martínez-ezquerro y herrera, cancerología 1 (2006): 83-96...

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ANGIOGÉNESIS:VEGF/VEGFRs como

Blancos Terapéuticos en elTratamiento Contra el Cáncer

José Darío Martínez-Ezquerro1,2 y Luis A. Herrera1* 1 Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas.2 Taller de Biología Molecular del Cáncer, Facultad de Ciencias, UNAM.

Abstract•

Angiogenesis is a process that involves the growth of new blood vessels from pre-exist-ing vasculature. Angiogenesis is a normal pro-cess in growth and development, as well as in wound healing. However, this is also a funda-mental step in the transition of tumors from a dormant state to a malignant state. Angiogen-esis begins with degradation of the basement membrane, followed by migration of endo-thelial cells out of the vessel. These cells then form into a tube which `sprouts’ from the old capillary and is extended further as the cells behind the leading tip begin to proliferate. The tips of such tubes can branch and eventually join up with other sprouts to form a closed loop through which blood can flow. Vascular endothelial growth factor, or VEGF, is the key signal used to promote growth of blood ves-sels. It binds to specialized receptors on the surfaces of endothelial cells and directs them to build new vessels. In this paper we have re-viewed the important role angiogenesis plays in malignant tumors development via VEGF and VEGF receptor, with special interest in metastasis and therapeutic strategies targeting these signal transduction pathways.

Key words: Angiogenesis, VEGF, VEGFR

Resumen•

EL TÉRMINO ANGIOGÉNESIS se refiere al proceso que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vas-culatura pre-existente. El proceso de la an-

giogénesis incluye la migración y proliferación de células endoteliales, la formación y organización de grupos celulares en estructuras tubulares que eventualmente se unirán, para finalmente madurar en vasos sanguíneos estables. Actualmente se recono-ce al sistema que incluye al factor de crecimiento vascular endotelial y a sus receptores como los principales reguladores de la formación de vasos sanguíneos. La finalidad de esta revisión es expo-ner el papel crucial de la angiogénesis, a través de las vías de señalización del factor de crecimiento endotelial vascular y su receptor, en el desarrollo del cáncer, especialmente durante la formación de metástasis, además de las estrategias terapéuticas cuyo blanco son estas vías de señalización, con la finalidad de inhibir la angiogénesis.

Palabras Clave: Angiogénesis, VEGF, VEGFR

•Correspondencia a:Luis A. Herrera MontalvoInstituto Nacional de Cancero-logía, Subdirección de Investiga-ción Básica. Av. San Fernando 22, Col. Sección XVI. CP 14080. Del. Tlalpan. México, D.F.

e-Mail: [email protected]

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Introducción•

Todas las células eucariontes requieren del sumi-nistro constante de oxígeno y nutrientes. Inver-tebrados como Caenorhabditis elegans (gusano) y Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) afron-tan esta situación tomando ventaja de la capaci-dad de difusión del oxígeno, logrando llegar a todas las células del cuerpo sin la necesidad de un sistema de entrega específico (1). Durante la evolución surgió en los vertebrados un sistema de circulación cerrado para resolver el problema de entrega de requerimientos ocasio-nado por el aumento de tamaño, debido a que la difusión del oxígeno no logra alcanzar a todas las células del embrión o animal en crecimiento. Me-diante este sistema vascular especializado se logró la remoción exitosa de desperdicios metabólicos y el suministro tanto de oxígeno como de nutrientes a tejidos y órganos distantes en el cuerpo (1,2). Existen distintos procesos relacionados que impli-can el crecimiento endotelial vascular que no se-rán discutidos en esta revisión pero que requieren ser distinguidos de la angiogénesis, objetivo prin-cipal de este artículo. Estos procesos son primero, la linfangiogénesis o formación de nuevos vasos linfá-ticos (1); segundo, la arteriogénesis o formación de nuevas arterias y, finalmente, la vasculogénesis que generalmente hace referencia a la formación de novo de vasos sanguíneos que ocurre en el desarrollo tem-prano del embrión a partir de células precursoras, aunque hallazgos recientes muestran que bajo circuns-tancias específicas, las células precursoras (tanto de médula ósea como de la sangre) pudieran contribuir también en la angiogénesis adulta (3).

La finalidad de esta revisión es exponer el papel crucial de la angiogénesis, a través de las vías de señalización del factor de crecimiento endotelial vascular y su receptor (VEGF/VEGFR), en el de-sarrollo del cáncer, especialmente durante la for-mación de metástasis, además de las estrategias terapéuticas cuyo blanco son estas vías de señali-zación, con la finalidad de inhibir la angiogénesis.

Angiogénesis•

El término angiogénesis se refiere al proceso que conduce a la formación de nuevos vasos sanguí-neos a partir de la vasculatura pre-existente (3; Figura 1). El proceso de pasos múltiples de la an-giogénesis incluye la migración y proliferación de células endoteliales (ECs), la formación y organi-zación de grupos celulares en estructuras tubulares que eventualmente se unirán, para finalmente ma-durar en vasos sanguíneos estables (4).

