (GSH) a glutatión oxidado (GSSG).
2 GSH + H2O2 GPx
GSSG + 2H2O REACCIÓN 5
ROOH + 2GSH GPx
ROH + GSSG + 2H2O REACCIÓN 6
Hay dos tipos de GPx, una forma enzimática tetramérica que es dependiente de Selenio,
elemento que es esencial para su actividad y controla la síntesis de la proteína, que elimina
tanto hidroperóxidos orgánicos (ROOH) como inorgánicos (H2O2). La otra forma no tiene Se,
tiene un peso molecular menor, es dimérica y sólo es capaz de eliminar ROOH.
Las GPx a nivel intracelular se localizan en el citosol y la matriz mitocondrial. Las diferentes
isoenzimas que se conocen se expresan en tejidos específicos. Se sabe que la expresión de la
GPx es inducida por estrés oxidativo y que una expresión aberrante de la misma está
asociada a una gran variedad de patologías, incluyendo la hepatitis y varios tipos de cánceres
como el de piel, riñón intestino o pecho (Townsend 2003).
También se han encontrado resultados contradictorios en los niveles de actividad de esta
enzima en sangre de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Algún autor ha encontrado un
aumento de la actividad de GPx (Martin-Aragon 2009) en plasma de pacientes con Alzheimer
y otros lo han corroborado en un modelo in vivo de ratones transgénicos con la enfermedad
(Resende 2008). Sin embargo otros autores han encontrado una disminución de la actividad
de GPx (Casado 2008; Kharrazi 2008; Rinaldi 2008; Padurariu 2010; Vural 2010) en los
pacientes con Alzheimer y alguno no han encontrado diferencias de actividad entre pacientes
y controles (Bourdel-Marchasson 2001).
Introducción
35
1.5.2.1.1.3. 1.5.2.1.1.3. Glutatión reductasa (GR)
La reacción de reducción del glutation oxidado, es catalizada por la GR y se encarga de
regenerar el GSH consumido (Reacción 7) por lo que es clave en la defensa antioxidante.
GSSG + NAPDH + H+ GR
2 GSH + NAPD+ REACCIÓN 7
Puesto que el pool de GSH celular es limitado y la elevación de la tasa GSSG/GSH es
altamente tóxica para la célula, esta enzima es de vital importancia para el funcionamiento
de la eliminación de H2O2 por la vía de la GPx, así como para la reconstitución del GSH
oxidado no enzimáticamente.
Algunos autores han encontrado aumentada la actividad de GR en el cerebro de pacientes
con Alzheimer (Lovell 1995), mientras que otros no han encontrado diferencias entre grupos
(Padurariu 2010) o bien han encontrado disminuida su concentración en plasma de pacientes
con Alzheimer frente a un grupo control (Zafrilla 2004; Casado 2008).
1.5.2.1.2. Antioxidantes no enzimáticos
Algunos componentes del plasma constituyen otro grupo de antioxidantes no enzimáticos,
los cuales inhiben la cadena de iniciación de reacciones de RL o rompen la cadena de
propagación de la misma.
El urato puede actuar como secuestrador de radicales OH•- y O2•- o como quelante de
metales de transición. La forma oxidada de ácido úrico puede ser reducida por el ácido
ascórbico (Santus 2001). La bilirrubina es un antioxidante liposoluble y, por tanto, capaz de
inhibir la lipoperoxidación. Es un pigmento biliar producido por el catabolismo del grupo
hemo. La albúmina la transporta en el plasma, y en condiciones fisiológicas, ambas pueden
actuar como antioxidante. La bilirrubina unida a la albúmina, a concentraciones equimolares,
compite con el ácido úrico por los radicales peroxilo, pero es menos eficiente.
Introducción
36
Otro grupo de moléculas antioxidantes son las que actúan secuestrando a los iniciadores del
proceso oxidativo tales como los metales de transición Fe y Cu, los cuales contienen un
electrón desapareado y aceleran fuertemente la formación de EROs. Dentro de este grupo se
encuentran la transferrina, el mayor transportador plasmático de Fe del organismo, la
ferritina que almacena este metal intracelularmente, la ceruloplasmina que secuestra iones
de Cu para impedir la formación de RL a partir de peróxidos, la albúmina, ya que en el
plasma sanguíneo el Cu no unido a la ceruloplasmina está ligado principalmente a ella, así
como proteínas que se unen con grupos hemo. Esta capacidad de retener iones metálicos es
una defensa antioxidante importante, ya que estos no pueden estimular la formación de RL y
por consiguiente el EO. Además, este secuestro permite utilizar el radical O2•- y el H2O2 para
propósitos metabólicos, sin que logre hacer demasiado daño a los tejidos, siempre y cuando
la cantidad de EROs no llegue a ser suficiente para producir una lesión directa y/o movilizar
los iones metálicos de sus lugares de almacenamiento.
Diversos estudios han evaluado los niveles de algunos de estos antioxidantes en pacientes
con Alzheimer, bien en suero, LCR o cerebro y se ha visto que se encuentran disminuidos con
respecto a controles (Johannesson 2003; Rinaldi 2003; Polidori 2004; Kim 2006). Otros
estudios han encontrado aumentados algunos de estos antioxidantes: bilirrubina (Kimpara
2000), ceruloplasmina (Loeffler 1994), transferrina (Loeffler 1995; Fisher 1997) o no han
encontrado diferencias entre pacientes y controles: ferritina (Fisher 1997), transferrina
(Loeffler 1994).
1.5.2.2. Antioxidantes exógenos
Los sistemas antioxidantes exógenos más importantes están constituidos principalmente por
vitaminas y micronutrientes. Estos mecanismos deben estar presentes en todos los
compartimentos celulares y por esto algunos antioxidantes son hidrosolubles, tales como la
vitamina C o el glutatión, y otros son liposolubles, tales como los b-carotenos o la vitamina E.
Introducción
37
1.5.2.2.1. Vitamina E
La vitamina E es el principal neutralizador de radicales peroxilo en medios lipídicos biológicos.
Debido a su hidrofobicidad se encuentra, sobre todo, en lípidos de membrana y en
lipoproteínas plasmáticas y es aquí donde ejerce principalmente su acción antioxidante. De
hecho, la vitamina E está reconocida como el principal antioxidante en tejido graso y como la
principal defensa frente a la peroxidación lipídica. De igual modo, en plasma y eritrocitos, la
vitamina E es el principal antioxidante liposoluble que protege a los lípidos del daño
peroxidativo.
Actúa interrumpiendo las reacciones en cadena de autooxidación, al transformarse en un
radical estable, neutralizando los radicales peroxilo y alcoxilo. Estos radicales formados
durante la peroxidación lipídica, se combinan con el α-tocoferol en vez de con otro ácido
graso, generando un hidroperóxido orgánico y el radical tocoferol (α-tocoferol-O), el cual es
bastante estable y muy poco reactivo, por lo que se corta la reacción en cadena.
La evidencia que parece indicar que los radicales libres pueden contribuir al proceso
patológico en la enfermedad de Alzheimer ha conducido a un interés en el uso de la vitamina
E en el tratamiento empírico de esta enfermedad. Por ello la mayoría de los estudios que
relacionan la vitamina E con el Alzheimer se basan en demostrar la eficacia del tratamiento
complementario con vitamina E. Aunque existen evidencias del beneficio de la vitamina E
para el proceso de EO, hoy en día todavía no se ha llegado a demostrar la eficacia de esta
vitamina para prevenir el Alzheimer (Gill 2009; Lloret 2009). Otros estudios han medido los
niveles de vitamina E en sangre de pacientes con Alzheimer encontrado concentraciones
disminuidas (Bourdel-Marchasson 2001; Polidori 2002, 2004; Rinaldi 2003; Baldeiras 2008),
aunque algunos autores no han encontrado diferencias (Charlton 2004). Existe un estudio en
ratones transgénicos con Alzheimer que han observado que en los cerebros se encuentra
disminuida la vitamina E a la vez que se produce un aumento en la peroxidación lipídica
(Resende 2008).
Introducción
38
1.5.2.2.2. Vitamina A
La vitamina A (todo-trans-retinol) y sus derivados biológicamente activos, retinal y ácido
retinoico, junto con un gran número de análogos sintéticos comprenden el grupo de
compuestos denominados retinoides.
Su naturaleza lipofílica y su localización en el compartimento hidrofóbico de las membranas
biológicas y lipoproteínas hacen que la vitamina A también sea un compuesto efectivo en la
reducción de la peroxidación lipídica, actuando como inhibidor de las reacciones de oxidación
en cadena.
Es importante señalar que el efecto antioxidante de la vitamina A se potencia en presencia
de la vitamina E y que este efecto es máximo en una proporción 1:10 (retinol: tocoferol), que
es precisamente la relación aproximada que guardan ambos compuestos en la mayoría de las
membranas biológicas. Este efecto sinérgico se atribuye no a una interacción física entre
estos 2 compuestos sino a que ambos protegen desde diferentes localizaciones físicas, la
vitamina E desde la parte exterior de la superficie de las membranas y la vitamina A desde el
interior.
Los estudios que han medido los niveles de vitamina A en sangre de pacientes con Alzheimer
han encontrado resultados contradictorios: disminución de vitamina A en pacientes con
Alzheimer (Bourdel-Marchasson 2001; Rinaldi 2003; Polidori 2004) o ausencia de diferencias
respecto a grupo control (Polidori 2002).
1.5.3. Productos del estrés oxidativo: Malondialdehido
Los lípidos cumplen un papel muy importante en los organismos vivos porque, además de su
alto aporte energético, participan en la regulación metabólica (hormonas, vitaminas,
prostaglandinas, etc) y son importantes componentes de las membranas biológicas
(fosfolípidos y esteroles). Todas las células, incluyendo las neuronas, están rodeadas por una
Introducción
39
membrana celular que las separa del medio extracelular. Esta membrana contiene enzimas,
canales, receptores y antígenos que juegan papeles vitales en la interacción de la célula con
otras células, hormonas y otros agentes reguladores del líquido extracelular, pero la
estructura básica de estas membranas biológicas es la bicapa lipídica, que funciona como una
barrera de permeabilidad selectiva. De esta manera los lípidos regulan los procesos celulares
asociados a las membranas biológicas, como por ejemplo transporte y comunicación celular,
por lo que son esenciales para el normal funcionamiento de estas membranas celulares.
Los organismos vivos obtienen lípidos a partir de la dieta, las reservas del tejido adiposo y de
la síntesis endógena de lípidos o lipogénesis. La dieta contiene principalmente triglicéridos,
ésteres de colesterol y fosfolípidos.
La utilización de los lípidos de la dieta implica la digestión y absorción intestinal por acción de
lipasas y ácidos biliares. Los ácidos grasos de cadena corta se incorporan directamente a la
sangre, mientras que los ácidos grasos de cadena larga se incorporan como quilomicrones,
que son sintetizados en la pared intestinal. Alrededor del 50% de los ácidos grasos
absorbidos se catabolizan por b- oxidación mitocondrial y peroxisomal en los animales, y el
50% restante se almacena como triglicéridos en el tejido adiposo.
De particular importancia son las reacciones mediadas por EROs que dan como resultado la
degradación oxidativa de los lípidos también llamada peroxidación lipídica. La peroxidación
lipídica es el proceso a través del cual los RL capturan electrones de los lípidos en las
membranas celulares. Esta es generalmente inducida por un radical HO·- que sustrae un
hidrógeno a la cadena lateral de un ácido graso formando un radical carbonado (R·). Este
último reacciona con oxígeno para formar peróxidos cíclicos y radicales hidroperóxidos
(ROO·) que propagan esta reacción en cadena. Se forman igualmente radicales alcoxílicos
lipofílicos (RO·). La peroxidación lipídica puede seguir propagándose en presencia de metales
de transición (Men+) existentes en el plasma, los cuales son catalizadores oxidativos. En la
mayoría de los casos este proceso de peroxidación afecta los ácidos grasos poliinsaturados,
debido a que contienen múltiples dobles enlaces entre los cuales se encuentran los grupos
metileno (-CH2-) que poseen hidrógenos particularmente reactivos.
Introducción
40
Los antioxidantes pueden formar complejos estables impidiendo su acción catabólica.
Además, dependiendo de su coeficiente de partición y potencial redox, los antioxidantes
pueden actuar libremente en la interfase celular comportándose como potentes protectores
de células y lipoproteínas o estabilizando antioxidantes lipofílicos que previenen la
peroxidación lipídica.
La peroxidación de lípidos produce una pérdida de PUFAs de la membrana provocando
finalmente la alteración de la estructura, la fluidez y la permeabilidad de las membranas
celulares. Cuando este fenómeno acontece sobre los fosfolípidos de las lipoproteínas
plasmáticas éstas aumentan significativamente su poder aterogénico.
La detección y medida de la peroxidación lipídica ha sido muy utilizada en el estudio de la
influencia del estrés oxidativo en distintas patologías. Para determinar el grado de oxidación
lipídica, se puede cuantificar el contenido de malondialdehído (MDA) en suero, orina o
muestra de tejido. Pero existen otros metabolitos igualmente válidos, si bien los métodos
analíticos requieren tecnologías más sofisticadas, como es el caso de compuestos volátiles
(pentano, etano), 8-2α-isoprostanos, hidroxinonenales (HNE), etc…
La mayoría de estudios donde han medido algunos de los marcadores de peroxidación
lipídica en sangre de pacientes con Alzheimer han encontrado unos niveles elevados de
estos marcadores con respecto a un grupo control (Lovel 1995; Bourdel-Marchasson 2001;
McGrath 2001; Ozcankaya 2002; Polidori 2002; Galbusera 2004; Zafrilla 2004; Gustaw-
Rothenberg 2010). Además también se han medido niveles de TBARS en cerebros de
pacientes con Alzheimer y DCL encontrando niveles elevados con respecto cerebros sanos
(Keller 2005).
En el curso de la oxidación de cadenas lipídicas con varios enlaces dobles aislados se crea,
bajo la acción de un radical hidroxi y de oxígeno, en primer lugar un radical lipoperóxido. Este
puede estabilizarse en un lipoperóxido cíclico. El lipoperóxido se descompone primero en un
endoperóxido bicíclico, y finalmente en MDA más dos cadenas acilo acortadas.
Introducción
41
La concentración de MDA es una medida de la peroxidación lipídica que ha tenido lugar. En el
cerebro de cadáveres que habían padecido enfermedad de Alzheimer se encontraron
concentraciones de MDA significativamente superiores a las que había en el cerebro de
individuos de edades semejantes que habían fallecido por otras causas. El MDA por si mismo
se clasifica como nocivo, ya que puede unirse “in vivo” a cadenas de ADN, desencadenando
mutaciones.
Algunos estudios han mostrado un incremento de la peroxidación lipídica al encontrar un
aumento de MDA en plasma (Bourdel-Marchasson 2001; Ozcankaya 2002; Polidori 2002;
Gustaw-Rothenberg 2010; Padurariu 2010) y cerebros (Karelson 2001; Dei 2002) de
pacientes con Alzheimer aunque otros estudios han corroborado el incremento de la
peroxidación lipídica con un aumento de otros productos de peroxidación como HNE
(McGrath 2001).
1.5.4. Aspectos generales de los metales y elementos Traza y su relación con el estrés
oxidativo en la enfermedad neurodegenerativa
Muchos de los metales con actividad redox que se encuentran en el organismo son
esenciales en la mayoría de las reacciones biológicas como la síntesis de ADN, ARN y
proteínas y actúan como cofactores de numerosas enzimas. La deficiencias de muchos de
ellos puede provocar alteraciones en el sistema nerviosos central y en la función de otros
órganos. Sin embargo, debido a sus propiedades redox, la acumulación de estos metales por
encima de la capacidad del complemento celular de metaloproteínas (catalítica, transporte,
almacenamiento) puede ser citotóxica como consecuencia de su participación en una gran
variedad de disturbios celulares caracterizado por el estrés oxidativo debido a un aumento
de la producción de EROs (Sayre 2005; Valko 2005).
Además, numerosos estudios sugieren que los metales juegan un papel importante en la
enfermedad de Alzheimer al encontrarse algunos de ellos con los péptidos β-amiloides, en las
placas amiloides que se forman en los cerebros de estos pacientes (Baum 2010). La unión de
Introducción
42
metales al β-amiloide modula varias propiedades físico-químicas de las placas amiloides que
se consideran centrales para la patogenicidad de los péptidos. En primer lugar algunos
autores han demostrado que los metales pueden promover in vitro la agregación de la
proteína β-amiloide (Cuajungco 2005). Otros estudios han confirmado que las placas
amiloides, en los cerebros postmortem de pacientes con Alzheimer, están anormalmente
enriquecidas en algunos metales (Huang 2004). Sin embargo no está claro el papel que
juegan los metales en toda esta cadena de eventos que se dan en el proceso de formación de
las placas amiloides.
Los diferentes metales y elementos Traza pueden tener distinto comportamiento referente al
EO, de manera que pueden actuar como agentes con actividad antioxidante conocida por ser
cofactores o coenzimas de enzimas antioxidantes, actuar como agentes oxidantes por
resultar tóxicos a cualquier nivel de concentración, en el organismo bien por su acción
oxidante o bien por otros mecanismos, o también algunos metales han demostrado que
pueden actuar con ambos comportamientos pudiendo tener actividad tanto oxidante como
antioxidante.
En el caso de las acciones oxidantes de los metales y elementos Traza se incluyen múltiples
mecanismos posibles que pueden resumirse en:
a) Metales cuyo mecanismo básico es la producción de EROs, por actuar como agentes
catalíticos en la reacción de Fenton (Cr, Cu, Fe y V).
b) Metales que no parecen por sí mismos generar radicales libres (Hg, Ni, y Cd). Sin embargo,
su toxicidad está asociada a peroxidación lipídica, oxidación del ADN y niveles aumentados
de peróxido de hidrógeno, entre otras evidencias de daño oxidativo
c) Finalmente, mecanismos a través de un desplazamiento del Fe de sus sitios de unión y la
subsiguiente redistribución, resultando en un aumento de las reacciones mediadas por Fe.
Aún no está claro en qué medida el aumento de los procesos oxidativos se produce como un
Introducción
43
efecto directo de estos metales (Al, Cd y Ni) o indirectamente a través de desplazamientos de
hierro inducidos por estos metales.
1.5.4.1. Aluminio
Uno de los principales efectos secundarios del Al es su capacidad de desplazamiento del
calcio (Ca) en los sistemas biológicos, con los correspondientes efectos secundarios que esto
pueda conllevar. Además el Al se puede acumular en distintos órganos y tejidos, sobre todo
en pacientes con enfermedades renales, lo que produce una gran toxicidad. La acumulación
de Al está relacionada con fenómenos característicos como demencia, enfermedades óseas y
anemia. La ingesta de agua con grandes dosis de Al y la baja ingesta de Ca se halla
relacionada con el desarrollo de trastornos neurológicos, incluido el Alzheimer, aunque se
trata todavía de un aspecto especulativo (Solfrizzi 2006).
Estudios realizados in vitro y en animales han podido demostrar que la intoxicación por Al
actúa inhibiendo a diferentes enzimas entre ellas la acetilcolinesterasa, L-glutamato, GABA,
hexoquinasa y dihidropterina reductasa (DHPR). La reducción de la actividad de estas
enzimas debido a la intoxicación por Al pueden dar lugar a cambios neurológicos como
reflejo de una alteración del metabolismo de los neurotransmisores (Vasudevaraju 2008).
