TOP  SI 117 

Section 1

Introduction to Medical Genetics - วชานวาดวย DNA & การเปลยนแปลงของ DNA ททาใหเกดโรค (โรคทางกรรมพนธ) - genetic material อยในเซลล 2 ทไดแกใน nucleus (nuclear genome) & mitochondria (mitochondrial

genome) - บรเวณทสารพนธกรรมมหนาทจาเพาะ 1 หนวยเรยกวา 1 gene - โรคพนธกรรมในปจจบนนม > 3,000 โรค (จะเลอกโรคทสาคญเทานนทแพทยตองร) - คนไขมรจมกรเดยว หรอคนไขมตาอยใกลกนมาก หวเลกมาก มปากแหวง & เพดานโหวตรงกลาง (midline

defect) บงบอกวาหนาไมแยกออกจากกน แสดงวาสมองไมแยกออกจากกน = “holoprosencephaly” (prosencephalon ไมแยกออกจากกน)

- anencephaly = ไมมสมอง - Genetic diseases: chromosomal disorders, mendelian disorders, mitochondrial disorders,

multifactorial diseases

Human Genome: Structure and Function - discovery ของ DNA มมาตงแต ค.ศ.1869 แลว (ทพบวามสวนประกอบใน nucleus เปน DNA) โดย

Friedrich Miescher: Nuclein in cell nucleus is composed of DNA - ค.ศ.1900 รวา RNA & DNA ประกอบดวย nucleotides, แตละ nucleotide กจะประกอบดวย sugar, a

phosphate group, & a base - Griffith (ค.ศ.1928) เปนคนแรกทแสดงใหเหนวาตองม transformation factor (ตองไมใช protein) ท

สามารถเปลยนแปลง bacteria ทเปน avirulent strain virulent strain: ทดสอบโดยเอา living avirulent strain + heat-killed virulent strain mouse dies แสดงวาตองม transformation factor ไปเปลยน bacteria ในเวลาตอมาจงรวาสารนนคอ DNA (โดย Avery, McLeod, & McCarty)

- Hershey & Chase ทาการทดลองโดยใช Sulfur กบ Phosphorus มา label bacteriophage แลวตดเชอลงไปใน bacteria แลวพสจนใหเหนวาสงทเรยกวา DNA นาจะม phosphorus เปนสวนประกอบ (คอเปน DNA แนนอน ถาเปน protein กตองม sulfur)

- Chargaff (ค.ศ.1947) พบวาในโมเลกลของ DNA อตราสวนระหวาง A = T & C = G แตอตราสวน A+T/G+C จะคงทในสงมชวตแตละชนด แตไมเทากน (คา A+T/G+C: E. coli = 1.00; Human = 1.52)

- Rosalind Franklin ถายภาพ X-ray diffraction ของโมเลกล DNA ทตกผลกเปน crystal และทาให Wilkins, Watson & Crick (ค.ศ.1962) สามารถจนตนาการรปรางของ DNA ได (double helical structure ม 2 ปลาย: 5’ & 3’)

- 1 โมเลกลของ DNA จะประกอบไปดวยสาย DNA 2 สายพนกนในลกษณะ anti-parallel fashion - DNA ม sugar & phosphate เปน backbone มสงทยนออกไปคอ base (ทาให 2 สายเชอมกนได ม

complementariness) - คนปกตจะม nuclear genome 2 sets (2 copies) = DNA 46 molecules (พอ & แมใหมาคนละ 23) - mitochondrial genome ม > 1 copy (5-20 วง/1 mt) - จานวน mitochondrial genome ในเซลล = จานวน mitochondria ตอเซลล × จานวน genome ตอ 1

mitochondrion - ถามองตอ base: mitochondrial genome จะม mutation rate สงกวา nuclear genome มาก เพราะทกๆ

ครงทเซลลแบงตว มถง 2,000-10,000 mitochondria ทจะแบงตว - ถามองทง genome: nuclear genome จะมจานวน mutation ตอ 1 การแบงตวมากกวา - human genome ม 3,000 Mb, 25,000 genes - สงทเปนปจจยหลกททาใหสงมชวตตางกน ไมใช DNA หรอ genome แตคอ “protein” - เซลลถงไมม nucleus กม genome ได (ม mitochondrial genome ถงแมไมม nuclear genome) - nuclear genome จะแยกไปอยบน 23 pairs of chromosomes

 TOP  SI 117 

- แตละ autosomal pair จะประกอบดวย homologous chromosome (homolog) - การเขยน chromosome เหมอนปาทองโก (1 chromosome ม 2 DNA molecules) เปนภาวะทเซลลกาลงจะ

แบงตว ไมใชภาวะปกต - ถาจะเขยน nuclear genome ในระยะทเซลลพก (interphase) จะตองลากเสนทงสน 46 เสน แตละเสนเปนเสน

เดยว - segregation of homologous chromosome จะแยกไปบนคนละ gamete กน (Mendel’s law) - gene ไมจาเปนตองม promoter แตสวนใหญเกอบทงหมดจะม - antisense strand = template strand; sense strand = coding strand - primary mRNA transcript จะม 5’cap, 5’UTR, exon, intron, 3’UTR, poly-A tail เมอตด intron ออก

แลวเชอม exon เขาดวยกนจะได mature mRNA - ใน gene เดยวกนสามารถไดผลผลต > 1 ชนดโดยกระบวนการ alternative splicing - ถาสกด mRNA ออกมาจากเซลลแลวสงเคราะห cDNA จะได DNA ตางจากเดม !! (สนลง) - ชายจะม meiosis (สราง gamete) ตลอดชวต และเกดแลวเสรจเลย แตหญงจะม meiosis เพยงชวชวตหนง เรม

เมออยในครรภมารดา และหลงคลอดแลวจะไมม meiosis ใหมเกดเลย (แต meiosis เดมกยงไม complete) - mitosis เราจะ replicate DNA (2n 4n) แต chromosome จะยงเปน 2n เทาเดม (แคเปลยนจากเสนเดยวเปน

ปาทองโก) เมอเกด centromere splitting กจะเหลอ DNA = 2n และ chromosome = 2n (จะเหนวา chromosome คงทตลอด)

- meiosis เราจะ replicate DNA (2n 4n) แต chromosome จะยงเปน 2n เทาเดม, ม homologous pairing, ม recombination ท chiasmata, เมอม 1st division (reduction division) จะเหลอ DNA = 2n และ chromosome กจะลดลงเปน n และเมอม 2nd division (centromere splitting) จะม DNA & chromosome เหลอ n

** จะเหนวาการเกด centromere splitting จะไมทาใหจานวนชด chromosome เปลยนแปลง แต DNA จะลดลง ½ สวนการเกด reduction division จะทาให chromosome & DNA ลดลง ½ ทงค

- crossing over จะเกดระหวาง non-sister chromatid ของ homologous chromosome** - ความผดปกตในการแบงแบบ meiosis เปนสาเหตทพบบอยทสดททาให newborn ม chromosome ผดปกต สวน

ความผดปกตของ DNA เกดมากอนแลว (ตงแต replication ในชวง interphase)

Human Genome Organization - ใน human genome 3,000 Mbp (total haploid genome) เปน gene แค 10% เทานน อก 90% อยนอก

gene, ใน 10% ซงเปน gene ม exon เพยง 10% เทานน ∴ ม exon เพยง 1% ใน human genome (≈ 30 Mbp)

- 90% ของ gene เปน non-coding ซงจะแบงเปน 1) intron, 2) pseudogene, & 3) UTR - extragenic (90%) จะม 80% เปน unique low copy อก 20% เปน repetitive (tandem repeat &

interspersed sequence) - tandem repeat คดเปน 60-70% ของ repetitive element (20% ของ extragenic) ทเหลอจะเปน

interspersed sequence (ทรจกดอยใน family Alu sequence (เปน SINEs) ซงเชอวามาจากบรรพบรษท

ตดเชอ retrovirus ฝากมาใหเรา) - หลกฐานทแสดงใหเหนวา mitochondria เปน bacteria ท infect human ancestors 1. ม sequence ท share กนใน rDNA ใน mitochondria กบ rDNA ใน bacteria 2. antibiotics บางชนดจะฆา mitochondria ของเราดวย คนไขบางคนทได antibiotics ex.

aminoglucoside จะหหนวก เพราะเซลลประสาทหจะม mitochondria จานวนมาก 3. mitochondria แบงตวแบบ binary fission ** Alu sequence เชอวาเปน viral sequence mitochondrial genome เชอวาเปน bacterial sequence - ยอม chromosome ดวย Giemsa สวนทตดสจาง (light band) (สาคญ) = euchromatic region เปนบรเวณ

ทม gene อยมาก & ม GC rich; สวนทตดสเขม (dark band) = heterochromatic region เปนบรเวณทม

repeat sequence คอท centromere & telomere, ม polymorphism, ม AT rich

 TOP  SI 117 

- gene หลาย gene ทมโครงสราง & หนาทคลายกน ซงเกดจาก duplication ของ ancestral gene และตอมาม evolutionary divergence เกด multigene family ซงอาจมาเรยงตอกน & จบกนเปนกลม = gene cluster (ex. α-globin gene cluster, β-globin gene cluster)

- ใน gene cluster อาจม pseudogene = gene ทม sequence คลาย functional gene แตไม function เพราะมาจากการเกด mutation ท coding หรอ regulatory sequence หรอทาใหม incomplete gene fragment

- pseudogene อาจเกดจาก insertion ของ DNA sequence ของ cDNA ซงไมมสวน promoter กได - กลม gene ขนาดใหญทม sequence ไมคอยคลายกน แตมความสมพนธกนในเชงหนาท & ม structural

domain คลายกน = gene superfamily (ex. Ig gene, gene ทสราง TCR) เกดจาก duplication ของ ancestral gene และตอมาม evolutionary divergence

** gene cluster เปน gene ใน multigene family ซงมาจาก gene ของบรรพบรษเดยวกนมาจบกลมอยใกลๆ กน

เปนชดๆ บน chromosome ซงอาจม pseudogene อยดวย, protein product จากแตละ functional gene ม function สมพนธกนใน superfamily

- centromeric region: ประกอบดวย α- & β-satellite DNA จบกบ centromere protein ในระหวาง cell division, มความสาคญกบ proper segregation, ม chromosome specific sequence, recombination poor, ตดส dark band

- telomeric region: ม TTAGGG repeats, สาคญใน homologous chromosome pairing (ตาแหนง NOR ตรงกน), สนลงเมอเกด cell division, ไมม chromosome specific sequence (แต subtelomeric region ม), gene poor (most chromosome), ตดส dark band

Mutations and Polymorphisms - mutation เปนการเปลยนแปลงของ DNA sequence (gene/ไมใช gene กได) - Generation of mutations 1. Error in replication of DNA** (พบบอยทสด) 2. Gene conversion (gene ทม sequence ใกลเคยงกนถาอยใกลกน gene หนงอาจ induce ใหอก gene

หนงเปลยนแปลงไปเปนรหสเหมอนตวมนเอง) ** พบการเปลยนแปลงแบบนในมนษยไดมากกวาในสงมชวตอนๆ เนองจาก gene ในมนษยมความซบซอน & ม

ลกษณะเปน superfamily จงมทง real gene, pseudogene (ไมไดทาหนาท) ** บางครงจะพบวา gene ปกตไปอยใกลๆ กบ pseudogene ซงมรหสใกลเคยงกบมนมากๆ รหสของ gene

นนจะเปลยนแปลงไปเปน pseudogene หยดทาหนาท !! 3. Unequal crossing over/recombination (เกดขนใน meiosis)

** โดยทวไป ระยะ M1 จะเกด crossing over ขนโดยจะถกกาหนดดวยรหสของ DNA ทมรหสเหมอนกน จง

ทาใหมการจบคกน แตในบางครงถารหสนนเหมอนกนหลายตาแหนง กอาจเกดการจบคผด ทาให crossover ไม symmetry จะได chromosome หนงสน อก chromosome หนงยาว gene หนงได DNA content ไปเยอะ อก gene หนงไดไปนอย เปนตน

4. Methylation of cytosine residue ** เปนสาเหตของ point mutation ทพบบอย โดยมการเตม –CH3 ท base C เกด deamination เปลยน C T

5. Slippage of replication of repeat array ** ขณะท replication machinery ขณะทขยบตวไปบนสาย DNA มนหลดออกไปจากสาย DNA แลวพอมาจบสาย DNA ใหม มนจบผดท โดยเฉพาะตาแหนงทม repeat จานวนมาก เนองจากรหสเหมอนกนหมด (จาไมไดวาเดมอยตรงไหน) จงอาจไปจบเหนอกวาเดม/ปลายกวาเดม ได repeat ทมจานวนมากขน/ลดลง

6. Alkylation by carcinogen ** alkylating agent = สารกอมะเรง ทาใหมการเปลยนแปลง base ในสาย DNA ได 7. Thymine dimerization by UV - Classification of mutations 1. By site: intron, exon, splice junction, promoter 2. By origin: germline (เกดท gamete ถายทอดใหลกหลาน), somatic (ไมถายทอดใหลกหลาน)

 TOP  SI 117 

3. By type: missense, nonsense, frameshift, stop codon, expansion, deletion, insertion 4. By functional consequence: loss of function, gain of function, neomorphic - บคคลทไดรบ germline mutation จะม mutation อยในทกๆ เซลลของรางกายของเขา และกจะถายทอดตอไปได

อกในทกๆ รนไป - insertion หรอ deletion จะทาใหเกด frameshift mutation กตอเมอสงท insert หรอ delete ไป หารดวย

3 ไมลงตวเทานน** (∴ ถาไมบอกวาหารดวย 3 ไมลงตว ผด !!) - point mutation = a change in a single base pair: missense, nonsense, frameshift (deletion),

frameshift (insertion) - เนองจากม genetic redundancy (หลายๆ codon อาจมความหมายถง aâ เดยวกน) ∴ บางครงการ

เปลยนแปลง base กอาจไมเกดการเปลยนชนด aâ = synonymous mutation (silence mutation) ** non-synonymous mutation = substitution - ผลของ frameshift mutation มกจะทาใหเกด premature stop protein นนสนลง - splice-site mutation: ทาใหไมเกดการตด mature mRNA ม sequence ของ intron หลดเขามาดวย =

intronic including mutation protein ยาวขน แตถาตาแหนงทจะตองมการเชอมมนไมเชอม (เชอมผด) กจะทาใหบาง exon หายไปจาก mature mRNA = exon skipping mutation

- โดยทวไป mutation ทเกดท base แรกของ exon มกจะทาใหการเชอมทาไมได ทาใหเกด exon skipping แต mutation ทเกดท base ตวสดทายของ exon มกทาใหการตดทาไมได ทาใหเกด intronic inclusion

- ถา mutation เกดท promoter protein product ม aâ ปกต !! (เพราะ promoter ไมเกยวกบสวนทเปน

code ของ protein แตจะสงผลให RNA pol มาจบไมได ทาใหเกด transcription ได แตมระดบตามาก mRNA นอยกวาปกต แตไมเปลยน code)

- mutation บางครงไมใช point mutation แตอาจ มการขาดหายไปทง gene = deletion เตมสวนของสาย DNA เขามาทไมไดเปนของ gene นน = insertion (ม DNA sequence อน insert เขาไป) เพมสวนของสาย DNA ทเปนของ gene นนอยแลว (มของปกตซาเขาไปอก copy หนง) = duplication

- mutation ของ mismatch repair gene (gene ทควบคม DNA repair แบบ mismatch repair) เปนสาเหตใหเกด heredity nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC)

- polymorphism = DNA sequence changes that do not alter protein function (เปนการเปลยนแปลงของ base ทาใหม code ตางไปจากปกต แตไมไดเปลยน function ของ protein ทาหนาทไดปกต)

- polymorphism = ปรากฏการณท allele ของ gene ใดๆ มไดหลายรปแบบ - ตาแหนงใดๆ ม polymorphism ตอเมอตาแหนงนนมความหลากหลาย > 1 ชนด แลวชนดทพบนอยกวาตองพบ

อยางนอย 1% ของประชากร** ** ex. ถา gene X ของคนในหองนม 3 แบบ คอเปน a, c, t ถาหองนม 255 คน เปน Xa 253 คน, Xc 1 คน

และ Xt 1 คน เรายงไมเรยกวาตาแหนงนม polymorphism - polymorphism ถานบจานวน allele ตองได ≥ 1% ถานบบคคลทเปน carrier ตองได ≥ 2% - Level of importance

disease causing (ทาใหเกดโรค) = mutation disease predisposing (ไมทาใหเกดโรค แตอาจกอความเสยงทจะทาใหเกดโรค) = polymorphism non-disease causing (ไมทาใหเกดโรค) = polymorphism

** สมยกอนถอวา polymorphism จะตองไมทาใหเกดโรค แตปจจบน polymorphism บางชนดกทาใหเราเสยงตอการเกดโรค แตไมไดทาใหเกดโรคดวยตวของมนเองเทานน อาจตองมปจจยอนๆ

** disease causing mutation รนแรงกวา disease predisposing polymorphism - Classification of polymorphisms 1. Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs): ตาแหนงทตางกนในสาย DNA เปนตาแหนงท

restriction enz. มาตดพอด ทาใหเกดการตด/ไมตด เอาไป run ใน gel electrophoresis ไดผลตางกน

2. Variable number of tandem repeats (VNTRs) and Satellites: เปน sequence ทเรยงกนเปนชดๆ

ซงมจานวนไมเทากนในแตละคน ซงถา repeat ม 50-200 bp เรยกวา VNTR 3. Minisatellite/Microsatellite: แตละ repeat ม 6-20 bp เรยกวา minisatellite; ถาแตละ repeat ม

2-4 bp เรยกวา microsatellite (microsatellite = STRs (short tandem repeats))

 TOP  SI 117 

4. Single nucleotide polymorphisms (SNPs): เปน polymorphism ทเลกทสด พบบอยทสด พบทกๆ

1,000 bp ตอสาย DNA; มลกษณะธรรมชาตคอมกจะ biallelic = แตละตาแหนงทตางกน จะตางกนแค 2 แบบเทานน (จะไมตางกน 4 แบบ; นอยตาแหนงจะเปน 3 แบบ); สวนมากอยใน non-gene sequence และถาอยใน gene กมกเปน intronic SNPs (อยใน intron) ไมคอยมผลตอ code ของ protein

** human ม 3×109 bp ม 3×106 SNPs ∴ มคนทแตกตางกนได = 43,000,000 แบบ ** ถอวา RFLPs เปน subset ของ SNPs 5. Insertion/Deletion (I/D) polymorphism: หายไป/เพมเขามาหลายๆ base - Effect of polymorphism 1. Exonic (coding) polymorphism 1) synonymous (silence): no change 2) null: ม effect คลายๆ mutation คอหยดทางานไปเลย = null allele 3) hypomorphic: ทาใหการสราง mRNA นอยลง = hypomorphic allele (ทาหนาทไมไดเตมท) 4) hypermorphic & gain of function: ทาใหเกด function เพมขน = hypermorphic allele (ex.

receptor ทสงเคราะหขนจบกบ target ไดดขน) 5) conformational change: ทาใหรปรางของ polypeptide เปลยนแปลงไป

6) stability change/fate change: ทาใหความเสถยรของ mRNA/protein เปลยนแปลงไป

2. Intronic (non-coding) polymorphism 1) no chage 2) splicing variant – elongated/shortened peptide: ใกลกบ splice site (intron-exon

boundary) ทาใหม intron inclusion/exon skipping 3) conformational change: เปลยน conformation ของ DNA (ไมใชของ protein)

transcription level ผดปกตไปได - การม exonic & intronic polymorphisms เปนลกษณะทางธรรมชาต ทาใหเกดความหลากหลายในเผาพนธ

มนษย (biodiversity) - Clinically useful polymorphism: ตวอยาง • MTHFR gene C667T variant

- gene ทสงเคราะห enz. MTHFR (methylene tetrahydrofolate reductase) ม polymorphism ทตาแหนง 667 โดยบางคนในประชากรม allele C (cysteine) บางคนม allele T (threonine)

- เมอทกคนม 2 genes จงอาจจะเปน CC, CT, หรอ TT กได - พบวาคนทม TT homozygotes จะเปน hyperhomocysteinemia (มระดบ homocysteine ในเลอด

สงมาก) เกด toxicity ตอ blood vessel ทง artery & vein ทาใหมลมเลอดอดตนในหลอดเลอดไดงาย (เปน risk factor for arterial & venous thrombosis)

- คนทม TT homozygotes เมอไดรบ vit. B6 ซงเปน coenz. ของ enz. MTHFR กจะเรงใหมการทางาน

ของ enz. นกจะลดระดบ homocysteine ในผปวย ลดความเสยงตอการเกดลมเลอดอดตน • HFE hemochromatosis: C282Y & H63D polymorphism

- HFE gene ทาหนาทเกยวกบ Fe2+ absorption ใน small intestine - ถาม polymorphism ทตาแหนง 282 เปลยนจาก C (cysteine) Y (tyrosine) หรอทตาแหนง 63

เปนจาก H (histidine) D (aspatate) จะสงผลให Fe2+ absorption สงมาก ม Fe2+ ในรางกายเกน

- พบบอยมากในคนผวขาว (caucasians) - คนผวขาวทเปน homozygote C282Y กจะเปนโรคทเรยกวา hereditary hemochromatosis (HHC)

(มกรรมพนธททาใหมการสะสมเหลกเกน) พออยในครงชวต กจะเรมผวดาขนเรอยๆ, heart failure, เปน DM, เปนหมน ** homozygote C282Y & compound heterozygote C282Y/H63D HHC homozygote H63D normal

- คนทม polymorphism น (C282Y) เราจะแนะนาให 1) ทาน Fe2+ นอยๆ (หลกเลยงอาหารทม Fe2+ สง) 2) บรจาคเลอดทกๆ 3 เดอน** ปองกนการเกดโรค Fe2+ เกน ** โรคน เมอเปนแลว การรกษามอยางเดยว คอใหยาขบ Fe2+ ออกจากรางกาย ซงรกษาไดผลไมด

 TOP  SI 117 

• APOE polymorphism - ApoE เปน ligand ของ cholesterol ท neuronal cell ซงมสวนทาใหเกดความเสยงตอการเปนโรค

Alzheimer’s disease - differ at residue 112 (site A) & residue 158 (site B) - พบวาถา polymorphism เปนชนด E4 (arginine/arginine) มความเสยงตอการเปน Alzheimer’s

disease มากกวาคนทเปนชนด E2 (cysteine/cystenine) & E3 (cysteine/arginine) - E3 allele เปน wide type allele & most common - พบวาถาเปน E2/E2 จะเสยงตอการเปน familial abetalipoproteinemia (ไขมนในเลอดสง) มากกวา

คนทเปน E3 หรอ E4 allele ** แมจะทาใหเกดโรค แตกไมไดทาใหเกดดวยตวของมนเอง (จงไมใช mutation) และจะมอยในประชากรทวไป บางคนกเปน E2/E4 บางคนกเปน E3/E4 บางคนกเปน E4/E4 (เสยงทจะสมองเสอมกวาคนอนเมออายมาก) ฯลฯ

- เราเอา polymorphism ไปหาความเสยง/ความโนมเอยงตอการเกดโรคตางๆ ในประชากร (หาบคคลประเภทท 2) - polymorphism ยงอยใน molecule ตางๆ ททาหนาท metabolize ยา (absorb, กาจดยา) ∴ ถาเราม

polymorphism บางชนด กอาจเลอกใชยาใหเหมาะสม (ex. เพม/ลดขนาดยา) = pharmacogenetics นาไปสการรกษาโดยอาศยขอมลเกยวกบ gene = gene-based therapy (เลอก best individual treatment ขนกบ genotype ของผปวยแตละคน)

- ปจจบน polymorphism เปนประโยชนมากในการคนหา gene กอโรค = disease gene mapping โดยเฉพาะใน

complex disease (โรคทเกดจากปจจยของ gene จานวนมาก (polygene) และมปจจยของ environment ดวย)

DNA Technology - DNA Technology = tools or techniques of manipulating DNA for use in 1) research, 2) clinical

practice (เวชปฏบต) or 3) industry - Use of DNA Technology 1. Confirming diagnosis: เพอยนยนการวนจฉยโรค (วาเปนโรคทางพนธกรรม) 2. Excluding the possible diagnoses: เพอแยกการวนจฉยนนออกมา/ตดการวนจฉยนนทง (ถาตรวจไมเจอ) ** เพราะอาการแสดงทคลายคลงกน มความเปนไปไดหลายโรค

3. Predicting clinical outcome: ทานายผลทาง clinic วาตอไปจะเกดอะไรขน 4. Presymptomatic diagnosis: เพอใหการวนจฉย/ปองกนกอนทเขาจะเปนโรค

5. Heterozygote (carrier) detection: ตรวจหาผทเปนพาหะ (ไมเปนโรค แตเสยงตอการมลกเปนโรค) 6. Gene therapy: รกษาโดยปรบเปลยนพนธกรรม (ปลกถาย/สอดใส gene เขาไปใน gene ปกต) 7. Study of normal/abnormal gene function: วจย/ศกษาการทาหนาทของ gene ทปกต/ผดปกต - Molecular genetic diagnostic testing 1. DNA-based testing: detect การเปลยนแปลง genomic DNA sequence 2. RNA-based testing: detect abnormal transcription/translation โดยดท mRNA หรอ cDNA

(โดย reverse transcription) 3. Protein-based testing: detect abnormal products - DNA-based testing: basic techniques, direct & indirect mutation detection - Basic techniques 1. DNA extraction: แยกสกด DNA ออกมาจากสงสกปรก (อะไรกไดทม nucleus อย) 2. DNA amplification: เพมจานวน DNA ออกมา (เพราะ DNA ทไดมามนอยมาก ระดบ ng) 3. DNA fragment isolation - electrophoresis: แยกชนสวน DNA ทเพมจานวนออกมา เพอเอามาตรวจ - Detection ม 2 แบบ 1. Direct mutation detection: ตรวจหา mutation บน DNA sequence โดยตรง 2. Indirect mutation detection (Linkage study): หา markers ทเรารซงไปคกนกบ causative gene

(เราไมจาเปนตองรจก gene นน แตถาเรารจก markers ทไปคกบ gene กจะรวาสงทไปดวยกนกคอ gene ทเราสนใจ)

- DNA preparation: source of DNA blood, tissue, cells

 TOP  SI 117 

1. Break cells: ทาให cell แตกกอน เพราะจะเอา DNA จาก nucleus 2. Proteinase K digestion: ยอยสวนทไมเกยว (protein ตางๆ ซงอยททก compartment ของ cell) ออกไป 3. DNA extraction by either phenol-chloroform or silica gel column: สกดเอา DNA ออกมา 4. Precipitation with alcohol 5. Dissolution with buffer or water - DNA amplification: เอา DNA ทสกดไดมาเพมจานวน

1. Molecular cloning (Recombinant DNA): เพมจานวน DNA โดยใส DNA sequence เขาไปในสาย

DNA (genome) ของ microorganism (โดยทวไปใช yeast หรอ bacteria) เมอมการเพมจานวนของ organism นน เพมจานวน genome มจานวน DNA fragment ทเราใสเขาไปเพมขน

** ทใชวธนบอยทสดคอการผลต vaccine (ex. HBV) & insulin 2. Polymerase chain reaction (PCR): direct amplification of specific DNA โดยใช specific

oligonucleotides (เปน template) และใส nucleotides & enz. polymerase เขาไป ** 1) denaturation (95°C), 2) hybridization (55-65°C), & 3) primer extension (72°C) ** การท PCR จะเรมขนได จะตองอาศย DNA sequence ทเขาคกนกบบรเวณทเราตองการใหเรม =

“primer” กอน เปนการกาหนดขอบเขตวาควรจะเรมทใด จากนนกจะม enz. Taq DNA pol มา extend - เมอ PCR สนสด จะไดผลผลต DNA เพมเปน exponential amplification ซงคดเปน = 2n (n = จานวน cycles) - DNA electrophoresis: เอาชนสวน DNA ทตองการซงผสมปนเปอยใน sol.n ออก (โดย size & charge) - DNA เปนกรด (nucleic â) เมออยใน buffer ในรางกายจะเปน anion run บน gel จะวงไปทประจบวก ตวท

วงเรวกจะเปน fragment ของ DNA ทสนๆ แยกออกมา - Direct mutation detection: ตรวจหา mutation บน DNA sequence โดยตรง

Advantage Disadvantage 1. Informative in every study (ตรวจแลวบอกไดเลยวาม/ไม mutation)

1. Causative gene must be known (ตองรกอนวาจะตรวจ gene อะไร)

2. Can test both of familial & sporadic cases (ตรวจไดทงคนคนนนคนเดยวหรอหลายคนในครอบครวกได)

2. Mutation must be known in many tests (ตองรกอนวาโรคนนๆ ทรวาจะตรวจม mutation อะไรบาง)

3. No need of multiple family members (ไมจาเปนตองใชสมาชกในครอบครวหลายๆ คนมา

ตรวจ)

4. No need of proband (ไมจาเปนตองหาคนทเปนโรคมาตรวจ)

- direct mutation detection ม 2 แบบ ไดแก mutation specific detection & mutation screening

Mutation specific detection Mutation screening 1. Mutations should/must be known (ตองร mutation วาเปนแบบใดกอน)

1. Unknown mutation mechanism (ไมตองร mutation, เปนแบบไหนกตรวจได)

2. Easier to use, simple techniques (การตรวจงาย)

2. More complex techniques, expensive tools (การตรวจยาก)

3. Easy to interpret the results (การแปรผลงาย ม/ไมม)

3. Need expertise to interpret the results (แปรผลยาก specific วาเปน missense/ nonsense/frameshift/...)

4. Useful for detecting common mutations (ใชกบโรคทม mutation ซงพบบอยๆ ex. โรคน เกดจาก mutation แบบนทงหมด หรอ 90% ใชวธนได)

4. Detect wide range of mutations (มขอด คอ ตรวจไดเยอะ)

5. Limited to certain set of mutations (ใชกบโรคทเกด mutation ไดหลากหลายไมได)

 TOP  SI 117 

1. Mutation specific detection: หา mutation ซงจาเพาะมาก มการใช 2 หลกการ 1.1 Hybridization-based testing: อาศยหลกการวา ถาใส sequence (probe) เขาไป ตองจบกบสวนท

เรา test ได แตถาจบไมได ม mutation แตยงไมรวาเปนแบบใด; ม 3 techniques 1.1.1 Southern blot hybridization: อาศยการแยก DNA ออกมาแลวตดดวย restriction enz.

เปนชนเลกๆ แลวเอาไป run electrophoresis ขนาดตางกนจะวงเรว-ชาตางกน จากนนเอา

probe เขาไปจบซงจะจบไดกบ fragment ของ DNA ทเขาคกน detect large changes in size of DNA fragments (large deletion/insertion)

** DNA fragments ท probe ไปจบได วงไปไดระยะไมเทากน ∴ มการเปลยนแปลงขนาด

1.1.2 Allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization: สราง probe มา 2 แบบ คอ

normal probe & mutant probe แลวเอา DNA ท amplify แลวมา hybridize ● ถา hybridize ไดกบ normal probe แสดงวา sample นนเปน normal allele ทสวนนน ● ถาไม hybridize กบ normal probe แต hybridize กบ mutant probe แสดงวาเปน

mutant allele ทสวนนน ● ถาไม hybridize กบ probe ใดทเรา design เลย แสดงวาม mutation แตไมรวาเปนแบบใด

Advantage Disadvantage 1. Sensitive method to detect known mutations (ดมาก ถาร mutation เพราะ sensitive มาก)

1. Detect only specific sequences in panel (ตรวจไดเฉพาะ sequence ทจาเพาะ)

2. Easier to use, simple techniques (การตรวจงาย ถาจบคอม ถาไมจบคอไมม)

2. May falsely detect another missense mutation at the same position (ถาตรวจไมเจอ กบอกไมได)

3. Useful for detecting common mutations (ใชไดดกบ mutation ทเปนแบบจาเพาะ)

1.1.3 Microarray: การทา ASO เลกๆ เอามาเรยงกนเปน panel มากมาย แตละ panel กจะม

specific mutation (อาจม list ของ mutation ex. ม 200 mutations) พอ hybridize แลว panel ไหนพบวาม DNA fragment จบกบ mutant probe ไดกแสดงวา sample ม mutant allele เปนแบบทเขาคไดกบ mutant probe ทใชใน panel นน

** Microarray กคอการเพมความสามารถของ ASO hybridization ขนมา โดยเหมอนการทา ASO เปนรอยๆ ASO

1.2 PCR-based testing: อาศยหลกการการเพมจานวนของ DNA โดยใช PCR 1.2.1 PCR only method 1.2.1.1 Multiplex PCR: การทา PCR หลายๆ reaction พรอมๆ กน โดย design การเขาค

กนของ primer กบบรเวณตางๆ ทจาเพาะใน gene ทมขนาดใหญมากๆ (เปนการแบงสวนของ PCR) แลวทาใหเกด PCR พรอมๆ กน จะได DNA fragment ขนาดตางๆ กน

เอามาทา electrophoresis ถาพบวามบาง band ไมขน แสดงวาสวนนนไมมการ

เพมจานวน แปลวา probe ไปเขาคจบไมได ม deletion ทสวนนน ** ∴ multiplex PCR ใชในการตรวจหา deletion ขนาดเลก (เลกกวาทจะตรวจไดโดย

Southern blot) 1.2.1.2 Long-run PAGE: โรคในกลม triplet repeat expansions เกดจากการเพมจานวน

base ซาๆ กน (ex. Huntington’s disease ม (CAG)37-121 ท HD gene ซงปกตจะม (CAG)10-35) เมอใส primer เหมอนกนในทง 2 samples amplify ไดทงค (เพราะในสวนหว-ทายท primer จะมาจบเหมอนกน ตางกนปรมาณ CAG ทเพมขน) ได DNA fragment ทขนาดตางกน ตวทม expansion กจะมขนาดใหญกวา เอามาทา electrophoresis คนทเปนโรค (ม expansion) กจะม fragment ทวงไดชา

 TOP  SI 117 

** ex. โรค spinocerebellar ataxia type 3 (Machado-Joseph disease, MJD) ม expansion ของ CAG ท MJDI gene พบวาเมอทา long-run PAGE กจะพบวา fragment วงชา (อยบน) ซงในคนปกต fragment ทไดจะวงไปไกลกวา (อยลาง)

** PAGE = polyacylamide gel electrophoresis 1.2.2 RFLP: คณสมบตหนงของ restriction enz. คอ recognize palindrome sequence แลวตด

∴ การตรวจ mutation โดยอาศย RFLP ทาได 2 กรณ คอ

1) mutation นนทาลาย restriction site (palindrome sequence) ตดไมได 2) mutation นนทาให sequence ปกตทไมใช palindrome กลายเปน palindrome ตดได เมอเอาไปทา electrophoresis กไดจะผลเปลยนไป (ม band นอยลง/เพมขน) 1.2.3 Allele specific amplification (ASA, Amplification refractory mutation system,

ARMS): ตรวจ mutation ท nucleotide ใด ก design mutant primer ทจาเพาะอยท nucleotide ตวสดทายของ primer แลวเอาไปทา PCR โดยแบงเปนกลมทใส mutant primer และกลมทใส wild-type primer ถา DNA ปกต กจะเกด product ของ PCR ใน Ξ ทใช wild-type primer เทานน ถาม mutation กจะเกด product ของ PCR ใน Ξ ทใช mutant primer เทานน

** กรณผทเปน heterozygote จะเกด product ในทง 2 Ξ 2. Mutation screening: ยงไมรวาจะตรวจหาอะไร รแตวามนผดปกต กจะ scan หาวา mutation มนอยทไหน

(แลวคอยมาดวา mutation เปนอะไร) หลกการ คอ ถา DNA sequence เปลยนไปแมเพยง base เดยว

คณสมบตทางกายภาพกจะเปลยนไปดวย การวงในกระแสไฟฟาโดยอาศย gel/ตวนาพเศษ จะแยกความ

แตกตางนออกได

2.1 Single strand conformational polymorphism (SSCP): ทาโดย denature DNA จาก PCR product (เลอกสวนได) single strand ซง fold, shape ของ single strand กจะเปลยนไปจากการมการเปลยนแปลง nucleotide เอาไปวงในกระแสไฟฟา ด band shift ถาสวนไหนวงตางออกไป

แสดงวาในสวนนนมความผดปกต (อยใน fragment ของ DNA ทเรา amplify ขนมาแลววงผดปกต) ทาใหรวา mutation อยตรงไหน (แตยงไมรวา mutation อยางไร เอามาทา DNA sequencing)

2.2 Denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE): เอา DNA มา denature single strand แลวผสมกบ probe ทตดฉลากดวยกมมนตรงส นามาทา electrophoresis บน denaturing gradient gel ซงเมอ single strand เกด reanneal (กลบมาจบกนใหม) จะเกดเหตการณ 2 อยางคอ

1) reanneal เหมอนเดม (normal DNA จบ normal DNA, mutated DNA จบ mutated DNA) ได homoduplex คงสภาพอยไดในภายใตสภาวะ denaturing

2) reanneal ไมเหมอนเดม คอ normal DNA ไปจบกบ mutated DNA (จบกนไดไมด แตกพอจบกนไดบาง) ได heteroduplex (ม mismatch กบ probe)

ใน denaturing gradient gel (ม denaturant (ex. สารเคม, T) เพมขนเรอยๆ) heteroduplex (ผดปกต) จะ melt & กลายเปน single-strand DNA ในบางจด เกดโครงสรางทเปนแขนง เคลอนทชากวา homoduplex (ตรวจพบไดโดย autoradiography)

** จะเหนวา ถา DNA ปกต กจะไมเกด heteroduplex ** วธนชดเจนกวาทา SSCP ** 2.3 Protein truncation test (PTT): DNA RNA protein แลวเอา protein มาทา

electrophoresis ถา protein ไหนสนกวาปกตกจะวงเรว จงใชตรวจหา mutation ททาใหเกด

truncated protein (truncate = ตด, ดวน, กด) ไดแก nonsense mutation, frameshift mutation (สวนใหญทาใหเกด premature stop codon), deletion, splice-site mutation

- advantage ของ mutation screening กคอจะ detect ไดเรว (rapid) & ไดถง 60-95% (ไมเหมอน

mutation specific detection ex. ASO ตอง hybridize, RFLP ตองมจงจะบอกได) - disadvantage ของ mutation screening คอตองการ further method = direct sequencing เพอ

characterize mutation - DNA sequencing: ทาเหมอน PCR แตเพม ddNTP เขาไป เมอใช ddNTP ในสาย DNA ทกาลงสรางใหม จะ

ไมสามารถตอ nucleotide ถดไปไดอก ไดสาย single-strand DNA ขนาดตางๆ กนแบบสม โดยมปลายเปน

ddNTP ทงหมด วงไดตางกนบน electrophoresis อาน DNA sequence ไดดวยตาเปลา (อานจากลาง

 TOP  SI 117 

- advantage ของ DNA sequencing คอ sensitive & informative มาก (บอก mutation เลกๆ นอยๆ ไดหมด) - disadvantage ของ DNA sequencing กคอ

1. ถาม large deletion & insertion/duplication จะ amplify สวนนนไมขน บอกอะไรไมไดเลย (∴ มกใชคกบ Southern blot)

2. แพง & ไมไดทาไดทกท (complex instrument set-up) 3. ม data เยอะมาก (ตองอาน sequence เปนระดบรอย kbp ตองอาศย textbook เปดชวย)

- Genetic testing – key point 1. No single method can identify all disease-causing mutations in a given gene (ไมมวธใดวธเดยวทดทสดในการตรวจ mutations) 2. Very few studies have directly compared sensitivity & specificity of available methods

for detecting gene mutations (การตรวจบอกไดแตวาตรวจได/ไมไดโดยอาศยขอจากดบางอยาง ถาตรวจไมเจอ กบอกไมไดวาจะเปน/ไมเปนโรค

∴ sensitivity & specificity ใชไมได) 3. Testing options must be decided on a gene-by-gene & lab-by-lab basis (ไมม lab ไหนสามารถตรวจ gene ไดทก genes และไมม lab ไหนทตรวจไดทก techniques เพราะราคาสง)

Pattern of Inheritance Part 1 - Mendel’s law of genetics 1. Law of dominance: “In a cross of parents that are pure for contrasting traits, only one

form of the trait will appear in the next generation” (ถามลกษณะการแสดงออกทางใดทางหนงซงสดขว 2 ขาง ex. สง-เตย, ขาว-ดา, ใหญ-เลก แลวนามาผสมกน

รนลกจะมการแสดงออกเพยงอยางใดอยางหนง) แสดงวาม trait หนงทเดนกวา 2. Law of segregation: “A pair of characteristics, only one can be present in a gamete” (แบบแผนการแสดงออกในรนลก ถาเปนลกผสม แมจะแสดงออกอยางใดอยางหนง แต trait ทดอยกวายงคงอย

และสามารถไปแสดงออกไดในอกรนหนงได เพราะใน gamete จะมลกษณะทง 2 แยกออกจากกน) 3. Law of independent assortment: “Pairs of characteristics separate independently of

each other during gamete formation” (แบบแผนการแสดงออกนน ทงเดนและดอย จะมการเขาคกนโดยไมขนแกกน และเปนแบบสม) - Mendelian genetics

gene เปน basic unit ของการแสดงออกในแตละลกษณะ (heredity manifesting characteristic/trait) ในแตละลกษณะ ลกจะไดรบ gene ม 1 ค โดยขางหนงมาจากพอ อกขางหนงมาจากแม gene ซงมาเขาคกนของพอและแม ถาทง 2 genes มการแสดงออกตางกน (dominant & recessive)

hybrids จะมการแสดงออกเพยงอยางใดอยางหนง (law of dominance) เมอมการผสมพนธกน (เกด meiosis) gene ทเคยเขาคกนจะแยกออก (segregate) เปนอสระ ไปอยใน

gamete ตางๆ รนลกกจะได gene เพยงฝายละครง (law of segregation) gene จะเขาคกนไดอยางอสระ (law of independent assortment)

- Terminology 1. Locus = ตาแหนงของ gene บน genome 2. Allele = ลกษณะของ gene บน locus เดยวกนซงแตกตางกน (alternative variants of gene at

particular locus) (ex. gene ททาหนาทแสดงสของดอก) 2.1 wild-type (normal) allele 2.2 mutant allele 2.3 polymorphism (เปน variant แตไมทาใหเกดโรค ex. ตนถวมดอกหลายส) 3. Genotype = set ของ alleles ทรวมประกอบกนเปนสงมชวต

4. Phenotype = การแสดงออกซง observable ทงทาง morphological, clinical (มองเหนและจบตองได), biochemical หรอ molecular trait

 TOP  SI 117 

** แตละคนม genotype ตางกน แตอาจม phenotype เหมอนกน (ex. ผวดา แต genotype ททาใหเกดผวดาอาจไมเหมอนกน อาจดามาก-ดานอย)

5. Homozygote = ณ locus ใด locus หนง ม allele เหมอนกนทง 2 alleles (identical allele) 6. Heterozygote = ณ locus ใด locus หนง ม allele ทง 2 ไมเหมอนกน (อาจจะปกตกบไมปกต หรอไมปกต

กบไมปกตทแตกตางกนกได) 7. Compound heterozygote = genotype ทม 2 mutant alleles ทตางกนบน locus เดยวกน (แสดงใหเหน

วาไมเหมอน heterozygote ทวๆ ไปทจะเขาใจกนวาเปน normal คกบ mutant) 8. Double heterozygote = genotype ทม heterozygosity เกดขนในทง 2 loci ทไมเหมอนกน - Pedigree symbols: ทนาสนใจ มดงน

proband (index case) = คนเปนโรคในครอบครวทมาพบเราเปนคนแรก ใชสญลกษณ affected (เปนโรค) & มลกศรช

ถาสมรสกนเองในครอบครว = consanguinity จะใชสญลกษณขดเชอมกน 2 เสน ถามการแทงบตรไปกอน = abort จะใชสญลกษณสามเหลยม ถาเปน twin แท = monozygotic twin ใชสญลกษณแบบ dizygotic twin แตมขดเชอมระหวางลก ถามการรบบตรบญธรรมเขามา = adopted in จะมวงเลบทลก แตใชเสนทลากลงมาเปนเสนประ

ถาใหลกไปเปนบตรบญธรรมคนอน = adopted out จะมวงเลกทลก และใชเสนทลากลงมาเปนเสนหนา คนทเราทราบวาเปน carrier แนนอน = obligate carrier เราจะใสจดตรงกลาง คนทเปน heterozygote จะระบายสครงเดยว ถาคลอดออกมาแลวตายคลอด = stillbirth จะใชสเหลยมขนมเปยกปน แลวมขดทบ ถามการหยาราง = divorce มขดทบระหวางเสนเชอม ถามคสมรสหลายคน = multiple union จะมขดเชอมไปยงคสมรสตางๆ

- การแสดง relativeness จะระบายส โดยเมอยด proband เปนหลก กจะได ● 1st degree relative คอพอ, แม, พนองทองเดยวกน, & ลก ซงจะม genotype ≈ ½ เหมอนกบผปวย ● 2nd degree relative คอป, ยา, ตา, ยาย, ลง, ปา, นา, อา, หลาน ● 3rd degree relative คอลกพลกนอง (ลกของ 2nd degree relative) - Single-gene diseases: เกดจากความผดปกตของ gene เพยง gene เดยวซงเพยงพอกบการทาใหเกดโรค ทา

ใหมแบบแผนการถายทอดทชดเจน = Mendelian inheritance - Pattern of mendelian inheritance: chromosomal location of the gene locus (autosomal & X-

linked), phenotype (dominant & recessive) ทาใหแบงแบบแผนการถายทอดทางพนธกรรมได 4 แบบ - ผชายจะม chromosome X เพยงอนเดยว = hemizygosity - ผหญงจะม 2 chromosome X มาจากทงพอและแม แตจะมเพยงอนเดยวทจะแสดงออก เรยกวาม X inactivation - คนจะเกดโรคไดตองไดรบ abnormal gene ทง 2 allele = recessive - ถา abnormal gene นนมเพยง 1 allele กสามารถเกดโรคได = dominant - ถา expression ของทง 2 alleles ทแตกตางกนเกดขนทงค = codominant - Autosomal dominant (AD): ม criteria ดงน 1. คนทเปนโรคจะมพอหรอแมเปนโรคดวย** (ยกเวนคนนนเปน new mutation) 2. คนทเปนโรคมทง ญ. & ช. 3. คนทเปนโรคจะมลกทมโอกาสเสยงเปนโรค = ½ 4. คนทไมเปนโรค จะไมถายทอดโรค** - AD จะมการถายทอดแบบ vertical transmission (เกดขนในทก generation เปนแนวดง จากรนหนงสอกรน

หนง) ซงถาพบตงแต 3 ชวคนขนไป, พบความผดปกตทง ญ. & ช., ถายทอดจากพอไปลกชายได เปน AD - Autosomal recessive (AR): ม criteria ดงน 1. คนทเปนโรคมพอ & แมปกตทงค** (เปน carrier) (ยกเวนกรณ pseudodominant inheritance) 2. คนทเปนโรคมเฉพาะในพนองทองเดยวกน = sibship เทานน** โดยมโอกาสเสยงเปนโรค = ¼ 3. คนทเปนโรคมทง ญ. & ช. - AR จะมการถายทอดแบบ horizontal transmission - โรคทพบไมบอยนก การทพอ & แมจะเปน carrier ทงคพบไดยาก พอและแมอาจจะเกยวของกนทางสายเลอด =

consanguinity (ม consanguineous marriage)

 TOP  SI 117 

- X-linked dominant (XD) 1. ผชายทเปนโรค ลกสาวทกคนจะเปนโรค แตไมมลกชายเปนโรคเลย !!** (เพราะได chromosome Y จากพอ) 2. ผหญงทเปนโรคถายทอดเหมอน AD ทกอยาง 3. คนทเปนโรคมทง ญ. & ช. 4. คนทไมเปนโรค จะไมถายทอดโรค** - ผหญงทเปนโรคจาก XD จะพบบอยกวาผชายทเปนโรค ≈ 2 เทา (เพราะม chromosome X มากกวา) & มความ

รนแรงนอยกวา (milder phenotype) - XD บางโรคทพบนอยและหายาก จะพบเฉพาะในผหญงเทานน เพราะถาผชายเปนโรคจะตายกอนคลอดทงหมด !! =

male lethality (ex. incontinentia pigmenti type 2) ∴ มแตลกสาวทเปนโรค, ลกสาวปกต, & ลกชายปกต อตราสวน 1 : 1 : 1 อตราสวนลกสาว : ลกชาย = 2 : 1 (แทนทจะเปน 1 : 1)

- X-linked recessive (XR) 1. คนทเปนโรคทงหมด/เกอบทงหมด เปนผชาย** (พบใน ญ. นอยมาก) 2. ผชายทเปนโรคมลกชายปกตทกคน !!** (เพราะได chromosome X จากแมเสมอ) 3. ผชายทเปนโรคจะถายทอด abnormal gene ไปใหลกสาวทกคน** ลกสาวเปน carrier ถายทอดโรคตอไป

ใหหลานตาทเปนชาย** มหลานตาทเปนชายเปนโรค ½ (ขนอยกบวาได X แบบปกตหรอเปนโรค) - ญ. ทเปน carrier ของ XR จะมลกชายเปนโรค ½ ของลกชายทงหมด & ลกสาวเปน carrier ½ ของลกสาวทงหมด - ญ. ทตองเปน obligate carrier บอกไดจาก 1) มพอเปนโรค** 2) มลกชายเปนโรคอยางนอย 1 คน & มพนองผชาย/ญาตผชายทางฝายแมเปนโรคอกอยางนอย 1 คน** - ครอบครวทมผชายเปนโรคหลายคน ทงหมดมความสมพนธกนทางแม (ซงปกตดแตเปน carrier) - XR จะถายทอดเปนแนวเฉยง = oblique transmission ผาน ญ. ทเปน carrier ** ถาพบคนทเปนโรคในพนองทเปน ช. บางครงนอกจากโรค XR แลว อาจเปน AR ทบงเอญเปนแตในพนองทเปน ช. กได - Y-linked inheritance: พบเฉพาะในผชาย; ผชายจะถายทอดใหลกชายทกคน; ไมเปนโรค มแตลกษณะบางอยาง - การ identify genotype ทเปนไปไดทงหมดในรนลกในการทา accurate risk calculation อาจทาไดโดย 1. วาดตาราง Punnett square 2. วาด chromosome diagram - ถาถามถงคนทม phenotype ปกตใน pedigree วามโอกาสทจะเปน carrier เทาไร ตองนกเสมอวาเรารแลววา

ปกตด ex. ในการถายทอดแบบ AR เมอมพนองทง ญ. & ช. เปนโรค แลวถามคนทไมเปนวาจะมโอกาสเปน carrier เทาไร ตองตอบวา 2/3** (ไมใช 1/2 เพราะในทงหมด มคนเปนโรค 1/4 ไมเปน 3/4 แลวใน 3 สวนนนมคนทปกตแบบ homozygote 1 สวน เปนคนทเปน carrier อก 2 สวน จงตอบ 2/3 เพราะเรารแลววาเขาไมไดเปนโรค)

** อยาลมวาตองใชขอมลทบอกใหเรารใน pedigree มาจากดขอบเขตการคานวณดวย !! - ถามชายปกตทมพนองทเปนโรคจากการถายทอดแบบ AR แตงงานกบหญงปกตทมโอกาสเปน carrier ในโรค

เดยวกน (carrier frequency) = 1/25 แลวถามวาลกสาวจะมโอกาสเปนโรคเทากบเทาไร… ตอบ 1/150 (รวาชายปกต จงมโอกาสเปน carrier = 2/3, หญงมโอกาสเปน carrier = 1/25, ถาทง 2 เปน carrier ลกม

โอกาสเปนโรค = 1/4 ∴ ลกมโอกาสเปนโรค = 2/3 × 1/25 × 1/4 = 1/150) ** ระวง ขอนถามวาลกสาวจะมโอกาสเปนโรคเทาไร ไมตองคดวาเปนลกสาว/ลกชาย เพราะรวาเปนลกสาวแลว คด

เหมอนเปนลกคนหนง แตถาถามวาโอกาสทจะไดลกสาวทเปนโรคมเทาไร จะตอง × ½ เขาไปเพมอก (เพราะตองคดโอกาสทจะไดลกสาวดวย)

 TOP  SI 117 

Special tips ** เปน vertical & คนทเปนโรคตองมพอหรอแมเปนโรค ∴ dominant แยก AD กบ XD: ถาพอถายทอดใหลกชายได AD; ถาไมมการถายทอดจากพอไปลกชายเลย XD

หลก “พอไปลกชาย ไมใช X-linked” “เปนโรคโดยทพอแมไมไดเปน เปน recessive”

(ยกเวน non-penetrant case) ** ดวาเปน horizontal (พนองกนเปนในรน II), พอแม (รน I) & ลก (รน III) ปกตด AR ** ถาผชายรน I เปนโรค, ลกสาวรน II ไมเปน, ลกชายรน III (ของลกสาวรน II) เปน XR

Pattern of Inheritance Part 2 - New mutation in AD inheritance: mutation ใหมเกดใน gamete หนงของพอแม ถามลกทเกดขนมา กจะ

มลกคนนนคนเดยวทเปนใน generation ทเรมม** (โอกาสเกดซา (recurrence risk) นอยมากๆ) แตคนทเปนโรคแลวกจะถายทอด AD ตามปกต (พอถายทอดใหลกชายได, โอกาสทลกเปนโรค = ½)

- Germline (Gonadal) mosaicism: เกด mosaicism ใน germ cell ตงแตเปน embryo พอโต เซลลสวน

หนงใน gonad กจะม gene ผดปกต ม gamete ผสมของ normal & mutant gametes มลกเปนได หลายคนใน generation ทเรมม** (recurrence risk สงกวา new mutation) แลวคนทเปนโรคแลวกจะถายทอด AD ตามปกต

- Penetrance: % ความบอยท abnormal gene นนแสดงออก (phenotypic expression) ในกลมประชากรทม gene นนอย; ถา 100% = complete penetrance; ถา < 100% = incomplete (reduced) penetrance; คนทม abnormal gene แตม phenotypic expression ออกมาปกต = non-penetrant case (ม non-penetrant trait)

- ม penetrance pedigree จะม skipped generation (เหนคนทเปนโรคกระโดดขามไป 1 generation คอม 1 generation ทไมมคนเปนโรค เพราะคนนนเปน non-penetrant case)

- Sex limited AD เปนตวอยางทเหนไดชดเจนของ incomplete penetrance คอโรค/ภาวะทมการแสดงออกทถกจากดดวยเพศ ex. โรคททาใหเกด congenital abnormality ใน female genito-urinary system (ex. ความผดปกตของ uterus), breast cancer โดยผชาย แมจะไดรบ gene ไปกมกไมทาใหเกดโรค

- Variable expressivity: abnormal gene เดยวกนอาจแสดงออกระดบตางกนในแตละคน; พบไดแมในครอบครวเดยวกน, เหนชดขนระหวางครอบครวซงม abnormal allele ตางชนดกน

