mechanisms of antibiotic resistance in bacteria ...seminarski rad barbara skender preddiplomski...

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

PRIRODOSLOVNO – MATEMATIČKI FAKULTET

BIOLOŠKI ODSJEK

MEHANIZMI REZISTENCIJE NA ANTIBIOTIKE U

BAKTERIJE ACINETOBACTER BAUMANNII

MECHANISMS OF ANTIBIOTIC RESISTANCE IN

BACTERIA ACINETOBACTER BAUMANNII

SEMINARSKI RAD

Barbara Skender

Preddiplomski studij biologije

(undergraduate Study of Biology)

Mentor: prof.dr.sc. Jasna Hrenović

Pomoćni mentor: dr.sc. Tomislav Ivanković

Zagreb, 2012.

2

SADRŽAJ

UVOD ........................................................................................................................................ 3

OPĆE KARAKTERISTIKE A. BAUMANNII ........................................................................... 4

MEHANIZMI REZISTENCIJE NA ANTIBIOTIKE U A. BAUMANNII ............................... 5

Aminoglikozidi....................................................................................................................... 5

ß-laktami................................................................................................................................. 6

Enzimatski mehanizmi ....................................................................................................... 6

Neenzimatski mehanizmi ................................................................................................... 8

Kinoloni................................................................................................................................ 10

Polimiksini ........................................................................................................................... 10

Tetraciklini i glicilciklini...................................................................................................... 10

KLINIČKE MANIFESTACIJE INFEKCIJA S A. BAUMANNII............................................ 11

Upala pluća........................................................................................................................... 11

Infekcije krvnog toka ........................................................................................................... 11

Infekcija urinarnog trakta ..................................................................................................... 12

Meningitis............................................................................................................................. 12

MOLEKULARNE TEHNIKE ZA ANALIZU SOJEVA A. BAUMANNII ............................. 13

Analiza plazmida.................................................................................................................. 13

Ribotipizacija ....................................................................................................................... 13

PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis) .............................................................................. 13

Metode tipizacije bazirane na PCR-u (eng. polymerase chain reaction) ............................. 14

AFLP metoda (eng. amplified fragment length polymorphism).......................................... 15

MLST metoda (eng. multilocus sequence typing) ............................................................... 15

ZAKLJUČAK .......................................................................................................................... 16

LITERATURA......................................................................................................................... 17

SUMMARY ............................................................................................................................. 21

3

UVOD

Bakterije vrste Acinetobacter baumannii spadaju među jedne od najproblematičnijih

bolničkih patogena. Sve veći broj bolničkih infekcija uzrokovanih sojevima vrste

Acinetobacter baumannii uzrok je zabrinutosti znanstvenika (Slika 1). Pronađeni su sojevi

ove vrste koji su rezistentni na sve do sada poznate antibiotike.

Upravo zbog toga se posebna pažnja počela posvećivati mehanizmima i načinu

stvaranja rezistencije kod ovih bakterija.

Rezistentnost na antibiotike uzrok je tome da A. baumannii ima sposobnost preživjeti

dulje vrijeme u bolničkom okruženju, te samim time ima i više mogućnosti za stvaranje

infekcije. A. baumannii napada najosjetljivije bolesnike najčešće preko ozljeda na koži i kroz

dišne putove.

Najpoznatija infekcija koju ovi organizmi uzrokuju je bolnička upala pluća, iako su u

posljednje vrijeme uočene infekcije koje napadaju i središnji živčani sustav, kožu i mekana

tkiva, te kosti.

U ovom radu osvrnuti ću se, osim na glavnu temu - mehanizme rezistencije, i na

taksonomsku podjelu i biologiju vrste A. baumannii, na bolničke manifestacije infekcije, te na

metode detekcije bakterije.

Slika 1. Kolnije bakterije Acinetobacter baumannii porasle na krvnom agaru (http://www.acinetobacter.org/)

4

OPĆE KARAKTERISTIKE A. BAUMANNII

Godine 1911. nizozemski mikrobiolog Martinus Beijerinck opisao je organizam imena

Micrococcus calcoaceticus. Tijekom narednih desetljeća nađeni su i opisani slični organizmi

koji su 1954. stavljeni u rod Acinetobacter. Ovo ime je predloženo da bi se razdvojili pokretni

od nepokretnih mikroorganizama unutar roda Achromobacter (akinetos,grč.- nepokretno)

(Bijernick, 1911)

Službeno je rod Acinetobacter priznat 1971. godine. Spada u porodicu Moraxelacea,

red Gammaproteobacteria, koji obuhvaća i rodove Moraxella, Psychrobacter i srodne rodove

(Rossau i sur., 1991)

Acinetobacter obuhvaća Gram-negativne, strogo aerobne, nepokretne i katalaza

pozitivne bakterije sa sadržajem DNA G+C baza od 39% do 47%.

Dobro rastu na čvrstim medijima koji se rutinski koriste u mikrobiološkim

laboratorijima. To su npr. ovčiji krvni agar ili tripton-sojin agar koji se inkubiraju na

temperaturi od 37°C/24h (Garrity i sur., 2005).