Varios investigadores también han sugerido que el Al puede inducir neurotoxicidad
afectando la homeostasis del Fe e incrementando el daño neuronal inducido por RL mediado
por Fe. El Al tiene un número de oxidación fijo y por lo tanto no puede participar en las
reacciones redox. Sin embargo, puede producir un reordenamiento de los lípidos de
membrana que ha demostrado facilitar la peroxidación lipídica iniciada por el Fe. Otros
estudios han señalado que el Al se puede unir a la ferritina en el cerebro e incrementar los
niveles de Fe catalíticamente activo.
La relación del Al con la enfermedad de Alzheimer también se establece por el elevado
contenido de Al en tejidos cerebrales de pacientes fallecidos por la enfermedad (Andrasi
2005). Diferentes trabajos también han demostrado que la agregación de la proteína β-
Introducción
44
amiloide está fuertemente influenciada por la conjugación de los péptidos con iones
metálicos como el Al (Drago 2008; Yumoto 2009). Se ha evidenciado, además, la presencia
de Al en los núcleos de las neuronas con degeneración neurofibrilar y en el centro de las
placas seniles (Candy 1986), observándose una concentración aumentada en los cerebros
(Smorgon 2004; Andrasi 2005) y sangre (Basun 1991; Zapatero 1995) de pacientes con
enfermedad de Alzheimer.
1.5.4.2. Cadmio
El Cadmio (Cd) es un metal pesado tóxico para el organismo, aunque podría ser un elemento
químico esencial. Sus características toxicológicas derivan de su semejanza química con el Zn.
El Cd es biopersintente y una vez absorbido por un organismo sigue siendo residente por
muchos años (décadas del excedente para los seres humanos) aunque se excreta
eventualmente. Al igual que el Hg no cumple función fisiológica conocida.
El Cd es incapaz de generar directamente RL, sin embargo, participa indirectamente en la
generación de varios radicales como los radicales superóxido, hidroxilo y óxido nítrico (Galán
2001). Esto es debido a que el Cd puede reemplazar al Fe y el Cu en diversas proteínas
citoplasmáticas y de membrana, aumentando así la cantidad de iones libres de Fe y Cu que
participan en la inducción de EO a través de la reacción de Fenton (Watjen 2004).
En la EA la exposición ambiental a algunos metales pesados como el cadmio parece ser un
factor de riesgo, sin embargo, el mecanismo definitivo de su toxicidad queda todavía por
dilucidar. Además de su intervención en el proceso de EO parece que el Cd interacciona con
la proteína Tau interfiriendo sobre la conformación y la auto-agregación de este péptido
relacionado con la patogenia de la EA (Jiang 2007).
Existe controversia entre los distintos estudios sobre el Cd en la enfermedad de Alzheimer.
Aunque existen estudios que han encontrado una concentración disminuida de Cd en LCR
(Basun 1991), la mayoría de estudios no han encontrado diferencias en plasma, LCR o
Introducción
45
cerebro entre pacientes con Alzheimer y controles (Basun 1994; Panayi 2002; Gerhardsson
2008).
1.5.4.3. Cobalto
El Cobalto (Co) es considerado un elemento esencial en el hombre. Es fácilmente absorbido
en el intestino delgado y se excreta por la orina. La única función conocida del Co, hasta
ahora, es formar parte de la vitamina B12. Una deficiencia en Co no se produce nunca en
humanos. Los signos y síntomas de la disminución de la concentración de Co son actualmente
los de la deficiencia de la vitamina B12 que provoca, entre otras, principalmente alteraciones
neurológicas.
El Co se utiliza en el tratamiento de anemias porque produce un aumento de glóbulos rojos.
Su toxicidad es relativamente baja en comparación con otros metales, sin embargo, es tóxico
y cancerígeno en concentraciones elevadas. Esto se debe a que el Co puede interferir en los
procesos de reparación del ADN causando directamente daños en el ADN.
El Co está implicado en la generación de RL. Mientras que el mecanismo de toxicidad
inducido por el Co no está plenamente esclarecido, el proceso de generación de RL mediado
por el Co si se conoce que contribuye a la toxicidad y carcinogenicidad del Co.
El Co se ha encontrado disminuido en sangre de pacientes con Alzheimer (Smorgon 2004)
aunque en algunos casos sin diferencias significativas (Gerhardsson 2008), pero no existen
demasiados estudios del Co en la enfermedad de Alzheimer.
1.5.4.4. Cobre
El cobre (Cu) es un metal esencial necesario para el funcionamiento del organismo. Equipado
con un alto potencial redox, el Cu sirve como cofactor de proteínas que participan en una
variedad de reacciones biológicas tales como la fotosíntesis y respiración,
Introducción
46
la formación de tejido conectivo, el metabolismo del hierro, la erradicación de los radicales
libres y la función neurológica (Kuo 2001).
El cerebro es tras el hígado el segundo órgano que contiene la mayor concentración celular
de Cu de todo el cuerpo. Su presencia en el cerebro corresponde a la distribución de las
enzimas dependientes de Cu, como la citocromo C oxidasa, dopamina-β-hidroxilasa (síntesis
catecolaminas) y actividad catalítica superóxido dismutasa (SOD). El cobre está implicado
directa o indirectamente en la patogénesis de muchas enfermedades neurológicas como la
enfermedad de Huntington, la enfermedad de Menkes, la enfermedad de Parkinson, la
enfermedad de Wilson entre otras, además de la enfermedad de Alzheimer.
Es un hecho constatado que en las deficiencias de Cu producen trastornos neurológicos
(Desai 2008). A su vez se sabe que el Cu, por encima de las necesidades celulares, participa
en la producción de RL y en la oxidación directa de lípidos, proteínas y ADN, al mismo
tiempo que potencian la formación y la agregación del depósito de β-amiloide (Castellani
2004; Huang 2004; Cuajungco 2005; Strozyk 2009).
Por todo ello es de gran interés el estudio de este metal en la enfermedad de Alzheimer por
su posible implicación en el desarrollo de la enfermedad, aunque existen resultados
discordantes. Algunos estudios lo han encontrado aumentado tanto en placas seniles (Lovell
1998) como en suero (Squitti 2002; Smorgon 2004). Sin embargo, otros trabajos han
relacionado una disminución de los niveles de Cu en plasma con el deterioro cognitivo que se
da en la enfermedad de Alzheimer (Pajonk 2005; Vural 2010) o en cambio no han encontrado
diferencias en este metal entre pacientes y controles (Gerhardsson 2008).
1.5.4.5. Cromo
El Cromo (Cr) es un elemento Traza esencial que participa en el metabolismo de lípidos y
carbohidratos y estimula la síntesis de ácidos grasos y colesterol, los cuales son relevantes
para las funciones cerebrales y otros procesos corporales. Es también un activador de varias
enzimas que se requieren para dirigir numerosas reacciones químicas necesarias en la vida.
Introducción
47
Los principales grados de oxidación en los que existe el cromo son Cr II, que es muy inestable
y tiene poca importancia biológica, Cr III y Cr VI. Los compuestos del Cr VI tienen mayor
toxicidad. El Cr VI una vez absorbido penetra en el torrente circulatorio donde se reduce a Cr
III, bien a nivel celular o bien en el hematíe. Según el estado de oxi-reducción del compuesto
el transporte es diferente: el Cr III se une a las proteínas plasmáticas, mientras que el Cr VI lo
hace a los hematíes.
El Cr se considera un metal oxidante productor de RL y por ello lo incluiremos en nuestro
estudio. Aunque no es un metal que se haya estudiado demasiado en la enfermedad de
Alzheimer, los pocos autores que lo han analizado han referido cantidades disminuidas de
este metal en sangre de pacientes con Alzheimer (Smorgon 2004).
1.5.4.6. Hierro
El Hierro (Fe) es un metal de transición esencial para la vida puesto que participa
prácticamente en todos los procesos de oxidación-reducción. Está presente en numerosas
enzimas involucradas en el mantenimiento de la integridad celular, tales como las catalasas,
peroxidasas y oxigenasas. Además el 65% del Fe del organismo forma parte de la
hemoglobina, el 10% forma parte de la mioglobina, citocromos y enzimas, y el 25% se
encuentra en proteínas como la ferritina, hemosiderina y transferrina.
El Fe participa en la formación de RL mediante la producción del radical OH- que
posteriormente puede iniciar la oxidación de lípidos u otras moléculas y además las
reacciones de estos RL pueden propagarse por descomposición de peróxidos.
Todo lo anteriormente expuesto hace que el Fe desempeñar una función clave en la toxicidad
mediada por metales, actuando tanto como oxidante (catalizando la producción de EROs)
como antioxidante (formando parte de la catalasa).
Aunque las interrelaciones no son completamente claras, también se ha comentado que
altos depósitos de Fe pueden incrementar el riesgo de enfermedad de Alzheimer. Se ha
Introducción
48
demostrado que el Fe puede acelerar la agregación del péptido β-amiloide que se forma en
lo cerebros de pacientes con Alzheimer (Huang 2004; Castellani 2005; Cuajungco 2005).
Además su elevado potencial redox participa en el proceso de EO que se da en la enfermedad
de Alzheimer (Honda 2004), mediante la formación de OH•- a través de la reacción de
Fenton, dando lugar al daño oxidativo a nivel de lípidos, proteínas y ADN (Smith 1997;
Castellani 2004).
Los estudios que han determinado los niveles de este metal en pacientes con enfermedad de
Alzheimer han dado lugar a resultados contradictorios. Unos han observado un aumento de
este metal en las placas amiloides, en los ovillos neurofibrilares, en el cerebro de pacientes
con Alzheimer (Lovell 1998) y en suero (Ozcankaya 2002), mientras que otros lo han
encontrado disminuido en suero (Smorgon 2004; Vural 2010).
1.5.4.7. Manganeso
El Manganeso (Mn) es un metal de transición con actividad redox esencial para el organismo
que se encuentra en concentraciones Traza, pero que su aumento produce toxicidad.
Aunque el Mn es un metal redox, basado en su reactividad en el organismo no es
considerado como tal. Sin embargo, puede existir en 6 estados de oxidación (Mn2+ a Mn7+),
tres de los cuales (Mn5+ a Mn7+) no se observan en sistemas biológicos, siendo su forma más
común Mn2+.
El Mn funciona en el cuerpo como un activador enzimático para aquellas enzimas que
intervienen en la transferencia de un grupo fosfato (p. ej. fosfato tranferasas y fosfato
dehidrogenasas), particularmente aquellas involucradas en el ciclo del ácido cítrico,
incluyendo la arginasa, fosfatasa alcalina y hexoquinasa. También es un componente esencial
de la enzima piruvato carboxilasa. Como cofactor o componente de varios sistemas
enzimáticos claves, el manganeso es esencial en la formación de huesos (p. ej: en la síntesis
de mucopolisacáridos), regeneración de células sanguíneas, metabolismo de carbohidratos y
el ciclo reproductivo. Dentro de los sistemas biológicos, el catión Mn2+compite
Introducción
49
frecuentemente con el Mg2+ por lo que también puede funcionar como un cofactor para
muchas enzimas que requieren magnesio.
Su papel en el proceso de EO se debe a su presencia en distintas enzimas, destacando la
superóxido dismutasa de manganeso (Mn-SOD), que cataliza la dismutación de superóxidos,
O2- y la Mn-catalasa, que cataliza la dismutación de peróxido de hidrógeno, H2O2.
La influencia del Mn sobre la actividad cerebral y nerviosa es compleja y va ligada a su
carácter esencial. La consecuencia es que el cerebro es sensible a la carencia de este metal,
con variaciones importantes en las consecuencias en función de la edad y las características
genéticas de cada persona. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, existen resultados
contradictorios con respecto a este metal. Hay estudios donde han encontrado este metal
disminuido en sangre (Basun 1991) y en LCR (Gerhardsson 2008) mientras otros han visto un
aumento en sangre (Gerhardsson 2008) o no han encontrado diferencias entre pacientes y
controles (Smorgon 2004).
1.5.4.8. Mercurio
El Mercurio (Hg) es un metal toxico para el organismo que no tiene ninguna función biológica
conocida. Sus efectos tóxicos afectan al sistema nervioso central y periférico, además de
tener cierta actividad corrosiva en otros órganos.
El Hg se une a las proteínas y produce una alteración difusa de la función celular, inhibición
de la síntesis proteica, que puede dañar el ADN e interrumpir la división celular. Interfiere
con el desarrollo de los microtúbulos del esqueleto neuronal, afecta la integridad de la
membrana celular haciéndola más adherente (esto explica porque está alterada la migración
celular) y afecta la transmisión sináptica, causando daño al cerebro y al SNC.
Estudios experimentales de este metal en pacientes con Alzheimer indican un papel decisivo
de este metal en la etiología de la enfermedad (Mutter 2007). Varios estudios in vivo e in
vitro han demostrado que la exposición de animales a formas de Hg se acompaña con la
Introducción
50
inducción de EO demostrando un aumento de la peroxidación lipídica y de enzimas
antioxidantes como respuesta a un mecanismo de protección de las células contra las EROs
(Lund 1993). La toxicidad del Hg se debe a que produce un agotamiento del glutatión y se
une a los grupos sulfidrilos de las proteínas (Valko 2005).
Los niveles de Hg se han visto aumentados en sangre (Hock 1998; Gerhardsson 2008) y
cerebros (Cornett 1998) de pacientes con Alzheimer, aunque en LCR no se han encontrado
diferencias entre pacientes y controles (Gerhardsson 2008).
1.5.4.9. Níquel
El Níquel (Ni) es un micronutriente esencial que no tiene sus funciones bien establecidas ya
que es difícil lograr una deficiencia sin que se produzcan déficits de otros elementos,
modificaciones de otros nutrientes o contaminaciones del propio metal. Se conoce que la
intoxicación aguda por inhalación de carbonilo de Ni produce síntomas predominantemente
respiratorios y neurológicos.
Debido a que es un metal redox, posible productor de RL (Valko 2005) y por el
desconocimiento que se tiene de las posibles implicaciones del metal en las enfermedades
degenerativas, lo incluiremos en nuestro estudio. Los escasos trabajos en los que han medido
este metal en pacientes con la enfermedad de Alzheimer, no han encontrado diferencias
entre sus niveles en sangre comparados con un grupo control (Basun 1991; Gerhardsson
2008).
1.5.4.10. Selenio
El Selenio (Se) es un elemento Traza esencial con interés nutricional y clínico. Es el menos
abundante y potencialmente el más tóxico de los elementos esenciales. Si bien la carencia de
selenio resulta perjudicial para la salud su exceso puede resultar tóxico, pero esto ocurre en
casos excepcionales y poco probables cuando se supera la dosis de 500 µg. Sus efectos
pueden expresarse con la aparición de la enfermedad denominada selenosis.
Introducción
51
La función biológica del Se se ejerce a través de las selenoproteínas las cuales tienen una
importante propiedad antioxidante en el organismo. Por otra parte, las selenoproteínas,
colaboran en la regulación de la función tiroidea y representan un papel importante en el
sistema inmune.
Hasta el momento se han identificado unas 35 selenoproteínas, aunque en muchos casos no
se ha aclarado totalmente su función biológica. La selenoproteína más importante es la
glutatión-peroxidasa (GPx). Esta enzima contiene 4 átomos de Se por molécula y su función
es la de prevenir el daño oxidativo en las células. Una disfunción de esta enzima conduce a la
acumulación de hidroperóxidos debido a que la enzima participa en la eliminación de H2O2 e
hidroperóxidos orgánicos y se relaciona con multitud de síntomas asociados con el déficit de
Se. La actividad GPx se correlaciona bastante bien con el contenido de Se en sangre y tejidos
en estados deficitarios, pero no cuando las concentraciones son altas.
Existen algunas evidencias que indican que el Se es importante para la función cerebral:
durante la depleción de selenio el cerebro tiene prioridad en el suministro de este elemento;
la tasa de recambio de algunos neurotransmisores se altera durante la deficiencia de Se; la
suplementación con Se reduce las convulsiones epilépticas intratables en los niños y se
advierte una aceleración de la declinación cognitiva en los ancianos con niveles séricos
reducidos de Se. También se ha observado que la reducción de los niveles séricos de Se se
asocia con una mayor incidencia de depresión y otros estados negativos del humor, tales
como la ansiedad, la confusión y la hostilidad y de modo contrario, la ingesta elevada o la
suplementación con este elemento parece mejorar el humor (Whanger PD 2001; Chen J
2003).
En el caso de la enfermedad de Alzheimer, la mayoría de estudios donde han medido los
niveles de Se han encontrado unos niveles disminuidos de este mental en sangre (Smorgon
2004; Gerhardsson 2008; Vural 2010) aunque existe algún estudio anterior que refería unos
niveles aumentados (Basun 1991) o bien alguno que no encontró ninguna diferencia entre
grupos (Meseguer 1999). Los estudios que han medido este elemento en LCR no han
Introducción
52
encontrado diferencias estadísticamente significativas entre pacientes con Alzheimer y
controles (Meseguer 1999; Gerhardsson 2008).
1.5.4.11. Vanadio
El Vanadio (V) es un mineral que se encuentra en la sangre, en los huesos y en los tejidos. Es
un elemento esencial en algunos organismos, aunque en humanos no está demostrado. El V
funciona como coenzima en numerosas enzimas del metabolismo de los azúcares, lípidos y
del colesterol, tiene propiedades insulinomiméticas y se ha demostrado que estimula la
proliferación y diferenciación celular. Se cree también que regula las reacciones de
fosforilación y desfosforilación a través del control de ATPasas, fosfatasas y adenilciclasa, lo
que tiene amplios efectos en las funciones celulares. Debe notarse, sin embargo, que no se
ha demostrado todavía que el vanadio sea un activador o inhibidor específico de alguna
enzima en humanos. La carencia de V no se ha descrito en los humanos.
El V es un metal con actividad redox capaz de generar RL y muy pocos estudios lo han
relacionado con la enfermedad de Alzheimer (Valko 2005). En estudios donde se han medido
sus niveles en plasma y LCR, no han encontrado diferencias entre pacientes con Alzheimer y
controles, aunque en LCR se encontraron niveles superiores en pacientes sanos (Gerhardsson
2008).
1.5.4.12. Zinc
El Zinc (Zn) es un metal esencial para el organismo contribuyendo al mantenimiento de la
integridad de la membrana celular y en el desarrollo y mantenimiento del sistema
inmunológico. Es componente de más de 70 enzimas diferentes que participan en el
metabolismo de las proteínas, lípidos e hidratos de carbono (Parkin 2004).
En el cerebro, las concentraciones de Zn son mayores en el hipocampo, la amígdala y la
corteza, y son relativamente bajos en el cerebelo. En general, las concentraciones de Zn en el
cerebro son aproximadamente 10 veces superiores a los niveles séricos de Zn (Dong 2008).
Introducción
53
Existe un transporte de Zn de la sangre al cerebro a través de la barrera hematoencefálica,
regulada por unas proteínas transportadoras de Zn. En comparación con otro tipo de tejidos,
el cerebro humano contiene cantidades significativas de Zn, por ello la deficiencia de Zn
puede llevar a trastornos en el SNC.