- ตวอยางของ variable expressivity เชน neurofibromatosis (Recklinghausen’s disease) (จาก

dominant gene บน chr.22) คนทเปนโรคจะมผวหนงเปนปมตามตว (ทาวแสนปม) = neurofibroma (NF) & มปานสนาตาลกระจดกระจายทวไปตามผวหนง เรยกวา café-au-lait macule (CAL); คนไขอาจม NF เตมตว

หรออาจมแค 2-3 NF โดยไมมอาการอนเลยกได, อาจมแค 2-3 CAL, ม NF มาก & 80 CAL กได - expressivity เปน severity ของ phenotypic expression = มลกษณะเปน spectrum สวน penetrance

เปน all-or-none - variable expressivity นอกจากฤทธของ abnormal gene การทางานของ gene ยงตองม interaction กบ

modifier gene (background gene) ดวย

- Variable age of onset เปนตวอยางทเหนไดชดของ expressivity เชนอายของผทเกดโรคขน โดยเกดโรคทอาย

ตางๆ กนขนกบบคคล & ความรนแรงตางกน โรคแบบนมาจาก gene กจรง แตไมเปน congenital - ประวตครอบครวทไมมใครเปนโรค แตจรงๆ อาจมคนทเสยชวตไปกอนทจะถงอายทแสดงอาการกได - โรคทางพนธกรรมหลายโรคมการแสดงออกเมออายมากขนเรอยๆ (ex. มะเรงทงหลาย) = late onset disease,

บางโรคอาจเสยชวตตงแตในครรภ (lethal in prenatal life) = embryonically lethal condition

 TOP  SI 117 

- โรคบางโรคมความรนแรงมากขนเรอยๆ ใน generation หลงๆ = genetic anticipation (ex. ในรนหนง onset เมออาย 55 y, รนตอไป onset เมอ 40 y, ตอไป onset เมอ 24 ป) พบในกลมโรคจาก mutation ชนด triplet repeat expansion (ในรนหลงๆ ยงม triplet repeat จนเกด threshold แลวเกดเปนโรคขน ยงมมากเทาไร ก

ยงแสดงอาการรนแรงมากเทานน) ex. โรค myotonic dystrophy - Pseudo-dominant (Quasidominant) inheritance (quasi = ดคลาย): AR ทถายทอดคลาย (mimicking)

AD คอพบเปน vertical transmission; พบในกรณม consanguinity (ในประเทศไทย โรคประจาถนกคอ

thalassemia เพราะคนไทยม carrier โรคนสงมาก มถง 2 ใน 5 คน) - factor ทมผลตอ pattern of inheritance (ทาใหพบ pseudo-dominant inheritance) เชน 1. consanguinity: cultural 2. common gene & carrier frequency: heterozygote advantage (ex. thalassemia ในเมองไทย คน

ทเปน carrier จะมความทนตอ malaria สงกวาคนทไมเปน carrier) 3. genetic isolates: inbred population (ex. คนยวมกจะแตงงานกบคนยวเทานน เรมจากครอบครวเพยง

ไมกสบครอบครว แลวขยายเผาพนธไดจนมประชากรเปนลาน จงม genetic background ใกลเคยงกนมาก ม

โอกาส carry โรคทเปน AR ไดสงกวา)

** ดแลว พอ/แมเปนโรค ลกไมเปนโรคเลย แสดงวา recessive แตดถายทอด vertical (เปนหลายรน) pseudo-dominant

- Genetic heterogeneity: ex. คนหหนวก 2 คนแตงงานกน แตลกออกมาปกตด โรคทจะทาใหหหนวกมเปนรอย คนหหนวก 2 คนไมจาเปนตองเปนโรคเดยวกน แตมการแสดง phenotype ทเหมอน/คลายกน เมอแตงงานกน

ลกกจะเปน carrier ของทง 2 โรค = double heterozygotes (ม 2 genetically different AR conditions) ∴ ไมมลกคนไหนเปนโรคเลย !! (พบแบบนไดบอย ex. คน 2 คนเจอกนทโรงเรยนสอนคนหหนวก

มสงคมเหมอนกน แลวแตงงานกน) - ถาม mutation ตางกนบน locus เดยวกน = allelic heterogeneity (mutational heterogeneity) - ถา mutation ทตาง loci กน = locus heterogeneity (ทาใหเกดโรคทเหมอน/คลายกนจาก gene ตาง loci) - Dosage compensation of X-linked genes: การท ญ. ม 2 X chromosome แต product ทสรางไมได

เปน 2 เทาของ ช. เพราะมกลไก dosage compensation จาก Lyon hypothesis ทกลาววาใน somatic cell ของ ญ. จะมเพยง 1 X chromosome ท active ทเหลอจะถก inactivate & เหนเปน X-chromatin body ในระยะ interphase

- X inactivation เกดใน early embryo ของ ญ. หลง fertilize มาไมนาน และสนสดเมอจะเขาส gastrulation (ม ≈ 100 cells) ซงการทา random X inactivation น บางเซลลกเกดกบ Xp (paternal) บางเซลลกเกดกบ

Xm (maternal) ถา ญ. เปน carrier กเดาไดวาเซลล ½ กจะม normal phenotype อก ½ กจะม abnormal phenotype ซง normal function แค 50% นเพยงพอตอการดารงชวต ญ. ทเปน carrier จงไมแสดงอาการของโรค

- ถาใน pedigree พบการถายทอดแบบ XR แตพบม ญ. เปนโรคอยคนเดยว (นอกนนผชายเปนหมด) แสดงวา ญ. คนนนม nonrandom X inactivation คอ X ท normal ถก inactivate ไปเกอบหมด ญ. คนนนเกดโรคได แมวาโรคนนจะถายทอดแบบ XR (เปนสาเหตอนดบ 1 ทผหญงเปนโรคจาก XR)

- Manifesting females of X-linked condition: ญ. ทเปนโรค XR มความเปนไปไดคอ 1. Homozygote 1.1 จากพอหรอแมทเปนโรค (พอเปนโรค แมเปนพาหะ) 1.2 new mutation ใน paternal gamete + heterozygous mother 2. Nonrandom X inactivation 3. 45, X with mutant allele (เปน Turner syndrome และเกด mutation กจะไมเกด inactivation เลย) 4. 46, XY female (คนท clinical phenotype เปนผหญง แต genotype เปนผชาย แตไมม function ของ

male hormone) - Mitochondrial inheritance: ถาผหญงเปนโรค ลกจะเปนโรคทกคน !! แตถาผชายเปนโรค ลกจะไมเปนโรค

เลย เพราะ mtDNA ถายทอดจากแมเทานน (maternal inheritance) เพราะ sperm จะมแต nuclear genome

 TOP  SI 117 

Human Cytogenetics - Human chromosomes: แตละ human somatic cell ประกอบดวย 46 chromosomes (คนพบโดย Joe Hin

Tjio & Albert Levan ใน ค.ศ.1956) = 44 autosomes + 2 sex chromosomes - human chromosome ทมรปราง, โครงสราง, & จานวนปกต = balanced chromosome - chromosome จะเขากนเปนค 23 ค; คของ chromosome ทเขาคกน = homologous chromosome

(homolog) โดยจะม genetic information เหมอนกน (matching) (เหมอน allele ทเขาคกน) - Structure of chromosome: ประกอบดวย p arm (short arm), q arm (long arm), centromere,

telomere - การเปลยนแปลงระดบ gene จะไมเหนการเปลยนแปลงใน chromosome

- การเปลยนแปลงระดบ chromosome เปนการเปลยนแปลงในระดบ gene ทมหาศาล (ลาน bp ขนไป) - human somatic cells ม diploid chromosome (2n = 46) - human gametes ม haploid chromosome (n = 23) - life เรมจาก 1 diploid cell เจรญขนมา & มการแบงตว - Cell cycle: แบงเปน 4 phases ไดแก G1, S, G2, M - cell cycle สวนใหญประกอบดวยชวงท cell เตบโต, cell division (mitosis) เปนสวนเลกๆ เทานน - เมอ cell เตบโตถงขนหนง (G1) กจะมการเตรยมพรอมโดยเพมจานวน chromosome (genetic material) (S)

เพอตอไปจะแบงครงใหได cell ลกซงมจานวน genome เทาเดม - G1: no DNA synthesis - S: DNA synthesis, DNA ในแตละ chromosome replicates กลายเปน bipartite chromosome

(ประกอบดวย 2 sister chromatids: เหน 2 long arms & 2 short arms) - G2: สงเคราะห RNA & proteins, cell ขยายขนาดเลกนอย - Mitosis: somatic cell division, chromosome segregation, continuous process (แตเหนไดจาก LM

แบงเปน 5 phases: interphase, prophase, metaphase, anaphase, telophase), 2 daughter cells ไดรบ complete set of diploid chromosome

- stages of mitosis 1. Interphase: เรมตงแตสงเกตไดวาใน nucleus มการหนาตวของ DNA & chromosome (เดมไมเหน) 2. Prophase: ลกษณะ band ของ chromosome เหนชดเจนขน (จากการ pack กนมากขน) 3. Metaphase: chromosome มาเรยงกนในแนวระนาบเปนแถวตรงกลางตงแต chromosome 1 – 46 พรอม

ทมการแบงเซลล, แตละ chromosome ถกยดอยดวย spindle fiber 4. Anaphase: แตละขางของ chromosome เดยวกนถกแยกออก (ไดแตละเซลลม 46 chromosomes, แตละ

chromosome ม 1 chromatid) ** เดมตอนเรม mitosis แตละเซลลจะม 46 chromosomes, แตละ chromosome ม 2 chromatids 5. Telophase: chromosome แยกออกจากกนไปอยทขว - Meiosis: เปนการแบงตวทเกดขนเฉพาะการสราง gamete เทานน, เมอสนสดการแบงตว 1 cell จะมจานวนชด

chromosome ลดลงครงหนง = haploid - Meiosis I = reduction division; แบง cell ออกมาแลวทาใหจานวน chromosome ลดลงครงหนง - prophase I แบงออกเปน leptotene, zygotene (มการเขาคกนของ chromosome แตกตางจาก

mitosis), pachytene, diplotene, diakinesis - Meiosis II = centromere splitting; คลาย mitosis, มจานวนชด chromosome ลดลงครงหนงในระยะ

anaphase II (เหมอน anaphase ใน mitosis) - recombination เกดในระยะ prophase I ชวงทมการแลกเปลยนชนสวน chromosome กน

- 46 Human chromosomes: แบงตาม size & location of centromere ● Metacentric: ม centromere อยตรงกลาง (แบง p & q arms ขนาดใกลเคยงใกลเคยงกน) ● Submetacentric (สมาชกสวนใหญ): ม centromere ใกลกลาง ● Acrocentric: short arm เปน satellite, มกานตอกบ centromere = stalk, chr.13, 14, 15, 21,

22 ** telocentric ไมมในคน

 TOP  SI 117 

- เมอกอนไมสามารถระบไดวาเปน chromosome คทเทาไร เพราะมขนาดใกลเคยงกนมาก เพยงจดวาเปน group A, B, C, D, E, F, G ตอมาม technique banding กชวยให

- Conventional study of human chromosome: Chromosome preparation 1. Cell culture (Dividing cells): ใช active cells (มการแบงตวอยแลว) เชน leucocytes (ถกกระตนดวย

mitogen), amniotic fluid cells, hematopoietic stem cells ** เซลลแตละเซลลยอมแบงตวไมพรอมกน เราจะตองมสารไปหยดไวทระยะใดระยะหนง metaphase 2. Stop cell division in metaphase: ใช colchicine, colcemid (mitotic spindle blocking agents) ** การตรวจ chromosome ไดชดเจน จะตองดในระยะ late prophase หรอ metaphase 3. Hypotonic treatment, fixing & cell pellet dropping: เอาเซลลลงใน hypotonic solution ใหเซลลแตก

4. Drying slide 5. Staining/Banding - Banding techniques: แตละ techniques มขอด-ขอเสยแตกตางกน ขนอยกบวาเราจะตรวจอะไร 1. Q banding: เปน standard banding reference (เปนตรวจมาตรฐาน ใชอางอง classification ของ

chromosome), ใช quinacrine mustard ยอมแลวไปตรวจโดย fluorescent microscopy (ผานแถบแสง UV, เหนเปนแถบมด-สวาง), ใชประโยชนสาหรบ heteromorphism

** ปญหาคอ 1) quinacrine หายาก 2) การใช fluorescent microscopy คอนขางแพง 3) การตดสไมถาวร เมอยอมไปนานๆ แลว การตดสจะจางลง !

2. G banding: most common, ตดสคลาย Q banding, ยอมดวย giemsa แลวเอาไปดดวย LM (เหนเปนแถบเขม-จาง), dark G band (เขม) = bright Q band (สวาง)

** ขอดคอ ตดสถาวร ! ** ขอดอยของการตรวจดวย Q banding & G banding คอ ตรง telomere จะตดสจางเหมอนๆ กนทก

chromosome (ทาใหดไดยาก) จงไดมการพฒนา R banding ขนมา 3. R (Reverse) banding: เอาไปทา special treatment (heat/other agents) กอน แลวเอายอมปกตดวย

G หรอ Q banding ได reverse band ทาใหบรเวณทตดสจางใน G band หรอตดสมดใน Q band จะตดสสวางขน เหนชดเจน (ใช investigation of light G band areas)

** special treatment คอแช chromosome ทตดอยบน slide ใน PO43- buffer (ใช Na2HPO4) pH 6.5 ท

T = 87°C นาน ≈ 10 min แลวคอยเอาไปยอมดวย giemsa แลวเอาไปตรวจดวยกลองจลทรรศนแบบ phase contrast

4. C (Constitutive heterochromatin) banding: ทาใหรอบๆ centromere & ทอนบางแหง (ม highly repetitive DNA อยมาก) ตดสเขมจด (แต chromosome บรเวณทวไป ตดสจางมาก)

5. H banding: ใช Hoechst 33258 ยอม, เอาไปตรวจดวย fluorescent microscopy ปรากฏแถบสเรองแสงจา (fluorescent band) ในสวน repetitive DNA (คลาย Q banding)

6. High-resolution banding: ยอม chromosome ในระยะ prophase หรอ early metaphase (prometaphase) กอนท chromosome จะ condense ทสด (arm ของ chromosome จะยาวกวา) จะเหน

band ใน haploid chromosome เปนชด ≈ 550 bands (มากกวาในระยะ metaphase ซงเหน ≈ 450 bands)

** ถารอให condense ทสดในระยะ metaphase ถามการหายไปขนาดเลกๆ อาจไมสามารถมองเหนได - Localization and nomenclature: 1p21.1 chromosome number, arm, region, band, subband ** chromosome region = บรเวณ chromosome ใน arm ขางนนซงนบจาก centromere ออกไป chromosome band = band ทเทาไรใน region นนนบจาก centromere - Karyotype: arranged photograph of all chromosome pairs in single cell ** nomenclature: no. of chromosome, type of sex chromosome pair (46,XY) - Molecular cytogenetics: ใชตรวจดการม/ไมม particular chromosome region หรอ evaluate

number/organization of chromosomes, ใชหลกการ hybridization

 TOP  SI 117 

1. Fluorescence in-situ hybridization (FISH): การ hybridize ใน cell, ทา probe ทจาเพาะกบสวนของ chromosome สวนใดสวนหนงเทานน, แบงเปน

1.1 Single copy FISH: ใช 1 probe 1.2 Two color FISH: ใช 2 probes (ใช 2 ส) 1.3 Multicolor FISH (M-FISH)

** ทาแตละ probe ใหจาเพาะกบ chromosome หนงเทานน เอาสหนงจาเพาะกบ chr.21, อกสหนงจาเพาะกบ chr.13, อกสหนงจาเพาะกบ chr.X, อกสหนงจาเพาะกบ chr.Y บอกเพศ/ความผดปกตในจานวน/โครงสรางของ chromosome ได

1.4 Spectral karyotyping (SKY): ใช fluorochrome (สารททาใหเกดสเรองแสง) 5 สผสมในสดสวนตางๆ กน สาหรบเตรยม chromosome painting probes 24 ชนด (สตางกน), แตละสจาเพาะกบ

chromosome 23 ค (22 autosomes + X + Y = 24) รวมกบการใช computer วเคราะหภาพทถายดวยกลองชนดพเศษ

** SKY มประโยชนในการตรวจ rearrangement ของ chromosome ทเกดขนขนาดนอยๆ ex. deletion (บอกยาก), translocation (ex. translocation สวนของ chr.1 ไปท chr.18 จะเหน

signal ของ chr.1 ไปอยทปลายของ chr.18), marker chromosome (chromosome ชนเลกๆ เพม

ขนมา ดวามาจากชนสวนของ chromosome ใด) ถาม chromosome เกนแลวตดสเหมอน

chromosome ใด กแสดงวาเปน trisomy ของ chromosome นน ฯลฯ

2. Comparative genomic hybridization (CGH): ทาทง whole genome โดยเปรยบเทยบระหวาง normal genome กบ genome ทตองการตรวจ, ใชมากในการศกษา cancer genetics เพอตรวจ deletion หรอ

amplification ของสวนทจาเพาะของ chromosome ใน cancer cell, ผสม test DNA (สมมตตดฉลากสเขยว) & control DNA (ปกต, สมมตตดฉลากสแดง) ในปรมาณเทาๆ กน แลวใหชงกน hybridize บน

metaphase chromosome ชนดเดยวกนทปกต ● บรเวณทปกตของ test DNA, ท metaphase chromosome โอกาสทสแดงกบเขยวจะจบมเทาๆ กน

signal รวมไดสเหลอง ● บรเวณทม deletion บน test DNA, ท metaphase chromosome จะไมมสเขยวมาจบ/จบนอยลง

เหนเปนสแดงชดขน (signal สแดงปกต แตสเขยวนอยลง) ● บรเวณทม duplication บน test DNA, ท metaphase chromosome โอกาสทสเขยวจะจบกมมากกวา

เหนเปนสเขยวชดขน ** CGH บอก translocation ไมได เพราะไมไดทาใหปรมาณ DNA เพมขน/ลดลง (ตองใช SKY) แตบอก

deletion หรอ duplication ได (SKY จะบอก deletion ไมคอยได เพราะทง chromosome ตดสเดยว) 3. Special cytogenetics studies: ใชในกรณทเราสงสยโรคบางอยางเทานน 3.1 Chromosome breakage: กระตนให chromosome มการแตกหก, ปกตไมแตกหกงายๆ ถาแตกหก

งายกวา แสดงวามความผดปกต (พอ chromosome แตกหกแลว พอตอกน กจะไมเหมอนเดม รปราง

ประหลาดไป ถาเหนอยางน กแสดงวามการแตกหกของ chromosome) 3.2 Sister chromatid exchange (SCE): แตกหกเปนการแลกเปลยนชนสวน chromosome กน,

จาเพาะกบโรคบางอยาง ex. bloom syndrome (ยอมส chromosome ดวย BrdU ซงจะทาให chromatid หนงตดสเขม อก chromatid ตดสออน ถาทาใหมนแตกหกแลว ตรงปลายกจะพยายามจะตอ

กนแลวกตอผด แตละ chromatid กจะมทงตดสเขม & ออนปนกน บงบอกวามการแตกหก) 3.3 Fragile site testing: ใชกบ fragile X 4. Indication for chromosome study: จะสงตรวจเมอ สงสยวาผดปกต (suspect chromosome aberration)

1) มอาการ (features) ท compatible with specific chromosome anomalies (ตรงตามโรคหนงๆ ซงเปนความผดปกตของ chromosome)

2) มปญญาออน (mental retardation) หาสาเหตไมเจอ 3) Multiple congenital malformation 4) ม specific symptoms: amenorrhea, short stature, ambiguous genitalia, infertility

Multiple spontaneous abortion, stillbirth (เดกตายคลอดจากความผดปกตของ chromosome) Family history of chromosome aberration carrier

 TOP  SI 117 

Cancer: characteristic chromosome aberration (มะเรงจากความผดปกตของ chromosome ทจาเพาะ)

Chromosome Aberrations - ม 2 รปแบบใหญๆ ไดแก 1. numerical aberration (รปรางปกต แตจานวนผดปกต): aneuploidy, polyploidy 2. structural aberration (โครงสรางผดปกต, จานวนอาจไมเปลยน): deletion, insertion, inversion,

translocation, ring chromosome, isochromosome (มแขน 2 ขางเหมอนกน), dicentric chromosome

- Aneuploidy: พบบอยทสด; กอใหเกดความผดปกตของมนษยหลายระบบ & คอนขางรนแรง โรคทเกดจะเกยวของกบ gene มาก/นอย แลวแตปรมาณ chromosome ทผดปกตไป ∴ phenotype กจะตางกนไปขนกบการเพมขน/ลดลงของ chromosome มาก/นอยเพยงใด และท chromosome ไหน

- ถา chromosome มลกษณะความผดปกตคลายคลงกนท chromosome หนงจาเพาะ ลกออกมาลกษณะกจะม

คลายกน - สาเหตหลกของ aneuploidy เกดจาก nondisjunction (ใน cell division); ex. trisomy 21, trisomy 13,

monosomy X - Nondisjunction: chromosome ไมแยกออกจากกนใน meiosis I หรอ II เปนผลให gamete หนงจะม

chromosome เพมขนมา ขณะทอก gamete หนงจะไมม chromosome ทจะตองไดไป, เมอ gamete ทม chromosome ทผดปกตไปรวมกบทปกตกจะทาใหมจานวน chromosome เพมขน/ลดลง

- Down’s syndrome: สวนมากม trisomy 21 (จาก nondisjunction), ผปวยจะมลกษณะคลายๆ กน ไมวาจะมา

จากครอบครว/ชนชาตใด, ม mental retardation, congenital heart defect, short stature, มสนของ skin เดนขนมาบรเวณหวตา = epicanthal fold, ตาจะเฉยงขน 2 ขาง = upslanting palpebral fissure

- nondisjunction เกดสมพนธกบอายของแม (maternal age) ทเพมขน เนองจาก oocyte หยดทระยะ prophase I มาเปนเวลานาน (ตงแตในครรภ) ยงคางอยนานเทาใด กยงมโอกาสผดพลาดมากเทานน !

- Turner syndrome: เปน monosomy X (45, XO), พบใน female เทานน, ผปวยจะมาหาแพทยตองเรองตวเตย, ไมม menses; ทตนคอม fold of skin เดนชดขนมา, ระดบของผมลงตากวาปกต = low hairline, มมมของแขนททามมกนชดเจน, ม coarctation of aorta (เปน congenital abnormalities), ม horseshoe kidney

- Polyploidy: chromosome เพมขนมาเปนชด ex. 3n (ex. (69, XXX), (69, XYY)), 4n (ex. 92, XXYY); severe consequences due to large unbalanced of genetic material

- คนทม polyploid จะเสยชวตหมด ! (เพราะขนาดม chromosome เพมขน/ขาดไป เพยงเลกนอยกยงมผลรนแรง) - Deletion/Insertion: ขาด/เพมชนสวนของ chromosome บางสวน, เปน segmental aneusomy = เกด

ความไมสมดลเฉพาะในสวนทการขาด/เพมนน (แตไมไดทาใหเกด aneuploidy) - deletion/insertion แบงเปน interstitial (ภายในของ arm ขางใดขางหนง) & terminal (ทปลาย) - อาจเปน microscopic deletion/insertion (เหนไดจาก banding, ใช LM ดได) หรอ submicroscopic

deletion/insertion (ตรวจไดโดยใช molecular cytogenetic methods) - Reciprocal translocation: มการแลกเปลยนชนสวน chromosome ระหวาง 2 chromosomes, จะม

breakage ของ chromosome > 1 ตาแหนง, ไมมการลด/เพมชนสวน chromosome genome ยงเทาเดม = balanced translocation

- โรคทเกดจาก reciprocal translocation: acute promyelocytic leukemia (APL) ตอบสนองตอการรกษาจาเพาะดมาก, ถาสงสยวาเปนตองลองตรวจ chromosome ถาตรวจเจอความผดปกต พยากรณโรคไดด โอกาส

ตอบสนองตอยาและหายขาดสงมาก - Robertsonian translocation: เกดขนใน acrocentric chromosome (chr. ทม centromere เกอบสดขาง

ใดขางหนง ทาใหแขนขางสน เปนเพยงกลมกอนของชนสวน chromosome = satellite รวมกบมกานตอออกมาจาก centromere = stalk)

** acrocentric chromosome ประกอบดวย chromosome คท 13, 14, 15, 21, 22 Robertsonian translocation เกดไดเฉพาะระหวาง chromosome เหลานเทานน

 TOP  SI 117 

- เมอ short arm ของ acrocentric chromosome ขาดหายไป แลวมการ fusion ของ chromosome ในกลมนเขาดวยกน ทาให long arm ตอกบ long arm = centric fusion ทบรเวณ centromere (แลวสญเสย short arm ไปเลย) เหลอ 45 chromosomes

- Robertsonian translocation ยงถอเปน balanced translocation เพราะชดของ gene ทอยบน short arm ของ acrocentric chromosome ทง 5 คเหมอนกนๆ** ∴ การเสย gene ซงเหมอนๆ กนไปเพยงสวนหนง

เพยงพอตอการทางานของมนษย ! - Meiosis in chromosomal translocation จะ form เปน tetrad (quadrivalent) ใหเขาคกนไดในระยะ

metaphase I, เมอ anaphase I จะแยกได 3 แบบ (ซาย-ขวา, บน-ลาง, เฉยง) ได gamete 6 แบบ จะมปกต

อยเพยง 2 แบบ !! มโอกาสไดลกปกต 1/3 (โอกาสอก 2/3 คอไดลกผกปกต) ● ถา chromosome ทอยสลบกนแยกไปดวยกน (แยกเฉยง) = alternate segregation gamete ปกต !!

(เพราะได chromosome ปกตไปทง 2 chromosomes หรอได chromosome ทม reciprocal translocation ไปทง 2 chromosome)

● ถา chromosome ทอยเคยงกนไปดวยกน = adjacent segregation gamete ไมสมดล !! มทง deletion & duplication

- ถาเกด Robertsonian translocation (ม chr.13 ปกต, chr.14 ปกต, chr.13+14) เวลาแยกจะได 3 แบบ คอ 1) gamete 1 chr.13 ตกบ chr.14 (ปกต); gamete 2 chr.13+14 อนเดยว (กม long arm ครบปกต) 2) gamete 1 chr.13 ตกบ chr.13+14; gamete 2 chr.14 อนเดยว

3) gamete 1 chr.14 ตกบ chr.13+14; gamete 2 chr.13 อนเดยว ** 1) = alternate segregation ปกต; 2) & 3) = adjacent segregation ผดปกต โอกาสไดลกผดปกตจะสงมาก ! - translocation Down syndrome ● t(14:21) (D/G translocation) เกด Robersonian translocation ระหวาง chr.14 กบ 21 พอ

gamete มารวมกนกได chr.21 มา 1 คปกต แตได chr.14 ปกตคกบ chr.14+21 ∴ ได 3 long arms ของ chr.21

** karyotype คอ 46,XX หรอ XX,rob(14q21q),+21 ● t(21:21)(q10:q10) (G/G translocation) chr.21 เกด Robertsonian translocation กนเอง,

gamete ทมารวมกนได chr.21 ปกตคกบ chr.21+21 ∴ ได 3 long arms ของ chr.21 - การเกด t(21:21) ไดแสดงวาพอหรอแมตองให gamete ซงเปน carrier ของ t(21:21) มา (ม chr.21+21 ม

chr. เดยวกปกต) เขาคนนนกตองเปน carrier ของ t(21:21) ดวย (ม chr.21+21 อย) - คนทเกด t(21:21) จะสราง gamete ได 2 แบบคอ 1) gamete ทม rob(21:21) อย หรอ

2) ไมม chr.21 เลย ถาได gamete ทม t(21:21) อย เดกกจะเปน trisomy 21 ถาได gamete ทไมม chr.21 กจะเปน monosomy 21

ซงจะไมรอด ∴ ถาพอหรอแมเกด t(21:21) ขน โอกาสทจะไดลกเปน Down’s syndrome = 100% - Inversion and Ring chromosome: เกด breakage ของ chromosome บน chromosome เดยวกน ● ถาเกด break ทง short arm & long arm แลวมการกลบดาน (180°) ของชน chromosome เฉพาะตรง

สวนปลายท break ไปกลบมาตอใหม = Paracentric inversion ● ถาเกด break ท arm ขางเดยว แลวมการกลบกนของชน chromosome = Pericentric translocation

(ครอม centromere ดวย) ● ถาเกด break ท short arm & long arm แตสวนปลายท break ไปเกด lost, breakage point ของ

ชนสวน chromosome ทเหลออยจะมา reunion กน เกดเปน Ring chromosome - Meiosis in chromosomal inversion form loop (ในระยะ prophase I), แลวเกด crossing over ใน

loop !! ● crossing over ใน loop ของ paracentric inversion เกด dicentric & acentric chromosomes ● crossing over ใน loop ของ pericentric inversion เกด partial monosomy & partial trisomy

(ex. A-B·C-A trisomy A & monosomy D, D-B·C-D trisomy D & monosomy A; chromosome หนงจะม short arm หายไป, long arm เกน อก chromosome หนงกตรงขาม)

 TOP  SI 117 

- Genomic imprinting: phenotype ทเราเหนเกดขนเนองจากความผดปกต/mutation ซงจาเพาะวา mutant นนไดรบมาจากใคร !! แสดงวาไมไดทางานเสมอทง 2 genes ทางานเพยง gene เดยวขนกบวามาจากพอหรอแม อก gene หนงทมาจากพอหรอแมมการปด switch (ไมทางาน) คานหลกการของ autosomal inheritance

** ex. ม gene F กบ M; chromosome ทไดรบมาจากพอ gene F จะทางาน สวน chromosome ทไดรบมาจากแม gene M จะทางาน phenotype ปกต !!; ถา chromosome นนจากพอม deletion ทาใหตาแหนงทม gene F & M หายไป ลกกจะเหลอ gene M จากแมเทานน, ในทางตรงขามกเชนเดยวกน พอ/แม เกด deletion ทเดยวกนเหมอนกน ถายทอดใหลก ไดอาการไมเหมอนกน เปนคนละโรค (ex. Prader-Willi syndrome เกดจาก

deletion บน chr.15 ทไดรบจากพอ, Angelman syndrome เกดจาก deletion บน chr.15 ทตาแหนงเดยวกน

แตไดมาจากแม) - Uniparental disomy: เกดความผดปกตแบบ genomic imprinting แตเกดจากการไดรบ chr. มาจากพอหรอ

แมเพยงอยางเดยว (สาเหตนกทาใหเปน Prader-Willi หรอ Angelman syndrome ได) สาเหตมาจาก

1) Trisomic rescue: gamete แมม nondisjunction พอ fertilize แลวได trisomy แลวเกดภาวะททาให allele หนงหายไปกลบมาเปนปกต ถา allele แมหายไป กจะปกตด แตถา allele พอหายไป กจะมทง 2 alleles มาจากแม

2) Monosomic rescue: gamete แมไมม allele นนเลย, gamete พอม 1 allele ปกต, พอ fertilize แลวได monosomy, ตอมามเหตการณททาใหเกด duplication เกดขนเปน 2 alleles ซงมาพอ

Genetic Linkage - Mendel’s law: I – Gene is the basic unit of heredity II – Homologous alleles segregate at meiosis to different gametes III – Non-homologous alleles assort independently (ยกเวนม tight linkage) - Synteny: gene ทอยบน chromosome เดยวกน = syntenic gene allele ของ 2 genes ทอยบน chromosome เดยวกน = syntenic allele ** ∴ syntenic allele จะไมเปน homologous allele เดดขาด (เพราะตองเปน allele ของคนละ gene กน) และ

homologous allele ตองอยบนคนละ chromosome กน (สรป: syntenic = chromosome เดยวกน คนละ gene; homologous = gene เดยวกน คนละ chromosome) - Linkage (เปนขอยกเวนของ Mendel’s law ขอท 3): 2 genes ทถายทอดไปดวยกนใน meiosis บอยครงกวาไม

ถายทอดไปดวยกน - การไมถายทอดไปดวยกน เปนผลของปรากฏการณทเรยกวา recombination (crossing over) ● ถาเกด recombination: syntenic gene จะไมถายทอดไปดวยกน ได recombinant product (เดม A อยบ

1 แต product ได A อยกบ 2 แทน) ● ถาไมเกด recombination: syntenic gene จะถายทอดไปดวยกน ได non-recombinant product - ถายงถายทอดไปดวยกนบอยครงมาก = ม tight linkage - ถา 2 genes ทอยใกลกนบน chromosome เดยวกน ไม link กนเลย (unlinked) โอกาสทจะเกด

recombination ระหวาง 2 loci เปนไปอยาง random (โอกาสทจะได recombinant : non-recombinant = 1:1)

- ถา 2 genes ทอยใกลกนบน chromosome เดยวกน link กน โอกาสทจะเกด recombination นอยมาก (ex. โอกาสได recombinant : non-recombinant = 1:10)

- ยง gene อยใกลกนมาก กยงมโอกาสทจะ link กนมาก (the closer 2 genes are from each other, the more likely that they are linked)

** เวลาพดวา link เราพดเปน locus (ไมไดพดเปน allele) - syntenic gene ทอยคนละ arm กน ไม linked แนนอน !! ** syntenic gene ไมจาเปนตอง linked กน (syntenic loci are not always linked) แต gene ทจะ linked กนตองเปน syntenic gene เทานน !! - ทกๆ homologous chromosome pair ใน meiosis จะม crossing over (recombination) เกดขนเสมอ โดย

เฉลย 1-3 chiasmata ตอ 1 chromosome

 TOP  SI 117 

- recombination เกดบนตาแหนงทเฉพาะ (ไม random) = recombination hot spot ∴ ถาเราร gene map บน chromosome จะบอกไดวา gene ไหนนาจะ link กบ gene ไหนบอยแคไหน เพราะเรารวา recombination ชอบเกดตรงไหน

- gene อาจอยใกลอยกน แตถาเกด recombination ระหวางคนนบอยมาก unlinked gene คหนงอาจอยหางกนกวา แตแทบไมพบ recombination เกดระหวางคนนเลย tight linkage ** linkage เปนปจจยของ recombination นนเอง !! (ผกผนกน) - Informativeness: ในการทจะทานาย genotype ของ gamete โดยอาศยขอมลเกยวกบ linkage & genotype

ของเซลลพอแม เราจะทานายไดโดยละเอยดตอเมอบคคลตงตนม genotype เปน heterozygote (ด product กจะรวาม recombination หรอเปลา)

- ถาบคคลตงตนเปน homozygote เราจะแยก recombinant ออกจาก non-recombinant ไมได - ประโยชนของ linkage คอใชทานายบคคลวาจะ “เปนโรค” หรอไม เวลาเราตด marker กจะตองตดท gene ซง link

กบ gene ททาใหเกดโรค & เปน heterozygote ในบคคลตงตน ถาตรวจพบ gene ทเปน marker ใน product กแสดงวาเปนโรค

** ex. ม mutation ททาใหเกด ADPKD, gene น link กบ gene A กบ gene c, ถาบคคลตงตนม A เปน

heterozygote (Aa) แลว gene ท mutant ม linkage กบ A (สวน gene บน chromosome อกแทงหนงคอ a กม linkage กบ gene ทไมได mutant), เราตด marker ท A ไว ถา product ออกมาพบ A แสดงวาเปนโรค

เพราะ A ตองไปกบ ADPKD, ถาบคคลตงตนม c เปน homozygote (cc) แลวเราไปตด marker ท c เราจะไมรวาเปนโรคหรอไม (เพราะ chromosome ทม c อาจตดมากบ gene ท mutant หรอไมกได) partially informative

- Overcoming problems of informativeness 1. เลอกใช DNA marker ทม polymorphisms มาก microsatellite marker (dinucleotide repeats,

CA repeats) (ม polymorphisms คอนขางมาก ม allele จานวนมาก คนแตละคนไมคอยเหมอนกน กจะไม

เกดปญหาเรอง homozygote ทจะเหมอนกนทง 2 alleles) ** ถาม marker อยางนมากๆ = ม marker haplotype 2. ใช > 1 marker (use of multiple tandemly located marker loci) (marker อยเรยงกนเปนชด แตละ

marker polymorphic หมดเลย สามารถแยกซาย-ขวาไดทกตาแหนง และ gene ทเราสนใจ อยตรงกลาง

ระหวาง marker เหลานนพอด) เพอกนการเกด recombination กลบไป-มา 3. ใช flanking markers (ขนาบขาง) จากทง 3’ & 5’ ends ของ gene, ยงดใหญถาม marker ซอนอยใน

gene เอง = intragenic markers (ex. microsatellite ทซอนอยใน intron) กจะเพม informativeness ** สรปวธแกปญหาเรอง informativeness: ใช marker ทม polymorphisms มาก (ex. CA repeats), ใช

หลายๆ markers ซง polymorphic หมด อยขนาบขาง gene, ยงอยใน gene เองไดยงด (ex. ใน intron) - Haplotype: set of alleles (markers) ทอยบน syntenic genetic loci, ใชสาหรบตดตาม pattern ของ

การสงผาน disease gene เมอรวา haplotype ใดท linked กบ mutant allele - Measuring linkage: ใช lod score (Z, logarithm of odds)

( = recombination fraction)

- การหา lod score เปนการหา probability (likelihood) วาลกษณะ 2 อยางทถายทอดในครอบครว นาจะเกด

จาก gene ม linkage กน มากกวา เกดโดยบงเอญ (ไม link) มากนอยเพยงใด? - recombination fraction = ระยะหางระหวาง gene 2 ตาแหนง (ระหวาง loci) - lod score ขนอยกบ recombination fraction (θ) วา 2 loci อยหางกนมากขนาดไหน - ถา lod score > 3 (โอกาส link สงกวาไม link ถง 1,000 เทา) significant linkage - ถา lod score < 0 (โอกาส link นอยกวา) no linkage ** ปกตถา lod score ได 0 โอกาส link กบ unlink เทากน - Linkage phases: ถา 2 genes ถายทอดไปดวยกนโดยม linkage (เปนเงอนไข), alleles ของ gene ทง 2 จะม

linkage phase ได 2 แบบ 1. Linkage in coupling: allele อยบน chromosome เดยวกนแลวถายทอดไปดวยกน (transmitted with; syntenic; cis) 2. Linkage in repulsion: allele อยบนคนละ chromosome กน แลวจะถายทอดไมไปดวยกนเสมอ (transmitted opposite to; trans)

 TOP  SI 117 

** ex. กาหนด 2 genes ม linkage ซงกนและกน allele ของ gene บน ม A กบ B allele ของ gene ลาง ม 1 กบ 2 “A กบ 1” หรอ “B กบ 2” อยใน coupling phase (เราสนใจ, ใชทานายอก allele หนง) “A กบ 2” หรอ “B กบ 1” อยใน repulsion phase (ถาเจอ A มกจะไมเจอ 2, ถาเจอ B มกจะไมเจอ 1 แต “A กบ 2” หรอ “B กบ 1” กเรยกวา “link กน” แตมนอย

บน chromosome คนละขางกน จงถายทอดไมไปดวยกน, ถา gene ไม link กนจะไมม linkage phase) ** Linkage เปนปรากฏการณระหวาง Locus Linkage phase เปนปรากฏการณระหวาง Allele (ของ locus ท link กน) - Linkage (Genetic) map: เขยนแผนภาพวา gene อยหางกนมากนอยแคไหน โดยระยะหางของมนคอโอกาสเกด

recombination (ถาอยหางกนมาก กแสดงวาโอกาสเกด recombination ระหวาง 2 genes มาก !!) ** ถาแสดงระยะหางระหวาง gene โดยระบระยะหางเปน base pairs physical map - linkage map กบ physical map ไมเหมอนกน ขนอยกบวา recombination hot spot อยตรงไหน: ถา 2

genes อยครอมระหวาง recombination hot spot (ตาแหนงเฉพาะทจะเกด recombination) จะอยหางกนมากใน linkage map ทงๆ ท physical map อาจจะเทากบ genes อกคหนงซงอยในบรเวณทเปน recombination poor spot

- ในอดต เวลาหาเราหาวา gene อยทไหนบน chromosome เราไมสามารถไป sequence ได จงใชวธผสมพนธสงมชวตแลวดการถายทอดของ allele เพอบอกวา gene ไหนอยใกล gene ไหนมากกวา ดงนนในสมยกอนเราได linkage map มากอน ยงระยะหางมาก กยงแสดงวาโอกาสเกด recombination มาก

- ระยะหางระหวาง gene บน linkage map วดเปนหนวย centiMorgan (cM) - 1 cM = 1% recombination frequency (ใน 100 ครงจะเกด recombination 1 ครง) - 1 cM มกจะเปนระยะหางใน physical map ≈ 1 Mb (1 ลานเบส) กลาวโดยงาย “ม recombination เกด 1

ครงใน ≈ 1 ลาน bp ในทกๆ 100 meiosis” ** จรงๆ แลว cM เอาไปเทยบเปน bp ไมได - Use of linkage analysis: 1. Use of known linkage: ใชทานายการเปนโรคในสมาชกครอบครว โดยเฉพาะในกรณทเราไมสามารถตรวจหา

mutation โดยตรงทตาแหนง gene ได (genomic sequence is not known) วนจฉยโรคกอนมอาการ

(presymptomatic detection)/วนจฉยโรคกอนคลอด (prenatal diagnosis) 2. Use of unknown linkage: ใชคนหาตาแหนง disease gene (gene discovery by genome wide scan) ** ex. ถา mutant allele ของ disease gene (ex. ADPKD) พบเหนวาจะ link กบ allele A แลว กจะใช allele A

ตดตามวาคนใน generation อนๆ จะเปนโรคหรอไม ถาได A มากจะทานายวาเปนโรค ถาได a มากทานายวาไมเปนโรค ถา linkage น 90% กแสดงวาเรามโอกาสทานายผด 10% (∴ การทานายการเปนโรคโดยใช linkage เปนการ

บอก probability ไมไดบอก definite เพราะไมไดไปหา mutation โดยตรง) ถาจะไมใหทายผด เรากตองเลอก

marker ท link อยาง tight หรอ 2 markers ท flank บน 1 – ลาง 1 - ขอดอยของการทานายโรคจาก linkage analysis คอ เราตองม samples จากคนหลายๆ คนในครอบครวทงทเปน

โรค & ไมเปนโรค, การทานายไม definitive (ไม 100%), แตกมขอดคอไมตองไปเสยเวลาหา mutation ใน

disease gene (ถาเราม marker อยแลว ไมนานกจะรจากการเจาะเลอดของคนในครอบครวมาตรวจ) ** วเคราะหการเกด ADPKD จาก gene PKD1 เราเลอก markers ทมาจากรอบๆ gene PKD1 จะตองม

haplotype ทจาเพาะ (specific haplotype) ทถายทอดจากคนทเปนโรคลงไปใหทกคนทเปนโรค และไมไดถายทอด

ไปใหกบคนทไมเปนโรค - Linkage mapping of disease gene: ถาเราทราบวา gene ใด link กบ marker ใด เราสามารถใช marker

นนมาทานายการเปนโรคได, ในทางตรงขาม ถาเรายงไมรวา disease gene อยทไหน เราสามารถเลอกหลายๆ

markers แลวมาทดสอบหาตาแหนงของ disease gene ไดโดยหา genotype ในครอบครวขนาดใหญๆ - Positional mapping of a disease gene: หา disease gene โดยการทา linkage study สมมตเราไมร

วา disease gene อยทไหน แตรวามโรคโรคหนงเปนโรคพนธกรรม gene เดยวถายทอดแบบ AD แลวเรามเลอดจากคนมาสกด DNA เรากสามารถใช polymorphic markers ทกระจดกระจายอยเปนระยะในทกๆ

chromosome, แตละ chromosome เลอกมา ≈ 10-15 markers, ทงหมด 22 chromosomes กม ≈ 400 markers เรากทา PCR 400 ครง แลวเอาผลมาดวา marker บน chromosome ไหนทมลกษณะของการ

 TOP  SI 117 

- Whole genome scan (Genome wide scan): scan ทง genome เพอหาตาแหนงวา disease gene อยทไหน

(เอาไปทา positional mapping of disease gene)

Human Gene Mapping - gene mapping เปนกระบวนการหาตาแหนงวา gene อยทใดใน human genome - mapping เปน pre-requisite (เกดมากอน, ใหรวามก exon, ก intron, ตรงไหนเปน 5’UTR, ตรงไหนเปน

3’UTR) กอนทจะทาการคนหาองคประกอบของ gene = cloning สวนมากเปนการเพมจานวน gene ในสงมชวตอนเพอเอามาศกษารายละเอยด

** ตอง map กอนถงจะเอามา clone ได - เมอกอนเราทา genetic mapping (linkage mapping) = หาตาแหนงของ gene วาอยบน chromosome ใดแลว

อยใกล/ไกลกบ DNA marker ทเราทราบตาแหนงมากนอยแคไหน โดยบอกระยะเปน linkage distance (cM) เปนโอกาสทจะเกด recombination ระหวาง 2 ตาแหนง ถาหางนอยกจะเปน tight linkage

- ปจจบน อยากบอกตาแหนงของ disease gene บน physical mapping (บอกเปน bp อยางชดเจนวาหางจาก

centromere/telomere เทาไร, หางจาก gene X ไปทาง upstream เทาไร) - ปจจบน HGP เสรจสน เราจะบอกตาแหนงใน physical map !! - Physical map: บอก absolute distance เปน base pair unit อยางชดเจน; ex. gene A อย upstream

จาก gene B ไป 3 Mb, gene B อย upstream จาก gene C ไป 8 Mb สรปไดวา gene A อย upstream จาก gene C ไป 11 Mb

** 1 band (จาก banding) จะม DNA ทบซอนกนอยแนน ≈ 1.6 Mb - Linkage map: บอก relative distance เปน centiMorgan (cM) (%recombination); ex. gene A อย

หางจาก gene B ไป 3 cM, gene B อยหางจาก gene C ไป 8 cM แปลวาถาม meiosis เกดขน 100 ครง allele A กบ B จะถายทอดไปดวยกน 97 ครงและม recombination เกดขน (ไมถายทอดไปดวยกน) 3 ครง

** ภาพทได อาจเรยงเปน gene A B C หรอเปน B A C กได เพราะการบอกระยะเปน cM นนจะไมสามารถบอกไดวาอยซายหรอขวาของกนและกน (ระบ upstream/downstream แบบ physical map ไมได !!)

- Restriction map: ระบไวอยางชดเจนวาจะมตาแหนงบนสาย DNA ทถกตดไดดวย restriction enz. อะไรบาง ทตาแหนงใดบาง (ex. บอกไดวาถาเอา EcoRI ตด chromosome นจะไดก fragment)

- Contig map: เกดจากกระบวนการหา gene วาอยทไหน โดยการตด DNA เปนชนยอยๆ แตละชนจะ overlap กนอยเลกนอย (overlapping contig) เรยกแตละชนวา contig (เอามาทาเปน map ของชนยอยๆ ได)

- Cytogenetic map: ระบชอ gene ลงไปบน band ของ chromosome (วา gene ใดอยบน region ใด band ใด

subband ใด) - Unigene map: map ของกลม gene ทอยในฐานขอมลท unique = ม sequence ซงไมซากบ gene อน - Radiation hybrid map: map ทเกดจากการทา hybrid cell ระหวางเซลลหนกบมนษย - Comparative map: map ทเปรยบเทยบสงมชวตหลายชนดบน chromosome region ท homologous กน - SNP map: แสดงตาแหนงของ SNP บน human genome ในแตละ region - Multiple map alignment: ปจจบนเราสามารถเอาทกๆ map ทมอยมาวางเทยบกนใหรวาในแตละ map ม

ตาแหนงเทยบกบ physical map แลวเปนอยางไร - Mapping tools: เราสามารถ map gene ไดหลายวธ อาจ map โดย somatic cell hybrid, radiation

hybrid, ทา genomic DNA library, FISH, ตรวจพบผปวยทม unbalanced karyotype etc. - Genome from patients with an unbalanced karyotype: ex. ถาวด enz. X ในคนปกตมคา = 2

หนวย/cc แตวดในเดกทเปน Down’s syndrome เฉลยมคา = 3 หนวย/cc ∴ gene ท code enz. X นาจะอยบน chr.21 (ratio ของ enz. จะเปน 3/2 เทาของคนปกต) เอามาใช map ได !! = dosage mapping

 TOP  SI 117 

- FISH: ผปวยม t(14q:21q) แลวเราร sequence บางสวนของ gene หนงๆ ทา FISH ถาพบวา signal บน chromosome ทม translocation ขยบไปอยอก chromosome หนง รวา gene นนมตาแหนงอยท translocation breakpoint เอามาใช map ได !!

- ในอดตกจะมการรายงานผปวยทง balanced & unbalanced translocation เปนขมสมบตทใชศกษาวา gene ทอยบน chromosome นนอยตรงไหน โดยทา FISH ไปบน metaphase chromosome ของผปวยเหลานน เพอดวาอยใกล/ไกล translocation breakpoint

- Somatic cell hybrid: ● เอา somatic cell ของหน (rodent) กบ somatic cell ของมนษยมาเพาะเลยงในจานเพาะเลยงเดยวกน ● ใสสารกระตนใหเกดการ fusion = polyethylene glycol (PEG) เกด 1 cell ม 2 nuclei ของหน &

มนษย = heterokaryon ● subclone heterokaryon ไปเรอยๆ เกดเซลลลกหลาย cell line ขน แตละ line จะ stable, แตละ line

จะ maintain chromosome ของหน & สละ chromosome ของมนษยไมเหมอนกน (random) ● end-up ดวย panel ของ cell ทแตละ cell จะม chromosome ของมนษยหลงเหลออยตาง chromosome

กน !! ● เมอม panel ลกษณะนมากเพยงพอ (ปกตใช ≈ 7-9 cells แตละ cell ม ≈ 3-5 chromosomes) เราจะ

สามารถ map ตาแหนงของ gene ไดหมด วาอยบน chromosome ใดกนแน โดยด pattern ของ positive cell

** ex. ทา FISH แลวดวามจดเรองแสงบน cell ไหนบาง บอกวา gene อยบน chromosome ไหน (ดวาใน

cell panel ทเรองแสงทงหมด chr. ไหนใน panel เหลานนท intersect กน) - Radiation cell hybrid: เหมอน somatic cell hybrid แตทาใหเกด fusion โดยใช X-ray (ไมไดใช PEG) กจะ

เกด chromosome break chromosome มนษยกจะมการฉกขาดหลดไป เหลอไวบางบาง chromosome แต chromosome หนจะมความทนมากกวา กจะคางย เรากจะได cell panel มาทา gene mapping

- Library: genome ทงหมด เอามาหนเปนชนเลกๆ ชนละ 200-500 bp แลวเชอมชนเหลานนเขา vector แลว

subclone เกบเอาไว (กบ bact.) ได contig library; วธการ

1) ใช rare cutter (restriction enz. ทตดหางๆ) > 1 ชนด แตละชนดตดคนละทกน เกดชนสวนท overlap ขน

** ควบคม Ξ โดย (1) จากดปรมาณ enz. ไมใหมากจนตดทกตาแหนงทตดได จะใหเลอกตดบางตาแหนงทใกลมนเทานน (2) หยด Ξ ดวยความรอน (denaturate enz.) เกดชนแตละชนเรยงกนเปนขนบนได = contig 2) เราเอาแตละชนไป subclone เขาใน vector โดยเอา solution ทม contig ผสมเขากบ vector (1 vector ก

จะเชอมกบ 1 contig) แลวไป plate บน plettydish แลวมนกจะงอกเปน colony ของ bacteria แตละ colony จะม 1 contig แลวแยกแตละ colony ไปเกบไว

** library กจะประกอบดวยเปนหมน/แสน colony - library อาจจะมาจากอะไรกได อยทวาเราอยากไดอะไร: เอาจากเลอดมนษย, หน, cDNA จากสมอง (ได human

brain cDNA library) - Disease gene mapping: วธทใช ไดแก conventional, candidate, positional, positional candidate - Conventional gene mapping: dosage, hybrid cell mapping, mapping using unbalanced karyote - Candidiate gene mapping: การหา disease gene โดยอาศยความร!! วาโรคทเราสนใจนาจะเกดจากความ

ผดปกตของโมเลกลใด เรากไปเลอก gene ทเกยวของกบ molecule นนมาทดสอบ โดยไปหา mutation ในผปวยทเปนโรคนน

* ex. คดกอนวา osteoporosis คดวาเกยวกบอะไรบาง (vit.D, estrogen, metabolism of Ca2+) ตงสมมตฐาน gene กอโรคกระดกอาจเปน vit.D receptor แลวมาตรวจ ถาตรวจเจอ mutation ตรงไหนในคนทเปน & ไมเจอในคนทไมเปน gene vit.D receptor (candidate gene) นเปน disease gene สาคญ 1 gene ทกอใหเกด osteoporosis (ม significance)

(แตถาตรวจเจอ mutation ทงในคนทเปน & ไมเปน osteoporosis gene นไมนาเปน gene สาคญทกอใหเกด

osteoporosis) - Pro: make sense (sensible way) แปลผลงาย คอนขางถก (ไมตองเหวยงแหมาก, test สก 2-3 genes ทเรา

สนใจ)

 TOP  SI 117 

- Con: เราตองตงสมมตฐาน (ตองรกอนวาโรคนนเกยวของกบอะไร) ex. โรคโรคหนง ตาบอด 1 ขาง ปากแหวง, นวดวน, & ขากดขางเดยวกน และปญญาออน แลวเปนทงครอบครว เรากไมรวาเราจะ candidate อะไร ใช candidate gene ไมได ! (งมหาไปหลาย 10 genes แลวอาจยงไม mutation เลย)

- Positional gene mapping: การใชความรเกยวกบ linkage มาหาตาแหนงของ gene ทาโดย 1) ทา linakge study: รวบรวมสมาชกในครอบครวหลายคนทงเปนโรค & ไมเปนโรค (หลายครอบครวยงด) เจาะ

เลอดทกคน (ex. 60 คนจาก 6 ครอบครวๆ ละ 10 คน) มา extract DNA แลวใช polymorphic DNA marker ทกระจายอยเปนระยะๆ บนทกๆ chromosomes (รวมกนได ≈ 400 markers) แตละ marker ของคน 1 คนกจะทา PCR 1 ครง

2) ดวา allele ของ marker วา marker ใดถายทอดจากคนทเปนโรคไปใหคนทเปนโรคแลวถายทอดตอไปใหคนทเปนโรคอกเสมอ แลวจะไมถายทอดไปใหคนทไมเปนโรค disease gene ตองหลบซอนอยระหวาง marker เหลานน

** เราตองม marker ท polymorphic แยก heterozygote ออกจากกนได (informativeness) - พอเราได marker แลว เราจะกสงซอ contig จาก region บรเวณระหวาง marker นถงน เขากจะบอกวามก

contig, ม map อยางไร, แลวจะสงหลอดทบรรจแตละ contig/หลอด (มหลอดตามจานวน contig ทบรษทเขาม) มาใหเรา เรากเอาหลอดมาสกด DNA, หลงจากนนเรากทา genetic mapping ใหมซงวธทา fine mapping (contig mapping) นกทาไดหลายวธ วธหนงคอ chromosome walking (เดนบน chr. ทละ contig ไปเรอยๆ

จนกวาจะเจอ gene) - Chromosome walking: ● เอา contig ซายสดมาหา SNP (ไมตองหาเอง เอา contig ไปใสในฐานขอมล กจะบอกวาม SNP อยตรงไหน

บาง) ซงเปน polymorphism ทม 2 alleles (biallelic) ● เอาไป genotype บนคน 60 คน (สมมต) อกรอบหนง ดวาทกคนทเปนโรคเปน allele (ของ SNP) เดยวกน

หรอไม ● ถาไมใชแปลวา contig นไมนาใช contig ทเราหา เรากเอา sequence ของปลายดานขวาของ contig ซายสดน

ไป hybridize ดวาหลอดตอไปคอหลอดไหน !! (เหตผลทตองทาให overlap กน) แลวกหา SNP ใหม ทาอยางนไปเรอยๆ จนเจอวา polymorphism นจะถายทอดไปกบโรคเสมอในคนไขทกคนในครอบครว !! ได contig ทสนใจแลวกเอาไป sequence

- วธรวาเจอ gene แลวกมหลายวธ ททาบอยคอ 1) การพบ promoter (พบ sequence ทเปน G-C rich), CAAT box, TATA box รวาตรงนตองเปนสวน

ตนของ gene แนนอน 2) เจอ consensus splice site บอกไดวาตรงนเปน intron-exon boundary 3) เทยบกบ EST map sequence นโผลขนมาใน expressed sequence library ∴ ตองเปนสวนของ

gene

- เมอไรเจอ gene แลวกตอง clone ออกมาวา exon, intron อยตรงไหน แลวเอา sequence กลบไปทดสอบวาตรวจพบ mutation ในผปวยตงตนหรอเปลา ! เจอจรงๆ confirm วาเราเจอ disease gene ทแนนอนแลว !!

