UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA

UNIDAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

FACULTAD DE MEDICINA

Manual de laboratorio de Bioquímica

Elaborado por Dra. Martha Teresa García López Portillo Docente de asignatura de Bioquímica

Nombre del alumno: ___________________________________________________ Grupo:_________________ Subgrupo:________________

2020-1

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Índice de prácticas de laboratorio

Nombre de la práctica Calificación Página

Normas de bioseguridad 4

Material y equipo de laboratorio 6

Agua y soluciones 8

pH y amortiguadores 11

Toma de muestra 13

Aminoácidos y proteínas 18

Determinación cuantitativa de hemoglobina en sangre total

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Metabolismo de los carbohidratos 24

Metabolismo de los lípidos 30

Metabolismo de los compuestos nitrogenados 35

Seminario de Integración metabólica

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Reglamento

1. Asistir a las prácticas de laboratorio con puntualidad.

2. Llevar zapato cerrado y cabello recogido.

3. Uso de bata de manga larga al ingreso del laboratorio.

4. Lavarse las manos al ingresar al laboratorio, durante los procesos que lo requieran y antes

de salir del laboratorio

5. Uso de guantes y lentes de seguridad cuando el procedimiento lo requiera.

6. Asistir a las prácticas en actitud ética, de colaboración y respeto.

7. Imprimir el manual de laboratorio, leer la practica antes de la misma y hacer sus

anotaciones y cálculos en el manual.

8. Si no se asiste a la práctica no tendrá derecho a entregar el reporte, por lo que la

calificación será 0%. En caso de presentar un justificante se le dará la oportunidad de

realizar la practica en otra fecha, la cual será asignada por el docente.

9. Entregar el reporte de la práctica, en tiempo y forma, este deberá incluir la conclusión de

cada uno de los integrantes del equipo. Si no entrega reporte o falta su conclusión, la

calificación será del 5 % siendo la calificación máxima de las practicas 15%.

10. Al abandonar el laboratorio deberá dejar su área de trabajo limpia, su material lavado y

acomodado.

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Práctica 1 Normas de bioseguridad

Objetivo general: Conocer las normas básicas de seguridad en el laboratorio de bioquímica

Objetivos específicos: 1. Conocer las normas de bioseguridad general 2. Conocer las medidas generales de protección 3. Conocer las medidas de seguridad para el manejo de muestras biológicas

Fundamento: La bioseguridad son todos los procedimientos y acciones que garantizan una mejor calidad de vida, tanto del profesional, del paciente y del medio ambiente.

Es un conjunto de medidas y normas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos frente a riesgos propios de su actividad diaria, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la seguridad de los trabajadores de la salud, pacientes, visitantes y el medio ambiente. Por tal motivo todas las instituciones de salud deben establecer un PROGRAMA DE BIOSEGURIDAD.

La implementación de los programas de bioseguridad en los organismos de salud surgió por el Centro de Control de Enfermedades (C.D.C.) de Atlanta (USA), en 1987, a través de un grupo de expertos quienes estaban preocupados en desarrollar guías para prevenir el V.I.H. entre el personal de salud, es así como establecen las normas o precauciones universales destinadas a proteger a toda persona que está en riesgo de infectarse con sustancias contaminadas con sangre del paciente portador de V.I.H. virus de la Hepatitis B, virus de la Hepatitis C, entre otros. Las precauciones universales parten del siguiente principio:“Todos los pacientes y sus fluidos corporales independientemente del diagnóstico de ingreso o motivo por el cual haya entrado al hospital o clínica deberán ser considerados como

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potencialmente infectantes y se deben tomar las precauciones necesarias para prevenir que ocurra transmisión”

PROCEDIMIENTO:

Compartir y discutir las normas de bioseguridad establecidas para el uso del laboratorio de bioquímica básica.

RESULTADOS: Que el alumno comprenda las medidas que deberá implementar en su trabajo en el laboratorio.

Incluir en el reporte de práctica las reglas de bioseguridad que se aplicaran durante el trabajo en el laboratorio de bioquímica.

Actividades de aprendizaje: 1. Leer completas las NOM-017-STPS-2008 y NOM-087-ECOL-SSA1-2002 y elaborar un

resumen con lo más importante. 2. Investigar y dibujar el símbolo de RPBI, que significan sus siglas, realizar un esquema de

cada uno de los contenedores y especificar su uso. 3. ¿Qué es un agente patógeno? 4. ¿Qué es una infección nosocomial y cómo se producen? 5. ¿Qué enfermedades se pueden adquirir por un punzocortante no desechado

apropiadamente? 6. Elaborar una conclusión de la práctica. 7. Bibliografía

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Práctica 2 Material y equipo de laboratorio

Objetivo general: Manejar adecuadamente el material y equipo de laboratorio

Objetivos específicos: 1. Identificar los materiales y equipos de uso común en el laboratorio 2. Utilizar de manera apropiada algunos de los equipos de laboratorio Introducción La comprensión de los conocimientos teóricos aprendidos en clase se logra mediante la realización de prácticas de laboratorio en que se requiere familiaridad con la utilidad y manejo apropiado del equipo de laboratorio, como el espectrofotómetro, centrífuga, potenciómetro, baños de temperatura constante, placa caliente, agitador magnético, material de vidrio, entre otros. Asimismo, el estudiante debe emplear el vocabulario apropiado y los conceptos de uso común en el laboratorio. Centrifugación. La centrifugación es un método empleado para separar partículas con base en la velocidad de sedimentación de cada una de ellas, como resultado de la fuerza centrífuga a la que se les somete. Espectrofotometría. La gran mayoría de métodos utilizados en el análisis de muestras de sangre, orina, L.C.R. (Líquido Céfalo Raquídeo), se basan en las reacciones de los componentes con reactivos especiales que forman complejos coloreados, cuya concentración puede ser conocida comparándola con patrones o estándares. La intensidad del color es medida en un aparato especial llamado espectrofotómetro el cual registra la intensidad de la luz transmitida o absorbida por las soluciones coloreadas. Es preciso conocer las leyes físicas en se se basan los instrumentos de medición. Ley de Lambert-Beer. Cuando se pasa un rayo de luz monocromática de intensidad inicial I0 a través de una solución en un recipiente transparente, parte de la luz es absorbida de manera que la intensidad de la luz transmitida I es menor que I0. La relación entre I e I0 depende de la longitud del medio

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absorbente, l, y de la concentración de la solución absorbente, c. Estos factores se hallan relacionados en la ley de Lambert y de Beer.

Actividades de aprendizaje: 1. Investigar el fundamento de la centrifugación y las partes de una centrífuga. 2. Investigar la utilidad y los componentes de un espectofotómetro 3. Investigar el espectro completo de la luz (ultravioleta, visible e infrarroja) 4. Investigar la utilidad de una báscula de bioimpedanciometría 5. Investigar la clasificación de los materiales de vidrio utilizados en el laboratorio de

bioquímica 6. Investigar qué otros métodos se utilizan para cuantificar el porcentaje y la distribución de

grasa corporal. 7. Investigar los daños que genera la luz ultravioleta 8. Investigar si la luz ultravioleta se utiliza para el tratamiento de algunas enfermedades.

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Práctica 3 Agua y soluciones

Objetivo general: Realizar cálculos para la preparación de soluciones porcentuales, molares y normales.