El Zn es un metal redox inerte y no participa en reacciones de oxidación-reducción, pero
actúa como un antioxidante por su implicación en dos mecanismos diferentes: (I) en la
protección de grupos sulfidrilos de proteínas y enzimas contra el ataque de los RL, o la
oxidación, y (II) reduciendo la formación de OH• a partir de H2O2 a través de la prevención
de la formación de RL o en otras palabras, como antagonista de la actividad redox de metales
de transición, tales como el hierro (Fe) y el cobre (Cu) (Bray 1990). Además el Zn es cofactor
de la SOD, una de las principales enzimas antioxidantes del organismo. Por ello la deficiencia
de Zn se asocia con un aumento de daño oxidativo que incluye un aumento de oxidación de
lípidos, proteínas y ADN (Oteiza 2000).
El papel del Zn en el etiología de la enfermedad de Alzheimer resulta muy controvertido, ya
que algunos autores han relacionado este metal con la formación de las placas amiloides
(Lovell 1998; Huang 2004; Cuajungco 2005; Strozyk 2009), mientras otros han encontrado
disminuido este metal tanto en las placas amiloides (Panayi 2002) como en suero
(Baum2010; Vural 2010).
HIPÓTESIS DE TRABAJO
57
Hipótesis de trabajo
Existen suficientes indicios en la literatura como para pensar que el estrés oxidativo es uno
de los eventos que se dan en la enfermedad de Alzheimer sin que hasta el momento
presente esté bien definido el comportamiento de los diferentes agentes moleculares
implicados.
El estrés oxidativo se produce debido a cambios en los niveles de sustancias oxidantes y/o
antioxidantes, bien por el aumento de los primeros o la disminución de los segundos, que
darán lugar a elevaciones en los niveles de moléculas oxidadas.
No están descritos marcadores bioquímicos de estrés oxidativo que permitan detectar la
presencia de la enfermedad de Alzheimer, ni cuando la enfermedad está bien establecida ni
en sus etapas precoces, y el diagnóstico se basa en datos clínicos a través de la realización de
test cognitivos. Es mas, existen pocos trabajos que revisen durante la fase de DCL el
comportamiento de metales, enzimas y vitaminas antioxidantes y los resultados en la
enfermedad de Alzheimer son contradictorios para muchos de ellos.
Esto nos lleva a plantear la hipótesis de que los pacientes con Alzheimer pueden presentar
diferencias en las concentraciones de los marcadores de estrés oxidativo como son productos
de estrés oxidativo, actividades enzimáticas, vitaminas antioxidantes y otros agentes
oxidantes y antioxidantes con respecto a sujetos sanos, y que incluso dichas diferencias
pueden presentarse en las fases iniciales de evolución a la demencia tipo Alzheimer, es decir,
durante la etapa de DCL.
OBJETIVOS
61
Objetivos
1. Optimizar los métodos de análisis de los diferentes marcadores sanguíneos de estrés
oxidativo y evaluar sus prestaciones analíticas para los objetivos propuestos.
2. Determinar las concentraciones de diferentes marcadores sanguíneos relacionados con el
estrés oxidativo en ancianos sanos y en ancianos afectos de DCL y Alzheimer.
3. Comparar dichos marcadores de estrés oxidativo entre los tres grupos de sujetos y
determinar si existen diferencias que permitan su utilización en la práctica asistencial
para la identificación y seguimiento de pacientes afectos.
4. Evaluar las interrelaciones existentes entre agentes antioxidantes no metálicos; metales y
elementos Traza antioxidantes y/o oxidantes y de actividad desconocida con los
productos resultantes de la actividad oxidativa (MDA).
5. Determinar las asociaciones presentes entre los metales y elementos Traza con enzimas y
vitaminas antioxidantes que participan en el estrés oxidativo en los diferentes grupos de
estudio.
6. Analizar el comportamiento de los distintos marcadores en el grupo de DCL que permita
identificar y diferenciar, entre los sujetos afectos de DCL, los que van a progresar a
Alzheimer y los que no.
SUJETOS A ESTUDIO
Sujetos a estudio
65
4.1. RECLUTAMIENTO DE PACIENTES Y CONTROLES
El reclutamiento de los pacientes y sujetos control ha sido realizado por el Servicio de
Neurología del Hospital General Universitario (H.G.U) de Elche dirigido por el Dr. Jordi Alom
Poveda (Jefe de Servicio de Neurología) que junto con Isabel Llinares Ibor (Neuropsicóloga de
la Unidad) han evaluado y clasificado a todos los sujetos de estudio.
Los pacientes con Alzheimer y DCL procedían de las Consultas Externas del Servicio de
Neurología, mientras que los sujetos control procedían de la Residencia de la 3ª edad de San
Isidro (Alicante).
A todos los sujetos del estudio o familiares se les informó a cerca de la investigación a
realizar y se les facilitó un documento de consentimiento informado para su participación
voluntaria en el estudio. (Anexo II)
4.2. SELECCIÓN DE PACIENTES Y CONTROLES
Todos los sujetos del presente estudio fueron evaluados para su inclusión en uno de los
grupos definidos. Además, se aplicaron los criterios generales tanto de inclusión como de
exclusión que se exponen a continuación:
Criterios de inclusión: Sujetos de más de 60 años con actividad ambulatoria.
Criterios de exclusión: Sujetos que presenten patologías en las que existe la posibilidad de
daño oxidativo (Figura 8) tales como: diabetes insulina-dependiente, insuficiencia renal
crónica, malnutrición, enfermedad inflamatoria de más de dos meses de evolución o sujetos
que tomen suplementos vitamínicos, agentes quelantes de metales, o sustancias que puedan
influir en las determinaciones de nuestro estudio.
Sujetos a estudio
66
Figura 8
http://institutobiologico.com/seminarios/imágenes/stop4.jpg
En todos los casos se han empleado los criterios estandarizados de diagnóstico y se ha
controlado analíticamente la presencia alguna patología de las descritas como criterio de
exclusión que pudiera interferir en este estudio.
El protocolo de estudio estándar para la exclusión de otras patologías neurológicas consiste
en el examen neurológico y neuropsicológico encaminado a detectar alteraciones focales
(tumoraciones, hematomas, etc.) o signos de afectación bilateral (atrofias, etc) que señalen
una causa secundaria de demencia o indiquen el origen primario del deterioro del cerebro
(p.e., degeneración). Los pacientes del estudio quedaron distribuidos en los siguientes
grupos:
Pacientes con Alzheimer: 36 pacientes afectos de Alzheimer probable, según criterios de
McKhann 1984. Se seleccionaron aquellos pacientes que no habían comenzado con
tratamiento anticolinesterásico.
Sujetos a estudio
67
Pacientes con DCL: 18 pacientes afectos de DCL que cumplían los siguientes criterios de
inclusión: informador fiable, CDR 0.5, actividades habituales de su vida diaria correctas (sin
limitación ni supervisión), MMSE ≥ 24 (20 en analfabetos). Los pacientes que cumplieron
criterios DCL se les aplicó protocolo y escala clínica, presentada a la Sociedad Española de
Neurología (Alom 2004) y estudio neuropsicológico consistente en: MMSE, test de
vocabulario de Boston (Kaplan, Goodglass, & Weintraub, 1986), test de Weschler de
memoria (Wechsler, 1995) (textos, palabras asociadas, control mental, información, dígitos
directos e inversos), memoria visual (subtest del test Barcelona), fluidez verbal (palabras con
P, animales), Trail making A, clave de números y cubos del test Wais.
Este grupo de pacientes fue reevaluado periódicamente para su diagnostico de enfermedad
de Alzheimer probable o el mantenimiento de su situación de DCL. De los resultados
obtenidos en un estudio previo en nuestro Hospital (Alom 2007), en el que se evaluaron las
características clínicas y neuropsicológicas de un grupo de pacientes afectados de DCL, en el
intento de identificar aquellos que evolucionarían a enfermedad de Alzheimer, se obtuvieron
13 variables clínicas y neuropsicológicas con valor significativo. Tras un análisis de regresión
logística realizado con esas 13 variables, para obtener la sensibilidad y especificidad
diagnósticas óptimas, se seleccionaron 7 variables: edad, tiempo de evolución, repetición de
comentarios, dificultad para comprender explicaciones, antecedentes depresivos, déficits
sensoriales y fluidez verbal de animales. Con el análisis de regresión logística de estas 7
variables se diagnosticó correctamente al 97% de la muestra (100% de los DCL que
progresaron a enfermedad de Alzheimer, y 94,4% de los DCL que no progresaron). Esta
“batería clínica” se ha utilizado en nuestro grupo de pacientes con DCL, en aquellos casos que
no han transcurrido 3 años de evolución de su deterioro, para ver si progresaban o no a
Alzheimer.
Grupo de sujetos control: 33 individuos sanos sin evidencia de deterioro cognitivo
(confirmado por informador) ni patología neurológica conocida y con un MMSE≥ 24 (20 en
analfabetos).
Sujetos a estudio
68
4.3. ESTUDIO GENERAL DE LOS PACIENTES Y CONTROLES
A todos los sujetos del estudio se les ha realizado un historial clínico que recogía los
siguientes datos: edad, sexo, nivel escolar, antecedentes de depresión, antecedentes
familiares de demencia y MMSE. En el caso de los pacientes se registró además: motivo de
consulta, tiempo de evolución de su enfermedad y escala funcional. Todo esto acompañado
de los análisis rutinarios, encaminados a descartar otras patologías de base, como son:
hemograma, bioquímica sérica, análisis de orina, hormonas tiroideas, vitaminas B12 y ácido
fólico, serología luética, así como pruebas de imagen como radiografía de tórax y la
tomografía axial computerizada cerebral o pruebas funcionales como electrocardiograma o
electroencefalograma y otras pruebas diagnosticas optativas como el proteinograma, análisis
del líquido cefalorraquídeo, VIH, electromiografía, arteriografía, resonancia magnética,
cardiografía-electroencefalograma, potenciales evocados, tomografía por emisión de fotón
único, etc…
Las determinaciones analíticas realizadas y su utilidad para el despistaje de las enfermedades
y/o el estado nutricional de los sujetos a estudio, que podrían plantear su exclusión son las
siguientes:
HEMOGRAMA: La serie roja permite la valoración de anemia y en la serie blanca nos
ayuda a detectar enfermedades hematológicas e infecciosas.
FUNCIÓN RENAL: Urea, creatinina, electrolitos (sodio, potasio y cloro), calcio y
fosforo.
FUNCIÓN METABÓLICA: Glucosa, acido úrico, proteínas totales.
PROTEÍNAS PLÁSMATICAS: Albúmina, ferritina, transferrina, ceruloplasmina y
proteína C reactiva (PCR).
LÍPIDOS: Colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol y triglicéridos.
Sujetos a estudio
69
FUNCIÓN HEPÁTICA: Transaminasas (GOT/GPT), bilirrubina total, GGT y fosfatasa
alcalina.
EVALUACIÓN DEL TIROIDES: TSH.
NIVELES DE VITAMINA B12, FOLATO Y HOMOCISTEÍNA.
ACTIVIDAD ADRENAL: Cortisol.
SEROLOGÍA LUES Y VIH: Permite detectar demencias que pueden causar estas
infecciones.
MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN
Materiales e Instrumentación
73
El Servicio de Análisis Clínicos del H.G.U de Elche dispone del personal de enfermería
cualificado para la obtención de las distintas muestra y los equipos necesarios para la
conservación de las mismas en las condiciones adecuadas, como son: centrífugas de frío
Eppendorf 5804R y temperatura ambiente Rotina 35 Hettich, congelador New Brunswick
Scientific U 410 Premium (-80ºC) y neveras domésticas (0-4 º C).
Cuenta, además, con el equipamiento general de utillaje básico (pipetas automáticas,
agitadores, etc.) así como de material fungible (tubos desechables, puntas de pipetas, etc.) y
material fungible específico como tubos de silicona, tubos Falcon de 50 ml, tubos eppendorf,
tubos libres de metales, etc..
Además del equipamiento general contamos con el siguiente equipamiento específico:
- Contador hematológico Cell-dyn 3700 (Abbott Científica), para realizar las determinaciones
hematológicas.
- Autoanalizador Immulite 2000 (DPC), para las determinaciones hormonales de TSH,
cortisol y la concentración de homocisteína.
- Analizador Architect i2000 (Abbott Científica), para las determinaciones de vitamina B12 y
ácido fólico.
- Autoanalizador Olympus AU 5400, para las pruebas bioquímicas e inmunoquímicas de
rutina (Tabla 2):
Materiales e Instrumentación
74
Tabla 2: Determinaciones realizadas en el autoanalizador OLYMPUS.
GLUCOSA UREA CREATININA ÁCIDO ÚRICO PROTEÍNA C
REACTIVA
CALCIO FÓSFORO SODIO POTASIO CLORO
COLESTEROL
TOTAL
COLESTEROL-
HDL
COLESTEROL-
LDL TRIGLICÉRIDOS ALBÚMINA
GOT GPT GGT FOSFATASA
ALCALINA
BILIRRUBINA
TOTAL
PROTEINAS
TOTALES CERULOPLASMINA FERRITINA TRANSFERRINA
- Equipo de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) Agilent 1100 series (Bio-Rad), con
un detector ultravioleta (Agilent, modelo 1100) para las determinaciones de vitamina A y E y
detector fluorescente (Waters, modelo 474) para la determinación de MDA. Especificaciones
de los componentes del sistema HPLC:
BOMBA: con capacidad para flujos de 0,6 ml/minuto y de una presión de hasta 300
kg/cm2.
AMORTIGUADOR DE PULSO: con capacidad para producir una línea de base inicial sin
ruidos a una absorbancia de 0,01 unidades en el monitor UV.
DESGASIFICADOR: se recomienda el uso de un sistema de desgasificación para evitar
la formación de burbujas de aire.
INYECTOR: con capacidad para una inyección precisa de 20 μl. Puede tratarse de un
bucle manual, una jeringa o un inyector de muestras automático.
Materiales e Instrumentación
75
CALEFACTOR DE COLUMNAS: debe ser capaz de contener la columna analítica. Debe
poder mantener una temperatura constante de 40 ° C ± 1 ° C.
GRABADORA/INTEGRADOR: con capacidad de monitorizar la salida del monitor UV.
-Autoanalizador centrífugo Cobas Mira Plus (Roche) para las determinaciones de enzimas
antioxidantes SOD, GPx y GR.
En el laboratorio de la empresa LABAQUA, donde vamos a realizar las determinaciones de los
metales en suero, se dispone del siguiente equipamiento:
- Espectrofotómetro de emisión de plasma con detección por espectrometría de masas
(ICP-MS) Agilent 7500i para la determinación simultanea de metales (Zn, Cu, Se, Al, Mn, Hg,
Cd, Fe, Cr, V, Co y Ni) en muestras de suero. Como principales características técnicas
podemos destacar:
Un sistema de introducción de muestras refrigerado mediante una cámara Peltier de
segunda generación que permite reducir los problemas de especies moleculares.
Posee un sistema de generación de radiofrecuencia que trabaja a 27.12MHz de potencia
lo que le proporciona una eficiente ionización y unos bajos niveles de combinaciones
matrices-óxidos. Este diseño junto con otras modificaciones hacen de este equipo el que
menor relación CeO/Ce (medida indirecta de las interferencias por óxidos) de cualquier
ICP-MS comercial.
El interfaz de introducción de muestra está diseñado para resistir altos niveles de sólidos
disueltos ya que minimiza el camino dentro del ICP haciendo que el volumen de muestra
introducido sea muy pequeño y por lo tanto no se produzcan interferencias por matriz y
pudiendo introducir prácticamente cualquier tipo de muestra.
Materiales e Instrumentación
76
Posee un sistema de detección de modo dual y por pulsos de forma simultánea (a
diferencia de otros ICP-MS) lo que le proporciona una gran velocidad de análisis en un
alto rango lineal (9 órdenes de magnitud).
Además el modelo 7500i del que disponemos está optimizado para cualquier tipo de
muestra ya que incorpora el sistema ISIS (Integrate Sampli Introduction System). Este
sistema dispone de una bomba peristáltica de tres canales que permiten autodiluciones,
sistema de limpieza e introducción de muestra rápida, preparación de muestra para
generador de hidruros, eliminación de matrices, etc. Además dispone de dos válvulas
“switching” que permite el trabajar con sistemas cromatográficos y sistemas para la
especiación de metales.
Todas estas características hacen que mediante este equipo se puedan determinar
concentraciones muy bajas de prácticamente todos los metales con una alta velocidad y
calidad de los resultados.
El equipo está dotado de un sistema de adquisición de datos equipo con dos
microprocesadores. El programa controla un muestreador automático con una capacidad de
hasta 300 muestras y que permite la estandarización automática, autocalibración, chequeo
de control de calidad, etc..
METODOLOGÍA
Metodología
81
La obtención de muestras biológicas y su procesamiento, separación de suero, plasma y
sangre total así como todas las determinaciones bioquímicas, hematológicas y parámetros
del estrés oxidativo, se han realizado en el Servicio de Análisis Clínicos del H.G.U de Elche. Las
determinaciones de los elementos metálicos se llevaron a cabo en laboratorio de la empresa
LABAQUA, en la Unidad de Espectrofotometría dirigido por Dña. Isabel de Blas.
6.1. OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS
La extracción sanguínea se realizó a primera hora de la mañana, en ayunas de un mínimo de
8 horas.
Las muestras de sangre de cada paciente fueron recogidas en varios tubos: 3 tubos
vacutainer de 7ml especiales para metales Traza (ref: 367737) sin anticoagulantes para las
determinaciones en suero, 2 tubos vacutainer de 3ml con EDTA K3 (ref: 367652) y 2 tubos de
4ml con heparina de Litio como anticoagulante (ref: 6324564) para las determinaciones en
plasma o sangre total.
Para obtener el suero se centrifugaron todos los tubos de suero (vacutainer 7mL), después de
haber coagulado la muestra, a 3000 rpm durante 10 minutos y se realizaron 4 alícuotas para
la determinación de parámetros bioquímicos, hormonas, vitaminas y metales. Para obtener
plasma se centrifugaron inmediatamente en frío, un tubo de EDTA K3 y otro tubo de heparina
de Litio a 3000 rpm durante 10 minutos. Del plasma EDTA se realizaron 2 alícuotas, una para
la determinación de homocisteína y otra para la determinación de MDA y del plasma
heparina se realizó una alícuota para la determinación de GR.
Uno de los tubos con EDTA se utilizo para realizar los recuentos hematológicos, mientras que
otro de los tubos con heparina se empleó para la determinación de GPx y SOD en sangre
total.
Metodología
82
Las determinaciones realizadas en el mismo día de la extracción fueron: hemograma,
bioquímica general, TSH, B12 y ácido fólico. El resto de alícuotas, que no se analizaron en el
momento, fueron congeladas inmediatamente a -80ºC hasta su procesamiento para evitar
posibles degradaciones de las muestras.
6.2. DETERMINACIÓN DE LOS PERFILES ANALITICOS BASICOS (BIOQUÍMICO,
HEMATOLÓGICO Y HORMONAL)
Las determinaciones bioquímicas, hematológicas y hormonales forman parte de la Cartera de
Servicios del Servicio de Análisis Clínicos del H.G.U. de Elche y se realizan de acuerdo a los
métodos de rutina.