- Positional candidate gene mapping: ทาเหมอน positional gene mapping (มครอบครวผปวย, ทา linkage study, ได region) แตพอได region แลวเราไมตองทา contig แลว เราเอา region นนไปคนบนฐานขอมล HGP วาระหวาง marker นถงน ม gene ททราบแลวก gene แลวดแตละ gene, limit ไปวาจะขอดเฉพาะ gene ทเกยวกบอวยวะทเราสนใจเทานน (candidate gene) แลวเอา sequence ของ gene เหลานนมา test ไดทนทวาผปวยของเราม mutation หรอไม

(เลอก gene ไดเลย ไมตอง walking ไปเรอยๆ หา SNP เพอด allele ทถายทอดตลอด แลวเอา contig ทเจอนนไป sequence หา gene เอง)

** Positional candidate gene mapping เปนวธหลกในปจจบนทใชหาตาแหนง disease gene เพราะทาไดดมากหลงจาก HGP เสรจสนแลว

Human Genome Project (HGP) - เปนความรวมมอระหวางชาตในการ sequence human genome ทงหมด (3×109 bp) โดยแบงกน sequence ท

20 สถาบนใน 6 ประเทศ; เรมตนป ค.ศ.1990 (กะวาจะเสรจในป ค.ศ.2003)

 TOP  SI 117 

- draft sequence เสรจ & ประกาศไดตงแตป ค.ศ.2000 - reference genome จะมาจากการ sequence คนหลายสบคน แลวเอา consensus sequence มา report วา

นคอ reference genome - จดประสงคเพอ identify human gene ทงหมด, อานรหสทงหมด (ทง gene & ไมใช gene) แลวเกบขอมลไวใน

database เพอใชคนหา disease gene & ศกษา human genome ในอนาคต, วจย คนหา สรปประเดนทอาจเปน

ขอพจารณาในดานจรยธรรม กฎหมาย และสงคมเกยวกบการใชขอมลเหลาน ** ปจจบน ไมสามารถจดลขสทธรหสพนธกรรม/mutation ได จดไดแตวธการตรวจ ! - วธการศกษา HGP: คลายๆ cloning แตเขาไมไดทา linkage, เขาตดแบง human genome เปน contig แลว

sequence เรอยๆ ทละ contig แลวเอาขอมลใสเขาไปใน database - บรษทเอกชน celera genomic (บอกวาทาไดเรวกวา HGP consortium) โดยใชวธ shortgun sequencing =

แทนทจะ sequence contig ท 1 แลวกไปหาวาซอนกบชนไหน เอา contig ท 2 มา sequence ทาไปเรอยๆ, บรษทนกตดมนเปนชนยอยๆ 3 ลานชน เอาใสเขาไปในเครอง sequencer 2,000 เครอง เอาผลผลตทไดเอาไปให computer เรยง sequence ให (computer จะอานวาตรงปลายเหมอนตรงเรมตนชนไหนใน 3 ลานชน เอามาจบ

เรยงตอกน) - บรษท celera พสจนวธนโดย sequence Hemophilus influenzae, ทาเสรจภายใน 6 เดอน แลวก sequence

E.coli & สงมชวตทใหญขนเลกนอย ใชเวลาไมนาน ภายใน 3 ป บรษท celera ก sequence human genome เสรจ !! (ในขณะท international consortium กเดมตวมเตยมไปทละ contig จนจะปท 10 แลว)

- celera & international consortium กตกลงทจะประกาศ draft sequence รวมกน (เพราะ celera ทใช database ตงตนจาก international consortium ทวางโครงไว แต sequence มาจาก celera)

- ตามทฤษฎแลว international consortium (build ไปบน chromosome walk) นาเชอถอมากกวา (99%) celera (ใช computer; นาเชอถอ 95-97%)

- ในป 2001 จรงๆ แลว database กยงไมสมบรณ คอตรงสวนทอยใกลๆ telomere & ใกล centromere ไมเสรจสน เพราะเปน repetitive DNA อานยากมาก

- Impact of the HPG: ● บน database จะเตมไปดวย sequence of all genetic information, both gene and non-gene

Refseq (reference sequence) ซงประกอบดวย sequence ของ genetic information เกอบทกทของ genome จะบอกวาเปนสายบวก สายลบ, หางจาก centromere ก bp, ม polymorphism อยางไร

● ม maps & landmarks บน genome ● ม expressed sequence วาอนไหน express แยก gene ออกจาก pseudogene ไดอยางชดเจน

(unigene, EST) ● ม DNA markers ใชในการ map gene อนๆ ทยงไมรได ● ม SNP ม variation, ขนอยกบแตละชนชาต, พสจนประวตวาคนไทยอพยพมาจากไหน (ม SNP ท share

กบคนแถบจนตอนใต + mix เขากบคน local เลกนอย) - จาก HGP ทาใหปจจบนเรารวา genome & gene ไมใชสงทสาคญทสดททาใหเราตางจากสตวอนๆ (เพราะ

genome ของเราไมตางจากหนเทาไรเลย) - complexity (สงทอธบายวาทาไมเราตางจากสงมชวตอน) ของ human genome ไมไดอยท genetic level แลว

แตอยท protein = proteomics & อยท mRNA = transcriptomics - variation ของ transcriptome & protein เปนสงทอธบาย diversity (speciation) - HGP ยงนาไปสการศกษา animal models & directed metagenesis (ทดลองทาใหเกด mutation ขนใน

สตวทดลอง ดวาจะเปนโรคอะไร) - การศกษา SNP จะชวยบอก evolution: บอกววฒนาการและการอพยพวาเรามาจากไหน เปนใคร สมพนธกบใคร - polymorphism จานวนมากจาก HGP ใชศกษาความเสยงในการเกด multifactorial disorders (ไมสามารถใช

linkage study ศกษาไดปกต เพราะเกยวกบสงแวดลอม ถาทากเปน negative หมด, lod score ตาๆ) - ในอนาคต การร mutation จะนาไปส gene therapy ** gene therapy = การเปลยนถาย gene โดยแกไข sequence, แตยคของการรกษาในปจจบน เปน gene-

based therapy = การรกษาโดยใช sequence information (ไมใช gene therapy) ** gene therapy มปญหาอยทวา foreign gene ไมสามารถอยไดนาน รกษาไดเพยงระยะสนๆ

 TOP  SI 117 

- HGP ใชใน genetic testings, predict โรควาจะเปน/ไมเปน ปลอดภยหรอไม นาไปสการทา preventive medicine หรอ gene-based therapy ตอไป

Multifactorial Diseases (Complex Disorders) - เปนโรคทเกดจากปจจยทาง environmental & polygenic (ม > 1 gene) รวมกน ** แตละ gene กไมจาเปน/ไมเพยงพอทจะทาใหเกดโรค = not sufficient, nor necessary ไมจาเปน สมมตม 10 genes, คนอาจจะเกดโรคนโดยไมไดม mutation ใน gene A กได ไมเพยงพอ ถงม mutation ใน gene A อยางเดยว กไมทาใหเกดโรคน - จาเปนตองมการเปลยนแปลงของกรรมพนธ > 1 ตาแหนง (ถามหลายตาแหนง กไมจาเปนตองเปลยนแปลงทก

ตาแหนง) แลวกยงอาจไมเพยงพอ ยงตองมสงแวดลอมดวย

- ลกษณะทควบคมดวยกรรมพนธหลายๆ ตาแหนง = polygenic trait ** Polygenic trait ≠ Multifactorial trait เพราะ multifactorial trait ตองมปจจยแวดลอมดวย !! - แตละกรรมพนธกจะม contribution มอทธพลทจะทาใหเกด phenotype นนมากนอยแคไหน (ซงแตละ gene

มกม contribution ไมมากนก อาจ 5% หรอ 10%) ** ไมเหมอน single-gene disorder ท gene จะม contribution เกอบ 100% (ม mutation กเกดโรค) - proportion of genetic component (∑contribution) = heritability (H) (ถาคาสง กแสดงวาอทธพลทาง

กรรมพนธมความสาคญมากกวา) - ถาม 3 loci แตละ loci มได 2 alleles กจะม genotype ได 9 แบบ - จานวน/ความแตกตางของ phenotype จะมากขนตามชนดของ allele ทแตละ locus มได และจานวน loci ท

ควบคม phenotype นน ∴ multifactorial trait เกอบทงหมด จงลกษณะการกระจายของ trait ในประชากรเปน bell-shaped curve = Gaussian distribution (majority ของมนษยกจะม phenotype อยตรงกลาง = อยใน norm)

(norm = สงทสงคมกาหนดวาเปนมาตรฐานทคนสวนมากเปน) - polygenic trait จะเปน Gaussian distribution เสมอ !! ** trait ใดกตามทไมสามารถ distribute เปน Gaussian distribution ไดจะไมใช polygenic trait - multifactorial หรอ polygenic trait ไมจาเปนตองวดไดอยางชดเจน (ex. ระดบความเครยดของมนษย) แต

จะตองเปนทเขาใจตรงกนวาในประชากรจะมความหลากหลายมากใน trait นน ● ถาวดได (ออกมาเปนตวเลข ex. IQ) = quantitative trait - threshold เปน cut-off value (ถาเกน ตางไปจาก norm) = ตาแหนงบอกวา heritability (genetic

factor) มมากเพยงพอ & environmental factor กมมากเพยงพอท trait (กรณนหมายถงโรค) จะ develop - ถาม threshold ทสงกมกจะม threshold ทตาอยดวยเสมอ ตองเรยกวาเปนโรคดวย (ex. ผทมบตรยากเปน

โรค กตองใหคนทมลกดกเปนโรคดวย) - ถาโรค cleft lip & cleft palate เปน multifactorial disease (ขนกบระดบ folate ในเลอดของแมเมอ

ตงครรภ, metabolism ของ methionine, ระดบ homocysteine ใน cord blood ดวย) แลวมเดกหญงคนหนง

เกดมาเปน cleft lip (กาหนดวาในประชากรพบในชาย > หญง 5 เทา) มปจจยทางกรรมพนธ & สงแวดลอมสงกวาเดกชายทเปน cleft lip

** ถาโรค multifactorial disease โรคใด พบในเพศทพบโรคนนนอยกวา แสดงวาคนคนนน ม genetic & environmental factors สงกวาโรคเดยวกนทพบในเพศทพบมากกวา

** ex. pyloric stenosis (เกดจาก hypertrophy ของ pyloric m.) เปน multifactorial disease ทพบในชาย

มากกวา, ถาผหญงเปน แสดงวาหญงนนจะตองม genetic & environmental factors สงกวาชายทเปนโรค! ** ∴ ถาเราด 1st degree relative ของ proband ทเปนหญง (เพศทพบนอยกวา; แสดงวากรรมพนธแรงกวา)

จะมโอกาสเปนโรคนมากกวา 1st degree relative ของ proband ทเปนชาย (เพศทพบมากกวา) ถาเราเปนโรคทพบในเพศเรานอยกวา ญาตของเราจะเสยงมากกวาญาตของคนทเปนเพศทพบมากกวา

(เรามกรรมพนธแรงกวา) - Identifying genetic component of multifactorial trait: Study of disease phenotype,

Molecular study of population Study of disease phenotype

 TOP  SI 117 

- Prevalence study of ethnically different population: การทโรคมกมความชกชมอยในประชากรกลมใดกลมหนงมาก มกม genetic factor (H) เปนสวนกาหนด !!

- Twin study: การสารวจหา phenotype ในคนทเปน monozygotic twin เปรยบเทยบกบ dizygotic twin แลวดวามอตราการเปนโรคเหมอน/ตางกนอยางไร ดวากรรมพนธสาคญขนาดไหน ! (ด H)

- ถา twin คนหนงเปน อกคนจะเปนดวย 80% = ม concordance rate (อตราการเปนดวยกน) = 80 - ถาโรค A ม concordance rate ใน monozygotic twin = 80, ใน dizygotic twin = 80 โรค B ม concordance rate ใน monozygotic twin = 80, ใน dizygotic twin = 30 โรค B ม H (genetic factor) สงกวา !! (เพราะ monozygotic twin มคาเทากบคนคนเดยวกน, dizygotic

twin มคาเทากบพนองพอแมเดยวกนเทานน เพยงแตเกดทองเดยวกน, ถา concordance rate เทากน แปลวา

genetic ไมสาคญมากนก แตถา genetic สาคญจรง โอกาสทคนคนเดยวกนจะเปนโรคเดยวกน ตองสงกวาโอกาสท

คนคนละคนจะเปนโรคเดยวกน เพราะ % gene ท share กนใน monozygotic twin มากกวา !!) - ถาโรค A ม concordance rate ใน monozygotic twin = 80 โรค B ม concordance rate ใน monozygotic twin = 40 โรค A ม H (genetic factor) สงกวา !! (ถา twin ทงคไดรบการเลยงดทเดยวกน เหมอนกน เปนการ

control environmental factor) - Adoption study: บคคลทม genetic เหมอนกน/ใกลเคยงกน (ex. พนองกน) กควรจะมโอกาสเปนโรคเดยวกน

มากกวาในคนทม genetic ตางกน, adoption study จะศกษาลกทไดรบการเลยงเปนบตรบญธรรมโดย

ครอบครวอนเปรยบเทยบกบลกของครอบครวนนทถกเลยงในครอบครวนน ดอตราการเปนโรคใดโรคหนง (ex. alcoholism; เดกทเกดจากครอบครวทพอแมตดเหลา แลวถกนาไปเลยงเปนบตรบญธรรมในครอบครวทพอ

แมไมมปญหาเรองการตดเหลา จะมปญหาเรองการตดเหลาตาลงชดเจน) ** twin study บอกวา genetic factor (H) มผลมากนอยแคไหน adoption study บอกวา environmental factor มผลมาก/นอยเมอเทยบกบ genetic factor - Sib pair analysis ● ศกษา genetic ในพนองทเปนโรคทงค = concordant sib pair ● ศกษา genetic พนองทคนหนงเปนโรค อกคนไมเปน = discordant sib pair ดวามตาแหนงใดใน genome ของ 2 คนทเหมอน/ตางกน - Disease gene mapping study design - Linkage study: กรณทโรคนนม disease gene จานวนนอย แตม H มาก จะหาไดงายกวา !! (เพราะเปนการ

คานวณทางสถตวา linkage marker มาความสาคญหรอไม ด sharing allele ของ marker ในคนทเปนโรค) ** ยงถามแค 2 genes ทตองม mutation ถงจะเกดโรค ยงหางาย ใชคนไมมากนก แตถาโรคหนงเกดจาก 60

genes แตละ gene ม contribution ≈ 1% เราตองใชคนเปนพนๆ/หมนๆ คน เพอหา gene เพราะ statistical significance จะตามาก

- Association study: การศกษาหาความสมพนธระหวาง polymorphism หนงๆ กบโรคใดโรคหนง ในบางครง

gene กอโรคอาจไมใช mutation แตเปนเพยง polymorphism กไดททาใหมความโนมเอยงทจะเปนโรค ** ตางจาก linkage study ตรงท linkage study เปนการศกษาการถายทอด allele ของ DNA marker ใน

ครอบครวของผทเปนโรค (เกบเลอดทงครอบครว) แต association study เปนการศกษาการม/ไมม polymorphism กบการเปนโรค (เกบเลอดคนเดยว) แตเราสามารถใชทง 2 วธเพอหาวา disease gene อยทใด

- ถาเราอยากรวาโรค X (เปน multifactorial disease) ม disease gene อยทไหน เปรยบเทยบ study: Linkage study: เราตองไปหาวามคนเปนโรค X อยทไหน ขอเจาะเลอดเพอเกบ DNA ของครอบครวใหญๆ ทมคน

เปนโรคหลายๆ คน หลายๆ ครอบครวทงครอบครว เกบทงคนทเปนโรค & ไมเปนโรค แลวเอามาศกษา DNA marker วามการถายทอด allele ตรงไหนบางทถายทอดจากคนทเปนโรคไปใหคนทเปนโรคเสมอ และไมถายทอดไป

ใหคนทไมเปนโรค ** แตละครอบครวอาจเปนคนละ marker กได แตในครอบครวเดยวกนตองเปน marker allele เดยวกน

Association study: ไปเอาคนทเปนโรค X มา 100-500 คน แลวมาศกษาวาคนเหลานมา allele ไหนบางใน

genome ทเหมอนกน ตรงนนกนาจะเปน/อยใกลๆ กบ allele ของ disease gene (ใครทเปนโรคกตองม allele นหมด)

- Linkage disequilibrium = การท marker allele หนงๆ ถายทอดไปกบ disease gene อยางสมาเสมอทงประชากร ! (ดงนนจะใช marker นนเปนเครองหมายของการเปนโรคได เรากจะทา association study)

 TOP  SI 117 

** ถาใน 3 ครอบครว ครอบครวท 1 A1 ถายทอดกบ B1, ครอบครวท 2 A2 ถายทอดกบ B2, ครอบครวท 3 A3 ถายทอดกบ B3 gene A กบ B link กน แตไมม linkage disequilibrium

** ถาทง 3 ครอบครว (แทนทงประชากร) A1 ถายทอดกบ B1 เหมอนกนหมด gene A1 กบ B1 อยใน linkage disequilibrium กน

Linkage locus ไปดวยกน Linkage disequilibrium allele คหนงไปดวยกนเสมอ !! จงใชตว allele เลย เปน marker ของการเปนโรคในประชากรไดเลย

- คนเปนเลอด group ไหน มความเสยงกบอะไรมากกวา group อน linkage disequilibrium - linkage disequilibrium เปน function ของเวลา & recombination; alleles ทเคยม linkage

disequilibrium กนตงแตสมยดกดาบรรพ ตอนนกอาจจะไมมแลว แตอาจจะยงม linkage ตอกนและกน ! - เมอไรกตามทเกด mutant allele ท gene A ขนในบรรพบรษของเรา polymorphism ทอยใกลๆ gene A มาก

ของคนนนบน chromosome นน มนจะอยใน linkage disequilibrium ทนทกบ mutation นน ! เปนอยางนไปเรอยๆ จนถงชวลกชวหลาน, เมอผานไปอก 50 generations เกด recombination ขนบอยๆ ระหวาง

marker กบ disease gene กจะไมอยใน linkage disequilibrium กนแลว แตกจะไป link อยกบ allele อนของ marker นน

** ∴ linkage disequilibrium (ใชบอยในทางการแพทย) เปนปรากฏการณทเรามองเหน เพราะ recombination ยงไมเกดขน polymorphism จงยงอยตดกบ gene นนอกระยะหนงในววฒนาการของสงมชวต พอเวลาผานไปนาน

ขน มนจะกลายเปน linkage equilibrium (คอเปน linkage ธรรมดา) (เวลาผานไป disequilibrium distance จะสนลงเรอยๆ จนเหลอเปน linkage ธรรมดา)

- Step in complex disease study: 1. Defining phenotypes: อาจมหลาย phenotype ใน 1 โรค, แต phenotype ยอยๆ ของ 1 โรค =

endophenotype (ex. DM จะม endophenotypes ตางๆ = ระดบ insulin, counterregulatory hormone, blood sugar, ปรมาณ HbA1C, insulin sensivity)

** ศกษา phenotype ยอยทเราตองการจะงายกวา ! 2. Collecting of cohort or families: define phenotypes ออกเปนยอยๆ, รวบรวมผปวยแบงเปน 2 กลม

(แตละกลม = cohort) คอ normal cohort & affected cohort ** จะตองมนใจวา normal cohort จะไมกลายไปเปน affected cohort (ex. จะปองกนการเปนมะเรง เราก

ไปเอาคนเปนมะเรงมา 500 คน ไมเปนมะเรงมา 500 คน (ควรไปเอาคนแกใกลตายแลวไมไดเปนมะเรงจงจะเปน

good cohort)) 3. Genotyping (candidate or whole genome): ศกษา DNA, อาจใช linkage กได ถาเราม DNA ของคน

ทงครอบครว, อาจใช association กได ถาเรามแตคนเดยวๆ เปนโรคเตมไปหมด

4. Analysis and confirmation of linkage and association: หาวาตาแหนงใดม confirm linkage หรอ confirm association

5. Replication of study in 2nd set of cohort: ไปหาประชากรมาอก set หนงมาทดลองซาวาผลทไดเปนผลจรงหรอไม (วธกคอ gain คนมาเยอะ แลวแบงเปน 2 กลม เกบกลมหนงไวกอน ทาการศกษาอกกลมหนง พอ

ไดผลในกลมแรกแลว เอาไป confirm ไปกลมท 2) 6. Gene finding and functional study: เมอรวาตาแหนงของ genome อยตรงไหนแลวจงจะไปคนหา gene

โดย positional หรอ positional candidate วาเปน gene อะไร & function อยางไร - ปจจยททาใหการสบคน gene วา gene ใดเปน disease gene ใน multifactorial disease ทาไดยากลาบาก 1. จานวน gene (genetic loci) มมาก แตละ gene อาจพบไดไมบอยนก (mutant allele อาจเปน rare

allele) 2. contribution หรอ heritability ของ phenotype นนอาจไมสงมาก ทาใหตองใชจานวนผปวยใน cohort

มาก

3. disease allele ถาเกดขนมานานแลว อาจไมม linkage disequilibrium แลว ทา association study ไมคอยไดผล (age of each disease and their underlying haplotypes)

4. ถาประชากรทนามาศกษาม genetic background ตางกนมาก (homogeneity) กจะศกษาลาบาก

 TOP  SI 117 

** ดวยเหตนจงมกทาในสตวทดลอง = inbred animal คอจะรวามาจากสายพนธไหน มกรรมพนธอยางไร

เหมอนกนทกประการ เพราะเกดจากพอแมเดยวกน แลวผสมกนซาไปซามา เรากจะรวาสตวทเปนโรคกบไมเปนโรค

มกรรมพนธตรงไหนทตางกน 5. ม environmental factor อนๆ ทเรา control ไมได (อาจเปนผลใหเกดโรคกได) 6. จาเปนตองใชความสามารถทางสถต & คณตศาสตรคอนขางสง

Population Genetics - population genetics ศกษา gene distribution ใน population - อธบายวาเหตใด gene frequency ในประชากรจงเปลยนแปลงขน-ลง/คงท แลวมผลตอ genotype อยางไร แลว

มผลตอ phenotype อยางไร - เกยวของกบทง genetic factors (mutation & mating) & environmental factors (natural selection

& migration) - gene frequency = allele frequency บอก frequency ของลกษณะทางพนธกรรมในระดบ genotype ท

ละเอยดทสด (ex. allele frequency ของ β-thalassemia = 2% ของประชากรไทย) - allele frequency ไดจากการนบจานวน allele นนทงหมด หารดวย จานวน allele ทงหมดในประชากร 1 คน

ตอ 1 locus ม 2 alleles ∴ ถามประชากร = n คน จะม 2n alleles (โดยบคคลทเปน homozygote ของ gene ใดๆ กจะ contribute ทง 2 alleles สวนบคคลทเปน heterozygote กจะ contribute เพยง allele เดยวเทานน)

- carrier frequency = อตราการพบบคคลทเปน carrier ของ gene ทเปน AR / หญงทเปน carrier ของ XR ในประชากร (carrier frequency มกเปนคน นบจานวนคนทเปน carrier หารดวยจานวนคนทงหมดในประชากร)

- What happens with a mutant gene? เปนไปไดทง ● mutant allele จะคอยๆ ลด = decrease จานวนลงเรอยๆ เมอเทยบกบประชากรทงหมด และคอยๆ หายไป

ในทสด (ex. เกด mutant allele แลวทาใหชายคนนนเปนหมนทนท) ● mutant allele จะคอยๆ เพม = increase ขนอยางชาๆ ถานบกนไปนานๆ (ex. 100 ชวคน) ในทสดจะเขาส

สมดล (ไมมทางเพมขนอยางไมมทสนสด) ● mutant allele จะอยในสมดล = stable เสมอ ไมวาจะคดทชวคนใดกตาม - ถา mutation มอายมากแลว mutation นนจะอยในสมดล - สมดลนเกดขนจาก genetic & environmental factors ทาใหยงตรวจพบ mutation อยไดในประชากร - เมอ mutation ม frequency อยในสมดลแลว

New mutation rate = Rate of allele loss (อตราการเกด mutation ใหม = อตราการหายไปของ mutant allele นนในประชากรแตละชวคน)

(1) mutant allele หายไปจากโลกน (rate of allele loss) ดวย 2 สาเหต 1. คนตาย ! 2. สงตอไปยงอกชวคนหนง แลวคนคนนน ไมมบตร ! (2) mutant allele เกดขนใหม (new mutation rate) 1. ม mutation เกดขนใหม (ex. จาก point mutation) 2. มเดกเกดใหมท carry mutation มาจากพอ/แม ถา (1) = (2) อยในสมดล !! = Hardy-Weinberg equilibrium - ถามอง mutation ทวโลกน ถงจะอยสมดล mutation นนอาจจะพบไดบอย/ถ ไมเทากนในแตละประชากร

(ex. พบ thalassemia มากในคน Asia, พบ sickle-cell anemia มากในคน African, พบ

hypercholesterolemia มากในคน French Canadian, พบ hemochromatosis มากในคนผวขาว, พบ Tay-Sachs disease พบมากในคน Ashkenazi Jews)

- การท gene frequency ไมเทากนในแตละประชากร มกไมไดเปนผลมาจาก genetic factor แตมกจะเปนผลมาจาก environmental factor มการเคลอนยายของกลมประชากร แลวเกด founder mutation คอมกลมคนท carry mutation จานวนมากมาตงถนฐาน สรางประเทศ สรางประชากรขน ลกหลานม mutation เหลานนอยชกชม

 TOP  SI 117 

- เมอไรท mutation ใดๆ อยใน equilibrium (new mutation rate = rate of allele loss) แลว %ของผทม

phenotype เปนแบบตางๆ จะคงท !! ex. AR allele: locus p ม allele 2 ชนดคอ p & q โดยท A ม allele frequency = p a ม allele frequency = q p+q = 1 ในประชากรกจะมคน 3 จาพวก: homozygous AA, homozygous aa, & heterozygous Aa p2+2pq+q2 = (p+q)2 = 1 โอกาสทจะพบ genotype AA = p2 = genotype frequency โอกาสทจะพบ genotype aa = q2, โอกาสทจะพบ genotype Aa = 2pq AA:Aa:aa = 1:2:1 เสมอ !! mutation อยในสมดล = Hardy-Weinberg equilibrium

- Hardy-Weinberg equilibrium มประโยชนทจะใชคานวณหาโอกาสทเราจะพบ genotype ชนดตางๆ ถาเรารวา

mutation นนอยในสมดล, และถาเรารวาเราเจอบคคลทม genotype เปนแตละแบบเทาไร เราสามารถคานวณกลบ

หา gene frequency ได !! ● ex. AR disease มความชกในประชากร = 1 ใน 3600 คน 1/3600 = genotype frequency = q2 ∴ q = 1/60 = gene frequency p = 59/60; 2pq = 59/3600 = carrier frequency จะเหนวา ถาโรคใดพบไมบอย p เขาใกล 1 2pq ≈ 2q (∴ AR disease ทพบไมบอย เอาความชกมาถอด square root แลว ×2 ได carrier frequency เลย) ● ex. กาหนด carrier frequency = 10% หาโอกาสทจะพบโรคนนในประชากร 2pq = 0.1 ≈ 2q q = 0.05 q2 = 0.025 - ถากรณ AD ถอวาบคคลทเปนโรคเปน heterozygote !! ∴ เจอคนทเปนโรคเทาไรในประชากร = 2pq ≈ 2q (เราถอวาคนเปน homozygote AD นอยมากๆ) ex. ถาพบคนเปนโรค achondroplasia = 1/10,000 allele frequency = 1/20,000 AD disease: Allele frequency = ½ × Population frequency of disease - กรณ XR ใหถอวาโรคพบในชายเทานน !! ∴ XR; Allele frequency = จานวนชายทเปนโรคในประชากร - XR; carrier frequency (โอกาสพบหญงทเปน carrier) = 2pq = 2×allele frequency = 2×ชายทเปนโรค ∴ XR; Carrier frequency = 2×จานวนชายทเปนโรคในประชากร - Factors that disturb Hardy-Weinberg equilibrium: mutation หรอ allele frequency บาง allele

กยงไมเขาสสมดล หรอเมอเขาสสมดลแลวกอาจหลดออกมาจากสมดลอกกได! กรณเหลานจะเปนสาเหตททาใหสมดล

ไมอยคงท ไดแก

1. Non-random mating ● แตงงานในกลมคนเชอชาตเดยวกนเทานน = ม population stratification (ethnic subgroup; ex.

ชาวมงตองแตงงานกบชาวมง) frequency of homozygote, ลด frequency ของ heterozygote ในประชากร

● แตงงานกบคนทม phenotype หรอ trait เหมอนๆ กนกบเรา = assortive mating (ex. คนหหนวกชอบแตงงานกบคนหหนวก) เกดขนกบบาง trait, สวนมากเปนปจจยทางสงแวดลอม

● แตงงานกบคนในเครอญาต = consanguinity 2. Non-constant allele frequency ● allele นนทาใหเกดภาวะ reduced fitness (< 1) = ความสามารถในการถายทอด allele ทเราไดรบมา

ไปสลกหลานลดลงกวาปกต, เกดขนไดหลายกรณ สวนมากเกดจากมทพพลภาพ (ทางปญญา/รางกาย) ex. คนเปน Robert’s syndrome (ไมมแขนขา ไมมบตร), Down’s syndrome (chr.21 ทเกนจะสงผลใหเดกชายเปนหมน ไมมบตร แตเดกหญงทเปน ยงสามารถตกไขได & ตงครรภได แตโอกาสทจะไดแตงงานกนอย)

** Fitness ทปกต = 1, ถาเปนหมน ไมสามารถมบตรไดเลย fitness = 0 ถา mutant allele ใดๆ มความรนแรงมาก & ม reduced fitness อยางมาก mutant allele นนม

แนวโนมจะหายไปจากประชากร ถา mutation rate ไมสงเพยงพอ !! (เพราะเกดแลว ไมถายทอดใหใคร)

 TOP  SI 117 

● ม natural selection ตามกฎของ Charles Darwin (ex. คนม thalassemia trait จะตดเชอ

malaria ยากกวา ∴ ในแดนทม malaria ชม กจะมบคคลทเปน thalassemia carrier จานวนมาก !!) ** การทธรรมชาตเลอกไว = selection for …; การทธรรมชาตเอาออก = selection against … ● ม gene flow = การ fluctuate ของ allele frequency ใน 2 อาณาบรเวณทอยตดกนแลวม allele

frequency ตางกนมาก ! แลวเกดการเคลอนทของคนทอยทชายแดน ขามประเทศแลวไปแตงงานกน (ex. ไทย-เขมร, ไทย-ลาว, ไทย-พมา allele frequency แทบไมตางกน แต ไทย-มาเลเซยตางกนชดเจน ถา

บคคล 4 จงหวดชายแดนภาคใตเรมแตงงานขามอาณาบรเวณกน บรเวณนนกจะเกด fluctuation ของ allele frequency ขน ทาให allele บางชนดนอยลง บางชนดเพมขน = gene flow)

** คาวา flow ให sense วาชาๆ เฉอยๆ เรอยๆ, ตรงขามกบ genetic drift เปน sudden change ● ม genetic drift เปน sudden change (ex. คนไทยปญญาออน 5,000 คนตดสนใจยายถนฐานไปตง

บานเรอนอยบนเกาะสมย แลวปวารณาตววาจะไมเหยยบแผนดนใหญอก allele frequency จะเปลยนไปทนท เมอเทยบกบ baseline เดม), มกเกดเวลาแบงดนแดน แยกประเทศ หรอมคนอพยพจานวนมากๆ ไป

เปนกลมกอน ** genetic drift มคาเทากบการทอยลกเตา เราจะไมสามารถทานายได กลมทแยกออกไปจะคนกาหนดวา

gene frequency ในกลมนนจะเปนอยางไร ขนอยกบ gene frequency ในกลมนนเทยบกบ gene frequency ของ baseline population

- selection จะสงผลไดบอยมากกบ AD disease (เพราะ heterozygote กแสดงอาการของโรคเสมอ) ธรรมชาตจะคดเลอก phenotype ทไมเหมาะออกไป, บาง phenotype จงเรยกวาเปน lethal dominant disease (disease with zero fitness) = โรคทไมสามารถถายทอดพนธกรรมได (lethal ทาง genetics ไมไดแปลวาตาย) ex. Apert syndrome, Thanatophoric dysplasia, Cornelia de Lange syndrome, Atelosteogenesis, Acrodysostosis, Osteogenesis imperfect type 2

Selection and mode of inheritance - AD: ถาม selection แลว สมดลจะอยไดจะมาจาก new mutation ทงสน !! แลวถาอยในสมดล (gene

frequency คงท) new mutation rate มกจะตองสงพอ ! - AR: ถาเปน negative selection (ม carrier แลวธรรมชาตคดเลอกออก) จะมผลนอยมาก !! เพราะ carrier ไม

แสดง phenotype, จะมผลตอ homozygote (มกคด homozygote ออก); แต positive selection จะมผลระยะยาวตอ carrier (ex. thalassemia)

- XR: selection พบในชายเทานน (hemizygous male) เพราะในหญงเปน carrier ไมมอาการใดๆ (ไมม phenotype)

Genetic drift vs Gene flow - Genetic drift: เปน fluctuation ขนาดใหญ (due to chance) ex. ม breaking off ของ subpopulation

ใน larger population - Gene flow: เปน slow diffusion ของ gene (due to population mixture) ex. ม migration ของ

population ทอยใกลๆ กน ** ทง genetic drift & gene flow (รวมกบ reduced fitness & natural selection) กทาใหเกด non-

constant gene frequency ซงจะสงผลให allele ไมอยใน Hardy-Weinberg equilibrium

 TOP  SI 117 

Section 2

Introduction to Clinical Genetics - Genetics Variation & Inheritance Human genetics Variation & Inheritance ในมนษย Medical genetics Variation & Inheritance ของ genetic disorder ททาใหเกด disease Clinical genetics สาขาของ Medical genetics ทเอาความรไป apply เพอ diagnosis,

prognosis, treatment, & prevention - Diagnosis pedigree recording (จากการซกประวตครอบครว), family study (การศกษาสมาชก

ครอบครว), genetic testing - Prognosis (เดน) พยากรณโรค & ทานายความเสยงของการเกดโรคทถายทอดในครอบครว

- Understanding (สาคญทสดขณะน) genetics ทาใหเราเขาใจชววทยา สขภาพ การเกดโรค - Treatment medical/surgical treatment, organ/stem cell transplant, gene-based therapy - Prevention (สาคญ โดยเฉพาะโรคทยงรกษาไมไดผล) counseling (risk assessment), detect carrier,

presymptomatic diag./predictive testing, prenatal diag., screening (newborn, heterozygote, prenatal)

** ขณะน genetic prevention ทาไปถงระดบประชากร ในประเทศไทย หญงทตงครรภเมอมาฝากครรภท ร.พ.

จะมการตรวจวาเปน carrier ของ thalassemia หรอไม ** prenatal diag. ทาเพอใหหญงทเปนแมเลอกทจะยตการตงครรภถาเดกในครรภเปนโรค เพอชวยครอบครวใหม

ลกปกต และหลกเลยงการมลกผดปกต (แตไมไดมจดมงหมายทจะฆาคนเปนโรคพนธกรรม) เนองจากยงไมมมาตรการในการรกษาทไดผล

- Ethical, Legal, & Social issues

Mendelian Disorders - Mendelian disorder เกดจาก single-gene mutation (1 gene ท 1 locus; อาจเกดจาก mutation ท 1 หรอ

2 allele กได) & ถายทอดตาม Mendel’s laws - Mendel’s laws 1. Law of uniformity (Unit of inheritance) (ถามลกษณะการแสดงออกทางใดทางหนงซงสดขว 2 ขาง ex. สง-เตย, ขาว-ดา, ใหญ-เลก แลวนามาผสมกน

รนลกจะมการแสดงออกเพยงอยางใดอยางหนง แสดงวาม trait หนงทเดนกวา) 2. Law of segregation (แบบแผนการแสดงออกในรนลก ถาเปนลกผสม แมจะแสดงออกอยางใดอยางหนง แต trait ทดอยกวายงคงอย

และสามารถไปแสดงออกไดในอกรนหนงได เพราะใน gamete จะมลกษณะทง 2 แยกออกจากกน) 3. Law of independent assortment (แบบแผนการแสดงออกนน ทงเดนและดอย จะมการเขาคกนโดยไมขนแกกน และเปนแบบสม) - Single-gene (Monogenic) disorders แบงเปน 2 แบบ

1. Mendelian disorder 2. Mitochondrial disorder ** โรคบางโรคจะเกดตองม mutation 2 genes = digenic disorder (การถายทอดตองเปน double heterozygote) ** oligogenic = เกดหลาย gene แตจานวนนอย; polygenic = เกดจากหลาย gene และจานวนมาก;

multifactorial = polygenic + environment - การเรยงลาดบของ gene บน chromosome เปน linear arrangement ** chromosome ไมใชแทง แตเปนสายยาว โดยในระยะ metaphase จะเหน chromosome หดสน เราใชระยะนมา

ตรวจไดงาย chromosome ทเปนรปปาทองโก = อยในภาวะทกาลงแบงตว 1 chromosome ม 2 chromatids ซงม gene เหมอนกนทกประการ เตรยมพรอมทจะแยก

- compound heterozygote = ทง 2 alleles บน 1 locus เปน mutant alleles แต mutate คนละแบบ - double heterozygote = heterozygote ท 2 loci

 

- การร identify geenotype ทเปนนไปไดทงหมดในนรนลก ทาไดโดดย 1. ววาด Chromosome diagramm (Mating diiagram) 2. ทาตาราง PPunnett squaare - Ped - Spo **

goitครอ

gen

คาวา sporaditer ทมาจากคอบครว, เปน Cnetic + envir

dic & familiaความผดปกตขอ

CA liver จาก hronment กได

al โดยทวไป สาเ

องการสราง thhepatitis vir

เหตจะมาจาก ghyroid hormorus หลายคนใน

genetic หรอไมmone; ทมาจาก

นครอบครว, en

มกได ทมาจ environmen

endemic goite

จาก genetic ent ex. เปน TBter; หรออาจมา

ex. B ทงาจากทง

- Newเปนใ

ลกเ

w mutation ใน generatioปนโรค = ½)

mutationon ทเรมม** แ

n ใหมเกดใน gaตคนทเปนโรคแ

amete หนงขอแลวกจะถายทอ

องพอแม ถามลก

ด AD ตามปกกทเกดขนมา ก

กต (พอถายทอดกจะมลกคนนนค

ดใหลกชายได, คนเดยวท

โอกาสท

- Gerแบง

gon

rmline (Gonaงตวตอไปเปน cnad ทม mutat

adal) mosaiccell line ทม mtion อย ∴ เว

cism การเmutation แลววลามลกจะเปนโ

เกด mutationปรากฏวาเปน

โรคไดหลายคน

n ทเกดใน 1 ce cell line ของนใน generati

ell ตอนเปน emง gonad คนคon นนทเรมม*

mbryo แลว ceนนนกจะมสวน

** ทงๆ ทตวเอ

ell นนนหนงของ

องปกต (ge mos** ดงนนน ครอบครวใดด

แสดดงวาพอหรอแมมเปน gonadal l mosaic (ถามมลกแค 1 คนมมาหาเรา เราจะไไมรวาเกดจาก new mutatioon หรอ germmline mosaicisism) ** New Ger ทง

หมด

2 อยาง ทาให gดทกเซลล

gamete ม mumutation ลกทเเกดจาก gameete ทม mutattion ทงตวขอองลกกจะม mututation

- Som(exsegexp

- Lyo(เกดระย

Dos

on hypothesดในชวง early ะ interphasesage compen

sis ใน somay embryo ของe; กลไกน ทาใหnsation

atic cell ของง ญ.) = X inaหการท ญ. ม 2

ง ญ. จะมเพยง ctivation

2 X chr. แต p

1 X chr. เทาน เหนเปน X-ch

product ทสรา

นนท active ทhromatin bodางกไมไดเปน 2

ทเหลอจะถก inady (Barr bod เทาของ ช. = ก

activate dy) ในกลไก

** - ran

ถา ญ

nor

ndom X inactญ. เปน carriermal functio

tivation ทเกดer กเดาไดวาเซn แค 50% นเพ

ดขนน บางเซลล

ซลล ½ จะม noพยงพอตอการ

ลกเกดกบ Xp (rmal phenotรดารงชวต ญ.

(paternal) บาtype อก ½ จะมทเปน carrier

างเซลลกเกดกบ

ม abnormal pr จงไมแสดงอา

บ Xm (materphenotype ซาการของโรค

rnal) ซง

** ** ยา!!

1.

digree เสนเชอมสาม-ภภรรยา = relaationship linee เสนตงลงมาจาาก relationshhip line (คนททอยใตเสนเปนลลกของคนทอยเหหนอเสน) = linne of descennt เสนพนอง (คนนทอยใตเสนนเปปนพนองกนหมมด) = sibship line เสนตงลงมาจาาก sibship linne = individuual line oradic vs FaSporadic Familial เปนหลายคนเฉพพาะใน familyy เดยวกน

ermline = celsaicism = ภาววะทม ≥ 2 gennetically difffferent cell llines ในคนคนเเดยวกน; mossaic = คน~)

มลกทเปน ADD > 1 คน โดยทพอ & แมปกต มลกทเปน XRmutation เลย

R > 1 คน โดยทพ

ย แสดงวาตอง

พอปกต & แมไเกด mutation

ไมเปน carrieron ท gonad)

r (ตรวจ DNAA จาก somatiic cell ของแมแลวไมพบ

ew mutation rmline mosai

matic mosaix. คนไข neurogment ใด segpress ออกมาใ

icism การofibromatosigment หนงขอใหม NF & CA

เกด mutationsis type 1 ม nองรางกายเทาน

AL)

n ท 1 cell ตอneurofibromaนน (segmenta

นเปน embryoma (NF) & caf

al distributio

o แลวเจรญไปเ

fé-au-lait spion) โดย cell ท

เปน somatic pots (CAL) ททม mutation

cell ทวไป

ท

n กจะ

จานวน Barr body = จานวน X chr. – 1

เซลลทแบงตวตอไปหลงเกด XX inactivatioion กจะม X อนนเดยวกนท inaactive (เหมอนนกบเซลลตงตนน)

X inactivat(ex. ovum จจะไมม X inacttivation)

amilial เปนคนเดยวในน family; ในบบาง family กรรณเกดจาก geenetic จะเปนผผลจาก new mmutation

ll line ทจะกลาายไปเปน gameete

เกดตอน prre-zygotic (g(germline muutation ทเกดรระหวาง gametetogenesis) aicism เกดขขนตอน post--zygotic

tion เกดขนเฉพพาะ somatic c cell เทานน ไมมเกดกบ germ m cell

TOOP  SI 117 

 TOP  SI 117 

2. X inactivation นไมมผลตอการทา DNA analysis (gene ท inactive กบ active ตรวจ DNA ไดเหมอนกน)

3. X inactivation ไมไดเกดทง chromosome gene ทอยท pseudoautosomal region (ปลาย short arm ของ X chr.) จะไมเกด X inactivation

- ม center ทควบคม X inactivation = X inactivation center (XIC) ขณะนทราบวาใน region ทม XIC ม XIST gene (XIST = X inactivation specific transcript gene) ซงจะสราง RNA ไปกระตนใหเกด

methylation ท C (cytosine residue) เปน 5-methylcytosine inactivate gene expression - methylation ยงมบทบาทในการปด switch gene ในปรากฏการณ genomic imprinting ดวย ** methylation เปน epigenetic mechanism เพราะเปนปรากฏการณอนทใชในการ modify gene expression

ทาใหเกดผลตอ phenotype แตไมไดทาให genotype เปลยนแปลง !! - Possibilities for sporadic case AD (จาก new mutaton, พอ/แมเปน germline mosaic) AR XR (จาก new mutation, แมเปน germline mosaic, แมเปน carrier) Multifactorial (ex. cleft lip, cleft palate) Chromosomal Phenocopy (non-genetic) (ex. endemic goiter) - Sex-limited trait trait ทแสดงออกเฉพาะเพศใดเพศหนงเทานน (ex. uterine/vaginal defect) - Sex-influenced trait trait ทพบทง 2 เพศ แตม expression หรอ severity ตางกน (ex. male-

pattern baldness ถายทอดแบบ AD ใน ช. แตเปนแบบ AR ใน ญ. พบ ช. หวลานบอยกวา แต ญ. กเปนได แตตองเปน homozygote)

- Pleiotropy 1 gene - several effects (ex. Marfan syndrome) - Variable expressivity gene อาจ express มากนอยไมเทากน เกด phenotypes ทม severity

หลากหลาย (ex. neurofibromatosis – ในครอบครวเปนมากนอยไมเทากน อาจเกดจาก gene, อาย, สงแวดลอม)

- ม intrafamilial variation (เนองจาก interaction กบ modifier gene (background gene) ท locus อน) & interfamilial variation (เนองจากคนละ allele กน)

- Clinical (Phenotypic) heterogeneity 1 gene – several diseases; mutation ของ gene เดยวกน

แตม expressivity ตางกนมากจนดเปนคนละโรค !! (ex. skeletal dysplasia) ** เปน concept เดยวกบ variable expressivity เพยงแตอนน vary มากจนดเปนคนละโรค) - Genetic heterogeneity several genes – 1 effect (phenotype เหมอน/คลายกน แตเกดจาก

mechanism ตางกน) - Locus heterogeneity โรคเหมอน/คลายกน เกดจาก gene คนละตาแหนง (ex. neurofibromatosis

type 1 & 2, albinism, ADPKD) - Allelic (Mutational) heterogeneity โรคเหมอน/คลายกน เกดจาก gene ท locus เดยวกน แตคนละ

allele (ex. cystic fibrosis, β-thalassemia, hemophilia; เกดจาก mutation ไดหลายแบบ) ** ปกต โรคตางๆ กจะม allelic heterogeneity อยแลว ยกเวนบางโรคทไมมจรงๆ ex. sickle-cell anemia

เปน mutation ชนดเดยวเทานน

- Phenocopy ลกษณะทเกดดเหมอน/คลายโรคทาง genetic แตอนทจรงมาจาก environmental factor ** คนตวเตย บางคนมาจาก genetic (มหลายโรค เปน genetic heterogeneity (locus/allelic)) บางคนเปน

environmental แทๆ (ex. เปนหวใจพการแตกาเนด, rickets) = phenocopy, & บางคนกเปน multifactorial - Penetrance % ความบอยท abnormal gene นนแสดงออกในกลมประชากรทม abnormal gene นน

** gene สวนใหญสามารถผาน threshold แลวแสดงออกได คนทเปนโรคกม variable expressivity คออาจม expression นอย/มาก คนสวนใหญจะม severity ของโรคอยระดบกลางๆ

- ถา abnormal gene นนแสดงออก 100% = complete penetrance; ถา < 100% = incomplete (reduced) penetrance

- คนทม abnormal gene แต phenotypic expression ปกต = non-penetrant case (คอไมสามารถจะผาน

threshold ททาใหม phenotype ผดปกต ได จงม non-penetrant trait คอปกต)

 TOP  SI 117 

- การท penetrance จะมาก/นอย ขนกบวาเราเอา threshold ทไหนเปนตววด (เพราะโรคม variable expressivity) ถาเราใช threshold สง penetrance กจะนอยลง (เพราะมอาการเทาน แตเรายงถอวาปกตอย คนทเรากาหนดวาผดปกตกเลยมนอย)

- pedigree ของแสดงโรค AD ทม incomplete penetrance จะพบ skipped generation (generation นนม non-penetrant case ซงอยทเรากาหนดวาถง threshold ทเทาไรถงจะเรยกวาแสดงออก)

- Onset age Prenatal (กอนคลอด) / Congenital (แรกเกด) / Delayed (ภายหลง) / Late (ตอนอายมาก) / Variable (อายตางๆ กน ไมแนนอน ex. SCA3, Huntington disease)

- Anticipation โรคมความรนแรงมากขนเรอยๆ ในชวคนถดๆ ไป (onset age นอยลง, โรครนแรงมากขน) พบในกลมโรคจาก mutation ชนด triplet repeat expansion (ในรนหลงๆ ยงม triplet repeat มากจนเกน

threshold แลวเกดเปนโรคขน ยงมมากเทาไร กยงแสดงอาการรนแรงมากเทานน) ex. โรค myotonic dystrophy

- Genomic imprinting phenotype ทเราเหนเกดขนเนองจากความผดปกต/mutation ซงจาเพาะวา mutant นนไดรบมาจากใคร แสดงวาไมไดทางานเสมอทง 2 genes ทางานเพยง gene เดยวขนกบวามาจากพอหรอแม อก gene หนงทมาจากพอหรอแมมการปด switch คานหลกการของ autosomal inheritance

** ex. ม gene F กบ M; chromosome ทไดรบมาจากพอ gene F จะทางาน สวน chromosome ทไดรบมาจากแม gene M จะทางาน phenotype ปกต !!; ถา chromosome นนจากพอม deletion ทาใหตาแหนงทม gene F & M หายไป ลกกจะเหลอ gene M จากแมเทานน, ในทางตรงขามกเชนเดยวกน

- Prader-Willi syndrome เกดจาก interstitial deletion ท paternal chr.15q; อาการคอตวเตย, อวนมาก !! (มความอยากกนอาหารมากๆ จนตองไปขดถงขยะ/แยงอาหารสตวกน), ตาลกษณะเหมอน almond, hypotonia, hypogonadism, สตปญญาบกพรองเลกนอย/ปานกลาง

- Angelman syndrome เกดจาก interstitial deletion ท maternal chr.15q ทตาแหนง & ขนาดเหมอนๆ

กบ Prader-Willi syndrome; อาการคอสตปญญาบกพรองรนแรง, ชก, เดนเกรง, ม ataxic gait (เดนเหมอนหนกระบอกเชด: puppet-like), ใบหนารนเรงมความสข หวเราะบอย = laughing puppet

** ขณะนรแลววา Prader-Willi กบ Angelman syndrome เกดจากคนละ gene แตอยใกลกน !! ทง 2 syndromes นจดเปน contiguous gene syndrome อาจเกดจาก interstitial deletion หรอเกดภาวะ uniparental disomy กได

- Uniparental disomy เกดความผดปกตแบบ genomic imprinting แตเกดจากการไดรบ chr. มาจากพอหรอแมเพยงอยางเดยว (สาเหตนกทาใหเปน Prader-Willi หรอ Angelman syndrome ได) สาเหตมาจาก

1) Trisomic rescue: gamete แมม nondisjunction พอ fertilize แลวได trisomy แลวเกดภาวะททาให allele หนงหายไป กลบมาเปนปกต ถา allele แมหายไป กจะปกตด แตถา allele พอหายไป กจะมทง 2

alleles มาจากแม 2) Monosomic rescue: gamete แมไมม allele นนเลย, gamete พอม 1 allele ปกต, พอ fertilize แลวได

monosomy, ตอมามเหตการณททาใหเกด duplication เกดขนเปน 2 alleles ซงมาพอ - Uniparental heterodisomy ex. เกด nondisjunction ใน meiosis I ของพอ chr. ทเกนมาใน

gamete เปน chr. ทตางกน พอ fertilize แลวกเกด trisomy ตอมาพอแบงตวครงตอไปแลวเกด

chromosome loss (trisomic rescue) chr. ทเหลออยทง 2 chr. ตางกน ! (แตเปนของพอทงค) - Uniparental isodisomy ex. เกด nondisjunction ใน meiosis II ของพอ ได gamete ม 2

chromatids (กคอ chr.) เหมอนกน (ทเดมไมแยกออกจากกน) พอ fertilize แลวกเกด trisomy แบงตวครงตอไปแลวเกด chromosome loss (trisomic rescue) เหลอ 2 chr. (แตเปนของพอทงค) เหมอนกนทกประการ !!