FUNDAMENTO: Una de las prácticas más comunes es la preparación de soluciones generalmente liquidas a partir de productos comerciales

Una solución es una mezcla homogénea de un soluto (sustancia que se disuelve un compuesto químico determinado) en un solvente (sustancia en la cual se disuelve un soluto, estos componentes pueden estar en estado sólido, liquido o gaseoso. El componente que determina el estado de la solución, es aquel que se encuentra en mayor proporción.

Existen diferentes formas de expresar la concentración de soluciones, entre las más usadas se encuentran:

Molaridad (M) Es el número de moles de soluto que hay disueltos en un litro de disolución: M=moles/volumen sus unidades son: mol/L

Soluciones porcentuales

Estas soluciones están expresadas en unidades físicas, es decir en la que solo dependerán de la concentración del soluto y el solvente.Estas soluciones nos indican la cantidad de soluto disuelto en 100 partes de solución. Las soluciones porcentuales se las puede expresar de la siguiente manera: 1. Porcentaje masa/masa ó peso a peso (% m/m ó p/p) 2. Porcentaje masa/volumen (% m/V) 3. Porcentaje volumen/volumen (% V/V)

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Dilución seriada Una dilución en serie constituye una sucesión de diluciones en las que van siendo subsecuentemente menos concentradas que su anterior. En un sistema de n diluciones en serie, la concentración de soluto en cada dilución sucesiva que es de 1/n de la anterior. Generalmente en las técnicas serológicas se efectúan al doble, es decir, que cada dilución tiene la mitad de la anterior. Pero para otras aplicaciones se puede elegir el factor de dilución de la muestra, este se obtiene dividiendo el volumen final al cual se lleva una dilución, dividido entre el tamaño de la alícuota. El factor de dilución es el numero por el cual se debe multiplicar la concentración de un soluto en una solución diluida, para reproducir la concentración de la muestra original.

Factor de dilución = Volumen total/Volumen de alícuota MATERIAL: -Gradillas -Pipetas semiautomáticas -Puntillas -Balanza granataria -Matraz Erlenmeyer -Probetas -Espátula -Vidrio de reloj -Parrilla eléctrica con agitador -Magneto REACTIVOS Cloruro de Sodio Azul de metileno Agua PROCEDIMIENTO Describa los cálculos y el procedimiento para preparar las siguientes soluciones: Prepare ____ mL de una solución 0.8M de NaCl. Prepare _____ mL de NaCl al 3.8% Prepare 5 tubos de una dilución seriada utilizando un Factor de dilución de _____, y un volumen final de____, anote cual es la dilución final de cada tubo haciendo un esquema del proceso que realizo. Describa el procedimiento que realizo para llevar a cabo cada una de las soluciones de los puntos 1, 2 y 3.

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Actividades de aprendizaje: 1. Investigar los tipos de soluciones 2. Investigar las propiedades de las soluciones 3. Investigar la composición en miliequivalentes de la solución salina a 0.9%, glucosa a 5%,

Hartman, Ringer, solución mixta (NaCl/glucosa) y registrarla en un cuadro 4. Calcular la osmolaridad de las soluciones del punto 3. 5. Resuelva los siguientes problemas:

1. ¿Cuántos gramos de NaOH se necesitan para preparar 250 mL de una solución al 55%?

2. Prepare 350 mL de una solución al 15% de NaOH. 3. Prepare 150 mL de una solución 2.4 M de NaCl.

6. Conclusión 7. Bibliografía

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Práctica 4 pH y soluciones

Objetivo general: Analizar las propiedades de soluciones ácidas y básicas

Objetivos específicos: • Medir el pH de diferentes sustancias

• Evaluar la capacidad amortiguadora de líquidos biológicos

Muestras proporcionadas por el alumno: Saliva. Jugo de naranja Yogurt Orina Agua Sudor Melox Leche Peptobismol Refresco claro Refresco oscuro

Actividades de aprendizaje 1. Investigar la composición promedio de las siguientes soluciones y cuál de esos compuestos

contribuye más al pH de la solución.

SOLUCIÓN COMPOSICIÓN

Saliva

Orina

Sudor

Leche

Refresco oscuro

Refresco claro

Jugo

SOLUCIÓN

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2. ¿Qué pH tiene la mayor parte de las sustancias estudiadas en este experimento? 3. Investigar la utilidad práctica de los siguientes compuestos y márcalos en el siguiente cuadro:

4. Investigar cuáles enfermedades tienen relación con el pH 5. Explicar la diferencia entre un sistema amortiguador y el de una sustancia con propiedad antiácida. 6. Conclusión 7. Bibliografía

Yogurt

Solución de jabón

Agua

COMPOSICIÓNSOLUCIÓN

Compuesto Antiácido Amortiguador Efecto sistémico

Bicarbonato de sodio

Hidróxido de magnesio

Hidróxido de aluminio

Subsalicilato de bismuto

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Práctica 5 Toma de muestras biológicas

Objetivo general: Obtención de una muestra de sangre Objetivos específicos: 1. Conocer los aspectos éticos en la toma de muestras biológicas. 2. Conocer la composición de la sangre 3. Identificar los diferentes tubos utilizados en los análisis clínicos y los anticoagulantes

utilizados. FUNDAMENTO:

La sangre contiene diferentes tipos de células dentro de un líquido transparente llamado plasma. La sangre transporta los elementos nutritivos (absorbidos por un sistema digestivo) y las hormonas (segregadas por sus glándulas) a las células de todo el cuerpo. También transporta los desperdicios a su sistema excretor (el que elimina lo que su cuerpo no necesita). De este modo, una vez que contrae una infección, la sangre puede transportar también los microbios a través de todo su cuerpo. Para una gran cantidad de estudios que requieren muestras sanguíneas, se deben conservar condiciones de ayuno. En algunos casos, el ayuno debe prolongarse como mínimo seis (6) horas y en ocasiones durante doce (12) horas. Algunos no requieren ayuno y se pueden practicar en cualquier momento En cualquiera de los casos, deben seguirse las siguientes indicaciones generales, a saber: La sangre debe recolectarse en tubos de vidrio o plástico estériles (preferiblemente tubos al vacío). En caso de recolectar la sangre con jeringa y agujas estériles, deben llenarse los tubos con precisión y agilidad, evitando en todo momento realizar procedimientos bruscos que puedan producir rompimiento de las células sanguíneas (hemólisis). Al recolectar la sangre, debe permitirse que se coagule, si es el caso, o someter los tubos con la muestra a ciertas maniobras recomendadas para evitar su coagulación.

Técnica de venopunción

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Por lo general se prefiere sangre venosa para la mayor parte de exámenes, y es recomendable obtener una mayor cantidad en caso de que se requiera repetir la prueba. Es común que se emplee una vena del brazo: se aplica un torniquete para bloquear la circulación venosa, se selecciona alguna vena adecuada por su calibre y prominencia y se limpia la piel con una torunda con alcohol, una vez que el alcohol se ha evaporado, se introduce la aguja con su jeringa estéril, con el bisel hacia arriba y en un ángulo de 45º, enseguida se tira del émbolo de la jeringa para que la sangre penetre a ésta. En cuanto se ha obtenido una cantidad suficiente, se libera la presión ejercida sobre el brazo y se extrae la aguja. Se aplica una torunda estéril en el sitio de la punción y se ejerce presión firme durante medio minuto para evitar escurrimiento de la sangre en tejidos circunvecinos. Anticoagulantes Existen múltiples factores involucrados en el proceso de coagulación de la sangre. Los anticoagulantes son sustancias que previenen la formación de coágulos. Existen diferentes tipos de ellos en polvo o líquidos. Deben seleccionarse siempre el anticoagulante apropiado según el estudio que se quiera realizar. Existen códigos de colores internacionalmente conocidos, para las diferentes presentaciones de tubos colectores de muestras sanguíneas:

Tapa roja……………………. Sin anticoagulante (Tubo seco). Tapa amarilla…………………Sin anticoagulante, pero con gel Tapa violeta…………………. Con EDTA (Ácido etilendiaminotetracético). Tapa azul …………………… Con CITRATO DE SODIO Tapa verde (o blanca) ………. Con HEPARINA.

