morpho physiological characterisation of monascus...

The First

International Proficiency Testing Conference

Sinaia, România 11th − 13th October, 2007

347

MORPHO PHYSIOLOGICAL CHARACTERISATION OF MONASCUS

PURPUREUS STRAINS OBTAINED BY RADIOMUTAGENESIS

Mariana Ferdeş, Camelia Ungureanu University Politehnica of Bucharest, Faculty of Applied Chemistry and Materials

Science [email protected], [email protected]

Abstract Adding colourants is a necessary step in the formulation of many food products. The purpose of this study was to obtain a hyper productive strain of Monascus purpureus used in the biosynthesis of a natural red food dye in solid state fermentation, on rice. Five mutant strains of Monascus purpureus were isolated after gamma and electron beam irradiation of conidiospores, at doses lower than 10 kGy. The mutant fungi show different morphocolonial aspects, varied red nuances and distinct microscopic reproductive structures and have lower growth rates on Petri dishes culture media than the parental strain. All the radioinduced mutants were cultivated in solid state fermentation system to obtain the red fermented rice and four of them produced more pigment than the parental strain. Key words: Monascus purpureus, pigments, gamma and electron beam irradiation, mutant strain 1. INTRODUCERE Fungii din genul Monascus, cunoscuţi şi sub numele de “red yeast” sunt utilizaţi de aproape două milenii în ţările din Asia de Est atât pentru prepararea unor alimente şi băuturi, pentru obţinerea de coloranţi alimentari cât şi pentru sinteza de produse dietetice şi farmaceutice. Orezul roşu fermentat cu Monascus purpureus, Ang-Khak, Hong Qu în China sau Koji, Ang-Khak, Beni Koji, Red Koji în Japonia, este menţionat în farmacopeea Chinei antice, unde este descris ca un tratament pentru îmbunătăţirea digestiei şi regenerarea sângelui, iar mai târziu, într-o carte de medicină chineză publicată în 1590, Li Shih-Chun menţionează utilizarea acestui preparat ca agent de colorare şi ca remediu medical pentru diferite boli.

mailto:[email protected]

Mariana Ferdes, Camelia Ungureanu: Morpho physiological characterisation of monascus purpureus strains obtained by radiomutagenesis

348

Pigmenţii biosintetizaţi de Monascus purpureus sunt utilizaţi în prezent ca atare sau sub forma de extract în diferite produse alimentare din carne, pastă tradiţională de peşte fermentat, produs tradiţional asiatic denumit “surimi”, “mirin”, sos “hoi-sin”, pastă “miso”, sos de soia, pastă de soia, “tofu”, ketchup, sos de banane, vin de orez (“shaoxin”), brandy, snacks-uri, ciocolate, îngheţate, coloranţi în hrana pentru animale de casă, produse cosmetice, coloranţi pentru păr şi pentru textile. Monascus purpureus sintetizează în medii lichide sau pe medii solide un amestec de cel puţin 6 pigmenţi, dintre care 2 galbeni – monascina şi ankaflavina, 2 oranj – rubropunctatina şi monascorubrina şi 2 roşii – rubropunctamina şi monascorubramina. Pentru metabolizarea substratului, acesti fungi sintetizează o serie de enzime cu acţiune hidrolitică din categoria amilazelor, amiloglucozidazelor, celulazelor, pectinazelor şi proteazelor în scopul scindării compuşilor macromoleculari. Orezul roşu fermentat conţine compuşi cu activitate de inhibitori ai 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductazei (HMG-CoA reductaza), care sunt responsabili de inhibarea sintezei colesterolului în ficat. Colorantul brut din Monascus include de asemenea acizi graşi nesaturaţi care contribuie la reducerea lipidelor serice; extractele de Monascus scad nivelul colesterolului total şi al LDH-colesterolului precum şi al trigliceridelor serice. Orezul roşu fermentat cu Monascus purpureus prezintă o activitate antimicrobiană faţă de o serie de microorganisme din genurile Bacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Listeria, Staphylococcus şi unele mucegaiuri datorată unei substanţe numite monascidina A. [1]

2. PARTEA EXPERIMENTALĂ 2.1. Materiale Materialul biologic şi medii de cultură În experimentele efectuate a fost utilizată o tulpină de Monascus purpureus, care a fost supusă unui tratament cu radiaţii gamma şi în fascicul de electroni acceleraţi în vederea izolării şi selecţionării de mutante cu potenţial productiv crescut pentru obţinerea de pigmenţi roşii alimentari Întreţinerea şi cultivarea speciilor fungice a fost realizată prin tehnica pasajului periodic pe mediile glucoză-extract de cartof-agar (m1), extract de malţ-agar (m2) şi glucoza-extract de drojdie-agar (m3) (glucoza 4%,extract de drojdie 1%, KH2PO4 0,3%, agar-agar 1,5). Viteza orară medie de creştere a fost calculată ca raportul dintre diametrul coloniei cultivate pe mediile de mai sus în cutii Petri la un moment dat şi numărul de ore de dezvoltare. Biosinteza aditivului de culoare din Monascus s-a efectuat pe orez măcinat şi sterilizat.