** การม chromosome loss ในการแบงตวครงตอไปน ทาให conceptus มชวตรอดมาได (เพราะถาเปน trisomy อาจมโอกาสรอดนอย)

- Oligogenic inheritance โรคทเกดจาก mutation หลาย loci (แตจานวนไมมาก) เชน

1. Digenic inheritance เกดจาก mutation ท 2 loci โดยคนทเปนโรคตองเปน double heterozygote ex. Retinitis pigmentosa (retina เสอม) 2. Triallelic inheritance เกดจาก mutation 3 alleles แต 2 loci โดย locus หนงเปน homozygote

(mutation ทง 2 alleles) อก locus หนงเปน heterozygote (mutation 1 allele) ex. Bardet-Biedl syndrome (ปญญาออน, มนวเกน, hypogonadism)

 TOP  SI 117 

AADD - Skeletal dysplasia เกดจาก mutation ของ FGFR3 บน chr.4p ทาใหเกดโรตไดหลายอยาง อยทวาเกดท

ตาแหนงไหนของ gene; โรคทเกด เชน 1. Achondroplasia 2. Hypochondroplasia 3. Thanatophoric dysplasia - Craniosynostosis เกดจาก mutation ของ FGFR2 หรอ FGFR1 (กรณ Pfeiffer syndrome); ไดแก 1. Crouzon syndrome (mutation ของ FGFR2) 2. Apert syndrome (mutation ของ FGFR2) 3. Pfeiffer syndrome (mutation ของ FGFR2 หรอ FGFR1) ** skeletal dysplasia & craniosynostosis เปนตวอยางของ clinical heterogeneity และสาหรบ Pfeiffer

syndrome กถอเปนตวอยางของ locus heterogeneity ดวย - ผทเปนโรค achondroplasia จะ ม genetic fitness (ความสามารถในการมลกลดลง เพราะโอกาสแตงงาน

นอยลง); ในทางการแพทย เมอกอนผหญงทเปนโรค achondroplasia เวลาคลอด โอกาสทจะตายทงแมและลกจะ

เยอะ (จงไมคอยมคนเปนโรคทรบมาจากการถายทอด) ม rate of allele loss ; จาก

New mutation rate = Rate of allele loss (Hardy-Weinberg equilibrium) ∴ ตองเกด new mutation เยอะเพอ replace gene ทหายไปจาก gene pool 80% ของผทเปน

achondroplasia ไมไดมประวตวามใครเปนในครอบครวมากอน แตมาจาก new mutation ตอน pre-zygotic (กอน fertilization; คอเกดใน gamete)

- Marfan syndrome เกดจาก mutation ท FBN1 gene บน chr.15q ขาด fibrillin-1 (เปน TGF-β antagonist) สราง CNT ผดปกต เกด pleiotropic effects ทสาคญ 3 ระบบ ไดแก

Ocular dislocation ของ lens Skeletal รปรางผอมสงกวาปกต ใบหนา แขนขา & มอเทาผอมยาว, hyperextensible joints (ขอ

หยอน & ดดงาย), รปรางของ chest & vertebra ผดปกต CVS aortic regurgitation & mitral valve prolapse, เกด aortic aneurysm ** สาเหตการตายของผปวย Marfan syndrome คอ aortic aneurysm แตก (rupture) - Neurofibromatosis type 1 (von Recklinghausen disease) เกดจาก mutation ท NF1 บน

chr.17q ทสราง neurofibromin ซง regulate RAS oncoprotein - ลกษณะสาคญของ neurofibromatosis type 1 ไดแก NF, CAL, brain & spinal cord tumor, bone

lesion (ex. kyphoscoliosis ของ vertebra, deformity & cyst ของ bone) ** NF (neurofibroma) เปนปม tumor พบไดทกสวนของ CNS; CAL (café-au-lait spots) เปนปานส

คลายกาแฟใสนม

- Neurofibromatosis type 2 เกดจาก mutation ท NF2 บน chr.22q - ลกษณะสาคญของ neurofibromatosis type 2 ไดแก acoustic neuroma (Schwannoma of N.8) (คนไข

จะมาดวย deafness), meningioma, juvenile cataract, CAL ** neurofibromatosis type 1 & 2 เปนตวอยางของ locus heterogeneity - Machado-Joseph disease (SCA3) spinocerebellar ataxia (SCA): เกด cerebellar atrophy,

dysarthria, bulging eyes, peripheral neuropathy - SCA3 ม variable onset age: onset ไดตงแตอาย 10-70 ป (สวนใหญคอ 40 ป), ตายภายใน 6-29 ป

หลงจาก onset - Huntington disease atrophy of caudate nucleus ทาใหเกด chorea, dementia, มความผดปกตทาง

จต; ม variable onset age

AARR - Oculocutaneous albinism (OCA) มหลาย types; OCA type IA เกดจาก null mutation ของ TYR

gene บน chr.11q ไมม tyrosinase activity ขาด melanin ท skin, hair, & eye เกด Visual impairment

** OCA 1 ม 2 types คอ tyrosinase-negative กบ tyrosinase-positive (แต activity) ** OCA 2 จะเปน tyrosinase-postivie !!

 TOP  SI 117 

** คด? ถามคนเปน albinism 2 คนแตงงานกน (คนจะเปน albinism ได ตองเปน homozygote ซะดวย เพราะเปน AR)

แตลกออกมาผวปกตทกคน!! แสดงวาอะไร? ตอบ แสดงวาพอ & แมเปน albinism ทเกดจาก mutation ทคนละ locus กน ลกทกคนทเกดมาเปน

double heterozygote ไมเกดอาการ (โรค albinism ม locus heterogeneity)

XXDD - Hypophosphatemic (Vitamin D-resistant) rickets เกดจาก mutation ท gene บน chr.Xp; เปน

rickets ทเกดจากการไม response ตอ physiologic dose ของ vit.D renal tubular resorption of PO4

3- hypophosphatemia & การสราง bone ผดปกต (∴ รกษาโดยให vit.D ขนาดสงๆ) ** rickets bow legs, short stature, slow growth ** คด? ญ. 2 คนเปนพนองกน เปน [XD] hypophosphatemic rickets เหมอนกน แต manifestation ตางกน (คน

หนงเขาหางออกจากกนชดเจน อกคนเขาดคอนขางปกต) ทงๆ ท allelic mutation เดยวกน ทาไม? ตอบ เพราะใน ญ. ทม manifestation มากกวา ม proportion ของ cell ท X chr. ทม mutant gene เปน X

chr. ท active เยอะกวา (แสดงถง extreme lyonization) ** ลกษณะทถายทอดแบบ XD มนอยมาก ทสาคญกคอ hypophosphatemic rickets & Xg blood gr. - ด pedigree แยก XD ออกจาก AD คอใน XD ถาม ช. เปนโรค ลกสาวทกคนจะตองเปนโรค !! ** ทง XD & XR เหมอนกนคอไมม male-to-male transmission เพราะฉะนนถาเหนพอถายทอดใหลกชาย A

พอแยก X & A ไดแลวกดวา ถามลกทเปนโรค แตพอแมไมเปน R

XXRR - Hemophilia A เกดจาก mutation ท FB gene บน chr.Xq ขาด factor 8 ** hemophilia B กถายทอดแบบ XR เกดจากการขาด factor 9 พบนอยกวา hemophilia A ** XR ปกตจะเกดกบ ช. เทานน โอกาสเกดกบ ญ. นอยมากเพราะตองเปนลกของ ช. ทเปน hemophilia กบ ญ. ทเปน

carrier (เปนไปไดยาก ยกเวนแตงงานในครอบครวเดยวกน) ลกสาวทเปนกจะเปน homozygote - ถา ญ. เปน carrier ของ XR แตแสดงความผดปกตออกมา = manifesting carrier คาอธบายทพบบอยสด

คอ Extreme lyonization (Atypical lyonization, Skewed X inactivation, Nonrandom X inactivation) หมายความวาม population ของ cell ทม mutant gene อยบน X chr. ท active เปนสดสวนมากกวา cell ทม normal gene บน X chr.

** ญ. ทเปนโรค XR ม 4 คาอธบายทเปนไปได 1. เปน homozygote 2. เปน heterozygote ทเกด extreme lyonization (พบบอยสด) 3. เปน Turner syndrome (ม chr. เปน 45, X) แลวม mutant allele 4. ม X-autosome translocation แลว gene ตรงตาแหนง breakpoint เกด mutation (จากการท DNA

ถกทาลาย) แสดงความผดปกตออกมา!! เพราะคนทม X-autosome translocation X chr. ทยงปกตอยจะถก inactivate ดวย

- ผชายทเปน hemophilia จะไมมลกชายทเปน hemophilia เลย (XR ไมม male-to-male transmission) แตลกสาวจะเปน carrier 100% = obligate carrier

** hemophilia เปนตวอยางของ allelic heterogeneity ดวย (เกดจาก mutation ไดหลายแบบ)

YY - gene ทสาคญทสดของ Y chr. คอ SRY gene (SRY = sex determining region of the Y) ควบคมการ

สราง TDF (testis determining factor) เพอกาหนดการเจรญทางเพศของ embryo ใหเปนเพศชาย; สมยกอนเปน gene ทใชในการตรวจเพศ

** ปจจบนไมใช SRY gene มาบอกเพศแลว สงทดทสดในการตรวจเพศคอ “การตรวจรางกาย” เพราะ genetic determination ไมไดกาหนด phenotype เสมอไป !

** trait ทกาหนดบน Y chr. เชน ขนาดของฟน, การเปนหมน (ขาด testis-specific spermatogenesis factor ทควบคมการสรางโดย gene บน Y chr. ทาใหสราง sperm ไมได = azoospermia)

 TOP  SI 117 

Chromosome Disorders - chr. ทเราตรวจไดคอในระยะ metaphase (chr. สนทสด) - chr. ท gene บน chr. active chr. จะเปนเสนยาวขดไปมา - ถามการเปลยนแปลงของ chr. ทเราสามารถเหนไดดวย microscope gene ทเกยวของกบการเปลยนแปลงนน

ตองมมากมายมหาศาล (ex. chr. 21 ทเกนมา จะม gene เกนมามากมายมหาศาล) พดใหมไดวาเปนความผดปกตของ gene ท magnitude สงมากๆๆๆ

- Human chromosomes: แบงตาม size & location of centromere ● Metacentric: ม centromere อยตรงกลาง (แบง p & q arms ขนาดใกลเคยงใกลเคยงกน) ● Submetacentric (สมาชกสวนใหญ): ม centromere ใกลกลาง ● Acrocentric: short arm เปน satellite, มกานตอกบ centromere = stalk, chr.13, 14, 15, 21,

22 ** telocentric ไมมในคน - Localization and nomenclature: 1p21.1 chromosome number, arm, region, band, subband ** chromosome region = บรเวณของ chromosome ใน arm ขางนนซงนบจาก centromere ออกไป chromosome band = band ทเทาไรใน region นนนบจาก centromere ออกไป

46,XY ชายปกต

47,XX,+21 หญงม chr. 21 เกนมา คอเปน Down’s syndrome 46,XX,18p- หญงม deletion ท chr.18p 45,XX,-14,-21,rob(14q21q) หญงเกด Robertsonian translocation ของ chr.14 กบ 21 ม

balanced 14/21 (chr. จงหายไป 1) 46,XX,t(1;3)(q32;p24) หญงม balanced reciprocal translocation ระหวาง q32 ของ chr.1 กบ

p24 ของ chr.3 46,X,i(Xq) หญงม isochromosome ของ chr.Xq (ม 46 chr. โดย sex chr. อนหนงปกต อกอนเปน

isochromosome) คนนกจะเปน Turner’s syndrome (เหมอน XO เพราะ p arm ของ X หายไปอนหนง) 45,X/46,XX หญงม mosaicism ของแบบ 45,X กบแบบปกต คอเปน Mosaic Turner’s syndrome (คน

คนนเรยกวา Turner mosaic) - Chromosomal abnormalities numerical (ผดปกตทจานวน), structural (ผดปกตทโครงสราง); อาจ

เกดจาก autosome หรอ sex chromosome; ทาใหเกด congenital anomalies หลายอยางรวมกน

** ทผดปกตท organ เดยว ไมใช chromosomal disorder แนนอน !! - chromosomal disorder ทาใหเกด multiple congenital anomalies, ปญญาออน (mental

retardation), พฒนาการทางเพศผดปกต (คอม delayed development; ex. หญงเปน Turner’s syndrome ไมมประจาเดอน, ชายเปน Klinefelter’s syndrome ม hypogonadism), ทาใหพฤตกรรมเปลยน

(ex. aggressive), ทาใหเกด neoplasm !! ** chromosomal disorder ไมใชสาเหตของภาวะ hermaphrodite (ambiguous genitalia) !! - Numerical abnormalities 1. Aneuploidy หารดวย 23 ไมลงตว ex. Monosomy (2n-1), Trisomy (2n+1), Tetrasomy (2n+2) 2. Polyploidy หารดวย 23 ลงตว (ไมนบ 46 ปกต) ex. Triploidy (3n, 69), Tetraploidy (4n, 92) - กลไกการเกด numerical abnormalities คอ nondisjunction อาจเกดใน meiosis I (ไมมการแยกตวของ

homologous chr.) หรอ meiosis II (ไมเกด centromere splitting) ** คด? 1. ระหวางการเกด nondisjunction ใน meiosis I กบ meiosis II ของรนปยา จะทาใหพอสราง gamete ทม

chr. ตางกนยงไง? ตอบ ถาเกด nondisjunction ใน meiosis I ของรนปยา จะทาใหพอสราง gamete ทม chr. ของทงป & ยาใน

เซลลเดยวกน ถาเกด nondisjunction ใน meiosis II ของรนปยา ของรนปยาจะทาใหพอสราง gamete ททง 2 chr. มา

จากปหรอยาฝายใดฝายหนง

 TOP  SI 117 

2. ถา nondisjunction เกดใน mitosis ของ zygote จะทาใหเกดอะไร? ตอบ ถา nondisjunction เกดตอนการแบงตวครงแรกของ zygote ลกเปน mosaic ทม 2 cell lines คอมทง

trisomic & monosomic ถาแบงเซลลแบบปกตไปแลวแลวคอยเกด nondisjunction ลกเปน mosaic ทม 3 cell lines คอม

euploid, trisomic, & monosomic - ผลรวมทงหมดของการเกด disorder จะชวยให clinician วนจฉยไดโดยวธ pattern recognition

AAuuttoossoommaall DDiissoorrddeerrss - Down’s syndrome ลกษณะเดน: Upslanting palpebral fissure (ตาเฉยงขน 2 ขาง), Small ears (ใบห

เลก), Hypotonia (ตวออน), Flat facies & occiput (ศรษะแบน), Simian crease (ม single transverse palmar crease), Epicanthal fold (มสนของ skin ทเดนขนมาบรเวณหวตา), Congenital heart disease (พบบอย), Duodenal atresia (ทาใหเกด obstruction), Clinodactyly (นวกอยงอเขา), Broad & short hand (มอ & นวสน), Protruding tongue (แลบลน), Flat nasal bridge (จมกแบน), Short statue, เสยงตอการเกด Leukemia, Hypothyroidism, Alzheimer’s disease สงกวาประชากรทวไป

- คนเปน Down’s syndrome 95% เกดจาก trisomy 21 (มกเกดจาก nondisjunction ใน meiosis I ของแม เปน de novo เสมอ)

4% เกดจาก Robertsonian translocation (ม translocation ของ acrocentric chr. กบ chr.21; 1/3 ของคนกลมนเกดจากมพอ/แมเปน balanced translocation carrier ซงม genetic material ครบถวน

จงไมเกดลกษณะใดๆ ผดปกตเลย; อก 2/3 เปน de novo mutation) 1% เกดจาก Mosaicism (เกดจาก nondisjunction ใน mitosis ของ zygote) ถาม cell line ทปกต

มาก ลกษณะของ Down’s syndrome จะลดลง ! ** ถาลกเปน trisomy 21, mosaicism ไมตองตรวจ chromosome พอและแม !! แตถาลกเปน Robertsonian

translocation Down’s syndrome ตองตรวจ chr. พอ & แมเสมอ !! เพราะถาฝายใดฝายหนงเปน balanced translocation carrier โอกาสจะเกดซาในลกคนตอไปจะสง ! (ถาแมเปน carrier โอกาสเกดซาจะสงกวาพอ กลาวใน Genetic counseling)

- หญงทสงอายจะมโอกาสเกด nondisjunction สงขน ! (จากขอมลคอพบวาม incidence สงขน) นยมใชทอาย 35 ป คอถาตงครรภแลวอายเมอเดกคลอด > 35 ป จะตองทาการวนจฉยโรคกอนคลอด (Prenatal diag.) เพราะโอกาสเสยงจากการทา Prenatal diag. < โอกาสเสยงมลกเปน Down’s syndrome ** คนไขเปน Down’s syndrome บางคนมาจากครอบครวทมคนเปน Down’s syndrome > 1 คน หรอเปน

Aneuploidy อน อาจม genetic predisposition ในพอแมททาใหเกด nondisjunction ไดบอยขน - พอแมปกต ลกคนแรกเสยชวตเมออาย 2 เดอน มลกษณะเปน Down’s syndrome ลกคนตอมาเปน Down’s

syndrome ตองเอาลกคนนไปตรวจ chr. เสมอวาเปน trisomy 21 หรอ translocation (ex. ม 46 chr. แต chr.21 ม 3 copies โดย chr. หนงไป translocate กบ chr.14 แลวเมอไปตรวจแมพบวาเปน balanced translocation carrier คอม 45 chr. แตม genetic material ครบ)

** สรป ตองตรวจ chr. คนไขทเปน Down’s syndrome เสมอ แลวเฉพาะคนไขทเปน translocation Down’s syndrome ตองตรวจ chr. ของทงพอ & แม ถาพบวาคนใดคนหนงเปน balanced translocation carrier ตองบอกวาโอกาสทครรภตอไปจะมลกเปนสง !

- Edwards syndrome (Trisomy 18) รนแรงกวา!, เดกมกตาย; ลกษณะเดน: Short sternum (sternum สน), Clenched hand & Overlapping fingers (มอกาแนน & นวเกยกน), Arch pattern on finger tips (ลายนวมอเปน arch pattern ทง 10 นว), Rocker-bottom feet (เทาเหมอนขาเกาอโยก), Prominent occiput (ตรงขามกบ Down’s syndrome ซงม flat occiput)

** การ diag. chromosomal disorder ไมไดใชลกษณะเปนตวบอก แตเอามาใชมาสงสยไดวานาจะเปนโรคอะไร การ

ยนยนตองตรวจ chr. เสมอ !! - Patau syndrome (Trisomy 13) รนแรงยงกวา trisomy 21 & 18 คอจะตายตอนเกด/ตายหลงเกดไม

นาน; ลกษณะเดน: Holoprosencephaly (telencephalic vesicles ไมแยกจากกน) ทาใหเกด midline defect ไปดวย: Cleft lip, Cleft palate, Skin defect at posterior scalp; Polydactyly (นวเกน)

 TOP  SI 117 

- Cri-du-chat (Cat cry) syndrome ลกษณะเดน: Cat-like cry (เสยงรองแหลมสงเหมอนแมวรอง), Microcephaly (ศรษะเลก ปญญาออนมาก), Downward slant of palpebral fissure (ตาเฉยงลง), Low-set ears (ใบหตา), Micrognathia (คางเลก); เกดจาก deletion of chr.5p

SSeexx CChhrroommoossoommee DDiissoorrddeerrss - Turner’s syndrome ลกษณะเดน: Short statue (ตวเตย), Amenorrhea (ไมมประจาเดอน), Absence

of 2˚ sex characteristics (ไมม pubic hair, breast), อาจมประวตวาแรกเกดมบวมทหลงเทา & ทคอ = ม cystic hygroma (เปน lymphatic sac) เมอโตขน sac นจะยบลง แลวเกด fibrosis Webbed neck; ม Low posterior hairline (ตนผมดานหลงตา), Short 4th metacarpals/metatarsals (ถากามอจะเหนชด

บมลงไป) - ปจจบนใช ultrasound มากขนในหญงตงครรภ โอกาสพบ Turner’s syndrome ในระยะทอยในครรภ ** Tunner’s syndrome ไมมปญญาออน (แตอาจมความบกพรองในเรองมต เขยน/อานแผนทไดไมด) - คนเปน Turner’s syndrome 50% เปน monosomy X 20% เปน Turner mosaic ถาเปนแบบ 45,X/46,XY ตองทา gonadectomy เสมอ !! (เพราะทาใหม

โอกาสเปน gonadoblastoma ได) 15% เปน isochromosome ** นอกจากนกอาจเกดจากม ring chromosome, deletion, etc. - Klinefelter’s syndrome ลกษณะเดน: Eunucoid appearance (ตวสง, แขนขายาว), Hypogonadism

(testis & penis เลก), Gynecomastia (จงเพม risk ตอการเกด CA breast) ** Klinefelter’s syndrome ไมมปญญาออน แตอาจมปญหาในการเรยน (learning disability) - fragile site เปน nonstaining gap (ตาแหนงทไมตดสบน metaphase chr.) - Fragile X syndrome เกดจาก triplet (CGG repeat) expansion ท 5’UTR ของ FMR1 gene บน

chr.Xq ปจจบนจงใชวธตรวจ DNA แทน (เมอกอน diag. ไดโดยเพาะเลยง chr. โดยใช culture media พเศษ

แลวตรวจดวย microscope แตปจจบนเปลยนเปนตรวจ DNA แทน) ** FMR = Familial Mental Retardation

- ลกษณะเดน [หกาง คางใหญ ไขยกษ]: Mental retardation, Large ear, Prognathism, Macro-orchidism; การถายทอดเปนแบบ XR

** Fragile X syndrome เปนสาเหตของปญญาออน “อนดบ 2” รองจาก Down’s syndrome CCoonnttiigguuoouuss GGeennee SSyynnddrroommee - Microdeletion/Microduplication เปน deletion/duplication ขนาดเลก ไมสามารถตรวจไดโดยการ

ตรวจ chr. ตามปกต ตองตรวจ DNA โดยวธ FISH !! (เปน molecular cytogenetics; FISH: ใช probe hybridize ไปกบ chr. บน slide แลวด signal ทเกดขน ถาม microdeletion ทสวนของ chr. ใดกไมปรากฏ

signal ท chr. นน) ** ปกตถาจะเหนการเปลยนแปลงดวย microscope ตองมการเปลยนแปลง > 2 Mb; ถานอยกวาน จดเปน

submicroscopic change - Contiguous gene syndrome syndrome ทเกดจาก microdeletion/microduplication ตรงทม gene

หลาย genes อยชดกน gene ขาดหายไป/เกนมาหลาย genes !! (contiguous gene = gene ทอยชดกน) - ตวอยางของ contiguous gene syndrome ทเกดจาก microdeletion เชน Prader-Willi syndrome,

Angelman syndrome, Velocardiofacial syndrome, DiGeorge syndrome (thymus ไมเจรญ immunodeficiency), WAGR syndrome

- ตวอยางของ contiguous gene syndrome ทเกดจาก microduplication เชน Beckwith-Weidemann syndrome (เดกเกดมาตวใหญ, ทองใหญ, สะดอจน, ลนใหญ)

- Velocardiofacial syndrome ลกษณะเดน: Conotruncal cardiac defect (เกด tetralogy of Fallot, pulmonary atresia), Cleft palate, ปญญาออน, มปญหาเรองการเรยน

** velocardiofacial syndrome กบ DiGeorge syndrome เปน syndrome ทสมพนธกน เกดจาก

microdeletion ท 22q11.2 เหมอนกน ** จากกลไกการเกด genomic disorder ทาใหพบประชากรทเปน (reciprocal) cat-eye syndrome ซงเปน

microduplication

 TOP  SI 117 

- WAGR syndrome ประกอบดวย Wilms tumor, Aniridia, Gonadoblastoma, GU abnormality, Retardation of growth & development

Genetics of Thalassemias and Other Hemoglobinopathies - Hb ประกอบดวย heme + globin (4 chains เปน tetramer: กรณ HbA คอ α2β2; แตละ chain จบกบ Fe2+) - Globin gene clusters คนพบตาแหนงของ globin gene กอนใครๆ เพราะมความสาคญ (พบกอนม DNA

technology ดวยซา) ม 2 clusters (cluster = genes กลมหนงมโครงสรางคลายๆ กนมาเรยงตอกน จบกน

เปนกลม) ไดแก 1. α-globin gene cluster อยบน chr.16p; ม locus ของ α-globin อย 2 loci คอ α1 (3’) กบ α2 (5’);

ทง α1 & α2 สราง α-globin chain ทงค แต α2 จะ express มากกวา 2-3 เทา; ม gene ζ 2. β-globin gene cluster อยบน chr.11p; ม gene β 1 locus, γ 2 loci (Gγ กบ Aγ ซงตางกนท AÂ

เพยง 1 ตาแหนง), δ, ε ** ทง 2 clusters ยงม pseudogene มโครงสรางท function ได (คอมาจาก ancestral gene เดยวกน) แต

มนไม function เนองจากการเปลยนแปลง - ทง α-globin, α-globin like, β-globin, β-globin like genes ม structure เหมอนกนคอม 3 exon, 2

intron (intervening sequence, IVS); ม 5’UTR, 3’UTR (ถก transcribed แตไม translated) - α- & β-globin gene มความยาวตางกน โดย α-globin gene ม 141 codon สวน β-globin gene ม 146

codon ได product มความยาวตางกน (α ได 141 AÂ, β ได 146 AÂ), IVS แทรกท codon ตางกน ** α อยบน chr.16 แตม 141 codon, สวน β อยบน chr.11 แตม 146 codon - ทาง 5’ ม promoter (regulatory) region - ขนตอน RNA processing จะนา mRNA precursor ทไดจาก transcription มาตด intron ตรง splice

junction แลวเชอม exon ตอกน (splice = เชอมตอกน) ทาใหเกด mature mRNA translated เปน

globin chain - Globin synthesis เกดไมเทากน เกดจากกลไก gene switching (gene เปด-ปด/เปลยนกนทางาน) - α-globin gene เรม express ตงแตอยในครรภ โดยจะ express มากจนคลอด & หลงคลอด - β-globin gene เรม express ตงแตอยในครรภ แตจะ express มากหลงคลอด ! - γ-globin gene express มากระหวางอยในครรภ และลดลงเมอคลอด & หลงคลอด จนเหลอระดบตา !! ** ดงนน ในครรภ Hb ทพบบอยควรเปน α2γ2 เรยก HbF (fetal Hb) และนาจะม HbA (α2β2) นอย แตเมอคลอด

แลว HbF นาจะลดลง สวน HbA นาจะเพมขน - δ-globin gene เรม express เมอใกลคลอด (แตนอย) แลวก express ระดบนอยหลงคลอดจนเปนผใหญ ** ดงนน HbA2 (α2δ2) จงมปรมาณนอย - Normal human Hb Embryonic Hb Hb Gower 1 (ζ2ε2), Hb Gower 2 (α2ε2), Hb Portland (ζ2,γ2) Fetal Hb HbF (α2γ2) Adult Hb HbA (α2β2), HbA2 (α2δ2) - Genetic disorders of Hb แบงไดเปน 3 กลม 1. Structural Hb variants โครงสรางของ globin chain ผดปกต (ยาวไป, สนไป, AÂ เปลยนไป) ไดแก

HbE, HbCS

- Molecular pathology of structural Hb variant พบไดทกกลไกททาใหเกด mutation (missense mutation, chain termination mutation, deletion, insertion, frameshift mutation, nonsense mutation: ถายงไปทาง 5’ จะมผลกระทบเยอะ!, fusion genes: 2 genes มาเชอมตอกนเนองจาก unequal crossing over ใน meiosis I เมอม synapsis และม crossing over ระหวาง non-sister chromatid ทาใหม genetic recombination)

- Missense mutation ทพบในไทยคอ HbE; ตางประเทศคอ HbS, HbC ** point mutation = single nucleotide substitution (ex. G A) - HbE GAG AAG (Glu Lys) ท codon 26 ของ β-globin gene ทสราง HbA กลายเปน

HbE (จะเหนวาตางกบ HbA ท AÂ ท 26 เทานน) - HbS GAG GTG (Glu Val) ท codon 6 ของ β-globin gene

 TOP  SI 117 

- HbC GAG AAG (Glu Lys) ท codon 6 ของ β-globin gene ** จะเหนวา mutation ทเกดท gene เดยวกน สามารถเกดขนไดท codon ตางกน และท codon เดยวกน

อาจเกดท nucleotide ตางกนได ทาใหเกด allele ทตางกน = allelic (mutational) heterogeneity; และเนองจากม gene อยหลาย locus ทควบคมการสราง Hb ม locus heterogeneity ไดดวย !!

- Chain termination mutation เกดกบ stop codon จงเกด chain elongation; ex. HbCS - HbCS UAA CAG ท codon 142 ของ α2-globin gene ม AÂ เพมเปน 141+31 = 172 AÂ ** HbCS มความสาคญในประเทศไทย เพราะเปนสาเหตการเกด α-thalassemia - Hb Pakse (เจอทลาว) UAA UAU - Nonsense mutation Hb McKees Rock: UAU UAA ท codon 145 ของ β-globin gene - Insertion Hb Tak: ม AC insertion ท codon 147 ของ β-globin gene frameshift (แต

กรณ Hb Tak จะม chain elongation: 146+11 = 157 AÂ ไมใช premature stop เหมอน

frameshift ทวๆ ไปเพราะดนไป insertion ตรง stop codon) - Deletion Hb Gunn Hill: เกดจาก unequal crossing over ใน meiosis I (synapsis

คลาดเคลอนไป เนองจากมน recognize DNA sequence ทม homology กนซงผดไป) ของ β-globin gene เพราะท AÂ ท 91 & 92 กบ 96 & 97 เหมอนกน แลวถดออกไปกยงคลายๆ กน recognize ผดตอน pairing ม deletion ท AÂ 91-95 (จาก 90 ก cross ตอกบ 96 เลย) = microdeletion; สวนอก gamete หนงกจะม AÂ 91-95 ตดกน 2 ชด = เกด microduplication

** ปกตการเกด synapsis (pairing) ใน meiosis I จะตองเกดอยางแมนยามาก! (ไมผดแมแต 1 nucleotide) เมอเกด crossing over ม recombination กยงม genetic material ครบถวน !

2. Thalassemias globin chain ปกต!! แตปรมาณนอยลง!; แบงตามชนดของ globin chain ทสรางนอยลง ex. α-thalassemia, β-thalassemia

** อยางไรกตาม กมบางคนทนอกจากจะสราง globin chain ผดปกตแลว ยงสรางปรมาณนอยลงดวย! คอม HbE หรอ HbCS แลวเปน thalassemia ดวย

- Molecular pathology in α-thalassemia ม 2 กลไก; defect สวนใหญเปน deletion 1. Gene deletion (most common) deletion ของ α-globin gene (ปกตม 2 loci: α1 & α2) α-thalassemia 2 haplotype deletion ไป 1 gene บน 1 chr. α-thalassemia 1 haplotype deletion ไปทง 2 genes บน chr. เดยวกน

** haplotype = group ของ alleles ทอยใกลกนบน chr. เดยวกน และมกถายทอดไปดวยกนทง set (2 haplotypes = genotypes)

- กลไกเกดขนจาก unequal crossing over (เนองจาก α1 กบ α2 คลายกน) α1 ไป pair กบ α2 ของอก chromatid หนง แลว crossover กน จะได

chromatid หนงม α (α1 กบ α2 อยางละครงท crossover กน) อยางเดยว = single gene complex ถาได gamete นไปกจะม α 1 gene ขาดไป 1 gene = α-thal 2 haplotype

chromatid อกอนหนงม α1, α, α2 = triple gene complex ถาได gamete นไปกจะม

α 3 genes -α/αα α-thal 2 haplotype (เหลอ 3 globin genes) เรยกวา α-thal 2 heterozygote --/αα α-thal 1 haplotype (เหลอ 2 globin genes) เรยกวา α-thal 1 heterozygote

--/-α compound heterozygote ของ α-thal 2 & 1 (เหลอ 1 globin gene) เกดโรค HbH disease (α-thal 1/α-thal 2)

** HbH เปน abnormal Hb (คนปกตไมพบ) แตประกอบดวย globin chain ปกตทเปน

homotetramer (β4) --/αCSα ม globin gene ท function ได 1 gene อก 1 gene เกด mutation ททาใหเกด HbCS

HbH disease with HbCS (α-thal 1/HbCS) ** อาจกลาวไดวา HbCS มผลเทากบ α-thal 2 haplotype; จะเหนวา Hb variant โดยตวมนเองไมได

ทาใหเกด thalassemia แตเมอไรทอยในภาวะ compound heterozygosity กจะทาใหเกด

thalassemia ได

 TOP  SI 117 

--/-- α-thal 1 homozygote (α-thal 1/α-thal 1) ไมม globin gene ท function ไดเลย เกด

โรค Hb Bart’s hydrops fetalis ตายคลอดทงหมด! ** Hb Bart’s เปน abnormal Hb แตกประกอบดวย globin chain ปกตทเปน homotetramer - Deletion in α-thal 2 มขอบเขตตางกนหลายขนาด ทสาคญคอ อนทหายไป 3.7 kb กบ 4.2

kb (ขาดหายไปไมเทากน แตกเกดจาก unequal crossing over เหมอนกน แตเนองจาก pairing คลาดเคลอนไดหลายแบบ เพราะใน intergenic DNA (DNA ระหวาง gene) ม sequence ทม homology กน แบงเปน 3 ชวง: X, Y, Z sequences ดงนน ถา Z ไปเขาคกบ Z ของอกสายหนงหรอ X ไปเขาคกบ X ทเปนคนละ intergenic DNA ผลทไดกจะได unequal crossing over ทตางกน)

Rightward deletion (พบบอย) เกด 3.7 kb deletion เกดจาก unequal crossing over ของ Z box (เรยก rightward deletion เพราะ Z อยขวาตอ X)

Leftward deletion เกด 4.2 kb deletion เกดจาก unequal crossing over ของ X box

- Deletion in α-thal 1 ขอบเขต deletion หลากหลายในแตละประชากร ทพบบอยในคนไทย คอ SEA deletion (SEA = southeast asia) deletion ไปเยอะมาก ทง α-globin 2

genes, etc. Thai deletion deletion เยอะกวา SEA deletion

2. Point mutation (rare) - Pathophysiology of α-thalassemia α สรางไมได เกด β4, γ4 เกด HbH (β4) & Hb Bart’s

(γ4) ซงม O2 affinity ** & unstability จบ O2 แลวไมปลอย เดกในครรภทเปน Hb Bart’s hydrops fetalis (ไมม HbA เลย) จะซด, บวม ตายคลอด

- precipitation ของ HbH ใน RBC ทาให RBC ถกทาลายท spleen เกด hemolysis

- Molecular pathology in β-thalassemia ม 2 กลไก; defect สวนใหญเปน point mutation 1. Point mutation (most common) 1.1 Non-functional mRNA (nonsense, frameshift) 1.2 RNA splicing mutation (splice junction, consensus region, intron, exon) 1.3 Transcriptional mutation (promoter mutation) 1.4 RNA cleavage & Polyadenylation mutation RNA splicing mutation ปกตตรง intron-exon junction ทาง 5’ เปน GT, ทาง 3’ เปน

AG; ถาม mutation ex. 1. ทาให splice signal (GT, AG) ผดไป 2. ไป activate cryptic splice site (ซอนเรนอย) ทาใหตรงนนกลายเปน splice site ทถกใช !!

2.1 ถาเกดเปน cryptic acceptor เกด splicing ระหวาง donor กบ cryptic acceptor 2.2 ถาเกดเปน cryptic donor เกด splicing ระหวาง cryptic donor กบ acceptor

ทง 2 แบบกจะทาให mRNA มสวนของ intron เหลออย !! ** นอกจากนน mutation ทเกดใน exon บางทก activate cryptic splice site ได (ex. HbE)

HbE mutation เกดท codon 26 (GAG AAG ทาให Glu Lys) ของ β-globin gene ทาใหม sequence คลาย donor consensus ดวย (เปน conserved sequence) ซงเปน donor splice site activation of cryptic splice site !!

** ปกตตองเชอม codon 30 (อย exon 1) กบ 31 (อย exon 2) พอเกด cryptic donor activate ขนมาท codon 26 จงเอา codon 26 เชอมกบ codon 31 codon 27-30 หายไป

(คอไป 4 codon = 16 nucleotide) & การเชอมกนนทาใหเกด frameshift mutation ดวย เกด premature stop ท codon 38

** พบวาใน HbE splicing ปกตจะเกด 60% อก 40% เกด splicing ท cryptic donor splice site output ของ HbE globin (เพราะการเกด abnormal splicing นจะทาให mRNA ทเกดขนทางานไมได) **นจงเปนเหตผลทวาทาให HbE ทาใหเปน β-thalassemia ดวย เพราะ

นอกจาก HbE จะสรางผดปกตอยแลว ยงทาใหสราง globin ลดลงดวย!!  2. Partial gene deletion (rare)

 TOP  SI 117 

** การรวาอะไรเปน common mutation จะมประโยชนในการ screen หา mutation ท common กอน (ทาใหประหยดเวลาและแรงงาน ไดผลเรว) ถาไมพบจงคอยไปตรวจหา mutation ชนดอนๆ ท rare กวา

** เกด β-thalassemia β-globin ratio ของ α/β globin α ทมสดสวนมากกวากจะจบกนเองเปน homotetramer หรอไปจบกบ chain อน (δ, γ) HbA (ถาเปน β+ thalassemia) หรอไมพบเลยถาเปน β0 thalassemia), HbA2 & HbF

- Pathophysiology of β-thalassemia เนองจากม ineffective erythropoiesis & เกด hemolysis ทาใหเกด anemia, bone marrow expansion bone deformity, hypercatabolism ผอม

แกรน ตวเตย, Fe2+ absorption Fe2+ load !! (ทาใหเกด endocrine deficiency, cirrhosis, heart failure) จะเหนวาเกดผลหลายอยางตอรางกาย = pleiotropic effect

3. Hereditary persistence of fetal Hb สราง HbF ตอเนองไปใน adult - Alleles and haplotypes at globin loci เนองจาก α-globin ม 2 loci, สวน β-globin ม 1 locus;

ดงนนจะพดถง α-thal haplotype กบ β-thal allele At α-globin loci (บน chr.16p) ม haplotype ได 3 ชนดไดแก α-thal 2 (-α/αα), α-thal 1 (--

/αα), HbCS (αα/αCSα) At β-globin loci (บน chr.11p) ม allele ได 3 ชนดไดแก β0-thal (β0 thal), β+-thal (β+ thal), HbE

(βE) - Common thalassemia disease in Thailand

Disease Genotype Hb Bart’s hydrops fetalis α-thal 1/α-thal 1

(homozygote) HbH disease α-thal 1/α-thal 2

(compound heterozygote) HbH disease with HbCS α-thal 1/HbCS

(compound heterozygote) HbCS homozygote (ทาใหเกด thalassemia ไดแตรนแรงนอย)

HbCS/HbCS (homozygote)

Homozygous β-thalassemia (รนแรง !!)

β-thal/β-thal (ปจจบนพบวาจรงๆ เปน compound heterozygote เปนสวนใหญ เกดจาก

mutation คนละชนด) β-thalassemia/HbE disease (พบบอยในคนไทย)

β-thal/HbE (compound heterozygote)

- Hb Bart’s hydrops fetalis บวมนา (hydrops), เดกมตบมามโต, หวใจโต

** hydrops fetalis มหลายสาเหต หนงในนนกคอเปน thalassemia ชนดรนแรงทม Hb Bart’s (γ4) - Homozygous β-thalassemia ถาเปนชนดรนแรง แสดงออกตงแตเดก; ตอนแรกเกดหนาตาไมเปลยนแปลง

มากนก แตจะดซด ตอมาจะเตบโตชา, ซด, ตบมามโต ** อาจมบางคนเปน homozygous β-thalassemia แตไมรนแรงนก เตบโตมาจนเปนผใหญ (แตพบนอย) - β-thalassemia/HbE disease (พบบอย) โดยทวไปจะรนแรงปานกลาง (แตถารนแรงมากกจะมอาการตงแต

เดก), ม face ทเปนแบบฉบบของ thalassemia (เพราะม bone marrow expansion เพอ compensate สราง RBC), ตาเหลอง, ซด, cachexia (เพราะม hypercatabolism)

- thalassemia ม variable severity (สดแลวแตวา genotype เปนอะไร) ex. β-thalassemia/HbE disease แตละคนรนแรงไมเทากนเนองจากม allelic heterogeneity

- พบวาคนทเปนพนองกน ม mutation ชนดเดยวกน และเปน β-thalassemia/HbE disease ทงค แตมความรนแรงของโรคไมเทากน แสดงวาม modifier gene มผลตอ severity

** ปจจบนความสนใจเรอง modifier gene มเยอะมาก เพอจะดวา gene ใดทจะทาให severity ของ thalassemia ลดลง นาไปสการรกษา ! **พบวาคนทม HbF สงจะ severity นาไปสการหาทางให HbF ยงคงสรางอยจนถง adult

 TOP  SI 117 

- HbH disease ม locus heterogeneity ดงนน แตละคนม severity ไมเทากน

- Thalassemia Non-disease form ไมเปน disease !!, ทสาคญคอ heterozygote ทกชนด !! ไมเปนโรค

ไมมลกษณะผดปกต, ไมมสขภาพออนแอ, ไมตางจากคนทวไป, ดภายนอก & ตรวจรางกายกไมร ** heterozygote ทกชนดไมเปนโรค เพราะ thalassmeia ถายทอดแบบ AR (คนทเปน heterozygote กจะ

เปน thalassemia carrier เทานน) α-thal 2 homozygote (α-thal 2/α-thal 2) ม gene α-globin ท function 2 genes เทยบเทา

α-thal 1 heterozygote non-disease (heterozygote ทกชนดเปน non-disease) α-thal 2/HbCS (compound heterozygote) มผลเทากบ α-thal 2 homozygote หรอ α-thal 1

heterozygote HbE homozygote (HbE/HbE)** Heterozygote & Double heterozygote ทงหมด !! - คนทเปน thalassmia non-disease form มผล Hb ตากวาคนทวไป แตเขาไมซด !! (จะไมมความผดปกตเลย อยา

ไปบอกวา “ซดเลกนอย”) 40% ของ นศพ. กเปน thalassemia carrier (ซงกแขงแรงเปนปกต) - Thalassemia in population ในประเทศไทย มคนเปน heterozygote (carrier) ≈ 40%; บางคนเปน

heterozygote > 1 ชนด (คนเปน homozygote ทไมเปนโรคกมมากในประชากรดวย) - ปจจบนมวธตรวจหาชนด Hb ททาไดงาย แมนยา ไมประหลาดใจวาคน 1 คนอาจม mutation ไดหลายอยาง แต

ความไมประหลาดใจของ geneticist นทาให clinician ตองระมดระวงการคานวณ genetic risk & การให counseling เพราะการถายทอดของ thalassemia ไมเหมอนกบ AR ทเกดจาก rare gene

- thalassemia เปน common gene ในประชากรม heterozygote เยอะ! ซงกมหลากหลายชนด บางชนด

gene interaction ทาใหเกด thalassemia บางชนดกไมทาใหเกด

- heterozygote frequency ในไทย α-thalassemia พบมากทสด; α-thal 2 พบมากกวา ! - HbE เทานน! ทแตกตางระหวางภาค โดยภาคอสานมเยอะมาก !! แต!! HbE โดยลาพงกไมไดทาใหเกดปญหาใด

จนกวาจะมาอยในภาวะ compound heterozygote กบ β-thalassemia เทานนจงจะเปนโรค β-thalassemia/HbE disease

** แตอนๆ คอ α-thalassemia, β-thalassemia, HbCS ไมมความแตกตางระหวางภาค - การทประเทศไทยม thalassemia เปน common gene ใน population เชอวาเปนเพราะ heterozygote มความ

ไดเปรยบใน natural selection = selective advantage คอจะถกคดเอาไว เพราะคนทเปน heterozygote ของ thalassemia จะมความตานทานตอ malaria falciparum ดกวาคนทม gene ปกต (เหมอนการม sickle-cell anemia ในคนผวดา) พบมากในภมภาคทเปน endemic area ของ malaria

** ปจจบน เรมพบวา คนทเปน thalassemia carrier อาจม risk ตอการเกด CHD นอยกวาคนทม gene ปกต - ลกทไดรบ mutant gene 2 gene มาจากพอและแมทเปน carrier เกดโรคได !! (แตถาทง 2 gene นนไมม

allelic interaction กนกไมเปนโรค !!) - การท thalassemia เปน common gene (ม frequency ) ม heterozygote, homozygote, &

compound heterozygote ใน population มาก มการแตงงานจานวนมากระหวางบคคลเหลาน แมไมใชญาต

กน การถายทอดตางจาก AR แบบฉบบในแง recurrence risk & pedigree (ดไมเหมอน คอจะมผปวย

thalassemia ในพนองหลาย sibship, พบไดในหลาย generation) - การพบในพนองหลาย sibship เพราะมการแตงงานระหวาง heterozygote ไดหลายคในครอบครว - การพบไดหลาย generation เพราะมคนทเปนโรคคอ homozygote ไปแตงงานกบ heterozygote ดการ

ถายทอดเหมอนเปน AD = Quasidominant (Pseudodominant) inheritance (quasi = ดคลาย) ** ดงนน การประเมน risk ของ thalassemia ตองระวง !! กอนประเมนตองทราบ genotype ของคแตงงานโดย

ตรวจเลอด และ/หรอตรวจ DNA ใหแนกอน การประเมน risk ใช chromosome diagram หรอ Punnett square & ทสาคญ ตองรวา genotype ใดคอ disease form และ genotype ใดคอ non-disease form

** ทพบเปนปญหาทาง clinic คอคนทเปน HbE heterozygote อาจม α-thal 1 haplotype ซอนอยดวย ดงนน

อยาประเมนแต risk ของ β-thalassemia ** การตรวจพบวาเสยงตอการมลกเปน thalassemia เปนประโยชนในการหลกเลยง & ปองกนการมลกเปนโรค !!

 TOP  SI 117 

Biochemical and Molecular Genetics of Human Diseases - mutation ทาใหเกดโรคไดดวย 3 กลไก 1. Loss of function ทาใหเกดโรคสวนใหญ !! 2. Gain of function 3. Nowel property (gene product มคณสมบตตางจากเดม) - ถาเกด mutation ใน coding region เกด abnormal protein - ถาเกด mutation ใน regulatory domain สราง protein นอยลง แตตวโครงสราง protein ปกต - ถาเกด mutation ททาให RNA ไมเสถยร/สญเสย function เกด abnormal protein หรอสราง protein

นอยลงกได - โรคบางกลมเกดจากการม gene expression ผดท ผดเวลา ! - enzyme deficiency (inborn error of metabolism) มกถายทอดแบบ AR, ขาด enz. product ท

อย distal ตอ enz. นนใน pathway นนจะสรางไดนอยลง & ม accumulation ของ precursor precursor ทม accumulation อาจม alternative pathway เกด metabolite อนๆ

** บางครง 1 gene ผดปกต อาจมผลตอ enz. หลายชนดกได !! - [AR] Phenylketonuria (PKU) พบบอยในประชากรผวขาว, การตรวจพบแตเนนๆ แลวใหการรกษาแตตน

จะปองกนผลเสยจาก gene ได 100%; เกดจาก mutation ใน gene ทสราง enz. phenylalanine hydroxylase ม accumulation ของ Phe ใน body fluid มผลตอสมอง ทาใหม Mental retardation (ปญญาออน),

Epilepsy (ชก), เดกสราง melanin pigment ไมได ทาใหม Fair skin (ผวสออน), Blond hair, Blue eyes, นงในทา Tailor’s position (ทาคนเยบเสอ)

** โรค PKU เปนโรคแรกทไดทาการ screen หาความผดปกตในเดกแรกเกด - เดกทเปน PKU จะตองจากดปรมาณ Phe ในอาหารจนโต, แมทเปน PKU แลวตงครรภกควรจากดปรมาณ Phe

ดวย มฉะนนเลอดแมจะมผลตอเดกในครรภ (ไมไดแปลวาจะทาใหเดกเปน PKU) - [AR] Alkaptonuria เกดจากการขาด enz. homogentisic acid oxidase (HGO) ม accumulation

ของ homogentisic acid ถกขบออกมาทาง urine ถาเอา urine ตงทงไวในอากาศกจะถก oxidize กลายเปนสดา !!; ม dark pigment deposit อยท tissue (sclera, cartilage (ดทใบห), collagenous tissue, joint) = Ochronosis ผาตดเขาไปจะเจอ vertebra เปนสดา; คนไขจะมาดวย Arthritis (degenerative arthritis)

- [AR] Oculocutaneous albinism (OCA) (เหมอนเดม) - [AR] Tay-Sachs disease เปน prototype ของ lysosomal storage disease; พบบอยมากในคนยว

พวก Ashkenazic Jews; เกดจากการขาด enz. hexosaminidase A accumulation ของ GM2 ganglioside (เปน sphingolipid) ใน lysosome ของ brain; แรกเกดเดกจะปกต ตอมาจะเรมมความเสอม

พฒนาการ ตาบอด หหนวก แลวเสยชวตเมออายนอย (2-4 ขวบ) = Progressive neurological deterioration; ลกษณะท typical คอจะม cherry-red spot ใน retina

** hexosaminidase A เปนตวอยางของการท enz. ทจะ function ไดตองประกอบดวย subunit หลายชนด

hexosaminidase A ประกอบดวย: α subunit (คมโดย gene บน chr.15), β subunit (คมโดย gene บน

chr.5), & activator (คมโดย gene บน chr.5); ถามสวนใดผดปกตไป hexosaminidase ไมสามารถ

cleave ตรงตาแหนงระหวาง N-acetylgalactosamine กบ galactose ได เกด accumulation ของ GM2 ใน lysosome ใน brain

- [AR, XR] Mucopolysaccharidosis ขาด enz. ในการสลาย GAG ผทเปนจะมลกษณะคลายคลงกน คอ

มการเปลยนแปลงของ face, bone, joint; เกด Coarse facies (ใบหนาไมสละสลวย), Hepatosplenomegaly(ตบมามโต เพราะม GAG สะสม), Stiff joint (ขอตดยด), Skeletal abnormalities, Mental retardation (มในบางโรค)

** โรคในกลมนทงหมดถายทอดแบบ AR ยกเวน!! Hunter syndrome โรคเดยวทถายทอดแบบ XR - เฉพาะกรณ [AR] Hurler syndrome จะม Cornea clounding (cornea ขน) ดวย

** Hurler syndrome จะรนแรงกวา Hunter syndrome (เพราะ Hurler จะม mental retardation มากกวา และม cornea ขนดวย)

- [AD] Familial hyperchloresterolemia เปน risk factor ของ CHD; พบบอยในคนผวขาว, เกดจาก

mutation ของ gene ทสราง LDL receptor deposit ของ lipid ตามทตางๆ Xanthelasma,

 TOP  SI 117 

- mutation ของ LDL receptor ทเกดในโรคนมหลายชนด แบงไดเปน 6 classes 1. สรางไมได 2. สรางได แต transport ไปท GA ไมได 3. จบ LDL ไมได 4. cluster อยใน coated pit ไมได 5. recycle ไมได 6. ไปหา target ท basolateral membrane ไมได - [AR] Cystic fibrosis ผดปกตท membrane protein ททาหนาทเปน Cl- channel (มหนาทขบ Cl- & ม

ผลตอ Na+ channel ใกลๆ ใหปดไมให Na+ เขา จดประสงคเพอใหในเซลลม NaCl ตา secrete secretion ไดดขน !!) เรยกวา cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) ซง encode จาก

CFTR gene บน chr.7 - ปจจบนพบ mutation ของ cystic fibrosis > 1,500 ชนด แต most common mutation ของ cystis

fibrosis คอ ΔF508 (deletion ของ Phe ทเปน AÂ ทตาแหนง 508) ** ดงนน เวลา screen หา cystic fibrosis กจะหา ΔF508 กอน - ท CFTR gene พบวาม polymorphic marker อยขนาบหวทาย พบวาม linkage disequilibrium = การท

marker allele หนงๆ ถายทอดไปกบ disease gene อยางสมาเสมอทงประชากร!! (คอ allele คหนงจะไปดวยกนเสมอ)

** เปนการบอกดวยวา mutation ใน ancestor ของ western Caucasian เรมตนมาจากบรรพบรษเดยวกนเปนสวนใหญ แลวตอมากคอยม divergence ไป

- domain ตางๆ ของ cftr (เปน Cl- channel; regulate Cl- & Na+) ประกอบดวย 1. regulatory domain (R) 2. nucleotide binding fold (NBF) 3. transmembrane domain (TM) ** การตรวจหา mutation สมยกอน จะตรวจหา sweat Cl- จะม Cl- มากขน !! - เดกทเปน cystic fibrosis จะม RTI (respiratory tract infection) เกด Chronic lung disease; ม

Pancreatic insufficiency (pancreatic enz. malabsorption), meconium ileus, **ม Congenital bilateral absence of vas deferens (CBAVD) (ไมม vas deferens ทง 2 ขางแตกาเนด)

- คนไขสมยกอนจะเสยชวตจาก RTI แตปจจบนม ATB ทด มคนไข ½ ทมชวตอยไดจนถงวยหนมสาว แตกจะ

เสยชวตจาก respiratory failure, 2˚ heart failure (เนองจากมโรคปอด) - [XR] Dystrophinopathies mutation ของ gene ทสราง dystrophin (เปน gene ทใหญทสดของมนษย

!! ขนาด 2.3 Mb ม 79 exon สราง protein ขนาด 427 kD เปน protein อยใน membrane ของ muscle & brain) บน chr.Xp; กลไกสวนใหญเกดจาก deletion (ผปวย 2/3 เกดจาก deletion); ทสาคญม 2 โรคคอ

1. Duchenne muscular dystrophy (DMD) เปนโรค muscular dystrophy ทพบบอยสดในเพศชาย!!, เกดจาก out-of-frame deletion (deletion ททาใหเกด frameshift); เดกจะม Muscle weakness เรมจากขา เดนแลวจะลมบอย เดนยายกนเหมอนเปดเดน = Waddling gait, ม Calf pseudohypertrophy (นองใหญจากสวนทไมใช muscle เพมขน !! ม muscle weakness เดกจะนงยองๆ ลกขนยนลาบาก) ตอมาจะออนแรงลงเรอย จากขากไปแขน ตอมาเดนไมได ตองนง wheelchair, ในทสดกจะเสยชวตจาก infection, heart failure (เพราะ dystrophin เปนสวนประกอบของทง skeletal m. & cardiac m.)