MATERIAL: -Bandeja. -Algodón. -Antiséptico. -Jeringa (según cantidad de muestra), -Aguja -Ligadura. -Guantes. -Tubos de recogida de muestras. -Impreso de petición de analítica.

PROCEDIMIENTO 1. Revisar solicitud de laboratorio 2. Seleccionar material apropiado para la toma de muestras

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3. Etiquetar los tubos con nombre y fecha del paciente 4. Identificación positiva del paciente. Se le preguntará ¿cómo se llama? 5. Comprobar que el paciente esté en ayunas si así se requiere 6. Explicar el procedimiento al paciente. 7. Sentar o acostar al paciente. 8. Lavado de manos. 9. Colocarse los guantes. 10. Colocar la ligadura entre 7,5 cm o 10 cm por encima del punto de punción. 11. Localizar la vena, suéltelo y póngalo de nuevo pasados 3 minutos. 12. Colocar el brazo extendido, de manera que la mano esté más baja que el codo; si es

necesario 13. Seleccionar la vena por palpación cuidadosamente Las venas más utilizadas para la venopunción se localizan en el área antecubital:

a) vena cubital: es la más larga y gruesa de todas y es la preferida por bordear la musculatura del brazo. b) vena cefálica: tiene las mismas características que la anterior, pero es un poco menos gruesa. c) Vena basílica: es más pequeña que las anteriores. Esta vena está cerca de la arteria braquial.

La palpación se hará con el dedo índice, palpando con suavidad y firmeza. Las venas tienen una consistencia esponjosa y rebotará bajo la presión del dedo. Las arterias se encuentran a

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mayor profundidad y palpitan; los tendones están duros, son como cuerdas, resistentes a la presión Antes de elegir una vena hay que ver su tamaño, dirección y profundidad. Con la experiencia se desarrolla un buen sentido del tacto para escoger la más adecuada. Desinfectar la zona elegida: Limpieza con alcohol u otro antiséptico para evitar la contaminación bacteriana o química. Debe hacerse con una torunda en forma circular, desde dentro hacia fuera. Dejar secar el alcohol o secarlo antes de puncionar; ya que si se deja húmeda el paciente sentirá quemazón durante la punción y si el alcohol penetra en el sistema de extracción de sangre se producirá una hemólisis que alterará los resultados. Si tiene que volver a palpar la vena, limpie su dedo con alcohol, pero no toque la zona de punción. Rompa el sello de la funda de la aguja e insértela con un giro en el receptáculo hasta el tope si usa sistema vacutainer. Si usa jeringa, encaje la aguja firmemente. En ambos casos compruebe que la aguja no contenga bordes ásperos o toscos, pero nunca la toque. Inmovilice la vena seleccionada colocando el pulgar debajo de la zona de punción y tense la piel; así se impide que la vena se escurra en el momento de la punción, el resto de los dedos se ponen detrás del codo para evitar que éste se doble o prevenir cualquier movimiento. Con el bisel hacia arriba puncione la piel con un suave y rápido movimiento. La pared superior de la vena debe ser puncionada y el bisel debe quedar en el interior de la vena; cuando la aguja está asegurada se conecta el primer tubo o se aspira para que la sangre fluya; una vez que empiece a salir soltar el torniquete. Si se usa sistema de vacío se encajará el tubo en el extremo y éste se llenará inmediatamente de sangre con un volumen hasta agotar el vacío del tubo. El tubo no se llenará nunca en su totalidad. El orden a la hora de extraer las muestras es el siguiente: 1º muestras esterilizadas (hemocultivos). 2ª muestras puras sin aditivos. 3º muestras con aditivos. Todos los tubos con anticoagulante hay que agitarlos suavemente invirtiendo los tubos 4 veces. Si se hace muy fuerte o muchas veces se puede producir hemólisis y si no lo hacemos suficientemente producirá coagulación Una vez llenado todos los tubos (sistema de vacío) o la jeringa, retiraremos la aguja, con un movimiento rápido y suave hacia atrás y se aprieta la zona con el fin de evitar la formación de un hematoma. La presión en la zona se hará durante más de cinco minutos o el tiempo necesario según el tipo de paciente, manteniendo recto el brazo.

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-Se retira todo el material, colocando cada uno en el contenedor correspondiente. -Se despide al paciente.

Actividades de aprendizaje: 1. Investiga la composición de la sangre 2. ¿Cuál es la diferencia entre suero y plasma? 3. ¿Qué son el EDTA, citrato de sodio y heparina?, en qué pruebas se utiliza cada uno y por

qué 4. Dibuja los diferentes tipos de tubos que se utilizan para hacer análisis clínicos,

especificando para qué prueba sirve cada uno y si tienen algún tipo de anticoagulante. 5. Conclusión 6. Bibliografía

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Práctica 6 Aminoácidos y proteínas

Objetivo general: Realizar pruebas de laboratorio que permitan el estudio de las propiedades físicoquímicas de aminoácidos y proteínas, además de su identificación. Objetivo específico: Utilizar técnicas analíticas que permitan la identificación de aminoácidos en general, aminoácidos específicos y proteínas, en cualquier espécimen biológico. Desarrollo experimental Experimento 1: Determinación de proteínas totales Prueba de Biuret Fundamento. Sirve para investigar la presencia de enlaces peptídicos. Se basa en la formación de sales complejas de color violeta cuando se añade sulfato cúprico en solución alcalina. El complejo esta formado por enlaces de coordinación, en que los pares electrónicos proceden de los grupos camino de los residuos de la cadena polipeptídica. La prueba de Biuret permite determinar las proteínas totales del suero.

MATERIALES Y REACTIVOS.

• Tubos de ensayo.

• Pipetas de 1 mL, 5 mL.

• Espectrofotómetro. • Solución Estándar de Proteínas totales (7.0 g/dL).

• Solución del Reactivo de Proteínas totales.

• Agua destilada.

• Suero.

PROCEDIMIENTO: 1. Coloque 1 mL de reactivo de proteínas totales en tubos etiquetados como blanco, problema

y estándar.

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2. Adicione 0.01 mL de la muestra (suero) dentro del tubo apropiadamente etiquetado como problema y mezcle.

3. En el tubo del estándar adicione 0.01 mL de la solución estándar a una concentración de 8.0 g/dL y mezcle.

4. En el tubo etiquetado como blanco de reactivo, adicione 0.05 mL de agua destilada, mezcle y utilice a este tubo para calibrar a cero de absorbancia.

5. Repose las muestras por 5 minutos a temperatura ambiente (15-30 °C). 6. Ajuste el instrumento a cero de absorbancia a 550 nm, usando el blanco de reactivo. 7. Lea y registre los valores de absorbancia, del estándar y del problema. Las muestras

deberán ser leídas dentro de 60 minutos después de desarrollado el color.

CÁLCULOS: [Proteínas totales] = (Lectura del problema) (Conc. del estándar) / Lectura del estándar.