Los niveles de glucosa, urea, creatinina, ácido úrico, proteínas totales, calcio, fósforo,
sodio, potasio, cloro, colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos, GOT,
GPT, GGT, fosfatasa alcalina, bilirrubina total, proteína C reactiva, ceruloplasmina,
ferritina transferrina y albúmina se realizaron en suero en el Autoanalizador Olympus AU
5400.
La vitamina B12 y el ácido fólico se realizaron en suero en el analizador Architect i2000
(Abbott Científica) mediante un inmunoensayo quimioluminiscente.
Las determinaciones hormonales de cortisol y TSH se realizaron en suero en el
autoanalizador Immulite 2000 (DPC) mediante un inmunoensayo quimioluminiscente.
La determinación de homocisteína se realizó en plasma EDTA en el autoanalizador
Immulite 2000 (DPC) mediante un inmunoensayo quimioluminiscente.
Las determinaciones hematológicas: recuento de hematíes, leucocitos y plaquetas,
recuento diferencial de leucocitos, concentración de hemoglobina y hematocrito, así
como los correspondientes índices hematológicos, se realizaron el contador
Metodología
83
hematológico Cell-dyn 3700 (Abbott Científica), el cual combina tecnologías de dispersión
de luz óptica e impedancia.
6.3. MÉTODOS ANALÍTICOS EN EL ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO
6.3.1. Determinación de la actividad de enzimas antioxidantes
Los reactivos para la determinación de las enzimas GPx, GR y SOD fueron suministrados por
RANDOX laboratories (United Kingdom). La medición de las enzimas se realizó adaptando los
métodos enzimáticos al analizador Cobas Mira Plus.
6.3.1.1. Determinación de la actividad Superóxido Dismutasa (SOD)
Reactivos
Composición Concentración
1. Mezcla de Sustrato
Xantina 0.05 mmol/l
I.N.T 0.025 mmol/l
2. Buffer
CAPS 50 mmol/l, pH 10.2
EDTA 0.94 mmol/l
3. Xantina Oxidasa 80 U/l
4. Standard 3.88 u/ml
5. Diluyente de muestra
Buffer Fosfato pH 7.0 0.01 mol/l
Metodología
84
Fundamento de la medición
El papel fisiológico de la SOD es acelerar la dismutación del radical tóxico superóxido (O2-),
producido durante los procesos oxidativos dando lugar a peróxido de hidrógeno y oxígeno
molecular.
2 O2.- + 2H+
SOD H2O2 + O2 REACCIÓN 4
Este método emplea Xantina y Xantina oxidasa (XOD) para generar radicales superóxido
(Reacción 8) los cuales reaccionan con cloruro de 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-
feniltetrazolio (I.N.T.) y formar un complejo con formazán de color rojo (Reacción 9). La
actividad de la SOD es medida como la disminución de la inhibición de esta reacción.
Xantina XOD
Ácido úrico + O2- REACCIÓN 8
I.N.T. Formazán REACCIÓN 9
O2- + O2
- + 2H+ SOD
O2 + H2O2 REACCIÓN 4
Procedimiento
Para esta determinación se utilizó 500 µl sangre total heparinizada que se procesó para
obtener un pellet de hematíes. La muestra se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm y se
eliminó el plasma. Después se lavaron los hematíes 4 veces con 2ml de NaCl al 0.9%
centrifugando 10 minutos a 3000 rpm después de cada lavado. Los hematíes lavados se lisan
con 2 ml de agua destilada fría, dejando incubar durante 15 minutos a 4ºC. El lisado obtenido
se diluye con el Diluyente de muestra al 1:25 y tenemos la muestra lista para procesar. Al
final obtenemos una muestra con una dilución total de 1:100 que se tendrá en cuenta en los
cálculos finales.
O2_
Metodología
85
La técnica se automatizó en el analizador Cobas Mira, preparamos los reactivos según las
indicaciones del fabricante, midiendo el aumento de absorbancia a 500 nm.
Los resultados obtenidos por el Cobas ya incluían la dilución 1:100 y los resultados eran en
U/mL. Para obtener los resultados en U/gHb se dividió por el valor de hemoglobina (Hb) de
cada paciente, que se obtiene del hemograma (la concentración del hemograma es en g/dL
por lo que se dividió por 100 para que obtenerlo en g/mL). Los cálculos fueron:
SOD (U/gHb) = SOD (U/mL) gHb/mL
En cada serie de trabajo se analizo un material de control valorado (ref SD 126, Randox
Laboratories) que permitió garantizar la calidad de las mediciones y la estabilidad de los
reactivos.
Metodología
86
6.3.1.2. Determinación de la actividad Glutatión Peroxidasa (GPx)
Reactivos
Composición Concentración
1. Mezcla de Sustrato
Glutation 4 mmol/l
GR ≥ 0.5 U/l
NADPH 0.34 mmol/l
2. Buffer
Tampón fosfato 0.05 mol/l, pH 7.2
EDTA 4.3 mmol/l
3. Hidroperóxido de cumeno 0.18 mmol/l
4. Agente diluyente
5. Reactivo de Drabkin
Fosfato potásico 104 mmol/l
Ferricianuro potásico 60.8 mmol/l
Cianida potásica 78.8 mmol/l
Fundamento de la medición
La actividad del enzima GPx se determinó de acuerdo con el procedimiento de Paglia y
Valentine (1967). La GPx cataliza la oxidación del Glutatión (GSH) por el hidróxido de cumeno
(ROOH) (Reacción 6). En presencia de GR y NADPH, el glutatión oxidado (GSSG) es
inmediatamente convertido a su forma reducida y el NADPH se oxida a NADP+ (Reacción 7).
La actividad de la GPx se obtendrá de la medida de la disminución de la absorbancia a 340
nm.
Metodología
87
2 GSH + ROOH GPx
ROH + GSSG + 2H2O REACCIÓN 6
GSSG + NADPH + H+ GR
NADP+ + 2GSH REACCIÓN 7
Procedimiento
La determinación se realizó en 50 µl de sangre total heparinizada. Debido a la presencia de
peroxidasas en sangre humana, las cuales dan unos resultados falsamente elevados en la
reacción, usamos para diluir la muestra el reactivo de Drabkins que contiene cianida que
sirve para inhibir estas interferencias.
Primero se diluyó 50 µl de sangre total heparinizada con 1ml de agente diluyente, que
convierte el glutatión a su forma reducida (GSH), y se incubó durante 5 minutos. Después se
añadió 1ml de reactivo de Drabkin se agitó y se procesó la muestra antes de 20 minutos.
La técnica se automatizó en el analizador Cobas Mira, preparamos los reactivos según las
indicaciones del fabricante, midiendo el descenso de absorbancia a 340 nm.
Los resultados directos obtenidos por el Cobas multiplican por el factor de dilución de la
muestra, en nuestro caso es 41, y los resultados obtenidos se expresan en U/L. Para obtener
los resultados en U/gHb se dividió por el valor de Hb de cada paciente que figuraba en el
hemograma (la concentración del hemograma está en g/dL por lo que se multiplicó por 10
para que obtener g/L). Los cálculos fueron:
GPx (U/gHb) = GPx (U/L) gHb/L
En cada serie de trabajo se analizó un material de control valorado (ref SC 692, Randox
Laboratories) que permitió garantizar la calidad de las mediciones y la estabilidad de los
reactivos.
Metodología
88
6.3.1.3. Determinación de la actividad Glutatión Reductasa (GR)
Reactivos
Composición Concentración
2 Buffer
Fosfato potásico 250 mmol/l pH 7.3
EDTA 0.5 mmol/l
3 Sustrato
GSSG * 2.2 mmol/l
4 NADPH 0.17 mmol/l
*Se reconstituye con buffer.
Fundamento de la medición
La GR cataliza la reducción del glutation GSSG en presencia de NADPH, el cual se oxida a
NADP+ (Reacción 7). La disminución de la absorbancia a 340 nm es la que mediremos para
obtener la concentración de GR.
GSSG + NAPDH + H+ GR
2 GSH + NAPD+ REACCIÓN 7
Procedimiento
La determinación de GR se realizó en plasma heparinizado. La técnica se automatizó en el
analizador Cobas Mira y no requiere de manipulaciones previas. Preparamos los reactivos
según las indicaciones del fabricante, midiendo el descenso de absorbancia a 340 nm. El
autoanalizador facilita los resultados directamente expresados en U/L.
Metodología
89
En cada serie de trabajo se analizo un material de control valorado (ref GR 2608, Randox
Laboratories) que permitió garantizar la calidad de las mediciones y la estabilidad de los
reactivos.
6.3.2. Determinación de vitaminas antioxidantes
La concentración de vitamina A y E se midieron simultáneamente mediante HPLC en suero.
Para la conservación y análisis las muestras se protegieron de la luz. El equipo de HPLC
realiza automáticamente los cálculos y permite obtener directamente las concentraciones de
vitamina A y Vitamina E expresadas en µg/dl.
Reactivos
Los reactivos utilizados fueron suministrado por BIO-RAD Laboratories GmbH (München) en
forma de kit y estaba compuesto por:
Solución de trabajo que contiene un estándar interno
Fase móvil
Calibradores y controles
Columna analítica
Fundamento de la medición
Se mezcla la muestra de suero con una solución de trabajo que contiene un estándar interno.
La misión del estándar interno es evaluar la pérdida de vitaminas que se produce durante el
proceso de extracción. Se elimina el precipitado resultante por centrifugación. El
sobrenadante se utiliza para realizar el análisis HPLC en un sistema isocrático. Las muestras
Metodología
90
se separan en una columna de fase inversa y se lleva a cabo la detección UV y la
determinación cuantitativa con la ayuda del estándar interno.
Procedimiento
Para realizar el análisis de la vitamina A y de la vitamina E, se necesitan 250 μl de suero.
Hasta que se llevó a cabo el análisis, las muestras permanecieron congeladas (- 80°C) y
protegidas de la luz. Los reactivos del kit se prepararon según instrucciones del fabricante.
Primero se instaló el prefiltro entre el inyector y la columna analítica
Luego se instaló la columna analítica y del prefiltro en el sistema HPLC, ajustando la
temperatura del calefactor de columnas a 40°C.
Se encendió el detector UV, ajustando la longitud de onda a 340 nm y el rango a 0,02
AUFS (escala completa de unidades de absorción).
Se bombeó la fase móvil a un flujo de 0,6 ml/min para equilibrar todo el sistema hasta
alcanzar una línea de base estable.
Después de una medición de 3 minutos se ajustó el detector a una longitud de onda
de 295 nm y rango = 0,01 AUFS.
Se procedió a inyectar un blanco y un calibrador para comprobar el funcionamiento
del sistema.
Se realizó una calibración al inicio de cada serie analítica, seguida de los controles y de
las muestras de pacientes.
Se procesaron dos controles, nivel bajo y nivel alto, con cada grupo de muestras de
los pacientes.
Metodología
91
Primero se procedió a realizar una extracción de las vitaminas, para ello se mezcló en
un tubo eppendorf de 1,5 mL, 200 μl de suero, control o calibrador, con 400 μl de la
solución de trabajo que contenía el estándar interno. Se mezcló enérgicamente
durante 1min.
Se eliminó el precipitado resultante por centrifugación en una micro-centrífuga
durante 5min a 10,000 x g.
El sobrenadante se transfirió con cuidado en un vial para inyector automático. Para el
análisis, se inyectaron 20 μl del sobrenadante en el HPLC.
El sobrenadante se mantiene estable durante 12 horas en el muestreador automático si éste
está protegido de la luz.
Condiciones del HPLC
Flujo de la bomba 0,6 ml/min
Columna DI de 90 mm x 3,2 mm
Volumen de muestra 20 µl
Temperatura columna 40ºC
Tiempo de retención 2,1 minutos la Vitamina A
7,9 minutos la Vitamina E
Detección 340 nm
transcurridos 3.0 minutos 295 nm
Metodología
92
6.3.3. Determinación de Malondialdehido
Reactivos
Los reactivos utilizados fueron suministrado por Chromsystems Instruments & Chemicals
GmbH (ref. 67000 Munich) en forma de kit y está compuesto por:
Reactivo de precipitación
Reactivo de derivatización
Tampón neutralizante
Fase móvil
Calibradores y controles
Columna analítica
Fundamento de medición
Para la determinación de la concentración de MDA utilizamos un método de HPLC isocrático
con detección fluorescente. La preparación de muestras consta de una efectiva precipitación
proteica, seguida de una derivatización. El fluoróforo que se crea con este proceso puede
detectarse específicamente, y en concentraciones mínimas. Para la conservación y análisis
las muestras se protegieron de la luz. El equipo de HPLC realiza automáticamente los cálculos
y permite obtener directamente las concentraciones de MDA expresadas en µg/L.
Metodología
93
Procedimiento
Para realizar el análisis de MDA se necesitan 100 µl de plasma (EDTA). Hasta que se llevó a
cabo el análisis, las muestras permanecieron congeladas (-80ºC) y protegidas de la luz. Los
reactivos del kit se prepararon según instrucciones del fabricante.
Antes de montar la columna de HPLC, se lavó primero el equipo con unos 20 ml de
fase móvil, con una velocidad de flujo de 1,0 ml/min.
A continuación se instaló la columna analítica en el sistema HPLC y se equilibró el
sistema durante 15 – 20 min con una velocidad de flujo de 1,0 ml/min, hasta que se
estabilizó la línea de base.
Se encendió el detector: Waters modelo 474.
Se inyectó después varias veces el estándar de calibración procesado hasta que los
cromatogramas fueron idénticos en sus tiempos de retención y áreas o alturas de
pico.
Se realizó una calibración al inicio de cada serie analítica, seguida de los materiales de
control y de las muestras de pacientes.
Se procesaron dos controles, nivel bajo y nivel alto, con cada grupo de muestras de
los pacientes.
Se añadieron 100 µl de plasma (calibrador, controles, muestras) y 500 µl de reactivo
de precipitación en un recipiente de reacción, se mezclaron durante 10s con vórtex.
Se centrifugó la muestra 5 min a 13.000 rpm.
500 µl del sobrenadante fueron pasados a un vial y se añadió 100 µl de reactivo de
derivatización y se agitó suavemente.
Metodología
94
Se incubó el recipiente cerrado durante 60 min a 95ºC.
A continuación, se enfrió la muestra inmediatamente con una mezcla de agua y hielo.
Se añadió 500 µl de tampón neutralizante y se agitó suavemente.
Se inyectaron 20 µl en el sistema de HPLC.
La muestra preparada es estable hasta 24 horas a temperatura ambiente.
Condiciones del HPLC
Flujo de la bomba 1,0 ml/min
Volumen de muestra 20 µl
Temperatura columna 25 ºC
Tiempo de retención 2,8 min
Detección excitación: 515nm
medición: 553 nm
6.3.4. Determinación de Metales y Elementos Traza
Habitualmente en el campo clínico se utiliza como técnica de determinación de metales la
absorción atómica, sola o con cámara de grafito. Uno de los principales problemas que
presenta la matriz suero es su alta concentración de proteínas que interfieren, tanto en el
sistema de nebulización como en el sistema de detección. La forma de eliminarla consiste en
la introducción de ecuaciones de corrección lo que permite suprimir todas las interferencias
Metodología
95
del detector, pero para evitar las del sistema de nebulización solo es posible mediante la
dilución de la muestra, con el consiguiente aumento del límite de detección, por ello
empleamos el nebulizador concéntrico de cuarzo que disminuye este límite. Las
interferencias que presenta la absorción atómica en estas muestras, son bien conocidas y se
resuelven habitualmente utilizando corrección de fondo, y adicionando correctores de matriz
Una de las novedades incluidas en este trabajo consiste en la determinación de metales por
espectrofotometría de emisión de plasma (ICP). La técnica del ICP consiste en un gas (Argón)
ionizado eléctricamente que tiene una temperatura de ionización muy elevada ( 1000ºC). La
muestra nebulizada es introducida mediante una corriente de argón en la zona plasmógena
donde se atomiza e ioniza. El equipo utilizado fue el ICP-MS Agilent 7500i con
automuestreador CETAC ASX-500 y conectado a un sistema de introducción e integración de
muestra (ISIS System).
Esta técnica permite la determinación de forma simultánea de un elevado número de
elementos Traza, a diferencia de la absorción atómica que obliga a determinar cada
elemento por separado con el consiguiente consumo de muestra biológica. Con la tecnología
de ICP-MS la determinación de arsénico, cadmio, cobre, hierro, manganeso, plomo, zinc,
cromo, fósforo, bario, antimonio, níquel y otros metales se puede analizar en menos de un
minuto, permitiendo además la selección de cualquier otro elemento del sistema periódico
sin incremento en el tiempo de análisis y variación en el proceso analítico. Las características
analíticas que presenta esta técnica son:
o Rango lineal del orden de 106, lo que hace innecesarias diluciones, evitando el riesgo
de errores.
o Reproducibilidad con coeficientes de variación inferiores al 15% expresado como la
desviación standard relativa.
o Límites de detección del orden de ng/L.
Metodología
96
La espectrometría de masas es una técnica de detección que se basa en la medida de la
relación carga/masa utilizando un espectrómetro de masas. Las muestras son nebulizadas y
el aerosol que se ha producido es transportado a las lentes iónicas hasta el cuadrúpolo, que
selecciona los iones de una determinada relación carga/masa. Posteriormente, estos iones
seleccionados por el cuadrúpolo son detectados por un multiplicador de electrones, que
puede trabajar en modo pulsos o en modo analógico. El modo pulso se utiliza para
concentraciones bajas, y utiliza toda la capacidad de amplificación del detector, mientras que
el modo analógico integra la señal sólo hasta obtener una intensidad suficiente, protegiendo
así al detector de señales demasiado intensas. Finalmente la intensidad leída en el detector
es transformada en concentración por medio del sistema informático.
El empleo de este método permite conocer prácticamente en el momento la analítica
completa de los metales de la muestra analizada, que proporciona una información muy
valiosa para decisiones rápidas ante hechos eventuales. Las interferencias antes enunciadas
en la absorción atómica no se presentan en la técnica de ICP, ya que la alta energía de la
fuente de excitación disminuye drásticamente las interferencias químicas. Además en ICP-MS
se utiliza el plasma como generador de iones a partir de los átomos de la muestra, y son
estos iones los que se detectan tras su separación lo que hace que esta técnica ofrezca
excelentes límites de determinación.
Para la determinación de metales se utilizaron reactivos ultra puros. Para la calibración se
usaron los siguientes materiales:
- Solución Multielementos Certipur IV de Merck.
- Solución Standard de Selenio Certipur de 106 mg/L de Merck.
- Solución Standard de Vanadio 106 mg/L de Fluka.
Como patrón interno se utilizó la mezcla de estándares internos de Agilent (Li, Sc, Ge, Y, In,
Tb y Bi, de 104 mg/L).
Metodología
97
Para la verificación de la calibración verificación se utilizó una solución de multielementos
inorgánicos de 105 mg/L, mientras que para la validación del método se utilizó un material
sérico de referencia ‘‘Serum Control Lyophilised REC-8881 para elementos Traza, Level II’’ de
ClinChek.
La técnica de ICP-MS empleada en este trabajo se encuentra acreditada por ENAC (Entidad
Nacional de Acreditación) según el anexo técnico nº 109/285.