** คนเปน DMD ควรทากายภาพบาบด + ใหแนะนาเกยวกบการชวยเหลอตวเอง, breathing exercise, passive movement (ถาไมไดทา ตอไปกจะเกด contracture ของ joint)

2. Becker muscular dystrophy (BMD) พบนอยกวา DMD, เกดจาก in-frame deletion (deletion ททาใหบางสวนของ gene ขาดหายไป แตไมเกด frameshift ม AÂ บางสวนหายไป แต AÂ ทมอยกปกต)

** การวนจฉย dystrophinopathies ทง DMD & BMD: ม Gowers’ sign ถาใหลกขนจากพน เดกจะควาตว แลวคอยๆ เอามอยนขาแลวเอามอไตขาขนมา (climbing up) จนยนตรงได (ไมสามารถยองๆ แลวลกขนไดเอง

เพราะม weakness ของ pelvic girdle ** ในทาง clinic จะแยก DMD กบ BMD โดยอาศย severity ของโรคเปนเกณฑ

 TOP  SI 117 

ถาเดกเดนไมไดตงแตอาย < 13 ป DMD ถาเดกยงเดนไดจนอาย > 16 ป BMD ถาอยระหวางนน intermediate type ** dystrophin gene เปนหนงใน gene ทม mutation สงสด เพราะเปน gene ขนาดใหญ โอกาสเกดการ

เปลยนแปลงจะงาย!! คนทมาหาเราไมมประวตเปนมากอนในครอบครว (เปนคนเดยว) ** ปกต การเปนโรค XR คนเดยวในครอบครว อาจเกดจาก 1. New mutation 2. พอ/แมเปน germline mosaic

3. แมเปน carrier (โดยจาก new mutation/โดยไดรบมาจากยาย) - ยอม IF (detect dystrophin ใน muscle) พบวา BMD จะพบ dystrophin นอย, สวน DMD จะไมพบเลย! - dystrophin protein ปกตจะประกอบกนเปน Dystrophin dimer N-terminal จบกบ actin (ในเซลล) C-terminal จบกบ glycoprotein (sarcoglycan) complex (ซบซอนมาก) ซงไปจบกบ laminin (นอก

เซลล) ** glycoprotein complex ประกอบดวย subunits มากมาย ความผดปกตของ subunit ของ complex นกทาใหเกดโรคกลามเนอหลายชนดแตกตางกน แตกไมสาคญเทา DMD & BMD

- บรเวณทจะม deletion บน dystrophin gene = deletion hot spot - เนองจาก dystrophin gene มขนาดใหญมาก ตาแหนงทม deletion กจะแบงเปน 2 บรเวณคอ 1. ทางใกล 5’ 2. บรเวณทอยกลางๆ gene - [AD] Osteogenesis imperfecta (OI) ความผดปกตของ collagen type I คนไขจะม Bone

fracture บอยๆ, Blue sclera (sclera บางจนเหน pigment ใต sclera sclera เปนสฟา), etc. ** OI ม 4 types (type I – IV) แตละ type มความรนแรงมากนอยตางกน - OI type I รนแรงนอย; ม Bone fracture, Blue sclera, Deafness (เนองจากม otosclerosis:

กระดกหเชอมตดกน) - OI type II รนแรงมาก; ม Bone fracture ตงแตอยในครรภ !! คลอดมากตาย เปน perinatal death

(เพราะกระดกหกหมดทงตว !!, กระดก cranium บางนม) ** OI ถายทอดแบบ AD แตกรณของ OI type II จะเปน AD ทเปน new mutation เทานน !! (คอเปนคนเดยวใน

ครอบครว) เพราะใครกตามทเปน OI type II จะไมสามารถมชวตอยรอดจนมลกได ! - Collagen type I เปน triple helix ประกอบดวย procollagen ซงประกอบดวย 3 สายยอย: proα1 2 สาย

& proα2 1 สาย รวมเปน procollagen collagen collagen fibrils mineralization (ใน bone) - mutation ของ collagen type I มหลายชนดมาก แบงไดเปนกลมใหญๆ 2 กลม 1. Collagen production OI type I: ม mutant allele ททาใหไมสราง proα1 เลย = null allele;

ปกต proα1 ม 2 สายกม 2 genes ถาม mutation ท 1 gene ทาใหเมอเอา proα1 ทสรางไดจากอก

gene หนงไปรวมกบ proα2 กจะได collagen type I ลดลง ½ เหลอ ½ (ความรนแรงจงนอยกวา) 2. Altered collagen structure OI type II-IV: กรณ OI type II ม missense mutation (AÂ

ตางไป) มผลรนแรง: สราง proα1 ไดแต structure ผดปกต เมอไปรวมกบ proα2 แลวเกดเปน

triple helix ได collagen ท structure ผดปกต degrade ไปถง ¾ เหลอ ¼ ** เปรยบเทยบกบ Hb: collagen product กเหมอน thalassemia; altered collagen structure กเหมอน

structural Hb variants; แต pathogenesis ไมเหมอน (ผลตางกนกบ Hb เลย) - ผลของการเกด mutation ในภาวะ heterozygote แลวมผลกระทบตอ normal allele จนทาให normal allele

function ไมได เรยกวา dominant negative mutation - [XR] Hemophilia (เหมอนเดม) ม joint deformity (เนองจากม bleeding ท joint = hemarthrosis) ** ปจจบน เดกเปน hemophilia เราตองทาใหเขามชวตเปนปกตดวยการให factor VIII ทดแทน - mutation ทสาคญใน hemophilia A คอการเกด inversion ของ gene (พบในคนไข severe hemophilia

ครงหนง !!) - factor VIII gene ม A gene (เปน gene เลกๆ) อยใน intron ท 22 & อยท distal ตอ gene ไปทาง

telomere อก 2 genes (คอม A gene อย 3 genes) - เมอม intrachromosomal crossover โดยเกด looping แลวม crossover ระหวาง “A gene ใน intron” กบ

“A gene อยนอก gene ไปทาง telomere” (ทาง 5’ หรอทาง upstream) เกด flip inversion

 TOP  SI 117 

[ ปกต ] 3’ 26 22 1 A A 5’ [ หลงจากเกด intrachromosomal crossover ] 3’ 26 (22/A) A 1 (22/A) 5’ จะเหนวากลบหวกลบหาง disrupt gene gene function ไมได ** โดยเหตน inversion ของ factor VIII gene จงเปนสาเหตของคนไข severe hemophilia ครงหนง (เพราะ

สราง factor VIII ไมไดเลย) - Disease due to unstable repeat expansion (เมอกอนพบแต expansion ของ 3 nucleotides จง

เรยกวา triplet repeat expansion) โรคทงหมดทอยในกลมน ทาใหมความผดปกตของสตปญญา (mental) & ระบบประสาท (neurological); จานวนชดท repeat ยงมการเปลยนแปลงระหวางทมการถายทอดจาก gen. อก gen. หนง (อาจเปนการถายทอดใน gamete รวมทงการถายทอดใน mitosis ของเซลล ex. เซลลสมอง)

- repeat expansion อาจพบทสวนใดใน gene กได ex. ท 5’UTR, exon, intron, 3’UTR; ในแตละโรคกจะเกด

repeat expansion จาเพาะกบโรคนน ตางตาแหนงกนในแตละโรค - กลไกการเกด repeat expansion เกดจากกลไก slipped misparing (pairing ระหวางเกด replication ของ

DNA หรอระหวาง DNA repair ถา pair เลอนไปกจะทาใหเกด repeat expansion ได) ยง gen. ผานไปมากขน ยงม unstable repeat expansion มากขน ความรนแรงจะยงมากขนในชวคนถดๆ ไปในครอบครว

เดยวกน = anticipation - โรคทเกดจาก unstable repeat expansion ทรจกกนด คอ Fragile X syndrome (5’UTR มผลตอ transcription) Huntington disease, SCA3 (exon มผลตอ gene product) Friedreich ataxia (intron) Myotonic dystrophy 1 (3’UTR) ** ม myotonic dystrophy 2 ดวย เกดจาก tetranucleotide repeat ทเกดใน intron จะเหนวา myotonic

dystrophy ม locus heterogeneity !! - ทา PCR & gel electrophoresis ในคนทเปน Huntington’s disease พบวา expanded allele จะทาให

เกด band ทวงชา (สวน normal allele กวงเรวปกต) แลวถาไปตรวจพอทเปนโรคจะมจานวน expansion นอยกวา (expanded allele ของพอจะวงเรวกวา เพราะในลกจะเกด repeat expansion มากกวา) แสดงถงปรากฏการณ anticipation

- Genomic disorders โรคในกลมนมลกษณะพเศษคอ เกดจากเพม/ลดจานวน copy ของ gene ทปกต - genomic disorders เกดจาก structure ของ chromosome ผดปกต เนองจากเกด homologous

recombination (recombination ระหวาง sequence ทม homology กน) ระหวาง low-copy repeat (repeat ทมจานวนชดไมเยอะ) แลวทาใหจานวน copy เปลยนไป!! (ex. ปกตม 1 ชดกลายเปน 2 ชด หรอไมมเลย)

- ตวอยางของ genomic disorders (เปนการพสจนการมอยจรงของกลไกน !!) HMSN I & reciprocal HLPP Smith-Magenis syndrome & reciprocal 17p11.2 duplication Velocardiofacial syndrome/DiGeorge syndrome & reciprocal Cat-eye syndrome - [AD] Hereditary motor and sensory neuropathy (Charcot-Marie-Tooth disease) type I

(HMSN I) เปนสาเหตของ peripheral neuropathy ทถายทอดทางพนธกรรมทพบบอยทสด !! - การเกด HMSN I: PMP22 gene (บน chr.17p) จะม sequence ทขนาบอย (flanking) 2 ขาง ใหเปน X กบ

Y เกด homologous recombination ระหวาง X กบ Y (ซงม low-copy repeat) ของ non-sister chromatid (คอ mispairing)

ได X PMP22 Y/X PMP22 Y = ม duplication ของ PMP22 gene เปน 2 ชด เกด HMSN I: เกด demyelination peripheral neuropathy

ได X/Y = ม deletion ของ PMP22 gene เกด HLPP (hereditary neuropathy with liability to pressure palsies: มแนวโนมตอการกดทบ)

** PMP = Peripheral Myelin Protein ** HMSN I เกดจาก duplication แตอาจเกดจาก point mutation กได ** ในประชากร เราจะสามารถพบทงคนไขทเปนโรค HMSN I และทเปนโรค HLPP เปนตวอยางวา

ปรากฏการณ homologous recombination ทเกดขนระหวาง low-copy repeat ใน genome มอยจรง !!

 TOP  SI 117 

- คนทเปน HMSN I จะ onset ตอนอาย 10-30 ป, ม Slow progressive distal muscle weakness & atrophy ขาลบ มลกษณะเหมอน inverted champagne bottle (ขวดแชมเปญกลบหว)

Pharmacogenetics and Pharmacogenomics - Pharmacogenetics การศกษา variation ในการ response ตอยา เนองจากความแตกตางของ gene; เปน

การดท 1 locus หรอท 1 allele ** ex. ผปวย G6PD deficiency มการ response ตอยาบางชนดโดยการเกด hemolysis ของ RBC เนองจาก

ม variant ของ allele ของ G6PD gene - Pharmacogenomics (-ome = the whole) การศกษา whole genes ใน genome ทมผลตอการ

response ตอยา; เปนการด interaction ของ gene ของแตละคนตอ drug response (ดทละหลายๆ genes เหมอนการศกษา complex disease)

** ความรนนามาใชในการพฒนายาใหม ปรบการรกษาดวยยาใหเหมาะสมกบแตละบคคล โดยอาศยพนฐานวาเขาม gene อะไรอย !

- ถาเราใชยา dose เทากนในประชากร ประชากรจะแบงไดเปนกลมตางๆ ไดแก 1.กลมทยาใชไมไดผล (ineffective), 2. กลมทยาไดผลดตามตองการ (optimal effect), 3. กลมทเกดพษจากยา (toxic effect)

- ทาอยางไรจงจะสามารถตดคนกลมทรกษาแลว ineffective กบกลมทเกด toxic effect ออกไป? นามาซง individualized medicine (การนาความร genomics มาใชในการจดการรกษาแตละคนตาม genome ของเขา ใหได optimal effect ทกคน)

** ปจจบน individualized medicine ยงทาไมได เพราะมยามากมายมหาศาล, gene ทมอทธพลตอ

metabolism ของยากมมากมายมหาศาล ดงนนปจจบนตองเลอกทาเฉพาะยาทมความสาคญทางการแพทย & ม TI แคบ

- Pharmacogenetic disorders เกดจาก 1. enz. หรอ protein มไมพอ/ทางานไมได 2. ความผดปกตของ receptor, transporter, channel protein 3. response ผดปกต เพราะ enz. ออกฤทธ/express มากเกน - คนไขแตละคนม BuChE polymorphism (BuChE = (butyrylcholine esterase) ระวงการให succinyl

choline (เปน noncompetitive neuromuscular blocking drug ออกฤทธ 3 min แลวจะถก BuChE ทาลาย ถาคนไขม BuChE ไมด จะทาใหเกด prolonged paralysis: หยดหายใจอยนานเกน 3 min)

- Malignant hyperthermia เปน monogenetic disorder ทคนไขบางคนเมอไดรบยาสลบบางชนดจะเกดภาวะไขสง, K+ สง, ชก เสยชวต !

- [XR] G6PD deficiency พบในประชากรโลก ≈ 4 ลานคน; บรเวณทม endemic malaria จะมผทเปน

G6PD deficiency มาก (เพราะเปน protective benefit); ม incidence ถง 12% ใน Thai males; เกดจาก

missense mutation (เกดท exon ตางๆ กน หรอทตาแหนงตางๆ กนบน exon เกด polymorphism) - คนทเปน G6PD deficiency จะปกตด จนกวาจะไดรบยา/สารบางอยางจากภายนอกรางกายเขาไป เกด

intermittent hemolytic anemia เปนๆ หายๆ (เปนตอนรบยา) ถารนแรงมากจะเกด renal failure ได (เนองจากม hemoglobinemia)

- บางทเดกจะเกด neonatal jaundice (ตวเหลองในระยะแรกเกด) - อาจม chronic hemolytic anemia (พบนอย) - กนถวปากอา (fava bean) เกด favism (ม hemolysis จากการกน fava bean) - variant (polymorphism) ของคนเปน G6PD deficiency ทพบมากในไทย ไดแก 1. G6PD Viangchan (WHO class III) 2. G6PD Canton (WHO class II) 3. G6PD Mahidol (WHO class III) ** class นอยๆ จะยงรนแรง !! (คอใน 3 variants น G6PD Canton รนแรงสด!) ** คนทม variant ของ G6PD จะเปนเครองมออยางหนงในการศกษา clone ของเซลล - G6PD variants แบงเปน 1. G6PD B normal variant ทพบในคนทวไป 2. G6PD A normal variant ทพบในคนผวดา

 TOP  SI 117 

- ถา abnormal variant ( activity) ของ G6PD ชนดใดวงใน gel electrophoresis แลวไปอยตาแหนงเดยวกบ G6PD B จะเรยกวา G6PD B- (ถาตาแหนงเดยวกบ G6PD A กเรยก G6PD A-)

Ex. BA ผหญงปกต; A- ผชายท G6PD def. (ทม A-); BA- ผหญงเปน heterozygote ทม A- ** ปจจบน enz. variant ทแยกไดโดย electrophoresis มา > 400 variants แลว - ยากลมสาคญทตองระวงการใหในผทเปน G6PD def. คอ sulfonamide, chloramphenicol, primaquine,

aspirin, paracetamol overdose, ondansetron, naphthalene (ลกเหมน) - Drug metabolizing enzyme (DME) polymorphism DME (enz. ททาหนาท metabolize ยา) ม

polymorphism เปนจานวนมาก มผลตอ pharmacokinetics, metabolism, ความปลอดภย, และประสทธภาพของยา

- DME polymorphism ม frequency ตางกนในประชากร ดงนนจานวน polymorphism ทพบและเปนปญหาใน

ชนชาตหนง กอาจไมไดเกดปญหาในอกชนชาตหนง เราจงตองรวาในเมองไทยน ม polymorphism ชนดใดซงมผลตอการใชยา

** คาวา genetic polymorphism หมายถงการม allele หลายๆ ชนดท locus หนง โดยตองม ≥ 2 alleles แลว

allele ทพบนอยกวาจะตองม frequency > 1% (ถาชนดทนอยกวาไมม % มากพอ เรากไมเรยกวาเปน polymorphism จะถอเปนเพยงการเกด mutation) - จาก DME polymorphism ม phenotypes ตางๆ

poor/normal/ultrafast metabolizer poor/extensive metabolizer (คาเกา) slow/rapid inactivation (คาเกา) - คนทเปน poor metabolizer ยาออกฤทธนาน/อาจม toxic effect (ดงนน อาจลด dose ยาลง) ** การใชยา INH ในคน Asia จะมปญหานอยกวาฝรง (เพราะฝรงเปน slow inactivator) - คนทเปน ultrafast metabolizer ใชยารกษา dose ปกตแลวไมไดผลในการรกษา (ตองให dose สง) - Consequences of DME polymorphism ยาออกฤทธนาน/ตองใชยา dose สงขน/ไมสามารถเปลยน

prodrug ใหกลายเปน active drug ได (ไมสามารถเปลยน codeine ใหเปน morphine ได)/เกด ADR/เกด

drug toxicities/เกด drug-drug interaction มากขน/ยาถก metabolize ใน alternative pathway - ยาสวนใหญถก metabolize โดย enz. ทอยในกลม CYP450 - CYP เปน gene superfamily (กลม gene ขนาดใหญทมความสมพนธกนในเชงหนาท & ม structural domain

คลายกน) - CYP450 อยใน microsome ใน liver & epithelium of small intestine - ม 56 CYP genes ถกแบงออกเปน 20 families (ตามความคลายคลงกนของ AÂ sequence) ** มหลาย gene หลาย family กจรง แตมเพยงนอย gene ทสราง protein ทมผลตอ drug metabolism (ท

สาคญคอ gene ใน CYP1, CYP2, & CYP3 families; ม 6 alleles ทสาคญในการ metabolize ยาใน phase I (ใช 6 alleles นใน phase I รวมกนถง 90%)มบทบาทใน pharmacogenetics ไดแก CYP1A1, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4)

** ex. CYP3A4: 3 คอ family number, A คอ subfamily letter, 4 คอ enzyme number ยาสาคญทผาน CYP2C9 warfarin ยาสาคญทผาน CYP2C19 PPI (ex. omeprazole), phenytoin ยาสาคญทผาน CYP2D6 β-blocker, opioids, antidepressant, antipsychotics, antiarrhymics ยาสาคญทผาน CYP3A4 warfarin (ผาน CYP2C9 ดวย), macrolides, protease inhibitors - TPMT polymorphism ทาใหตองตรวจ TPMT กอนใชยา chemotherapy รกษา (6-MP, 6-thioguanine,

azathiopurine) ** TPMT = thiopurine methyltransferase - polymorphism ใดมความสาคญทาง clinic หรอไม ขนกบวายาทถก metabolize โดย CYP450

polymorphism นนใชเยอะหรอไม, เปนยาสาคญหรอไม, ยานน TI แคบหรอไม, ม alternative pathway ในการ

metabolize ยาหรอไม (ถาไมม ความสาคญกยงมาก), มยาอนใชแทนหรอไม, มความแตกตางของ activity/toxicity ระหวาง parent drug กบ metabolite หรอไม

- การใหยารกษา asthma ในแตละคน อาจม response ตางกน อยทวาม genotype เปนอยางไร (ex. ให β2-agonist กขนอยกบคนไขม β-adrenoceptor variant ชนดไหน)

 TOP  SI 117 

- warfarin นอกจากใช CYP450 (CYP2C9, CYP3A4) ในการ metabolize แลวยงใช vit.K epoxide reductase complex I ดวย: VKORC1 haplotype พบวาคนไขทม haplotype บางชนดตองให warfarin dose สงกวา!

- Pharmacogenetic testing in use today TPMT screening ทากอนใหยา 6-MP ดวาม TPMT polymorphism ชนดใดจะไดปรบขนาดยาไดถก

UGT1A1 genotyping เปน guideline ในการให irinotecan ในการรกษา colorectal cancer

Amplichip TM® CYP450 (DNA microarray) สามารถทา genotype ของ CYP2D6 (ม 27 alleles) กบ CYP2C19 (ม 3 alleles)

EGFR gene overexpression testing เพอใหยา certuximab ในการรกษา head & neck cancer หรอ metastatic colorectal cancer

HER2/neu gene overexpression testing เพอใหยา tratuzumab (Herceptin®) ในการรกษา breast cancer

- Implications of pharmacogenomics มความสาคญในการคนควายาใหม (new drug development), การใชยา (drug utilization), การปองกนผลเสยจากยา (ADR)

- Research in pharmacogenomics มแนวทางหลกในการวจยอย 2 อยาง 1. หา gene & gene product ทเกยวของกบการเกดโรคตางๆ เพอจะหาวา target ทเราจะใชเพอรกษาอย

ตรงไหนบาง 2. หา gene & allele ททาให response ตอยามความแตกตางกน - การหา variant ททาใหเกดความแตกตางในการตอบสนองตอยา ทาได 2 วธใหญๆ คอ 1. Candidate gene approach มความรอยวานาจะม gene ใดบางเกยวของ แลวกไปเลอก gene นนมา

ทดสอบ (ex. ไปหา variant ในคนทตอบสนองตอยาผดจากปกต) 2. Whole genome approach หาหมดทง genome ปจจบน ทาไดงาย (เดมกวาจะหา gene ได 1 gene ใช

เวลานานมาก ตองทา chromosome walking ไปทละ contig จนเจอ) โดยทา linkage study คอตรวจหา SNPs ทมอย จนรวา gene ตองหลบซอนอยระหวาง SNPs ซงเปน marker (จะถายทอดไปกบ gene) ได region เอา region นนไปคนบนฐานขอมล HGP วาระหวาง SNPs นถงน ม gene ททราบแลวก gene แลวดแตละ gene, limit ไปวาจะขอดเฉพาะ gene ทเกยวกบอวยวะทเราสนใจเทานน (candidate gene) แลวเอา sequence ของ gene เหลานนมา test ไดทนทวาผปวยของเราม mutation หรอไม

** การหา SNP พรอมๆ กนทละหลายๆ loci ในคราวเดยว ใชวธ microarray ** วธการหา gene โดย whole genome approach ตามวธทกลาวมา เรยกวา positional candidate gene mapping

- SNPs map = ตาแหนงของ SNPs บน chromosome - SNP-LD = SNP linkage disequilibrium profile Linkage locus ไปดวยกน Linkage disequilibrium allele คหนงไปดวยกนเสมอ !! (ปกต การท allele ใดจะถายทอดไปกบ allele ใดนน เปนเรองทเกดขนโดยบงเอญ ขนกบ frequency ของ allele นนในประชากร เรยกวา linkage equilibrium แตเมอไรทพบวา allele ชนดหนงชอบไปกบ allele อกชนดหนงบน locus ท link กนบอยกวาทจะเกดดวยความบงเอญ = linkage disequilibrium) - เอา SNP ของคนไขทใชยาไดผล เปรยบเทยบ คนไขทใชยาไมไดผล ดวาคนทใชยาไดผลจะเจอ SNP ใดเหมอนกน

โดยไมเจอไมในคนทใชไมไดผล ใช SNP นนเปน marker เพอตรวจสอบกอนใชยาวาใครจะตอบสนอง โดยตรวจ

SNP-LD - คนทม DME variant allele บางชนด จะม specific SNP marker ทอย link กบ allele นน ดงนนถาตรวจ

เจอ SNP marker นน กนาจะม DME variant allele ชนดนนดวย - SNP consortium เปนโครงการใหญพยายามหาวา SNP map ในประชากรเปนอยางไร ทา high-density

SNP map ของ human genome เผยแพรลงใน SNP database ใหใครเอาไปใชกได ** เรากเอา database นมาใชหาการตอบสนองตอยา โดยคาดหมายวาคนทม SNP บางชนด นาจะ link กบ

gene ทกาหนด DME variant

 TOP  SI 117 

- จากการวจยทาง pharmacogenomics คาดวาจะมยาทใชไดผลดขน, ปลอดภยขน, มวธทแมนยาขนในการตรวจสอบวาใครควรไดยาขนาดไหน, ทาใหคนพบยาใหมๆ ทไดผลดในการรกษางายขน, คาใชจายในการรกษาถกลง (เพราะใชยาตรงกบคน ตรงกบโรค ตงแตแรก)

Genetics of Common Disorders with Complex Inheritance - Mendelian disorder เกดจาก single gene: มคนอย 2 พวกคอ เปนโรค & ไมเปนโรค discontinuous

variation ** single gene มฤทธมาก (เพยง 1 หรอ 2 alleles ท locus เดยวก manifest ออกมาได) - Multifactorial disorder เกดจาก polygene + environmental factor continuous variation ** polygene หลาย gene แตละ gene มฤทธนอย (ม contribution นอย) small, but additive

effect ** ไมมโรคใดทเกดจาก polygene อยางเดยว (แตมลกษณะทควบคมโดย polygene ex. เสนลายมอ) - proportion of genetic component (∑contribution) = heritability (H) (ถาคาสง กแสดงวา genetic

factor มความสาคญมากกวา) - complex disease บางโรคมผลของ polygenic เปนสดสวนสง (H ) (ex. schizophrenia) บางโรคมผลของ

environmental เปนสดสวนสง (ex. infection, trauma poisoning) ** คนทเปน hemophilia ถาไมไดรบ trauma กจะไมมอาการแสดงออกมา, คนทม pharmacogenetic

disorder แตไมไดรบยาใด กจะเปนคนปกต ** โรคทมปจจย genetic เปนสดสวนมาก จงจะเรยกวาเปน genetic disorder (สวนโรคทมปจจย genetic นอย

อาจเรยกวา non-genetic (acquired) disorder) - Evidence for genetic factor in common diseases and malformations การจะหาหลกฐานวา

โรคใดมปจจย genetic เปนสาเหตบาง (ex. โรคทพบบอยในประชากร, โรคทเปนแตกาเนด) มหลายวธ - Family study (familial tendency) ดวาโรคนนมกเกด > 1 คนในครอบครวหรอเปลา - Twin study การสารวจหา phenotype ในคนทเปน monozygotic twin เปรยบเทยบกบ dizygotic twin

แลวดวามอตราการเปนโรคเหมอน/ตางกนอยางไร ดวา genetic สาคญขนาดไหน ! (ด H) - ถา twin คนหนงเปน อกคนจะเปนดวย 80% = ม concordance rate (อตราการเปนดวยกน) = 80 - ถาโรค A ม concordance rate ใน monozygotic twin = 80, ใน dizygotic twin = 80 โรค B ม concordance rate ใน monozygotic twin = 80, ใน dizygotic twin = 30 โรค B ม H (genetic factor) สงกวา !! (เพราะ monozygotic twin มคาเทากบคนคนเดยวกน, dizygotic

twin มคาเทากบพนองพอแมเดยวกนเทานน เพยงแตเกดทองเดยวกน, ถา concordance rate เทากน แปลวา

genetic ไมสาคญมากนก แตถา genetic สาคญจรง โอกาสทคนคนเดยวกนจะเปนโรคเดยวกน ตองสงกวาโอกาสท

คนคนละคนจะเปนโรคเดยวกน เพราะ % gene ท share กนใน monozygotic twin มากกวา !!) - ถาโรค A ม concordance rate ใน monozygotic twin = 80 โรค B ม concordance rate ใน monozygotic twin = 40 โรค A ม H (genetic factor) สงกวา !! (ถา twin ทงคไดรบการเลยงดทเดยวกน เหมอนกน เปนการ

control environmental factor) ** concordance rate genetic - Adoption study บคคลทม genetic เหมอนกน/ใกลเคยงกน (ex. พนองกน) กควรจะมโอกาสเปนโรค

เดยวกนมากกวาในคนทม genetic ตางกน, adoption study จะศกษาลกทไดรบการเลยงเปนบตรบญธรรมโดย

ครอบครวอนเปรยบเทยบกบลกของครอบครวนนทถกเลยงในครอบครวนน ดอตราการเปนโรคใดโรคหนง (ex. alcoholism; เดกทเกดจากครอบครวทพอแมตดเหลา แลวถกนาไปเลยงเปนบตรบญธรรมในครอบครวทพอ

แมไมมปญหาเรองการตดเหลา จะมปญหาเรองการตดเหลาตาลงชดเจน) ** twin study บอกวา genetic factor (H) มผลมากนอยแคไหน adoption study บอกวา environmental factor มผลมาก/นอยเมอเทยบกบ genetic factor - Population/Migration study บางประชากรม incidence ของโรคบางโรคสงกวาบางประชากร; ประชากรท

ม incidence ของโรคสง ถายายถนฐานไปอยอกประเทศหนงแลว incidence ลดลง แสดงวา environmental factor มสวน !!

 TOP  SI 117 

- Polymorphism and association study คนทเปนโรคม association กบ allele ใดท locus ใด บอยกวาท

จะเกดขนโดยบงเอญหรอไม ถาคนทเปนโรคม allele ใดใน genome ทเหมอนกน ตรงนนกนาจะเปน disease gene / อยใกลๆ กบ allele ของ disease gene (ใครทเปนโรคกตองม allele นหมด)

- Animal models (ศกษาในสตวทดลอง) - multifactorial disorder มการถายทอดทคอนขางยงยางซบซอน (ไมตรงไปตรงมาเหมอน mendelian) จงใชคา

วา complex disorder - Characteristics of complex inheritance 1. gene เปนสาเหตททาใหเกดโรค แตโรคไมใช single-gene disorder 2. มคนเปนหลายคนในครอบครว คนทเปนญาตกบคนเปนโรค นาจะม disease-predisposing allele มากกวา

คนทไมไดเปนญาตกบคนเปนโรค (คนทเปนญาตกนจงมแนวโนมจะเกดโรคเหมอนๆ กนไดมากกวา) 3. ญาตของคนทเปนโรคทม gene เหมอนๆ กบคนทเปนโรค อาจไมมอาการแสดงออก (discordant) กได =

incomplete penetrance 4. ยงคนเปนโรคเปนญาตทสนทใกลชดเทาไหร (ม gene เหมอนกนมากกวา) ญาตของคนทเปนโรคกจะเกดโรคได

บอยกวาคนทเปนญาตหางๆ - Finding the Genes involved in multifactorial (complex) traits (Quantitative trait loci) ** การหา gene ทเปนสาเหตของ multifactorial disorder loci ททาใหเกด predisposition ตอการเกด

โรค multifactorial disorder เรยกวา quantitative trait loci (ขนกบจานวน (หลายๆ locus); ตางกบ

qualitative triat ทเกดจก mutation ของ single gene)  Step 1: Linkage and association

ทา association study ในประชากร** (เปน case-control study หาความสมพนธระหวาง SNP (DNA marker) หนงๆ กบโรคใดโรคหนง ด OR & RR บอก association ระหวาง SNP นกบโรค

รวาคนทม SNP นจะมความเสยงเปนกเทาของคนทไมม SNP น) ** การทา association study ในชวงแรกๆ คอการตรวจ HLA-disease association (เพราะ HLA กเปน genetic marker ทม polymorphism ในระดบสงสด)

ทา linkage study ในครอบครว** ทมคนเปนโรคหลายคน (ดวา allele ตรงไหนบางทถายทอดจากคนทเปนโรคไปใหคนทเปนโรคเสมอ และไมถายทอดไปใหคนทไมเปนโรค)

ทา sib-pair analysis โดยเปรยบเทยบ SNP ระหวางพนอง**ทเปนโรคเหมอนกน = concordant sib pair (ดวาม SNP อนไหนทพบในพนองทเปนโรคเหมอนกน ด allele sharing amoung relatives)

ทา animal model Step 2: Fine-mapping ทา physical map / genetic (linkage) map Step 3: Sequence analysis หา sequence ของ gene Step 4: Functional test of candidate genes ดวา function ของ gene นนเปนสาเหตของโรคจรง

หรอไม - whole genome association study ทา association study ทงหมดใน genome (ไมไดทาทละ 1 variant) - ตวอยางของ complex trait genes DM type 1 HLA-DQB DM type 2 HLA-DQA, CARN10 Crohn’s disease (เปน IBD) CARD15/NOD2, IBD1, IBD5 Alzheimer’s disease AopE Asthma ADAM33 ACE levels (สมพนธกบการเกด HT) ACE - haplotype เกดขนจากการท allele ทอยใน set นยงมเวลาไมมากพอทจะเกด recombination แลวแยกออกจาก

กน จงยงม linkage disequilibrium - เมอผานไปหลาย generations เกด recombination มากขนระหวาง marker กบ disease gene ในทสด

กจะไมอยใน linkage disequilibrium กนแลว แตกจะไป link อยกบ allele อนของ marker นน ** ยง marker นนอยหางจาก disease gene เทานน โอกาสจะถกแยกกนกจะมากจากการเกด crossing over ** haplotype มความแตกตางกนในประชากร กเนองจากการเกด recombination ไปหลายๆ generations นบจาก

ancestor

 TOP  SI 117 

** ในประชากรเดยวกน จะมโอกาสพบ common haplotype ได (โดย common haplotype ในแตละประชากรกจะแตกตางกน)

- The international HapMap project (HapMap = haplotype map) HapMap เปน catalog ของ genetic variants (set ของ SNPs ทอยใกลกน) ทพบบอยในมนษย ดวาม haplotype อยทไหนบาง มความแตกตางในแตละประชากร/ในประชากรเดยวกนหรอไม จดประสงค: เอา HapMap มาใชหา gene ของ common disease / หา gene ทมความแตกตางในการ response ตอยา; เอามาใชประโยชนในการทา whole-genome study (เพอ link genetic marker กบ disease / เพอ identify disease gene)

** การตรวจ gene เพยง 1 locus แลวทานายวาคนนกนอาหารอยางนไมได เพราะจะเกด CHD หลอกลวง!! (เพราะ CHD เปน multifactorial disease) ไมไดประโยชนอะไร!

** ถาจะทานายความเสยงตอโรค ซกประวตครอบครวดกวา ทา pedigree !! (ดกวาการตรวจ gene เสยอก)

Cancer Genetics and Hereditary Cancer Syndromes - cancer ทงหมดเปน genetic disease (เปน somatic genetic disorder) “All cancer is genetic, but some cancers are more genetic than others” (cancer ทพบไดหลายคน

ในครอบครว (familial) กแสดงวา genetic มบทบาทมากกวา cancer บางชนดทมกเปน sporadic) - มเพยง cancer บางชนดทเปน hereditary cancer เพราะเกด germline mutation (mutation ท germline

cell) - cancer บางชนดถายทอด (inherit) ไดโดยทคนคนนนไมไดรบการถายทอดมากอน - cancer เกดจาก mutation ของ gene ทเกดขนใน cell เพยง 1 cell ตอมาเซลลนนแบงตว, ม mutation มาก

ขน สะสม mutation จนมากพอ (≈ 5-10 mutations) = accumulative change กลายเปน malignant cell

** cancer เปน clone ของ cell - เวลาพดถง genetic cancer จะแยกเปน 2 อยาง 1. Common cancer สะสม mutation ท locus ตางๆ จนมากพอ

2. Hereditary cancer syndrome ไดรบการถายทอดจากคนทม 1st hit mutation อยใน germ cell เมอไรคนนนเกด 2nd hit กจะเกด cancer

- ลกษณะทจะชแนะวาเปน hereditary cancer syndrome 1. เปนหลายคนในครอบครว (familial) 2. ม phenotype อนรวมดวย (ex. retinoblastoma ทเกดจาก deletion ของ Rb gene ท chr.13 บางทกจะ

ม gene ใกลเคยงหายไปดวย เดกกจะม malformation, Wilms tumor แลวมความผดปกตอนรวมดวย อาจ

เปนสวนหนงของ WAGR syndrome ซงเปน contiguous gene syndrome ทเกดจาก microdeletion) 3. เกดเมออายนอย (atypical age; เพราะปกตจะเจอในคนอายเยอะ) 4. เกดท atypical site & atypical sex (ex. เกด CA breast ในผชาย) 5. เกดในหลายตาแหนง (multifocal) อาจเปน synchronous (เกดพรอมกน แตมาจากคนละ clone

(multiple 1˚ tumor)) หรอ metachronous (จาก clone เดม แลวเวลาตอมาไปงอกกอนใหม (successive tumor))

6. เกดกบ organ ทง 2 ขาง (ถา organ นนม 2 ขาง) 7. เกด 1˚ tumor หลายๆ ชนดในคนคนเดยวกน

- Genes involved in carcinogenesis 1. Oncogenes กระตน cell division; ถา proto-oncogene (มอยแลวในสงมชวต) ถก activate

เปน oncogene (cellular oncogene, c-onc) (เปน gene ผดปกต) จะเกด cancer ** ใน virus เมอ provirus DNA integrate เขากบ cellular DNA แลวไปโอบอยขาง proto-

oncogene แลวไปเปลยนแปลง sequence ของ proto-oncogene ใหกลายเปน viral oncogene (v-onc) เรยกกลไกนวา viral insertional mutagenesis

** Functional classification of oncogene Growth factor, Growth factor receptor (ex. RET), Intracellular signaling transduction factor (ex. RAS สราง protein with GTPase activity), DNA-binding nuclear protein (ex. C-MYC), Cell cycle factor (ex. cyclin D1, BCL-2), Telomerase

 TOP  SI 117 

** oncogene ไมเปนสาเหตของ hereditary cancer เลย!! เพราะถาเกด mutation ใน germline cell จะรนแรงมากจนทาให fertilized ovum หรอ zygote ไมสามารถมชวตตอไปได !!

2. Tumor suppressor genes ยบยง tumor growth, ม 2 กลม 2.1 Gatekeeper checkpoint (ex. RB1, p53) 2.2 Caretaker จรงๆ คอ DNA repair genes

** tumor suppressor genes จะทาใหเกด cancer ไดตองม mutation เกดทง 2 alleles ท locus เดยวกน (คนทเปน sporadic case ตองเกด mutation ถง 2 ครง, มกพบในคนอายมาก; คนทเปน

familial case รบ 1st hit มาแลว แลวรอเกด 2nd hit จงใชเวลานอยกวา sporadic case) 3. DNA repair genes ถาเกด mutation แลว gene น fail จะเกด cancer 4. Genes that are transcribed into oncomir พบวาใน tumor บางชนดมสาเหตจาก gene ทสราง

non-coding RNA ซงมขนาดเลกเรยกวา microRNA (miRNA) ซงทาหนาทไปยบยงการทางานของ RNA

ของ gene อนจงเรยกอกอยางวา small interfering RNA (siRNA) (small เนองจากขนาดเลก); เนองจาก

RNA นทาใหเกด cancer ไดจงเรยกวา oncomir (มาจาก onco miRNA) ** mutation ท oncogene AD

mutation ท tumor suppressor gene & DNA mismatch repair gene AR (เปนกลไกการเกดมะเรงระดบเซลลตาม Two-hit hypothesis แตการถายทอด 1st hit เปนการถายทอด predisposition แบบ AD with incomplete penetrance)

- Regulation of cell growth and differentiation เมอ growth factor มาจบ growth factor receptor เกด signal transduction pathway (ใช molecule ทเปน gene product หลายชนด) ไปถง nuclear membrane interact กบ TF (DNA-binding nuclear protein) TF ไปจบ regulatory sequence ของ gene สราง gene product ทใช control growth & differentiation

** ถาม mutation ทใด กจะทาใหกลไก control นเสยไป (ex. ม oncogene activation, loss of function ของ tumor suppressor gene)

- Cell cycle regulation ม checkpoint เปนจดตรวจกอนทเซลลจะเขาส mitosis; ทสาคญ 2 จด ไดแก 1. G1-S checkpoint 2. G2-M checkpoint

- pRb-E2F transcription complex อยใน G1-S checkpoint เปนตวหามไมใหผานจาก G1 ไป S เกด

cell cycle arrest - เมอไรท pRb ถก phosphorylate โดย cyclin D-CDK4 complex inactivate pRb ปลอย E2F ออก

เซลลสามารถผานจาก G1 ไป S ได - p53 interact ใน cell cycle regulation ผาน p21 p21 ไปยบยง CDK4 induce ใหเกด apoptosis !! ในกรณท pRb-E2F transcription complex ทาใหเกด cell cycle arrest

ไมได (เพราะเกด DNA damage) ** p53 จงเปน tumor suppressor gene ทสาคญมาก - p53 เปน TF, เปน multimeric complex (ดงนน การเกด mutation ท p53 gene จงทาใหเกด dominant

negative effect ได) - p53 gene ไดชอวาเปน Guardian of the genome (เทวดาคอารกษ genome) - p53 mutations 1. Mutant p53 protein monomers ทาใหเกด dominant negative effect 2. Loss of function of p53 (most common) ทาใหเซลลทม DNA damage ไมเกด apoptosis และยง

แบงตวตอไปใหเซลลลกทม mutant gene 3. Germline p53 mutation ทาใหเกด hereditary cancer ทเรยกวา Li-Fraumeni syndrome [AD]

(ถายทอด predisposition แบบ AD, รอเกด 2nd hit แลวจงเกด cancer) - Replication of telomere by telomerase เนองจากเซลลแบงตวแบบ semiconservative replication

strand ทเกด Okazaki fragment จะขาดสวนปลายไปเลกนอย (ความยาวเทากบ Okazaki fragment) แตไมมปญหา เพราะสวนทหายไปเปนสวนทซากนเปนชดๆ ดงนน ในทกๆ ครงทเซลลแบงตว telomere จะสนลงตรงสวน hexanucleotide repeat อก strand หนงกยนมาเปน overhanging

 TOP  SI 117 

- เมอสนลงไปเรอยๆ มนจะ expose unique sequence ทอยตดกนตอ nucleolus เมอไรทมนสนมากจนถง cut-off value จะกระตนใหเกดการแก เซลลตายในทสด

- enz. telomerase เปน reverse transcriptase (RT) โดยทตวมนเองเปน RNA ใชตวมนเองเปน

template แลวกสราง DNA ตอความยาวให telomere - cancer cell จะม enz. telomerase ท overexpressed (ถาเซลลปกตจะไมม หรอมในระดบตาๆ) เพอคอยมอง

หาวา telomere ไหนทสนแลว มนจะ synthesize telomere ใหยาวออก maintain ความไมแกใหกบเซลล immortalization ** จดไดวา Telomerase gene (เปน anti-apoptotic gene) กเปน oncogene กลมหนง เพราะการมอยทาให cell ม activity มากขน

- สาเหตท telomerase overexpressed อธบายวา 1. เกดจาก gene อน: ม oncogene ซงสราง product เปน TF TF มากระตน expression ของ

telomerase gene 2. เกดจากตวมนเอง: mutation upregulate telomerase gene expression มากขน

- Types of mutation that cause cancer 1. Mutation in proto-oncogene ไป activate proto-oncogene ใหเกด c-onc; เกดแมเพยง 1 allele

กเพยงพอทจะทาใหเกด cancer ได (เปน dominant) 2. Mutation in tumor suppressor gene

2.1 เกด mutation ททาให loss of function ทง 2 alleles ถงจะแสดงใหเหน (recessive) 2.2 เกด dominant negative mutation mutation ทเกดขน 1 allele แลวมผลตอ normal allele ท

locus เดยวกนทางานไมไดไปดวย (พบใน p53 gene) ** p53 เปน multimeric complex (dominant negative effect จะเกดกบ protein ทรวมกนหลายสายเปน ex. dimeric, polymeric)

3. Chromosome abnormalities ถาเกดแลว 3.1 ไป disrupt tumor suppressor gene loss of function 3.2 ไปทาให oncogene ยายไปอยทใหม สงแวดลอมทาให oncogene active มากขน !! ** cancer ทเกดจาก chromosome abnormalities ทจาเพาะ ex. CML, Burkitt lymphoma, Retinoblastoma, Wilms tumor นาไปศกษาตอถง gene ทเปนสาเหต !

- Regulation of activation of RAS protein RAS protein เปน GTP-binding protein (จบกบ GTP แลวจงจะ active) โดยตวมนเองกม intrinsic GTPase activity อยในตว เปลยน GTP ทมนจบใหเปน GDP

- ถาเกด mutation active RAS ทจบกบ GTP ไมสามารถเปลยนเปน inactive RAS ทจบ GDP ได RAS จะออกฤทธตอไปเรอยๆ กระตน cell division เกด cancer

** neurofibromin จะทาให RAS protein เปลยนจาก active inactive; ถา neurofibromin เสยหนาท RAS จะออกฤทธตอไปเรอยๆ (จะเหนวาการเกด neurofibromatosis type 1 เกดจาก mutation ท NF1 จงทาใหไมม neurofibromin ไป regulate RAS protein (เสย interaction) เกด cancer)

- t(9;22)(q34;q11) in CML สวนของ chr.9 (ม abl oncogene) ยายไปท chr.22 (ม bcr oncogene) เกดการเรยงตวใหมบน chr.22 = Philadelphia chromosome (Ph1) (chr.22 มขนาดสนกวาปกต เพราะเอาสวน q arm ของ chr.22 ไปตอกบ chr. 9 ทตรง breakpoint แลวเอาสวนปลายๆ สนๆ ของ q arm ของ chr. 9 มาตอกบ chr.22) & ทาใหเกด bcr/abl fusion (chimeric) gene & protein (ทาง 5’ หรอ N-terminal เปน bcr, ทาง 3’ หรอ C-terminal เปน abl) ม activity กระตนใหม cell division มากกวาปกต เกด CML

- BCR/Abl fusion protein ม novel function ดวย !! คอมฤทธเปน tyrosine kinase - t(8;14)(q24;q32) in Burkitt lymphoma สวนของ chr.8 (ม c-myc oncogene) ยายไปท chr.14

สวนท code สวนหนงของ Ig molecule ทาให c-myc oncogene อยภายใตการควบคมของ Ig promoter และ Ig exon กจะเกด fusion gene ทม transcription ประกอบไปดวย Ig สวนหนงกบ c-myc transcript สวนหนง ซงเปน potent oncogenic inducer protein กระตน lymphoid cell ใหกลายเปน lymphoma

- จากการศกษาคนไข Burkitt lymphoma ยงพบวาเกดไดจาก t(2;8) & t(8;22) อก ลองศกษาตรง breakpoint พบวา breakpoint ท chr.8 ม c-myc, ท chr.14 มตาแหนง Ig heavy chain, ท chr.2 ม

 TOP  SI 117 

- Chromosome deletion in Retinoblastoma, Wilms tumor, & Colorectal cancer retinoblastoma พบ deletion ของ chr.13p Wilms tumor พบ deletion ของ chr.11p colorectal cancer พบ deletion ของ chr.18

** การเกด deletion ของ chromosome แลวเกด tumor แสดงวาม gene ทหายไปนนเปน “tumor suppressor gene”

- Chromosome insertion in Neuroblastoma แสดงวาม insertion ของ “oncogene” - Monosomy in Menigioma chr.22 หายไป มการขาดหายไปของ gene บน chr.22 - Trisomy 7 in Epithelial tumor แสดงวา gene ทเปนสาเหตอยท chr.7 & เปน “oncogene” - Oncogene amplification เปนการเพม copy ของ oncogene เมอศกษา chromosome จะเหน double

minute chromosome (เหน chr. เลกๆ แตละ chr. ดเปนจดเลกๆ 2 จด) หรอเหนเปน band ทขยายขนาดขนบน

chr. เรยก heterogeneously staining region (HSR) ** เมอไรเจอ double minute chr. หรอ HSR เปน evidence วามการเกด oncogene amplification

- Retinoblastoma เปน tumor ของ retinoblast พบในวยเดก; เกดจาก retinoblast 1 cell ม mutation แลวแบงตว กอนโตขน ปดกนทางเดนของแสง เวลาตรวจตาจะไมพบ red reflex (ซงพบในคนปกต เวลาสอง

ไฟเขาไป แสงทกระทบ retina จะสะทอนมาเปนสแดง) จงเรยก white reflex - retinoblastoma ม 2 ชนด ไดแก

1. Familial (Hereditary) retinoblastoma (40%; เปนหลายคนในครอบครว) มการถายทอด predisposition ของการเกด retinoblastoma (ถายทอด 1st hit แบบ AD) มา เนองจากม germline mutation ของ Rb gene คนเปนโรค มกเปนเมออายนอยกวาพวกทเปน sporadic, อาจพบไดทตาทง 2 ขาง (bilateral) & ทหลายตาแหนง (multifocal) ถาเกด 2nd hit ทตาทง 2 ขาง หรอทเซลลหลายตาแหนง

2. Sporadic retinoblastoma (60%; เปนคนเดยวในครอบครว) มกเปนเมออายมากกวา, มกเปนทตาแหนงเดยวของตาขางเดยว (unilateral, unifocal)

** พบวาพวกทเปน unilateral case จานวนหนง (15%) เปนพวกทไดรบการถายทอดมา ** การเกด mutation ของ Rb gene กจะทาใหไมเกด pRb-E2F transcription complex ทจะไปทาใหเกด

cell cycle arrest (โดยหามไมใหเซลลผานจาก G1 S) - Knudson’s Two-Hit model for retinoblastoma การเกด cancer จาก tumor suppressor gene

เกดจากการสญเสยหนาท 2 ครง = Two-hit hypothesis (เปนคาอธบายของมะเรงทถายทอดทางพนธกรรมเกอบทงหมด!!)

- Two stages of tumor generation 1. 1st hit ไดรบมาจากพอแม / new somatic mutation / ม chromosome rearrangement 2. 2nd hit เกด new somatic mutation ทอก chr. ท homologous กน / ม somatic recombination /

ม gene ปกตขาดหายไป แลวม duplication ของ chr. ทม mutant gene จาก 1st hit อย - คนทไมเกด 2nd hit กยงไมเกดมะเรง คนในครอบครวจะสามารถถายทอด germline mutation นไปไดเรอยๆ - somatic recombination (mitotic crossover) mitosis ไมม pairing (ปกตจงไมเกด recombination),

แต chr. จะมาเรยงตวอยท equatorial plane แลวเกด centromere splitting sister chromatid แยกออกจากกนไปส daughter cell; แตกรณทคนทเปน heterozygote (จาก 1st hit) แลว homologous chr. เกดมาอยใกลกนแลวเกด crossover !! จากทเดม mutant gene อยบน 1 chr. กจะแยกตวไปอยอก chr. ดวย เวลาเกด centromere splitting แลว chromatid ทม mutant gene ทง 2 chromatids (ซงเดมเปนของคนละ chr.) แยกไปอยบน daughter cell เดยวกน (แยกไปฝงเดยวกน) เกดภาวะ homozygosity ของ Rb mutant gene เกด retinoblastoma

** ถาปกตทวไป ถาม mutant gene อยท 1 chromosome (จาก 1st hit) เวลาเกด centromere splitting ทง 2 chromatids ของ chr. นนกถกแยกจากกนไปอยคนละเซลล ยงคงภาวะ heterozygosity อย

- loss of heterozygosity (LOH) เมอตรวจ marker (ซงปกต marker ทเราเลอก กตองเปน heterozygote แลวจะดการ link ไปกบ mutant allele) แลวพบวา marker เดมทใชกลายเปนภาวะ homozygosity = loss of heterozygosity (LOH, reduction to homozygosity) แสดงวาม

 TOP  SI 117 

- ถาทาการศกษาโดยเอา tumor cell ไปตรวจหา marker ถาพบวาม LOH เอาไปวงบน gel จะพบ band เกดขนเพยง 1 band (แทนทจะม 2 bands) บอกทางออมวาเกด loss of function ของ gene แสดงวา cancer ชนดนนเกดจาก tumor suppressor gene

** LOH เปนการบอกทางออมวามการ loss ของ normal allele ไป - [AR] Chromosome instability syndromes พบวา chr. มาการแตกหก, เมอตรวจ chr. จะพบ

chromosome รปรางแปลกๆ เนองจากม rearrangement, มความโนมเอยงตอการเกด cancer สง !! ex. Ataxia telangiectasia (ผดปกตในการตรวจพบ DNA damage เมอตรวจไมพบจง repair ไมได เสยง

ตอการเกด leukemia & lymphoma) Bloom syndrome ( SCE (sister chromatid exchange) ยอมส chr. ดวย BrdU ซงจะทาให

chromatid หนงตดสเขม อก chromatid ตดสออน ถาทาใหมนแตกหกแลว ตรงปลายกจะพยายามจะตอกน

แลวกตอผด แตละ chromatid กจะมทงตดสเขม & ออนปนกน เหน band ถมาก !! บงบอกวามการแตกหก; ลกษณะคอม rash ทหนา, เสยงตอการเกด leukemia, lymphoma, CA)

Fanconi anemia (ม break, gap, dicentric chr.; ผดปกตในการตรวจพบ DNA damage) Xeroderma pigmentosum (excision repair ไมได; เกดการเปลยนแปลงของ skin ท expose ตอแสง

ex. ใบหนา ม photosensitity) - DNA repair systems ทสาคญ เกยวของกบการเกด cancer ม 2 systems

1. Excision repair system excision สวนทเกด thymine dimer (จากการถก UV) ออก แลว repair 2. Mismatch repair system repair error ทเกดระหวาง replication ทาโดยเกด methylation แลว

เอา protein ทตองใชในกระบวนการ repair มาจบทสายทถก, เมอ recognize ไดวา error ทไหน กจะตด

DNA สายทเปน non-methylated แลวเอา nucleotide ทถกใสโดย DNA pol, พอแกเสรจกจะปด nick ดวย DNA ligase

- [AD] Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) เกดจาก DNA repair mutation (mutation ของ DNA mismatch repair gene) = mutator mutation; ถายทอดแบบ AD with incomplete penetrance (ถงม mutant gene อาจไมเกดโรคกได พบ skipped generation ได), พบในอายนอย, พบไดหลายตาแหนงพรอมกน (synchronous: คอเกดขนพรอมกน แตมาจากคนละ clone); อาจทาใหเกด

CA endometrium, etc. ได ! - การเกด DNA repair mutation จะทาใหเกด genome wide error of replication เราเรยกภาวะท mutation

เกดขนใน genome ไดอยาง random เลยวา Genomic instability ทาใหเกด hypermutable phenotype - HNPCC ม Microsatellite instability (MSI) เมอเกด replication error (RER) จะทาให

microsatellite (เปน tandem repeat) เปลยนขนาด คอเกด unstable repeat expansion (กลไกกคอ

slipped mispairing เหมอนเดม) ** ด microsatellite จาก normal tissue และจาก tumor ทวงใน gel ใน normal ปกตจะขนมา band

เดยว (single band) แตใน tumor ซงม MSI จะม band เปลยนขนาดไป มขนาดตางๆ หลากหลาย เพราะม

variation ของ sequence number ** ในคนไขคนใดทสงสยวาจะเปน HNPCC เบองตนอาจนาไปตรวจ replication error โดยตรวจ

microsatellite marker เปรยบเทยบกบใน normal cell (เจาะเลอด) ด MSI - HNPCC พบเปน % นอยในประชากร (เพราะสวนใหญจะเปน sporadic colorectal cancer ทเกดโดย multistep

carcinogenesis) แต! ถามคนในครอบครวเปน recurrence risk จะสงมาก !! เพราะถายทอดแบบ AD - Epigenetic mechanisms ไมเกยวของกบ genetic code - epigenetics = การรบ phenotype ผดปกตทถายทอดได โดยไมไดเปนผลจาก genotype ทผดปกต ** นอกจากใน cancer แลว epigenetic mechanism ยงเกยวของกบโรคอนๆ ได, อาจพบใน X inactivation,

genomic imprinting - methylation ในทาง genetics หมายถงการเตม –CH3 ท C (cytosine residue) ตรงตาแหนงท 5 เกด 5-

methylcytosine มกเกดกบสวน CpG island (ตาแหนงทม CG repeat เยอะๆ บนสาย DNA เดยวกน); การเกด methylation จะลด transcription ของ gene

** ปจจบน methylation เปนคาอธบายในการเกด X inactivation & genomic imprinting

 TOP  SI 117 

- epigenetic mechanism ทสาคญ ไดแก

1. Hypomethylation ทาให gene express มากขน; ถาเกดกบ oncogene กเหมอนไป activate !! 2. Hypermethylation หยดยงการทางานของ gene; ถาเกดกบ tumor suppressor gene กจะทาให

suppress การเกด tumor ไมได !! 3. Loss of imprinting (LOI) gene ทปกตจะถก imprint ไมแสดงออก แตเมอเกด LOI gene นน

แสดงออก ถาเกดกบ oncogene oncogene กจะ express !! - Multistep carcinogenesis cancer บางชนด (ex. colorectal cancer) ตองเกดจาก mutation หลาย

ครง !!; ยงม mutation มากขน ความเปน malignant กจะมากขน จนถงระดบหนงกจะกลายเปน cancer แลวกเกด metastasis

- Colorectal cancer (ทเปน sporadic: เปน tumor เดยว, ถาเปน organ ทม 2 ขางกจะเกดขางเดยว, เปนคนเดยวในครอบครว) พบวา ถาเอา adenoma ระยะตางๆ มาด mutation ในเซลลจะพบวา ถาพบ mutation นอยกจะ malignant นอย, ถาพบ mutation มากกจะมความเปน malignant เพมขน; พบวาการเปลยนแปลงทเรวสดคอการขาดหายไปของ APC gene ตอมาพบวาม DNA hypomethylation เกดขน เกด activation ของ K-ras oncogene ตอมาพบวามการขาดหายไปของ DCC gene ตอมากมการขาดหายไปของ p53 gene

** ตลอดทางน อาจม mutation ของ DNA repair gene ดวย, อาจม gene อนๆ ทเกยวของอก (ex. SMAD4, TGF-β receptor)

(APC = adenomatous polyposis coli; DCC = deleted in colorectal cancer) ** นอกจาก HNPCC [AD] กบ sporadic colorectal cancer แลว ยงม familial adenomatous polyposis

(1%), polygenic colon cancer (เปน complex disorder) ** ปจจบน breast cancer ทเกด BRCA gene ขณะนไดนาความรมาใชในการตรวจหา breast-ovarian cancer

syndrome

Oncogenesis - cancer เกดจากความผดปกตของ somatic cell cancer สวนมาก 90-95% จงไมมการถายทอดทาง

พนธกรรม ทเหลอ 5-10% เปน cancer ทถายทอดได - ความผดปกตท somatic cell ทเกดขน กวาทจะกลายไปเปนมะเรงเปนกอน ตอง 1. สะสม 2. ซบซอน - สะสม ตองมความผดปกตเปนขนตอนหลายขนตอน = accumulative change (เรมจากความผดปกตครงท 1

2 3 4 … ตอกนไป) - ความผดปกตทเกดขนครงแรก ซงมกเปนความผดปกตของ DNA เรยกวา 1˚ genetic alteration (ครงตอๆ

ไปกจะเปน 2˚, 3˚, 4˚ alteration) - กอนมะเรงทตรวจพบ จงเปนเสมอนลกหลานทเกดจากเซลลตงตนเพยง 1 เซลล จงเรยกวาเปน clonal expansion

disorder - มะเรงทเปน clone เดยวกน มกจะมลกษณะทางพนธกรรมพนฐาน (1˚ genetic alteration) เหมอนกน มลกษณะ

ทางพยาธวทยาคงท มการตอบสนองทางคลนก (ตอการใหรงส/ใหยาเคมบาบด) คลายคลงกน ** ดงนน ถาเรารกษา breast cancer แลวเกดมสวนทหลงเหลออย กลายเปนสวนทไมไวตอรงสหรอยาเคมบาบด

ทงๆ ทเดมกอนนนเคยไว แสดงวาเกด new clone (เพราะม pattern การตอบสนองตางไป) - โดยปกต มะเรงเกดมาจากเซลล 1 เซลล แตกไมจาเปน บางครงบางคนอาจมความโนมเอยงทจะเกดมะเรงขน และม

มะเรงปดขนในรางกายหลายตาแหนง แตละตาแหนงกเกดขนดวยตวของมนเอง ไมไดเกยวของกน ทเรยกวา

synchronous tumor (polyclonal) บงบอกวาเกดพรอมกน แตมนเปนคนละ clone กน ** บคคลทเปนมความเสยงทจะเปน retinoblastoma กอาจมกอนเนอเกดขนท retina ทงขางขวาและซายพรอม

กน คนละ clone กน !! แตถาเปน retinoblastoma ขางขวาอยางเดยว เอาลกตาขางขวาทงไป 6 ปตอมา มาเกดทตาขางซาย มความเปนไปไดทวามเซลลลกหลานจากตาขางขวา move ไปตาม lymphatic, bl.vv., optic n. ไปโผลทตาขางซาย clone เดม !!