Experimento 2: Relación entre albúmina y globulina (A:G) La albúmina reacciona de manera específica con el colorante verde de bromocresol, por el método llamado “error proteico de los indicadores”, formando una coloración verde proporcional a la concentración de la fracción de albúmina, que puede medirse con un espectrofotómetro. Las globulinas se calculan a partir de la diferencia entre la cantidad de proteínas totales y la fracción de albúmina. MATERIALES Y REACTIVOS: • Suero o plasma del voluntario • Suero control

• Solución de verde de bromocresol

• Agua destilada

PROCEDIMIENTO:

1. Coloque 1.0 mL del reactivo de albúmina (BCG) dentro de tubos etiquetados como: blanco, estándar y muestra.

2. En el tubo apropiadamente etiquetado como muestra coloque 0.01 mL de la muestra (suero) y mezcle bien.

3. En el tubo blanco de reactivo utilice 0.01 mL de agua destilada. 4. En el tubo del estándar adicione 0.01 mL de la solución estándar a una concentración

de 5.0 g/dL y mezcle. 5. Dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos. 6. Ajuste a cero de absorbancia a 630 nm con el blanco de reactivo.

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7. Lea y registre las absorbancias para el estándar y el problema.

CÁLCULOS: Albúmina (g/100ml)= Absorbancia del problema ( Con. del patrón)/ absorbancia del patrón

RESULTADOS:

Valores normales de referencia: Proteínas totales: 6 a 8 g por 100 ml Albúmina: 3.5 a 5.5 g por 100 ml Globulinas: 1.5 a 2.5 g por 100 mlInterpretación de resultados:

Actividades de aprendizaje: 1. Nombrar los 10 aminoácidos esenciales2. Investigar algunos alimentos, en especial de origen vegetal, que no aporten alguno de los

aminoácidos esenciales.3. Investigar la estructura y función de la albúmina4. Investigar la relación de la albúmina con el edema5. Investigar las causas de hipoalbuminemia6. Investiga cuáles son las proteínas plasmáticas7. Investiga 3 patologías ocasionadas por deficiencias en las enzimas metabolizadoras de los

aminoácidos.8. Conclusión 9. Bibliografía

PACIENTE P. TOTALES ALBUMINA GLOBULINAS RELACION A/G

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Práctica 7

Determinación cuantitativa de hemoglobina en sangre total OBJETIVOS:

• Conocer los límites normales de la concentración sanguínea de hemoglobina en el hombre y la mujer.

• Conocer los diferentes tipos de hemoglobina en el organismo humano y saber diferenciar la estructura de cada una de ellas.

• Conocer las consecuencias clínicas debidas a un nivel inferior y superior con respecto a la concentración normal de hemoglobina en el organismo.

• Relacionar los resultados de laboratorio con alteraciones funcionales en el organismo humano.

INTRODUCCIÓN

La hemoglobina es la proteína principal de los eritrocitos que funciona como acarreadora de oxígeno desde los pulmones hasta los tejidos metabolicamente activos. Mientras que en músculo esquelético una proteína análoga, la mioglobina, actúa como almacenador del oxígeno absorbido de la sangre y lo libera, cuando se necesita, al sitio intracelular de oxidación, la mitocondria. La capacidad del transporte de oxígeno depende, entre otros factores, de la presencia de hierro ferroso en la molécula del grupo hem; la deficiencia de hierro se asocia con la deficiente síntesis del hem, y los síntomas de la anemia obedecen a la anoxia de los tejidos. El total del hierro orgánico es de unos 50 a 70 mmol (3 a 4 g). Alrededor del 70 % del hierro está circulando en la hemoglobina eritrocitaria. El 25 % del hierro total esta almacenado en el sistema reticuloendotelial, sobre todo en el hígado, bazo y medula ósea, unido a las proteínas formando la ferritina y la hemosiderina. El hierro almacenado en las células reticuloendoteliales de la medula ósea actúa como reserva para la eritropoyesis.

El hierro es absorbido por un proceso activo en el intestino delgado proximal y pasa rápidamente al plasma. El hierro puede cruzar las membranas celulares, incluidas las intestinales, únicamente por transporte activo en la forma ferrosa; en este estado reducido se halla en la oxihemoglobina y

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en la hemoglobina “reducida”. En el interior de la célula intestinal parte de este hierro se combina con la proteína apoferritina para formar ferritina.

El hierro es transportado en el plasma en forma férrica, ligado a una proteína específica, la transferrina. En la ferritina y hemosiderina, y cuando esta unido a la transferrina, se halla en estado férrico. MATERIALES Y REACTIVOS.

• Tubos de ensayo.

• Pipetas de serológicas de 1/10 mL y 10 mL.

• Espectrofotómetro.

• Solución Estándar de Hemoglobina (20.0 g/dL). • Solución del Reactivo de Drabkin.

• Agua destilada.

• Gradilla.

• Muestra: sangre total.

PROCEDIMIENTO:

1. Tomar 3 mL de sangre y colocarla en un tubo con anticoagulante, mezclar a vuelta de campana.

2. Deposite 5.0 mL de reactivo de Drabkin en cada uno de los tubos marcados como muestra, blanco y estándar.

3. Usando la pipeta serológica de 1/10 mL añadir con cuidado 0.02 mL de sangre total al tubo marcado como muestra. Enjuagar la pipeta con la que se agregó la muestra con el reactivo varias veces. Mezcle bien por inversión y deje reposar por 10 minutos.

4. En el tubo del estándar adicionar 0.02 mL de la solución estándar a una concentración de 20 g/dL. Mezcla bien por inversión y deje reposar por 10 minutos.

5. Transferir aproximadamente 3 mL de cada dilución preparada (1:251) a la celdilla correspondiente para realizar las lecturas de absorbancia.

6. Ajustar el espectrofotómetro a 0 de absorbancia utilizando el blanco de reactivo a 540 nm de longitud de onda.

7. Proceda a leer las absorbancias tanto de la muestra como del estándar.

CALCULOS: Relacione el valor de la lectura problema con el estándar como sigue: [g de Hb] = (Lectura de la muestra) (Conc. del Estándar) / Lectura de Estándar.

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RESULTADOS:

Valores Esperados: Rango normal de hemoglobina en sangre total: Hombres (adultos) 13 - 18 g/dL Mujeres (adultos) 11 - 16 g/dL Recién nacido 14 -23 g/dL 1 año de nacido 12 - 16 g/dL 1 mes de nacido 10 - 14 g/dL Actividades de aprendizaje: 1. Investigar la estructura y función de la hemoglobina y la mioglobina 2. Describe los pasos del catabolismo del grupo hemo 3. Investiga el transporte y almacenamiento del hierro 4. Menciona signos y sintomas de la anemia y sus hallazgos laboratoriales 5. Investiga la diferencia entre la anemia ferropénica y la anemia perniciosa, sus causas y

características. 6. Conclusión 7. Bibliografía

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Práctica 8 Metabolismo de carbohidratos

Objetivo general: • Analizar la relación entre las mediciones antropométricas y la glucemia Objetivos específicos: • Desarrollar las habilidades básicas de la antropometría