6.4. PRESTACIONES DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS EN EL ESTUDIO DEL ESTRÉS
OXIDATIVO
6.4.1. Métodos de determinación de enzimas antioxidantes, Vitaminas A y E y
Malondialdehido
Los aspectos evaluados tanto para las determinaciones de las enzimas antioxidantes
estudiadas como para las mediciones de HPLC de vitaminas A y E, así como MDA fueron:
imprecisión (intra e intreserial) e inexactitud analítica así como linealidad y limite de
detección, siguiendo el protocolo propuesto por José Manuel González de Buitrago (2004).
Precisión analítica: Es la concordancia entre medidas repetidas con un mismo espécimen. La
precisión es un término conceptual que no posee valor numérico. El término cuantitativo es
la imprecisión que se define como el coeficiente de variación de los resultados de un
conjunto de medidas repetidas.
Determinamos la imprecisión intraserial (repetibilidad) analizando un espécimen, formado
por un pool de muestras, de forma repetida (15 veces) en la misma serie de trabajo. Los
resultados que obtuvimos fueron:
Metodología
98
VIT A
(µg/dL)
VIT E
(µg/dL)
MDA
(µg/L)
GPX
(U/L)
GR
(U/L)
SOD
(U/mL)
1 62.2 1742.1 12.2 316 47.1 52.9
2 63.4 1548.9 15.8 321 52.6 55.4
3 63.7 1665.6 13.9 324 49.7 59.1
4 67.1 1587.3 11.8 323 47.8 45.6
5 65.8 1630.2 10.0 324 50.2 58.1
6 63.8 1538.4 12.7 330 47.6 54.1
7 65.5 1556.6 11.1 331 56.7 56.8
8 61.2 1532.5 12.1 328 45.7 63.6
9 65.1 1607.0 11.5 329 42.8 55.5
10 62.9 1584.8 12.7 331 50.5 56.8
11 65.7 1545.9 11.5 338 46.6 59.5
12 60.9 1499.0 10.3 365 48.6 55.3
13 63.2 1592.7 10.4 326 48.3 48.7
14 65.7 1611.4 11.0 334 47.3 54.0
15 63.2 1635.9 11.8 319 49.7 54.3
Media 63.9 1591.8 11.9 329 48.7 55.3
Desviación estándar
1.8 61.1 1.5 11.5 3.2 4.3
Coeficiente Variación (%)
2.8 3.8 12.4 3.5 6.6 7.8
Metodología
99
Determinamos la imprecisión interserial (reproducibilidad) analizando el mismo espécimen,
formado por un pool de sueros por triplicado, durante 4 días de trabajo consecutivos. Los
resultados que obtuvimos fueron:
Exactitud analítica: Es una medida de la concordancia entre el valor obtenido para una
determinación y su valor real. Es un término conceptual que no posee valor numérico. Como
término cuantitativo se usa la inexactitud, que se define como la diferencia numérica entre el
valor medio de una serie de determinaciones y su valor verdadero.
VIT A
(ug/dL) VIT E
(ug/dL)
MDA (ug/L)
GPX (U/L)
GR (U/L)
SOD (U/mL)
DIA 1 63.9 1593.3 11.3 364 77.2 63.2
DIA 2 78.6 1405.7 13.0 344 76.8 69.5
DIA 3 67.1 1596.1 10.8 366 69.9 66.3
DIA 4 73.9 1487.8 12.8 358 79.7 62.2
Media 70.2 1520.7 12.0 358.0 75.9 65.3
Desviación estándar
6.6 91.7 1.1 9.9 4.2 3.3
Coeficiente Variación (%)
9.4 6.0 9.1 2.8 5.5 5.1
Metodología
100
Para evaluar la inexactitud analítica utilizamos materiales de control con valores asignados
mediante métodos definitivos o de referencia. Se escogió dos materiales de control con dos
niveles de concentración: bajo y alto para las determinaciones de vitaminas y MDA, y un nivel
para las determinaciones enzimáticas. Se analizó cada material por triplicado, en cuatro
series de trabajo diferentes. Los resultados que obtuvimos fueron:
VIT A (µg/dL)
BAJO ALTO
VIT E (µg/dL)
BAJO ALTO
MDA (µg/L)
BAJO ALTO
CONTROL 16.0 117.0 430.0 1365.0 13.4 50.4
DIA 1 14.6 111.9 509.1 1552.3 14.9 39.2
DIA 2 19.2 149.9 438.9 1488.6 12.2 47.7
DIA 3 16.1 143.3 547.5 1776.8 12.9 52.5
DIA 4 17.1 128.9 452.4 1509.9 11.5 52.8
Media 16.7 133.5 486.9 1581.9 12.9 48.0
Error media
relativo (%) 4.4 14.1 13.2 15.8 -3.7 -4.7
Metodología
101
Linealidad y límite de detección: Para determinar la linealidad se prepararon a partir del
estándar o control de mayor concentración, 5 soluciones de distinta concentración, las cuales
se encontraban dentro de los intervalos establecidos para cada tipo de análisis. Se analizaron
cada uno de los niveles por duplicado. Para establecer el límite de detección de la técnica, se
analizaron diez replicados de un blanco de solución salina, tratado del mismo modo que las
muestras, calculándose la media y la desviación estándar de las medidas obtenidas. La
linealidad y límite de detección que se obtuvieron fueron:
CONTROL
GPX (U/L)
601.0
GR (U/L)
88.0
SOD (U/mL)
351.0
DIA 1 466.3 77.2 421.4
DIA 2 568.7 79.6 426.4
DIA 3 479.7 79.7 416.0
DIA 4 536.4 80.7 371.6
Media 512.8 79.3 408.8
Error media
relativo (%) -14.6 -9.9 16.5
Metodología
102
6.4.2. Optimización del método ICP-MS para la determinación de Metales en suero
sanguíneo.
Puesto que en el laboratorio LABAQUA donde se van a realizar las determinaciones de los
distintos metales, no trabajan habitualmente con muestras con la matriz proteica de los
sueros sanguíneos, se ha procedido al estudio de una metodología de trabajo que sirva para
determinar los metales en las muestras remitidas por el H.G.U. de Elche. De los resultados de
evaluación de este método se obtuvo una publicación (De Blas I, 2007), donde podemos
observar los resultados obtenidos (Anexo III).
Tratamiento de la muestra
En base a la bibliografía y artículos encontrados, evaluamos varios tratamientos de las
muestras de suero previo a su análisis. Dichos pre-tratamientos están destinados a evitar los
problemas derivados de la matriz compleja de estas muestras biológicas:
1. Dilución seguida de tratamiento ácido: dilución 1/10 del suero con agua y
acidificación al 0.5% con HNO3.
VIT A (µg/dL)
VIT E (µg/dL)
MDA
(µg/L)
GPX
(U/L)
GR
(U/L)
SOD
(U/mL)
Lineal hasta 200 4000 227 1200 300 3.9
Límite de
detección 5.4 33.8 2 7.3 3.3 0.2
Límite
cuantificación 16.1 101.4 6 22 10 0.6
Metodología
103
2. Tratamiento ácido seguido de dilución: acidificación del suero al 1% con HNO3, y
después dilución al 1:10 del sobrenadante.
3. Tratamiento básico: dilución al 1/10 con EDTA al 0.05% y NH4OH al 1%.
4. Tratamiento básico 2: dilución al 1/10 con EDTA al 0.05% y NH4OH al 1% y después se
añadió 1-butanol al 2%.
Los resultados de la optimización han sido objeto de una publicación internacional que se
presentan en el anexo III.
6.5. MÉTODOS ESTADÍSTICOS
Los análisis estadísticos se realizaron con el programa informático SPSS (Stadistical Package
for Social Sciences) para Windows v 17.0.
En primer lugar se aplicó el test de Kolmogorov-Smirnov que demostró que todas las
variables seguían una distribución normal.
Los resultados de las variables cuantitativas se expresan como media ± desviación estándar
(DE) y las cualitativas como porcentajes, para cada grupo estudiado.
En el caso de variables cuantitativas, para averiguar la existencia o no de diferencias
estadísticamente significativas entre los grupos se ha aplicado el análisis estadístico de la
varianza (ANOVA). Posteriormente, en los casos donde encontramos significación estadística
o significaciones próximas a 0.05, se ha realizado un análisis intergrupos (2 a 2) para analizar
las diferencias grupo a grupo aplicando un test post hoc, el test de Tukey.
Para analizar las relaciones entre variables categóricas se empleó el test de 2 (Chi-
cuadrado).
Metodología
104
Mediante regresión lineal, se estudió la existencia y el grado de asociación entre las variables
cuantitativas que encontramos más representativas del EO, obteniéndose el valor del
coeficiente de correlación de Pearson (r).
La valoración de la capacidad diagnóstica de las determinaciones, que presentaron
diferencias estadísticamente significativas, se realizó a través del estudio de sensibilidad y
especificidad mediante curvas de rendimiento diagnóstico, o curvas ROC (Receiver Operating
Characteristic). Se entiende por:
Sensibilidad es la capacidad del test de identificar correctamente a pacientes con la
enfermedad. Probabilidad de que un sujeto con la enfermedad de positivo en el test.
Especificidad es la capacidad del test de identificar correctamente a los sujetos que no tienen
la enfermedad. Probabilidad de que un sujeto sano de negativo en el test.
Al tratarse de variables cuantitativas se debe establecer el punto de corte óptimo que
separará un resultado negativo de uno positivo, buscando así el equilibrio entre la
sensibilidad y la especificidad. El punto de corte óptimo se considerará aquel que viene dado
por la combinación de máxima sensibilidad y especificidad, y es el que tiene como
coordenadas al punto en el que la curva más se alejado de la diagonal.
Para las variables cuantitativas, que mostraron diferencias estadísticamente significativas
entre grupos, se realizó la curva ROC y se midió su área bajo la curva (ABC) y su intervalo de
confianza (IC) al 95%.
Posteriormente se utilizó un modelo de regresión logística multivariante para calcular los
riesgos (odds ratios OR) asociados a la enfermedad.
El límite de confianza es del 95%, para todos los análisis estadísticos se definió como
significativo el valor de p bilateral inferior a 0.05.
RESULTADOS
109
Resultados
7.1. CARACTERISTICAS GENERALES DE LA POBLACION A ESTUDIO
Del conjunto de sujetos estudiados, cumplieron satisfactoriamente todos los requisitos para
participar en el estudio 87 pacientes: 36 pacientes afectos de Alzheimer, 18 pacientes con
DCL y 33 sujetos sanos (grupo control).
De los 36 pacientes con enfermedad de Alzheimer, 16 eran hombres (44.4%) y el resto, 20
mujeres (55.6%). La media de edad fue de 77.75 (± 5.31 DE).
En el caso de los 18 pacientes con DCL, 10 eran hombres (62.5%) y 8 mujeres (37.5%). La
media de edad fue de 73.88 (± 7.09 DE).
Finalmente, de los 33 sujetos sanos, 12 eran hombres (36.4%) y 21 mujeres (63.6%). La media
de edad fue de 74.00 (± 5.03 DE).
La distribución por edad y sexo, así como las características generales de la muestra se
presentan en las tablas 3 y 4.
Tabla 3. Características demográficas de la población estudiada.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33)
p
EDAD 77.75 ± 5.31 73.88 ± 7.09 74.00 ± 5.03 0.012*
HOMBRES 16 (44.4%) 10 (62.5%) 12 (36.4%) 0.479
MUJERES 20 (55.6%) 8 (37.5%) 21 (63.6%) 0.041*
* p< 0.05
110
Resultados
Encontramos diferencias estadísticamente significativas en la edad de los pacientes
(p=0.012). El test de Tukey confirmó que estas se encontraban entre el grupo de pacientes
con Alzheimer y el grupo control. El grupo de pacientes con enfermedad de Alzheimer fue el
de mayor edad que los otros dos grupos. Globalmente, el 56% de los sujetos del estudio
fueron mujeres, encontrando diferencias estadísticamente significativa entre grupos
(p=0.041) siendo la frecuencia de mujeres menor en el grupo DCL.
En cuanto al estudio del estado cognitivo de la población estudiada (Tabla 4), los resultados
muestran que existen diferencias significativas (p<0.001) entre los valores del MMSE, siendo
los pacientes con Alzheimer los que presentan valores menores. El estudio de comparaciones
múltiples reveló que las diferencias se encontraban entre el grupo de pacientes con
Alzheimer y el resto de grupos.
En los sujetos estudiados, menos del 10% de participantes de cada grupo presentó algún tipo
de depresión. El antecedente familiar de demencia se dio en el 50.0% de casos con Alzheimer
y DCL, mientras que en los sujetos control solo se dio en 7.1% de los casos.
Se recogieron los datos del nivel educacional de los participantes del estudio y se clasificaron
como: analfabetos, estudios primarios (saben leer y escribir), secundarios y universitarios. El
58.8% de los pacientes con Alzheimer, el 75.0% de los pacientes con DCL y el 53.6% de los
controles tenían estudios primarios. Ninguno de los pacientes con la enfermedad de
Alzheimer había recibido educación universitaria. No encontramos diferencias significativas
entre los niveles educativos de los grupos.
Todos los resultados están incluidos en la tabla 4.
111
Resultados
Tabla 4. Estado cognitivo, presencia de depresión, historia familiar de enfermedad y nivel
de estudios.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33)
p
MMSE* 20.7 ± 4.4 26.5 ± 3.2 28.9 ± 1.3 <0.001
DEPRESIÓN 9.1 % 10.0 % 7.1% 0.819
Hª FAMILIAR
DEMENCIA 50.0 % 50.0 % 7.1% 0.030
NIVEL EDUCACIÓN
Analfabetos 35.6 % - 10.7% -
Primarios 58.8% 75.0 % 53.6% 0.140
Secundarios 5.9% 12.5 % 17.9% 0.102
Universitarios - 12.1% 17.9% -
*Datos normalizados sobre 30
7.2. ESTUDIO ANALÍTICO GENERAL DE LOS SUJETOS A ESTUDIO
En las tablas 5-7 se presentan los resultados de las determinaciones analíticas generales
realizadas en cada subgrupo de pacientes y la significación estadística de las diferencias
observadas.
112
Resultados
Tabla 5. Resultados del estudio hematológico.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33) p
Hemoglobina (g/dL) 13.74 ± 1.17 13.94 ± 1.34 14.11 ± 1.13 0.452
Hematíes*106 /µI 4.51 ± 0.42 4.45 ± 0.38 4.49 ± 0.38 0.876
Hematocrito (%) 40.99 ± 3.77 40.79 ± 3.79 41.46 ± 3.16 0.778
Leucocitos*103 /µL 6.34 ± 1.91 6.11 ± 1.51 6.52 ± 1.82 0.733
Neutrófilos*103 /µL 3.68 ± 1.43 6.63 ± 12.83 4.43 ± 6.12 0.372
Linfocitos*103 /µL 1.89 ± 0.77 3.40 ± 6.54 3.75 ± 7.79 0.411
Monocitos*103 /µL 0.53 ± 0.16 1.01 ± 2.25 0.90 ± 2.03 0.548
Plaquetas*103 /µL 219.53 ± 61.43 217.61 ± 48.54 225.24 ± 64.99 0.889
Tabla 6. Resultados del estudio hormonal y vitamínico.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33)
p
Vitamina B12 (pg/ml) 315.47 +
130.08
318.89 ±
93.48
383.76 ±
250.94
0.270
Folato (ng/ml) 6.77 ± 3.89 7.90 ± 3.23 8.60 ± 3.43 0.123
Cortisol (µg/dl) 17.05 ± 4.19 15.67 ± 4.40 19.00 ± 7.16 0.112
TSH (U/ml) 2.23 ± 1.32 2.41 ± 2.53 1.84 ± 1.20 0.119
Homocisteína (µmol/L) 12.61 ± 4.11 10.63 ± 2.85 10.74 ± 3.28 0.065
113
Resultados
Tabla 7. Resultados del estudio bioquímico.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33)
p
Glucosa (mg/dL) 117.47 ±
30.45
114.61 ±
21.87
112.67 ±
23.09
0.757
Urea (mg/dL) 45.38 ± 12.82 39.00 ± 17.30 39.61 ± 8.91 0.115
Creatinina (mg/dL) 1.04 ± 0.26 0.99 ± 0.18 0.94 ± 0.19 0.210
Calcio (mg/dL) 9.73 ± 0.29 9.84 ± 0.52 9.78 ± 0.45 0.657
Fósforo (mg/dL) 3.53 ± 0.42 3.33 ± 0.35 3.64 ± 0.49 0.055
Proteínas totales (g/dL) 7.15 ± 0.41 7.16 ± 0.43 7.16 ± 0.42 0.992
Colesterol total (mg/dL) 211.44 ±
52.90
215.72 ±
31.85
211.88 ±
35.13
0.936
Colesterol-HDL (mg/dL) 56.92 ± 14.70 51.89 ± 9.44 65.52 ± 28.89 0.067
Colesterol-LDL (mg/dL) 134.66 ±
37.01
142.39 ±
26.85
136.03 ±
26.86
0.689
Triglicéridos (mg/dL) 137.69 ±
95.11
135.61 ±
57.85
116.58 ±
55.53
0.471
GOT (U/L) 19.56 ± 4.54 20.00 ± 3.73 20.67 ± 5.68 0.659
GPT (U/L) 16.69 ± 5.64 16.89 ± 4.85 19.88 ± 8.50 0.129
GGT (U/L) 28.53 ± 19.78 25.39 ± 8.70 31.27 ± 20.07 0.537
Fosfatasa Alcalina (U/L) 81.63 ± 19.77 80.56 ± 21.30 76.76 ± 23.99 0.651
Sodio (mEq/L) 140.09 ± 2.93 140.28 ± 2.49 140.21 ± 1.83 0.964
Potasio (mEq/L) 4.56 ± 0.45 4.43 ± 0.38 4.53 ± 0.32 0.479
Cloro (mEq/L) 103.72 ± 2.34 104.22 ± 3.15 103.55 ± 2.44 0.639
Proteína C Reactiva (mg/L) 2.55 ± 2.80 2.43 ± 2.91 2.25 ± 2.33 0.899
114
Resultados
Analiticamente, todos los sujetos estudiados presentaban una situación similar, con
resultados dentro de los márgenes de normalidad que cabe esperar para su edad (Anexo IV).
Solo la homocisteína presentó niveles ligeramente superiores a los de referencia y
únicamente en el grupo de enfermos de Alzheimer.
No encontramos diferencias estadísticamente significativas entre ninguno de los parámetros
generales estudiados. Los estudios de comparaciones múltiples realizados para la
homocisteína y el fósforo solamente revelaron diferencias significativas entre los niveles de
fósforo del grupo DCL y el grupo control.
Estos resultados indican que no había diferencias entre los grupos de pacientes en cuanto a
su situación metabólica o fisiopatológica, salvo a nivel cognitivo.
115
Resultados
7.3. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LOS AGENTES IMPLICADOS EN EL METABOLISMO
OXIDATIVO EN LA POBLACIÓN A ESTUDIO
7.3.1. Resultados de los Metales y Elementos Traza
Los resultados de los diferentes metales y elementos Traza analizados para los tres grupos de
sujetos a estudio se presentan en la tabla 8. Los resultados obtenidos para cada uno de los
metales y elementos Traza en los tres grupos de sujetos estudiados se inscribieron dentro de
los rangos de valores de referencia esperados en población normal (Anexo IV).