La angiogénesis se lleva a cabo principalmente por los siguientes pasos (1,5; Fig. 2): (a) las ECs precursoras dan origen a los vasos sanguíneos; (b) las ECs se ensamblan formando un laberinto vascular primitivo de capilares pequeños (vascu-logénesis); (c) el plexo vascular se expande de manera progresiva debido al nacimiento de los vasos; (d) el cual se remodela formando un red vascular altamente organizada de vasos grandes que se ramifican en vasos pequeños; (e) los cana-les recién formados por ECs, son cubiertos por pericitos y células de múscu-lo liso, las cuales regulan la

Figura 1•

Angiogénesis: crecimiento de nuevos vasos a partir de los ya existentes Aunque actualmente el concepto abarca el remodelaje de la red inicial de vasos sanguí-neos formada durante la embriogénesis.

85VEGF/VEGFRs como Blancos Terapéuticos

contracción y dilatación de los vasos sanguíneos, proporcionando resistencia y permitiendo la re-gulación de la perfusión de los vasos.

Se pueden distinguir dos tipos de angiogénesis, la angiogénesis fisiológica/normal y la angiogénesis patológica/anormal. La primera, ocurre durante el crecimiento necesario de vasculatura que comienza en la embriogénesis y que continúa después del na-cimiento en el desarrollo temprano postnatal, para

proveer de manera adecuada el oxígeno y los nu-trientes requeridos por los órganos en crecimiento (6), además de proporcionar señales promotoras morfológicas (5) y siendo fundamental para la for-mación de hueso endocondral y el crecimiento del esqueleto (7). A lo largo del desarrollo así como en la etapa adulta, la angiogénesis fisiológica ocurre únicamente en el ovario en mujeres menstruantes, debido a que el crecimiento folicular y el desarrollo del cuerpo lúteo dependen de la proliferación de nuevos vasos capilares, y en la placenta durante el embarazo; también está presente en algunos de los vasos sanguíneos que permanecieron quies-centes y que pueden reactivarse durante la re-paración y cicatrización de heridas (1, 3). Este mecanismo fisiológico implica una estructura y funcionamiento jerárquico bien ordenado de la vasculatura corporal. La segunda aparece cuando se alcanza y sobrepasa el umbral entre los estimuladores e inhibidores an-giogénicos. Se pueden distinguir dos tipos

de angiogénesis patológica: ‘angiogénesis activada’ y ‘angiogénesis inhibida’, dependiendo de los niveles dominantes de moléculas pro- o anti-angiogénicas, respectivamente (6; Cuadro I). Existen diversas condi-ciones asociadas a la ‘angiogénesis activada’ como las enfermedades malignas, además de estar implicada en obesidad, asma, diabetes, cirrosis, esclerosis múl-tiple, endometriosis, SIDA, infecciones bacterianas y enfermedades auto-inmunes (1, 7). Por el contrario, cuando el interruptor de la angiogénesis se encuen-

Figura 2•

DEGRADACIÓN DE LA MATRIZ EXTRACELULAR.

Cuadro I•

TIPOS DE ANGIOGÉNESIS PATOLÓGICA


tra apagado o es insuficiente como en el caso de enfermedad isquémica cardiaca o de pre-eclampsia, la ‘angiogénesis inhibida’ está asociada al mal funcio-namiento de ECs, a la regresión o malformación de los vasos, además de prevenir la revascularización, cicatrización y regeneración (1).

Además del VEGF, existen distintas moléculas im-plicadas en la regulación positiva de la angiogénesis, incluyendo al factor ácido de crecimiento de fibro-blastos (aFGF), FGF básico, factor de crecimiento transformante alfa (TGF-α) y TGF-β, factor de cre-cimiento de hepatocitos (HGF), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), angiogenina, interleucina 8 (IL-8) y las angiopoietinas (Ang-1 y -2) (8), fac-tor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), VEGF derivado de la glándula endócrina (EG-VEGF), leptina, las prostaglandinas, lípidos, entre otros, algunos de ellos como el TGF-α y bFGF, ac-tuando al menos en parte, regulando la expresión del VEGF (3). En este artículo, nos enfocaremos exclusivamente en el VEGF debido a su participa-ción crucial en los procesos angiogénicos.

VEGF•

Actualmente se reconoce al sistema que incluye al VEGF y sus receptores como el principal regulador de las ECs vasculares y de la formación de vasos san-guíneos (6, 9). El VEGF es un factor de crecimiento con actividad mitogénica altamente específica para las ECs; es miembro de la súper familia de genes VEGF-PDGF que incluye al VEGF-A, -B, -C, -D y –E, así como al factor de crecimiento de placenta (PIGF) (2,3, 10). El VEGF fue identificado en los años 80s como un factor de permeabilidad vascular (VPF) y como un factor de crecimiento específico de ECs vasculares codificado por el gen VEGF, por lo que ha sido referido como VEGF, VEGF/VPF o simplemente VPF (2; Figura 3).

El VEGF activo está compuesto por dos subunida-des idénticas. La unión a su receptor es mediada por el homodímero a través de la unión del núcleo de la proteína; la modulación de la actividad del VEGF está dada por la unión a heparina, que resul-

ta en una mayor eficiencia de la actividad de cinasa (11) y a carbohidratos en la superficie celular, con los dominios que se extienden a partir del núcleo del VEGF, los cuales son de distintos tamaños de-pendiendo de la isoforma de esta proteína (12).