2.2. Metode Metode de iradiere Studiul posibilităţii de obţinere a unor tulpini mutante hiperproductive s-a realizat prin utilizarea factorilor mutageni fizici, respectiv a radiaţiilor ionizante gamma şi a fasciculului de electroni. Iradierile au avut drept scop selecţionarea coloniilor mutante utile în producerea de pigmenţi alimentari din Monascus purpureus. Pentru ambele


349

tipuri de iradiere s-a folosit o suspensie de conidiospori în apă sterilă, obţinută din cultura pe mediul potato-dextrose-agar a tulpinii parentale. Iradierea gamma Iradierea gamma s-a efectuat la o sursa de 60Co standard, tip “creion”, de la Institutul de Fizica şi Inginerie Nucleara “Horia Hulubei” Bucureşti-Măgurele. Sursa a prezentat o activitate de aproximativ 105 TBq şi elementele dispuse astfel încât permit o geometrie de iradiere plana. Iradierile au fost efectuate în domeniul de doze 1-10 kGy, la un debit de doză fix de aproximativ 3 kGy/ora, prin varierea timpilor de iradiere şi cu asigurarea unei uniformităţi a dozei mai mici de 10%. Iradierea în fascicul de electroni Iradierea în fascicul de electroni s-a făcut în Laboratorul Acceleratori de Electroni din Institutul Naţional de Fizica Laserilor, Plasmei şi Radiaţiei Bucureşti-Măgurele, prin folosirea unui accelerator liniar de electroni “ALIN” care prezintă următorii parametri principali: energia medie a electronilor 6 MeV, curentul mediu în flux de 5 μA, lungimea pulsului 3,5 μs, frecventa de repetiţie de 100 Hz şi puterea medie de circa 60 W. Dozele de iradiere au variat între 1-10 kGy, iar valorile debitului dozei între 100-2000 Gy/min. Biosinteza şi analiza pigmenţilor Aditivul de culoare din Monascus a fost obţinut prin cultivarea tulpinii pe orez măcinat, în flacoane Erlenmeyer de 1500 mL, la temperatura de 30oC, timp de 14 zile. Mediul de culoare roşu-grena a fost uscat, măcinat şi supus unui tratament termic pentru reducerea încărcăturii microbiene, rezultând produsul final cu aspectul unei pulberi roşu intens. Extracţia pigmenţilor s-a realizat în Et-OH 96%, la un raport diferit în funcţie de mutanta cultivată. Absorbanta amestecului de pigmenţi galbeni, oranj şi roşii a fost măsurata la un spectrofotometru CARY 3E, la lungimile de unda de 400 nm (corespunzătoare maximului de absorbţie al componentei galbene) şi de 510 nm (corespunzătoare maximului de absorbţie al componentei roşii). [1] 3. REZULTATE ŞI DISCUŢII Creşterea potenţialului biosintetic al microorganismelor poate fi realizată printr-o serie de metode, dintre care una dintre cele mai necostisitoare este utilizarea factorilor mutageni, chiar dacă acest procedeu necesită o activitate laborioasă nu întotdeauna finalizată cu succes, din pricina caracterului aleatoriu al apariţiei coloniilor cu caractere mutante utile. Iradierea gamma a fost realizată la o sursă de 60Co, cu caracteristicile prezentate anterior. Pentru fiecare probă iradiată a fost stabilit numărul de UFCxcm-3, s-a determinat viabilitatea suspensiei de spori, rezultatele fiind prezentate în tabelul nr 1.