Tabla 8. Metales y Elementos Trazas los diferentes grupos estudiados.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33)
p
Al (µg/L) 37.49 ± 44.56 25.38 ± 20.52 17.47 ± 15.51 0.035*
Cd (µg/L) <0.5 ± 0 <0.5 ± 0 <0.5 ± 0 -
Co (µg/L) 0.5008 ± 0.0047 0.5000 ± 0.0000 0.5000 ± 0.0000 0.498
Cu (µg/L) 1006.6 ± 182.8 931.4 ± 185.4 878.8 ± 234.5 0.038*
Cr (µg/L) 3.317 ± 0.745 3.550 ± 0.968 3.740 ± 0.687 0.082
Fe (µg/L) 961 ± 346 1030 ± 296 1025 ± 438 0.721
Mn (µg/L) 1.68 ± 0.53 1.50 ± 0.46 1.83 ± 0.74 0.171
Hg (µg/L) 1.091 ± 1.103 1.222 ± 1.120 1.184 ± 0.926 0.889
Ni (µg/L) 1.55 ± 1.03 1.74 ± 1.53 1.96 ± 1.19 0.373
Se (µg/L) 98.70 ± 19.92 99.34 ± 15.85 99.31 ± 22.21 0.990
V (µg/L) 0.525 ± 0.129 0.575 ± 0.118 0.564 ± 0.175 0.396
Zn (µg/L) 643.5 ± 149.7 670.2 ± 219.2 659.9 ± 148.5 0.838
* p< 0.05
116
Resultados
De todos los metales determinados, solo se encontraron diferencias estadísticamente
significativas entre los 3 grupos en los niveles de Cu (p = 0.038) y Al (p = 0.035). Los niveles de
Al y Cu fueron superiores en el grupo de pacientes con Alzheimer, observándose un aumento
de estos al progresar los signos de demencia, ya que los DCL presentaban en ambos casos
unas concentraciones intermedias entre los enfermos de Alzheimer y el grupo control, este
último con los niveles más bajos.
El test de comparaciones múltiples realizado para Al y Cu mostró que las diferencias se
encontraban entre el grupo de pacientes con Alzheimer y el grupo control.
Los valores de Cr, Fe, Hg, Mn, Ni, Se y Zn fueron inferiores en el grupo de pacientes con
Alzheimer, con respecto al grupo control, pero sin presentar diferencias significativas. Los
resultados del Cd fueron inferiores al límite de detección en todos los grupos de sujetos y el
Co mostró resultados similares en los tres grupos.
7.3.2. Resultados de las defensas antioxidantes
7.3.2.1. Resultados de los antioxidantes endógenos
7.3.2.1.1. Actividades enzimáticas
Los resultados obtenidos para cada una de las actividades enzimáticas antioxidantes en los
tres grupos de sujetos estudiados se inscribieron dentro de los rangos de valores de
referencia esperados para la población normal (Anexo IV), salvo la GPx que mostró
actividades superiores a los rangos de referencia presentes en la bibliografía en los tres
grupos estudiados.
Las cifras de SOD y GPx fueron inferiores en el grupo control pero sin llegar a presentar
diferencias significativas, mientras que las cifras de GR fueron estadísticamente superiores en
el grupo control (p = 0.015) respecto al grupo de pacientes con Alzheimer y con DCL. Las
117
Resultados
diferencias significativas se encontraron solamente entre el grupo DCL y el grupo control. Los
resultados pueden observarse en la tabla 9.
Tabla 9. Niveles de enzimas antioxidantes en los diferentes grupos estudiados.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33)
p
SOD (U/gHb) 1311 ± 276 1330 ± 275 1207 ± 245 0.177
GPx (U/gHb) 108.7 ± 19.5 110.3 ± 19.1 102.7 ± 21.0 0.437
GR (U/L) 53.8 ± 10.7 47.8 ± 9.8 60.8 ± 21.2 0.015*
* p< 0.05
7.3.2.1.2. Antioxidantes no enzimáticos
No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de ác.
úrico, bilirrubina total, albúmina, transferrina, ferritina o ceruloplasmina entre los 3 grupos
de paciente. Los resultados obtenidos para los distintos parámetros en cada grupo se
observan en la tabla 10.
118
Resultados
Tabla 10. Otras defensas antioxidantes en los diferentes grupos estudiados.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33)
p
Ácido Úrico (mg/dL)
5.13 ± 1.60 5.73 ± 1.18 5.64 ± 1.77 0.327
Bilirrubina total (mg/dL)
0.704 ± 0.231 0.639 ± 0.213 0.724 ± 0.421 0.657
Albúmina (g/dL)
4.21 ± 0.24 4.26 ± 0.32 4.25 ± 0.25 0.749
Transferrina (mg/dL)
251.4 ± 33.9 232.7 ± 22.4 252.9 ± 35.4 0.084
Ferritina (ng/mL)
86.5 ± 81.1 93.9 ± 55.9 78.6 ± 44.5 0.700
Ceruloplasmina (mg/dL)
25.88 ± 4.06 23.56 ± 3.48 25.82 ± 4.28 0.110
Encontramos niveles de Transferrina menores en el grupo DCL (232.7 + 22.4 mg/dL),
respecto de los pacientes afectos de Alzheimer (251.4 + 33.9 mg/dL) o el grupo control
(252.9 + 35.4 mg/dL), pero sin diferencias estadísticamente significativas.
7.3.2.2. Resultados de los antioxidantes exógenos
Las determinaciones de las vitaminas A y E ofrecieron en todos los casos y grupos a estudio
resultados dentro de los rangos de referencia esperados (Anexo IV).
Las cifras de Vitamina A fueron inferiores en el grupo de enfermos de Alzheimer pero sin
encontrar diferencias significativas (p= 0.133) entre los distintos grupos. Las cifras de
119
Resultados
Vitamina E fueron inferiores en el grupo de pacientes control pero también sin encontrar
diferencias estadísticamente significativas (p = 0.497) (Tabla 11).
Tabla 11. Niveles de vitaminas antioxidantes en los diferentes grupos estudiados.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33)
p
Vitamina A (µg/dL)
50.5 ± 12.5 51.2 ± 10.9 56.1 ± 11.7 0.133
Vitamina E (µg/dL)
1470 ± 409 1473 ± 306 1386 ± 214 0.497
7.3.3. Resultados de los productos del estrés oxidativo: MDA
La concentración del principal producto de peroxidación lipídica, el MDA, fue marcadamente
inferior en el grupo de sujetos control (Tabla 12), mostrando diferencias estadísticamente
significativas entre controles y pacientes (p<0.001).
Sin embargo, todos los sujetos a estudio presentaban valores de MDA dentro del rango de
referencia previsto para población normal (Anexo IV).
Tabla 12. Niveles de MDA en los distintos grupos de pacientes estudiados.
EA
(N=36)
DCL
(N=18)
CONTROL
(N=33)
p
MDA (µg/L)
(µg/L)
19.0 ± 8.1 19.4 ± 6.5 12.5 ± 4.9 <0.001*
* p< 0.05
120
Resultados
7.4. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS DE LOS AGENTES DEL METABOLISMO OXIDATIVO EN
EL DETERIORO COGNITIVO LEVE
Se agruparon los pacientes con DCL según su evolución o no a Alzheimer durante un plazo de
3 años: grupo de pacientes con DCL que evolucionó a Alzheimer (DCL-EA) y grupo de
pacientes con DCL estable (DCL).
La distribución por edad y sexo, así como las características generales de la muestra se
presentan en las tablas 13 y 14. No se encontraron diferencias entre sexo o edad ni en
ninguna de las características generales de la muestra.
Tabla 13. Características demográficas de la población estudiada.
DCL-EA
(N=6)
DCL
(N=12) p
EDAD 77.17 ± 5.85 72.09 ± 7.30 0.165
HOMBRES 4 (66.7%) 6 (50.0%) 0.527
MUJERES 2 (33.3%) 6 (50.0%) 0.157
* p< 0.05
121
Resultados
Tabla 14. Estado cognitivo, presencia de depresión, historia familiar de enfermedad y nivel
de estudios.
DCL-EA
(N=6)
DCL
(N=12) p
MMSE* 24.7 ± 4.1 27.4 ± 2.4 0.196
DEPRESIÓN - 16.7% -
Hª FAMILIAR
DEMENCIA 50.0% 50.0% 0.655
NIVEL EDUCACIÓN
Analfabetos - - -
Primarios 66.7% 80.0% 0.414
Secundarios - 20.0% -
Universitarios 33.3% - -
*Datos normalizados sobre 30
Se analizaron los resultados bioquímicos iniciales de ambos grupos. Los resultados obtenidos
de cada una de las variables estudiadas se presentan en las siguientes tablas 15-19. No
encontramos diferencias en ninguno de los parámetros entre los grupos de pacientes con
DCL.
122
Resultados
Tabla 15. Metales y elementos Trazas en pacientes con DCL.
DCL-EA (N=6)
DCL (N=12)
p
Al (µg/L) 16.48 ± 16.39 29.82 ± 21.54 0.202
Cd (µg/L) <0.5 ± 0 <0.5 ± 0 -
Co (µg/L) 0.500 ± 0.000 0.500 ± 0.000 -
Cu (µg/L) 941.3 ± 172.2 926.5 ± 198.9 0.879
Cr (µg/L) 3.589 ± 1.017 3.530 ± 0.988 0.908
Fe (µg/L) 1095 ± 390 998 ± 250 0.529
Mn (µg/L) 1.21 ± 0.42 1.64 ± 0.42 0.055
Hg (µg/L) 1.145 ±1.013 1.261 ± 1.210 0.843
Ni (µg/L) 2.08 ± 2.30 1.57 ± 1.06 0.529
Se (µg/L) 98.42 ± 18.35 99.80 ± 15.31 0.868
V (µg/L) 0.535 ± 0.085 0.595 ± 0.121 0.302
Zn (µg/L) 636.4 ± 176.5 687.1 ± 243.2 0.657
123
Resultados
Tabla 16. Niveles de enzimas antioxidantes en pacientes con DCL.
DCL-EA (N=6)
DCL (N=12)
p
SOD (U/gHb) 1304 ± 113 1343 ± 333 0.785
GPx (U/gHb) 113.9 ± 25.5 108.5 ± 16.0 0.585
GR (U/L) 46.5 ± 7.4 48.4 ± 11.1 0.715
Tabla 17. Niveles de vitaminas antioxidantes en pacientes con DCL.
DCL-EA (N=6)
DCL (N=12)
p
Vitamina A (µg/dL) 53.5 ± 16.9 50.0 ± 7.0 0.546
Vitamina E (µg/dL) 1540 ± 316 1439 ± 309 0.529
124
Resultados
Tabla 18. Otras defensas antioxidantes en pacientes con DCL.
DCL-EA (N=6)
DCL (N=12)
p
Ácido Úrico (mg/dL) 6.31 ± 1.10 5.43 ± 1.15 0.327
Bilirrubina total (mg/dL) 0.69 ± 0.34 0.61 ± 0.12 0.657
Albúmina (g/dL) 4.33 ± 0.29 4.22 ± 0.34 0.749
Transferrina (mg/dL) 243.70 ± 9.42 227.20 ± 25.20 0.084
Ferritina (ng/mL) 93.40 ± 45.20 94.20 ± 62.50 0.700
Ceruloplasmina (mg/dL) 23.67 ± 2.34 23.50 ± 4.03 0.110
Tabla 19. Niveles de MDA en pacientes con DCL.
DCL-EA (N=6)
DCL (N=12)
p
MDA (µg/L)
21.7 ± 6.2 18.3 ± 6.5 0.303
A nivel bioquímico, no encontramos diferencias entre ninguno de los agentes del EO entre los
DCL que evolucionaron a enfermedad de Alzheimer en el periodo de tres años y los que
mantuvieron ese nivel de deterioro cognitivo.
125
Resultados
7.5. ESTUDIOS DE ASOCIACION DE LOS DIFERENTES AGENTES IMPLICADOS EN EL ESTRÉS
OXIDATIVO
Basándonos en el comportamiento del MDA como un marcador de EO diferenciador entre
sujetos sanos y pacientes con deterioro cognitivo o demencia, se estudiaron sus posibles
relaciones con los agentes oxidantes y antioxidantes más relevantes, buscando asociaciones
que reforzaran su utilidad como marcador bioquímico de neurodegeneración.
7.5.1. Correlaciones del MDA
7.5.1.1. Correlación de los niveles de lípidos y MDA.
En primer lugar estudiamos las relaciones entre los niveles de lípidos de los diferentes grupos
de sujetos estudiados y las concentraciones de MDA, tratando de evaluar si los productos de
peroxidación lipídica son consecuencia de las concentraciones de los substratos oxidables o
independientes de los niveles sanguíneos de lípidos (que eran similares en los tres grupos de
sujetos). Tras analizar la relación entre los niveles de los distintos lípidos y el MDA no
encontramos ninguna correlación. Los resultados vienen reflejados en la tabla 20.
Tabla 20. Correlaciones lípidos y MDA.
MDA (µg/L)
r p
COLESTEROL (mg/dL) 0.015 0.894
LDL-COLESTEROL (mg/dL) 0.058 0.605
TRIGLICERIDOS (mg/dL) 0.166 0.135
HDL-COLESTEROL (mg/dL) -0.172 0.120
126
Resultados
7.5.1.2. Correlación de los niveles de agentes antioxidantes y MDA.
Analizamos la existencia de correlación entre algunas de las sustancias antioxidantes
determinadas en nuestro estudio y los niveles de MDA, encontrando los resultados que se
reflejan en la tabla 21.
Tabla 21. Correlaciones defensas antioxidantes y MDA.
MDA (µg/L)
r p
SOD (U/gHb) -0.017 0.876
GPx (U/gHb) -0.053 0.633
GR (U/L) -0.198 0.068
Vit A (µg/dL) -0.141 0.195
Vit E (µg/dL) -0.140 0.200
Úrico (mg/dL) 0.047 0.671
TBil (mg/dL) 0.035 0.752
Alb (g/dL) -0.056 0.614
Trf (mg/dL) -0.052 0.638
Fer (ng/mL) 0.109 0.329
Cer (mg/dL) -0.077 0.491
127
Resultados
No encontramos ningún tipo de asociación entre el MDA y los antioxidantes estudiados, ni
endógenos ni exógenos.
7.5.1.3. Correlación de los niveles de Metales y Elementos Traza y MDA.
Analizamos la existencia de correlación entre los metales y elementos Traza determinados
en nuestro estudio y los niveles de MDA, encontrando los resultados que se reflejan en la
tabla 22.
Tabla 22. Correlaciones Metales y Elementos Traza y MDA.
MDA (µg/L)
r p
Al (µg/L) 0.384 <0.001*
Co (µg/L) 0.147 0.177
Cu (µg/L) 0.340 0.001*
Cr (µg/L) -0.437 <0.001*
Fe (µg/L) 0.219 0.043*
Mn (µg/L) -0.024 0.829
Hg (µg/L) 0.007 0.946
Ni (µg/L) -0.354 0.001*
Se (µg/L) 0.087 0.424
V (µg/L) -0.106 0.330
Zn (µg/L) -0.175 0.106
*p<0.05
128
Resultados
Se encontraron débiles correlaciones entre los niveles de MDA y la concentración de Al, Cu y
Fe. El carácter de esta asociación resultó positiva, es decir, que al aumentar las
concentraciones de los metales también lo hacia el MDA.
En el caso de Cr y Ni se encontraron asociaciones negativas con los niveles de MDA.
Estos resultados sugieren el papel protector del Cr y Ni, para los que la reducción de sus
concentraciones se asocia a la peroxidación lipídica y a la presencia de Alzheimer y DCL. Por
el contrario, el Cu y el Al, no solo presentan concentraciones más elevadas en los pacientes
con enfermedad de Alzheimer y DCL sino que existe una estrecha asociación con la patología
neurodegenerativa. Así mismo, el Fe se asoció a la presencia de MDA en los pacientes
estudiados.
7.5.2. Correlaciones de los Metales y Elementos Traza
7.5.2.1. Correlación entre los niveles de enzimas antioxidantes con los niveles de Metales y
Elementos Traza.
Puesto que algunos de los metales y elementos Traza estudiados actúan como elementos
catalíticos esenciales para diversas enzimas, se ha realizado un test de correlación entre los
niveles de los distintos metales y elementos Traza estudiados y los niveles de las enzimas
antioxidantes medidas (Tabla 23).
129
Resultados
Tabla 23. Correlaciones entre enzimas antioxidantes con Metales y Elementos Traza.
SOD
(U/gHb)
GPx
(U/gHb)
GR
(U/L)
r p r p r p
Al (µg/L) -0.065 0.551 0.103 0.340 -0.124 0.252
Co (µg/L) 0.016 0.887 0.158 0.144 -0.028 0.793
Cu (µg/L) -0.053 0.626 0.045 0.684 -0.254 0.017*
Cr (µg/L) 0.011 0.925 0.045 0.684 0.173 0.108
Fe (µg/L) -0.96 0.390 -0.168 0.128 -0.193 0.074
Mn (µg/L) -0.085 0.436 -0.453 <0.001* -0.050 0.647
Hg (µg/L) -0.085 0.432 -0.197 0.068 -0.166 0.125
Ni (µg/L) 0.038 0.733 -0.037 0.741 0.123 0.255
Se (µg/L) -0.141 0.205 -0.132 0.235 -0.257 0.016*
V (µg/L) -0.070 0.528 0.496 <0.001* 0.086 0.430
Zn (µg/L) -0.185 0.086 -0.302 0.006* -0.133 0.221
*p<0.05
No se observa ninguna relación entre la SOD y los elementos metálicos estudiados. Los
niveles de GPx se correlacionan positivamente con los niveles de V y negativamente con los
niveles de Zn y Mn. Los niveles de GR se correlacionan débilmente de forma negativa con los
niveles de Cu y Se.
130
Resultados
7.5.2.2. Correlación entre los niveles de vitaminas antioxidantes con los niveles de Metales y
Elementos Traza.
Se analizó la correlación entre los niveles de los distintos metales y elementos Traza con las
concentraciones de vitaminas antioxidantes determinadas. Los resultados se muestran en la
tabla 24.
Tabla 24. Correlaciones entre vitaminas antioxidantes con Metales y Elementos Traza.
Vit A
(µg/dL)
Vit E
(µg/dL)
r p r p
Al (µg/L) -0.149 0.170 -0.263 0.014*
Co (µg/L) -0.129 0.235 -0.189 0.080
Cu (µg/L) 0.051 0.638 -0.009 0.931
Cr (µg/L) 0.061 0.572 0.407 <0.001*
Fe (µg/L) -0.010 0.928 -0.028 0.798
Mn (µg/L) 0.171 0.114 -0.025 0.816
Hg (µg/L) 0.095 0.383 0.036 0.738
Ni (µg/L) -0.069 0.528 0.401 <0.001*
Se (µg/L) 0.112 0.303 0.199 0.064
V (µg/L) -0.310 0.004* -0.217 0.043*
Zn (µg/L) 0.169 0.118 0.305 0.004*
*p<0.05
131
Resultados
En el caso de la vitamina A solo encontramos una correlación negativa con los niveles de V.
En el caso de la vitamina E encontramos una correlación positiva con los niveles de Cr, Ni y Zn
y una débil correlación negativa con los niveles de Al y V.
