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Metodi post-genomici in biochimica cellulare

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Metodi post-genomici in biochimica cellulare

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Metodi post-genomici

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Quantitative analysis of systems biology by taking advantage of available genomic information at the level of

1. SNPs analysis associated to disease or drug response2. mRNA (transcriptomics)3. Protein (proteomics)4. Post-translational modifications (aka “modificomics”)5. Surface exposure (surfomics)6. Protein-protein interactions (interactomics)7. Small metabolites (metabolomics) and their relations

(metabonnomics)

Many other fantasy exercises (glycomics, lipidomics, allergenomics, degradomics, excluding – perhaps – comics...)

G.B Smejkal, “I’m an –omics, you’re an -omics... ” Exp. Rev. Proteomics 3 (2006) 383-385

Metodi post-genomici

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Metodi post-genomici

• Modelli cellulari e animali• Trascrittomica• Proteomica• Systems biology

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Modelli cellulari e animali(farmacologici e/o genetici)

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Modelli cellulari(farmacologici e/o genetici)

• Facilità di mantenimento e trattamento

• Possibilità di combinare trattamento farmacologico e manipolazione genetica

• Utili per riprodurre un singolo meccanismo

• Cellule umane (o murine)

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Modelli animali(farmacologici)

• Intero organismo vs. cellule isolate

• Trattamento sistemico o lesione chimica locale

• Possibilità di valutare l’effetto anterogrado/retrogrado

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Modelli animali (e vegetali?!?)(genetici)

• Organismi modello• Genoma noto• Non solo topo!• Vita breve• Invertebrati (e piante…)

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Trascrittomica

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Trascrittomica

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Trascrittomica

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Trascrittomica

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Trascrittomica

• Distanza Euclidea

• Correlazione di Pearson

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Proteomica

• Non c’è correlazione tra quantità di mRNA e quantità di proteina (Gygi et al., 1999)

• Il proteoma è un’istantanea del fenotipo a livello biochimico

• Il proteoma tiene conto del processing delle proteine

S.P.Gygi et al., Mol. Cell. Biol. 19, 1720 (1999)

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Proteomica

• Metodi basati su 2-DE• Metodi “gel-free”

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Proteomica (2-DE)

Principi della 2-D elettroforesi

• I dimensione Isoelettrofocusing in condizioni denaturanti: separazione in base al punto isoelettrico

• II dimensioneSDS elettroforesi: separazione in base al peso molecolare

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Proteomica (2-DE)Vantaggi• Possibilità di caricare campioni non purificati• Risoluzione estremamente alta• I gel 2 –DE sono collettori di frazioni proteiche molto efficienti • Proteine sono protette all’interno della matrice del gel

Problematiche • Gradiente di pH • Limiti nel determinare proteine poco rappresentate • Capacità di caricare campione • Proteine idrofobiche • Proteine ad alto peso molecolare

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Proteomica (2-DE)

• A global, unbiased approach• Hypothesis-generating rather than hypothesis-driven• A “find the difference” game between two

conditions

Control Treated

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Proteomica (2-DE)

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Proteomica (2-DE)

ProteineProteine

ColorazioneAcquisizioneAnalisi di immagine

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Proteomica (2-DE)

Find the difference…

ControlloControllo Esordio PrecoceEsordio Precoce Esordio TardivoEsordio Tardivo

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Proteomica (2-DE)

Find the difference…

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Proteomica (2-DE)

Metodi statistici

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Proteomica (2-DE)

• Peptide mass fingerprinting• LC-MS/MS• Western blot (non globale)

Identificazione delle proteine

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Proteomica (2-DE)

Peptide Mass Fingerprinting

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Proteomica (2-DE)

Peptide Mass Fingerprinting

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Proteomica (2-DE)

Peptide Mass Fingerprinting (Limiti)

• La proteina non è presente nel database• La proteina è ricca di modificazioni co/post-

traduzionali• Lo spot nasconde più di una proteina

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Proteomica (2-DE)

Peptide Mass Fingerprinting (Limiti)

• La proteina non è presente nel database• La proteina è ricca di modificazioni co/post-

traduzionali• Lo spot nasconde più di una proteina

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Proteomica (2-DE)

LC-MS/MS

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Proteomica (gel-free)

• Metodi quantitativi (ICAT, iTRAQ, …)• Protein arrays

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Proteomica (gel-free)

• ICAT

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Proteomica (gel-free)

• iTRAQ

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Proteomica (gel-free)

• Protein arrays (e SELDI)

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Systems Biology

• Necessità di analizzare un elevato numero di informazioni (Network analysis)

• Necessità di arricchire un ridotto numero di informazioni (Network enrichment)

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Systems Biology

• Interazione fisica• Stesso pathway (KEGG)• Stessa Gene Ontology

(GO)

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Systems Biology

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Un esempio(realizzato a Busto…)

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Un modello cellulare per identificare Un modello cellulare per identificare nuovi meccanismi e nuovi bersagli nuovi meccanismi e nuovi bersagli

terapeuticiterapeutici

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Il modello cellulareIl modello cellulare

• La linea cellulare umana SH-SY5Y incamera dopamina, ma la immagazzina con difficoltà nelle vescicole

• La linea viene trasfettata stabilmente per esprimere α-sinucleina or β-galattosidasi

Simile a quello che succede nella malattia di Parkinson

Simile a quello che succede nella malattia di Parkinson

α-sinucleina

(Gómez-Santos et al., 2003)

I livelli di α-sinucleina sono alterati nella malattia di Parkinson

I livelli di α-sinucleina sono alterati nella malattia di Parkinson

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Le condizioni sperimentaliLe condizioni sperimentali

-SinucleinaD

opam

ina

Effetto combinato

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Trova la differenza!Trova la differenza!

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Page 42: Metodi post-genomici in biochimica cellulare. Metodi post-genomici

Trova la differenza!Trova la differenza!

• sintesi proteica

• mitocondri

• stress ossidativo

• citoscheletro

• trascrizione

• mitocondri

• trasduzione del segnale 42

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Cosa hanno in comune?Cosa hanno in comune?

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Page 44: Metodi post-genomici in biochimica cellulare. Metodi post-genomici

Generare nuove ipotesiGenerare nuove ipotesi

NF-κB

Apoptosi

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Ritorno al modelloRitorno al modello

VDAC2 4h

ctr

ctr inib

DA inib

DA

Inibitore GSK3β

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Alberio, Fasano, Rizzuto e altri,in preparazione

VDAC2Ctr DA VDAC1 VDAC2 VDAC3

Ctr DA Ctr DA Ctr DA

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Partendo dal modello cellulare, Partendo dal modello cellulare, verso nuovi bersagli terapeuticiverso nuovi bersagli terapeutici

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