Tabel 1 - Viabilitatea celulelor de Monascus în probele iradiate gamma DOZA (kGy) 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 UFC . cm-3 7,9x

1062,5x106

3,9x105

6,3x104

3,1x104

6x 103

6x 102

199 32 5 0

Viabilitate (%)

100 31,6 4,9 7,9x10-1

3,9x10-1

7,6x 10-2

1x 10-2

2,5x 10-3

4,1x 10-4

6x 10-5

0


350

Selecţionarea tulpinilor hiperproductive a fost realizată utilizând ca mediu de cultură mediul cu glucoza şi extract de cartof, în cutii Petri, însămânţate din diluţia corespunzătoare a suspensiei de spori iradiaţi şi termostatate la 30 oC, timp de 5 zile. În urma observării diferenţelor de culoare apărute între coloniile din plăci, au fost selecţionate un număr de 25 posibile mutante, care au fost repicate pe acelaşi mediu de cultură, în scopul verificării caracterelor şi izolării celor mai bune producătoare de pigmenţi roşii. În final au fost selecţionate şi izolate doar două colonii, cele mai intens colorate. Acestea au fost denumite M1, izolată din suspensia de spori iradiată la doza de 6 kGy şi tulpina M2, izolată din suspensia de spori iradiată la 4 kGy. Iradierea în fascicul de electroni a fost realizată conform procedeului descris, într-un iradiator liniar ALIN 7, la INFLPR Bucureşti-Măgurele. Probele iradiate au constat, ca în cazul iradierii gamma, din suspensii de conidiospori în apă sterilă, având o concentraţie de 24,7 x 105 UFC.cm-3. Dozele de iradiere au fost cuprinse între 1 şi 10 kGy, determinându-se pentru fiecare în parte numărul de UFC.cm-3 şi viabilitatea (tabelul 2).

Tabel 2 - Viabilitatea celulelor de Monascus în probele iradiate în fascicul de electroni

DOZA (kGy) 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

UFC.

cm-324,7x105

5,1 x105

7,5 x104

10 x103

1 x103

102 25 4 0 0 0

Viabilitate (%)

100 20,6 0,03 4,04 x10-3

4,04 x10-4

4,04 x10-5

1,01x10-5

1,62 x10-6

0 0 0

Pentru selecţionarea tulpinilor mutante cu capacitate productivă ridicată în ceea ce priveşte sinteza pigmenţilor roşii, dintr-un număr de 11 colonii repicate pe mediul cu glucoza şi extract de cartof, au fost izolate, în final, trei tulpini, toate provenind din suspensia de spori iradiată la doza de 2 kGy; acestea au primit denumirea M3, M4 şi M5. Caractere culturale ale tulpinilor mutante Tulpinile mutante izolate în urma procedeului de iradiere au fost cultivate pe mediile menţionate mai sus, studiindu-se aspectul şi culoarea coloniilor şi determinându-se vitezele de creştere la diferite temperaturi, comparativ cu tulpina parentală. Pentru toate mediile de cultură utilizate, se observă diferenţe mari atât între mărimea coloniilor tulpinii parentale şi restul mutantelor, cât şi între acestea din urmă. Cea mai rapidă creştere a prezentat-o tulpina martor, în special pe mediul m3 conţinând glucoză şi extract de drojdie, urmată de tulpina mutantă M5. Valorile cele mai mici ale diametrelor coloniilor s-au înregistrat în cazul tulpinii M4, pe toate mediile utilizate. Influenţa diferitelor temperaturi asupra creşterii tulpinilor mutante a fost studiată utilizând mediul m1, termostatarea realizându-se la 30 oC şi 37o C timp de 7 zile, iar la 20 oC timp de 18 zile. Valorile vitezelor orare de creştere ale tulpinilor mutante comparativ cu tulpina parentală sunt prezentate în figura 1. Toate cele cinci tulpini mutante au prezentat viteze orare de creştere mai mici decât tulpina parentala, pentru temperaturile luate în consideraţie.


351

De exemplu, la 30oC, tulpina parentală a crescut cu o viteză medie de 0,393 mm/oră, în timp ce M1 şi M5 au avut viteze de creştere de aproximativ 0,25 mm/oră. Cea mai mică valoare a acestei mărimi, de numai 0,06 mm/oră s-a înregistrat în cazul tulpinii M4.