7.6. ESTUDIO DE LA PRECISIÓN DIAGNÓSTICA DE LOS AGENTES DEL METABOLISMO
OXIDATIVO PARA LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Para analizar la precisión diagnóstica de algunas de las variables estudiadas se realizó el
estudio de sensibilidad y especificidad con curvas ROC.
De todas las variables cuantitativas, que mostraron diferencias estadísticamente significativas
entre grupos, se realizó la curva ROC y se midió su área bajo la curva (ABC) y su intervalo de
confianza (IC) al 95%. Solo mostraremos aquellas curvas cuya ABC sea superior a 0.5, valor
mínimo para considerar un test válido como prueba diagnóstica, y además muestren
significación estadística (p<0.05). Acompañando a estos datos, se detallan los valores de
sensibilidad y especificidad, directamente del punto de corte considerado óptimo.
Se realizaron los análisis de curvas ROC para el diagnóstico de pacientes con enfermedad de
Alzheimer, considerando como enfermos los pacientes con Alzheimer mientras que el grupo
control lo formó el grupo de sujetos sanos.
En los gráficos 1-3 se muestran las curvas ROC para las variables MMSE, Cu y MDA y el punto
de corte óptimo para diferenciar mejor a los pacientes con enfermedad de Alzheimer.
132
Resultados
Grafico 1: Curva ROC para la variable MMSE.
ABC P IC al 95% Valor
óptimo Sensibilidad Especificidad
MMSE 0.970 <0.001 0.000 – 1.00 24.5 100% 81.8%
133
Resultados
Grafico 2: Curva ROC para la variable Cu.
ABC P IC al 95% Valor
óptimo Sensibilidad Especificidad
Cu 0.670 0.015 0.541 – 0.800 846.7 91.4% 42.4%
134
Resultados
Grafico 3: Curva ROC para la variable MDA.
ABC P IC al 95% Valor
óptimo Sensibilidad Especificidad
MDA 0.779 <0.001 0.670 -0.887 12.7 80.0% 60.6%
135
Resultados
De todas las variables estudiadas el valor del MMSE y los niveles de Cu y MDA fueron válidas
como pruebas diagnósticas para la enfermedad de Alzheimer, observando que el MMSE es la
variable que tiene mayor sensibilidad y especificidad diagnóstica (S= 100% y E=81.8%).
7.7. ANÁLISIS DE REGRESIÓN LOGÍSTICA
Para determinar con mayor exactitud el papel de estos marcadores diagnósticos en la
enfermedad de Alzheimer, se realizó un análisis de regresión logística. Se controlaron las
variables diagnósticas prefijadas por las curvas ROC: MMSE, Cu y MDA. Para ello se
agruparon las variables según el valor óptimo obtenido de las curvas ROC y se calculó la odds
ratio (OD) y los intervalos de confianza del 95% (Tabla 25).
Tabla 25: Variables y riesgo asociado a la enfermedad de Alzheimer.
VARIABLE OD P IC GRUPO
ENFERMOS
GRUPO SANOS
MMSE < 24.5 177.3 <0.001 17.3 – 1835.7 EA Control
Cu > 846.7 µg/dL 8.1 0.001 2.1 – 31.8 EA Control
MDA > 12.7 µg/L 5.4 0.001 1.8 – 15.9 EA Control
Loa resultados de la regresión logística indican que presentar un MMSE inferior a 24.5 puntos
supone un riesgo de 177.3 veces superior de encontrarnos ante un paciente con enfermedad
de Alzheimer. En el caso del Cu niveles superiores a 846.7 µg/dL o para el MDA valores
136
Resultados
superiores a 12.7 µg/L representa un riesgo de presentar enfermedad de Alzheimer 8.1 veces
o 5.4 veces respectivamente.
DISCUSIÓN
Discusión
141
La bibliografía publicada hasta el momento parece indicar que los pacientes con Alzheimer
sufren más EO respecto a la población general (Sayre 2001; Mecocci 2004; Zhu 2004; Gella
2009), y que este proceso se produce desde los momentos iniciales de la enfermedad.
La posibilidad de que el EO producido, bien por un aumento de RL y EROs y/o por una
disminución de las defensas antioxidantes, pueda promover el proceso neurodegenerativo
que se produce en la enfermedad de Alzheimer es de particular interés, pues actualmente se
desconoce la etiología de la enfermedad y la patogenia de esta es muy diversa. Como se
comenta en el apartado Introducción el cerebro requiere una elevada demanda de oxígeno,
debido a que las neuronas tienen una actividad metabólica muy importante, y además su
contenido en antioxidantes es bajo, que unido a la presencia de altos niveles de oxígeno
potencia la producción de RL y EROs, dañinos para las células y tejidos.
Los pacientes con DCL presentan un estado cognitivo intermedio entre envejecimiento
normal y demencia y puede implicar un estado de pre-enfermedad de Alzheimer, o más
general un estado de pre-demencia (Luis 2003). El desenlace en cada caso de DCL es incierto,
sin embargo, muchos sujetos con DCL permanecen estables o a veces revierte a un estado
cognitivo normal y aproximadamente un 15% de ellos evolucionan a Alzheimer (DeCArli
2003). Por ello es interesante también el estudio de este grupo de pacientes, donde
podemos encontrar las fases iniciales de la enfermedad de Alzheimer.
El número de pacientes que se ha incluido en el estudio no ha sido muy elevado, sobre todo
en el grupo de pacientes con DCL. El proceso de selección ha sido muy dificultoso debido a
que el EO es un mecanismo patogénico común a múltiples patologías de las que se dan con
relativa frecuencia en la edad avanzada. Esto nos ha obligado a incluir en nuestra serie solo a
aquellos sujetos, con o sin deterioro cognitivo, pero que no presentaran adicionalmente
enfermedades asociadas al EO. Las pruebas de laboratorio y de imagen a las que se
sometieron nos permitieron realizar una rigurosa selección de los pacientes. Por otra parte,
el grupo de DCL resultó el más difícil de reclutar ya que su identificación entre los ancianos
sanos y los dementes no siempre resulta sencillo.
Discusión
142
La selección de los sujetos a estudio fue realizada cuidadosamente y se basó tanto en la
evaluación e identificación neurológica de cada grupo como en la valoración analítica de los
sujetos, de modo que la comparabilidad intergrupos no estuviera sujeta a sesgos y la
presencia o no de EO estuviera influenciada por la presencia de patologías asociadas. A
todos los sujetos incluidos en nuestro estudio, se les realizó un estudio analítico general
(Tablas 5-7) sin encontrar diferencias estadísticamente significativas de los parámetros
generales estudiados entre grupos de sujetos. Por tanto, la totalidad de los sujetos a estudio
se comportó como un grupo homogéneo en lo relativo a la ausencia de patologías asociadas
al EO.
Desde el punto de vista clínico, dispusimos de una muestra de pacientes con Alzheimer con
poco tiempo de evolución de la enfermedad, ya que fueron reclutados para nuestro estudio
en el momento del diagnóstico, cuando todavía no habían comenzado con ningún
tratamiento anticolinesterásico. En los pacientes con DCL se procedió a realizar un
seguimiento anual, hasta llegar al tercer año de evolución, realizando una nueva evaluación
neurológica que permitió determinar la evolución a Alzheimer en 6 pacientes, mientras que
el resto permanecieron estables (12 pacientes). En los pacientes que no han llegado al tercer
año de evolución se ha estimado su progresión a Alzheimer (Alom 2007). El grupo DCL
constituye una diana muy interesante de cara a nuestra investigación ya que su estudio nos
permitirá evaluar las diferencias en lo que respecta al EO con la enfermedad de Alzheimer
bien establecida. O lo que es lo mismo, si los marcadores de estrés son eficaces para
identificar el estadiaje pre-demencia o si su comportamiento es similar a la enfermedad de
Alzheimer. Adicionalmente, el seguimiento de la evolución de los DCL nos permitirá aportar
nuevas evidencias sobre si el curso del deterioro puede ser previsto con el estudio de los
marcadores de EO.
Respecto a las características epidemiológicas de los sujetos de nuestros estudio,
encontramos diferencias en la edad media entre los distintos grupos (p=0.012), presentando
el grupo de pacientes con Alzheimer una edad superior al resto (Tabla 3). Resulta evidente
que los pacientes con Alzheimer incluidos en nuestro estudio son de inicio tardío
Discusión
143
presentando una edad superior a 65 años. Por tanto corresponden a pacientes de Alzheimer
esporádico.
El porcentaje de mujeres en el grupo DCL fue inferior con respecto al resto de grupos,
correspondiendo además con el único grupo donde el porcentaje de mujeres fue menor que
el de hombres (Tabla 3). Este dato puede tener que ver con las cifras ya conocidas de
supervivencia superiores que presenta la mujer y coincide con otros datos que indican que
las mujeres presentan más riesgo que los hombres de padecer Alzheimer (Chen 2009;
Musicco 2009).
Como es lógico, en el grupo de pacientes con EA se obtuvieron puntuaciones menores en el
MMSE. Actualmente el diagnóstico de Alzheimer se basa en la puntuación de test cognitivos,
como es el MMSE, después de descartar otras patologías. Sin lugar a dudas, el MMSE
presentó diferencias estadisticamente significativas (Tabla 4) entre grupos con la progresiva y
gradual disminución del deterioro cognitivo presente en los pacientes con Alzheimer y DCL.
Son numerosos los métodos utilizados para medir el daño oxidativo en los sistemas
biológicos. En esencia, el estudio del EO se realiza midiendo el equilibrio/desequilibrio de los
agentes implicados en su aparición (pro-oxidantes) y los protectores, conocidos como
antioxidantes (endógenos o exógenos) o bien, valorando los resultados de la actividad
oxidativa. El método utilizado en este trabajo ha abarcado la valoración del EO mediante la
determinación de agentes oxidantes/antioxidantes, como son las enzimas (SOD, GPx y GR) y
vitaminas (A y E) antioxidantes, y de productos del EO como son los niveles de MDA
(producto de peroxidación lipídica). Adicionalmente, se ha investigado el papel que juegan
varios metales y elementos Traza, algunos de actividad conocida en el EO y otros por
determinar, lo que supone una investigación completamente novedosa.
Las técnicas de laboratorio utilizadas para medir los parámetros sanguíneos clásicos (glucosa,
colesterol, hemoglobina, etc…) incluidos en el estudio, no presentan ninguna particularidad,
pues se ajustan a las normas de la rutina analítica básica. Sin embargo los ensayos utilizados
en el presente estudio para determinar el EO, son técnicas especiales que no realizamos de
Discusión
144
rutina en el laboratorio de nuestro hospital. Los métodos utilizados para ello han sido
elegidos por ser los más adecuados a las necesidades de trabajo. Además de las
determinaciones incluidas en nuestro estudio, existen otras que participan tanto en el
sistema antioxidante (catalasa, glutatión, vitamina C), oxidantes (NO) y productos de
oxidación (proteínas y DNA) que no hemos incluidos bien por no disponer de la tecnología
adecuada para determinarlas o bien por ser moléculas que por sus características de
estabilidad no eran compatibles con el diseño de nuestro estudio.
Los métodos analíticos empleados para las determinaciones propuestas fueron los que
garantizaban una mayor fiabilidad en las mediciones, ya que una de las limitaciones de los
resultados encontrados en la literatura científica radica en el empleo de métodos poco
específicos. Es el caso de la determinación de antioxidantes totales (TBARS) por métodos
espectrofotométricos, que incluyen importantes interferencias, en lugar de la estimación de
moléculas aisladas o bien, la determinación de vitaminas por colorimetría, en lugar de la
cromatografía de alta resolución o HPLC empleadas en este estudio. En el presente trabajo se
ha incluido la valoración de las prestaciones analíticas de los métodos de análisis como un
componente esencial de la investigación.
La precisión del método de HPLC para la determinaciones de vitamina A, vitamina E y MDA se
estimó mediante la medición de la repetibilidad y la reproducibilidad. Los valores de CV para
la repetibilidad fueron todos inferiores al 7.8%, excepto para MDA, encontrándose por
debajo del límite de aceptación (< 2.5 DE), lo que demuestra la buena precisión de los
métodos propuestos. En cuanto a la reproducibilidad, los CV fueron todos inferiores al 10.0%
lo que se encuentra por debajo del límite de aceptación, de 2 a 3 veces la repetibilidad.
Además, los métodos utilizados fueron exactos, ya que los límites de tolerancia diferentes del
margen de error se situaron por debajo los límites de aceptación (±15.0%) en todos los
niveles de concentración analizados. El método de determinación de la SOD fue el menos
exacto, ya que sobrepasaba el límite de aceptación (16.5%). Este hecho puede deberse a que
el procesamiento de la muestra control utilizada para la determinación de la exactitud,
Discusión
145
requirió varias diluciones, entre ellas una al 1:200, que probablemente aumentara el error en
su preparación.
Los resultados de la linealidad y límite de detección de las distintas técnicas mostraron que
son aceptables, ya que abarcan las concentraciones séricas que se alcanzan en cada una de
ellas.
La determinación de los metales y elementos Traza se realizó en suero sanguíneo obtenido
en tubos especiales libres de metales utilizando la tecnología de ICP-MS. La técnica se
encontraba optimizada para el análisis de metales en matrices distintas del suero sanguíneo
humano, por ello hemos tenido que ponerla a punto. Para ello se revisó la bibliografía y se
evaluaron varios métodos de preparación de muestras. Tras analizar las muestras con los 4
tipos de pre-tratamientos posibles: dilución seguida de tratamiento ácido, tratamiento ácido
seguido de dilución, tratamiento básico, tratamiento básico + 1-butanol al 2%. (Anexo III),
vimos que los mejores resultados fueron los obtenidos con el método básico. Además los
límites de linealidad y de detección de la técnica se encontraban dentro de los rangos de
cada metal o elemento Traza en población general (Anexo IV).
La repetibilidad del método fue inferior al 10.8% para todos los metales, lo que mostró la
excelente precisión de la tecnología propuesta. La reproducibilidad también se encontró en
todos los casos por debajo del límite de aceptación (de 2 a 3 veces la repetibilidad), sólo en el
caso del Al (16.6%) nos encontramos ligeramente por encima de este límite (13.8%).
De todos los parámetros estudiados, relacionados con el EO, el MDA es sin lugar a dudas el
que mejor y más claramente identifica casos de controles, encontrando niveles
significativamente aumentados en el caso de pacientes con Alzheimer. Nuestros datos
coinciden con la mayoría de estudios encontrados en la literatura (Bourdel-Marchasson
2001; Ozcankaya 2002; Polidori 2002; Gustaw-Rothenberg 2010; Padurariu 2010), pero
además confirmamos el riesgo que confieren la presencia de niveles más altos para padecer
Alzheimer (Tabla 25). Además, para descartar que los niveles superiores de MDA presentes
en los pacientes con Alzheimer y DCL frente al grupo control no correspondieran a la
Discusión
146
presencia de concentraciones mayores de los correspondientes sustratos lipídicos,
realizamos un estudio de correlación que mostró la ausencia de asociación (Tabla 20). Ya
hemos indicado anteriormente que los tres grupos de sujetos estudiados no arrojaron
diferencia entre ellos en los que respecta a las concentraciones de las magnitudes
bioquímicas generales, incluidos los lípidos (Tabla 7). Parece claro que el MDA, resultado de
la peroxidación lipídica y por tanto del daño oxidativo, diferencia pacientes con enfermedad
de Alzheimer y DCL de sujetos normales y nos permite analizar los agentes de EO así como
los metales y elementos Traza en nuestra serie para determinar su relación con la
enfermedad neurocognitiva.
Los metales están considerados como elementos importantes en situaciones de EO tanto por
sus funciones oxidantes como antioxidantes. Las acciones oxidantes de los metales incluirían
múltiples mecanismos como el de potenciar la formación y agregación del depósito de β-
amiloide, en el caso concreto de la enfermedad de Alzheimer, y el de su toxicidad debido a
un aumento de sus niveles (Strozyk 2009). Mientras que las acciones antioxidantes estarían
esencialmente asociadas a las enzimas antioxidantes de las que forman parte, excepto en el
caso del zinc que ha sido propuesto como un antioxidante per se.
Los resultados de los metales y elementos Traza analizados en nuestro estudio revelan
niveles dentro de los rangos de normalidad esperados para todos ellos. Sin embargo,
encontramos diferencias significativas en los niveles de Cu y Al, cuyos niveles resultaron más
elevados en los pacientes con enfermedad de Alzheimer (Tabla 8). Estos resultados
analizados en asociación al MDA (Tabla 22) revelan el papel que pueden jugar los metales y
elementos Traza en la enfermedad de Alzheimer, ya sea como oxidantes o antioxidantes.
Así, los niveles de Al, Cu y Fe se correlacionan positivamente con las concentraciones de MDA
indicando su posible implicación en el daño oxidativo cuyo indicador bioquímico en nuestro
estudio es el MDA. Por tanto podemos considerar que actúan como sustancias oxidantes. Por
el contrario, el Cr y Ni exhiben un comportamiento protector frente al EO (Tabla 22).
Discusión
147
En nuestra serie, la concentración sérica de Al correlaciona positivamente con la enfermedad
de Alzheimer como ya apuntaban algunos autores (Zapatero 1995; Smorgon 2004). La
presencia aumentada de Al se había demostrado en las placas seniles (Candy 1986) y en
cerebros (Andrasi 2005) de pacientes con Alzheimer. Además el carácter exclusivamente
oxidante del Al se pone de manifiesto en nuestra serie al correlacionarse los niveles de este
con los del MDA. De hecho, ha sido conocido como un elemento tóxico para el SNC, porque
conduce a un deterioro del metabolismo de los neurotransmisores y estimula la producción
del β-amiloide. Nuestros resultados confirman las evidencias que ponen de manifiesto
algunos autores (Drago 2008; Vasudevaraju 2008) acerca de su posible papel etiopatogénico
para la enfermedad de Alzheimer, y que incluso se ha visto que comienza en la fase de DCL
(Smorgon 2004).
En el caso del Cu hemos encontrado un comportamiento similar al Al. El Cu se comporta en
nuestra serie como un oxidante, ya que hemos encontrado aumentados sus niveles en los
pacientes con Alzheimer con respecto al grupo control y además estos se asocian con un
aumento en los niveles de MDA. Estos resultados coinciden con el de otros autores (Squitti
2002; Smorgon 2004), y que al igual que los niveles de Al, estos aumentan gradualmente con
la progresión de la demencia, desde el grupo control hasta el grupo con Alzheimer. Además,
los resultados de las curvas ROC confirman la relación de este metal con el proceso
neurodegenerativo de la enfermedad de Alzheimer y el riesgo que confiere, niveles
aumentados de este metal, para padecer la enfermedad. Hemos observando que la
determinación de este metal tiene una alta sensibilidad para el diagnóstico de la enfermedad
de Alzheimer (Gráfico 2). Aunque se trata de un metal que habitualmente se incluye entre las
defensas antioxidantes por sus características de cofactor de enzimas antioxidantes, nuestros
resultados ponen de manifiesto el potencial redox que presenta cuando este se encuentra
aumentado por encima de las necesidades celulares, participando así en la producción de RL
y en la formación y agregación del depósito de β-amiloide (Castellani 2004; Huang 2004;
Cuajungco 2005; Strozyk 2009).