Ove bakterije formiraju glatke, mukoidne, sivo-bijele kolonije (Slika 1). Ponekad

kolonije kompleksa A. calcoaeticus - A. baumannii nalikuju kolonijama koje formiraju

Enterobacteriae: kolonije prekonoćnih kultura su promjera 1,5-3 mm. Ali, za razliku od

Enterobacteriae, kompleks A. calcoaeticus- A. baumannii ne raste na McConkey agaru.

Istraživanja su pokazala da kolonije koje uzrokuju infekciju rastu u kulturama pri niskom pH,

sa jakim dotokom zraka i obogaćenima acetatom ili drugim prikladnim izvorom ugljika

(Baumann, 1968).

Vrste roda Acinetobacter smatraju se organizmima koji su sveprisutni u okolišu: od

vodenih staništa, preko tla, povrća, životinja pa sve do ljudske kože.

Prema do sada rađenim istraživanjima, u Europi je postotak kliconoša A. baumannii

razmjerno nizak. Po tome se da zaključiti da ova vrsta nije tipična sveprisutna vrsta. Podaci

prikupljeni istraživanjima ne mogu potvrditi da li je infekcija koju A. baumannii uzrokuje

potaknuta nekim vanjskim okolišnim čimbenicima. Prirodno stanište A. baumannii još nije

definirano (Peleg et al. 2008).

5

MEHANIZMI REZISTENCIJE NA ANTIBIOTIKE U A.

BAUMANNII

Broj mehanizama rezistencije koji su do sada otkriveni u vrste A. baumannii je velik i

premašuje broj nađenih mehanizama u ostalih Gram-negativnih patogena.

A. baumannii se brzo može prilagoditi na okolišni stres. Kao dokaz tome je brzo

globalno širenje sojeva rezistentnih na ß-laktame, uključujući karbapeneme. Na soju nađenom

u Francuskoj (AYE), nakon provedenog sekvencioniranja genoma, nađen je, do sada najveći,

'resistance island'1 veličine 86 kb (AbaR1). Od 88 otvorenih okvira čitanja2 (eng. open reading

frame-ORF), smatra se da ih je čak 82 podrijetlom iz drugih Gram-negativnih bakterija (npr.

Pseudomonas sp., Salmonella sp. i Escherichia coli). Od 52 gena za rezistentnost, 45 (86.5%)

ih se nalazi na AbaR1 'resistance islandu' (Fournier i sur., 2006). Istraživanja ovog genoma

ponudila su dokaz genetske 'promiskuitetnosti': prisutan je niz pokretnih genetskih elemenata

koji potječu od različitih domaćina. Ti pokretni genski elementi uključuju transpozone, tri

integrona klase 1 i 'insertion sequence' (IS) elemente. Zanimljiva je činjenica da ni jedan

plazmid nije registriran na AbaR1, a plazmidi koji su pronađenu u AYE soju nemaju u sebi

markere za rezistenciju. Slični 'resistance islandi' su detektirani i u drugim sojevima iz iste

geografske regije, samo sa manjim brojem kilobaza. Od 22 soja čak 77% je imalo netaknut

ORF za ATP-azu i fenotip otporan na antibiotike (Fournier i sur., 2006).

Aminoglikozidi

Aminoglikozidi su antibiotici koji djeluju na način da na različite načine sprečavaju

sintezu proteina

(http://sharepoint.zvu.hr/katedre/319/Nastavni%20matrijali/IRT%20STUDIJ/pdf.%20za%20s

rudente%20IRT%20-MIKRO/antibiotici.pdf). U sojevima A. baumannii prevladavaju geni

koji kodiraju enzime koji modificiraju aminoglikozide. Ti geni se nalaze u unutar integrona

1 Resistance island- genetski lokus unutar kojeg se nalaze geni za rezistenciju(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1286457906000505)2 Otvoreni okvir čitanja(eng. open frame reading)- slijed nukleotida(dio gena) koji kodira protein( od start dostop kodona) (http://www.scfbio-iitd.res.in/tutorial/orf.html)

6

klase 1. Mehanizam koji se tu javlja je metilacija3 16S rRNA. To onemogućava prianjanje

aminoglikozida na ciljano mjesto i na taj način uzrokuje visoku rezistentnost na sve

aminoglikozide koji se koriste u medicini (gentamicin, tobramicin, amikacin) (Doi i Arakawa,

2007).

ß-laktami

ß-laktamski antibiotici su skupina baktericidnih antibiotika koji djeluju tako da

ometaju sintezu stanične stjenke bakterije


rudente%20IRT%20-MIKRO/antibiotici.pdf). Obuhvaćaju cefalosporine, peniciline,

monobaktame i karbapenema. U rezistenciji na ß-laktame postoje dva tipa mehanizama:

enzimatski i neenzimatski.

Enzimatski mehanizmi

Od ovog načina rezistencije prevladava enzimatska degradacija pomoću ß-laktamaze.

Ali, valja naglasiti da unutar jednog fenotipa postoji više mehanizama koji 'surađuju' te na taj

način razvijaju rezistenciju (Bou i sur., 2000). Ono što je jedinstveno za sve sojeve A.

baumannii je kromosomski kodirana takozvana Acinetobacter-proizvedena cefalosporinaza

(AmpC cefalosporinaza) (Huyer i sur., 2005). To je enzim iz skupine ß-laktamaza koji djeluje

na cefalosporine- antibiotike širokog spektra otporne na penicilazu. Čimbenik koji kontrolira

ekspresiju ovog enzima je IS element imena ISAba1 (Heritier i sur., 2008).

