This document is downloaded at: 2017-12-21T21:34:22Z

TitleAmplification of HTLV-1-related Sequences among Patients withNeurological Disorders in Highly Endemic Nagasaki: Lack of Evidence forAssociation of HTLV-1 with Multiple Sclerosis

Author(s) 中山, 大介

Citation (1990-03-31)

Issue Date 1990-03-31

URL http://hdl.handle.net/10069/29347

Right

NAOSITE: Nagasaki University's Academic Output SITE

http://naosite.lb.nagasaki-u.ac.jp

16 号外第108号) 長崎大学学報 平成 2年 7月31日

中山大介(長崎県)昭和35年 7月14日生

授与年月日 平成 2年 3月31日

主論文 Amplification of HTLV -l-related

Sequences among Patients with N eu-

rological Disorders in Highly Endemic

N agasaki: Lack of Evidence for Asso-

ciation of HTL V -1 with Mu1tiple Scle-

rOSlS

論文内容の要旨

緒言

ヒト 、レトロウイルスの一つであるhuman T-

lymphotropic virus typel (HTLV-1)はadultT cell

leukemia (A TL)の原因ウイルスであると共に，

HTLV-lで流行地で多発する脊髄の炎症性疾患， trop-

ical spastic paraparesis/HTL V -1 associated

myelopathy (TSP /HAM)とも密接に関連している。

一方， Koprowskiらは脱髄疾患である多発性硬化症

(MS)患者血清中にHTLV-1と交差反応する抗体が

存在することにもとづき， HTLV-lと近縁のレトロウ

イルスがMSに関与していることを提唱した。しかし

これを否定する報告もある。最近， PCR (polymerase

chain reaction)を用いてReddyら， Greenbergらが独

立にMS患者末梢血単核球(PBMC)からHTLV-1の一

部と相同なDNAを検出し， HTLV-1そのもの或いは

近縁のレトロウイルスがMSに関与していることを示

唆した。しかし疫学的にみるとHTLV-l流行地とMS

多発地は一致せず，またHTLV-l流行地におけるMS

とHTLV-1の関連を論じた報告はない。本研究では

HTLV-1流行地である長崎県から発症してくるMS，

及び類縁の神経疾患とHTLV-1との関連を検討した。

すなわち，対象患者PBMC中にHTLV-1関連DNA配

列が存在するか否かをHTLV-lゲノム上の 6領域を

標的とするPCRを用いて検索した。

材料と方法

皇墾:国立療養所川棚病院を受診した九州、|出身の神経

疾患患者30症例。対照としてATL患者 2例， HTLV-

1キャリア30例および健常者70例。抗HTLV-l抗体検

査:ゼラチン凝集法，間接蛍光抗体法を併用し，一致

しないものはwesternblot法で確認した。 DNA抽出:

末梢血からficoll-conray法でPBMCを分離しpro-

平成 2年 7月31日 長崎大学学報 (号外第108号) 17

teinase K/SDS法で細胞DNAを抽出した。 PCR:細

胞DNA1J1gを鋳型として940C1分(1回目のみ 3分)，

600C 2分， 720C2分のサイクルで25回増幅させた。反

応液組成は50mMKCl， 10mM Tris -HCl pH8 _ 3，

1.5mM MgC12， 0.01%ゼラチン， dNTP各200mM，

プライマー各100pmol，Taq DNA po1ymerase 2. 5unit，

計100μ10PCR産物のサザン分析:PCR産物を 2%ア

ガロースゲルで分画しナイロン膜に移し取った後ハイ

ストリンジェントな条件でハイプリダイゼーションを

行った。クローン化HTLV-1プロウイルス由来の

DNA断片を32p標識したものをプロープとした。

結果

(l)PCRプライマーの選択:HTLV-1と部分的なホモ

ロジーを持つ未知のウイルスをも検出できるように

HTLV-1プロウイルスゲノム上の 6領域すなわちU3，

U5，星空豆， po1，旦主および息茎に相当する 6組のプライ

マーを合成した。

(2)PCRの特異性:HTLV-1感染細胞株 (MT-2，TL-

Su)およびATL細胞のDNAを鋳型にすると 6領域全

てについて予想されるサイズのシグナルが検出された。

これに対し非感染細胞株(Jurkat，CEM)のDNAでは

何も検出されなかった。 HTLV-1キャリアは少なくと

もU5，豆笠， po1，Q互の 4領域で全例陽性であった。健

常者の一部がU3領域のみ弱いシグナルを生じたが他

の5領域は全例陰性であった。

(3)PCRの感度:細胞あたり 1コピーのHTLV-1プロ

ウイルスを有するATL細胞のDNAを10倍段階希釈し

たものを鋳型としてPCRの感度を検定した。 env領域

は3ng(103コピー)，その他の 5領域は0.3ng(102コピ

ー)が検出可能であった。

(4)神経疾患30症例のPCR解析:症例の内訳はMS8例，

脊髄進行性筋萎縮症 2例， TSP/HAM4例，脊髄小脳

変性症7例，重症筋無力症 (MG)7例，慢性炎症性脱

髄性ポリニューロパチー 1例およびSLE1例。このう

ちPCRでHTLV-l関連DNA配列が検出されたのは

MS1例， TSP/HAM4例およびMG1例の計 6例で

あった。この 6例は抗HTLV-1抗体も陽性であった。

残る24例はPCR，抗HTLV-1抗体共に陰性であった。

考案

TSP/HAM患者では 4例中 4例からHTLV-1関連

DNA配列が検出されたのに対し， MSでは 8例中 1例

に過ぎなかった。TSP/HAMを除いた26例中， PCR陽

性となったのは 2例 (MS1例， MG1例)すなわち約

8%で長崎県における成人のHTLV-1キャリア率と

差がない。陽性となったMS1例およびMG1例は偶発

的なキャリアであったと考えられる。我々のPCRの感

度は他報告に比べて低いが健康HTLV-1キャリアは

全例陽性となる。この系で検出できないような少数の

ウイルス感染細胞が病気を起こすとは考えにくい。ま

た， HTLV-1と部分的なホモロジーを持つ末知のウイ

ルスの存在を示唆するようなシグナノレは得られなかっ

た。我々の結果は， HTLV-1はTSP/HAMとは密接に

関連しているがMSをはじめ今回調べたその他の神経

疾患とは特に関連がない事を示すものと考えられる。

論文審査の結果の要旨

中山大介は昭和61年 3月長崎大学医学部を卒業，同

年 5月医師国家試験に合格し，同年 4月に長崎大学大

学院医学研究科に入学した。大学院では病理系を専攻

し，細菌学(指導教官・長崎大学医学部細菌学教室・

宮本勉教授)を主科目としてウイルス学，特に成人T

細胞白血病ウイルス (HTLV-l)に関する研究を行っ

た。この間，学位論文 (Amplificationof HTL V -1-

re1ated Sequences among Patients with Neurologi-

ca1 Disorders in Highly Endemic N agasaki:Lack of

Evid.ence for Association of HTL V -1 with Mu1tip1e

Sc1erosis) を完成， Japanese Journa1 of Cancer

Research (Vol. 81， pp238--:246， 1990) に発表してこ

れを主論文とし，参考論文一編を附して，長崎大学大

学院医学研究科委員会に審査を申請した。

同委員会は，これを平成 2年 3月7日の定例委員会

に附議し，論文内容の要旨を検討し，研究経歴等を審

査した結果，受理して差し支えないものと認めたので，

上記の通り 3名の審査委員を選定した。学位申請者は

大学院医学研究科長，審査委員を含む研究科委員出席

のもとに平成 2年 4月25日開催された大学院研究発表

会において主論文の内容について研究発表を行ない，

質疑及討議に応答した。委員は主査を中心として慎重

に審議の上，同日の定例委員会でその結論を報告した。

主論文は成人T細胞白血病ウイルス (HTLV-l)と

多発性硬化症 (MS)の関連を検討したものである。原

因不明の脱髄疾患MSにHTLV-1の関与を示唆する

報告がある。即ちKoprowkiらはMS患者血清中に

HTLV-1と反応する抗体を検出し， Reddyら， Green-

bergらはMS患者末梢血単核球中にHTLV-1と相同な

DNAを検出した。しかしHTLV-1流行地とMS多発地

は一致しないことなどから議論となったが，一定の結

論は出ていない。またHTLV-1流行地におけるMSと

HTLV-1の関連を論じた報告はない。そこで本研究で

はHTLV-1流行地である長崎県から発症したMSを含

む各種神経疾患30症例(MS8例，脊髄進行性筋萎縮症

2例，熱帯性産性脊髄麻庫/HTLV -1 associated

mye10pathy [TSP /HAM] 4例，脊髄小脳変'性症7

例，重症筋無力症 [MG]7例，、慢性炎症性脱髄性ポリ

ニューロパチー 1例， SLE1例)を対象として患者末

梢血単核球中にHTLV-1と相同なDNAが存在するか

否かをHTLV-1プロウイルスゲノム上の 6領域(U3，

18 号外第108号) 長崎大学学報、

U5，皇室皇，.2旦1，竺~， .2茎)を標的とする遺伝子増幅法

(Polymerase chain reaction : PCR)を用いて検索

している。その結果，TSP/HAM患者では 4例中 4例

からHTLV-l関連DNAが検出されたのに対し， MS

では 8例中 1例に過ぎなかった。 TSP/HAMを除い

た26例中PCR陽性になったのは 2例(MSl例， MGl

例)でいずれも抗HTLV-l抗体陽性即ちキャリアであ

った。対象26例中 2例 (8%)のキャリア率は長崎県

における成人のHTLV-lキャリア率と差がない。従っ

て陽性となったMS及びMGは偶発的なキャリアであ

ったと考えられる。

以上の結果は， HTLV-lはTSP/HAMとは密接に

関連しているがMSをはじめ今回調べたその他の神経

疾患とは特に関連がないことを示すもの正考えられ，

前記の論議に一定の結論を得たものと云える。

医学研究科委員会は審査委員の報告に基づいて，こ

れを討論に附して審議した結果，本研究論文は医学特

に腫虜ウイルス学，神経内科学の分野に胎いて貢献す

るところ大であり，学位に値するものとして合格と判

定した。

審査担当者 主査 教授 五十嵐 章

副査教授珠玖 洋

副査教授長瀧重信

平成 2年 7月31日