Tabel 3 - Aspectul coloniilor mutante pe mediul m 3 (cultivare în plăci Petri 168 ore/ 30oC)

Tulpi

na

Aspectul coloniei

Culoarea

Reversul

Viteza orară de creştere (mm/oră)

sălba-tică

pufos, suprafaţă cutată radial

albă după 48 ore, devine crem după 120 ore, apoi cărămizie în centru

cutat, portocaliu, devine roşu în centru după 120 ore

0,505

M1 pufos, suprafaţă slab cutată

albă în primele zile, portocaliu intens după 120 ore; la 168 ore agarul periferic este colorat în roşu

devine puternic cutat, este roşu-portocaliu în primele 48 ore, apoi se colorează în roşu-intens

0,223

M2 pufos, cutată neregulat

la început albă, apoi roz-portocaliu după 120 ore

puternic cutat, se colorează în portocaliu apoi în roşu

0,157

M3 pufos mai ales în centru, suprafaţă cutată radiar

albă după 48 ore, apoi devine roz

uşor cutat, portocaliu, apoi roşu după 120 ore

0,232

M4 zona centrală cu aspect rugos, compact, zona periferică cu miceliu aderent la mediul de cultură

culoare roşie din primele zile

necutat, de culoare roşie

0,155

M5 pufos, suprafaţă uşor cutată radial, după 144 ore apar în centru picături de lichid roşu, miceliul aerian central se dezvoltă vertical

albă după 48 ore, apoi roz-portocalie, mai colorată în centru, după 120 ore agarul din jurul coloniei se colorează în roşu

slab cutat, portocaliu la 48 ore, apoi devine roşu

0,265

Scăderea vitezelor de creştere pentru tulpinile mutante comparativ cu tulpina parentală este corelată cu o producţie crescută de pigmenţi, fenomen observat chiar prin studiul aspectului şi culorii coloniilor. Acest lucru se poate explica fie printr-un proces de inhibare a creşterii datorită sintezei de pigmenţi, fie prin competiţia pentru nutrienţi existentă între creştere şi pigmentogeneză [2] .


352

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0,350,4

Viteze orare de crestere

(mm/ora)

20 C-18 zile 30 C-7 zile 37 C-7 zile

Temperatura si durata de dezvoltare

parentalaM1M2M3M4M5

Figura 1 - Vitezele orare de creştere ( mm/oră ) la temperaturile de 20o C, 30 oC şi 37o C pe mediul glucoza-extract de cartof

Aspectul microscopic al tulpinilor mutante

Studiul caracterelor microscopice ale tulpinilor mutante a fost efectuat din culturile în plăci Petri pe mediul glucoza-extract de cartof, după o durată de termostatare de 6 zile la 30oC. Preparatele microscopice au fost realizate în apă sau lactofenol, principalele caracteristici ale tulpinilor examinate la microscop fiind prezentate mai jos: Pentru tulpina parentală cu fenotip sălbatic au fost vizualizate hife cu diametrul de aproximativ 7 μm şi un aparat reproducător bine reprezentat, atât prin formaţiuni caracteristice reproducerii pe cale asexuată, cât şi pe cale sexuată. Sporii imperfecţi se evidenţiază sub forma de lanţuri de conidiospori în număr de 10-12 / lanţ, cu succesiune bazipetală, de forma rotundă sau uşor ovală, mai ascuţiţi la capătul proximal, cu dimensiuni cuprinse între 7-14 μm diametru, cei mai mari fiind primii formaţi. Conidiosporii au pereţi subţiri, dar pot funcţiona drept clamidospori, când grosimea pereţilor creşte. De cele mai multe ori, aceşti spori se prezintă incolori, putini dintre ei fiind coloraţi în roşu-purpuriu, în special cei din capătul lanţului (fig. 2). Mutanta M1- în preparatul microscopic se observă hife cu diametrul cuprins între 7 şi 9 μm, puternic ramificate, având lungimi mai mici decât în cazul tulpinii parentale. Din loc în loc, de-a lungul hifelor şi în special la capetele acestora, se observă prezenţa pigmenţilor de culoare roşu-purpuriu, în cantitate mai mare decât la martorul neiradiat. Conidiosporii au dimensiuni de 9 pană la 10 μm, unii dintre ei coloraţi, grupaţi în lanţuri de 5-6; de obicei ultimul din lanţ este colorat în roşu. De asemenea, faţă de tulpina martor, ascele sunt mult mai rare. Mutanta M2 - prezintă numeroşi conidiospori cu dimensiuni diferite, 7-10 μm diametru, unii coloraţi în roşu-portocaliu, grupaţi în lanţuri lungi de 10-15. Ascele, de culoare roşu-portocaliu, sunt mai rare faţă de tulpina parentală. Mutanta M3 - prezintă hife cu diametrul cuprins între 4 şi 7 μm, conidiospori cu dimensiuni de 7-12 μm, în număr mare, în lanţuri de câte 10-12, uneori pigmentaţi. În interiorul unor hife mai groase se observă multe incluziuni rotunde, incolore. Ascele sunt mai rare decât la martor, dar în număr mai mare decât la mutantele M1 şi M2 .