U A. baumannii su još pronađeni i ß-laktamati širokog spektra (ESBLs), ali detekcija i

procjena njihove prave uloge je dosta otežana, pogotovo zbog prisutnosti AmpC (Peleg i sur.

2008).

Integron blaVEB-1 kodiran je na kromosomu i identičan je onome koji je pronađen u

Pseudomonas aeruginosa. Povezan je sa IS26 elementom te to pokazuje moguće podrijetlo i

način širenja u A. baumannii. Osim njega postoji i blaPER-1, kromosomski ili plazmidno

3 Metilacija- proces u kojem se na proteine, molekule DNA i slične molekule dodaju metilne grupe te se na tajnačin mjenja ekspresija gena, ali ne i sam gen.

7

kodirani integron koji sadrži IS element( ISPa12) koji pojačava njegovu ekspresiju (Grilich i

sur., 2002).

Osim ESBLs-a, u A. baumannii postoje i ß-laktamati uskog spektra (NSBLs), ali oni

nisu toliko važni jer je njihov klinički značaj limitiran drugim čimbenicima rezistencije.

Na ß-laktamate koji imaju karbapenemaznu aktivnost se obraća posebna pažnja. To su

ß-laktamati koji uključuju serin oksacilinaze (Amblerova klasa4 D OXA tip) i metalo-ß-

laktamaze (MBL) (Amblerova klasa B). Do sada karbapenemaze Amblerove klase A nisu

opisane u A. baumannii (Queenan i Bush, 2007).

Prvi identificirani OXA tip enzima sa karbapenemazno-hidroliznom aktivnošću bio je

izoliran sa soja A. baumannii u nađenog u Edinburghu, Škotska (Paton i sur., 1993). Njega

kodira plazmid i prenosiv je. Gen je kasnije sekvencioniran i nazvan blaOXA-23, te on sada

pridonosi rezistenciji na karbapenimide na globalnoj razini (Donald i sur., 2000). Osim ovog

gena nađena je još nekolicina OXA tipa genskih klastera. Svi oni su kodirani plazmidom te se

smatra da se upravo zato rezistentni sojevi toliko jako i brzo šire (Peleg i sur., 2006). BlaOXA-

51 geni su jedinstveni i prirodno se pojavljuju u A. baumannii. Produkt ovog enzima ima veći

afinitet za imipeneme nego za meropeneme (Heritier i sur., 2003). Njegova uloga u

rezistenciji na karbapeneme je povezana sa prisutnošću ISAba1. U nedostatku ovog elementa

A. baumannii pokazuje minimalnu osjetljivost na karbapeneme (Turton i sur., 2008).

Provedena su brojna istraživanja na blaOXA genima. Na temelju tih istraživanja

doneseni su sljedeći zaključci: prirodni plazmidi sa blaOXA genima pokazuju veću razinu

rezistentnosti nego rekombinantni plazmid u sličnim domaćinima (Heritier i sur., 2005), IS

elementi su veoma važni čimbenici u stvaranju rezistencije. Oni imaju dvije važne uloge:

kodiraju transpozazu- mobilni su i sadrže promotor regije koje vode do pojačane ekspresije

determinanti za rezistenciju (Peleg i sur., 2008).

Metalo-ß- laktamaze nisu toliko učestale u A. baumannii, ali njihova hidrolitička

aktivnost na karbapeneme je izrazito snažna (Poirel i Nordmann, 2006). Ovi enzimi

hidroliziraju sve ß- laktamate osim monobaktama. Samo tri MBL grupe su detektirane u vrste

A. baumannii: imipenemaze (IMP), Verona imipenemaze (VIM) (Lee i sur., 2003) i Seoul

imipenemaze (SIM) (Lee i sur., 2005). MBL se najčešće nalaze unutar integrona. U skladu se

time, sojevi A. baumannii koji imaju integrone su rezistentniji od onih sojeva koji ih nemaju

(Gu i sur., 2007). Kada su izolirani, integroni nisu mobilni nego ugrađeni u plazmide ili

transpozone koji služe kao genetsko 'vozilo' za širenje rezistencije (Peleg, 2008).

4 Amblerova klasifikacija- podjela ß-laktamaza u 4 klase( A,B, C, D). Podjela se temelji na homologijiproteina(sličnosti aminokiselina) (Erdeljić, 2012.)

8

Neenzimatski mehanizmi

Ovo je drugi tip mehanizama koji uzrokuju rezistenciju na ß- laktamate. Ti mehanizmi

uključuju promjene u vanjskoj membrani proteina (Bou i sur., 2000), multidrug efflux

pumpe'5 (Heritier i sur., 2005), te alternacije u afinitetu ili ekspresiji proteina koji se vežu na

penicilin (Fernandez-Cuenca i sur.,2003). Malo se toga zna o porinima na vanjskoj membrani

A. baumannii. Pokazalo se da je gubitak proteina CarO povezan sa rezistencijom na

imipeneme i meropeneme. Gubitak CarO porina je posljedica prekida carO gena umetanjem

insercijskih elemenata (Mussi i sur.,2005). U sojeva koji su imali epidemijski učinak vanjski

membranski proteini djeluju zajedno sa OXA genima ili proteinima koji su osjetljivi na

toplinu. No, potrebno je provesti još istraživanja kojima bi se točno razjasnila uloga porina u

rezistenciji na antibiotike (Peleg i sur., 2008).