- 1˚ genetic alteration สามารถตรวจพบไดในเซลลทกเซลลใน clone - เนองจากการเปลยนแปลงททาใหเกดมะเรงเปนการเปลยนแปลงทสะสม ดงนนบางลกษณะทเกดในภายหลง (2˚, 3˚,

4˚) อาจไมไดพบในเซลลมะเรงทกๆ เซลล - ในกอนมะเรงไมไดประกอบดวยเซลลเนอรายเทานน แตยงประกอบดวยเซลลปกตดวย = bl.vv. & CNT

 TOP  SI 117 

** แสดงวาเซลลทกเซลลในกอนมะเรง ไมจาเปนตองม 1˚ genetic alteration ตองเฉพาะ malignant cell ทมาจาก clone เทานนจงจะม

- เราเรยกการเปลยนแปลงททาใหเกดมะเรงซงตองเกดเปนขนตอนนวา multi-step oncogenesis - ปจจบน องคความรเกยวกบมะเรง ทาใหเราสามารถตรวจพบ genetic predisposing factor (เปน predictive

test ทจะ identify genetic predisposition): 1) gene กอมะเรง 2) polymorphism ททาใหเสยงตอการเกดมะเรง

** ปจจบนม microchip มาวางขายทจะตรวจ SNPs ทงหมดกวา 400 ตาแหนง สาหรบกวา 100 มะเรง - เราสามารถม diagnostic test ทจะ detect cancer ตงแตเนนๆ โดยการตรวจทางพนธกรรม ** ปจจบนมการเอา stool ไปตรวจหาวาใครบางนาจะมเซลลกอ CA colon มการเอานาจาก pancreatic duct

ไปตรวจหาวาใครนาจะมมะเรงตบออน - มการดดแปลงกลวธในการรกษาเพอใหเขากบกลไกททาใหเกดมะเรง (ex. เรารวา tyrosine kinase ตวหนงกระตน

ใหเกด growth เรากใช monoclonal Ab ไป block tyrosine kinase receptor ทเซลลมะเรง) - Multi-step carcinogenesis: Normal epithelium Hyperproliferative epithelium Early

adenoma Intermediate adenoma Late adenoma Carcinoma Metastasis ** ปจจบนเรารวา การเปลยนแปลงแตละขนเกดไดจาก gene และรดวยวา gene อะไร - ตวอยางการเกด multi-step oncogenesis ของ colon cancer Genotoxic stress โดย chemical: Normal colonic mucosa cell Hyperplasia APC mutation: Hyperplasia Adenoma (APC = adenoma polyposis coli) O-MGMT promoter hypermethylation: Adenoma Carcinoma in situ (O-MGMT เปน

tumor suppressor gene)   K-ras activation (point mutation): Carcinoma in situ Early colon cancer p53 point mutation / frameshift mutation: Early Late colon cancer (p53 เปน tumor

suppressor gene) Loss of DCC: Late colon cancer Metastatic colon cancer (DCC = delete in colon cancer

เปน tumor suppressor gene) - Basic characteristics (ขอ 1-5 ใน tumor cell จะมลกษณะตางออกไปจากสงทเซลลปกตม, ขอ 6 & 7 เปน

ลกษณะเฉพาะทมใน cancer cell เทานน) 1. Cancer-related gene mutation เซลลปกตกม cancer-related gene อย แตยงไมเกด mutation

หรออาจเกดแลวแตยงไมม environmental factor มากระตน 2. Alteration in cell cycle control, growth & differentiation เซลลปกตกม cell cycle control,

growth & differentiation สวนเซลลมะเรงจะเสย cell cycle control ทาใหเซลลวงเขาส mitosis โดยไมมการหยด ไมมการหลดออกไป dormant ในระยะ G0 จะคางอยแตในชวง mitosis แบงตวไปไดเรอยๆ และไม

ตาย, ม differentiation ตา ** โดยสวนใหญ ถา growth มาก กจะ differentiate ไดนอย (แปรผกผนกน) 3. Abnormal cell-cell & cell-matrix interaction เซลลมะเรงจะมการสอสารผดปกต

4. Dysregulated apoptosis สญเสยการควบคม programmed cell death ไป ทาใหเซลลมะเรงไมตาย ! 5. Tumor angiogenesis เซลลมะเรงมความสามารถกระตนใหเกด angiogenesis สราง bl.vv. มาเลยงตว

มนเอง เซลล bl.vv. เหลานมกเปนเซลลทปกต แตเจรญอยางผดปกตเขามาในกอนมะเรง

6. Immortalization เซลลมะเรงจะมความสามารถทจะแบงตวใหเซลลลกไปไดเรอยๆ

7. Metastatic potential เซลลมะเรงสามารถหลดออกจากทเดมไปสรางเนอเยอใหมอกทหนงได - Genes associated with cancer predisposition (ยนทสมพนธกบการเกดมะเรง) ม 3 กลม ไดแก 1. Oncogenes (กระตน cell division; ถาทางานจะเกด cancer) 2. Tumor suppressor genes (ยบยง tumor growth; ถา fail จะเกด cancer) 3. DNA damage-response genes (DNA repair; ถา fail จะเกด cancer) ** บาง cancer จากเกดจาก gene ทง 3 อยาง; บาง cancer เกดจาก gene อยางใดอยางหนงกได - Oncogenes เปน gene ทกระตน growth และสงเสรมใหเกด cancer; ไมใช gene ปกต แตเปน mutant

allele ของ Proto-oncogene

 TOP  SI 117 

** proto-oncogene มอยในเซลลมนษยปกต proto-oncogene ถกอะไรบางอยาง (ex. retrovirus, carcinogen) มากระตนใหเปลยนเปน activated oncogene ทาใหขบวนการเกยวกบ signal proliferation, differentiation, หรอ apoptosis เสยไป โอกาสเกด neoplastic transformation เพมขน

- proto-oncogene ม 2 alleles ใน 1 locus; oncogene ม function เปน dominant mode (เพยง 1 allele เทานนทเปลยนแปลงกเพยงพอทจะกระตนใหเกดมะเรง)

- Mechanism of oncogene activation 1. เพมจานวน oncogene ใหมเยอะขนเปน 5, 10, หรอถง 1000 copy (change in number) = amplification

** ex. ยน c-myc ถกเพมจานวน promyelocytic leukemia ยน n-myc ถกเพมจานวน neuroblastoma ยน eIF ถกเพมจานวน ovarian cancer ยน N-ras ถกเพมจานวน mammary carcinoma ** gene พวกนม sequence ทปกต ไมไดม mutation ใดๆ เพยงแตเพมจานวนมาเยอะๆ กกระตน cell

growth ไดแลว

2. เปลยนแปลง sequence (change in sequence) = point mutation ** ex. ยน H-ras เปลยนเบสท codon 12 จาก G A ทาให translate ได protein ตวใหมซงเปน

oncogene protein ทมความสามารถในการ transform สง ** การเปลยนแปลง sequence อาจเกดจาก deletion, transition, insertion กได นอกจากน aneuploidy

(ex. duplication), polyploidy (ex. trisomy) กอาจทาใหเกด oncogene activation ได ** บางครงอาจเกดจากการเปลยนแปลง sequence ทอยใกลๆ กบ proto-oncogene แลวไปกระตนยงไงกไมรให

เปลยนไปเปน activated oncogene เรยกวา positional effect 3. เปลยนแปลง structure ของ proto-oncogene (change in structure) เชน translocation ทาให sequence ของ proto-oncogene 2 ชนดมาอยใกลกน หรอ 1 ชนดมาอยใกล

กบอก gene หนงทาใหเกด fusion (chimeric) gene เปน gene ใหมขน ** ex. สวนของ chr. 9 (ม abl oncogene) ยายไปท chr. 22 (ม bcr oncogene) เกดการเรยง

ตวใหมบน chr. 22 = Philadelphia chromosome (Ph1) (chr.22 มขนาดสนกวาปกต เพราะเอาสวน q arm ของ chr. 22 ไปตอกบ chr. 9 ทตรง breakpoint แลวเอาสวนปลายๆ สนๆ ของ q arm ของ chr. 9 มาตอกบ chr. 22) & ทาใหเกด BCR/Abl fusion gene & protein เกด chronic myeloid leukemia (CML) : t(9;22)(q34;q11)

สวนของ chr. 8 (ม c-myc oncogene) ยายไปท chr. 14 สวนท code สวนหนงของ Ig molecule ทาให c-myc oncogene อยภายใตการควบคมของ Ig promoter และ Ig exon กจะเกด fusion gene ทม transcription ประกอบไปดวย Ig สวนหนงกบ c-myc transcript สวนหนง ซงเปน potent oncogenic inducer protein กระตนให lymphoid cell กลายเปน lymphoma เกด Burkitt’s lymphoma : t(8;14)(q24;q32)

viral insertional mutagenesis ชนสวน genome ของ virus integrate เขามาใน proto-oncogene (เปน exogenous sequence insertion) ทาใหการควบคมเสยไป กระตนใหกลายเปน

activated oncogene ** ex. provirus DNA integrate เขากบ cellular DNA แลวไปโอบอยขาง proto-oncogene แลวไป

เปลยนแปลง sequence ของ proto-oncogene ใหกลายเปน v-onc (viral oncogene) ** v-onc เจอในสตวมากอน (มาจาก retrovirus ททาใหสตวเปนมะเรง) เมอวเคราะหแลวกพบวามความคลายกบ proto-oncogene ในมนษย ซงเมอถก activate กจะกลายเปน c-onc (cellular oncogene)

- RET proto-oncogene เปน gene ท encode receptor tyrosine kinase; ถาเกด mutation จะทาใหเกด

Medullary thyroid carcinoma (gain of function) Pheochromocytoma (gain of function) Hyperparathyroidism (gain of function) Hirschsprung disease (HSCR; Congenital aganglionic megacolon) (loss of function)

neural crest ไม migrate มาทผนง colon มกเกดตรง sigmoid colon & rectum ทาให colon ขยายใหญ

(ตรง proximal กวา) และไมม peristalsis (ตรง distal กวา)

 TOP  SI 117 

Congenital central hypoventilation syndrome (CCHS; Ondine’s curse) เปน respiratory disorder ทม failure ของ autonomic control of breathing

- RET proto-oncogene (อยบน chr. 10) ทาใหเกดไดทง medullary thyroid carcinoma, hyperparathyroidism, และpheochromocytoma ในคนเดยวกนหรอในครอบครวเดยวกน เรยกรวมวา

Multiple endocrine neoplasia 2A (MEN 2A) ** จะเหนวาผลของ oncogene จะสงผลตอหลายอวยวะ แตละอวยวะกจะเปนมะเรงชนดจาเพาะของมนเอง - MEN 1 เกดจาก germline mutation ของ MEN1, chr. 11 มผลกบ anterior pituitary,

parathyroid, adrenal cortex, & islets of Langerhans - MEN 2 เกดจาก germline mutation ของ RET, chr. 10 มผลกบ thyroid C-cells, parathyroid, &

adrenal medulla - How oncogene causes cancer oncogene ทาใหเกดมะเรงไดอยางไร กตองมาดวา proto-oncogene

encode protein ททาหนาทอะไร เปน growth factor / growth factor receptor (ex. RET receptor tyrosine kinase) / transcription factor (ex. c-myc) / signal transducer / apoptosis regulator (ex. bcl-2)

- signal transduction: เมอม growth factor มาจบกบ growth factor receptor จะทาใหเกด

phosphorylation (เตม PO43- เขาไปท cytoplasmic domain ของ growth factor receptor) เกดการ

recruit protein อนๆ แลวเรมกระตน signal cascade ภายในเซลล (ไปกระตนใหเกด phosphorylation ของ protein ในเซลลเปน cascade) จนในทสดไปถง protein ตวหนงทสามารถเขาไปใน nucleus แลวไปกระตน gene expression ได

- oncogene เกอบทงหมดมคณสมบต transform normal cell malignant cell ได เรยกวา transforming effect และกระตนใหเซลลโตและแบงตวได เรยก kinase effect

** แตละ oncogene กจะม kinase effect & transforming effect ทไมเทากน - cancer ทเกดจาก oncogene เปน dominant & เกดใน somatic cell ไมถายทอด = sporadic cancer - Oncogene identification 1. Transformation experiment เอา cancer ของคนมายอยใหเปน cancer cell เลกๆ เอา DNA ไป

transform mouse fibroblast ท culture ขนมา แลวดวา mouse fibroblast ไหนกลายเปนมะเรงก

extract genome ของ mouse fibroblast นนเอามาดวามตรงไหนท genome ของคนเขาไปอย แสดงวาเปน oncogene

2. Comparative genomic hybridization (CGH) เราสกด DNA จาก cancer cell มาตดฉลากเรองแสงสเขยว = test DNA แลวเอา normal cell มาสกด DNA ตดฉลากเรองแสงสแดง = control DNA แลวเอา DNA ทง 2 อยาง co-hybridize (ใหชงกน hybridize ท sequence เดยวกน) บน metaphase chromosome ชนดเดยวกนทปกต (ทาทง whole genome)

● บรเวณทปกตของ test DNA, ท metaphase chromosome โอกาสทสแดงกบเขยวจะจบมเทาๆ กน signal รวมไดสเหลอง

● บรเวณทม deletion บน test DNA, ท metaphase chromosome จะไมมสเขยวมาจบ/จบนอยลง เหนเปนสแดงชดขน (signal สแดงปกต แตสเขยวนอยลง)

● บรเวณทม duplication บน test DNA, ท metaphase chromosome โอกาสทสเขยวจะจบกมมากกวา เหนเปนสเขยวชดขน

Region of interest 1. บรเวณทมสเขยวมากๆ นาจะม oncogene (ถก amplification ขนมา) 2. บรเวณทมสแดงมากๆ นาจะม tumor suppressor gene (ทาใหม tumor DNA นอยกวา normal

DNA) ** CGH เปน modification ของวธ FISH ในการหา oncogene location (ปกต FISH จะทา probe ทจาเพาะกบสวนใดสวนหนงบน chromosome เทานน แต CGH จะทาทง whole genome เพอใชศกษา cancer genetics)

3. Microarray (Gene chip assay) คนหา oncogene mutation (ทา synthetic DNA probes หลายๆ แบบ ไป hybridize ตดท panel ไหน กแสดงวา sample ม mutant allele ทเขาคไดกบ mutant probe ทใชกบ panel นน: เหมอนทา ASO (allele specific oligonucleotide) hybridization มากมายพรอมกน)

 TOP  SI 117 

- Oncogenes: From basic to current technology ความรเกยวกบ oncogene ทาใหเกดอะไรบาง? มวธวนจฉยโรค (diagnostic means) ใหมๆ ม prognostic markers ใหมๆ

มคาแนะนาใหมๆ สาหรบ treatment มการรกษาตรงเปาหมายมากขน (many more targeted forms) Targeted therapy มความเขาใจเกยวกบ tumor biology ดขน - Available genetic test 1. Diagnostic test Mutation testing (RET, c-Kit) Chromosome analysis (ด translocation) FISH testing (neuroblastoma, BCR/Abl (หา fusion gene)) 2. Prognostic test (Rx related) Determination of appropriate Rx (Her-2Neu) 3. Pharmacologic test Susceptibility to chemotherapy toxicity (CYP450 2E1 & Taxol toxicity) - Tumor suppressor genes ทาหนาทยบยงการเกดมะเรง - บคคลจะเกด cancer จาก tumor suppressor gene ไดจะตองเกด mutation ทง 2 alleles แตไมจาเปนจะตอง

เปน mutation ชนดเดยวกน (ex. allele หนงเปน point mutation อก allele หนงเปน deletion กได) - Knudson’s Two-Hit model for retinoblastoma การเกด cancer จาก tumor suppressor gene

เกดจากการสญเสยหนาท 2 ครง = Two-hit hypothesis (เปนคาอธบายของมะเรงทถายทอดทางพนธกรรมเกอบทงหมด!!)

- ปกตม 2 copies เมอ 1 copy เสยไป = 1st hit บคคลคนนนจะเสยง (predisposed) ตอการเกด cancer (แตยงไมเกด) เมอ copy ท 2 เสยไป = 2nd hit เสยทง 2 copies เกด cancer !! - 1st hit mutation (ยงไมทาใหเกดอะไร) สามารถถายทอดจาก germ cell ของพอแมสลกได ** ตางกบ oncogene ทมเพยง single hit กเกดมะเรงแลว มกเปน sporadic cancer - คนทไมเกด 2nd hit กยงไมเกดมะเรง คนในครอบครวจะสามารถถายทอด germline mutation นไปไดเรอยๆ - การทบคคลม 1st hit mutation อยใน germ cell แลวถายทอดไปได ทาใหเกดกลมอาการทเรยกวา Hereditary

cancer syndrome (มะเรงทถายทอดไดทางกรรมพนธ) - กลไกททาใหเกด mutation ของ tumor suppressor gene มมากมายหลายกลไก แตพบวากลไกสาหรบ 1st hit

มกจะเปน point mutation เกอบเสมอ !! แต 2nd hit อาจจะเปน chromosome loss / deletion / unbalanced translocation (ทาใหมการขาดหายไปของ tumor suppressor gene บรเวณนน) / loss and reduplication (chromosome หายไป แลวม duplication จาก chromosome ทม 1st hit อย เลยเกด 2nd hit เลย) / mitotic recombination (ปกต mitosis จะไมม recombination แตถาม แลวเกดเอาสวนทม 1st hit แลกไป ไดเซลลลกทม mutation ทง 2 copies) / point mutation อกกได

- จากเดม tumor suppressor gene ทมแต 1st hit คอม 1 normal คกบ 1 mutant (heterozygosity) แลวตอมาเกด 2nd hit เรยกวา Loss of heterozygosity (LOH)

- LOH เปนกลไกท activate tumor suppressor gene และเปน marker ของ tumor suppressor gene - Hereditary cancer (5% ของมะเรงทงหมด) เกดกบบคคลทม somatic mutation อยทกเซลล !! เจาะ

เลอดมาตรวจจะเจอความผดปกตของ DNA ถา mutation นนเปน oncogene organ ทจาเพาะตอการเกด cancer กจะคอยๆ เกด cancer ไปทละ

organ โดยไมตองม mutation ใดๆ อก ถา mutation นนเปน tumor suppressor gene (ม 1st hit) รอวาเซลลใน organ ไหนเกด 2nd hit

organ นนกจะเกด cancer

- บคคลทเกดมาพรอมกบ mutant allele ทเสยงตอการเกด cancer = germline mutation (มมาตงแต germ cell แลว) สวนมากเปน tumor suppressor gene ถายทอด 1st hit ดงนน สงทถายทอดไมใช cancer แตเปน cancer predisposition

 TOP  SI 117 

- Sporadic (Non-hereditary) cancer (สวนใหญ) เกดกบเซลลเดยวม somatic mutation เปนตนกาเนดของ clone แลวกขยายตวเปนกอนมะเรง เจาะเลอดมาตรวจจะไมเจอความผดปกต ตองตรวจจากกอนมะเรง

เทานน

- คนทเปน sporadic cancer กยอมไมม mutation อยใน germ cell กยอมไมถายทอด mutant gene ไปใหกบลกหลาน

- เปน sporadic cancer ลกเสยงตอการเปนมะเรงหรอไม? ตอบ เสยง !! แตเสยงเทาประชากรทวไป - เปน hereditary cancer มลกได แตลกจะมความเสยงทจะไดรบกรรมพนธนไปและเสยงตอการเปนมะเรงสง

กวา ตองตรวจตงแตเนนๆ - Malignant melanoma เกดจาก CDKN2A (tumor suppressor gene สราง p16; อยท 9p) ถาม Two-hit เกดขน จะเกด melanoma CDK4 (oncogene; อยท 12q) ถาเกด activation กจะเกด melanoma etc. - DNA damage-response genes เกยวกบ DNA mismatch repair - ปกตเวลาเซลลแบงตวจะเกดความผดพลาดขน (จาก machinery ของ replication ท identify base ผด) ถา

เกดแลวจะทาใหไม complementary กบ DNA สายตรงขาม เกด hairpin structure (กระดกขนมา) - DNA damage-response gene จะสงเคราะห DNA repair protein ทคอยตรวจด mismatch เพอ repair

สวนทผดใหถกตอง - ถา DNA repair protein ทาหนาทผด (โงซาซอน) ไปเอา base สวนทถกทคกบ base ทผดแกใหเขาคกบ base ท

ผดเพอใหเขาคกนได เกด permanent mutation !! - ถา DNA damage-response gene ไมทางาน เกด permanent mutation ขนอยาง random !! ไปเรอยๆ

ควบคมไมได เพราะถา repair สวนทผดไมได เวลาเซลลแบงตว DNA กจะตองแยกเปน 2 สาย สายทม base ทผดกจะ replicate ได DNA เขาคทม base ทผดจบคกนอยในเซลลลก ถา mutation นไปเกดในสวนทเปน proto-oncogene หรอ tumor suppressor gene กจะทาใหเกดความเสยงตอการเกด cancer !!

** จะเหนวา DNA damage-response gene มนไมไดกอมะเรงดวยตวมนเอง แตมนไปสงเสรมใหเกด mutation ขนใน proto-oncogene หรอใน tumor suppressor gene อกทหนง

- การเกด DNA repair mutation จะทาใหเกด genome wide error of replication เราเรยกภาวะท mutation เกดขนใน genome ไดอยาง random เลยวา Genomic instability ทาใหเกด Hypermutable phenotype

- โรคกลมสาคญทเกดจาก DNA repair mutation คอ Hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC; Lynch syndrome)

- 10-15% ของ sporadic tumor จะม Microsatellite instability (MSI) - กรณ HNPCC 95% จะม MSI ในหลาย loci - ถาเรา amplify sequence ของ DNA ทเราเชอวา normal นาจะขนมา band เดยว (เปน single band) แลวเกด

พบวามขนาดหลากหลายมาก (sequence number ม variation มาก) เราจะสามารถบอกไดวาใน tumor ม MSI เมอเทยบกบ normal cell (วธการทา เรากใช normal DNA ของคนไข เทยบกบ tumor DNA ของคนไข)

แสดงวา DNA repair gene ไมไดทาหนาทอยางเหมาะสม จงทาให microsatellite DNA มจานวน repeat copy ทเกดขนไมเสถยร (instable) ม variation ของขนาด DNA ทตางกนทวงบน gel

- Cell cycle control cell cycle ปกต จะม G0 (dormant phase) เซลลทออกมาจาก G0 กจะเขาส S (ม DNA & protein synthesis) G2 M (mitosis) G1 (cell growth)

- Checkpoints of cell cycle 3 ตาแหนง (cell cycle checkpoint = protein ทคอยคมวาเซลลพรอมหรอยงทจะเขาส phase ตอไป)

1. G1 checkpoint ชวงน มการกระตนดวย growth factor, ถาม growth factor มากระตนจนผาน G1 checkpoint ไปไดแลว จะไมตองการ growth factor อกตอไป (ชวงนถกยบยงโดย pRb, p53 และจะถกกระตนใหสรางมากถาม DNA damage)

2. G2 checkpoint ดวา DNA replication ทเกดขนในระยะ S สมบรณหรอไม โดยดวาม okazaki fragment บน DNA lagging strand หรอไม

3. M checkpoint ดวา spindle fiber ตดอยท kinetochores แลวหรอไม - checkpoint proteins (encode มาจาก genes associated with cancer predisposition ทง 3 กลม) ตวท encode มาจาก oncogene มกมผลกระตนใหเซลลขยบไปท phase ขางหนา

 TOP  SI 117 

ตวท encode มาจาก tumor suppressor gene & DNA damage-response gene หยดยงเซลลใหอยใน phase เดม

- family ของ protein ทมความสาคญสาหรบ cell cycle control คอ cyclin-dependent kinase (CDK) ซงจะให checkpoint protein คอยตรวจสอบวาเซลลนนเหมาะสมทจะขยบไปท phase ตอไปใน cell cycle หรอไม และปองกนไมใหเซลลทม damaged DNA แบงตว การทหยดยงไวท current stage กเพอใหเกด DNA repair ได ปองกนการแพรขยาย clone ของเซลลทม mutant allele

- checkpoint protein ยงทาหนาทตดสนวาเซลลไหนทแยมาก (unreparable cell) ไมสมควรจะถกแบงตวตอไป

กจะ shuttle เซลลเหลานนโดยทาใหเกด apoptosis - ดงนน ความผดปกตของ gene ท encode checkpoint protein กทาให cell cycle ผดไปจากปกต (เซลลทควร

จะถก apoptosis หรอเซลลทควรอยใน G0 กถก allow ใหเขา mitosis ตลอดเวลา) - checkpoint protein ทสาคญมากอกตวหนง นอกจาก CDK คอ p53 เปน Master checkpoint ทอยหลง

ระยะ G1 ออกไป คอย detect DNA damage - เมอไรม DNA damage p53 จะทาหนาทคอ 1. กด transcription ของ bcl-2 gene (ซงจะยบยง apoptosis) ระดบ bcl-2 เรง apoptosis 2. เพม transcription ของ bax gene ระดบ bax (เปน cytoplasmic apoptotic protein) เรง

apoptosis ** p53 gene เปน gene ทพบวาเกด mutation บอยทสด !! ในบรรดาการเกด human cancer ทงหมด !! (ทง

sporadic & hereditary cancers) - Abnormal differentiation cancer มคณสมบตคอม abnormal differentiation - Stem cell เปนเซลลทยงไมม differentiation แตม potential ทจะ diffentiate = ม differentiating

capability สงมาก !! - Terminally differentiated cell จะไมแบงตวอก (ex. muscle cell, osteocyte, mature blood cell) ** Differentiation เปนสดสวนผกผนกบ Growth ** - differentiation เกดขนจากผลของ gene จากการม TF (transcription factor) มากระตน (ไป bind กบ

DNA) ใหสราง protein ททาใหเกด differentiation ของเซลล - ปจจบน TF กเปน target ทสาคญทเราจะพฒนายายบยงการเกดมะเรง - Apoptosis เกดได 2 pathways 1. Mitochondrial pathway (Intrinsic pathway) - cell injury (ขาด growth factor, ม DNA damage โดยรงส/toxin/ROS, มการสะสม misfolded

protein) กระตน Bcl-2 family (sensor) - Bcl-2 family กระตน Bax & Bak (Bcl-2 family effector) dimerize เขาไปใน mitochondrial

mb. ไป form channel (gate open) - Cyt.C & pro-apoptotic protein (ex. p53) ออกจาก mitochondria - Cyt.C ไปกระตน initiator caspase เพอใหไปกระตน executioner caspase อกทหนง - p53 ไปกระตน executioner caspase ไดเลย 2. Death receptor pathway (Extrinsic pathway) - receptor-ligand interaction (FasL ทอยบน activated T lymphocyte มาจบ Fas / TNF มาจบ

TNF receptor) กระตน adaptor proteins - adaptor proteins ไปกระตน initiator caspase กระตน executioner caspase - จะเหนวา executioner caspase กจะเปนจดทมาบรรจบรวมกนของ intrinsic & extrinsic pathway สงทมา

กระตน executioner caspase ทาใหเกด apoptosis ได ไดแก 1. Initiator caspase (ถกกระตนโดย cyt. C (กรณ intrinsic) หรอ adaptor protein (กรณ extrinsic)

จากการกระตนโดย FasL-Fas หรอ TNF-TNFR interaction) 2. p53 (ถกกระตนโดย DNA damage) 3. Granzyme B (จาก TC lymphocyte) Executioner caspase กจะไป

1) สลาย cytoskeleton เกด cytoplasmic bleb 2) กระตน enz. endonuclease nucleus แตกเปน fragment เขามาอยใน cytoplasmic bleb

 TOP  SI 117 

Cytoplasmic bleb หลดออกมาเปน apoptotic body relocalize PS (phosphatidyl serine) ออกมาอยดานนอก (เปน caspase-dependent process; ปกต PS จะอยผวในของ cell membrane)

Phosphatidylserine (PS) จะถก recognize โดย macrophage เกด phagocytosis (จบกน

apoptotic bodies) - apoptosis กเปน anti-tumor drug target อยางหนง มคนทาการทดลองโดยการใช cancer cell เอามา

transfect p53 gene เขาไปใน cancer cell cancer mass ลดขนาดลงได !! - bcl-2 oncogene จะผลต protein bcl-2 apoptosis, VEGF ( angiogenesis) ** VEGF = vascular endothelial growth factor (เปน angiogenic protein); ท bl.vv. จะม VEGF

receptor รบ VEGF จาก cancer cells แลวจะถกกระตนใหเจรญเขาไปในกอนมะเรง

- เมอไรท bcl-2 oncogene ม mutation กลายเปน activated oncogene เซลลไมมวนตาย! cancer ** susceptilibity ตอ apoptotic stimuli บอกไดโดย ratio bcl-2 : Bax protein และเปน molecular

switch ซงจะ determine วา cell จะ death หรอ survive - Tumor angiogenesis oncogene ม effect on apoptosis; oncogene บางชนดม effect on

angiogenesis ดวยโดยไปกระตนการสราง angiogenic protein ไปกระตน endothelial cell ใหเกด

angiogenesis

Oncogene Angiogenic protein Inhibitor BCR/Abl PDGF STI 571 Her-2Neu VEGF Herceptin EGF VEGF, bFGF Iressa,C225 Ras VEGF Farnesyltransferase

inhibitor

ยา STI 571 (Imatinib mesylate, Gleevec®) รกษา CML (response rate 80% ถอวาคอนขางด แตทาใหหายขาดไมได ตองกนตลอดชวต !!)

** ยา Gleevec® เปน TK inhibitor ยบยง BCR-Abl TK ทพบในผปวย CML ทาใหหยดการแบงตว แลว

ตายแบบ apoptosis & ไปยบยงการทางานของ PDGF ดวย

ยา Herceptin® (Tratuzumab) รกษา Breast cancer (ฉดแลวมโอกาส 20-30% ท breast cancer นนจะยบตวไปไดแมจะเปนระยะท 4 ทแพรกระจายแลว)

** ยา Herceptin® เปน humanized mAb (monoclonal Ab ทมองคประกอบเปนของคนเกอบทงหมด

ยกเวนสวน hypervariable regions (CDRs) ทอยท variable region ของ heavy & light chains) ตอ

Her-2Neu ซงเปน epidermal growth factor ชนดหนงท overexpressed บน breast cancer cell ** Her-2Neu เปน oncogene ท pathologist สามารถยอมดไดจากชนเนอ ถาพบเปนบวกจานวนมาก (3+,

4+) แสดงถงม overexpress คนไขกจงจะไดรบการฉด Herceptin® ยา Iressa® (Gefitinib) รกษา Lung cancer ** ยา Iressa® จะออกฤทธยบยง epidermal growth factor receptor (EGFR) ใชรกษา non-small

cell lung cancer โดยใชไดผลดกบผปวยทมความผดปกตของ EGFR ททาให receptor ม hyperactivity ยา Farnesyltransferase inhibitor ยงไมมทใชจรงทาง clinic แตทามาทดลองในการลด product

ของ Ras oncogene เพอรกษา Neurofibromatosis type 1 (โรคทาวแสนปม) - Folkman theory ใน tumor ประกอบไปดวย tumor cell + vascular bed - tumor จะโตขนไดเรอยๆ จาเปนตองมการเพมขนทเปน proportion กนของ blood supply โดย tumor cell จะ

สราง VEGF, angiopoietin, angiostatin, VHL ไปควบคมการสราง bl.vv. (กรณ angiostatin จะยบยงการสราง bl.vv.)

- ยา Avastin® รกษา CA colon โดยไปยบยง angiogenesis (แตระวงผลขางเคยงทจะไปยบยง angiogenesis ในลาไสปกต ทาใหเกดลาไสทะลได)

- รกษา Liver cancer ทา Hepatic a. ligation เนองจาก 70% ของเลอดทไปเลยงตบมาจาก portal v., 20-30% มาจาก

hepatic a. แต 90% ของเลอดทไปเลยงกอนมะเรงตบมาจาก hepatic a. ดงนนเราจงผก hepatic a. เลย

ไมใหเลอดเขาไปเลยงกอนมะเรง ทาใหเกด tumor necrosis

 TOP  SI 117 

ทา Transhepatic oil chemoembolization (TOCE; Transarterial chemoembolisation, TACE) ใสสายสวนเขาไปทาง femoral a. แลวเขาไปจนถง hepatic a. ฉดยาเขาไป แลวปลอย gel foam หรอ

นามนเขาไปอด ใหยาคงอยในนน - Immortalization เกดจาก telomerase overexpression - enz. telomerase มชอวา hTERT เปน reverse transcriptase ทจะ recognize hexanucleotide

repeat (TTAGGG) ซงเปน tandem repeat ทอยท telomere - เนองจากเซลลแบงตวแบบ semiconservative replication strand ทเกด Okazaki fragment จะขาดสวน

ปลายไปเลกนอย (ความยาวเทากบ Okazaki fragment) แตไมมปญหา เพราะสวนทหายไปเปนสวนทซากนเปน

ชดๆ ดงนน ในทกๆ ครงทเซลลแบงตว telomere จะสนลงตรงสวน hexanucleotide repeat เมอสนลงไปเรอยๆ มนจะ expose unique sequence ทอยตดกนตอ nucleolus เมอไรทมนสนมากจนถง cut-off value จะกระตนใหเกดการแก เซลลตายในทสด

** ปจจบนเรารวาการแกของมนษยเกดจาก telomere shortening - cancer cell จะม enz. telomerase ท overexpressed (ถาเซลลปกตจะไมม หรอมในระดบตาๆ) เพอคอยมอง

หาวา telomere ไหนทสนแลว มนจะ synthesize telomere ใหยาวออก maintain ความไมแกใหกบเซลล immortalization

** พบวา ถาทาการทดลองโดย transfect telomerase gene หลายๆ copy ใหกบเซลลทแกๆ กลายเปนเซลลออนทนท !! immortalized cell

- การเปน cancer ทเปน poorly differentiated cell กจะมความรนแรงของโรคมากกวา well differentiated cell เพราะเซลลยง differentiate ไดนอย จะ growth ไดมาก ดงนน lymphoblastic (immunoblastic) lymphoma ยอมรนแรงกวา lymphocytic lymphoma

- Metastatic potential การท cancer cell สามารถหลดออกจากกอนมะเรง แลวเคลอนยายตวเองไปตงถนฐานทอน (เปนเหตการณทเกดขนในชวงทายๆ ของการเกดมะเรง การกระจายของมะเรง) เกดกอนใหมขนทอน

เรยกกอนใหมทเกดขนนวา metachronous tumor (มาจาก clone เดม มางอกเปนกอนใหม) ** ตางกบ synchronous tumor ทมาจากคนละ clone กน แตเกดขนพรอมกน

- cancer cell ตองสามารถสราง enz. ยอย matrix ยอยตวเองออกจากเซลลขางเคยงได enz. ทสาคญคอ enz. protease (proteolytic enz.) รองลงไปคอ collagenase, elastase

- gene สาคญทควบคมการสราง enz. ในกลมน คอ gene ในกลม metalloprotease ex. TIMP1, TIMP2, KISS-1, DCC (delete in colon cancer) express enz. ยอยแลวทาใหเซลลเขาไปใน bl.vv. หรอ lymph vv. แลว metastasis ไปทอนได

** MP = matrix metalloprotease บางทเรยกวา MMP family gene - เมอกอน เราถอวา cancer cell เทานนทม metastatic potential แตในปจจบนเรารวา benign tumor กม

metastatic potential - ในผหญงทม uterine leiomyoma มความสามารถจะหลดไป organ อนได !! (ทงๆ ทเปน benign tumor) =

Metastasizing leiomyoma (จากทมกอนใน uterus กไปพบกอนเตมปอดไปหมด แตเปน benign tumor) - Endometriosis (Chocolate cyst) เปนอกตวอยางของ endometrial lining ทสามารถงอกขนหลายทใน

รางกาย (ex. ไปเกดท lung, skin, brain) ตดชนเนอมาดกพบวาไมใช cancer ** ดงนน ถากลาววา cancer cell เทานนทม metastatic potential ผด !! เพราะมตวอยางของเซลลทไมใช

cancer แตม metastatic potential ไดแก 1. metastasizing leiomyoma 2. endometriosis - Chemical oncogenesis  จะเหนวา colon cancer บาง step กเกดจากการ expose ตอ chemical

(normal hyperproliferative epithelium) ex. ชอบกนถว, ลกชนปง ** cancer เกดไดจาก 1. Gene 2. Chemicals 3. Ionizing radiation & UV 4. ความซวย (คออาจมา 1., 2.,

3. ทเราไมรวาอะไร) - ใน chemical oncogenesis ขอมลสวนมากไดมาจาก 2 สวนคอ

1. Epidemiologic study (ศกษาทางระบาดวทยา) ex. คนททางานในโรงงาน plastic ท expose ตอ vinyl chloride ตลอดเวลา จะเกด angiosarcoma, คนสบบหร (มสาร TAR หรอ TAR-related substance) จะเปน CA lung, CA bladder, CA pancreas

- ใน chemical oncogenesis ม 3 ขนตอน 1. Initiation สารเคมตอง induce ใหเกดการเปลยนแปลงของเซลลกอน

 TOP  SI 117 

2. Promotion กระตนใหเซลล growth มากขนเรอยๆ 3. Progression ทาใหเนองอกขยายขนาดใหญและม malignant potential ** มผพยายามเอา 3 ขนตอนนไป map กบ gene ไดขอสรปวา gene อยทขนตอนไหนกได สารเคมจะออกฤทธโดยตรง หรอออกฤทธผาน gene กได

- สารกอมะเรงเรยกวา carcinogen (แตจะทาใหเกด carcinoma หรอ sarcoma กได) - Carcinogen ม 3 classes

1. Genotoxic ออกฤทธโดย toxic ตอ genome มนษย ซงเปนได 2 แบบ 1) Clastogen ทาใหสาย DNA ฉกขาด ทาใหตามดวย repair ถา repair ไมไดหรอ repair ผดปกต

กจะเกด permanent mutation 2) Mutagen ทาใหเกดการเปลยน base ไปเลย (ex. alkylating agent)

2. Mitogenic กระตนใหเกด mitosis (ex. phytohemagglutinin ทพบใน mitogen จะกระตน T cell ใหแบงตว)

3. Cytotoxic พดรวมๆ วาเปนพษตอเซลล ไมไดเจาะจง อาจกอมะเรงโดยกระทาตอสวนทไมใช DNA (ex. ไป

inhibit mitochondrial apoptotic signal) - ตวอยางของ chemical oncogenesis

Alkylating agent Leukemia As (arsenic, สารหน) Skin cancer (squamous cell carcinoma & basal cell carcinoma) Vinyl chloride (ในโรงงาน plastic) Angiosarcoma Nitrosamine Stomach cancer Asbestos (อยในใยแกว, optic fiber) Mesothelioma

- chemical agent อาจจะ act ผาน non-genotoxic pathway (สวนใหญ) หรออาจทาใหเกด genetic mutation กได แลวจงทาใหเกด cancer

- ปจจบน คนททางานอยในโรงงานทม fiber optic กจะไดรบการตรวจ CXR สมาเสมอ & ไดรบการใส mask ชนดพเศษทสามารถปองกนใย asbestos ได (asbestos ทาใหเกด mesothelioma)

- chemical carcinogen ทาใหเกด sporadic cancer ยงไมมหลกฐานวา chemical carcinogen เรงการเกด

hereditary cancer (คนทเปนจะซวยดวยตวเขาเอง ไมตองเจอ carcinogen ใดๆ กมโอกาสเปนมะเรงสงอยแลว) - Hereditary cancer พบ 5-10% ของ cancer ทงหมด, ลกษณะการถายทอดเปนตาม Mendelian

inheritance แบบ AD ทงหมด !! เกอบทงหมดเปน tumor suppressor gene ** ระวงสบสน การถายทอด genetic predisposition ม pattern แบบ dominant (AD) คอรบเพยง 1st hit mutation กคอได genetic predisposition แลว แต tumor suppressor gene มกลไกระดบเซลลเปน

recessive ตาม two-hit hypothesis - ผปวยทเปน cancer แลว 1 organ ความเสยงของ cancer ท organ อนกอาจจะม ในกรณท cancer นน

แสดงออกหลายระบบทเรยก pleiotropic effect ดงนนการตรวจหา gene กอมะเรงนกอาจจะนาไปสการปองกนมะเรงท organ อนได

- ตวอยางของ hereditary cancer Retinoblastoma (จาก Rb1: tumor suppressor gene) เกดขนไดตงแตอยในครรภ Familial adenomatous polyposis (จาก APC: tumor suppressor gene) MEN2 (จาก RET: oncogene) Breast-ovarian cancer (จาก BRCA1 & 2: tumor suppressor gene) Xeroderma pigmentosum (จาก XP: oncogene) เกด skin cancer ถาโดน UV โดยทาใหเกด

thymidine dimerization แลวคนเหลานจะ repair ไมได (คนเหลานจะเดนออกนอกบานไดเฉพาะตอนกลางคนเทานน)

- ความรเกยวกบ oncogenesis นาไปสอะไรบาง 1. การรกษาโรค (อาจใช gene therapy หรอ mAb ตอ oncogene product = targeted therapy) 2. ใช Ab หรอ chemical เพอ induce tumor suppressor gene หรอเลยนแบบ tumor suppressor gene

product (ex. transfect p53 หรอ CDK ลงไปใน cancer cells) 3. ใช angiogenesis inhibitor 4. ใช apoptosis inducer induce apoptosis ดวยยาหรอ chemical

 TOP  SI 117 

5. ใช differentiation inducer (ex. growth factor หรอ differentiation factor บางชนด) induce ใหเซลลพฒนาไปเปน terminally differentiated cell มนจะไดหยดแบงตว

6. ใช telomerase inhibitor - Cancer gene therapy เปนสวนใหญของ gene therapy ทมในปจจบน พยายามตดตอ gene เพอยบยง

การโตของมะเรง ททา gene therapy กบ cancer เพราะเทยบแลวทางายกวาอยางอน เพราะ cancer เปนโรคของ somatic cell เราแคไปเปลยนแปลงเซลลสวนหนงเทานน (ไมคอยทากบโรคพนธกรรม (monogenic disease)

เพราะเกด mutation ทกเซลล ตองเปลยนแปลงเซลลทงรางกายซงยาก!!) - การทดสอบวาโมเลกลทเราสนใจสามารถเขาไปส cancer cell ได = gene marking study - การรกษา เชน

1. เพม apoptotic gene 2. การ block oncogene ดวยโมเลกล RNA ทเปน antisense 3. ใสโมเลกลบางอยาง หรอ express gene บางอยางใน cancer cell แลว induce ใหเกด apoptosis (ex. เอา

melanoma cell หรอ TC cell ทอยรอบๆ tumor ออกมาใส IL-2 แลวเอาเซลลทถกกระตนแลวฉดกลบเขาไปเพอใหไปฆา cancer cell) = suicidal gene therapy

4. Tumor immunotherapy (tumor vaccine) ให Ab คอ tumor antigen 5. ใส gene ททาใหมความอดทนตอการใหยาพษเขาไปในเซลลปกต โดยอาศยกลไกวา cancer cell ไมสามารถ

uptake gene เหลานเขาไปได = Drug resistance salvage gene therapy 6. เลอกใส gene ททาใหเกดความไวตอยาเขาไปใน cancer แลวใหยานนเขาไป 7. block oncogene โดยใช recombinant mAb = targeted therapy

- ปจจบน gene therapy ยงมความสาเรจนอย เพราะประสบปญหาเกยวกบการหา non-toxic vector, ตองไมทาใหสรางภมคมกนตอ vector เพอให vector อยไดนาน, ตองผลตไดงาย ตลอดเวลา สามารถใส vector ไดงาย, สงทใสเขาไปตองม express gene product ไดนานและสง, ตองออกฤทธเรว, ตองเปนทยอมรบ

Quiz 1. Mutation ทเกดใน cancer-related gene เปน dominant กได หรอ recessive กได oncogene เปน dominant; tumor suppressor gene และ DNA mismatch repair gene เปน

recessive 2. cancer-related mutation ทก types ทเกดขนพบไดใน all cancer cells เฉพาะ 1˚ genetic alteration เทานนทพบในทก cancer cells แตการเปลยนแปลงอนๆ อาจจะไมพบในทก

เซลล 3. sporadic cancer เกดจาก somatic mutation แต hereditary cancer เกดจาก germline mutation แตบางท hereditary cancer กอาจเกดจาก somatic mutation ดวยและม germ cell involvement 4. DNA mismatch repair gene ม oncogenic mechanism คลาย tumor suppressor gene มากกวา

oncogene DNA mismatch repair gene ตองสญเสยทง 2 copy จงจะ loss of function และเกด genomic

instability ทาใหเกด cancer 5. oncogene mutation สวนมากเกดจาก loss of function oncogene mutation สวนมากเปน gain of function (ex. จาก amplication, translocation) 6. ใน tumor suppressor gene 1st hit mutation สวนมากเปนชนดทแตกตางจาก 2nd hit mutation 1st hit mutation สวนมากเปน point mutation แต 2nd hit mutation เปนอะไรกได (chromosome loss

/ deletion / unbalanced translocation / loss and reduplication / mitotic recombination / point mutation)

7. hereditary cancer สวนมากจะพบในอายนอยกวา cancer ชนดเดยวกนทเปน sporadic cancer เพราะ hereditary cancer สวนมากเกดจาก tumor suppressor gene เปนไปตาม Two-hit model

บคคลทเปน hereditary cancer ไดรบ 1st hit มาจากพอแม ตองรอเวลา X ป เพอใหเกด 2nd hit แตคนท

เปน sporadic cancer ตองใชเวลา X+Y ป (X ปเพอเกด 1st hit บวกอก Y ปเพอเกด 2nd hit) ดงนนคนเปน

hereditary cancer จงมกจะเกดทอายนอยกวา sporadic cancer ตางกบ oncogene ทมกจะไมตางกน

เพราะเกด cancer ไดจาก single mutation

 TOP  SI 117 

8. targeted therapy ทเปนทนยมมากทสดในปจจบนคอการใช stimulation ของ tumor suppressor gene the most common type ของ targeted therapy ในปจจบน คอใช mAb ตอ product ของ oncogene 9. tumor cell ม characteristic คลายคลงกบ normal cell ยกเวน immortalization & metastatic

potential 10. ปจจบนม genetic test สาหรบ hereditary cancer โดย test เหลานสามารถทาใหผปวยและ family

member มชวตยนยาวได (lead to better survival) เพราะการ test เจอ hereditary cancer ทาใหแพทยสามารถใหคาแนะนาแกครอบครววามความเสยง

มากกวาประชากรปกต และสามารถใหคาแนะนาในการระมดระวงตวเองตรวจมะเรงในระยะเบองตนเพอใหเกด

early treatment หรอตด organ ทจะเกดมะเรงทงกอนจะเกดมะเรง

Developmental Genetics and Birth Defects - Developmental genetics วชาทวาดวย genetic control ทมตอ embryonic development และ

หลงจากนน - Developmental genes มลกษณะสาคญ ดงน

1. Evolutionary conservation มการ conserve ไวใน evolution (คอพบไดในสงมชวตตงแตชนตาชนสง มเหมอนๆ กน) เพราะมนจาเปนสาหรบชวตทปกต

2. Temporal specificity ออกฤทธในชวงเวลาทจาเพาะ & ในลาดบเวลาตอเนองกนทจาเพาะ 3. Tissue specificity จาเพาะตอเนอเยอ (บาง gene กออกฤทธเฉพาะกบ brain, บาง gene ทออกฤทธ

เฉพาะ limb, แตบาง gene กอาจออกฤทธในหลายๆ organ กได) - Genetic mediators of development (สงสอจาก genetic ไปส target เพอควบคม development)

1. Paracrine signaling molecule เปน protein ทเมอถกสรางออกจากเซลลแลวจะไปอยใน space รอบๆ

เซลลแลว diffuse ไปในระยะใกลๆ สงสญญาณไปใหเซลลอยเซลลรอบๆ (เซลลทรบสญญาณอาจอยใกลๆ

หรอหางไกลกบมนกได); gene family ทสราง paracrine signaling molecule ม 4 families ไดแก 1.1 Hedgehog family 1.2 Wingless (Wnt) family 1.3 Transforming growth factor β (TGF-β) family 1.4 Fibroblast growth factor receptor (FGFR) family 2. DNA transcription factor เปน protein ทไปจบท regulatory sequence ของ gene เพอจะ

regulate gene expression (ทอย downstream ตอมน (3’)) ** TF บางตว อาจออกฤทธตอ gene หลาย gene ทอย downstream ตอมนกได ดงนนการ

เปลยนแปลงของ TF จงมผลมาก ! gene family ทสราง TF ไดแก

1.1 Homeodomain-containing family 1.1.1 Homeobox (HOX) gene family 1.1.2 Paired-box (PAX) gene family

1.2 High mobility group (HMG)-box-containing family 1.2.1 SOX

1.3 T-box (TBX) gene family 3. ECM protein เปน macromolecule; ex. collagen, fibrillin, proteoglycan, large glycoprotein

(fibronectin, laminin, tenescin) ** การเกด mutation ท fibrillin-1 gene ทาใหเกด Marfan syndrome ** การเกด mutation ท elastin gene ทาใหเกด supravalvular aortic stenosis

- Sonic hedgehog-Patched-Gli pathway SHH gene (sonic hedgehog gene) จะชกนาใหเกด cell proliferation (express ท notochord, brain, limb) สราง SHH protein ไปจบกบ Patched (Ptch) (เปน receptor (transmembrane protein) ของ SHH; สรางจาก PTCH gene)

- ปกต Ptch จะไป inhibit การทางานของ Smoothened (Smo) (เปน transmembrane protein อกตวหนง สรางจาก SMO gene)

- SHH มาจบ Ptch Ptch เลก inhibit Smo เกด signaling cascade ในเซลลได !!