Discusión
148
El Cr es uno de los metales escasamente estudiado en el contexto de la enfermedad de
Alzheimer. En nuestra serie parece comportarse como un agente protector de la
neurodegeneración, guardando relación inversa con el grado de progreso de la misma y con
los niveles de MDA (Tabla 22). Aunque se sabe que es un metal oxidante y todos los datos
bibliográficos apuntan a que este metal está involucrado en el proceso de EO, puede que en
nuestra serie este metal tenga un efecto neuroprotector a través de su participación en el
metabolismo de lípidos y carbohidratos, procesos relevantes para las funciones cerebrales.
Este papel protector también lo han referido en los pocos estudios en los que lo han
estudiado y han encontrado al igual que en nuestra serie, una disminución de este metal en
los pacientes con Alzheimer (Smorgon C 2004).
El Fe, es un metal redox relacionado exclusivamente con la formación de RL a través de la
reacción de Fenton, que además contribuye al proceso neurodegenerativo participando en la
formación del β-amiloide y los ovillos neurofibrilares. Aunque también se describe su papel
como antioxidante al formar parte de la catalasa, lo que hace que en la bibliografía hayamos
encontrado resultados contradictorios en los estudios que han evaluado el papel de este
metal en la enfermedad de Alzheimer (Ozcankaya 2002; Smorgon 2004; Vural 2010). En
nuestro caso, los resultados no coinciden con ninguno de los encontrados en la bibliografía
ya que no hemos encontrado diferencias entre los niveles de este metal en los distintos
grupos. Los análisis de correlación han mostrado una débil asociación positiva de este metal
con los niveles de MDA lo que si apunta a que el metal puede contribuir en el proceso de EO
producido en la enfermedad de Alzheimer.
Los resultados del resto de metales estudiados (Co, Mn, Hg, Ni, Se, V y Zn) no han mostrado
diferencias entre ninguno de los grupos estudiado. Solamente en el caso del Ni hemos
observado una asociación negativa con el MDA (Tabla 22). Aunque los niveles de Ni no
presentan diferencias significativas entre grupos (Tabla 8), sus menores niveles en el grupo
de pacientes con Alzheimer junto a su negativa correlación con los niveles de MDA, apuntan
a una posible acción antioxidante de este metal.
Discusión
149
Aunque los datos bibliográficos revelan que el Cd puede intervenir en el proceso de EO y que
además algunos autores lo relacionan con la patogenia de la enfermedad de Alzheimer,
nuestros pacientes mostraron niveles de Cd por debajo del límite de detección de la técnica
por lo que no hemos podido evaluar su papel en nuestra serie.
Las enzimas antioxidantes se saben que cumplen un importante papel en el proceso de EO, y
en particular el que se produce en el contexto de la enfermedad de Alzheimer. Los
resultados de las enzimas antioxidantes obtenidos para los tres grupos de sujetos estudiados
estuvieron dentro de los rangos de valores de referencia esperados, salvo en el caso de la
GPx (Tabla 9) que presentó, en todos los casos de nuestra serie, valores ligeramente
superiores a los esperados (27.5-73.6 U/gHb). Otros autores que han determinado esta
enzima con el mismo método, mostraron niveles dentro del rango de normalidad descrito
(Bourdel-Marchasson 2001; Kharrazi 2008). Tal vez la diferencia pueda ser debido a que
realizaban la medida a partir de hematíes lisados mientras que nosotros utilizamos sangre
total heparinizada, en cualquier caso los exhaustivos controles analíticos realizados
garantizaron la calidad de los resultados.
De los antioxidantes enzimáticos, medidos en este trabajo, solo la GR se muestra como tal
en nuestra serie (Tabla 9). Los niveles que encontramos de esta enzima en el grupo de
pacientes con enfermedad de Alzheimer fueron inferiores a los del grupo control al igual que
encontraron otros autores (Zafrilla 2004; Casado 2008), pero nosotros hemos obtenido los
niveles más bajos de la enzima en el grupo de DCL. Es de resaltar que ninguno de los estudios
encontrados en la bibliografía habían valorado hasta el momento los niveles de esta enzima
en el grupo de pre-demencia de DCL. Los bajos niveles de GR encontrados en nuestra serie,
tanto en el grupo de pacientes con enfermedad de Alzheimer como en el grupo de DCL, nos
hace pensar que participaría en el proceso de EO aunque no ha resultado evidente ya que no
encontramos ninguna asociación de esta enzima con los niveles de MDA (Tabla 21). Sin
embargo observamos una débil relación con los niveles de Cu y Se (Tabla 23).
Al comparar los niveles de SOD y GPx entre los grupos, hemos visto que los niveles de los tres
grupos son similares. En la literatura encontrada referente a ambas enzimas, solo
Discusión
150
encontramos un estudio en el que no encontraron ninguna diferencia entre los niveles de
estas enzimas entre paciente con Alzheimer y un grupo control (Bourdel-Marchasson 2001),
aunque en este estudio no se midieron los niveles en pacientes con DCL. El único estudio
donde se midieron los niveles de SOD y GPx tanto en pacientes con Alzheimer como en
pacientes con DCL fue en el realizado por Rinaldi (2003), y en este caso los autores
encontraron niveles disminuidos de las dos enzimas en ambos grupos con respecto al grupo
control. Respecto a la GPx, existe algún trabajo más en el que se han medio los niveles de
esta enzima en el grupo DCL, en el que encontraron niveles aumentado de GPx en este grupo
con respecto a un grupo control (Martin-Aragon 2009). Por otra parte, la GPx se relacionó
con los niveles de Mn, V y Zn (Tabla 23) dato que no ha sido descrito.
Otros compuestos tales como la transferrina, la ferritina, la ceruloplasmina y la albúmina
sabemos que contribuyen a la defensa antioxidante, tal y como se describe en la
Introducción, por su capacidad de secuestrar al Fe y Cu. Nuestros resultados no han
mostrado ninguna diferencia entre los niveles de estos antioxidantes en ninguno de los
grupos (Tabla 10) ni ninguna correlación con la concentración de MDA (Tabla 21). Los
estudios encontrados en la bibliografía en los que se había medido alguna de estas proteínas
muestran una amplia variedad de resultados. Algunos autores encontraron niveles
disminuidos de estas proteínas en pacientes con Alzheimer frente a un grupo control (Fisher
1997; Kim 2006; Johannesson 2003). En cambio cuando se han analizado en LCR o tejido
cerebral encontraron niveles aumentados en los pacientes con Alzheimer o bien no
encontraron diferencias entre grupos (Loeffler 1994, 1995), como ha ocurrido en nuestra
serie. Además ninguno de estos estudios ha medido los niveles de estas proteínas en
pacientes con DCL. Algo similar sucede con sustancias como el ácido úrico y la bilirrubina, que
no muestran diferencias significativas entre grupos (Tabla 10).
En el caso de los resultados obtenidos para las vitaminas antioxidantes no hemos encontrado
diferencias entre los grupos de sujetos estudiados (Tabla 11). Solamente hemos observado
una correlación positiva entre la concentración de Vitamina E y la concentración de algunos
metales (Zn, Cr y Ni), junto con una correlación negativa con los niveles de V y Al (Tabla 24).
Discusión
151
La mayoría de estudios en los que se ha medido los niveles de vitamina E en sangre de
pacientes con Alzheimer encontraron una disminución de los niveles de esta vitamina con
respecto a un grupo control (Bourdel-Marchasson 2001; Polidori 2002, 2004). Otros estudios
también encontraron esta disminución incluso en la fase de DCL (Rinaldi 2003; Baldeiras
2008). En nuestra serie no encontramos diferencias en los niveles de vitamina E, pero
observamos que el grupo de pacientes con enfermedad de Alzheimer y el de pacientes con
DCL tienen unos niveles de vitamina E ligeramente más elevados que los del grupo control
(Tabla 11).
Los trabajos encontrados sobre los niveles de vitamina A en la enfermedad de Alzheimer
muestran concentraciones disminuidas en los pacientes afectos (Bourdel-Marchasson 2001;
Rinaldi 2003; Polidori 2004) o bien no encuentran diferencias entre los pacientes y el grupo
control (Polidori 2002). En nuestra serie no encontramos diferencias significativas en los
niveles de vitamina A entre ninguno de los grupos estudiados, aunque si vemos que los
pacientes con enfermedad de Alzheimer tienen los niveles más bajos de esta vitamina
seguido del grupo con DCL (Tabla 11). También hemos encontrado una correlación negativa
entre las concentraciones de Vitamina A con los niveles de V (Tabla 24).
Las vitaminas juegan un papel importante en el deterioro cognitivo y en la enfermedad de
Alzheimer, y aunque se requieren más estudios que sigan confirmando su rol en la etiología
de la enfermedad, así como los mecanismos mediante los cuales actúan, es destacable que
son micronutrientes (ya sean provenientes de la dieta o de suplementos) importantes a tener
en cuenta tanto en la prevención como en el tratamiento del deterioro cognitivo y de la
enfermedad de Alzheimer.
El estudio de la precisión diagnostica de las variables cuantitativas, que mostraron diferencias
estadisticamente significativas en el análisis de ANOVA, por medio de las curvas ROC ofreció
algunos resultados novedosos.
Por una parte, evidenció la alta sensibilidad (100%) y especificidad (81.8%) obtenida por el
test MMSE (Grafico 1), además del elevado riesgo obtenido cuando se presentan niveles
Discusión
152
inferiores a 24.5 puntos, al comparar el grupo de enfermedad de Alzheimer con sujetos sanos
(Tabla 25). Este dato no hace más que confirmar la utilidad de los test cognitivos en el
diagnostico de la enfermedad de Alzheimer, hecho totalmente aceptado por la comunidad
científica.
Igualmente, niveles de MDA superiores a 12.7 µg/L mostraron una sensibilidad y
especificidad aceptables (80.0% y 60.6%) para la identificación de enfermos de Alzheimer
(Gráfico 3). Nuevamente, el MDA se ha revelado como el marcador bioquímico más claro en
la identificación de pacientes con enfermedad de Alzheimer. En el caso del Cu, niveles
superiores a 846.7 µg/L mostraron una alta sensibilidad para el diagnóstico de enfermedad
de Alzheimer (91.4%) aunque su especificidad no fue tan buena (42.4%). Sin embargo, en
nuestra serie en el caso del Cu, a partir de unos niveles de concentración determinados, deja
de prevalecer su implicación en la defensa antioxidante como cofactor de actividades
enzimáticas para actuar como agente pro-oxidante tal y como ya describieron algunos
autores (Castellani 2004; Huang 2004; Cuajungco 2005; Strozyk 2009).
En el intento de evaluar qué criterios de DCL pueden ser más útiles para identificar a los
pacientes que van a evolucionar a enfermedad de Alzheimer de los que van a permanecer
estables, se ha realizado una comparación de los resultados obtenidos dentro de este grupo
de pacientes. Entre los parámetros medidos relacionados con el EO, no hemos encontrado
ninguna diferencia estadísticamente significativa, ni siquiera en la medida de MDA (Tablas
15-19). El pequeño tamaño muestral de estos grupos nos hace incidir en una interpretación
cautelosa de nuestros resultados, ya que en muchos casos es posible que las comparaciones
no alcanzasen la significación estadística debido a este hecho. Esto nos lleva a seguir el
reclutamiento de pacientes con DCL, debido a la importancia de este grupo, para confirmar
que nuestros resultados no se deban al bajo número de pacientes.
CONCLUSIONES
157
Conclusiones
-Los pacientes con enfermedad de Alzheimer y DCL presentan niveles de MDA superiores
al grupo control. Esto sugiere que el EO representa un mecanismo común y subyacente
en la patogenicidad de dichos procesos.
- La concentración plasmática de MDA se ha evidenciado como un factor independiente
para la identificación de pacientes con Alzheimer. Nuestro estudio ha permitido
establecer los niveles y el riesgo asociado de presentar Alzheimer con suficiente potencia
estadística.
- Los niveles elevados de EO en estas patologías dependen exclusivamente de un
aumento de sustancias oxidantes como el Al y el Cu. Se trata de metales potencialmente
oxidantes por lo que deberían ser investigados sistemáticamente en estos pacientes.
- En los pacientes afectos de DCL, los resultados de las determinaciones practicadas en
nuestro trabajo no nos permitieron predecir la evolución de su situación clínica hacia la
enfermedad de Alzheimer o el mantenimiento del simple DCL, si bien el grupo de sujetos
fue bastante reducido y debería ser investigado en una serie más numerosa.
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ANEXO
179
ANEXOI
180
ANEXO II
HOJA DE INFORMACIÓN AL PACIENTE/CUIDADOR/RESPONSABLE LEGAL
1. ¿En qué consiste este estudio? El servicio de Bioquímica y el servicio de Neurología
del Hospital General Universitario de Elche está llevando a cabo un estudio de
investigación biomédica para determinar los “MARCADORES BIOLÓGICOS DE ESTRÉS
OXIDATIVO PARA EL DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL DETERIORO COGNITIVO LIGERO POR
ENFERMEDA DE ALZHEIMER”.
2. ¿Cómo se realiza este estudio? Si decide participar en este estudio, por parte del
servicio de Neurología se le practicará una evaluación clínica y/o neuropsicológica,
además de una analítica para completar su estudio.
3. Su participación es voluntaria y usted es libre de rechazar su colaboración en este
estudio.
Sus datos serán tratados de modo que la información que se obtenga no pueda asociarse a
ninguna persona física, por lo que su confidencialidad queda garantizada.
Todos sus datos se mantendrán estrictamente confidenciales y exclusivamente su médico
conocerá su identidad. Ningún dato personal que permita su identificación será accesible a
ninguna persona que no sea su médico, ni podrán ser divulgados por ningún medio.
Los resultados del estudio serán recogidos y guardados de forma anónima y disociada,
vinculándose a un código (número de paciente), de manera que únicamente su médico
puede conocer su identidad.
Los datos obtenidos de todos los participantes serán examinados y valorados anónimamente
por un grupo de investigadores que podrán hacer propuestas y sugerencias con el fin de
mejorar el conocimiento de su enfermedad.
181
Los investigadores agradecen la confianza y el esfuerzo que realiza, en el caso que decida
colaborar y si desea hacer alguna pregunta o aclarar algún tema relacionado con el estudio,
no dude en ponerse en contacto con:
Nombre del investigador: Natividad López Riquelme
Número de Teléfono: 647843775
182
CONSENTIMIENTO INFORMADO DEL PACIENTE POR ESCRITO
Título del ensayo: MARCADORES BIOLÓGICOS DE ESTRÉS OXIDATIVO PARA EL DIAGNÓSTICO
PRECOZ DEL DETERIORO COGNITIVO LIGERO POR ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Yo, _____________________________________________________
(nombre del paciente)
Declaro bajo mi responsabilidad que:
He leído la hoja de información sobre el estudio que se me ha entregado.
He podido hacer preguntas sobre el estudio.
He recibido suficiente información sobre el estudio.
He sido informado por ____________________________________
(nombre del investigador)
183
Comprendo que mi participación es voluntaria.
Comprendo que puede retirarme del estudio.
· cuando quiera;
· sin tener que dar explicaciones;
Presto libremente mi conformidad para participar en el estudio:
Firma del paciente: ____________________Firma investigador: ___________________
Lugar y Fecha: ____________________________________________
Firma del Tutor Legal y/o cuidador: ___________________________
Lugar y Fecha: ____________________________________________
184
ANEXO III
185
186
187
188
ANEXO IV
Parámetro Unidades Intervalo de
Referencia
BIOQUIMICA
GLUCOSA mg/dL 75 - 110
UREA mg/dL 17 - 43
CREATININA mg/dL 0.66 - 1.09
ACIDO URICO mg/dL 2.6 - 6.0
CALCIO mg/dL 8.5 - 10.6
FOSFATO mg/dL 2.6 - 4.5
PROTEINAS TOTALES g/dl 6.60 - 8.30
ALBUMINA g/dl 3.50 - 5.20
BILIRRUBINA TOTAL mg/dL 0.30 - 1.20
COLESTEROL TOTAL mg/dL <200
COLESTEROL-HDL mg/dL >35.0
COLESTEROL-LDL mg/dL 0 - 150
TRIGLICERIDOS mg/dL <150
GOT U/L 10 - 35
GPT U/L 10 - 34
GGT U/L 7 - 38
FOSFATASA ALCALINA U/L 30 - 120
189
SODIO mEq/L 135 - 148
POTASIO mEq/L 3.50 - 5.10
CLORO mEq/L 98 - 106
PROTEINA C REACTIVA mg/L. < 2.0
FERRITINA ng/mL 10 - 120
TRANSFERRINA mg/dL 200 - 360
PREALBUMINA mg/dL 20.0 - 40.0
CERULOPLASMINA mg/dL 15 - 45
HORMONAS Y VITAMINAS
CORTISOL MAÑANA µg/dL 5.00 - 25.00
TSH µU/mL 0.350 - 4.940
ACIDO FOLICO pg/mL 2.4 - 34.0
VITAMINA B12 pg/mL 179 - 1.162
HOMOCISTEINA µmol/L 5.00 - 12.00
VITAMINA A µg/dL 30 - 80
VITAMINA E µg/dL 500 - 1800
190
HEMOGRAMA
HEMATIES *10e6/µL 3.80 - 5.20
HEMOGLOBINA gr/dL 12.0 - 15.5
HEMATOCRITO % 35.0 - 45.0
LEUCOCITOS *10e3/µL 4.00 - 11.00
NEUTROFILOS ABSOLUTOS *10e3/µL 2.00 - 7.20
LINFOCITOS ABSOLUTOS *10e3/µL 1.50 - 4.50
MONOCITOS ABSOLUTOS *10e3/µL 0.40 - 1.10
EOSINOFILOS ABSOLUTOS *10e3/µL 0.04 - 0.50
BASOFILOS ABSOLUTOS *10e3/µL 0.00 - 0.20
PLAQUETAS *10e3/µL 130.0 - 450.0
ENZIMAS ANTIOXIDANTES
SUPERÓXIDO DISMUTASA U/gHb 1092 - 1817
GLUTATIÓN PÈROXIDASA U/gHb 27.5 - 73.6
GLUTATIÓN REDUCTASA U/L 33 - 73
PRODUCTO OXIDACION LIPIDICA
MALONILDIALDEHIDO µg/L < 36
191
METALES
ZINC µg/L 600 - 1500
COBRE µg/L 700 - 1600
HIERRO µg/L 490 - 1500
SELENIO µg/L 60 - 120
MANGANESO µg/L 0.54 - 1.8
COBALTO µg/L 0.07 – 1.7
ALUMINIO µg/L < 60
MERCURIO µg/L < 10
CADMIO µg/L < 5
VANADIO µg/L 0.26 – 1.3
NIQUEL µg/L 1 - 3
CROMO µg/L 2.5 – 6.3
Reunido el Tribunal que suscribe en el día de la fecha acordó otorgar, por
a la Tesis Doctoral de Don/Dña. Natividad López Riquelme la calificación de
.
Alicante de de
El Secretario, El Presidente, UNIVERSIDAD DE ALICANTE CEDIP La presente Tesis de D. ________________________________________________ ha sido
registrada con el nº ____________ del registro de entrada correspondiente.
Alicante ___ de __________ de _____
El Encargado del Registro,