Genom A. baumannii kodira široki spektar 'multidrug efflux' sistema (Fournier i sur.,

2006). Najbolje proučena je AdeABC pumpa iz porodice resistance-nodulation-division

(RND) pumpi (Heritier i sur., 2005). RND pumpama potrebna su dva dodatna proteina da bi

mogle normalno obavljati svoju funkciju: membranski fuzijski protein te vanjsko membranski

porin (Marchand i sur., 2004). AdeABC pumpa sadrži mjesto za supstrat koji može biti ß-

laktamat, aminoglikozid, erirtomicin, klorafenikol, tetraciklin i etidij bromid. AdeABC se

sastoji od tri komponente: AdeB je transmembranska struktura, AdeA je unutarnji

membranski fuzijski protein, a AdeC formira vanjski membranski porin (Marchand i sur.,

2004). AdeABC je kromosomski kodirana i obično je regulirana sa sustavom od dvije

komponente (senzor kinaza i pripadajući regulator odgovora). Inaktivacijom

transmembranske komponente pumpe dolazi do gubitka funkcije same pumpe i otpornosti na

antibiotike (Magnet i sur.,2001). S druge strane, kada se inaktivira gen koji kodira vanjski

membranski porin (adeC), pumpa ne gubi svoju funkciju (Slika 2) (Marchand i sur., 2004).

5 Multidrug efflux pumpe- aktivni proteinski transporteri koji se nalaze u citoplazmatskoj membrani. Veoma suspecifične i mogu ispumpati iz stanice široki spektar antibiotika, deterženata i sličnih spojeva.

9

Slika 2. Građa pumpe iz porodice RND pumpi (http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-

S1369527409000939-gr1.jpg)

10

Kinoloni

Kinoloni su skupina antibiotika čije se djelovanje temelji na inhibiciji sinteze

nukleinskih kiselina


rudente%20IRT%20-MIKRO/antibiotici.pdf). U A. baumannii su opisane mutacije gena koji

kodiraju DNA girazu i topoizomerazu IV (Hamouda i Amyes, 2004). Mutacije utječu na

prianjanje na ciljno mjesto. Slično kao i gore navedeni aminoglikozidi, i ovi kinoloni su

supstrati na 'multidrug efflux' pumpama uključujući i AdeABC pumpu (Higgins i sur., 2004).

Nemogućnost vezivanja kinolona na pumpu dovodi do stvaranja rezistencije na antibiotike

(Peleg i sur., 2008).

Polimiksini

Polimiksini djeluju na stanice na način da ometaju funkciju citoplazmatske membrane.

Iako postoje različita istraživanja i pokusi, mehanizam rezistencije A. baumannii na

polimiksine je još uvijek nepoznat (Peleg i sur., 2008).

Tetraciklini i glicilciklini

Tetraciklini i glicilciklini djeluju, baš kao i aminoglikozidi na sprečavanje sinteze

proteina


rudente%20IRT%20-MIKRO/antibiotici.pdf). Rezistentnost na tetracikline i njihove derivate

može biti posredovana ribosomalnom zaštitom (Fluit i sur., 2005). Transpozon u suradnji sa

IS elementom uzrokuje rezistentnost na tetraciklin (Ribera i sur., 2003). Ribosomalna zaštita

je posredovana tet genima (Ribeira i sur., 2003). Osim toga rezistentnost se i stvara

onemogućavanjem prianjanja tigeciklina na AdeABC pumpu (Magnet i sur., 2003).

11

KLINIČKE MANIFESTACIJE INFEKCIJA S A. BAUMANNII

Iako je dosta teško pomoću današnjih metoda sa sigurnošću odrediti koje bolesti

uzrokuje ova bakterijska vrsta, neke od njih su poznate.

Upala pluća

dobivena u bolnici

U studijama provedenim u Sjedinjenim američkim državama pokazalo se da je između

5 i 10% slučajeva upale pluća kod pacijenata na intenzivnoj njezi uzrokovano A. baumannii

(Gaynes i Edwards, 2005). Vrlo je vjerojatno da je u određenim institucijama taj broj i veći.

Obično pacijenti koji imaju infekciju A. baumannii ostaju duže na intenzivnoj njezi

(Garnacho – Montero i sur., 2005).

dobivena u interakciji s okolinom

Ova bolest je najčešća tijekom kišne sezone u tropskim područjima i to među

osobama koje imaju povijest ovisnosti o alkoholu (Anstey i sur., 2002). Ponekad se osobe s

ovakvom upalom pluća moraju primiti u bolnicu na jedinicu intenzivne njege. Karakterizira

ju nepredvidljiv klinički tijek, infekcija sekundarnog krvnog toka i smrtnost u 40 do 60%

slučajeva (Leung i sur., 2006).