• Desarrollar habilidades para la toma de presión arterial

• Diferenciar los cambios de la glucemia en el estado pre y posprandial Introducción Los carbohidratos son las biomoléculas mas abundantes de la naturaleza. Representan más de la mitad de todo el carbono orgánico y 0.3% del peso corporal en el ser humano. Además proporcionan de 50 a 60% de la energía consumida por un individuo. La concentración normal de glucosa en sangre es de 60 a 100 mg/100 ml, aun durante los estados posprandial, ayuno o inanición. La insulina es la hormona encargada de introducir la glucosa en las células para disminuir la glucemia, promueve la glucólisis, la glucogenogénesis en hígado y músculo, y promueve su transformación en triglicéridos para almacenarse en los adipocitos. Por otra parte las hormonas contrarreguladoras de la insulina, como el glucagón, la adrenalina y los glucocorticoides, elevan la glucemia al activar la glucogenólisis, la gluconeogénesis, la lipólisis y la degradación de proteínas, al mismo tiempo que reducen el empleo periférico de la glucosa. La homeostasis de la glucosa es fundamental porque las neuronas y los eritrocitos, principalmente la utilizan como combustible. Cuando el organismo pierde la capacidad de regular la glucemia, la glucosa plasmática se eleva. A este trastorno se le llama Diabetes mellitus, que es una enfermedad sistémica, crónico-degenerativa, con grados variables de predisposición genética, con participación de factores ambientales, que se caracteriza por hiperglucemia crónica, debido a la deficiencia en la acción o producción de insulina, lo que afecta el metabolismo intermedio de los carbohidratos, lípidos y proteínas. Categorías de glucemia en ayuno:

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1. Glucosa plasmática en ayuno menor de 100 mg/dl = glucosa normal 2. Glucemia en ayuno mayor o igual a 100 mg/dl y menor o igual a 125 mg/dl= glucemia

anormal de ayuno. 3. Glucemia en ayuno mayor o igual a 126 mg/dl= diabetes mellitus. Evaluación antropométrica La antropometría es la técnica que se ocupa de medir las dimensiones físicas y la composición global del cuerpo humano en diferentes edades y estados fisiológicos. Las mediciones antropométricas permite evaluar la composición corporal y hacer inferencias acerca del crecimiento y desarrollo físico, y del estado de nutrición del individuo. Los depósitos de grasa visceral están relacionados con el desarrollo de enfermedades crónicas, como resistencia a la insulina, diabetes mellitus y enfermedades cardiovasculares que representan las primeras causas de morbilidad y mortalidad en México y el mundo.En épocas recientes, se ha identificado que el diámetro de cintura tiene más valor, porque esta relacionado con los depósitos de grasa visceral y las morbilidades debidas a la obesidad. En el siguiente cuadro se muestran las mediciones antropométricas más utilizadas en la práctica clínica.

Evaluación de la presión arterial La toma de la presión se utiliza para medir la fuerza o presión que ejerce la sangre en las paredes de las arterias. La presión tiene dos medidas: la presión sistólica es la máxima y la diabólica es la mínima; ambas se representan con cifras: 120/80 mmHg.La presión arterial puede presentar variaciones entre una persona y otra, además de variaciones durante el día. Por lo general, cuando una persona duerme, la presión tiende a disminuir; cuando tiene actividad física, tiende a elevarse.La presión alta (hipertensión arterial) desencadena problemas cardiacos, renales, vasculares, etc. A continuación se presentan sus valores normales y sus alteraciones:

Medida Evalúa

Peso Masa corporal total

Estatura Longitud total del cuerpo

Indice cintura-cadera (ICC) Depósitos de grasa en la región abdominal

Indice de masa corporal (IMC) Desnutrición, sobrepeso y normalidad

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Desarrollo experimental A) Mediciones antropométricasTodos los alumnos deben realizar las siguientes actividades, trabajando en binas o pares:1. Medir el peso2. Medir la talla3. Calcular el IMC o índice de Quetelet: IMC= PESO/TALLA AL CUADRADO4. Medir la circunferencia de la cintura y la cadera. Se mide en centímetros con cinta métrica,

con el individuo en posición de firmes, con los brazos colgando del cuerpo y el abdomen descubierto. La cintura se mide tomando como referencia la mitad de l distancia entre el borde costal inferior y el borde superior de la cresta ilíaca. La cadera se mide en el nivel de ambos trocánteres mayores y pasando por la parte más prominente de los glúteos. Se aplica la siguiente fórmula:

ICC= Circunferencia de la cintura/circunferencia de la caderaEl ICC es útil para determinar si la grasa corporal esta distribuida en el nivel central (abdominal, visceral o androide) o periférica (localizada en brazos y cadera o ginecoide). La grasa visceral se relaciona con mayor riesgo de alteraciones metabólicas y de enfermedades cardiovasculares.B) Medición de la presión arterialLa persona a evaluar debe estar sentada y cómoda, por lo menos durante 5 min, tranquila y sin hablar, con brazos y piernas relajados.• Colocar el brazo sobre el nivel del corazón, de manera que descanse sobre una mesa; si la

persona está acostada, extender tan solo el brazo.• Colocar el brazalete del baumanómetro alrededor del brazo sin ropa, por encima del codo. El

brazalete no debe estar muy apretado.• Colocar el diafragma del estetoscopio en el lado interior de la hendidura del codo. Insuflar

con rapidez el brazalete del baumanómetro con la perilla, a una presión de 200 a 220 mmHg

Categoría Sistólica Diastólica

Normal Menor de 120 hasta 129 Menor de 80 hasta 84

Normal alta 130-139 85 - 89

Hipertensión leve o grado I 140 - 159 90 a 99

Hipertensión moderada o grado II

160 - 179 100 - 109

Hipertensión intensa o grado III

Mayor a 180 Mayor a 110

Hipertensión sistólica aislada Mayor a 140 Menor a 90

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(si se insufla lentamente se puede alterar la presión). Comenzar la liberación del aire poco a poco; anotar o memorizar el número indicado en el marcador con el primer latido. Este número es la presión sistólica (máxima). Cuando el pulso se detenga al seguir desinflando la banda, anotar el número, que representa la presión diabólica (baja).

La arteria braquial es un vaso sanguíneo que va del hombro a debajo del codo. Esta arteria es la más utilizada para medir la presión.C) Extracción y procesamiento de muestras biológicas1. Extraer una muestra de 5 ml de sangre venosa y colocarla en tubo sin anticoagulante de

tapa roja.2. Al estudiante que se le extrajo la sangre debe ingerir su desayuno habitual y se les tomará

muestra a los 30 y noventa minutos.3. Centrifugar ls muestras a 2500 rpm durante 5 minutos.4. Aspirar el suero con una pipeta Pasteur, con cuidado de no aspirar el paquete celular.D) Determinación de la glucemia en ayuno y posprandialFundamento: En solución acuosa, la enzima glucosa oxidada oxida a la glucosa para dar ácido glucónico y peróxido de hidrógeno.1. En presencia de la enzima peroxidasa, el peróxido de hidrógeno reacciona con el fenol y la

4-aminofenazona, para formar un complejo de color rojo.2. La intensidad de color desarrollada se relaciona de forma directamente proporcional a la

concentración de glucosa.3. Se determina mediante espectrofotometría a una longitud de onda entre 460 y 560 nm,

empleando un patrón de 100 mg/dl de glucosa.PROCEDIMIENTO:1. Coloque 1.0 mL de reactivo de glucosa en tubos etiquetados como blanco, problema y estándar. Precaliente los tubos durante 5 minutos a 37º C en baño de agua.2. Coloque 0.01 mL de suero en el tubo problema y mezcle bien.3. En el tubo blanco adicione 0.01 mL de agua destilada y utilice a este tubo como blanco de reactivo.4. En el tubo del estándar adicione 0.01 mL de la solución estándar de glucosa a una concentración de 100 mg/dL.5. Incube nuevamente todos los tubos temperatura ambiente durante 15minutos.6. Coloque a cero de absorbancia el espectrofotómetro ajustando a 500 nm con el blanco de reactivo.7. Lea y registre las absorbancias para el problema y el estándar.8. Realizar el mismo procedimiento después de desayunar a los 30 y 90 minutos.Cálculos:

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Glucosa (mg/dl)= (absorbancia del problema/absorbancia del patrón) x (concentración del patrón)

Actividades de aprendizaje:1. Realizar una encuesta en que se registre edad, género, peso, talla, IMC, ICC y glucemia de

cada uno de los integrantes del grupo.2. Registrar en una base de datos Excel los datos de las variables anteriores y sacar el

promedio y la desviación estándar.3. Identificar la cantidad y el porcentaje de compañeros que tengan peso bajo, peso normal,

sobrepeso, obesidad tipo I, II y III.4. Analizar qué porcentaje de compañeros tiene glucemia normal, hiperglucemia de ayuno o

diabetes, según los criterios de esta práctica.5. Dividir la base de datos por género y repetir de la acción 1 a la 4.

A. ¿la frecuencia de alteraciones de peso (bajo, sobrepeso y obesidad) es mayor en h o m b r e s o e n m u j e r e s ?____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

B. ¿La frecuencia de alteraciones de la glucemia es mayor en hombres o en mujeres?______________________________________________________________________________

6. Realizar una evaluación propia y de la familia, incluyendo cada uno de los datos solicitados en el cuadro de evaluación de factores de riesgo para diabetes en el entorno familiar del estudiante:

Tiempo Estudiante

Basal

30 minutos

90 minutos

Evaluación Estudiante Padre Madre Otro familiar

Presión arterial

IMC (kg/m2)

Uso de medicamentos antihipertensivos (si o no)

Último valor de glucemia (mg/dl)

Evaluación

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7. Contestar la encuesta para determinar la calificación de riesgo propio y de los familiares de desarrollar DM tipo 2.

Una calificación mayor o igual a 9 significa riesgo alto de desarrollar DM (con 81% de sensibilidad y 76% de especificidad), se sugieren cambios en los hábitos de alimentación y un programa de ejercicios (caminata diaria de 30 min) para disminuir el riesgo de desarrollar DM y para mantenerse sanos.8. Definir estado posprandial.9. ¿Cómo se espera que se encuentre la glucemia, la insulina y el glucagón en el estado de ayuno y posprandial ?

Actividad física por semana (horas)

Consumo de frutas y verduras a diario (si o no)

Estudiante Padre Madre Otro familiarEvaluación

Variable Puntaje Estudiante Familiares Otros

Edad (años) 45 a 54 55 a 64

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IMC Mayor de 25 y menor de 30 Mayor de 30

13

Circunferencia de cintura (cm) Hombres 94 a menor a 102 Mujeres de 80 a menor de 88 Hombres de 102 o mayor y mujeres de 88 y mayor.

334

Uso de medicamentos antihipertensivos 2

Antecedentes de glucemia alta 5

Actividad física menor a 4 horas por semana (individuos que trabajan sentados, no caminan mucho, en su tiempo libre leen, ven televisión o no realizan labores físicas en el hogar)

2

Falta de consumo diario de frutas y vegetales

1

Total 0 a 20

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10. ¿Qué tipo de carbohidratos elevan menos la glucemia del paciente diabético? Fundamentar la respuesta.11. ¿Cómo están los niveles de insulina seria si la persona ingiere una dieta abundante en fructosa y por qué?12. Conclusión13. Bibliografía

Práctica 9 Metabolismo de lípidos

Objetivo general Analizar la relación entre las mediciones antropométricas y el perfil de lípidosObjetivos específicos 1. Determinar la categoría de peso de acuerdo con el IMC2. Determinar el riesgo cardiovascular de acuerdo con el ICC3. Determinar la concentración sanguínea de colesterol total y triglicéridos (TG)4. Relacionar los cambios de concentración de colesterol y TG con la dietaIntroducción Consecuencias del exceso de grasa corporal.La obesidad es el incremento de peso corporal debido al aumento de grasa. De forma particular, la grasa visceral propicia alteraciones metabólicas como dislipidemias, hiperglucemia e hipertensión, que se agravan con el envejecimiento y el aumento de peso corporal, además la presencia de factores hereditarios, puede originar el síndrome metabólico (SM), que confiere riesgo para patologías crónico-degenerativas, como DM tipo 2 y enfermedades cardovasculares.El factor fisiopatológico central que vincula la obesidad con las patologías crónicas es la resistencia a la insulina, que se evalúa por distintos métodos como el clamp insulina-glucosa, el cual es el más exacto pero costoso, el índice TG/HDL y el modelo homeopático (índice HOMA-RI).En México se ha reportado que los criterios del ATP III para el diagnóstico del SM resultan adecuados:

Presencia de tres o más de los siguientes criterios:

1. Circunferencia de cintura: mayor a 102 cm en hombres y mayor de 88 cm en mujeres

2. TG séricos mayor o igual a 150 mg/dl

Presencia de tres o más de los siguientes criterios:

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Esta práctica esta dirigida a revisar la relevancia clínica de la concentración de lípidos en la sangre, como indicador bioquímico del estado de salud de un individuo y de la aplicación de los parámetros clínicos para la detección del síndrome metabólico.Desarrollo experimental Procedimiento general:Los alumnos deben trabajar en binas para realizar las mediciones antropométricas uno al otro. Después deben tomar muestras de sangre, centrifugarlas y obtener el suero o plasma para cuantificar los lípidos.Experimento 1Medidas antropométricas A. Clasificación del peso corporal de acuerdo al IMCA partir del valor de IMC calculado en la práctica 8, identificar en qué categoría de peso se encuentra el alumno, de acuerdo con los puntos de corte del cuadro siguiente<.

Para la interpretación adecuada del IMC se debe considerar si el individuo es de talla baja, si cursa algún estado fisiológico como el embarazo, si presenta aumento de peso a expensas de masa muscular (fisicoculturistas) y si se trata de niños o personas de edad avanzada.B. Clasificación del riesgo cardiovascular de acuerdo con el ICCA partir del ICC calculado en la práctica 8 identificar en qué categoría de riesgo se encuentra el alumno de acuerdo con los siguientes puntos de corte:

3. Presión arterial mayor o igual a 130/85 mmHg

4. HDL-colesterol menor a 40 mg/dl en hombres y menor a 50 mg/dl en mujeres

5. Glucemia mayor a 110 mg/dl

Presencia de tres o más de los siguientes criterios:

