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Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of -Flight Mass Spectrometry -

MALDI-TOF goes routine

C h r i s t o p h G a s s n e r

Blood Transfusion Service Zurich, SRC,

Department of Molecular Diagnostics (MOC),

Schlieren, Switzerland

Blutspende Zurich, Switzerland, Christoph Gassner

NH

2 (1)

CO

OH

(417)

D in the erythrocyte membrane ...

NH

2 (1)

CO

OH

(417)

NH

2 (1)

CO

OH

(417)

NH

2 (1)

CO

OH

(417)

NH

2 (1)

CO

OH

(417)

inner side

regular Dcategorypartial D weak D DEL dd


Y

LP

LWA

CR

R

V

T

SR

L Y K CS

m

L

L

L

EA

A

IL

LF

FF

T

SA

D

Y

H

E

D

K GQ

LV

A

S

Y

Q

V

G

Q

D

L

S

TL

FG

LG

IA

AM

VT

L

F

R

S

R

W S

VSH

A

FN

LA

L

G

L

VQ

WA

IL

LDG

FL

MF

PF

Q

S

G

K

V IV

TL

F

S

I

R

L

A

T

S

G

L

AV

DV

SI

LV

SL

AS

M

V N L

Q

A

K

L

VV

VL

V

VT

LG

E

A

M

V

R

L

N

S

N

FN

I

TD

Y

N

H

I

Y

I

H

MM

M

M

P

LC

AV

S

L

G

FY

AA

FV

W

L

P

E

G

D D

TQT

A

T

S

P

E

I

PK

K

L

AS

LG

AL

FL

F

PS

F

WM

W

M

L

RL

PS

S

A R

I

E

N

K

Y

F V A

V

T

V A

SA

TV

VS

I

Y

A

N

GS

S L A

Q

P

H

G

H

S

IK

G Y

S

TK

GG

AL V V

V

A

V

G

T

S

HC

IL

P

S

P

G

A

V

GS

ILG

A

V

V

L

L

GA

L

L

P

R

C

V

G

S

I

N

I

M

Y

G

GY

K

L PH

S

N

M

WV

V L

I

L

I Y

GL

GEI

L

L

LL

S F

G

T

D

G

N

MI

G

GP

Q

L

G

E

A

V

IS

L

V

L

T

S

L

SL

AI

LL

T

L

L

L

G

A

V

DI

DF K

D

T

H

K

WI

Y

NL K

P AH

DFK

WV

FPHLAVGF

N

S

C

Q=100

L=150

Q=200

V=250

D=350

K=400

V=50

V=300

NH2 (1) COOH (417)Blutspende Zurich, Switzerland, Christoph Gassner

Weak D types Wagner FF. et al., Blood 1999Körmöczi GF et al, Transfusion 2005

Gassner C et al, Transfusion 2013

1

3

2

31

32

45.1

75

76

45.1

NH2

XK 444 aa

KEL 732 aa

94

115

191

345

627

724

6 possible N-glycosylation sites, eventually not including Asp724.

There are 16 Cys (tightly folded) of which Cys72 interacts with XK.

“McLeod“ with late onset neuromuscular abnormalities: all mutated XK protein (3 disrupted splice sites, 1 missense mutation).Russo et al (Lee, Reid, Redman) 2002

Kell/Cellano blood group protein

MEMBRANE

INSIDE

OUTSIDE


SNP - aminoacid change - change of N-glycosylation site (Asn-Arg-Thr): Cellano (KEL2) => Kell (KEL1)

N

N

O

N

OO

O

N

N

O

N

O

HO

2HN

HN2HN

+2HN

N

N

O

N

OO

O

N

N

O

2HN

HN2HN

+2HN N

OS

TT PHET

A

A ASNC

C

G ARGA

A

T MET 193G

C

T LEUG

A

C THRG 193


Vel resides on SMIM1, on chromosome 1p36


1 2 3 454 221 119 2126 186 311 194

rs1175550

ATG TGAC = 0.217T = 0.783

Cvejic A. et al, 2013: “… A cohort of 70 Vel− individuals was

found to be uniformly homozygous for a 17 nucleotide

deletion (exon 3) in the coding sequence of SMIM1. …”

17 bp

MPX, SNPs, alleles n n n .