Infekcije krvnog toka

U velikoj studiji bolničkih infekcija krvnog toka u Sjedinjenim državama (1995. –

2002.), A. baumannii je 10. najčešći agens, odgovoran za 1.3% svih mikrobnih bolničkih

infekcija krvnog toka (0.6 infekcija na 10000 primljenih) (Wisplinghoff i sur., 2004).

Smrtnost infekcija krvnog toka A. baumannii kod osoba na intenzivnoj njezi se kreće od 34%

do 43.4% i po tome je infekcija krvnog toka A. baumannii treća najveća po smrtnosti. A.

baumannii infekcije se najkasnije pojavljuju tijekom hospitalizacije (26 dana nakon primitka

na hospitalizaciju) (Wisplinghoff i sur., 2004).

12

Infekcija urinarnog trakta

A. baumannii ponekad uzrokuje i infekciju urinarnog trakta (UTI). Prema jednoj

studiji ova bakterija je odgovorna za 1.6% UTI-ja na intenzivnoj njezi (Gaynes i Edwards,

2005). Tipično je ova infekcija povezana sa infekcijom uzrokovanom kateterom ili

kolonizacijom (Peleg i sur., 2008).

Meningitis

Mikrobiološka epidemiologija bolničkog meningitisa uključuje Gram-negativne

patogene pa nije iznenađujuće da A .baumannii koja je otporna na niz lijekova spada među

takve uzročnike. Smrtnost uzrokovana infekcijom s A. baumannii se javlja u do 70%

slučajeva (Metan i sur., 2007).

13

MOLEKULARNE TEHNIKE ZA ANALIZU SOJEVA A.

BAUMANNII

Za kontrolu širenja A. baumannii u bolnicama, potrebno je identificirati potencijalne

spremnike organizama i načine prijenosa. Kako bi se provela identifikacija potrebno je

napraviti usporedbu izolata kod podvrsta i u nastavku je pregled tehnika koje se time bave


Analiza plazmida

Većina vrsta Acinetobactera sadrži urođene plazmide. Ova metoda je uspješna u

analizi sojeva A. baumannii. Pri analizi rezultata dobivenih ovom metodom mora se u obzir

uzeti činjenica da se plazmidi vrlo lako prenose između bakterija te da se, zbog njihove

mobilnosti, vrlo lako mogu izgubiti ili dobiti (Peleg i sur., 2008).

Ribotipizacija

Razvijena je primarno za identifikaciju acinetobaktera, posebice tragova A. baumannii

kompleksa, na razini vrste (Gerner – Smidt, 1992). Ova metoda koristi enzime EcoRI, ClaI i

SalI za restrikciju čiste kromosomalne DNA, nakon čega slijedi elektroforeza, blotting i

hibridizacija cDNA sondom označenom s digoksigenin-11-UTP-om i dobivenom od rRNA E.

coli (Griffith i sur., 2006). Ova metoda daje rezultate vrlo brzo, ali je veoma skupa i zahtjeva

specijalnu opremu koja postoji u samo nekoliko laboratorija u svijetu (Peleg i sur., 2008).

PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis)

Ovo je metoda koja se najčešće koristi. Velike DNA molekule se odvajaju pomoću

električnog polja koje periodično mijenja smjer unutar gela. Intaktna kromosomska DNA se

cijepa pomoću restrikcijskih enzima ApaI i SmaI (Bou i sur., 2000). Dobiveni kromosomski

fragmenti se razdvajaju elektroforezom i profili otisaka se uspoređuju vizualno ili koristeći

14

posebne računalne programe koji omogućuju spremanje profila otisaka u bazu podataka.

Standardizacija protokola bi omogućila rano otkrivanje početka infekcije (epidemije)

pogotovo ako su slučajevi geografski razdvojeni (Peleg i sur., 2008)

Metode tipizacije bazirane na PCR-u (eng. polymerase chainreaction)

PCR je metoda pomoću koje se kratki fragmenti DNA umnožavaju u veliki broj

identičnih kopija uz pomoć enzima DNA polimeraze (Slika 3). Ove metode tipizacije su

relativno jednostavne, brze i nisu skupe, te omogućavaju grupiranja A. baumannii sojeva sa

različitom genotipskom povezanošću. Ipak, uspješnost ove metode ne može se mjeriti sa

uspješnošću PFGE metode. Analiza sojeva PCR-om korisna je za male, lokalne - analize, ali

nije toliko prikladna za uspoređivanje sojeva koji uzrokuju epidemije na globalnoj razini


Slika 3. Način djelovanja PCR-a (http://bio-ggs.blogspot.pt/2011/01/ggs-live-polymerase-chain-reaction-

pcr.html)

15

AFLP metoda (eng. amplified fragment length polymorphism)

Ovo je metoda koja analizira raznolikost duljina fragmenata DNA koji su dobiveni

umnožavanjem PCR-om. DNA se prvo cijepa restrikcijskim enzimom, a zatim se određeni

fragmenti umnožavaju, te tek nakon toga slijedi analiza. Ovo je veoma korisno oruđe u

određivanju srodnosti, te je veoma pogodna za klasifikaciju Acinetobacter sojeva na razini

podvrste (Peleg i sur., 2008).