 TOP  SI 117 

- พบวา mutation ของ gene ทควบคม protein ของระยะตางๆ ใน Sonic hedgehog-Patched-Gli pathway ทาใหเกดโรคตางๆ กนหลายโรคนาสนใจ ex. mutation ของ SHH Holoprosencephaly (defect ในการสรางแยก forebrain & midface, ม proboscis ยน

ออกมา; ถาม degree มากกเปน cyclopia (ตาเดยว)) ** นอกจาก SHH mutation แลว ยงอาจเกดในคนทเปน trisomy 13 ได

PTCH Nevoid basal cell CA syndrome SMO Basal cell CA บางชนด & Medulloblastoma GLI3 Pallister-Hall syndrome, Grieg syndrome, Smith-Lemli-Opitz syndrome (จะเหนวา

ทาใหเกดโรคตางกนไดถง 3 อยาง เปนอกตวอยางของ clinical heterogeneity) CREBBP (สราง cofactor สาหรบ Gli protein) Rubinstrin-Taybi syndrome (มนวหวแมมอใหญ

= broad thumb) - Fibroblast growth factor receptor (FGFR) เปน paracrine signaling molecule; FGFR ม

domain ตางๆ, mutation ทเกดท domain ตางกนกจะทาใหเกด skeletal dysplasia (กรณ FGFR3) หรอ craniosynostosis (กรณ FGFR2, FGFR1) ตางชนดกนได

- domain ของ FGFR จะม Ig-like domain, TM domain (transmembrane), TK1 & TK2 domain (tyrosine kinase) ถาเกด mutation กจะเกดโรคตางๆ

** skeletal dysplasia & craniosynostosis เปนตวอยางของ clinical heterogeneity ** Pfeiffer syndrome เปนตวอยางของ locus heterogeneity - Homeobox (HOX) gene ประกอบดวย conserved 180 bp sequence = homeobox สราง HOX

protein เปน TF - HOX gene แบงไดเปน 4 gene clusters (A, B, C, D) แตละ cluster ประกอบดวย gene ท link กนอยาง

ใกลชด ** ในหน (Hox) & มนษย (HOX) ม cluster เหมอนกน ม gene คลายคลงกนมาก - ใน 1 cluster จะใหหมายเลขตงแต 1-13 (แม gene อาจมไมครบ 13) - ลกษณะเดนของ HOX gene: gene ทอยตาง cluster กนแตหมายเลขเดยวกน จะมความคลายคลงกนมากกวา

gene ทอยใน cluster เดยวกนแตตางหมายเลข (ex. HOXA13 กบ HOXB13 จะคลายกนมากกวา HOXA13 กบ HOXA1-12) ลกษณะน เรยกวา Paralogous gene (gene มความคลายคลงกน แมจะอยตางทกน)

- [AD] Synpolydactyly เกด mutation ท HOXD13 ทาใหมนวเกน (เปน gain of function mutation) - [AD] Hand-Foot-Genital syndrome เกด mutation ท HOXA13 ทาใหมนวท 1 & 5 สน,

hypospadias, bicornuate uterus ** โรค synpolydactyly & hand-foot-genital syndrome เปนเพยง 2 โรคในมนษยทพบวาเกดจาก mutation

ของ HOX gene - Paired-box (PAX) gene ประกอบดวย conserved DNA sequence ท encode DNA-binding

transcription regulator domain; ปจจบนคนพบแลว 9 PAX genes - [AD] Waardenburg syndrome type 1 เกด mutation ท PAX3 sensorineural hearing loss,

hypopigmentation (ม patch of white hair), pale blue eye - [AD] Aniridia (ไมม iris) เกด mutation ท PAX6 (เปน loss of function mutation)

** aniridia ยงพบเปนสวนหนงของ WAGR syndrome ซงเกดจาก 11p13 microdeletion ดวย - T-box (TBX) gene มกระจายทวไปใน genome - [AD] Ulnar-mammary syndrome เกด mutation ของ TBX3 (เปน loss of function mutation) - [AD] Holt-Oram syndrome เกด mutation ของ TBX5 (เปน loss of function mutation)

defect ท upper limb & shoulder girdle, ม cardiac anomaly

Immunogenetics - Major histocompatibility complex (MHC) เปน cluster ขนาดใหญบน chr.6 - MHC ม 3 classes แตละ class ม polymorphism มาก! (ในแตละ locus มความหลากหลายมาก & haplotype

ของมนกจะทาใหเกดความหลากหลายมากขนไปอก)

 TOP  SI 117 

** haplotype ทงหมดทเปนไปได (เอา antigenic variant คณกนทงหมด) ≈ 15 ลาน haplotypes และhaplotype ยงมการแสดงออกแบบ co-dominant (ถายทอดแบบ AD และทง 2 alleles มการแสดงออก โดย

แสดงออกในระดบหองปฏบตการ) ดวย !! (มความสาคญในการทา organ transplant ตองมความจาเพาะ) - เฉพาะ MHC class I & II เทานนทเปน HLA อยบน cell surface ซงจะ recognize Ag รวมกบ TCR - MHC class III เปนเพยง serum protein ซงบางสวนเกยวของกบ immune system (ex. complement,

properdin, cytokine) บางสวนกไมเกยวของเลย (ex. TNF, 21-OHase, HFE) - MHC class I อยท cell surface ของทก nucleated cell; ประกอบดวย HLA-A, HLA-B, HLA-C - structure ของ MHC class I ประกอบดวย polypeptide 2 unit ทแตกตางกน heterodimer (ประกอบดวย

α chain ของ MHC class I กบ β2m interact สวนใหญกบ CD8+ lymphocyte) - MHC class II อยท cell surface ของ professional APC (DC, MØ, B cell) ; ประกอบดวย HLA-

DP, HLA-DQ, HLA-DR - structure ของ MHC class II เปน heterodimer เหมอนกน แตเปน α & β subunits ** peptide binding cleft ของ MHC class I molecule จะอยระหวาง α1 กบ α2, สวน peptide binding

cleft ของ MHC class II molecule จะอยระหวาง α1 กบ β1

** MHC class I จะใช α3 จบกบ CD8, สวน MHC class II จะใช β2 จบกบ CD4 - locus ของ HLA gene ใกลกนมาก มกถายทอดไปดวยกน !! (เปน haplotype; โอกาสเกด recombination

นอย) ** โอกาสทพนองทพอแมเดยวกน จะม haplotype ทเหมอนกน = ¼

- HLA and disease association ยงไมทราบแนชด (ถงแมวาโรคสวนใหญจะเปน autoimmune disease) - อาจเปนไปไดวา

1. HLA บางชนดมความโนมเอยงทจะกอ autoimmune disease มากกวา HLA ชนดอน 2. เปนความสมพนธโดยบงเอญ คอม disease gene ท link กบ HLA บางชนด (จงถายทอดไปดวยกนตลอด

เปนภาวะ linkage disequilibrium) ** คนทเปน ankylosing spondylitis (ม chronic inflammation ของ axial joint) > 95% ม HLA-B27

ม association แนนอน !! (แตทาใหเกดโรคหรอไม บอกไมได! เพราะคนสวนใหญทม HLA-B27 กไมเกดโรค) ** disease association ไมจาเปนตองเปน positive association อาจเปน negative association กได (ex. ผทม HLA-DQ6 จะมความเสยงตอ DM type I นอยกวาคนปกต) ** คนทเปน hereditary hemochromatosis (เกดจาก mutation ของ HFE) 75% ม HLA-A3 เพราะ mutant allele ของ HFE (เปน MHC class III) link กบ HLA-A3 (เปน MHC class I)

- Immunoglobulin (Ig) Ig หรอ Ab แตละชนดจะมความจาเพาะตอ Ag เพยง 1 ชนดเทานน - Ab มอย 2 forms

1. Membrane-bound form อยบนผวของ B lymphocyte (สรางจาก B lymphocyte) = B-cell receptor (BCR)

2. Soluble form ละลายอยใน serum (สรางจาก plasma cell) - T-cell receptor (TCR) เปน membrane-bound receptor บน T lymphocyte ม structure

คลายคลงกบ Ig, สวนใหญเปน αβ TCR, recognize peptide-MHC complex จาก APC (MHC class I กจบกบ CD8, MHC class II กจบกบ CD4)

** กรณ BCR (membrane-bound Ig) จะใช Igα & Igβ ทาใหเกด signal transduction สวน TCR จะใช CD3 ทาใหเกด signal transduction

- Somatic rearrangement of Ig cluster (เกดขนในชวงการสราง specific B lymphocyte เมอมกระตนผาน APC) เปนกลไกททาใหคนเราสามารถ recognize Ag ทหลากหลายในโลกนได (กจะตองสราง Ab หลากหลายเชนกน) โดยสราง Ab จาก gene เพยงไมก gene เทานน

- ทง light chain & heavy chain จะม constant region (เหมอนกนในทก Ab) สวนทตางกนในแตละ Ab เรยกวา variable region ** constant region กบ variable region ตอกนดวย junctional region

- ในสวน heavy chain ยงม hypervariable region (complementarity determining region, CDR) เปนสวนเลกๆ ทมความหลากหลายมากขนไปอก (ซงกเปนสวนของ variable region) ** Ag จะจบกบ Ig ท CDR ของ VH & VL

 TOP  SI 117 

- มสวนหนงของ Ig gene ซง code สาหรบ constant region โดยเฉพาะ (กรณ heavy chain กจะม 5 regions ใหญๆ ตามความแตกตางของชนด Ig)

- ยงม unit เลกๆ ท code region ตางๆ ของ variable region ซงแตละ unit กมความหลากหลายใน subunit ของมนเอง

- เมอมการกระตนใหสราง specific B lymphocyte (ถกกาหนดใหสราง Ig ไดเพยงแบบเดยว) จะเกด

rearrangement ขนใน Ig cluster โดย enz. recombinase ทาการตด subunit ทจาเพาะในแตละ region นน

เอาสวนทไมตองการออก เกด D-J joining เกด V-DJ joining เกด VDJ-H joining ได final product ทพรอม translated code heavy chain ของ specific Ab ออกมา (specific กบ Ag ชนดเดยวเทานน) ** V = variable, D = diversity, J = junctional ** คาอธบายนเปนของ heavy chain; กลไกนกเหมอนการสราง TCR (structure คลายกบ Ig)

- Single-gene disorders of the immune system

Category Designation Gene defect Inheritance

Combined T & B lymphocyte

defects

X-linked SCID IL2RG XR Adenosine deaminase deficiency

ADA AR

Omenn syndrome RAG1, RAG2 AD Ab deficiency Bruton’s agammaglobulinemia BTK XR

Distinctive syndromes with immune defects

Wiskott-Aldrich syndrome WASP XR Ataxia telangiectasia ATM AR

Phagocyte disorders

Chronic granulomatous disease (CGD)

CYBB, CYBA, others

XR, AD

Chediak-Higashi syndrome CHS1 AR

Genetic Counseling and Genetic Risk Assessment - จดประสงคดงเดมของ genetic couseling คอชวยใหคนทเสยงตอการเปนโรค/เปนโรคอย/เสยงตอการถายทอด

โรคม understanding (ทาใหเขาเขาใจวาเกดไดอยางไร ชวยคลายทกขไดบาง) แตปจจบนสามารถทาใหเขามทางเลอก!! ตดสนใจทจะรบบรการใด ดงนน ปจจบนบทบาทของ genetic counseling ทสาคญคอ prevention (จรงๆ เราอยากรกษา แตทาไมได)

- Incidence of genetic diseases สารวจในเดกทม genetic condition & malformation ● 2.5% เปนมาแตกาเนด (พบในเดกแรกเกด) ● 30% ของคนไขเดกทตองอยใน ร.พ. ม genetic เปนสาเหต

- การศกษาใน adult พบวามประชากร 10% ม chronic disease ซงม genetic component ดวย (คอเปน

complex disorder นนเอง) - Total load of genetic diseases พบวาประชากร 1,000 คนจะมภาวะของ genetic disease 37-52 คน

(ทสาคญในประเทศไทยกคอ thalassemia & G6PD def.) - Patient and family with genetic disease คนไขทเรมสรางครอบครวจะมความหวงวาตนจะมครอบครว

ทสมบรณ มอนาคตทแจมใส แตเมอเขาพบวามเขาปญหาเรองพนธกรรม ทกอยางสญสลาย สงคมกทกขไปดวย เปน

เหมอน “ภาระของสงคม” (ฟงดไมด) เราจงไมปลอยใหปญหานเกดขน ทงๆ ทเรารวาแกไขได มเทคโนโลยด แตแพทย

ขาดความร! - Micheal Baraitser เปน geneticist & neurologist กลาววา “มนเปนความตองการพนฐานของมนษย (basic

human need) ทจะรวาเกดอะไรผดปกตขน จะเกดซาอกไหม แลวจะปองกนไดไหม” แมวาโรคนนจะยงไมมวธรกษาทไดผลในปจจบน

- Genetic counseling เปน communication process (กระบวนการสอสาร; ตองมการใหขอมล รบขอมล มผ

สงสาร และผรบสาร สารนนเปนทงวจนสาร (verbal) & อวจนสาร (non-verbal)) ทเกยวของกบปญหาของมนษย

 TOP  SI 117 

● Information การให genetic counseling ตองใหแนใจวาบคคล/ครอบครวนนเขาใจ! เขาใจ

diagnosis, course (ตอไปจะเกดอะไรขน), treatment, ถายทอดแบบไหน, risk ตอการเกดขน/ถายทอดไป, มทางเลอกอะไรบางทจะจดการกบ risk เหลาน ** genetic counseling จะไมบรรลวตถประสงค ถาผมารบคาปรกษาไมเขาใจ ดงนนแพทยตองฝกฝนการให

genetic counseling (เพราะตองสอสารกบทงคนไข, ครอบครวคนไข & ประชากรทวไปทมาตรวจ) ● Support genetic counseling จะชวยใหกาลงใจ เพอใหคลายความทกข! โดยใหเขารวาเกดขนไดยงไง

ตอไปจะเกดอะไรขน (คนทรวาตอไปจะเกดอะไรขน จะมความทกขนอยกวา) เพอใหเลอกทางเลอกทเหมาะสมตามความตองการของเขา โดยเขาใจพนฐานความคด ความตองการ โครงสรางครอบครว สงคมของเขา

** ดงนน genetic counseling คนทรดทสดคอคนไข !! (ไมใชแพทย ไมไดใหแพทยหรอ genetic couselor

บอกวาอะไรดทสด แตใหคนไขเขาใจแลวตดสนใจเองบนพนฐานของความเขาใจ = informed decision) - Indications for genetic counseling

1. ผทเพงไดรบการวนจฉยวาม genetic disease 2. ผทมประวตครอบครววาม genetic disease ในครอบครว (แมวาตวเขาเองจะไมเปน) 3. คสามภรรยาทเคยมลกทม genetic disease 4. ผทจะทา prenatal diagnosis เนองจากมารดามอายมาก (> 35 ปในวนทเดกคลอด) 5. คสามภรรยาทเปนญาตกน (consanguinity) 6. คนท expose ตอ teratogen (สารกอลกวกล; ex. ยา, X-ray) 7. ภรรยาแทงบอยๆ (อาจเปนเพราะลกม chromosomal disorder เนองจากพอหรอแมเปน translocation

carrier) , เปนหมน (ex. พอเปน Klinefelter’s syndrome) 8. กอนทา genetic testing ( carrier testing, presymptomatic testing) = pretest counseling (เพอ

อธบายวาทาไมถงทา, ทาอยางไร, ผลแปลวาอะไร, false positive, false negative, ขอจากด, คาใชจาย, เวลาทใช, ประโยชน & ผลเสยทจะเกดขน) & เมอไดรบผล = posttest counseling (อธบายซาอกครงวาผลนนแปลวาอะไร, มทางเลอกอยางไร) ** การทา genetic testing ให โดยไมทา counseling กอน ถอวาผดจรยธรรม! (จะทาใหเกดปญหา!)

9. ทาในคนทไมไดเปนโรค แตมาตรวจกรอง (screening) วาเปนหรอเปลา ● heterozygote screening (ex. thalassemia) ● prenatal screening (ex. ทา serum screening ในแม, ทา ultrasound ด fetus ในครรภ) ● newborn screening (ex. PKU, congenital hypothyroidism)

- Steps in genetic counseling 1. Question ดวาเขาถามอะไร (ถามเรองตวเขา/ลกเขา/ความเสยงตอการมลกเปนโรค/ตรวจดมย) 2. Diagnosis ตองมกอนให genetic counseling (ถาไมม diagnosis ทถกตองมากอน จะทาใหเกดผลเสย

ตามมามากมาย) 3. Pedigree ดวาในครอบครวมใครเปนโรคบางหรอไม

** แต pedigree ทไมมใครเปนโรคเลย มแตตวเขาเปนคนเดยว กจาเปนตอการให genetic counseling (ไมใชทาแตกรณทมคนเปนหลายคนในครอบครวเทานน)

4. Risk assessment ดวาใครในครอบครวอกบางทเสยง (ใช pedigree & ตองมความเขาใจเรอง mode of inheritance) จาเปนตองมารบ genetic counseling/testing

5. Communication สอสารใหเขา/ครอบครวเขาเขาใจ 6. Follow-up and support ตดตามและใหการสนบสนนประคบประคอง

- ผใหคาปรกษาแนะนา = genetic counselor, ผมารบคาปรกษาแนะนา = counselee (consultand) (อาจเปน/ไมเปนโรคกได)

- คนทเปน genetic counselor ในประเทศตะวนตก นอกจากแพทย (ทเปน medical geneticist) แลว ยงมปรญญาการฝกอบรม ซงคนทจะเปน genetic counselor ได ตองจบปรญญาโทเปนอยางนอย ! (ขณะนมถง

ปรญญาเอก; ตองมความรทง genetic & communication เปนอยางด) - Establishing diagnosis เปนขนตอนสาคญทสด!!; เพราะถา diag. ผด กจะใหขอมลผด เกดผลเสยตามมา

เปนเหตใหมการฟองรอง!

 TOP  SI 117 

- การ diag. กมการซกประวต, ตรวจรางกาย, เขยน pedigree*, ตรวจ lab, imaging, genetic testing* (karyotyping, biochemical analysis, DNA analysis)

- สญลกษณในเขยน pedigree ทนาสนใจ: ไมทราบเพศ = , ครรภไมทราบเพศ = , ผชาย 5 คน = , ผชายไมทราบจานวน = , = ญ. เปน carrier ของ XR (ถา carrier ของ AR ใชระบายทบครงซก)

P  5 

n 

- การเขยน pedigree: เรมจากคนทเปน proband เขยนพนอง เขยนพอแม เขยนลก; บอกวาใครเปน

proband, carrier (heterozygote) - Barton Childs กลาววา “ถาไมถาม family history ทด เปนทเวชศาสตร (bad medicine) แลวสกวนหนงกจะ

ถกลงโทษทางกฎหมายโทษฐานละเลย” - Working pedigree: - จะ diag. ไดยงไงวาเปนโรคอะไร? สงปรกษา

ผเชยวชาญ (ex. neurologist), เปดตารา, internet, หนงสอภาพตางๆ, บทความวารสาร, etc. - Risk assessment

 

 

ในทาง genetic แบง risk ได เปน 2 อยาง

1. Theoretical risk (ความเสยงทางทฤษฎ ทกคน

ทกเชอชาตเหมอนกน) เปน risk ของ mendelian disorder; อาศย ● Pedigree (เอามาเขยน chromosome

(mating) diagram & Punnett square) ● Lab test/investigation/genetic testing

(ทาให risk จาก pedigree เปลยนไปได ex. จาก pedigree ม risk ½ แตเมอทา genetic testing ไดผลลบ risk กลายเปน 0)

2. Empirical risk (ความเสยงทไดจากการศกษาประชากร ไมตรงไปตรงมา) เปน risk ของ chromosomal

& multifactorial disorder; อาศย Population survey (ศกษาครอบครวคนไขทมคนเปนโรคแลว 1 คน

โอกาสทอกคนจะเปนดวยมมาก/นอยเทาไหร) - risk ทเกดขนแตละครงไมขนตอกนและกน (risk ทจะเกดครงตอไปยงเทาเดม) “Chance has no memory!”

จาก pedigree จะตองบอกไดวาใครทเปน obligate heterozygote - ● AD คนทมพอ/แมเปน + มลกเปน

(ถาเขาไมแสดงอาการออกมาแสดงวาอาจเปน non-penetrant case = incomplete penetrance) ● AR พอแม & ลกของคนทเปนโรคทกคน

● XR 1. ลกสาวของ ช. ทเปนโรค 2. ญ. ทมลกเปนโรค & พนอง ช. 1 คนเปนโรค

ญ. ทมลกชาย 2 คนเปนโรค/ลกสาว 2 คนเปน carrier/ลกชาย 1 คนเปนโรค ลกสาว 1 คนเปน carrier 3. - autosomal disorder ทเปน sporadic case จะซบซอนมาก แนะนาใหสงปรกษา geneticist แตอาจใหคาแนะนา

เบองตนไปกอนได ex. มลกเปน NF แลว 1 คน (โดยไมมประวตครอบครว) risk ของลกคนตอไป ขนกบวาคนทเปน

เปน new mutation หรอพอ/แมเปน germline mosaic แตไมวาจะเกดจากสาเหตอะไร ลกทเปนโรคจะม risk ในการถายทอดใหลกรนถดไปเหมอนกน! (เพราะ gene ผดปกตอยในตวเขาทงตว)

- การทมคนเปนโรคคนเดยวในครอบครว อาจเปนเพราะ ม variable expressivity (พอแมอาจมความผดปกต แตไมแสดงออก) ● gene

● non-paternity ● ถาปยาตายายตายไปหมด (เราไมเคยตรวจ) อาจเปนไปไดวาพอ/แมเปน non-penetrant case

- risk ของการเปน carrier ใน AR ไมคอยสาคญเทาไหร ยกเวน consanguinity คด!

1. พนองทไมเปนโรคของคนทเปนโรค AR มโอกาสเปน carrier = 2/3 2. พนองของคนทเปน carrier มโอกาสเปน carrier = ½ 3. ลกของคนทเปน carrier มโอกาสเปน carrier = ½

 TOP  SI 117 

4. พนองของคนทมโอกาสเปน carrier = ½ จะมโอกาสเปน carrier = ½×½ = ¼ พอแมทเปน carrier แนนอน ถาหยากนแลวไปแตงงานใหม โอกาสทลกจะเปนโรคตามาก! ยกเวน gene นนเปน

common gene (ex. thalassemia) 5.

6. คนเปนโรค AR แตงงานกบคนทไมใชญาต โอกาสทลกจะเปนโรคตา! (เพราะโอกาสทจะไปเจอ carrier ตา) 7. พอเปนโรค XR ไมมทางทลกชายจะเปนโรค (เพราะพอให Y), โอกาสทลกสาวจะเปน carrier = 1

แมเปน carrier ของ XR โอกาสทลกสาวจะเปน carrier = ½ 8. 9. ลกเปนโรค XR คนเดยว โอกาสทลกคนถดไปจะเปนโรค = ?

(ขนกบวาทเปนคนเดยวนน เปนจาก new mutation/แมเปน germline mosaic/แมเปน carrier โดยทไมร การทแมเปน carrier กอาจมาจากแมม new mutation/ยายเปน germline mosaic/ยายเปน carrier)

- Consanguineous marriage แมจะไมมประวตครอบครว ลกของคนทเปนญาตกนกมความเสยงตอ birth defects, genetic disorders, อายสน สงกวาในประชากร (risk เพมขนจาก background risk) โดย

แตงงานระหวาง 1st degree relatives risk เพมขน 30% ● แตงงานระหวาง 1st cousins risk เพมขน 3% ● แตงงานระหวาง 1st cousins once removed and 2nd cousins risk เพมขน 1% ●

** ปกตความเสยงในประชากร = background risk (population risk) = 3-4% - คนทเปนญาตกนมโอกาสไดรบ abnormal gene ทมาจาก ancestor รวมกน ถา abnormal gene นถายทอดไปให

ลก แลวไปอยในลกคนเดยวกน เปนภาวะ homozygote ลกเปนโรค! สสม พนองกน = sibling - สเหลอง ลกพลกนองกน = 1st cousins สเขยว ญาตกน = 2nd cousins สเหลอง & สเขยว = 1st cousins once removed (คนหนงเปน 1st cousin อกคนเปน 2nd cousin)

-

- อาศยวธคานวณของ AR ตอการเปน carrier - Background risk vs Personal risk

● Background risk (Population risk) risk ทไดจาก population ● Personal risk risk ทไดจาก family history / การตรวจอนๆ

- Recurrence risk for Down syndrome เปน empirical risk - trisomy 21 แมยงมอายมากขน ยงมความเสยงทลกจะเปน Down syndrome สงขน! (อาจเปนเพราะ egg

ของแมอยใน meiosis I มานานมาก โอกาสเกด nondysjunction จงมาก (มาเกดใน meiosis II)) ** nondysjunction ในการเกด trisomy เกดจาก oogenesis เปนสวนใหญ & มกเกดใน meiosis II (แตกเกดใน meiosis I หรอเกดในพอกได) อบตการณของ Down syndrome สงขนอยางรวดเรว หลงจากแมอาย 35 ป !! (แมทอาย > 35 ปจงใหทา

prenatal diag. เพราะ risk จาก procedre กบ risk ตอการมลกเปน Down syndrome คนกน คอถาทาเมอแมอายนอยกวาน risk จาก procedure อาจไมคนกบ risk ตอการมลกเปน Down syndrome)

-

- recurrence risk ของ trisomy 21 (relate กบอายแม) ≈ 1% (เปน empirical risk เอาไปบวกเพมกบ

background risk) - trisomy 21 เกดจากพอแมทม chr. ปกตทงค ! มนอยกรณมากทพอ/แมเปน mosaic (ซงถาพอ/แมเปน mosaic

risk ตอการมลกเปน trisomy 21 คนตอไปกจะสงขน!) คนทเปน mosaic Down syndrome จะมลกษณะของ Down syndrome นอยกวาคนทเปน trisomy 21 ทงตว -

- translocation Down syndrome คนทเปน มความเปนไปไดคอ 1. เปนคนเดยวในครอบครว (new mutation) = de novo translocation Down syndrome

พอ/แมเปน balanced translocation carrier กได กรณน risk ตอการมลกคนตอไปเปน Down syndrome จะสงขนกวาใน population ขนกบวาพอ/แมเปน carrier

2.

ถาแมเปน carrier จะม risk สงกวา!!** **** ยา! กรณทตรวจ chr. แลวพบวาคนไขเปน translocation Down syndrome ตองตรวจ chr. พอ & แมเสมอ ถาพอ/แมเปน carrier จะทาให risk ตอการมลกคนตอไปเปน Down syndrome สงขน จงม indication ในการทา prenatal diag. (แตถาคนไขเปน trisomy 21 จะไมตรวจ chr. พอ & แม) chr. พอ & แม)

 TOP  SI 117 

- recurrence risk ของ translocation Down syndrome ● เปน de novo (ไมมพอ/แมเปน carrier) 0.5-1% (ทยงสงกวา population เลกนอยอย เพราะไมรวาอะไร

เปนเหตททาใหเกด translocation: พอ/แมอาจม genetic makeup บางอยางททาใหมแนวโนมตอการเกด

translocation) ● พอเปน carrier 2.5% ● แมเปน carrier 10-15% ** ● พอ/แมเปน 21q21q carrier 100% (เพราะลกไมแทงจาก monosomy 21 กเปน Down syndrome)

- Recurrence risks for common multifactorial disorders ศกษางายในโรคทเปน congenital (ไดตวเลขด), แตโรคท late onset (ex. DM, HT) จะศกษายาก เพราะไมรวาจะทาเมออายเทาไหร มปจจยทรบกวน

มาก (ตวเลขกจะไมคอยด); ด recurrence risk ของลกในพอแมทปกตเทยบกบพอ/แมทเปนโรค ** ex. Congenital heart disease

● ถาพอแมปกต ม recurrence risk ในลกคนท 2 = 1-4% ● ถาพอเปนโรค ลกม risk = 2% ● ถาแมเปนโรค ลกม risk = 6% **

- หลกการ: risk จะสงขนถามญาตทเปนโรคนน > 1 คนในครอบครว (เพราะม genetic load ทจะทาใหเกดความผดปกตนนอยในครอบครวมาก) ** การเกด complex disorder อาจเปรยบเทยบไดกบนาในแกว (threshold model) ● (นา = genetic load) ถามนาไมเกนปากแกว นากไมลนออกมา ความผดปกตนนกไมแสดงออก แตถาพอ &

แมตางคนตางเทนาลงไปมากเทาไหร โอกาสจะลนแกวกมากเทานน! (= เกด congenital anomalies) ● ถายงใสกอนหนลงไป (กอนหน = environmental factor) กยงทาใหนาลนแกวไดงายขน!!

- recurrence risk จะเพมขนในกรณตอไปน 1. คนทเปนโรคในครอบครวเปนชนดรนแรง genetic load เยอะ !! recurrence risk 2. ถาความผดปกตนนมความแตกตางในอบตการณระหวางเพศ ถาคนทเปนโรคในครอบครวเปนเพศทมอบตการณ

ตากวา (ex. pyloric stenosis พบใน ช. มากกวา แตม ญ. เปนในครอบครว) genetic load เยอะ !! recurrence risk

3. แตงงานระหวางญาต (consanguineous marriage) (พอแมมโอกาสม abnormal gene เหมอนๆ กน) - Genetic counseling เปนการให information & support; information ใหไปเพอใหเขาตดสนใจให

เหมาะสมกบความตองการ คานยม สถานภาพ ศาสนา ความเชอ วฒนธรรม ของคนผนน (จงตองให information มากพอ ครอบคลมพอ จาเปนตอการตดสนใจ และเขาใจได)

- information ทให: ● Medical aspect

1. Clinical features (ลกษณะของโรค) 2. Complications (ผลแทรกซอน) 3. Prognosis (ตอไปจะเปนยงไง) 4. Therapy (รกษาอยางไร จะหายดไหม ขอดขอเสยของการรกษาตางๆ)

● Genetic aspect 1. Biology (Genetic basis) (ทาไมถงเกดขน) 2. Risk (ความเสยงตอการเกด/เกดซา) 3. Burden (ถาเกดแลวรนแรงแคไหน “ภาระ” จากโรคน) 4. Options (มทางเลอกใดไหมทจะหลกเลยง ex. prenatal diag., จากดจานวนลก, ขอ donor ovum จาก

คนอนกรณทแมเปน carrier) ** risk & burden ตองพจารณาคกน !!

● Congenital heart disease risk , burden ** ● Anencephaly risk , burden (เพราะเดกเกดมาตายหมด) ● Color blindness [XR] risk , burden ● DMD [XR] risk , burden

● Psychological aspect เปนประเดนสาคญสาหรบ genetic counseling 1. Incorporation of information for decision making 2. Healthy adjustment

 TOP  SI 117 

** การทลกม risk/ในครอบครวม risk/ตวเองเปนโรค เปนความทกขอนใหญหลวง + ความรสกผด รสกเปน

ตราบาป เราจะตองใหขอมลกบคนเหลาน แตขอมลมความซบซอน จงตองใชทกษะในการสอสารทดมาก แลวให

เขาปรบตวปรบใจตอ risk - Reproductive options (มทางเลอกอะไรบางถารวาม risk ตอการเปน genetic disease)

● เปนโสด ● เลอกคแตงงานทไมเปน carrier กรณตวเองเปน carrier ของ AR (ยาก ex. thalassemia เพราะตกลงปลง

ใจไปแลว) ● ไมมลก หรอถาไดลกปกตมาแลว กไมมลกอกตอไป (จากดจานวนลก) ● เสยงเอา กรณท risk / risk แต burden / เปนโรคทมการรกษา (ex. thalassemia) ● artificial insemination by donor (ผสมเทยมโดยใช sperm จากผอน) กรณสามม mutant gene / เปน

balanced translocation carrier ** option การผสมเทยมน มกไปใชในกรณมบตรยาก/เปนหมน แตไมมคนใชสาหรบ genetic option ● in vitro fertilization & donor ovum กรณภรรยาม mutant gene ในภาวะ dominant / เปน carrier

ของ XR / เปน balanced translocation carrier ● preimplantation (กอนฝงตว) / prenatal (กอนคลอด) diagnosis ● รบบตรบญธรรมมาเลยง (adopt a child) ** ไมม option ใดทดทสด option เหลานมความเหมาะสมมากนอยไมเทากนสาหรบแตละคน! จงตองอธบาย

option ตางๆ แลวใหเขาเลอก option ทเหมาะสมเอง - Principles in genetic counseling (หลกการให genetic counseling)

1. Accurate diagnosis (การวนจฉยตองถกตอง!) 2. Nondirective counseling (Autonomy) (การใหคาปรกษาแนะนา ตองไมชทางเลอกแลวตดสนใจแทน

เพยงแตบอกทางเลอกใหเทานน นบถอในความเปนอสระในการปกครองตวเอง) 3. Truth in counseling (ตองบอกแตความจรงเทานน & ไมปกปด) 4. Confidentially & trust (รกษาความลบของผปวย ทาใหเกดความไววางใจ) 5. Parentally counseling (ใหคาปรกษาแนะนาทงพอ & แม / ทงสาม & ภรรยา เพราะมความรบผดชอบทตอง

ตดสนใจรวมกน) 6. Concern for the individual (มงประโยชนของ counselee เปนหลก ไมใช population เหมอนแพทย

ทวไป: มงไปทความรบผดชอบตอคนไขเปนสาคญ ความรบผดชอบตอสงคมเปนรอง) ** ex. ถาคสามภรรยาตดสนใจทจะมลก แมลกจะเสยงตอการเปนโรครนแรง & ตองรกษา ใชเงน กระทบถง

งบประมาณประเทศ กยงตองมงประโยชนใหเขาเปนสาคญ เพราะเขาตดสนใจเชนนน (geneticist จะไมบอกวาคณตดสนใจใหลกเปนโรค จะเปนภาระของประเทศ)

7. Timing of genetic counseling (ตองเลอกเวลาใหเหมาะ) ** ex. ไมเรวเกนไป ไมเลอกเวลาทเขาเพงมความทกขหลงจากรวาลกเปน Down syndrome แตเวลานนเปนเวลาทจะใหการ support ทางการแพทย ใหขอมลทจาเปนขณะนน เมอไหรทเขาพรอมจงคอยให genetic counseling (คอใหขอมลเพมเตมเพอปองกนการเกดในลกคนตอไป) ไมชาเกนไป ไมรอจนเขาตงครรภอกครงแลวคอยไปให genetic counseling

Genetic Testing and Screening - Genetic testing เปนการวเคราะห DNA/RNA/chr./protein/metabolite เพอ detect การ

เปลยนแปลงทสมพนธกบโรคทมการถายทอดทางพนธกรรม - ขณะนมการตรวจสาหรบ single-gene disorder > 1,500 โรค/ภาวะ

** บางโรคพบนอย กทาไดเฉพาะท Lab. บางแหงทมความสนใจเปนพเศษ; โรคทพบบอยและเปนปญหาสาคญ กจะม

Lab. หลายแหงทตรวจได - Clinical applications มดงน (ทสาคญคอขอ 2.-4.)

1. Diagnostic testing (ใชนอย) เหมอนโรคอนทวไป คออาศยประวต, ตรวจรางกาย, ตรวจทาง Lab., imaging

2. Predictive testing (มประโยชนมาก) ตรวจผทเปนโรคกอนมอาการสาหรบ late onset disease

โดยเฉพาะ neurodegenerative disease (ไมมทางรกษาในปจจบน)

 TOP  SI 117 

** มผลกระทบทางจตใจจากการรวาวนหนงเราจะเปนโรค จงตองประเมนคนไขใหด ทา pretest & posttest counseling เสมอ !!

สาหรบโรคทตรวจพบแตเนนๆ แลวมทางรกษา การตดสนใจรบการตรวจจะไมยาก & ผลกระทบทางจตใจนอยกวา สาหรบโรคทไมมทางรกษา กยงคงตรวจเพอจะไดเตรยมตวเตรยมใจสาหรบอนาคต เรองการแตงงาน, การมลก (ตองคดใหด เพราะอาจจะถายทอดไปใหกบลก !!), อาชพ (ex. ถาเรารวาวนหนงจะเปน Alzheimer disease กจะไมไปเปนนกธรกจการเงน, ถาเรารวาจะเปน retinal degeneration กจะไมไปเปนนกบน)

● Presymptomatic ● Predispositional

3. Carrier (Heterozygote) testing ตรวจ ญ. ทเปน carrier ของ XR 4. Prenatal/Preimplantation testing (สาคญทสด!!)

- Methods 1. Direct mutation analysis ตรวจหา mutant gene โดยตรง! (ผล: positive/negative); ขอด:

ตรงไปตรงมา, ตรวจคนเดยวได! 2. Linkage analysis (Indirect DNA analysis) ตรวจหา DNA marker ท link กบ gene ทเราสนใจ,

ตองทาการตรวจสมาชกหลายคนในครอบครว! ตองม key person ทมขอมล = informative; ขอด: ใชกบ

gene ทยงไมสามารถ identify gene ได/ยงไมสามารถตรวจหา mutation ไดทงหมด (คอยงไมรวา gene นนเปนยงไง mutation ยงไง แตรวา link กบอะไร), ใชกบ gene ท mutation เปนรอย/พนชนด จะไดไมตอง

ไป detect mutation ทละชนดวามหรอไม (สนเปลอง!!) ใชวธตรวจ linkage ดกวา! 3. Cytogenetic analysis ตรวจ chr. 4. Biochemical analysis ตรวจทาง biochemistry

- Linkage analysis (Indirect DNA analysis) ยงใช intragenic marker ยงด (เพราะไมม recombination ทานายไมผดพลาดแนนอน), ตรวจเพอตดตามครอบครววามการถายทอด mutant gene ไปกบ

marker นนๆ หรอไม - Requirements

1. Closely linked DNA markers (polymorphisms) marker ตองอยใกลกบ gene มากพอถงจะเอามาใชได อยางนอยตองหางจาก gene ≤ 2 cM (% ของการเกด crossing over ≤ 2%, โอกาสทานายผดพลาด ≤ 2%), ยงเปน tight linkage หรอเปน intragenic marker ยงด! ** แตจรงๆ แลวถงแมจะเปน intragenic marker กม intragenic crossing over ได ถา gene นนม

ขนาดใหญ ex. DMD 2. Informative family crucial family member (คนทเปนโรค) ตองม marker เปน heterozygote

เพอจะไดบอกไดวา marker ใดมาจากพอ, marker ใดมาจากแม (พอ & แมกจะตองม marker ทตางกนพอดวยจงจะบอกได)

3. Known linkage phase ตองรวา disease gene อยใน coupling phase กบ marker ใด (ตองอยบน

chr. เดยวกน) - Linkage analysis for AD disorder

จากคนทเปนโรคบอกไดวา disease gene อยบน chr. เดยวกบ allele “A” ทานายลกทเกดขน ● AC (แมให A, พอให C) เปนโรค !! ● BC (แมให B, พอให C) ไมเปนโรค !! การทานายนมโอกาสผดพลาด = ระยะหางระหวาง marker นนกบ gene

 TOP  SI 117 

- Linkage analysis for AR disorder ลกทเปนโรคม marker BC (พอให B, แมให C) แสดงวาพอ

& แมม disease gene อยบน chr. เดยวกนกบ marker B & C สวน allele A ทอยบน chr. ทคกน เปน chr. ทม normal gene; ดงนน ลกทเกดใหมม BC เปนโรค !! (ถาเปน AB หรอ AC carrier; ถาเปน AA normal

homozygote) - Linkage analysis for XR disorder

ลกชายทเปนโรค ม 1 allele (เพราะม 1 X chr.) คอ C บอกไดเลยวา marker C ตองอยบน chr. เดยวกบ mutant gene crucial family member ในทน คอ

ลกชายทเปนโรค “C” 1. แม ตองเปน heterozygote “BC” ทาใหเราแนใจวาลกชายทม marker B จะม normal gene สวนลกชายทม marker C จะม mutant gene

2.

ดงนน ถาจะตรวจลกสาววาเปน carrier หรอไม หรอถาแมตงครรภ แลวทา prenatal diag. กจะสามารถทานายได !! (ถาไดลกสาว AC carrier; ลกสาว AB ไมเปน carrier; ลกชาย

C เปนโรค; ลกชาย B ไมเปนโรค) ** การบอกผลการทานาย จรงๆ ตองใชคาวา “นาจะ” (probably) เพราะการทา linkage analysis ไมใช diagnostic test เหมอน direct mutation analysis

- Carrier (Heterozygote) testing (detection) detect หาคน carrier ทมกจะ asymptomatic ทม mutation ของโรค AR, XR ** ใชคาวา “มกจะ” (usually) เพราะม carrier ของ XR บางคนเปน manifesting carrier สวน carrier ของ AR เปน asymptomatic แนนอน ! ** คนทเปน manifesting carrier ของ XR ไมตองทา carrier testing กพอบอกได ex. ญ. ทมความเสยงตอการเปน DMD เปน ญ. คนนนมนองโต (calf pseudohypertrophy) หรอเจาะเลอดพบ CK

- Methods ● Hemophilia A factor VIII assay, linkage analysis, mutation analysis ● DMD/BMD serum CK, linkage analysis ** hemophilia A & DMD ถอวาเปนหวใจสาคญของ carrier detection ในการใหบรการทางการแพทย ● G6PD deficiency enzyme assay (แตกไมคอยมคนทา เพราะไมใชเรองใหญโต ตรวจเพยงแตวาใครเปนก

พอ ไมจาเปนตองตรวจ carrier) ● Anhidrotic ectodermal dysplasia dental defects (มฟนบางซขาดหายไป), ทา iodine starch

test พบวาบาง segment ของ skin ไมม sweat gland, mutation analysis - Lyon hypothesis การเกด random X inactivation ในระยะ early embryo เพศหญง เซลลลกหลานท

แบงตวตอไปหลงเกด X inactivation กจะม X อนเดยวกนท inactive (เหมอนกบเซลลตงตน) ถา Xm ม mutant gene, Xp ปกต; เมอเกด X inactivation แลวทาใหสดสวน Xm active มากกวา Xp มโอกาสแสดงลกษณะของ disease ออกมา (ถา 100% ของเซลลในรางกายไป inactivate Xp หมด ญ. คนนนกจะแสดงโรคออกมาเหมอน ช. เปนโรค ถาเซลลสวนใหญในรางกายม Xp active ปกต!)

-

** Lyon hypothesis (X inactivation) ไมรบกวนการทา DNA testing (จงเปนประโยชนมากสาหรบการทา carrier detection)

- ญ. ทเปน carrier จะม variation ตงแต asymptomatic, ตรวจพบความผดปกตเลกนอย มาก

- ด pedigree ของครอบครวทม DMD พบวา 2/3 ของ obligated carrier ม serum CK (อก 1/3 ปกต; แสดงใหเหนวา ญ. ทเสยงตอการเปน carrier แมตรวจไมพบความผดปกต กบอกไมไดวาไมเปน)

 TOP  SI 117 

- Carrier risks in XR disorder ex. Hemophilia A (familial) - ญ. ทเปนลกของแมทเปน obligated carrier ม

carrier risk = ½ - Carrier testing in XR disorder เราตรวจหา linkage ของ hemophilia A โดยตรวจหา marker ท

link กบ factor VIII; marker ทใชมหลายตาแหนงดงน ● Extragenic closely linked ทาง 5’ end ● Intragenic CA repeat (microsatellite) ท intron 13, 22 RFLP (เปนตาแหนงทบางคน enz. BclI ตดได บางคนตดไมได) ท intron 18 set ของ allele ทอยใกลกนบน chr. เดยวกน และมกถายทอดไปดวยกนทง set = Haplotype (การทา

haplotype analysis จงเปนประโยชนในการตรวจหา carrier) - Carrier testing in XR disorder by linkage analysis

ลกชายม haplotype สดาแลวเปนโรค ถาตรวจลกสาว พบวาม haplotype เดยวกบพชายทเปนโรค ลกสาวเปน carrier ถาตรวจลกสาว พบวาได opposite haplotype (haplotype ขาว) มา ไมเปน carrier

- Potentially pitfalls with linked DNA markers (ขอดอยของ linkage study) มโอกาสเกด recombination 1. ตองได sample จานวนมากพอ (ถาไปเจอครอบครวทไมรวมมอ/crucial family member ตายไปแลว/ตดตอไมได กจะลาบาก) จะตองมคนไขทยงมชวตอย (หรอม DNA ทเราเกบไวไดอย)

2.

3. บางทคนทเปน crucial family member ม marker เปน homozygote ไมม informativeness การตรวจ linkage เราตองรวาโรคนนเกดจาก gene locus ไหน *ระวงโรคทม locus heterogeneity (เกดจาก gene ไดหลาย locus ex. hemophilia A & B) เราเขาใจผด ไปตรวจ marker ของอก locus หนง (factor VIII) ผลออกมาวาไมเปน แตจรงๆ risk ของเขาอยอก locus หนง (factor IX)

4.

- XR (hemophilia A): กรณ sporadic case จะเปนปญหา! คนทเปน sporadic case สาเหตมหลายอยาง (new mutation, แมเปน carrier, แมเปน germline mosaic, แมเปน new mutation, แมไดรบถายทอดมาจากยาย)

การทา carrier testing ใน sporadic case ทาไดเพยง exclude carriership เทานน!!

-

พสาว/นองสาวคนใดทได opposite haplotype มา จะบอกไดเลยวาเขาไมเปน

carrier = “carriership excluded” !!

●

● พสาว/นองสาวคนใดทได haplotype เหมอนคนไข จะบอกไมไดวาเปน carrier หรอเปลา!!

 TOP  SI 117 

** คาอธบาย ถาไมม haplotype เหมอนคนเปนโรค กแสดงวาไมได chr. ททาใหเกดโรคมา (เพราะ haplotype เปน set ของ allele ท link กนอยบน chr. เดยวกน) เราจง exclude ได !! แตถาได haplotype เหมอนคนทเปนโรค อาจเปน haplotype ทม linkage กบ gene อนๆ ทปกตทวไปก

ได ไมจาเปนทจะตองม disease gene link มาดวย (ไมจาเปนตองเปน affected haplotype) เพราะ sample ของคนเปนโรคมนอย ไมเหมอนกรณ familial ทมเอาคนเปนโรคทงครอบครวมาดแลววาคนเปนโรคม haplotype ไหนเหมอนกน จงใช haplotype นนบอกไดเลยวาถาเจอกแสดงวาเปนโรค/carrier

- mutation ชนดหนงทพบบอยใน severe hemophilia คอ inversion ใน intron 22 (ม gene เลกๆ อย) detect ในครอบครวโดยทา Souththern blot analysis (restriction analysis) digest ดวย BclI แลว

hybridize กบ F8A probe คนท normal ได 3 band ขนาด 21.5, 16, 14 kb; คนเปน hemophilia A ทเกดจาก inversion type I หรอ type II กจะม band ตางจากปกต, คนทเปน carrier ของ inversion type I หรอ type II กจะม combination ของ chr. ททาใหเปน hemophilia กบ chr. ท factor VIII ปกต

- Carrier testing in XR disorder by linkage analysis & mutation analysis จาก linkage analysis ท exclude carriership ได แลวคนทสงสยวาเปน carrier ละ? (คนทม haplotype เหมอนคนทเปนโรคทเปน

sporadic case; เพราะทาใหเกด risk ในพนอง/ญาต) เอาไปทา Direct mutation analysis (ex. ทา Southern blot) ถาพบวา band มลกษณะปกตทง 2 chr. ไมใช carrier !!

*** กรณ DMD/BMD ทเปน sporadic case เราด haplotype เพอ exclude carriership ได แต direct mutation analysis ทาไดเพยงเพอ detect deletion ของ band แต!! detect carrier ใน DMD/BMD ไมได !! เพราะการม deletion ของ gene แมทาใหบาง band ขาดหายไปบน 1 chr. แตอก chr. ทม normal gene (ม band ปกต) กจะบดบง deletion นนได ! มองไมออก !!

ดงนน จงตองใชวธตรวจหา enz. CK ● ถาไดผลปกต กยงบอกอะไรไมได ! ● ถาไดผลผดปกต (CK ) บอกไดวาเปน carrier!! (แตถา DMD/BMD ทเกดในครอบครวนนเปน familial กใชแต linkage analysis บอก carrier ไดเลย) - Diagnostic testing ปกตการ diag. genetic disease ไมใชการตรวจ DNA แตใชประวต, ตรวจรางกาย,

ประวตครอบครว, imaging, biopsy, ตรวจเลอด, etc. แตจะใชการตรวจ DNA เพอ diag. เฉพาะในกรณน 1. คนไมมอาการ อยากรวาตนเองม gene นนหรอเปลาในโรคทเปน late onset disease (ex. Huntington

disease, Machado-Joseph disease, ADPKD) 2. ทา prenatal diagnosis 3. ใชเมอมโรคทดคลายๆ กนหลายอยาง แลวไมรวาเปนโรคอะไร! (เพราะการ diag. ทถก จะนาไปส counseling &

risk assessment ทถกตอง; ex. โรค BMD [XR] vs limb-girdle MD [AR] ม proximal muscle ลบ! จะเหนวา pattern การถายทอดตางกน ทาให risk assessment ตางกนดวย!)

** เนองจากเราตรวจ gene ของ limb-girdle MD ไมได แตเราตรวจ BMD ได เอา ช. ทเปนโรคไปตรวจ! ทาการตรวจหาสวนตางๆ ของ dystrophin gene พรอมๆ กนหลายๆ สวนใน PCR ครงเดยวกน = multiplex PCR ถาพบวาม deletion ไปหลาย band (= ม deletion ของ dystrophin gene) สรป ช. คนนเปน BMD

- Presymptomatic diagnosis ปกตทาไดหลายวธ ● Clinical examination ตรวจรางกาย, หาการแสดงออกในระยะเรมตน/การแสดงออกทไมทาใหเกดอาการ ● Special investigation (ตรวจพเศษ) ex. ตรวจหา polyp โดย colonoscopy, barium enema ใน FAP ● Biochemical tests ex. ตรวจเลอดหาระดบ ceruloplasmin ดวาเปน Wilson disease หรอไมกอนท

จะมอาการ ● DNA testing - ตวอยางการทา presymptomatic diagnosis ใน genetic disorders ● FAP ทา colonoscopy, brain enema, molecular testing ● ADPKD ทา ultrasound, molecular testing ● Wilson disease หาระดบ ceruloplasmin, liver function tests, slit lamp exam. for K-F ring ● FH หา serum cholesterol, LDL-cholesterol (กอนทเขาจะเกด xanthelasma, plaque)

 TOP  SI 117 

- Predictive testing ตรวจเพอทานายกอนทเขาจะมอาการ; แบงเปน 1. Presymptomatic testing คนทม mutant gene แมจะยงไมมอาการ แตตอไปจะมอาการแนนอน

เนองจากเปน late onset disease (เกดใน adult) ex. von Hippel-Lindau (VHL) disease, Machado-Joseph disease (SCA3), Huntington disease

2. Predispositional testing คนทม mutant gene ทานายวาตอไปม risk ตอไปการเกดโรค แตจะเกดโรค

หรอไมกได คอในโรค hereditary cancer syndrome (เพราะไดรบถายทอด 1st hit = predisposition มา จะเปน cancer เมอคนนนเกด 2nd hit) ex. HNPCC (เกดจาก mutation ของ DNA mismatch repair gene), hereditary breast-ovarian cancer (mutation ของ BRCA1, BRCA2)

ตวอยาง presymptomatic testing ในครอบครวทเปน VHL disease ทา DNA testing: พบ mutation ท exon 3 ตาแหนง 8689 (C G) ซงทาใหเกด restriction site ใหม ตรวจพบโดย restriction analysis คนทม mutation จะตดได 3 fragments เอาไป run ขน 3 bands (คนปกตม 2 bands)

-

● คน 201 ม 2 bands ไมไดรบ mutation นนมา! ● คน 208 ม 3 bands (เหมอนปา) ตอไปจะเปน VHL disease !!

สวนคนอนๆ ทยงไมไดมาตรวจ risk จะยงเปน ½ (พอทา DNA testing จงเปลยนเปน 0 หรอ 1) ** DNA testing จงทาให risk assessment มความแมนยามากขน !! - Genetic screening การ screen (ตรวจกรอง) คนทไมมอาการเพอหาความผดปกตทพบบอย! ใชการตรวจท

ราคาถก sense & spec , เปนการตรวจหาใน population สาหรบคนทม genotype บางชนดทสมพนธกบการเกดโรค/ม predisposition ตอการเกดโรค/ถายทอดไปยงลกหลานได

- จดประสงค (goal) ของ genetic screening ตรวจใหพบแตเนนๆ (early recognition) เพอจะสามารถปองกนการเกดโรค/ทาใหกลบมาเปนปกต (ex. ตรวจพบวาเปน PKU แตเนนๆ ปองกนผลเสยททาใหเกด mental retardation; ตรวจพบ congenital hypothyroidism แตเนนๆ ใหการรกษา ปองกน cretinism)

1.

ใหขอมลสาหรบคนเปนโรคเพอใชในการตดสนใจในการมครอบครว (reproductive decision) 2. - Principles of genetic screening

1. Clearly defined disorder (เลอกทาเฉพาะโรคทมลกษณะโรคชดเจน ไมคลมเครอ รวาอนไหนเปนโรค อนไหน

ไมเปน) 2. Appreciable frequency (ตองมความถในประชากรมากพอ ถงจะคม!) 3. Advantage to early diagnosis (การตรวจหาแตเนนๆ เปนประโยชน) 4. False negative (Sensitivity ) (มความไวสง) 5. False positive (Specificity ) (มความจาเพาะสง) 6. Benefits outweigh the costs (คาใชจายถก เมอเทยบกบผลทไดรบ) 7. Equal access to testing (หลกจรยธรรม: ทกคนตองสามารถเขาถงการตรวจนได)

- Population screening ตวอยางททากน ไดแก 1. New born screening (screening ใน 2-3 วนแรกเกด) ตรวจหา PKU, congenital

hypothyroidism, galactosemia, sickle-cell anemia, cystic fibrosis 2. Carrier (Heterozygote) screening (ของ common genetic disorder ในประชากร) ตรวจหา

thalassemia, sickle-cell anemia (ในคนผวดา), Tay-Sachs disease (ใน Ashkenazic Jews) 3. Prenatal screening (ตรวจในระยะตงครรภ กอนเดกคลอด) ตรวจหา chromosome abnormality

(โดยเฉพาะ trisomy 21), neural tube defect - Newborn metabolic screening in Thailand ทกระทรวงสาธารณสขไดทาแลว ม 2 โรคคอ PKU &

Congenital hypothyroidism ● PKU ใช Guthrie’s bacterial inhibition test เปน screening test, ใช fluorometry, mass

spectrophotometry เปน confirmatory test

 TOP  SI 117 

● Congenital hypothyroidism ใช enzyme immunoassay เปน screening test, ใช immunoradiometric assay เปน confirmatory test

** ยงมการทา pilot study สาหรบการ screen โรค CAH (ยงไมรวาความถในประชากรไทยมากนอยแคไหน) โดยใช radioimmunoassay & โรค inborn errors of metabolism โดยใช mass spectrophotometry (ราคาแพง! กตองลองทาดวาคม ไมคม)

- Guthrie test เอาวนผสมกบ Bacillus subtilis แลวใสสารยบยงการเจรญไว, เจาะเลอดจากเดกแรกเกดใสแผนกระดาษกรองกลมๆ แลววางไปวางไปบนวน ถาเลอดเดกคนไหนม Phe จะไปลบ

ลางฤทธของสารยบยงการเจรญ ทาให B. subtilis เจรญเปน

colony ได ** ใช [ ] ของ Phe มาตรฐานเปรยบเทยบกบ sample ทเอามา

ตรวจ ถาวงกลมขนาดใหญ แสดงวา Phe ** เนองจากเปน screen ม false -ve, false +ve ได (sense & spec ไม 100%) มโอกาสพลาด!