El VEGF responde a varios estímulos tales como hi-poxia/isquemia principalmente mediante el factor inducible de hipoxia 1 (HIF-1), a distintos factores de crecimiento (EGF, TGF-α y -β, KGF o factor de cre-cimiento derivado de queratinocitos, IGF-1 o factor de crecimiento insulínico tipo 1, FGF y PDGF), a oncogenes activados (por ejemplo Ras) así como a distintas citosinas (IL-1-α y IL-6), p53 mutado, estró-geno y óxido nítrico (NO). Mediante estos estímulos se aumenta la expresión del VEGF (2, 13) resultando en la inducción de proliferación de ECs derivadas de las arterias, venas y vasos linfáticos (7) así como en la proliferación de algunos tipos celulares no endo-teliales (14); además, el VEGF promueve la migra-ción celular e inhibe la apoptosis (15), incrementa la conductividad hidráulica de microvasos aislados y vasodilatación, como resultado del NO deriva-do de ECs (7), promueve la angiogénesis y la per-meabilización de los vasos sanguíneos y participa en la vasculogénesis (13) y en la linfangiogénesis (16). Cuando su regulación es normal, el VEGF contribuye al remodelamiento vascular durante el ciclo ovárico y la implantación embriónica, a la cicatrización y repara-ción, mientras que cuando es inadecuada, este factor contribuye al desarrollo de tumores sólidos al promo-ver la angiogénesis, además de participar en distintas condiciones como la psoriasis, artritis reumatoide, re-tinopatía diabética y diabetes mellitus (6, 13).

VEGF-A. Es el miembro principal y más estudia-do de esta familia de genes, el cual es codificado por un solo gen organizado en ocho exones se-parados por siete intrones, siendo una glicopro-teína homodimérica de 45 KDa (7). El VEGF-A emplea sitios de unión simétricos en cada polo del dímero para unirse tanto al VEGFR-1 como al VE-GFR-2 y puede inducir heterodímeros entre estos dos receptores (10). Hasta el momento se han reportado seis isoformas del VEGF en seres hu-manos las cuales contienen 121, 145, 165, 183,


189 y 206 residuos de aminoácidos, generados como resultado del procesamiento alternativo del RNAm (7, 13), que difieren tanto en su masa molecular como en sus propiedades biológicas. Las distintas isoformas del VEGF-A incrementan la permeabilidad vascular, estimulan la prolifera-ción y migración de ECs, proveen a dichas células con señales de supervivencia y anti-senescencia, además de promover neuroprotección en desór-denes isquémicos (3). El VEGF-A165 es la isofor-ma predominante del VEGF-A, es una molécula cargada positivamente que se une a la heparina, por otro lado, el VEGF-A145 y el VEGF-A183 son las variantes menos frecuentes. Las propiedades de las distintas isoformas del VEGF-A difieren en-tre sí. El VEGF-A165 es la isoforma más común y

estudiada, además de ser el transductor de seña-les más fuerte entre los distintos tipos del VEGF; fue originalmente descubierto como un potente factor de permeabilización vascular (3), esta iso-forma es principalmente secretada; sin embargo, una fracción significativa permanece unida a la superficie celular y a la matriz extracelular. Ade-más de unirse al VEGFR-2, esta proteína puede unirse a la neuropilina 1 (NRP-1), incrementan-do su afinidad al receptor VEGFR-2 hasta 10 ve-ces, aproximadamente (2). El VEGF-A121 es una proteína soluble que no se une a la heparina y que difunde libremente en los tejidos, sirviendo como una señal guía de larga distancia para la migración direccional. El VEGF-A189 es una pro-teína unida a la matriz extracelular que se une a la heparina con mayor fuerza que el VEGF-A165 y funciona en la atracción celular en un rango de acción corto. Finalmente, la isoforma 206 se

Figura 3•

TIPOS DE VEGF Y RECEPTORES


encuentra casi completamente secuestrada en la matriz extracelular y su función se desconoce hasta el momento (3, 7).

VEGF-B. Se conocen dos isoformas, el VEGF-B167 y el VEGF-B186, cada una con 167 y 186 residuos de aminoácidos, respectivamente. La expresión del VEGF-B no es regulada por hipoxia y estimula la pro-liferación celular ligeramente; es un ligando tanto para el VEGFR-1 como para la NRP-1 y se expresa en dis-tintos tejidos humanos normales, principalmente en el miocardio en desarrollo, además de expresarse en tumores humanos benignos y malignos (13).

VEGF-C. Es un potente factor de permeabilidad, aunque 4-5 veces menor que el VEGF-A, y se sintetiza como un dímero pre-péptido (proteínas que requieren procesamiento post-traduccional) con un tamaño de 61 KDa por subunidad, que mediante la maduración proteolítica forma un ho-modímero de 21 KDa. Tanto las formas maduras del VEGF-C como las parcialmente procesadas se unen al VEGFR-3 con gran afinidad, mientras que solo las formas completamente procesadas se unen al VEGFR-2. Este factor estimula la migración y proliferación de ECs; su unión al VEGFR-3 regula la señalización del VEGFR-2 actuando de manera sinérgica con el VEGF-A. Además, está asociado a las células neuroendócrinas (NE) aunque sin par-ticipación aparente en el desarrollo de la vascula-tura del sistema neuroendócrino (13).