RHDhigh 2

RHDbroad /RHCcEe 3 49 79

Kell-Kidd- Duffy 1 15 21

MNS 1 11 15

RARE 2 23 36

HPA / HNA 1 13 23

10 108 170


6‘000 18‘000 36‘00012‘000 24‘000 30‘000

samples: Zurich area ( 2/3) I other Swiss areas ( 1/3)~ 1,300,000 «SNP-genotypes»

samples & typings for MALDi-TOF (mass spec.)

MPX, SNPs, alleles n n n .

RHDhigh 2

RHDbroad /RHCcEe 3 49 79

Kell-Kidd- Duffy 1 15 21

MNS 1 11 15

RARE 2 23 36

HPA / HNA 1 13 23

10 108 170


6‘000 18‘000 36‘00012‘000 24‘000 30‘000


samples: Zurich area ( 2/3) I other Swiss areas ( 1/3)«WALDI 2013»: 761 757«RUDI2013»: 14’743 3’397 Total 2013: 15’504 4’154Total 2013: 19’658

~ 1,300,000 «SNP-genotypes»



Zurich Cumulated Chur Luzern Basel Lugano Aarau Neuchat.

WALDI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1

4 4

5'443 10

21.3% 45

RUDI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4 4

24'219

9 9

26.0%

13

24

63

ALL

29'662 179

TTAAACTTTAACCGAAC 5‘200 DaltonCTTGGAGGCTGGCGCATCTCTGGTAAATGGACTTCCTTAAACTTTAACCGAACGCTGAGACTTCTGATGAGTCAGTATGGCCATTTCCCTTTCTTCAGAG

TTAAACTTTAACCGAAT 5‘216 DaltonCTTGGAGGCTGGCGCATCTCTGGTAAATGGACTTCCTTAAACTTTAACCGAATGCTGAGACTTCTGATGAGTCAGTATGGCCATTTCCCTTTCTTCAGAG

Single Nucleotide Polymorphism (“SNP“)- aminoacid change –change of N-glycosylation site: Cellano ( KEL2) => Kell ( KEL1)

GGCGCATCTCTGGTAAA

CTTGGAGGCTGGCGCATCTCTGGTAAATGGACTTCCTTAAACTTTAACCGAACGCTGAGACTTCTGATGAGTCAGTATGGCCATTTCCCTTTCTTCAGAG

CTTGGAGGCTGGCGCATCTCTGGTAAATGGACTTCCTTAAACTTTAACCGAACGCTGAGACTTCTGATGAGTCAGTATGGCCATTTCCCTTTCTTCAGAGCGGTAAAGGGAAAGAAGT

KEL*02/02 (kk)

KEL*01/02 (Kk)

KEL*01/01 (KK )

amplification primer


extension primer

CTTGGAGGCTGGCGCATCTCTGGTAAATGGACTTCCTTAAACTTTAACCGAATGCTGAGACTTCTGATGAGTCAGTATGGCCATTTCCCTTTCTTCAGAG


STEP 1: PCR amplification


TTAAACTTTAACCGAAC 5‘882 DaltonCTTGGAGGCTGGCGCATCTCTGGTAAATGGACTTCCTTAAACTTTAACCGAACGCTGAGACTTCTGATGAGTCAGTATGGCCATTTCCCTTTCTTCAGAG

TTAAACTTTAACCGAAT 5‘898 DaltonCTTGGAGGCTGGCGCATCTCTGGTAAATGGACTTCCTTAAACTTTAACCGAATGCTGAGACTTCTGATGAGTCAGTATGGCCATTTCCCTTTCTTCAGAG