Criterio Punto de corte

Bajo peso Menor 18.5

Peso normal 18.5 a 24.99

Sobrepeso 25 a 29.99

Obesidad I 30 a 34.99

Obesidad II 35 a 39.99

Obesidad III (mórbida) Mayor o igual a 40

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Experimento 2Indicadores bioquímicos A. Determinación cuantitativa del colesterol sérico La cuantificación del colesterol en suero sirve como indicador de las funciones hepática y biliar, la absorción intestinal, el riesgo de enfermedades cardiovasculares, las funciones tiroides y las enfermedades arteriales. Conocer su concentración es importante para el diagnóstico y clasificación de las hiperlipoproteinemias. La concentración de colesterol varía con la dieta, el estrés, la edad, el género, el peso corporal, el equilibrio hormonal, la actividad física y el embarazo.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO.El ensayo del colesterol involucra reacciones enzimáticas secuenciales. La enzima colesterol esterasa hidroliza los esteres de colesterol para originar colesterol libre y ácidos grasos libres. El colesterol libre así producido se oxida en presencia de colesterol oxidasa para formar 4-colesterona y peróxido de hidrógeno. La peroxidasa cataliza la oxidación con peroxido de hidrógeno de 4-aminofenazona, con la subsecuente copulación de ρ-hidroxibencensulfonato. El producto final es un colorante quinonaimina que absorbe a 505 nm, y cuya intensidad de color es directamente proporcional a la concentración del colesterol presente en la muestra.PROCEDIMIENTO:1. Coloque 2.0 mL del reactivo de colesterol en tubos de ensayo rotulados como blanco,

problema y estándar.2. Añada 0.02 mL de la muestra (suero) al tubo problema y mezcle.3. En el tubo del estándar agregar 0.02 mL de la solución estándar a una concentración de 200 mg/dL y mezcle.4. En el tubo de blanco de reactivo adicionar 0.02 mL de agua destilada y mezcle.5. Incubar todos los tubos durante 5 minutos a 37 ºC.6. Fijar el instrumento a cero de absorbancia a 505 nm usando el blanco de reactivo.7. Leer y anotar las absorbancias de la muestra y el estándar antes de 60 minutos.

Grado de riesgo Punto de corte del ICC

Bajo Menor a 0.73

Medio Mujeres: 0.73 a 0.79Hombres: 0.73 a 0.89

Alto Mujeres mayor o igual a 0.80Hombres mayor o igual a 0.90

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CÁLCULOS:Utilice la siguiente ecuación para calcular la concentración de colesterol en suero:[mg/dL de colesterol total] = (Absorbancia de la muestra/absorbacia del patrón) x Concentración del Estándar

Valores Normales:Recién nacido: 53-135 mg/dLInfante: 70-175 mg/dLNiños: 120-200 mg/dLAdolescentes: 120-200 mg/dLAdultos: 140-200 mg/dLB. Determinación de la concentración seria de TG Las fuentes de TG son la dieta y la síntesis endógena a partir de carbohidratos. La determinación sérica de TG es importante para el diagnóstico y tratamiento de las hiperlipidemias. Se ha identificado que el aumento de los TG es un factor de riesgo para aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares.FUNDAMENTO DEL MÉTODO.

Los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente a glicerol, el cual, mediante GK y GPO, libera el peróxido de hidrógeno que se valora mediante la reacción de Trinder, de acuerdo a las siguientes reacciones: Triglicéridos + H2O LPL Glicerol + ác. Grasos Glicerol + ATP GK Glicerol-3-fosfato + ADP Glicerol-3-P + O2 GPO Dihidroxiacetona-P + H2O2 H2O2 + 4-AAP + 3,5-DHBS POD Quinoneimina + 2H2O

1. Los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente por la lipasa a ácidos grasos libres y glicerol.

2. El glicerol es fosforilado por el adenosin-trifosfato (ATP) en presencia de glicerol cinasa (GK) para producir glicerol-3-fosfato y adenosin-difosfato (ADP).

3. El glicerol-3-fosfato es oxidado a dihidroxiacetona fosfato (DAP) por la enzima glicerol fosfato oxidasa (GPO), produciendo peroxido de hidrógeno (H2O2).

4. En una reacción colorimétrica tipo Trinder catalizada por peroxidasa (POD), el H2O2 reacciona con 4-aminoantipirina (4-AAP) y 3,5-dicloro-2-hidroxibencen-sulfonato (3,5-DHBS) para producir un cromógeno de color rojo (Quinoneimina). La cantidad de esta quinona formada es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la muestra.

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MATERIAL Y REACTIVOS:

• Tubos de ensayo

• Gradilla

• Pipetas serológicas

• Micropipetas • Puntas para micropipeta

• Vaso de precipitado de 200 ml

• Baño maría

• Termómetro

• Torundas, jeringas, torniquete, y guantes de látex PROCEDIMIENTO: 1. Coloque 2.0 mL del reactivo de triglicéridos en tubos de ensayo rotulados como blanco,

problema y estándar. 2. Añada 0.02 mL de la muestra (suero) al tubo problema y mezcle. 3. En el tubo del estándar agregar 0.02 mL de la solución estándar a una concentración de

200 mg/dL (226 mmol/L) y mezcle. 4. En el tubo de blanco de reactivo adicionar 0.02 mL de agua destilada y mezcle. 5. Incubar todos los tubos durante 5 minutos a 37 ºC. 6. Fijar el instrumento a cero de absorbancia a 500 nm usando el blanco de reactivo. 7. Leer y anotar las absorbancias de la muestra y el estándar antes de 15 minutos. CÁLCULOS: Utilice la siguiente ecuación para calcular la concentración de triglicéridos en suero: [mg/dL de triglicéridos] = (Absorbancia de la muestra/ Absorbancia del Estándar) X Concentración del estándar. RESULTADOS:

Valores Esperados: Niveles recomendados (deseables) de TG para adultos: Hombres: 40 – 160 mg/dL (45 – 181 mmol/L) Mujeres: 35 – 135 mg/dL (40 – 153 mmol/L) Actividades de aprendizaje 1. Describir la síntesis de los ácidos grasos a partir de glucosa y su almacenaje como

triglicéridos. 2. Explicar la forma en que son regulados el metabolismo y transporte de lípidos en el

organismo humano. 3. Describir los componentes y funciones de la partículas lipoproteínicas.

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4. Investigar las causas de hipercolesterolemia. 5. Investigar las opciones de tratamiento para la hipercolesterolemia 6. ¿Cuál es la enzima reguladora de la síntesis de colesterol? 7. ¿Cómo se llaman los medicamentos que inhiben a la enzima reguladora de la síntesis de

colesterol? 8. Investigar las causas de hipertrigliceridemia 9. Investigar cuál es la enzima reguladora de la síntesis de TG 10. Investiga el mecanismo que utilizan los fibratos para disminuir los TG 11. Conclusiones 12. Bibliografía

Práctica 10 Metabolismo de compuestos nitrogenados

Objetivo general Identificar algunos productos nitrogenados que se encuentran en la sangre y se excretan en la orina. Objetivos específicos • Explicar el papel fisiológico de la urea.

• Interpretar los niveles séricos de urea en el organismo.

• Describir la función de la urea y el ácido rico y saber de donde proviene cada uno.

• Cuantificar la urea y ácido rico en suero Introducción Se denominan compuestos nitrogenados a las biomoléculas que contienen nitrógeno, ya sea macromoléculas o productos de desecho. Las macromoléculas nitrogenadas más importantes con las proteínas y los ácidos nucleicos, sus precursores son los aminoácidos y las bases nitrogenadas. Otros compuestos nitrogenados son las porfirinas, que se encuentran en la hemoglobina, la mioglobina, citocromos y la catalasa. Los productos del catabolismo de los ácidos nucleicos, las proteínas y el grupo hemo son el ácido rico, la urea y la bilirrubina, respectivamente. La creatinina proviene del catabolismo de la fosfocreatina, que se forma a partir de la arginina, metionina y cisteína y, por lo tanto, se le considera como producto del cataclismo de las proteínas. Como no es posible eliminar el amoniaco producido en el catabolismo de las proteínas, es necesario convertirlo a urea en el hígado. Al ácido rico, la creatinina y la urea se les elimina por la orina y constituyen casi 93% de los compuestos nitrogenados presentes en esta. El resto lo conforman el amoniaco y otras sustancias.