VEGF-D. Es un mitógeno para las ECs y un ligando tanto para el VEGFR-2 como para el VEGFR-3. Este factor es un compuesto linfangiogénico de menor potencia que el VEGF-C, que parece estar sub-ex-presado durante el desarrollo, así como después de la organogénesis. Al igual que el VEGF-C, esta proteí-na se encuentra asociada con las células NE (13).

Tanto el VEGF-C como el -D, son elementos esenciales para el desarrollo del sistema linfáti-co y pueden inducir la angiogénesis y aumentar la permeabilidad vascular; ambas moléculas son sintetizadas como pre-proteínas que requieren de procesamiento post-traduccional (3).

VEGF-E. Fue descubierto en el genoma del pa-rapoxivirus Orf (cepa NZ-7), que es un virus de cadena lineal doble de DNA que causa dermatitis pustular contagiosa en ovejas, cabras y ocasional-mente en seres humanos, histológicamente carac-terizada por lesiones vasculares y edematosas (4, 17). Este miembro de la familia del VEGF también referido como VEGForf que carece del dominio de unión a heparina encontrado en el VEGF-A, se une y activa específicamente al VEGFR-2 (2), resultando en un efecto mitogénico y en actividad de permeabilidad vascular similar al producido por el VEGF-A165 (4), aunque hasta el momento se desconocen los residuos de aminoácidos que me-dian esta unión (18). Además, induce la expresión del factor tisular (TF) y la angiogénesis (14). In-teresantemente, el VEGF-E contiene un dominio carboxi-terminal rico en treonina y prolina cuya función se desconoce y el cual no se encuentra en ninguna otra forma del VEGF de mamíferos (17). Por otro lado, la cepa NZ2 expresa otra proteí-na tipo VEGF llamada ORFV2-VEGF o VEGForf2, con una potencia mitogénica entre 4-5 veces me-nor que la del VEGF-A165 (4).

Receptores del VEGF•

El proceso de señalización que resulta en la angio-génesis se encuentra mediado por uniones de alta afinidad de los VEGFs con receptores específicos de actividad tirosina cinasa (RTKs) (10; Figura 3), localizados tanto en la superficie de las ECs vascu-lares y en células derivadas de la médula ósea (7), como en forma soluble en circulación (2, 3, 10).

Todas las isoformas del VEGF son capaces de unir-se a alguno de estos tres receptores: VEGFR-1 (también conocido como Flt-1), VEGFR-2 (KDR o Flk-1) (13) y/o VEGFR-3 (Flt-4) (7, 10); estos receptores contienen siete dominios homólogos a inmunoglobulina (Ig) en su parte extracelular, una región transmembranal, un dominio yuxtamem-branal y un dominio intracelular de señalización tirosina cinasa interrumpido por un inserto de ci-nasa de 69 aminoácidos y la región carboxi-termi-nal (4, 7, 10). El segundo y tercer dominio de Ig


representa la región de unión al ligando, mientras que las regiones del cuarto al séptimo dominio de Ig son esenciales para la dimerización del recep-tor (2). Además, algunos VEGFs que se unen al VEGFR-1 y/o VEGFR-2 también pueden unirse a co-receptores como las neuropilinas (NRPs) (19), mediante secuencias específicas en el extremo car-boxilo y, a otros receptores de la superficie celular, por vías distintas a las de los dominios de unión a la heparina (10). Al igual que otros RTKs, los VE-GFRs se dimerizan y experimentan trans-autofos-forilación con la unión al ligando, desencadenando una cascada de señalización fosforilando distintas proteínas, como la proteína cinasa-C (PKC), fosfo-lipasa C-gamma (PLC-γ), fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K), sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS) y el blanco de rapamicina en mamíferos (mTOR), regulando mecanismos involucrados en angiogé-nesis, activados por el VEGF (3).

VEGFR-1. Fue el primer receptor identificado de alta afinidad para el VEGF (2) pero su función pre-cisa continúa bajo debate, principalmente debido a las distintas propiedades que pueden encontrarse, dependiendo de la etapa del desarrollo y el tipo celular (7), por ejemplo inhibiendo y promoviendo quimiotaxis, actuando como un receptor dual: po-sitivamente, como el Flt-1 en la superficie celular, y/o negativamente, como el Flt-1 soluble (sFlt). El VEGFR-1 es una glicoproteína transmembranal de 180 KDa cuyo RNAm puede ser cortado y empal-mado, produciendo una proteína más corta (sFlt) con únicamente seis dominios extracelulares de Ig, la cual se encuentra presente en el suero y mantiene la actividad de unión al VEGF-A y PlGF, funcionando así como un regulador negativo de estas proteínas, al secuestrar y suprimir sus niveles fisiológicos (2, 3, 10). En contraste, el VEGFR-1 de la superficie celular se une al VEGF-A, VEGF-B y PlGF-1 y -2 (3) resultando en la activación de la PI3K y otras pro-teínas de transducción de señales (20); sin embargo, también se ha reportado que por la vía selectiva del Flt, el VEGF es incapaz de generar una señal mito-génica (18). El VEGFR-1 se encuentra expresado principalmente en las ECs, aunque también se en-cuentra en células trofoblásticas, monocitos, células

renales mesangiales, células del músculo liso uterino y en distintos tipos celulares tumorales. La transcrip-ción del VEGFR-1 es aumentada por la hipoxia y, aunque probablemente no induce proliferación ce-lular debido a que las proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPKs) no son activadas por este recep-tor, sí promueve la generación de proteasas como la metaloproteasa de matriz extracelular 9 (MMP-9), las cuales son requeridas para la degradación de la membrana basal de los vasos sanguíneos en las eta-pas iniciales de la angiogénesis (3, 13, 18).