Single Nucleotide Polymorphism (“SNP“)- aminoacid change –change of N-glycosylation site: Cellano ( KEL2) => Kell ( KEL1)

CTTGGAGGCTGGCGCATCTCTGGTAAATGGACTTCCTTAAACTTTAACCGAACGCTGAGACTTCTGATGAGTCAGTATGGCCATTTCCCTTTCTTCAGAG

CTTGGAGGCTGGCGCATCTCTGGTAAATGGACTTCCTTAAACTTTAACCGAACGCTGAGACTTCTGATGAGTCAGTATGGCCATTTCCCTTTCTTCAGAGCGGTAAAGGGAAAGAAGT

KEL*02/02 (kk)

KEL*01/02 (Kk)

KEL*01/01 (KK )


extension primer



STEP 2: ddNTP extension


spectrogram ofthree differentJs a/Js b (KEL*06 I KEL*07) DNAs

Primer unextended extended~5‘612 ~5‘882 I~5‘898

MALDI-TOF mass spectrometrymeasures molecular weight (in Dalton) of extension primers (5‘612) plus 1 extended base.

Heterozygous samples show 2 different molecular weights for those primers at about 5‘882 and 5‘898 Dalton (all indicated by arrow).

Other specific peaks are results of other bloodgroup SNPs, detected in multiplex in the same PCR.

Js(a+b-)KEL6 I KEL6

Js(a+b+)KEL6 I KEL7

Js(a-b+)KEL7 I KEL7


Multiplexed specificities, e.g. KEL-JK-FY (15 SNPs)


homozygous heterozygous


Automated DNA preparation: 96-well MT format. Chemagen a “division” of PerkinElmer

low to high throughput (e.g. 10 times 96 samples/d)

"MALDI-TOF"


Donor-

DNAs(e.g. BG O, RhD -)

e.g. multiplex forKpa, Lua, Jsa, Ytb, Cob ,…

Amplification &

Primer Elongation

GATCCCGATGATGT

GATCCCGATGATGC

"Spotting"

"MALDI-TOF"

6 - 8 hours


Results KEL, SLC14A1, DARC (Kell, Kidd, Duffy), n = 4‘000

There was 1 sample of KEL*02 I KEL*02.03

heterozygous genotype with negativity for

Kpa: KEL*02.03(R700Q)Null.

With respect to SLC14A1 (Kidd), two serological pre-values

were wrong, the third was a JK*Bnull allele in a genetically

JK*A I JK*B heterozygous individual as demonstrated by the

negative serology for Jkb.

With respect to DARC (Duffy), as expected, 28 of a

total of 52 (54%) FY*A I FY*X heterozygous individuals

were misinter-preted as Fya homozygous, serologically.

A new unspecified FY*Bnull allele was discovered:

FY*B(G261R)Null.

KK Kk Kk kk kk kk

allel-1 allel-2 Kp(a-b+) Kp(a-b+) Kp(a+b+) Kp(a+b-) Kp(a+b+) Kp(a-b+)

KEL*01 KEL*01 9

KEL*01 KEL*02 193

KEL*01 KEL*02.03 3

KEL*02.03 KEL*02.03 1

KEL*02 KEL*02.03 103 1

KEL*02 KEL*02 3,683

KEL*02 KEL*02(R516L) 5

KEL*02 KEL*02(G573G)mod 2

allel-1 allel-2 Jk(a+b-) Jk(a+b+) Jk(a-b+)

JK* A JK* A 1,050 1

JK* A JK* B 1 1,999 1

JK* A JK*A(Y194X)null 2

JK* B JK* B 946

allel-1 allel-2 Fy(a+b-) Fy(a+b+) Fy(a-b+) Fy(a-b-)

FY* A FY* A 703

FY* A FY* B 2 1,835

FY* A FY* B 1

FY* A FY*(GATA) 24

FY* A FY*X 28 24

FY* B FY* B 1 1,285

FY* B FY*(GATA) 23

FY* B FY*X 71

FY*(GATA) FY*(GATA) 2

FY*X FY*X 1

GYPE

GYPA

GYPB

Blood Transfusion Zurich, Switzerland

1 2 3 4 5 6 7# 19594 bp 99 96 # 86 79 17

U- del 9k (AB) MNS1/2 (AB) MNS9 (A, Vw)