MLST metoda (eng. multilocus sequence typing)

MLST se koristi za tipiziranje višestrukih lokusa. Pomoću ove metode se direktno

mjere varijacije u DNA sekvencama, te se karakteriziraju sojevi pomoću njegovih

jedinstvenih profila alela. Ova metoda se dosada koristi za tipizaciju samo nekoliko sojeva A.

baumannii većinom iz španjolskih i njemačkih bolnica (Peleg i sur., 2008). Jedna od varijacije

ove metode koja se koristi je PCR-ESI-MS. PCR- ESI- MS ujedinjuje PCR sa ionizacijom i

masenom spektrometrijom te omogućuje konkretniju detekciju sojeva Acinetobactera. U

prilog ovoj metodi ide činjenica da je relativno brza (traje samo 4 sata) (Peleg i sur., 2008).

16

ZAKLJUČAK

S obzirom da su prokariotske stanice veoma sposobne i prilagodljive, bilo je potrebno

samo dvadesetak godina, od početka aktivne upotrebe antibiotika, da bi bakterije počele

pokazivati prve znakove rezistentnosti na njih. Mehanizmi rezistencije su različiti: od

transpozona i integrona pa sve do efflux pumpi. Te mehanizme razvila je i bakterija

Acinetobacter baumannii, koja trenutno izaziva veliku zabrinutost među svjetskim

znanstvenicima. U zaključak ne stavljajte literaturu

Najčešći izvori epidemija su upravo bolnice. Zbog prekomjerne i učestale upotrebe

antibiotika i dezinfekcijskih sredstava, mikroorganizmi koji se nalaze u bolnicama imaju veće

šanse za razvoj rezistencije. Samim time, farmaceutske tvrtke razvijaju snažnije i jače lijekove

širokog spektra koji su sposobni uništiti te organizme.

Kako spriječiti daljnje stvaranje rezistencije i prodor epidemija? Kao prvo, važno je za

liječnike da pažljivo biraju u kojim slučajevima će propisati određene antibiotike. Isto tako,

od iznimne je važnosti da se antibiotici širokog spektra pažljivo koriste i propisuju samo ako

je jako teško identificirati organizam-uzročnik rezistencije. Potrebno je i paziti na dozu

antibiotika i na pravilno uzimanje lijekova. Pri tome se misli da se antibiotici moraju uzimati

do kraja propisane terapije, a ne prestati uzimati čim se simptomi povuku.

U novije vrijeme započeta su intenzivna istraživanja na novim, još učinkovitijim,

antibioticima širokog spektra izoliranim iz biljaka i životinja. Isto tako, velika nada polaže se

u razvoj lijekova koji bi zapravo bile komplementarne DNA kiseline koje bi se vezale na

virulentne gene patogena te na taj način onemogućile transkripciju.

17

LITERATURA

1. Anstey N. M., Currie B. J., Hassell M., Palmer D., Dwyer B., Seifert H. 2002.

Community-acquired bacteremic Acinetobacter pneumonia in tropical Australia is

caused by diverse strains of Acinetobacter baumannii, with carriage in the throat in at-

risk groups. J. Clin. Microbiol. 40:685–686.

2. Baumann P. 1968. Isolation of Acinetobacter from soil and water. J. Bacteriol. 96:39–

42.

3. Beijerinck, M. 1911. Pigmenten als oxydatieproducten gevormd door bacterien. Versl.

Koninklijke Akad.Wetensch. Amsterdam 19:1092–1103.

4. Bou G., Cervero G., Dominguez M. A., Quereda C., Martinez-Beltran J.. 2000.

Characterization of a nosocomial outbreak caused by a multiresistant Acinetobacter

baumannii strain with a carbapenem-hydrolyzing enzyme: high-level carbapenem

resistance in A. baumannii is not due solely to the presence of beta-lactamases. J. Clin.

Microbiol. 38:3299–3305

5. Bou G., Cervero G., Dominguez M. A., Quereda C., Martinez-Beltran J.. 2000. PCR-

based DNA fingerprinting (REP-PCR, AP-PCR) and pulsed-field gel electrophoresis

characterization of a nosocomial outbreak caused by imipenem- and meropenem-

resistant Acinetobacter baumannii. Clin. Microbiol. Infect. 6:635–643.

6. Doi Y., Arakawa Y.. 2007. 16S ribosomal RNA methylation: emerging resistance

mechanism against aminoglycosides. Clin. Infect. Dis. 45:88–94.

7. Donald H. M., Scaife W., Amyes S. G., H. K. Young. 2000. Sequence analysis of

ARI-1, a novel OXA beta-lactamase, responsible for imipenem resistance in

Acinetobacter baumannii 6B92. Antimicrob. Agents Chemother. 44:196–199.

8. Erdeljić V., 2012. Utjecaj primjenjene antimikrobne terapije na selekciju

mikroorganizama koji produciraju beta-laktamaze proširenog spektra (AmpC i ESBL)

i ishod lječenja bolesnika. Doktorska disertacija, Medicinski fakultet Sveučilišta u

zagrebu, p. 146.

9. Fernandez-Cuenca F., Martinez-Martinez L., Conejo M. C., Ayala J. A., Perea E. J.,

Pascual A. 2003. Relationship between beta-lactamase production, outer membrane

protein and penicillin-binding protein profiles on the activity of carbapenems against

clinical isolates of Acinetobacter baumannii. J. Antimicrob. Chemother. 51:565–574.