VEGFR-2. Fue el segundo receptor del VEGF en ser identificado. Es una proteína de 230 KDa (10) de la cual se conocen dos variantes funcionales producto del procesamiento del RNAm (21). Este receptor se une a VEGF-A y a formas maduras del VEGF-C y –D (3). Únicamente la forma glicosilada final del VEGFR-2 es capaz de autofosforilarse en respuesta al VEGF (13) y participa de manera cru-cial en la angiogénesis en el desarrollo y la hema-topoyesis, siendo el mayor mediador de los efec-tos mitogénicos, angiogénicos y de aumento de la permeabilidad del VEGF; además, cuando es acti-vado por el VEGF, resulta en una respuesta migra-toria celular (7, 13, 18). El VEGFR-2 se encuentra expresado principalmente en las ECs, además de células madre hematopoyéticas, megacariocitos y células progenitoras retinales. Aunque la produc-ción de este receptor aumenta bajo condiciones de hipoxia, esta no es su principal inductora, se propone que un mecanismo post-transcripcional pudiera ser el responsable de su sobre-expresión (13). Su activación por fosforilación vía el VEGF, resulta en la activación de las MAPKs por la fos-forilación de las tirosinas de la vía del PI3K-PLC-γ-PKC, sin emplear la activación de la vía de Ras (2, 13, 18). Interesantemente, la activación del VEGFR-2 aumenta y activa la sintetasa endotelial de óxido nítrico (eNOS), un mecanismo impor-tante a considerar, tomando en cuenta que el NO juega un papel crucial en la proliferación de ECs, migración celular, formación de tubo, aumento de la permeabilidad vascular, hipotensión y angiogé-nesis inducidas por el VEGF. La activación de este receptor es suficiente para la activación de trans-


ductores de señales involucrados en la mitogénesis y migración celular, así como en la maquinaria an-giogénica y la permeabilidad vascular (18).

VEGFR-3. Es un receptor tirosina cinasa de su-perficie celular altamente glicosilado y relativa-mente estable de 180 KDa aproximadamente. Actualmente se conocen dos formas transcritas que difieren entre sí por sus extremos carboxilo (13); la forma predominante en los tejidos, co-rresponde a un transcrito de 5.8 Kb, mientras que la variante alternativa consta de 4.5 Kb. Des-pués de la biosíntesis, la forma glicosilada del VE-GFR-3 de 195 KDa, es cortada proteolíticamente en el quinto dominio de Ig, aunque las cadenas resultantes de 120 KDa y 75 KDa, permanecen unidas por un enlace disulfuro (10). El VEGFR-3 y sus ligandos (las formas no procesadas del VEGF-C y –D), están involucrados en la linfan-giogénesis, al igual que en la angiogénesis (2, 3) y en la migración celular (18), a pesar de que el VEGF-A no se une a este receptor. El VEGFR-3 se expresa en las ECs vasculares en las etapas tempranas del desarrollo, mientras que después de la organogénesis permanece restringido a las ECs linfáticas; además, se puede sobre-expresar tanto en tumores vasculares benignos como ma-lignos de niños y adultos. Este receptor se en-cuentra activado en los capilares sanguíneos de reciente formación que rodean a los tumores sólidos, siendo importante tanto para la génesis de la neo-vascularización inducida por el tumor, como para el mantenimiento del recubrimiento de las ECs durante la angiogénesis tumoral (13).

NRP-1 y NRP-2. Las neuropilinas son receptores glicoprotéicos sin actividad de cinasa ubicados en la superficie celular, que se unen a las colapsinas/semaforinas (proteínas implicadas en la señaliza-ción para la guía neuronal), PlGF-2, VEGF-A165, VEGF-B y VEGF-E (3, 10, 19). La Nrp-1 de 130-135 KDa (4) contiene solo una cola intracitoplásmica corta y se sugiere que aumenta la unión del VEGF-A165 con el VEGFR-2, actuando a manera de co-receptor; sin embargo, no existe evidencia de que las NRPs señalen después de unirse al VEGF (7).

Por sí misma, la Nrp-1 puede mediar la señaliza-ción que resulta en migración celular, aunque no en proliferación. Al igual que el VEGFR-2, la Nrp-1 se encuentra particularmente expresada en algunas células tumorales, además de ECs, probablemente estimulando el crecimiento y la migración de la célula tumoral (3, 4). Interesantemente, la unión tanto de la NRP1 como de la NRP2 con las sema-forinas, activa la señal de repulsión del axón (7).