MNS11 (AB, Mg) MNS14 (A, Mta)

MNS19 (A, Hut)

93 95 6

U- del 16k (BE) MNS6 (BE, He) MNS3/4 (B) U- GYPB(NY)null

U- GYPB(IVS5+5g>t)null

93 110 196

//

i 2000 bp

//

//

//

Specificities: MNSs, final version (1 MPX only)

M MN N

allele-1 allele-2

MNS1 MNS1 1'206 5 ? / 2d MNS2 negative ?

MNS1 MNS9 (Vw) 1

MNS1 MNS2 2 1'928 1: M / MNS11 (Mg)

MNS1 MNS6 (He) 1

MNS1 MNS9 (Vw) 2

MNS1 MNS14 (Mta

) 7

MNS2 MNS2 841

MNS2 MNS9 (Vw) 3

MNS2 MNS14 (Mta

) 2

1'209 1'945 846

4'000


Results MN, n = 4‘000 (preliminary)

With respect to MN, a total of 9 discrepancies between phenotype an d genotype.

Two MN were due to false negative N-serology and 7 look like genetically undetected N-alleles.

S Ss ss

allele-1 allele-2

MNS3 MNS3 429 1

MNS3 MNS4 1 ? 1'682 1s / 1d

MNS3 MNS4 plus U- (hetero) 1

MNS4 MNS4 1'878

MNS4 MNS4 plus U- (hetero) 6

430 1'684 1'886

4'000


Results Ss, n = 4‘000 (preliminary)

With respect to Ss, a total of 4 discrepancies between phenotype an d genotype.

One serological Ss / MNS3/MNS3 was in fact S, one ss / MNS3/MNS4 was in fact Ss. One ss /

MNS3/MNS4 has a “silent” MNS3 (adsorption/elution), one SS / MNS3/MNS4 discrepancy

awaits second sampling.


HFA genotyping


Results on HFA genotyping, n = 26‘622 31.12.2013sero "RARE" specificities Caucasians (Swiss) n=26'622, 31.12.2013 "Black-Africans" (n = 54)

