metodi post-genomici in biochimica cellulare. metodi post-genomici
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Metodi post-genomici in biochimica cellulare
Metodi post-genomici
Quantitative analysis of systems biology by taking advantage of available genomic information at the level of
1. SNPs analysis associated to disease or drug response2. mRNA (transcriptomics)3. Protein (proteomics)4. Post-translational modifications (aka “modificomics”)5. Surface exposure (surfomics)6. Protein-protein interactions (interactomics)7. Small metabolites (metabolomics) and their relations
(metabonnomics)
Many other fantasy exercises (glycomics, lipidomics, allergenomics, degradomics, excluding – perhaps – comics...)
G.B Smejkal, “I’m an –omics, you’re an -omics... ” Exp. Rev. Proteomics 3 (2006) 383-385
Metodi post-genomici
Metodi post-genomici
• Modelli cellulari e animali• Trascrittomica• Proteomica• Systems biology
Modelli cellulari e animali(farmacologici e/o genetici)
Modelli cellulari(farmacologici e/o genetici)
• Facilità di mantenimento e trattamento
• Possibilità di combinare trattamento farmacologico e manipolazione genetica
• Utili per riprodurre un singolo meccanismo
• Cellule umane (o murine)
Modelli animali(farmacologici)
• Intero organismo vs. cellule isolate
• Trattamento sistemico o lesione chimica locale
• Possibilità di valutare l’effetto anterogrado/retrogrado
Modelli animali (e vegetali?!?)(genetici)
• Organismi modello• Genoma noto• Non solo topo!• Vita breve• Invertebrati (e piante…)
Trascrittomica
Trascrittomica
Trascrittomica
Trascrittomica
Trascrittomica
• Distanza Euclidea
• Correlazione di Pearson
Proteomica
• Non c’è correlazione tra quantità di mRNA e quantità di proteina (Gygi et al., 1999)
• Il proteoma è un’istantanea del fenotipo a livello biochimico
• Il proteoma tiene conto del processing delle proteine
S.P.Gygi et al., Mol. Cell. Biol. 19, 1720 (1999)
Proteomica
• Metodi basati su 2-DE• Metodi “gel-free”
Proteomica (2-DE)
Principi della 2-D elettroforesi
• I dimensione Isoelettrofocusing in condizioni denaturanti: separazione in base al punto isoelettrico
• II dimensioneSDS elettroforesi: separazione in base al peso molecolare
Proteomica (2-DE)Vantaggi• Possibilità di caricare campioni non purificati• Risoluzione estremamente alta• I gel 2 –DE sono collettori di frazioni proteiche molto efficienti • Proteine sono protette all’interno della matrice del gel
Problematiche • Gradiente di pH • Limiti nel determinare proteine poco rappresentate • Capacità di caricare campione • Proteine idrofobiche • Proteine ad alto peso molecolare
Proteomica (2-DE)
• A global, unbiased approach• Hypothesis-generating rather than hypothesis-driven• A “find the difference” game between two
conditions
Control Treated
Proteomica (2-DE)
Proteomica (2-DE)
ProteineProteine
ColorazioneAcquisizioneAnalisi di immagine
Proteomica (2-DE)
Find the difference…
ControlloControllo Esordio PrecoceEsordio Precoce Esordio TardivoEsordio Tardivo
Proteomica (2-DE)
Find the difference…
Proteomica (2-DE)
Metodi statistici
Proteomica (2-DE)
• Peptide mass fingerprinting• LC-MS/MS• Western blot (non globale)
Identificazione delle proteine
Proteomica (2-DE)
Peptide Mass Fingerprinting
Proteomica (2-DE)
Peptide Mass Fingerprinting
Proteomica (2-DE)
Peptide Mass Fingerprinting (Limiti)
• La proteina non è presente nel database• La proteina è ricca di modificazioni co/post-
traduzionali• Lo spot nasconde più di una proteina
Proteomica (2-DE)
Peptide Mass Fingerprinting (Limiti)
• La proteina non è presente nel database• La proteina è ricca di modificazioni co/post-
traduzionali• Lo spot nasconde più di una proteina
Proteomica (2-DE)
LC-MS/MS
Proteomica (gel-free)
• Metodi quantitativi (ICAT, iTRAQ, …)• Protein arrays
Proteomica (gel-free)
• ICAT
Proteomica (gel-free)
• iTRAQ
Proteomica (gel-free)
• Protein arrays (e SELDI)
Systems Biology
• Necessità di analizzare un elevato numero di informazioni (Network analysis)
• Necessità di arricchire un ridotto numero di informazioni (Network enrichment)
Systems Biology
• Interazione fisica• Stesso pathway (KEGG)• Stessa Gene Ontology
(GO)
Systems Biology
Un esempio(realizzato a Busto…)
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Un modello cellulare per identificare Un modello cellulare per identificare nuovi meccanismi e nuovi bersagli nuovi meccanismi e nuovi bersagli
terapeuticiterapeutici
Il modello cellulareIl modello cellulare
• La linea cellulare umana SH-SY5Y incamera dopamina, ma la immagazzina con difficoltà nelle vescicole
• La linea viene trasfettata stabilmente per esprimere α-sinucleina or β-galattosidasi
Simile a quello che succede nella malattia di Parkinson
Simile a quello che succede nella malattia di Parkinson
α-sinucleina
(Gómez-Santos et al., 2003)
I livelli di α-sinucleina sono alterati nella malattia di Parkinson
I livelli di α-sinucleina sono alterati nella malattia di Parkinson
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Le condizioni sperimentaliLe condizioni sperimentali
-SinucleinaD
opam
ina
Effetto combinato
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Trova la differenza!Trova la differenza!
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Trova la differenza!Trova la differenza!
• sintesi proteica
• mitocondri
• stress ossidativo
• citoscheletro
• trascrizione
• mitocondri
• trasduzione del segnale 42
Cosa hanno in comune?Cosa hanno in comune?
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Generare nuove ipotesiGenerare nuove ipotesi
NF-κB
Apoptosi
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Ritorno al modelloRitorno al modello
VDAC2 4h
ctr
ctr inib
DA inib
DA
Inibitore GSK3β
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Alberio, Fasano, Rizzuto e altri,in preparazione
VDAC2Ctr DA VDAC1 VDAC2 VDAC3
Ctr DA Ctr DA Ctr DA
Partendo dal modello cellulare, Partendo dal modello cellulare, verso nuovi bersagli terapeuticiverso nuovi bersagli terapeutici
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