Angiogénesis en Cáncer y Metástasis•

Teniendo en cuenta que el oxígeno debe ser distri-buido por la sangre a todas las células del cuerpo de un organismo, es necesario que las células es-tén localizadas (por lo menos en los vertebrados) entre 100 a 200 μm de un vaso sanguíneo para poder sobrevivir (22, 23), por lo que si un grupo de células tumorales necesita evadir la inanición, requieren promover el proceso normal de la an-giogénesis para formar su propia fuente sanguínea mediante el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos y así, superar la falta de distribución de oxígeno y nutrientes y evadir una muerte certera (12, 24). Esta activación de la angiogénesis conduce a la neo-vascularización del tumor, dando como resultado su crecimiento rápido (22). En contraste, los tumo-res latentes no tienen la capacidad de expandirse más allá de un tamaño microscópico menor a 0.5 mm (25). Se ha propuesto el bloqueo de la angiogé-nesis como el mecanismo para explicar este com-portamiento, ya que se ha observado que pueden permanecer latentes por meses, hasta que ocurre la activación de la angiogénesis (25) cuando los reguladores pro-angiogénicos sobrepasan el ba-lance contra los reguladores anti-angiogénicos. De hecho, la angiogénesis no participa en la carcinogé-nesis pero si promueve la progresión tumoral (1) y es un elemento esencial para la formación de me-tástasis al proveer un sitio de entrada a la circula-ción de los vasos sanguíneos, así como de oxígeno y nutrientes por la neo-angiogénesis (24). Además, el tumor puede secretar factores que promueven reacciones linfáticas de manera similar a la pro-ducción de factores angiogénicos, influyendo en


la ruta de diseminación metastásica dado que los vasos linfáticos pueden ser invadidos por las células tumorales; de hecho, para los patólogos, tanto la invasión vascular como la linfática son factores pro-nóstico en las enfermedades malignas (13).

Considerando lo anterior, queda claro que el blo-queo de la angiogénesis es actualmente considera-do como una estrategia clave para atacar el cre-cimiento tumoral y el desarrollo de metástasis. A continuación se mencionarán las principales estrate-gias anti-angiogénicas diseñadas hasta la fecha.

Potencial Terapéuticode la Angiogénesis•

En los años 70s, Judah Folkman comenzó una nueva carrera en contra del cáncer, al hipotetizar que si el

tumor requería de la neo-angiogénesis para poder crecer más allá de 1-2 mm entonces, al inhibir la angiogénesis, la expansión tumoral debería regresar por lo menos a un tamaño de 1-2 mm (24, 26).

Tomando en cuenta que distintas condiciones es-tán caracterizadas por un aumento o disminución de la angiogénesis como en cáncer, desórdenes oculares, articulares y de la piel, o en tejidos is-quémicos, respectivamente (1), como resultado del sistema de activación/inactivación que involu-cra a los VEGFs/VEGFRs, el desarrollo de agen-tes farmacológicos que inhiben o promueven la angiogénesis, hace a este sistema particularmente conveniente para su intervención en la búsqueda de resultados terapéuticos eficientes.

En general, los distintos y ampliamente aceptados esfuerzos realizados para solucionar la lista crecien-te de desórdenes angiogénicos pueden dividirse en: estrategias anti-angiogénicas, que buscan la inhibición de la angiogénesis y pro-angiogénicas, que promue-van el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos.

Estrategia Anti-Angiogénica•

El VEGF y sus receptores juegan un pa-pel fundamental en distintas condicio-nes como en cáncer y metástasis, por

lo que su inactivación resulta conveniente dentro de las estrategias anti-angiogénicas

en el cáncer (Figura 4). Las ECs son el principal blanco de esta estrate-

gia porque, en teoría, su estabilidad genómica no les permitiría adquirir

resistencia a las in-tervenciones anti-angiogénicas. Sin

embargo, distintas estra-tegias adicionales se están enfocando en otros tipos celulares no endoteliales que afectan la angiogé-nesis, por lo menos in-directamente (1), para

Figura 4•

TERAPIA ANTI-ANGIOGÉNICA


arrestar la proliferación de las ECs, prevenir el cre-cimiento de los vasos e inducir la regresión de vasos pre-existentes. Estas estrategias pueden dividirse de la siguiente manera:

Anticuerpos para el VEGF o inhibidores del VEGF. En virtud de que el VEGF es uno de los fac-tores clave en la promoción de la angiogénesis, se han llevado a cabo distintos esfuerzos para inhibir-lo, mediante anticuerpos. En el 2004 se aprobaron los siguientes compuestos inhibidores del VEGF: el avastin (bevacizumab), que es un anticuerpo mono-clonal recombinante humanizado contra el VEGF-A165 (rhu Mab VEGF), así como el pegaptinib, un aptámero que bloquea al mismo factor, para el tratamiento de cáncer colorectal metastásico en combinación con regimenes de quimioterapia ba-sada en 5-fluorouracilo y, el ranibizumab, que es un fragmento molecular de un anticuerpo monoclonal (Fab) que neutraliza a todas las isoformas del VEGF, para el tratamiento de la forma húmeda (neo-vas-cular) de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) (26). Con respecto a los resultados obtenidos con avastin, se ha visto que no provee beneficios al ser suministrado como monoterapia, mientras que cuando se combina con la terapia convencional sensibiliza y aumenta la eficacia de esta al inducir citotoxicidad en algunas células ma-lignas, activar respuestas inmunes anti-tumorales y suprimir la actividad pro-angiogénica de células he-matopoyéticas (1). Sin embargo, se ha encontrado también que las estrategias que emplean anticuer-pos anti-VEGF no siempre previenen el crecimiento de tumores sólidos (13), probablemente debido a la dificultad para bloquear todos los VEGF circulan-tes (4). Por otro lado, los VEGF-C y –D median la diseminación metastásica cuando son liberados por las células tumorales (27), por lo que resulta impor-tante analizar si la inhibición de estos factores tiene beneficios terapéuticos en pacientes con cáncer. Anticuerpos contra VEGFRs. La señalización del VEGFR-1 ha sido ligada a la inducción de MMP9 y a la facilitación de la metástasis por lo que es con-siderado como un blanco de inhibición en la tera-peútica anti-tumoral (7). De hecho, se ha observado

que los anticuerpos monoclonales anti-VEGFR-2 como el DC101 pueden inhibir la angiogénesis y el crecimiento de distintos xenotransplantes tumorales humanos (32); por otra parte, el anticuerpo quimé-rico c-p1C11, que está dirigido contra los VEGFR-2 de superficie celular y solubles, se encuentra bajo evaluación clínica (4). Debido a que el VEGFR-3 se encuentra expresado ampliamente en la mayo-ría de los tumores vasculares humanos benignos y malignos, y es frecuentemente sobre-expresado durante la transformación tumoral, pero ausente en tumores no-endoteliales pero si en angiosarcomas, lo hace ser un marcador útil en la identificación his-toquímica de neoplasias endoteliales humanas, todo esto hace de este receptor un candidato importante como un potencial blanco terapéutico anti-angiogé-nesis/linfangiogénesis contra el desarrollo tumoral. Esta propuesta se sustenta por estudios en los que la inactivación del VEGFR-3 mediante el bloqueo por anticuerpos monoclonales, suprime el crecimiento tumoral al inhibir la neo-angiogénesis en tejidos con tumor (13). Sin embargo, también se ha visto que el empleo de vatalanib, el cual bloquea al VEGFR-1, -2 y -3, no muestra un aumento sustancial benéfico con la quimioterapia convencional (1).

Señuelos solubles. Aprovechando la actividad de unión del VEGF y PlGF al sFlt, se han dise-ñado estrategias que emplean VEGFRs solubles que secuestran a sus ligandos, evitando la unión a sus receptores de membrana, demostrando que son capaces de suprimir el crecimiento tumoral y la vascularización (33). Sin embargo, en esta estrategia se debe tener en cuenta que el exceso de neutralización del VEGF o PlGF por los sFlt está implicado en distintos desórdenes como la disfunción endotelial en la pre-eclampsia (7).

Moléculas pequeñas inhibidoras de VEGF-RTKs. Se han desarrollado distintas moléculas que reconocen e inhiben a los receptores tirosina cinasa, con la finalidad de detener el crecimiento tumoral, al bloquear la cascada de señalización de los VEGFRs. Algunas de estas moléculas in-hibidoras que han sido analizadas en protocolos clínicos fase II/III (26), incluyen al SU6668 que


bloquea tanto al VEGFR-2 como al PDGFR-β (2, 28), SU11248 o malato de sunitinib, que inter-fiere con el VEGFR-2, PDGFR, c-kit y Flt-3 (29), Bay 43-9006 o sorafenib, que bloquea al VEGFR-2 y -3 (26), además de PTK787/ZK 222584 o vatalanib (30), ZD4190 (4) y AG-013736 (26) que bloquean a los VEGFR-1 y -2. Por otro lado, se ha investigado la posibilidad del empleo de ribozimas que bloquean específicamente al VE-GFR-1. De hecho, en ensayos clínicos de fase I la angiozima ha demostrado ser bien tolerada sin conocerse aún sus beneficios terapéuticos (4).

Esteroides angiostáticos. Algunos esteriodes in-cluyendo a la progestina, acetato de medroxiproges-terona y glucocorticoides como la dexametasona y cortisona fueron las primeras moléculas reconoci-das en contar con actividad anti-angiogénica (31); algunos metabolitos de los corticoesteroides como el tetrahidrocortisol han mostrado también activi-dad anti-angiogénica y han guiado el camino para el descubrimiento de otros inhibidores endógenos (25). Otro esteroide, la escualamina, interrumpe significativamente la proliferación y progresión tu-moral en estudios in vitro, mientras que en estudios pre-clínicos, ha mostrado beneficios aditivos en el retraso del crecimiento tumoral al combinarse con cis-platino, paclitaxel, ciclofosfamida, genisteína o radioterapia. Sin embargo, el único esteroide anti-angiogénico que ha sido evaluado en estudios clíni-cos es la medroxiprogesterona (31).