** ถาไดผล +ve แลวกยงตองทา confirmatory test ตอ (spec ) คอทา mass spectrophotometry! ถา +ve ก diag. ไดเลย แลวใหการรกษา!!

- Carrier (Heterozygote) screening screen ในประชากรกลมตางๆ ทจาเพาะ

● β-thalassemia Greeks, Italian, Cypriots, SEA ● α-thalassemia SEA, Chinese ● Sickle-cell anemia African-Americans ● Tay-Sachs disease Ashkenazi Jews ● Cystic fibrosis Northern Europeans - Prenatal screening ด pregnancy กอนลกคลอด, ดวา ญ. คนไหนม risk ตอการมลกเปน aneuploidy

โดยเฉพาะ Down syndrome (trisomy 21), Neural tube defect ● Down syndrome (& other chromosomal abnormalities) มวธ screen หลายวธ ทนาสนใจ เชน 1. Triple test ถาเปน trisomy 21 จะม

1) AFP (ตรงขามกบ neural tube defect) 2) Unconjugated E3 (E3 = estriol) 3) Chorionic Gn ( ใน trisomy 21; ใน trisomy 18) ** สรป trisomy 21: ; trisomy 18: 2. Newer markers free β-HCG, PAPP-A (pregnancy-associated placental protein) 3. Ultrasound ในบางสถาบน เปนมาตรฐานในการตรวจ pregnancy ใน 2nd trimester (โดยเฉพาะใน

ร.พ. ทคนไขมเงนจาย) ● Neural tube defect ตรวจหา AFP (α-fetoprotein) ในเลอดแม ถา AFP confirm โดย

ultrasound & ตรวจ AFP ใน amniotic fluid ** อยาลมวา genetic testing ทงหมดจะตองให pretest counseling เสมอ! (เพราะการตรวจมคาใชจาย & ผล

ตรวจอาจผดกได ถาทา screening แลวผลตรวจผด กจะเกดความเจบปวดทางใจ) - Principles of genetic testing & screeing 1. Voluntariness (ตองเปนไปดวยความสมครใจ ไมมการบงคบ) 2. Autonomy (นบถอการตดสนใจของผมาตรวจ) 3. Right to full information (มสทธทจะรบขอมลทงหมดอยางไมปดบง & เปนความจรง) 4. Confidentiality (ตองรกษาขอมลนไวเปนความลบ)

 TOP  SI 117 

Prenatal and Preimplantation Genetic Diagnosis - Prenatal diagnosis (ทาระยะครรภออน) เปนวธการทดในระหวางทยงไมมวธรกษา ● ขอด 1. เปนโอกาสใหคสามภรรยามทางเลอก โดยใหขอมลใหวามทางทจะมลกปกตได (ทาใหไมกงวลใจ) 2. ชวยใหคสามภรรยาเตรยมตวเตรยมใจวาลกทเกดมาอาจผดปกต แลวใหการรกษาตงแตแรกเกด (ถาเขา

ตดสนใจทจะเอาเดกในครรภนนไว) 3. ทาใหบคลากรทางการแพทยสามารถวางแผนและเรมใหการรกษาเมอเดกคลอดสาหรบโรคทสามารถรกษาได

(หรออาจรกษาไดตงแตอยในครรภ) ● ขอเสย จบลงดวยการยตการตงครรภ (ถาเขาตองการปองกนการมลกเปนโรค) - Indication 1. แมสงอาย** (> 35 ปในวนทเดกคลอด) 2. ลกคนกอนม chr. abnormality แบบ de novo (ex. trisomy 21) เพราะ recurrence risk สงกวาใน

ประชากร 3. พอ/แมเปน balanced carrier ของ chr. abnormality (ex. translocation, inversion) 4. มประวตครอบครวเปนโรค ทา prenatal diag. โดย biochemical/DNA analysis 5. มประวตโรค XR ในครอบครวทยงไมสามารถ diag. โดยตรวจหา disease gene โดยตรงได ตรวจเพศของ

เดกในครรภ ถาเปน ช. จะไดตดสนใจ (ม risk) 6. มประวตในครอบครวเคยมคนเปน neural tube defect มากอน 7. ทา prenatal screening โดยตรวจ serum ของแม & ultrasound แลวพบวามความผดปกตททาใหม risk

ตอการมลกในครรภผดปกต confirm โดยใช prenatal diag. !! - Genetic counseling for prenatal diagnosis ม counseling กอนทา prenatal diag. (เพราะคนทมา

ทา prenatal diag. เปนคนทตองการมลกปกต! ถาตองยตการตงครรภจะเจบปวดมาก) risk ทลกจะเปนโรค, ความรนแรงของโรค, ตอไปจะเปนอยางไร, มการรกษามย, หตถการในการทา prenatal diag. invasive มย (ทาใหเกดอนตรายตอแม & เดกในครรภได), คาใชจาย, ผลอาจไมแนนอน, บอกไมไดชด (เจอ chr. แปลกๆ ไมรวาคอ

อะไร, เจอ mutation ชนดทไมเคยเจอมากอน ไมรวา severe หรอ mild), ผลอาจแปลยาก, อาจตองตรวจเพมเตมอนๆ

- ถาลกในครรภม risk อาจตดสนใจไมทา prenatal diag. กได - กอนจะไดผลการตรวจ จะเปนเวลาททรมาน กงวลใจมาก, บางทการตรวจกลมเหลว (culture ไมขน, ได specimen

นอยไป DNA ไมพอ) ตองตรวจซา มปญหา! นอกจากจะเจบตว เกดอนตรายแลว อายครรภกสงขนเรอยๆ ถา

พบวาเดกในครรภผดปกตตอนทเลยกาหนดการยตอายครรภแลว จะยตไมได ผดกฎหมาย! ** ดงนน เวลาให counseling ทดทสดคอ “กอนตงครรภ” แตหลายคนกมาตอนตงครรภแลว! - หลกในการให genetic counseling nondirective counseling (ให autonomy แก patient; เราพยายามจะ

ม empathy เขาไปในโลกของเขา แตมนเปนโลกคนละใบ ยงไงกตดสนใจแทนไมได เพราะคนทจะตองอยกบผลการ

ตดสนใจคอเขา ไมใชเรา; ถาให counseling ผด หรอไมไดบอกวาลกในครรภม risk ตอการเกดโรคแลวควรทา prenatal diag. อาจตองรบผดชอบทางกฎหมายดวย!)

- ถาเลอกทา prenatal diag. แลว ไมมขอบงคบ/ผกมดใดๆ ทเขาจะตองยตการตงครรภ ถาลกในครรภเปนโรค

(เพราะถอวาการทา prenatal diag. เปนการให informed choice) - Limitation of prenatal diagnosis

1. ไมมการตรวจใดทตรวจไดทกอยางวาลกในครรภผดปกตหรอไม 2. เราตรวจเฉพาะโรคทเปนปญหาในครอบครว (specific condition) & รวาเดกในครรภม risk เทานน!

(indication: แมสงอาย, ประวตครอบครวเปนโรค, screening test ใหผล +ve, risk factor อนๆ) - Methods of prenatal diagnosis

1. Noninvasive testing (ไมทาใหเจบตว, ไมเกดอนตราย) ● ตรวจ Biochemical marker (ex. AFP) ในเลอดแม

● Ultrasound ตรวจหาความผดปกตทเหนไดชดๆ !! เดกตองโตพอสมควร คออายครรภ 18 wks. เครองตองด ละเอยด คนดเกง ด congenital heart disease, แขนสนผดปกต, cleft, clubfoot, นวขาดหายไป, congenital PKD; fetal abnormality บางอยางบงบอกวาเดกอาจม chr. abnormality ex. ม nuchal translucency (เนอเยอดานหลงคอ) หนากวาปกต, ม cystic hygroma (ลกษณะของ

 TOP  SI 117 

** ultrasound ใชเพอบอก: position ของ fetus, placenta, อายครรภ (gestation), ครรภแฝด/ไมแฝด, amniotic fluid มาก/นอย, มความผดปกตของโครงสรางรางกายหรอเปลา, etc.

** คนเปน Hb Bart’s hydrops fetalis เมอทา ultrasound กจะเหนนาในชองทอง (ม ascitic fluid) diag. ไดวาเปนโรค ตดสนใจยตการตงครรภ !! (เพราะเดกทเกดมาไมรอดทงหมด); แมทตงครรภทมเดกเปน Hb Bart’s hydrops fetalis จะเสยงตอการเกด toxemia of pregnancy (HT, ตวบวม, ชก)

● Isolation of fetal cells from maternal blood (เปนวธใหม ยงอยในขนทดลอง; เพราะเรารวามเซลลลกบางชนดหลดจากเดกในครรภเขาส circulation ของแม เอามา amplify DNA)

** fetal cell ทพบปนอยใน circulation ของแมในชวง 1st trimester ไดแก lymphocyte, nucleated RBC, trophoblast (แยกออกมาโดยวธการทาง immunology)

2. Invasive testing ● Amniocentesis (เจาะดด amniotic fluid รอบตวเดก โดยใชเขมเจาะผานหนาทองแม) นยมทาเมอ

อายครรภ 16 wks.; ใชบอยทสด* สาหรบตรวจ chr. ผดปกต, ตรวจเพศ (culture chr. มาด/หา SRY gene) สาหรบ XR disorder, หา mendelian disorder ตางๆ ทสามารถทา DNA testing ได, metabolic disease, neural tube defect โดยตรวจ AFP ใน amniotic fluid

** ระวงเซลลแมปนเปอน tissue ของลก ทาโดยดดนาทงไปกอน เพอใหเซลลแมทตดอยบนเขมออกไป

กอน (เพราะถาเอาเซลลแมไปตรวจ จะทานายผด!) ● Chorionic villi sampling (CVS) (ตด chorionic villus ซงม DNA เจรญมาจากตนกาเนดเดยวกบ

เดกในครรภ) ทาไดเหมอน amniocentesis ตางกนททาเมออายครรภ 10-12 wks. (นอยกวา) ขอด: ถา diag. ไดตงแตครรภออนๆ การยตการตงครรภจะมอนตรายตอแมนอยกวา & ผลกระทบทาง

จตใจนอยกวา (เดกยงไมดน แมยงไมม bonding (ความผกพน)) ขอเสย: ผลกระทบจากการทา CVS จะสงกวา amniocentesis ** risk จาก procedure ของการทา amniocentesis ตา (0.5-1%) บวกเขาไปกบ population risk

จากการตงครรภ (1-2%) risk 1.5-3% ไมเยอะ !! แต! CVS ทาเมออายครรภออนกวา: risk จาก procedure ของการทา CVS (1%) บวกเขาไปกบ

population risk จากการตงครรภ (2-3%) risk เยอะกวา !! (ดงนน กตองอธบายใหเขาเขาใจ เพอใหเขาเลอกทางเลอกไดวาอยากทาอะไร) ** CVS ทาได 2 วธ

1) Transcervical CVS เอา cannula สอดเขาทาง vagina แลวดดเอา chrionic villus ออกมา 2) Transabdominal CVS ใชเขมเจาะผานหนาทองแลวไปดด chrionic villus ออกมา

● Cordocentesis (Fetal blood sampling, Percutaneous umbilical blood sampling) (เจาะเลอดจาก umbilical vessel) ตองใชความชานาญ; ทาเมออายครรภ 19-21 wks; ทา ultrasound แลวใชเขมเจาะไปท insertion ของ umbilical cord & placenta แลวเจาะเลอดจากบรเวณนน; ใชในการ diag. ความผดปกตของเลอด/chr., thalassemia, metabolic disorder (เอาเลอดไปทา assay)

● Preimplantation genetic diagnosis (PGD) (ทา in vitro fertilization: เอาไขออกมาเพาะเลยงใหแบงตวถงระยะ blastocyst ตดเอา blastomere มา 1 cell มาทา single-cell PCR/FISH)

● Fetoscopy (สองกลอง) ปจจบนใชนอย เพราะอนตราย & ตองใชทกษะเยอะ (เพราะปจจบนม ultrasound ทด !!); ทาเมออายครรภ 19-21 wks; ใชเมอตองการ biopsy tissue จากเดกมาตรวจ ex. liver biopsy, skin biopsy (กรณมความผดปกตของ skin ชนดรนแรงในบางโรค)

- Cytogenetic studies in prenatal diagnosis 1. Karyotyping ทาไดจาก amniocentesis (long-term culture), CVS (direct preparation /

short/long-term culture), cordocentesis (ใช lymphocyte ในเลอดเดก; short-term culture)

2. FISH ดจานวน chr. ทเราสนใจ (ex. chr.21 วาม 2 หรอ 3 chr.) เหนเปนการตดสเรองแสง แลวนบจานวนวามกท

 TOP  SI 117 

- Problems in cytogenetic studies 1. Chromosome mosaicism อาจเปน true mosaicism (เดกคนนนเปน mosaic จรง) หรอ

pseudomosaicism (เดกไมไดเปน mosaic; เจอบางเซลลเทานน; พบได แตไมรทาไม) 2. Confined placental mosaicism ม mosaicism เฉพาะท placenta (แต fetus ไมไดเปน) 3. Unexpected other unusual chromosome findings พบ chr. แบบทไมคาดหวง (ex. ตรวจ

Down syndrome แตไปเจอ Turner, เจอ chr. แปลกๆ ทไมรวาอะไร, เจอ marker chr.) 4. Culture failure culture ไมขน ตองทาซา! - Prenatal prevention & management of genetic diseases เราสามารถ prevention &

prenatal treatment ไดบางโรค ex. ● ambiguous genitalis จาก CAH (รกษาโดยให glucocorticoid treatment ในแม) ● bladder obstruction (รกษาโดย surgical intervention in utero) ● SCID (รกษาโดยทา bone marrow transplantation ตงแตอยในครรภ)

Treatment of Genetic Diseases and Gene-based Therapy - Alexander Graham Bell กลาววา “So little done. So much to do.” (ทาไปนดเดยว มอกเยอะทตองทา)

วธการทเปนไปตามแบบฉบบในการรกษาทางการแพทยทวไป (conventional means) จาเปนตอง identify gene product ใหได & เขาใจ pathophysiology ของการเกดโรคนนกอน จงจะใหการรกษาได

- Preventive measures in some genetic diseases ● G6PD deficiency หลกเลยงยาทเปน oxidizing agent ● Malignant hyperthermia หลกเลยงยาสลบ (anesthetics) ● FH saturated fat, รกษาดวยยา ● FAP colectomy ● Marfan syndrome (ขาด fibrillin-1) β-blocker (ลดการเกด aortic aneurysm) & ARB - Treatment of genetic diseases แบงเปนระดบตางๆ: gene, mRNA, protein, metabolic,

phenotype, family - Mutant gene 1. Stell cell transplantation ใช stem cell ซงสามารถ differentiate ไปเปนเนอเยอได (ไปซอมแซม) 2. Gene therapy (ตรงทสด) ทดแทน abnormal gene ดวย normal gene (ใช vector) 3. Pharmacological modulation of gene expression ใชยาไปดดแปลง gene expression - Mutant mRNA 1. RNA interference ทาให RNA ทผดปกตทาหนาทไมได (ใช siRNA) - Mutant protein (ใชมากอนทจะรกษาท gene & ท mRNA ได) ในกลม inborn error of metabolism

(metabolic genetic syndrome) 1. Protein replacement ทดแทน protein ทขาดไป (enz., clotting factor, etc.) 2. Enhancement of residual function กระตน enz. ทมอยใหทาหนาทมากขนโดยให cofactor,

vitamin ตางๆ

- Metabolic or other biochemical dysfunction 1. Dietary restriction จากด substrate (ของ enz. ทขาด) ทไดจากอาหาร (ex. จากด Phe ใน PKU) 2. Pharmacologic ใชยาทาใหมการเปลยนแปลงในทาง metabolic biochemistry ไปในทศทางทเรา

ตองการ (replacement, diversion, inhibition, depletion) ex. ใหยาขบ Cu2+ ออกในคนเปน Wilson disease

- Clinical phenotype เหมอนการรกษาโรคทวๆ ไป 1. Medical intervention (รกษาโดยการใหยา) 2. Surgical intervention (ผาตดรกษา) ** การรกษาท phenotype ยอมไดผลไมดเทาการรกษาทจดเรมตนของมน (ยงรกษาทระดบ gene ได ผลกนาจะ

ยงด ทงปองกน & ลดอาการของโรค, ภาวะแทรกซอนตางๆ)

 TOP  SI 117 

- Approaches to treatment of genetic diseases ● Specially restricted diet (จากดอาหาร) PKU (จากด Phe) Galactosemia (จากด galactose) ● Replacement of missing gene product (ทดแทน gene product ทขาด) Hemophilia (ให factor VIII) CAH (ให steroid hormone ทดแทน) ● Induction/Augmentation of enzyme Homocystinuria (ให vit. B6 เพอให induce ให enz. ทาหนาทมากขน) Methylmalonic aciduria (ให vit. B12) ● Elimination from the body Wilson disease (กาจด Cu) Hereditary hemochromatosis (กาจด Fe โดยเจาะเลอดออก (phlebotomy) เปนระยะๆ แลวใหเลอด) ● Other forms of medical/surgical treatment Hypercholesterolemia (ใหยาลด cholesterol) DM (ให hypoglycemic drug, insulin) HT (ให antihypertensive drug) PKD (ม complication คอ HT, UTI, renal impairment กรกษาไปตามนน) Congenital malformation (ผาตดรกษา) FAP (colectomy) Hereditary spherocytosis (คนไขม hemolytic anemia ตดมามออก เพอไมใหไปทาลาย RBC ท

เปน spherocyte) ● Replacement of defective tissue PKD (ทา renal transplantation) Thalassemia (ทา stem cell transplantation) SCID (ทา stem cell transplantation) ** stem cell transplantation เมอกอนเรยก bone marrow transplantation เดยวนรแลววาเซลลทใช

คอ stem cell ซงอาจเอามา bone marrow หรอมาจาก tissue อนหรอ cord blood กได - Gene products biosynthesized by recombinant DNA technology ความกาวหนาของ

recombinant DNA technology ทาใหสามารถสราง gene product มาใชรกษา genetic disorder หลายโรค (แทนทจะตองไปสกดสารเหลานมาจากตวคนซงอาจจะ contaminate virus ททาใหเกด CJD) ไดแก insulin, GH, factor VIII & IX, EPO, β-IFN, α1-AT (ในคนทเปน α1-AT deficiency แลวเกด panlobular emphysema), α-galactosidase A

- Gene therapy บาบดโดยการให gene/genetic material เขาไปในรางกายเพอทาหนาทแทน ** definition ของ gene therapy ในปจจบน ไดรบการขยายใหกวางออกไป (โดย UK gene therapy

advisory committee): “gene therapy = การนา genetic material ใสเขาไปใน somatic cell ของมนษยอยางจงใจ เพอประโยชนในการรกษา, ปองกน, หรอวนจฉย”

- gene therapy ทาไดหลายวธ ● In vitro (Ex vivo) (ทานอกรางกาย) vs. In vivo (ทาในรางกาย) ● Germline gene therapy (เอา genetic material ใสเขาไปในเซลลของ embryo เซลลนนจะกลายไปเปน

ทง germline cell & somatic cell ทม genetic material นนอย) vs. Somatic cell gene therapy (เอา genetic material ใสเขาไปใน somatic cell) - กอนทจะทา gene therapy 1. ตอง characterize gene ททาหนาทไมไดนนกอน 2. รวา gene นน express ใน tissue/organ/target cell ใด (ทเราจะใส gene เขาไป) 3. เลอกวาจะใช vector system ใดเพอจะนา gene เขาไปในเซลลของผปวย

 TOP  SI 117 

- Methods of gene transfer 1. Viral vectors ใช retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, lentivirus ● virus ตองสามารถ integrate เขา genome & แบงตวได ● ตองกาจดความรายแรงของ virus กอน! (จะไดไมเกด infection) ● เซลลท virus ไป infect กตองมชวตอยนานพอทจะทาหนาทได ● gene product ทเกดขนกตองไมกระตน immune มาตานทาน ● virus ทใสเขาไปตองไมทาใหเกด viral insertional mutagenesis 2. Non-viral methods ไดแก 2.1 Naked DNA 2.2 Liposome-mediated DNA transfer ใส DNA ทตองการโดยใช liposome (เปน bilayer lipid)

เพอใหผาน membrane เขาไปในเซลลได 2.3 Receptor-mediated endocytosis - Somatic cell amendable to gene therapy somatic cell ทสามารถใช gene therapy ได ไดแก 1. Bone marrow stem cell 2. Skin fibroblast 3. Muscle cell (มการทดลองใชใน DMD โดยใส gene เขาไปใน myoblast แลวฉดเขา muscle ปรากฏวา

muscle ทางานได แตจะหวงผลการรกษาไมได! เพราะ muscle พการทงรางกาย!!) 4. Vascular endothelial cell นาจะด! เพราะฉดเขา iv. แลวสามารถไปอยท endothelium ไดทงรางกาย 5. Hepatocyte (รกษา FH โดยใส LDL-receptor gene ทปกตใน hepatocyte แลวปลกถายใหคนไข) 6. Lymphocyte - Ex vivo gene therapy เอาเซลลออกจากตวผปวย (ex. เจาะเลอดเอา lymphocyte ออกมา, เอา

hepatocyte จาก liver biopsy มา; ถาเซลลไมพอ กเอามา culture เสยกอน ex. culture fibroblast) แลว

transfer gene เขาไป แลว select เอาเฉพาะเซลลทไดรบ gene ไปใสในตวผปวย ● ex. รกษา hemophilia B ใช factor IX gene transfer เขาไปใน fibroblast แลวเอา fibroblast ทม

gene ท transfer นฉดเขาไปใน stomach cavity ** factor VIII มความเปนไปไดนอยกวา เพราะ gene มขนาดใหญ! (มปญหา มขอจากดในทางเทคนค) รกษา FH (คนทเปน homozygote จะมระดบ cholesterol ในเลอด จะเสยชวตตงแตเดก เพราะม

การเปลยนแปลงของ bl.vv.) ทา liver biopsy เอา hepatocyte มา culture แลว transfer LDL-receptor gene เอาไปฉดเขา portal v.

- In vivo gene therapy เอา gene ทเรา clone ไดมา transfer เขา organ นนเลย! (ex. ฉดเขาไปใน

brain, cardiac m.) ● ex. รกษา cystic fibrosis นา CFTR gene transfer เขาไปใน liposome/adenovirus แลวเอาไปพน

จมก!! (ทาเปน nasal spray) พบวาม gene expression ในปอดของผปวยได ** ถอวา gene therapy ยงหางไกลจากความเปนจรงทจะเอามาใชรกษาโรคได! - Germline gene therapy หามทา! เพราะผดจรยธรรม; เปนการใส gene เขาไปใน zygote (1 cell ระยะ

pronuclear stage) แลวเอากลบเขาไปท oviduct/uterus ไดลกททงตว (ทง germline & somatic cell) ม gene ใหมใสเขาไป! ถายทอดไปชวลกชวหลาน!!

- ในป 1990: ประสบความสาเรจในการรกษา [AR] SCID (ADA deficiency) ดวย gene therapy (เอา lymphocyte มา transfer ADA gene เขาไป) แลวเดกคนนนมการตอบสนองดมาก!

** แตเดกคนนยงไดรบ replacement therapy โดยให enz. ADA ท combined กบ PEG รวมดวย จงยงไม

แนใจวาการทเดกคนนอาการดขน (ม infection นอยลง) เกดจาก gene therapy อยางเดยวหรอเปลา - ในป 2000: ประสบความสาเรจในการรกษา [XR] SCID (lack of γc cytokine receptors (IL2RG)) ดวย

gene therapy (เอา lymphocyte มา transfer γc cytokine receptor gene เขาไปโดยใช retrovirus เปน

vector) แต! เกดปญหาขน: คนไข 3 คนจาก 11 คนทมารกษาแบบน เกด leukemia เนองจาก retrovirus ทเอามาใชเปน

vector นนทาใหเกด mutation ใน LMO-2 oncogene บน chr.11 - Jesse Gelsinger เปน participant ในการทา OTC gene therapy (เนองจากเขาบกพรอง enz. ornithine

transcabamylase ใน urea cycle; มทงชนดรนแรง & ไมรนแรง, Jesse เปนชนดไมรนแรง) กลาววา

 TOP  SI 117 

“What’s the worst that can happen to me? I die, and it’s for the babies” (อยางเลวรายทสดทจะเกดกบฉนกคอฉนตาย แตทงหมดกทาเพอคนไขเดกทเปนชนดรนแรง) แลวเขากตาย! ในป 1999 ทาให committee ตางๆ หยดอนมตการทา gene therapy ไปพกใหญ!! ** ดงนนกอนทจะนาการรกษาตางๆ มาใชกบคนไขได จะตองผานการทดสอบจนแนใจกอน !!

- RNA modification (Gene blocking) therapy ถา mRNA ทสรางมาทาหนาทผดปกต (gain of function mutation, cancer gene) สงททาไดคอ

1. suppress (block) ไมให mRNA นนทางาน

2. correct (แก) การทาหนาททผดปกตของ mRNA นน

- วธการ modify การทาหนาทของ mRNA ม 3 วธ ไดแก 1. Antisense therapy สราง oligonucleotide ทเปน antisense strand ไป block mRNA โดยจบกบ

mRNA ทเปน sense strand ** antisense oligonucleotide จะถก design & สรางขนตามความตองการใหม base sequence ท

complementary กบ mRNA ทตองการจะ block หนาท ! 2. Ribozyme therapy ใช ribozyme (RNA ทเปน enz. ดวย) ไปสลาย mRNA ทเราตองการจะ block

หนาท; ribozyme ท design ขนมาทประกอบดวย ● Flanking region (2 ขาง) เปน antisense RNA ทม sequence complementary กบ RNA ทเรา

ตองการยบยง, ทาหนาทไปจบ mRNA ตรงตาแหนงทตองการ! ● Nucleolytic motif (Catalytic component) ทาหนาททาลาย mRNA นนซะ! 3. RNA interference pathway ใช small interfering RNA (siRNA) ไปขดขวางการทางานของ

mRNA; หลกการคอ 1) สราง dsRNA หรอ sHRNA (short hairpin RNA) ขนมา 2) enz. dizer (มอยแลวตามธรรมชาต) มาตดยอย (สบใหเลกเปนชนเลกๆ) dsRNA ใหเปน siRNA หลาย

อน (ขนาด 21-24 nucleotides) 3) siRNA ไปจบกบ RISC (RNA-inducing silencing complex) 4) active RISC (ทม siRNA มาจบ) จะมาจบกบ target mRNA ทาใหคลายตวออก แลว siRNA จะไป

ตด mRNA ทเปน target ได!! ** RNA interference pathway มอยแลวตามธรรมชาต การคนพบการทางานของ siRNA นไดนาไป

ทดลองรกษา cancer & HIV infection - Stem cell therapy stem cell มความสามารถ self-renewal (สรางทดแทนตวเอง) & differentiate

ไปเปน specialized cell ชนดตางๆ ได ** การโฆษณาการรกษาดวย stem cell ถอวาผดกฎหมายและจรยธรรม (ยงไมมรายงานวาใชไดผล!) ยกเวน

การใช stem cell เพอ transplantation ในโรค thalassemia, immunodeficiency - แบงประเภทตามแหลงทมาของ stem cell ไดเปน

1. Somatic stem cell therapy ใช somatic cell ทวไปทเปน stem cell (เอามาจาก tissue) differentiate ไปเปนเซลลทเหมอน tissue of origin ** พบ stem cell ไดในหลาย tissue (แมแต liver, brain กม) แตทพบมากทสดกคอใน “เลอด”

2. Embyonic stem cell (ESC) therapy ใช inner cell mass (เปน pluripotent ESC) ในระยะ blastocyst มาเปน stem cell differentiate ไปไดทงสวนทเปน endoderm, mesoderm (hematopoietic cell หลายชนด, muscle cell), & ectoderm (neural cell)

** จะเหนขอแตกตาง คอ ESC สามารถ differentiate ไปเปนเซลลไดหลายชนด แต somatic stem cell จะ differentiate ไปเปนเซลลเหมอนตนตอทเอามาเทานน !!

** ESC therapy เอามาใช 2 อยาง 1) Transplantation (เปนความหวงอย) เอา ECS มา culture แลวใสสารบางอยางททาให

differentiation (in vitro) ไปเปน specialized cell ทตองการ แลว transplant (in vivo) ไปทดแทน disease cells/tissues ** ex. คนใบหขาด กเอา ECS มาใสสารให differentiate ไปเปนใบห / etc.

2) Gene therapy เอา somatic cell จากคนไขมาใส normal gene เขาไปทดแทน gene ทผดปกต แลวเอา somatic cell นนมา fuse กบ enucleated egg (egg ทไดจาก donor ทเอา nucleus ออก) =

 TOP  SI 117 

ขอด: เปน autologous (ไมมเซลลแปลกปลอม, ไมม virus) ไมเกด rejection ! - โรคทจะไดรบการพจารณาใหทา gene therapy ตองเปนโรคทรนแรงมาก, ไมมวธการรกษาใหหาย, ทาใหคนไขม

อายสน ex. SCID (ทง AR & XR), hemophilia B, FH (จะรกษาในคนทเปน homozygote), cystic fibrosis, DMD, Gaucher disease, hemoglobinopathies (ex. thalassemia), cancer, IHD (มคนพยายามทา gene therapy เพอรกษา MI โดยใช stem cell ฉดเขา cardiac m. ท infarct แลว กมการตอบสนองบาง แตจะตองแนใจวาการตอบสนองนยนยาว & ไมเกดผลเสย), AIDS, RA 

Prevention and Control of Genetic Diseases - หลก: prevent ถา treat ไมได; treat ถา prevent ไมได - Prevention of genetic diseases แบงเปน 1. Primary prevention ● ปองกนไมใหม mutagen (ทาไดยาก; ปองกนการใชสารพษ, ยา, X-ray) ● จากดการมลกในอายทเหมาะสม (เพราะแมทมลกเมออายมากขน ลกจะเสยงตอการเกด aneuploidy มากขน

, พอทมลกเมออายมากขน ลกจะเสยงตอการเกด new mutation มากขน)   ● ให folic acid supplement กอน + ระหวางม conception (พรอมจะตงครรภกกนเลย แลวกกนมาจน

ตลอดการตงครรภ) 2. Secondary prevention เกด mutation/โรคไปแลว จะปองกนไมใหเกดซาอก! ● genetic counseling ● genetic screening (หา carrier) ● prenatal screening / prenatal diagnosis (เพอเลอกยตการตงครรภถาเดกในครรภมความพการแต

กาเนดหรอมโรคพนธกรรมทรนแรง ไมมวธรกษา)   3. Tertiary prevention ปองกน complication จากโรคนน (ex. ทา colectomy ในคนเปน FAP กอนจะ

เปลยนแปลงไปเปน adenoCA, ให β-blocker/ARB ในคนเปน Marfan’s syndrome เพอปองกนก ารเกด

aortic aneurysm) - Prevention and control of common genetic diseases in population (การปองกนและควบคมโรค

พนธกรรมทพบบอยในประชากร) ประกอบดวย ● การใหการรกษาทดทสดกบผปวยทเปนโรคแลว (best possible treatment) ● ทา carrier detection ● ม prenatal diagnosis เปนบรการในชมชน ● ใหความรแกประชาชน & ให genetic counseling ทกระยะของการปองกนและควบคมโรคพนธกรรม - Common genetic disorders in specific ethnic groups ● β-thalassemia Greeks, Italian, Cypriots, SEA ● α-thalassemia SEA, Chinese ● Sickle-cell anemia African-Americans ● Tay-Sachs disease Ashkenazi Jews ● Cystic fibrosis Northern Europeans - Carrier & prenatal testing ● Tay-Sachs disease เปนแบบฉบบของ prevention & control โรคพนธกรรมในประชากรทไดผลสาเรจ

ดมาก!! (เพราะประกอบดวยองคประกอบครบทกอยางทกลาวมา) มการรณรงคใหทา carrier detection โดยตรวจ hexosaminidase A ในวน Tay-Sachs prevention day; ความสาเรจนเกดจากความรวมมอของชาว Ashkenazi Jews, บคลากรทางการแพทย, ผนาทางศาสนา (จะดวามหลกฐานวาไดทา carrier detection แลวหรอไม โดยไมไดสนใจผลการตรวจ! แตเพยงเพอใหร risk ของการมลกเปนโรคกอนทจะแตงงาน)

 TOP  SI 117 

● Thalassemia มการรณรงคในประเทศแถบ mediterranea ใหตรวจคแตงงานกอนมลก & รณรงคใหม

การบรจาคเลอดใหผทเปนโรค thalassemia ดวย (รณรงคในการรกษา) เปนประโยชนในการใหความรแกสาธารณชนในการปองกนโรค thalassemia

- Thalassemia prevention & control การรกษาในปจจบนมวธทไดผลจนหายขาดได แตมขอจากดเพราะคาใชจายสงมาก & มความเสยงตอผลแทรกซอนจากการรกษา + การรกษาบางครงอาจไมสาเรจ !!

● Treatment ในปจจบน ไดแก 1. Blood transfusion & Iron chelation ใหเลอด + ยาขบ Fe (เพราะจะม Fe จากเลอดสะสมใน

รางกาย ) ไปตลอดชวต! ซงเลอดมาจากการรบบรจาค แตยาขบ Fe มราคาสง (ใชฉด) ปจจบนจงมการศกษาหายาขบ Fe ชนดกน (มการทดลองใชในการศกษาวจยแลว)

2. Stem cell transplantation ไดผลด หายขาดได ปญหา: เมอจะทา transplantation จะตองกด

immune เกด complication (ex. infection, GVHD) เสยชวตได! 3. Treatment of complications ex. ผาตดเอา gallbladder ออก รกษา pigment stone, รกษา

bone fracture, splenectomy (กรณเกด hypersplenism), HF, pulmonary thromboembolism, etc.

● Prevention ไดแก 1. Public education (สาคญทสด) ใหความรแกประชาชน โดยเฉพาะบคลากรทางแพทยตองเขาใจดพอ

ex. เขาใจวา carrier คอคนปกต, เปาหมายหลกในการปองกน thalassemia ในทาง genetics คอ

ชวยเหลอใหคสามภรรยามโอกาสมลกทปกต & ชวยลดความทกขทรมานจากการมลกเปน

thalassemia (ถาปราศจากโครงการน เขาอาจไมกลามลกเลย/ไปลอบทาแทง) ไมใชการลดจานวนคนเปน thalassemia (เปนเพยงผลพลอยได!! แมวาในทางเศรษฐศาสตรการแพทย อาจมการเสนอโครงการ

โดยใหตวเลขวาประเทศจะประหยดงบประมาณไดมากแคไหนเมอไมมคนไข thalassemia เกดมาในประเทศ) 2. Carrier screening/detection ตองใชวธท sensitivity , specificity , คาใชจายถก, ทาไดงาย

, ผทตองการตรวจสามารถเขาถงบรการนได 3. Prenatal diagnosis เนองจากโรค thalassemia เราร molecular defect, ร product ของ gene

วาทาใหเกด Hb ผดปกต ใชความรนทา prenatal diag. ได โดยทา DNA analysis, เจาะ cord blood มาตรวจชนดของ Hb (ชวย diag. Hb Bart’s hydrops fetalis ไดอยางแมนยา!!)

** เนองจากประเทศไทยมปญหา thalassemia ซบซอนทสดในโลก การทา prenatal diag. จะตองรกอนวาโรคทตองการตรวจเปนโรคอะไร, ตองการตรวจหา mutation ชนดใด ดงนนคสามภรรยาทรวาตวเอง

เปน carrier & เปนคเสยง!! (คอเปน carrier ของ thalassemia ชนดเดยวกน & interaction ระหวาง allele ทงสองทาใหเกด disease) จะตอง characterize ไดวา mutation ในคสามภรรยานนเปนอะไร จง

จะสามารถทา prenatal diag. โดย DNA analysis ใน fetus ได 4. Genetic counseling มความสาคญทกขนตอน !! ตงแต ● กอนทา carrier detection ● หลงทราบผลวาเปน carrier ● กอนตรวจคแตงงาน ● หลงทราบวาคแตงงานเปน carrier ● กอนเลอกทา prenatal diag. หลงจากทราบวาเปน carrier ทงค ● หลงทราบผล prenatal diag. ● กอนยตการตงครรภ ● หลงยตการตงครรภ ● กอนการตงครรภอกครง - Public education จาเปนอยางยง เพราะถาคนไมรวามบรการน กจะไมมาใชบรการ หรอถามความเขาใจทผด

วาบรการนสามารถตรวจไดมากกวาความเปนจรง หรอไมรวาตรวจอะไรไดบาง มประโยชนอะไร กจะเปนผลเสยตอ

โครงการ - วธการทจะให public education ● ศกษาในโรงเรยน, มหาวทยาลย

● จดเสวนาในชมชน ● ใหขอมลผานญาต, เพอน, เพอนบาน

 TOP  SI 117 

● รณรงคทางโทรศพท, ออก TV, วทย, หนงสอพมพ ● มองคกรตางๆ (ex. มลนธโรคโลหตจางธาลสซเมยแหงประเทศไทย) ● พระ, นกบวช ● แพทยครอบครว, อายรแพทย, สตแพทย, กมารแพทย etc. ตองมความรพอทจะใหความรนแกผทอยในความ

ดแลของตนเองได - Carrier (Heterozygote) screening การทา carrier screening เปนการตรวจหา genotype หรอ

phenotype ใน target population เพอระบวาคนใดเปน carrier ทงๆ ทไมมอาการ เอาไปใชบอก risk & option ตอการมลก

- วธการทา carrier screening ม 2 อยาง 1. Family-centered screening ทาในครอบครวคนไขทเปน thalassemia; สะดวก ครอบครวจะมาตดตอ

กบแพทยอยแลว เพอปองกนหลงจากมผเปนโรคแลว!; ปองกนไมใหมคนเปนโรคใหมจานวนไมมากนก ขอด: ทาใหครอบครวทมคนเปนโรคแลวมความรความเขาใจเรองโรคเปนอยางดกวาประชาชนทวไป, เขาใจถง

ความทกขทงทางจตใจ & สงคมจากการมผเปนโรคในครอบครว, เหนความสาคญของการปองกน (โอกาสพบ

carrier ในครอบครว ) 2. Population-based screening (ดกวา!) ตรวจในประชากร โดยเฉพาะในประชากรทมอบตการณของ

carrier (ex. ประเทศไทย); ผลทจะไดรบ (เพราะอบตการณของ thalassemia carrier ในประชากรไทยสงถง 40%)

2.1 Premarital screening (ดทสด! เพราะเปนระยะทยงม option มากทสด) ตรวจกอนแตงงาน, ถาพบเปน carrier ทงคกอาจเปลยนคแตงงาน/ตดสนใจกอนแตงงานวาจะมลกมย?/ตดสนใจทา prenatal diag. มย?/ถาลกเปนโรคจะยตการตงครรภมย?

** แตยากในทางปฏบต เพราะคสามภรรยาตกลงปลงใจกนไปแลว! ** ชวงเวลาทดยงกวา คอ screen ตอนยงไมมค (ex. ระหวางเปนนกเรยน, นกศกษา) มการรณรงค

ในตรวจหา carrier ของ Tay-Sachs disease ใน high school ทประเทศ Canada 2.2 Preconceptional screening ตรวจกอนมลก (หลงแตงงานแลว); คนทมการศกษา/เศรษฐานะสงจะ

ทาวธนกนเยอะ ** ดงนน ททคนเรมโครงการในประเทศตางๆ มกเรมตอนมาฝากครรภ ซงจรงๆ แลวถอวาเปนชวงเวลาท

ดนอยทสด! เพราะขณะนน มความวตกกงวลมากมายเรองการมลก นอกจากโรคพนธกรรม & thalassemia ยงตองตรวจ DM, HIV, rubella, syphilis ใหขอมลสาหรบคนทไมมพนฐานความรนเลยในเวลาทจากดมาก เพราะตองแขงกบเวลาทอายครรภมากขนๆ ถาพบวาเปน carrier แลวกยงตองตามสามมาตรวจอกวาเปน carrier ดวยหรอไม & สามไทยกมกไมรวมมอ! แตถาไดตรวจแลวพบวาสามเปน carrier การให counseling ทงสามภรรยาในเวลานนกไมเหมาะอยางยง (บอยครงทสามโทษวาเปนเรองของภรรยา เพราะภรรยาตรวจพบวาเปน carrier กอน) แตกตองจายอม เพราะคนทม risk ตอการเปน thalassemia ในประเทศพฒนาแลว (ex. UK) จะมเศรษฐานะทางสงคมตา มกไมมาพบแพทยกอนตงครรภ แตจะมาตอนตงครรภ (ดวยเหตนการปองกนและควบคม thalassemia โดยการทา carrier screening จงมกเรมทคลนกฝากครรภ) ยา! ไมใชเวลาทดทสด แตเปนเวลาจายอมทจาเปนตองทา

การทจะตดสนใจในเวลาอนสน, ตอง diag. ใหไดวาเปน carrier หรอเปลา, ตอง characterize molecular defect, ใหขอมลตางๆ เรอง prenatal diag, procedure, risk, benefit, การตดสนใจ

เปนเรองทยากลาบากมาก ดวยเหตน การให counseling ในโครงการ thalassemia prevention & control ซงทาทคลนกฝากครรภจงมกทาไมไดมาตรฐาน!! เกดผลเสย; บางท mutation นน

characterize ไมได, ตองใชเวลาในการตรวจเพมเตม, บางครงกจาเปนตองตดสนใจทาอะไรไปซงอาจไมใชสงทดทสดทอยากจะทาใหกบผปวย ดงนน ยา ! การทา genetic counseling ทดทสดคอทาตอนทยงม option มากทสด & มผลกระทบตอจตใจนอยทสด

** ขณะนมกฎแพทยสภาออกมาวาถาเดกในครรภเปนโรคพนธกรรมทรนแรง ไมสามารถรกษาได ม

risk และคสามภรรยาไดรบ genetic counseling จนเขาใจดแลว และเลอกตดสนใจเองทจะยต

การตงครรภสามารถทาได!!

 TOP  SI 117 

แนวทางปฏบต (สงเกต: ให pretest & posttest counseling ตลอด!!) ● สมาชกครอบครวผปวย/ญ. ทมาฝากครรภ/ประชาชนทวไป ไดรบ Education/Counseling*

● สมาชกครอบครวผปวย/ญ. ทมาฝากครรภ/ประชาชนทวไปทา Carrier screening เปน carrier/โรค รบ Genetic counseling* ● คครอง รบ Genetic counseling* ● ตรวจคครอง คครองเปน carrier/โรค รบ Genetic counseling* ● คสามภรรยาทม risk ตอการมลกเปนโรค รบ Genetic counseling* (ใหขอมลเกยวกบ

prenatal diagnosis) ● คสามภรรยาทม risk ตอการมลกเปนโรคเลอกทจะทา Prenatal diagnosis รบ Genetic

counseling* ● ถาพบวาเดกในครรภเปนโรค รบ Genetic counseling* ● คสามภรรยาเลอกวาจะดาเนน pregnancy ตอไป/terminate pregnancy!! ● หลงจากเลอกแลว รบ Genetic counseling* (เกยวกบการตงครรภครงตอไป/การรกษา

ถาเลอกจะดาเนน pregnancy ตอ) ● เมอตงครรภครงตอไป รบ Genetic counseling* (ใหขอมลเกยวกบ prenatal diagnosis

อกครง) ** คนมแนวโนมจะคดวา prenatal diag. เปนคาตอบในการปองกนโรค thalassemia คอตองกาจดไม

มคนเปนโรคเกดขนมา เขาใจผดอยางสนเชง! & ทาใหมการดาเนนการหลายอยางทผดๆ (ex. ใหขอมลททาใหหวาดกลว รงเกยจคนเปน thalassemia, ตองใหตรวจในโรงเรยน, ม poster ตดไววาหนาตาคนเปน thalassemia เปนอยางน จมกแบน หนาผากโหนก)

2.3 Prenatal screening ตรวจกอนคลอด - Thalassemia carrier screening in Thailand ปจจบนในประเทศไทย ตรวจหา carrier 3 ชนด ไดแก 1. α-thal 1 2. β-thal 3. HbE (carrier = heterozygote = trait) เพราะ carrier ทง 3 ประเภทนสามารถทาใหเกด severe thalassemia ไดแก 1. Hb Bart’s hydrops fetalis 2. Homozygous β-thalassemia 3. β-thalassemia/HbE disease - Carrier testing for thalassemia ● Screening test จะตองใช test ทราคาถก, ตรวจงาย, sense , spec , วธทใช ไดแก 1. Osmotic fragility test ตรวจความเปราะของ RBC (ถา RBC มขนาดเลก กจะแตกยากกวา) 2. DCIP precipitation test (DCIP = dichlorophenol-indophenol) DCIP สามารถไปตกตะกอน

Hb ผดปกตทไมเสถยร ไดแก HbH & HbE เมอตกตะกอนกจะขน +ve 3. RBC indices RBC ในผทเปน thalassemia จะม Mean corpuscular volume (MCV) ถา <

70 femtoliter ใหสงสยไววาอาจเปน thalassemia หรอ iron-deficiency anemia (ตองมความรวาจะแยก 2 ภาวะนออกจากกนยงไง)

● Confirmatory test เมอ screen แลวพบวามความผดปกต 1-2 อยาง กจะ test ตอเพอ confirm โดย 1. Hb typing หาชนดของ Hb; ปจจบนใชวธ chromatography (แตเดมใชวธ electrophoresis):

HPLC & LPLC (high- & low-pressure lipid chromatography) ไดผลแมนยา & ตรวจงาย สะดวก! ** ดวาม HbA2, HbE, HbH, Hb Bart’s หรอเปลา 2. DNA analysis เพราะ α-thal 1 & α-thal 2 ไมมการเปลยนแปลงชนด Hb; ถาสงสยวาเปน carrier

(ex. screen +ve) หรอไม กตองทา DNA analysis ดวาม deletion ของ α-globin gene หรอไม

 TOP  SI 117 

- Heterozygote & Prenatal diagnosis ทา Dot blot hybridization: ถอหลกวา ASO probe จะ hybridize กบ specific DNA

วธการ: เอา normal probe (IVS1) ใสเขาไปในแผนกระดาษกรอง แลวเอา mutant probe (IVS1 ตาแหนงท 5, mutate จาก G C & IVS1 ตาแหนงท 1, mutate จาก G T) ใสไปในอกแผน (กรณน 2

แผน) แลวเอาหยดเลอดของคนไขตางคนกนหยดลงไป (แตละวงในแผนเดยวกนคอคนไขคนละคน) ถาม hybridization เกดขนได ม allele นน!!

ถา hybridize กบ normal probe เทานน ปกต !! (ex. B1) ● ● ถา hybridize กบ mutant probe เทานน ม mutation เปน

แบบนน (homozygote ex. A11, B6) ● ถา hybridize กบทง normal & mutant probes เปน

carrier !! (ex. เลอดของ A4, B8) - ตอมา ไดมการดดแปลง เกดเปนวธ Reverse dot blot hybridization

วธการ: เอา normal probe + mutant probe หลายชนดหยดลงไปบนกระดาษกรองคกน (ดงรป) คนปกตจะ hybridize กบเฉพาะ normal probe เทานน! แต test sample จากรปพบวามสวนท hybridize ทง normal & mutant probe carrier !! ** probes เหลาน designed ขนตาม common mutation ทพบในประชากร!! (แตไมสามารถตรวจทกชนดของ mutation ได จงใชบอกไดเปนขนตนเทานน)

- ปจจบนการทา characterization ของ molecular defect มความกาวหนาไปเยอะโดย technique ตางๆ

prenatal diag. ของ thalassemia จงทาไดอยางแมนยา!! (แตกไมปราศจากปญหาเสยทเดยว บอยครงอาจไปเจอ mutation ทบอกไมไดวามความรนแรงหรอไม); trend ในปจจบนนคอการทา genotype-phenotype correlation ถาพบวาคสามภรรยาม risk ตอการมลกทม mutation ชนดไมรนแรง กจะนาไปสการตดสนใจวาจะทา prenatal diag. หรอยตการตงครรภหรอไม

Ethical, Social and Legal Issues in Medical Genetics - Immediate benefits from genomics (ประโยชนทไดรบจากการศกษา HGP) 1. identify gene ทเปนสาเหตของ single-gene disorder ได 2. identify gene ทเกยวของกบ common complex multifactorial disease (พบบอยในประชากร) ได 3. identify gene ทเกยวกบการ response จากการรกษาดวยยา (ex. DME, target ทยาไปออกฤทธได) 4. นาไปสการสรางยาใหมๆ ซงเปนประโยชนมาก นาความรไปใชกาหนดยาทไดผลในคนไขแตละคน ไดขนาดยาท

อยใน therapeutic level ไมเกด ADRs (เรมเหนแลววาทาได!) - Impact on medical practice (ผลกระทบของ HGP ตอเวชปฏบต) 1. ทาใหเราเขาใจโรคตางๆ & categorize กลมโรคตางๆ (ทแตกอนแบงตาม phenotype) ** โรคทสบสนมากทสดในการ categorize คอโรคของระบบประสาท (neurological disease), โรคผวหนง,

skeleton dysplasia, โรคตา การร gene ทเปนสาเหตจะทาใหเขาใจโรคกลมตางๆ ดขน 2. นาไปส genetic testing เพอทานาย risk & ปองกน (carrier detection, newborn screening,

prenatal screening, prenatal diag., etc.) 3. การพฒนายาเรวขน, มประสทธภาพมากขน 4. การรกษาปลอดภยขน, ไดผลดขน - Basic ethical principles (หลกจรยธรรมทยดถอกนทวไป) ม 4 ขอ ดงน 1. Beneficence (ความเปนประโยชน) 2. Non-maleficence (ความไมเกดโทษ: limitation of harm & suffering)

 TOP  SI 117 

3. Respect for human beings and human dignity (ความนบถอความเปนมนษย) ประกอบดวย 1) Autonomy (การนบถอการตดสนใจ การเลอกทางเดนชวตของบคคลผนน) 2) Informed consent (การตรวจตางๆ ตองมการใหความยนยอม หลงจากไดรบขอมลแลว) 3) Confidentiality (การรกษาขอมลเปนความลบ) 4) Privacy (การรกษาความเปนสวนตว ตองกาหนดวาใครสามารถเขาถงขอมลนนได/ไมได) 4. Justice (ความยตธรรม) ใหทกคนสามารถเขาถงบรการได ** ปญหาจะเกดขน เมอหลก 4 หลกนขดกนเอง!! ex. การตดสนใจของคสามภรรยาวาตองการยตการตงครรภ

เพราะเพยงลกในครรภเปนเพศทไมตองการ/มความพการแตกาเนดททาใหไมสวยงามเพยงเลกนอย (ถาเลอก

respect autonomy กจะไปขดกบ non-maleficence & justice ตอเดก) - Rifkin ชอบออกมาตอตานเวลาทม genetic technology ใหมๆ เรมตงแตเดกหลอดแกว, cloning, etc.

** คนกลววา cloning จะนาเอาไปทา reproductive cloning (ซงหามทาเดดขาด!) ปจจบน เราเอามาใชในการทา

therapeutic cloning (nuclear transfer) ** Eugenics เปนคาทคนกลวมาก เพราะกลวระบบ Nazi ทจะทาใหมนษยเปนชาตพนธทบรสทธ ปราศจากคนโรคจต, alcoholism, ปญญาออน, โรคพนธกรรม, etc.; eugenics ทาใหเกดความหมนหมองทาง genetics เพราะม geneticist ทเปนพวก Nazi หลายคน

- Genetic information เปนลกษณะพเศษคอ 1. Private (เปนขอมลสวนตว) 2. Powerful (มอทธพลสงตอการตดสนใจ, นาไปใช) 3. Potential for prediction (นาไปใชในการทานายได) 4. Implications for other family members (ขอมลของคน 1 คน จะมผลตอคนอนในครอบครวดวย) 5. Permanent (เปนขอมลถาวร genetic testing ทาครงเดยว ไมตองตรวจซา) 6. Can be damaging (ทาใหเกดความเสยหายไดมาก ถานาไปใชในทางทผด) - Major ethical, legal, social issues in medical genetics ● Genetic testing Prenatal genetic testing (ตรวจกอนตงครรภ) & Termination of pregnancy (ถาไมมเหตผลท

อนญาตใหทา หามทา!) Prenatal diagnosis สาหรบภาวะทไมใชโรค/เปนเพศผดจากความตองการ ทาไมได!

** การเลอกเพศจาก prenatal diagnosis มททาทเดยวเทานน คอกรณทเดกในครรภเสยงตอโรค XR หรอโรคนนยงไมมวธ prenatal diagnosis กจะเลอกเพศ ถาพบวาเดกในครรภเปน ช. ม risk ตอการเปนโรค (ถอวาเปน indication เดยวสาหรบการเลอกเพศ นอกนนเปนการผดจรยธรรมทงสน!!)

Testing for late-onset disease in asymptomatic indivisual (ตรวจสาหรบโรคทเปน late onset โดยไปทาตงแตอายนอย/เปนเดก/prenatal diag. ขอมลนตองคดใหดวาเปนประโยชน/โทษกนแน)

Genetic testing in children (ตรวจเดกสาหรบโรคทเปน late onset กอนทเดกจะตดสนใจไดวาเขาอยากจะตรวจหรอไม)

● Duty to warn & permission to warn ถาแพทยพบวามสมาชกในครอบครวคนหนงม gene ทเปนอนตราย มหนาทจะตองไปแจงสมาชกคนอนในครอบครวไหม? ถาเจาตวหามแจง จะผดไหมถาจะไปแจง?

แนวทางทออกมาแลว: แพทยตองแจง! (ตองยอมผดฐานละเมดความลบ) เพราะเหมอนกบรวาคนหนงจะไปฆาคน

แลวเราไมไปเตอนคนคนนน แลวคนคนนนกถกฆาจรงๆ ถอวาเราผด

● Misuse of genetic information by employers & insurers การใช genetic information เพอจะเลอกปฏบตไมรบคนเขาทางาน/ไมรบประกนสขภาพ/เรยกคาประกนสขภาพสงมากๆ ทงๆ ท genetic testing นาจะชวยประหยดเงนของบรษทประกนสขภาพ เพราะการรกอนสามารถปองกนได

** เพงมการออกกฎหมายผานกฎหมายรฐสภา USA เรอง discrimination act สาหรบ genetics เปนเรองทนายนดมาก!

● Genetic screening Stigmatization (รสกเปนตราบาป ถาครอบครว/สงคมไมเขาใจ) Privacy

Coercion (การบงคบตรวจ ผด!)

 TOP  SI 117 

- Important principles in genetic testing ● Autonomy (นบถอการตดสนใจ) ● Confidentiality (รกษาความลบ) ● Privacy (กาหนดวาใครจะเขาถงขอมลได) ● Right to full information (มสทธทจะไดขอมลเตมท) ● Right not to know (มสทธทจะไมตองการรผลการตรวจ) ● Voluntariness, informed consent (การตรวจเปนไปโดยสมครใจ มการใหคายนยอม) ● Non-directive counseling (ใหคาปรกษาแนะนาชนดทไมตดสนใจแทน ปองกนการบงคบตรวจซงเปนลกษณะ

ของ eugenics) - Benefits & risks of predictive testing ● Benefits 1. ถารวาไมเปนกจะตลายใจ มนใจวาตนเองไมเปน 2. สามารถตดสนใจไดวาถาเราไมม gene นน เรากจะแตงงาน มลก 3. ถาพบวาม gene นนจะไดลดปจจยเสยง (ex. เสยงตอ DM กจะควบคมอาหาร) ● Risks 1. ผลทางจตใจ 2. ความสมพนธในครอบครวจากการทรวาภรรยา/สาม/ลกคนใดคนหนงม gene นน/เปนโรค

3. การรกษาความลบ 4. การประกนสขภาพ/การสมครงาน - Predictive testing: Hereditary breast cancer risk 50-80%; รแลวมประโยชนไหม?/ไมอยากร - DNA testing for risk prediction ควรตรวจ Huntington disease ไหม ขณะนเราอยดอย ถารวาม

gene จะทายงไง, จะกงวลไหม (อาจฆาตวตายได ถาไมไดรบ counseling ทด) - Genetic information & reproductive decisions ● ตองไมบงคบวาเจาตว/คสามภรรยาจะตองตดสนใจอยางไร ถาผล +ve ● ม informed consent เปนหลกประกน ปองกนไมใหเกดการกดดน (eugenic pressures) - Confidentially vs. Disclosure (เมอไหรจะปด เมอไหรจะบอก) มขอดขอเสย (ตามทกลาวไปแลว), บาง

กรณเราอาจเลอกเปดเผยความลบได, เขามสทธทจะขอไมรกได - Genetic testing of children & adolescents การตรวจเดกสาหรบโรคผใหญ ไมมประโยชน!! - Genetic discrimination & health insurance การเลอกปฏบตในการประกนสขภาพจากการมโรค

พนธกรรม ปจจบนทาไมไดแลว! - Francis Collins (เปน director ของ HGP) กลาววา “การทา genetic testing มศกยภาพทจะปฏวต

การแพทย แตการปฏวตกยอมมความสญเสย การบาดเจบ เปนธรรมดา”

----- THE END -----