353

Mutanta M4 - hifele sunt mult mai scurte decât în cazul celorlalte mutante, cu îngroşări la capete şi din loc în loc, prezentând numeroase incluziuni. Conidiosporii pot avea dimensiuni mari, de până la 15 μm diametru, cu pereţi mai groşi. Ascele, cu un diametru de 24-30 μm se observă în număr mare, colorate în roşu intens.

Figura 2 - Aspectul microscopic al tulpinii parentale

Figura 3 - Aspectul microscopic al tulpinii M4

Mutanta M5 7 μm, grupaţi în lanţuri de pân la 15. Ascele sunt destul de dese, dar mai puţine decât la tulpina parentală,

a. Astfel, în ceea ce priveşte aspectul hifelor,

- prezintă numeroşi conidiospori cu diametrul de ă

colorate, cu diametrul de 40-60 μm. Preparatele microscopice ale tulpinilor mutante au scos în evidenţă modificări destul de importante ale morfologiei acestoracestea sunt mai scurte şi uneori mai subţiri, fenomen care, corelat cu producţia crescută de pigmenţi, ar putea fi explicat prin inhibarea formării constituenţilor peretelui celular prin sinteza sporită de monascorubrină şi rubropunctatină. De altfel, pentru toate tulpinile mutante se pot observa mai multe zone hifale sau conidiospori intens coloraţi în roşu în preparatele microscopice. În acest mod ar putea fi explicată şi micşorarea ratei de creştere, care pare a fi în legătură cu producţia de pigmenţi. Încetinirea sintezei de glucani, celuloză, chitină sau alţi constituenţi proprii peretelui celular determină încetinirea creşterii şi mărirea fragilităţii hifelor. Acest fenomen este cel mai bine evidenţiat în cazul mutantei M4, cu cea mai mică viteză de creştere, dar cu o pigmentaţie accentuată a coloniilor. Prin urmare, s-ar putea trage concluzia că sinteza de pigmenţi este un proces în competiţie cu sinteza de materiale ale peretelui celular. În ceea ce priveşte formaţiunile reproducătoare, tulpinile mutante sunt caracterizate printr-un număr redus de asce, modalitatea predominantă de înmulţire fiind sporii asexuaţi.[1,3]


354

Producţia de pigmenţi roşii utilizând tulpinile mutante cultivate pe medii solide

e medii solide, comparativ cu tulpina parentală neiradiată, în scopul selecţionării

O tulpină parentală (calculate ca unităţi cm prin multiplicarea

Figura 4 - Raportul de cre

4. CONCLUZII

eficientă de creştere a pigmentogenezei tulpinii parentale este prezentată de inducerea mutagenezei prin iradiere gamma şi în fascicul de

, 1998, Metoda de obţinere a unui colorant alimentar utilizând o tulpină de Monascus purpureus, Buletin ştiinţific, 1998, vol.II, Tehnologii

[2] scus fermentation products. J Agric Food Chem

[3] 2000;102(7):E9012-E9013

Producţia de pigmenţi roşii a fost urmărită în urma cultivării tulpinilor mutante obţinute pcelei mai productive. Rapoartele de creştere a producţiei de pigmenţi roşii şi galbeni, exprimate ca Unităţi DO mutant / Unităţi D . -3

densităţii optice cu diluţia), sunt prezentate în figura 4.

ştere a DO la 510 nm în extractul alcoolic pentru tulpinile mutante faţă de tulpina parentală

O modalitate reelectroni, procedee în urma cărora au fost obţinute tulpini mutante valoroase ce pot fi utilizate pentru biosinteza la scara industriala a pigmenţilor roşii. Mutantele hiperproductive M1, M2, M3, M4 şi M5 selecţionate diferă de tulpina parentală prin pigmentaţie, viteza de creştere, morfologie macro şi microscopica şi prin potenţialul biosintetic al pigmenţilor roşii pe medii solide. BIBLIOGRAFIE [1] Ferdeş, M.

alimentare, 289 - 294 Liu, BH.; Wu, TS.; Su, MC. et al. Evaluation of citrinin occurrence and cytotoxicity in Mona2005;53(1):170-175 SoRelle R. Appeals Court says Food and Drug Administration can regulate Cholestin. Circulation

0

1

2

3

4

5tulpina paretala

DO mutant / DO

3.250M1M2M4M5

morpho physiological characterisation of monascus...

Documents