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Balance nitrogenado En el adulto, se llega a un balance nitrogenado, cuando la cantidad de nitrógeno ingerido es igual al eliminado. El balance nitrogenado debe ser positivo durante el crecimiento del individuo o cuando se desea aumentar la masa muscular, y negativo cuando se tiene una dieta deficiente en proteínas o cuando se ingiere una cantidad suficiente de proteínas y calorías pero con deficiencia en un aminoácido esencial, también será negativo cuando existe una enfermedad debilitante en la que hay aumento del catabolismo proteico como se observa en cáncer, tuberculosis pulmonar o en el periodo postoperatorio.

Experimento 1 Determinación de urea sérica Material: • Pipetas serológicas.

• Micropipetas.

• Puntillas de micropipeta.

• Bulbos. • Tubos de ensaye

• Gradilla

• Baño María a 37 ºC

• Espectrofotómetro y aditamentos

• Calculadora, lápiz y marcador indeleble

• Papel absorbente • Insertos del reactivo.

Reactivos:

• Reactivo de Urea.

• Calibrador ó estándar de urea • Controles normal y anormal.

• Agua destilada. Procedimiento: 1. Determinación de Urea en suero 2. Realice la determinación de una muestra problema, un estándar y un control siguiendo la

técnica de que se disponga en el laboratorio. 3. Lea en el espectrofotómetro las absorbancias de las muestras problema y control y

registre los valores obtenidos en su manual 4. Calcule la concentración del problema y control mediante la siguiente fórmula:

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Urea en mg/dL = (Abs del problema/ Abs. del patrón) x [estandar] RESULTADOS

VALORES DE REFERENCIA DE UREA EN SANGRE Adultos entre 7 y 20 mg/dL. Niños pequeños de 5 a 18 mg/dL.

Experimento 2 Determinación de creatinina sérica FUNDAMENTO DEL MÉTODO. La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con el ácido pícrico en medio alcalino dando un complejo de color amarillo que se cuantifica mediante lectura fotométrica. En la determinación de creatinina por medio de la técnica de punto final, la adición de ácido al medio, destruye el picrato de creatinina pero no el color formado por los demás compuestos. Por lo tanto la diferencia entre la lectura fotométrica antes y después del agregado de ácido, permite cuantificar la creatinina en forma específica. MATERIALES Y REACTIVOS.

• Tubos de ensayo.

• Pipetas de serológicas de 1/10 mL y 10 mL.

• Espectrofotómetro.

• Solución de ácido pícrico (41.4 mmol/L). • Solución de ácido acético al 20 %.

• Solución Buffer de polioxietilén lauril éter al 0.4% .

• Solución Estándar de Creatinina (20 mg/dL).

• Agua destilada.

• Gradilla. • Baño maría.

• Termómetro.

• Muestra: Suero. PROCEDIMIENTO: 1. En tres tubos etiquetados como blanco, estándar y muestra colocar 1 mL de solución de

ácido pícrico (41.4 mmol/L) y 1 mL de buffer PLE (Solución de polioxietilén lauril éter al 0.4% en buffer de glicina/NaOH 1mol/L a pH de 12.4) y mezclar.

2. En el tubo de la muestra adicionar 0.20 mL de suero y mezclar. 3. En el tubo del blanco de reactivo adicionar 0.2 mL de agua destilada y mezclar.

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4. En el tubo del estándar adicionar 0.2 mL de la solución estándar a una concentración de 20 mg/L y mezclar.

5. Incubar todos los tubos durante 10 minutos en baño de agua a 37 ºC. 6. Dentro de los 15 minutos de retirado del baño, leer el estándar (S) y la muestra (M1) en

espectrofotómetro a 510 nm llevando a 0.000 de densidad óptica con el blanco de reactivo. 7. Después agregar al tubo del blanco de reactivo y de la muestra 0.1 mL de la solución de

ácido acético al 20 % (Stopper). Mezclar y dejar los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos.

8. Volver a leer la muestra (M2), llevando a 0.000 de densidad óptica con el blanco de reactivo.

CÁLCULOS: Creatinina en Suero (mg/L) = (M1 - M2) x f f = 20 mg/L S RESULTADOS:

Valores de referencia: Suero: 0.8 - 1.4 mg/dL Experimento 3 Determinación de ácido úrico FUNDAMENTO DEL MÉTODO. El procedimiento de la uricasa se basa en la oxidación del ácido úrico por la uricasa a alantoín, dióxido de carbono y peróxido de hidrógeno (H2O2). Este último causa la conexión oxidativa de 4-aminoantipirina (4-AAP) y 2-hidroxi-3,5-ácido diclorobencensulfónico (HDBS), cuando esta en presencia de peroxidasa, para formar un cromógeno rojo, el cual es proporcional a la cantidad de ácido úrico presente en la muestra. MATERIALES Y REACTIVOS. • Tubos de ensayo.

• Pipetas de serológicas de 1/10 mL y 10 mL.

• Espectrofotómetro.

• Solución Estándar de ácido úrico (8.0 mg/dL).

• Solución del Reactivo de Uricasa.

• Agua destilada. • Gradilla.

• Baño maría.

• Termómetro.

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• Muestra: SUERO. PROCEDIMIENTO: 1. Coloque 2.0 mL del reactivo de uricasa en tubos de ensayo rotulados como blanco,

problema y estándar. 2. Añada 0.05 mL de la muestra (suero) al tubo problema y mezcle suavemente. 3. En el tubo blanco de reactivo añadir 0.05 mL de agua destilada y mezclar suavemente. 4. En el tubo del estándar agregar 0.05 mL de la solución estándar a una concentración de 8.0

mg/dL y mezcle suavemente. 5. Incubar todos los tubos durante 10 minutos a 37 ºC. 6. Fijar el instrumento a cero de absorbancia a 520 nm usando el blanco de reactivo. 7. Leer y anotar las absorbancias de la muestra y el estándar. CÁLCULOS: Utilice la siguiente ecuación para calcular la concentración de ácido úrico en suero: [mg/dL de Acido Urico] = (Abs. de la muestra/ Absorbancia del Estándar) X Concentración del patrón RESULTADOS

Valores esperados: Suero: Hombres 3.6 - 7.7 mg/dL Mujeres 2.5 - 6.8 mg/dL Orina: 205 - 750 mg/24 horas. Actividades de aprendizaje: 1. Investigar cómo se determina el balance nitrogenado 2. Investigar las causas de hiperuricemia. 3. Investigar qué medicamento inhibe a la enzima xantina oxidasa y para qué enfermedad se

utiliza. 4. Investigar cuáles son las causas de la hiperbilirrubinemia 5. Investigar cuáles son los productos terminales de la degradación de las pirimidinas 6. ¿Qué son las porfirias? 7. Completar el siguiente cuadro de las porfirias:

Enfermedad Enzima deficiente Manifestaciones clínicas

Tratamiento

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7. Conclusiones 8. Bibliografía

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Sánchez Enriquez S, Flores Alvarado LJ, Gurrola Díaz CM, Heredia Chavez P. (2014) Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica. (Tercera Edición). México: McGraw Hill Education.

Universidad Autónoma de Baja California Unidad de Ciencias de la Salud (S.F.) Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica, Bloques I, II y III. Mexicali, B.C.40

Enfermedad Enzima deficiente Manifestaciones clínicas

Tratamiento

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