Antigen

Antigen

antithetic

("frequent") ISBT allele

n

rare

homo-

zygous

n

hetero-

zygous

n

frequent

homo-

zygous

sum

valid

% typing

failure

21'398

n

rare

homo-

zygous

n

hetero-

zygous

n

frequent

homo-

zygous

sum

valid

% typing

failure 54

done 1 K k KEL*01 56 1'888 24'274 26'218 1.518% 0 3 51 54 0.000%

done 2 Kpa

Kpb

KEL*02.03 4 605 25'643 26'252 1.390% 0 0 54 54 0.000%

done 3 Jsa

Jsb

KEL*02.06 0 99 26'118 26'217 1.521% 1 6 47 54 0.000%

done 4 KEL17 KEL11 KEL*02.17 0 82 26'129 26'211 1.544% 0 0 54 54 0.000%

yes 5 Lua

Lub

LU*01 36 1'823 24'342 26'201 1.581% 0 4 50 54 0.000%

yes 6 LU14 LU08 LU*02.14 5 478 25'731 26'214 1.533% 0 3 51 54 0.000%

yes 7 LU19 LU18 LU*02.19 2'497 10'876 12'833 26'206 1.563% 8 26 18 52 3.704%

yes 8 Dia

Dib

DI*01 0 33 26'175 26'208 1.555% 0 0 54 54 0.000%

yes 9 Wra

Wrb

DI*02.03 0 12 25'571 25'583 3.903% 0 0 54 54 0.000%

yes 10 Ytb

Yta

YT*02 110 2'834 23'272 26'216 1.525% 0 0 54 54 0.000%

yes 11 Cob

Coa

CO*01 39 1'909 24'227 26'175 1.679% 0 0 54 54 0.000%

yes 12 Knb

Kna

KN*02 17 1'406 24'797 26'220 1.510% 0 0 54 54 0.000%

yes 13 McCb

McCa

KN*01.06 2 33 26'175 26'210 1.548% 2 19 33 54 0.000%

yes 14 Vil Vil neg KN*01.07 6 115 26'154 26'275 1.303% 10 25 19 54 0.000%

yes 15 Doa

Dob

DO*02 4'340 12'642 9'285 26'267 1.333% 3 25 26 54 0.000%

yes 16 Hy neg Hy (pos) DO*02.–04 0 13 26'235 26'248 1.405% 0 2 52 54 0.000%

yes 17 Joa neg Jo

a (pos) DO*01.–05 0 12 26'201 26'213 1.536% 0 3 51 54 0.000%

yes 18 LWb

LWa

LW*07 1 196 26'025 26'222 1.503% 0 0 54 54 0.000%

01.07.2013 19 SC:2 SC:1 SC*02 0 68 11'858 11'926 1.868% 0 0 54 54 0.000%

01.07.2013 24 Vel Vel (neg) SMIM*02 2 423 11'505 11'930 1.835%

yes 20 Cra neg Cr

a (pos) CROM*–01 0 12 26'145 26'157 1.747% 0 2 52 54 0.000%

yes 21 Tcb

Tca,c

CROM*01.03 0 5 26'156 26'161 1.732% 0 3 51 54 0.000%

yes 22 Tcc

Tca,b

CROM*01.04 0 43 26'156 26'199 1.589% 0 0 54 54 0.000%

yes 23 Ina

Inb

IN*01 0 3 26'177 26'180 1.660% 0 0 0 54 0.000%


Results … 31.12.2013

HuSti Projekt Nr. 140: Molekulardiagnostisches Labor des B lutspendedienstes SRK Zürich:Hoch-Durchsatz-Genotypisierung von Spender-Blutgruppe n

Im Jahr 2013 alleine wurden mehr als die Hälfte aller zu testenden Blutspender, nämlich 18‘134 vonschlussendlich 36‘000 des Gesamt-Projekts, aufgebracht und untersucht; ein Beleg für die enormeKapazität der entwickelten Methode. Es wurden viele seltene Spender entdeckt, z.B. 110„Yt(a-b+)“, mehr als bisher aus der gesamten Schweiz insges amt bekannt waren.Einige davon dienten bereits als dringend benötigte Blutve rsorger! Die Einbindungund neuartige Vernetzung der regionalen Blutspende-Zentren Basel, Chur, Luzern, Lugano, Aarau,und Neuchatel mit Zürich, wird durch deren Beitrag von 6‘161 Proben (23% aller 26‘622 bis Ende2013 Untersuchten) unterstrichen. Resultate bzgl. der Blutgruppen Kell, Kidd und Duffy befinden sicham Weg zur wissenschaftlichen Publikation. Die internationale Resonanz auf die SchweizerResultate schwankt zwischen Neid und Begeisterung. Mit Budget und Zielerreichung liegt das Projektim Plan für das finale Jahr 2014.


Spender

RUOEthik: Genetische Blut- und

“Gewebegruppen (HLA)” ausgenommen

§Vorschriften Blutspende SRK

Schweiz, 01.01.2013

CHF (€, $)Eigenverantwortung (Privat-Betrieb)

Empfänger (Patienten)

RUOEthik: Genetische Blut- und “Gewebegruppen (HLA)” ausgenommen

§Empfehlungen der SVTM und des BSD SRK Schweiz, 2009

CHF (€, $)Analysenliste (BAG)


https://sbsc-bsd.ch/DokuMan/DokumenteBSD/Allgemeines/tabid/107/language/de-CH/Default.aspx

Vorschriften Blutspende SRK Schweiz, 01.01.2013(Blut-Spender)




Die Bestimmung eines erweiterten Phänotyps

(RhCc RhCw, RhEe, K/k, Jka/b, Fy a/b, MN, Ss)

muss/soll 2 mal an 2 unabhängigen Spender-Proben durchgeführt werden.