18

10. Fluit A. C., Florijn A., Verhoef J., Milatovic D. 2005. Presence of tetracycline

resistance determinants and susceptibility to tigecycline and minocycline. Antimicrob.

Agents Chemother. 49:1636–1638.

11. Fournier P. E., Vallenet D., Barbe V., Audic S., Ogata H., Poirel L., Richet H., Robert

C., Mangenot S., Abergel C., Nordmann P., Weissenbach J., Raoult D., Claverie J. M.

2006. Comparative genomics of multidrug resistance in Acinetobacter baumannii.

PLoS Genet. 2:e7.

12. Garnacho-Montero J., Ortiz-Leyba C., Fernandez-Hinojosa E., Aldabo- Pallas T.,

Cayuela A., Marquez-Vacaro J. A., Garcia-Curiel A., Jimenez-Jimenez F. J.. 2005.

Acinetobacter baumannii ventilator-associated pneumonia: epidemiological and

clinical findings. Intensive Care Med. 31:649–655.

13. Garrity G.M., Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., 2005. Bergey’s manual of

systematic bacteriology, Volume 2, Part B. Springer, New York, p. 425-437

14. Gaynes R., Edwards J. R. 2005. Overview of nosocomial infections caused by gram-

negative bacilli. Clin. Infect. Dis. 41:848–854.

15. Gerner-Smidt P. 1992. Ribotyping of the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter

baumannii complex. J. Clin.Microbiol. 30:2680–2685.

16. Girlich D., Naas T., Leelaporn A., Poirel L., Fennewald M., Nordmann P. 2002.

Nosocomial spread of the integron-located veb-1-like cassette encoding an extended-

spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa in Thailand. Clin. Infect. Dis.

34:603–611.

17. Griffith M. E., Ceremuga J. M., Ellis M. W., Guymon C. H., Hospenthal D. R.,

Murray C. K. 2006. Acinetobacter skin colonization of US army soldiers. Infect.

Control Hosp. Epidemiol. 27:659–661.

18. Gu B., Tong M., Zhao W., Liu G., Ning M., Pan S., Zhao W. 2007. Prevalence and

characterization of class I integrons among Pseudomonas aeruginosa and

Acinetobacter baumannii isolates from patients in Nanjing, China. J. Clin. Microbiol.

45:241–243.

19. Hamouda A., Amyes S. G. 2004. Novel gyrA and parC point mutations in two strains

of Acinetobacter baumannii resistant to ciprofloxacin. J. Antimicrob. Chemother.

54:695–696.

20. Heritier C., Poirel L., Aubert D., Nordmann P. 2003. Genetic and functional analysis

of the chromosome-encoded carbapenem-hydrolyzing oxacillinase OXA-40 of

Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. 47:268–273.

19

21. Heritier C., Poirel L., Lambert T., Nordmann P. 2005. Contribution of acquired

carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter

baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. 49:3198–3202

22. Heritier C., Poirel L., Nordmann P.. 2006. Cephalosporinase overexpression resulting

from insertion of ISAba1 in Acinetobacter baumannii. Clin. Microbiol. Infect. 12:123–

130.

23. Higgins P. G., Wisplinghoff H., Stefanik D., Seifert H. 2004. Selection of

topoisomerase mutations and overexpression of adeB mRNA transcripts during an

outbreak of Acinetobacter baumannii. J. Antimicrob. Chemother. 54:821–823.

24. Hujer K. M., Hamza N. S., Hujer A. M., Perez F., Helfand M. S., Bethel C. R.,

Thomson J. M., Anderson V. E., Barlow M., Rice L. B., Tenover F. C., Bonomo R.

A.. 2005. Identification of a new allelic variant of the Acinetobacter baumannii

cephalosporinase, ADC-7 beta-lactamase: defining a unique family of class C

enzymes. Antimicrob. Agents Chemother. 49:2941–2948.

25. Lee K., Lee W. G., Uh Y., Ha G. Y., Cho J., Chong Y. 2003. VIM- and IMP-type

metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. in

Korean hospitals. Emerg. Infect. Dis. 9:868–871.

26. Lee K., Yong D., Yum J. H., Lim Y. S., Bolmstrom A., Qwarnstrom A., Karlsson A.,

Chong Y. 2005. Evaluation of Etest MBL for detection of blaIMP-1 and blaVIM-2

allele-positive clinical isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J. Clin.

Microbiol. 43:942–944.

27. Leung W. S., Chu C. M., Tsang K. Y., Lo F. H., Lo K. F., Ho P. L. 2006. Fulminant

community-acquired Acinetobacter baumannii pneumonia as a distinct clinical

syndrome. Chest 129:102–109.

28. Magnet S., Courvalin P., Lambert T. 2001. Resistance-nodulation-cell division-type

efflux pump involved in aminoglycoside resistance in Acinetobacter baumannii strain

BM4454. Antimicrob. Agents Chemother. 45:3375–3380.

29. Marchand I., Damier-Piolle L., Courvalin P., Lambert T. 2004. Expression of the

RND-type efflux pump AdeABC in Acinetobacter baumannii is regulated by the

AdeRS two-component system. Antimicrob. Agents Chemother. 48:3298–3304.