Inhibidores endógenos. Consisten de fragmentos de proteínas grandes, que pueden actuar como in-hibidores endógenos de la angiogénesis a manera de precursores latentes activados por la proteólisis, únicamente cuando son requeridos (24, 26), por ejemplo la angiostatina, que resulta de la degra-dación de plasminógeno, la endostatina que es un fragmento críptico de la colágena XVIII y, otros inhi-bidores endógenos de la matriz extracelular como la tumstatina, vasostatina y vasoinhibina (25, 26).

Inhibidores de metaloproteinasas. Todos los miembros de la familia de los inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMPs) inhiben la angiogé-

nesis, así como el crecimiento tumoral y la me-tástasis. Se ha observado en estudios pre-clínicos que el BB94 y batimastat, inhibidores sintéticos de proteasas, resultan en anti-angiogénesis, inhibición del crecimiento tumoral y actividad anti-metastási-ca (24), sin embargo, esta estrategia ha tenido una eficacia pobre y con efectos secundarios (28).

Modificadores de la respuesta biológica. Son sustancias sintéticas como el interferón-α (citosina) que se han utilizado para tratar distintos tumores, empleando su capacidad para estimular al sistema inmune y afectar el suministro sanguíneo (25).

Péptidos anti-adhesivos. Anticuerpos que re-conocen a la integrina así como péptidos antago-nistas, han mostrado la capacidad de bloquear la interacción de las integrinas con sus ligandos en la matriz extracelular (24). La vitaxina, es un an-ticuerpo dirigido contra la molécula de adhesión integrina α-v-β-3 y ha sido evaluado en ensayos clínicos fase I en los que se demostró estabilización e incluso regresión tumoral en más del 50% de los pacientes sin presentar efectos secundarios adver-sos. Actualmente se llevan a cabo estudios clínicos de fase II en distintos tumores sólidos (4).

Otros agentes. Los oligonucleótidos antisentido (7), así como anticuerpos de fragmento variable de una sola cadena (scFv), inmunotoxinas, inmu-noliposomas (4), anticuerpos fúngicos como la fumagilina y sus análogos sintéticos como el TNP-470, e inhibidores de canales de calcio que blo-quean la proliferación y migración de las células tumorales, así como el carboxiamidotriazol (CAI), que inhibe la angiogénesis (24), han sido utilizados exitosamente contra el crecimiento tumoral, prin-cipalmente al inhibir la actividad angiogénica. Por lo tanto, este tipo de estrategias tienen un poten-cial considerable para su futura aplicación clínica.

Estrategias combinatorias. Como ya hemos revi-sado, el dirigir las estrategias contra el VEGF, aunque es el principal factor angiogénico, por sí sólo no es suficiente para erradicar tumores malignos debido a que muchos factores angiogénicos además de éste,


contribuyen para el cambio hacia la angiogénesis patológica (1). Para atacar este problema, se han realizado distintos esfuerzos que combinan estrate-gias, obteniendo así efectos anti-tumorales mayores al combinar por ejemplo la terapia antiangiogénica particularmente contra el VEGFR y VEGFR-2 con la radioterapia así como quimioterapia, respectiva-mente (7). Además, la intervención de otras cé-lulas pro-angiogénicas como las células murales, células del estroma y hematopoyéticas podría mejo-rar en un futuro el desempeño de las estrategias anti-angiogénicas al incrementar la eficacia y disminuir la resistencia a la inhibición de la angiogénesis (1).

Afortunadamente, los efectos adversos de la tera-pia anti-angiogénica reportados en ratones, no han ocurrido en humanos; sin embargo, el riesgo es permanente, por lo que los futuros estudios deben tomar en cuenta distintos factores que podrían influir en la presencia de dichos efectos como la predispo-sición genética o el tratamiento farmacológico (1). En el trabajo de G. Semenza publicado en el 2003 (22), se publicó una lista de los distintos inhibidores de angiogénesis y de la transducción de señales que bloquean la angiogénesis indirectamente, y que han sido probados en ensayos clínicos.

Concusión•

Actualmente solo hay 18 inhibidores de la angio-génesis sometidos a evaluación clínica en la base

de datos del National Cancer Institute (http://www.cancer.gov/clinicaltrials), por lo que se ne-cesita realizar un mayor esfuerzo en la investigación de terapias anti- y pro-angiogénicas, además del análisis de nuevas estrategias combinatorias que logren evadir la resistencia adquirida a los inhibido-res angiogénicos reportada en algunas estrategias de terapia anti-angiogénica. Probablemente, este esfuerzo desemboque en estrategias sinergísticas con resultados más eficientes, como aquellos en los que se ha observado una regresión tumoral completa al combinar la angiostatina y endostati-na (34), o bien inducir a que los tumores regresen a tamaños en los que ya no dependan del incre-mento vascular (24), ya sea mediante el uso de agentes citotóxicos o no. La exploración de otras estrategias que involucran a compuestos naturales que inhiben la angiogénesis como los del té verde (35) y principios activos obtenidos de distintos extrac-tos medicinales herbales (36); así como del empleo de métodos poco invasivos y económicos como lo es el análisis de los ácidos nucléicos circulantes, para el diagnóstico, pronóstico y monitoreo de distintas condiciones (36-41) servirán en un futuro como parte de la estrategia global dirigida contra la erradicación del cáncer.

Agradecimientos:

M. en C. Lucía Taja Chayeb por sus comentarios críticos a este trabajo.


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