Die Bestimmung eines erweiterten Phänotyps

(RhCc RhCw, RhEe, K/k, Jka/b, Fy a/b, MN, Ss)

muss/soll 2 mal an 2 unabhängigen Spender-Proben durchgeführt werden.

Deshalb die Idee: Warum nicht 1 mal serologisch, und 1 mal

genetisch?

MPX, SNPs, alleles n n n . n n n MPX, SNPs, alleles

RHDhigh 2

RHDbroad /RHCcEe 3 49 79 10 10 Cc, Cw, Ee, D, psi, DCes

Kell-Kidd- Duffy 1 15 21 10 13 K/k, Kpa/b, Jsa/b, kNull,

Jk a/b, JkNull,

Fy a/b/x/Null

MNS 1 11 15 3 5 MN, Ss, U neg (del)

RARE 2 23 36 9 18 Sc, Yt, In, Co, Di, Lu,

Wr, Do, LW, Vel (a/b)

HPA / HNA 1 13 23

10 108 170 2 32 46


New « select module » MALDi-TOF (mass spec.)

«select modul»


Planung

Dezember 2014 Jänner Februar März April Mai

Super-Modul, auch

"Select-Modul "

Teste / Validiere "Select-Modul" n = ca. 1'500

EDV. Interpretation. Datentransfer von MALDI-TOF nach CTS. LASTENHEFT.

Sobald EDV auf gutem Weg. Akkreditierung SAS.

Vergleichstestung Bern-Mannheim-Zürich

Sequenzierung der Diskrepanzen zw. Mannheim und Inno-Train (erfolgt durch Peter Bugert)

Meeting bzgl. Resultate Abklärung Diskrepanzen.

Verrechnung BE und MA nach Projekt-Ausschuss Bericht und Klärung Rechnungslegung. Hierzu: 2013-10-02-INTERN-FREY-KOHLER.doc

Detail: Klärung Vorgehen HNA-1 (Sequenzierung FCGR3A, und B?)

Detail: Klärung Publikation der Vergleiche.

Starte Manuskript: Vergleichstestung

Validation RARE mit AK für Phänotypen

Aufbau serologischer Arbeitsplatz MOC. Einberufung und Testung

Aufbringung DNAs intern/extern

Stand Ende 2013: WALDI 5'300

Besammlung WALDI: Genf, Lausanne, St. Gallen, Wallis (expect WALDI: 760) ?

WALDI fertig besammelt und getestet

Stand Ende 2013: RUDI 21'000

expect RUDI: 5'300 extern, 4'000 intern

"Diskrepanzen" Verfolge und Kläre

Sequenziere Diskrepanzen Starte Manuskript: MNS Einberufung Diskrepanzen von fertiger WALDI-Testung.

Berichte intern, RARE-Donor-File, extern

Retypisiere "RARE" mit Select-Modul.

Berichte an RARE-Donor-File

Berichte an externe Teilnehmer


Molecular Diagnostics & Cytometry (MOC)

Stefan Meyer, Nadine Trost,

Sonja Sigurdardottir, Kathrin Neuenschwander,

Eduardo Meyer, Chantal Brönnimann, Yvonne Merki

Christoph Gassner

ALL @ Blutspende Zürich

Schlieren, Switzerland

Beat M. Frey

«Murmel» BSD SRK Graubünden

Thomas Schulzki

BSD SRK Zentralschweiz

Andreas Maier

Blutspendezentrum beider Basel

Andreas Buser

Blutspendedienst Aargau, Solothurn

Martin Wernli, Jörg Sigle

Trasfusione CRS Svizzera Italiana, Daminano Castelli

Transfusion CRS Neuchatel-

Jura Amira Sarraj

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