30. Metan G., Alp E., Aygen B., Sumerkan B. 2007. Acinetobacter baumannii meningitis

in post-neurosurgical patients: clinical outcome and impact of carbapenem resistance.

J. Antimicrob. Chemother. 60:197–199.

20

31. Mussi M. A., Limansky A. S., Viale A. M. 2005. Acquisition of resistance to

carbapenems in multidrug-resistant clinical strains of Acinetobacter baumannii:

natural insertional inactivation of a gene encoding a member of a novel family of beta-

barrel outer membrane proteins. Antimicrob. Agents Chemother. 49:1432–1440.

32. Paton R., Miles R. S., Hood J., Amyes S. G. B. 1993. ARI-1: β-lactamase-mediated

imipenem resistance in Acinetobacter baumannii. Int. J. Antimicrob. Agents 2:81–88.

33. Peleg A. Y., Bell J. M., Hofmeyr A., Wiese P. 2006. Inter-country transfer of gram-

negative organisms carrying the VIM-4 and OXA-58 carbapenem-hydrolysing

enzymes. J. Antimicrob. Chemother. 57:794–795.

34. Peleg A. Y., Seifert H., Paterson D.L. 2008. Acinetobacter baumannii: Emergence of a

Successful Pathogen. Clin Microbiol Rev. 21, 538-582.

35. Poirel L., Nordmann P. 2006. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii:

mechanisms and epidemiology. Clin. Microbiol. Infect. 12:826–836.

36. Queenan A. M., Bush K. 2007. Carbapenemases: the versatile betalactamases. Clin.

Microbiol. Rev. 20:440–458.

37. Ribera A., Roca I., Ruiz J., Gibert I., Vila J. 2003. Partial characterization of a

transposon containing the tet(A) determinant in a clinical isolate of Acinetobacter

baumannii. J. Antimicrob. Chemother. 52:477–480.

38. Ribera A., Ruiz J., Vila J. 2003. Presence of the Tet M determinant in a clinical isolate

of Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. 47:2310–2312.

39. Rossau R., Van Landschoot A., Gillis M., De Ley J. 1991. Taxonomy of

Moraxellaceae fam. nov., a new bacterial family to accomodate the genera Moraxella,

Acinetobacter, and Psychrobacter and related organisms. Int. J. Syst. Bacteriol.

41:310–319.

40. Turton J. F., Ward M. E., Woodford N., Kaufmann M. E., Pike R., Livermore D. M.,

Pitt T. L. 2006. The role of ISAba1 in expression of OXA carbapenemase genes in

Acinetobacter baumannii. FEMS Microbiol. Lett. 258:72–77.

41. Wisplinghoff H., Bischoff T., Tallent S. M., Seifert H., Wenzel R. P., Edmond M. B.

2004. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals:analysis of 24,179 cases

from a prospective nationwide surveillance study. Clin. Infect. Dis. 39:309–317.

42. http://sharepoint.zvu.hr/katedre/319/Nastavni%20matrijali/IRT%20STUDIJ/pdf.%20z

a%20srudente%20IRT%20-MIKRO/antibiotici.pdf

43. http://www.scfbio-iitd.res.in/tutorial/orf.html

44. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1286457906000505

21

SAŽETAK

Acinetobacter baumannii su gram negativne, katalaza pozitivne i strogo aerobne

bakterije koje su razvile visoku rezistenciju na gotovo sve grupe antibiotika. Imaju veliku

sposobnost brze prilagodbe na okolišni stres, te upravo stoga i predstavljaju sve veću

prijetnju. Mehanizmi rezistencije se većinom temelje na pokretnim genskim elementima:

transpozonima, integronima i 'insertion sequence' elementima. Oni pomažu u stvaranju

rezistencije na sljedeće antibiotike: aminoglikozide, ß-laktame, kinolone, polimiksine,

tetracikline i glicilcikline.

Osim ovih mehanizama, u radu su opisane i molekularne metode analize i detekcije

sojeva A. baumannii (analiza plazmida, ribotipizacija, metode temeljene na PCR-u, PFGE,

AFLP i MLST metoda), te kliničke manifestacije infekcija sa gore navedenom bakterijom

(upala pluća, infekcije krvnog toka i urinarnog trakta, meningitis).

SUMMARY

Acinetobacter baumannii are gram-negative, catalase-positive and strictly aerobic

bacteria who have developed high resistance on almost every type of antibiotic. They have

high ability for adaption on enviromental stress and, because of this, they present big threat in

health institutions. Resistance mechanisms are mostly based on mobile genetic elements:

transposons, integrons and insertion sequence elements. They are helping in creation of

resistance at different types of antibiotics: aminoglycosides, ß-lactams, quinolones,

polymyxins, tetracyclines and glycylcyclines.

Except this mechanisms, in this work are described methods for moleclar analysis and

detection of A.baumannii strains (plasmid analysis, ribotyping, PCR-based typing methods,

PFGE, AFLP and MLST). Also, there is short reference to clinical manifestations of

A.baumannii infections.

mechanisms of antibiotic resistance in bacteria ...seminarski rad barbara skender preddiplomski...

Documents